一种多肽及其应用
阅读：794发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种多肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种多肽的应用，属于 生物 制药领域。1.一种多肽，其特征在于，多肽中含有的结构域Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu，其中X是Trp或Tyr;Y是Arg或Cys；和Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala；或者上述结构域中突变其中的任意 氨 基酸后的序列；可以 治疗 各种 纤维 化 疾病 及病状，包括 肺 纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化、肾纤维化和心肌纤维化、 皮肤 纤维化以及肺部组织病变。，下面是一种多肽及其应用专利的具体信息内容。
1.一种多肽，其特征在于，多肽中含有的结构域
Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu，其中X是Trp 或Tyr; Y是Arg或 Cys；和 Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala；或者上述结构域中突变其中的任意氨基酸后的序列。
2.根据权利要求1所述的一种多肽，其特征在于所述的多肽用linker连接，所述的linker为 Gly-Gly-Gly-Gly、Ser-Ser-Ser或其它氨基酸组成的柔性linker，即Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-linker-Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu。
3.根据权利要求1所述的一种多肽,其特征在于，多肽的氨基酸序列为以下氨基酸序列或含有与其80%的同源性的氨基酸序列：
多肽I:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Trp-Arg-Gly-Glu;
多肽II：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Trp-Cys-Gly-Glu;
多肽III:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Tyr-Arg-Gly-Glu;
多肽IV:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Tyr-Cys-Gly-Glu。
4.权利要求1-3任意一项所述的多肽在制备纤维化药物中的应用。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的所述的多肽在制备抗肺组织病变药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的多肽在制备纤维化中的应用，其特征在于，所述的组织纤维化包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、皮肤纤维化、骨髓纤维化。
7.根据权利要求5所述的多肽在制备抗肺组织病变药物中的应用，其特征在于，所述的抗肺组织病变包括细菌性肺炎、病毒性肺炎、支原体肺炎、真菌性肺炎、衣原体肺炎、原虫性肺炎。
8.根据权利要求4所述的多肽在制备抗纤维化药物中的应用，其特征在于，所述的多肽为多肽或其药学上可接受的盐，多肽或其药学上可接受的盐的剂型为注射剂、胶囊、片剂、鼻喷剂或气雾剂。
9.根据权利要求5所述的多肽在制备抗肺组织病变药物中的应用，其特征在于，所述的多肽为多肽或其药学上可接受的盐，多肽或其药学上可接受的盐的剂型为注射剂、胶囊、片剂、鼻喷剂或气雾剂。
一种多肽及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 由于器官成纤维细胞过度沉积细胞外基质(ECM)成分如纤连蛋白(FN)和I型胶原蛋白(COLI)被定义为纤维化。器官纤维化是许多导致终末器官衰竭疾病的最终共同途径。不可控制的伤口愈合应答(包括急性和慢性炎症、血管生成、成纤维细胞的活化和细胞外基质的重塑)参与了纤维化的发病过程。目前对器官或组织纤维化的发病机制、诊断方法和防治措施已经进行了广泛的研究，现有的技术中，虽然在某些方面已经取得了长足的进步，但仍然有些关键问题没有解决。
[0003] 现已知，器官或组织纤维化是由于多种原因(如炎症、免疫、毒物等)引起实质细胞损伤，然后导致实质细胞的炎症变性、坏死、并激活相应的细胞释放多种细胞因子和生长因子如(TGF-β1、VEGF等)，这些因子激活静息状态的细胞外基质产生细胞，使之转化为肌成纤维细胞；肌成纤维细胞大量的增殖，并分泌大量的细胞因子，通过旁分泌的方式再作用与巨噬细胞。肌成纤维细胞可以合成大量的胶原等ECM成分，同时ECM的降解减少，从而造成器官或组织纤维化。因此，器官或组织纤维化的发生和发展是细胞、细胞因子和ECM等相互作用，多因素参加的结果。其中主要原因均与胞外基质(包括基质金属蛋白酶的变化异常)及血管生成异常有密切联系。
[0004] 1.肺纤维化
[0005] 肺纤维化是肺组织过度修复的过程，Wilson指出，当“损伤-炎症-修复”链中任一或多个环节出现问题都会导致纤维化的发生。目前，可将肺纤维化的发生归结于以下三个阶段：(1)损伤阶段：肺泡上皮细胞受到气体、粉尘、感染(细菌或病毒)、药物、放射性损伤等等因素的刺激而受损；(2)效应阶段：损伤会促使肺泡上皮细胞凋亡，产生氧化应激反应，损伤部位募集炎症细胞(巨噬细胞、T/B淋巴细胞、中性粒细胞等等)和大量分泌的转化生长因子-β(TGF-β)会刺激成纤维细胞的增殖和分化，促使肺成纤维细胞灶形成；(3)纤维化阶段：成纤维细胞灶的形成并促使细胞外基质(ECM)的过度分泌，致使肺组织实质细胞逐步被间质细胞取代，肺组织失去弹性，硬度增加，最终使肺组织失去生理功能，致使患者因纤维化造成的呼吸衰竭而死亡。
[0006] 多种细胞参与了纤维化的发生，如肺上皮细胞、内皮细胞、肺炎症细胞(主要为巨噬细胞)和肺间质细胞(成纤维细胞、肌纤维母细胞)，其中肺间质细胞为肺纤维化发生的关键效应细胞。同时，细胞分泌的细胞因子诸如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、整合素、金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制剂(TIMP)等等也对肺纤维化的发生影响颇深。
[0007] 细胞因子中最关键的是TGF-β。TGF-β是可以调节细胞增殖、分化的多功能细胞生长因子。可以通过直接刺激原位成纤维细胞的活化或通过内皮间质化(EnMT)、上皮间质化(EMT)过程来刺激肌成纤维细胞的大量增殖和ECM的过度积聚。当TGF-β由于损伤持续被活化时，会交叉激活MAPK、EGF、Wnt/β-catenin信号，导致纤维化的发展。PDGF、bFGF、VEGF作为生长因子均可促进肺成纤维细胞的增殖和分化，对肺纤维化的进展产生影响。MMP/TIMP为ECM的主要调节剂，两者的含量在ECM的平衡中起到关键作用。这些细胞因子都或多或少对肺成纤维细胞的增殖和活化及胶原的形成产生影响，因此合理调控细胞因子的表达将有助于肺纤维化的治疗。
[0008] 本发明设计的多肽，其具有金属基质蛋白酶抑制剂和抑制血管生成的双重功效，将MMP抑制剂与血管生成抑制剂相结合，MMP抑制剂从调节ECM和肺部损伤的关键细胞因子MMP/TIMP着手，血管生成抑制剂可以抑制细胞因子的释放如TGF-β1、VGFE等，可以抑制成纤维细胞的增殖和活化，其可以从病理学上的主要发病机制作用于肺纤维化的治疗。
[0009] 2.肝纤维化
[0010] 肝纤维化是肝脏对各种病因所致慢性肝损伤的修复反应，主要特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。肝纤维化是各种慢性肝病共有的病理特征，是进一步向肝硬化发展，甚至恶变死亡的主要中间环节。由于肝硬化的治疗十分困难、死亡率高，而目前认为肝纤维化具有可逆性，因此阻断或延缓肝纤维化的发生发展，对于多种伴随肝纤维化的慢性肝病的治疗，具有重要应用价值。目前，临床上肝纤维化治疗包括针对原发病的病因治疗和针对纤维化本身的治疗。但去除原发病因并不能完全抑制肝纤维化的发展，而纤维化的存在还可影响对原发病的治疗效果，因此，针对纤维化的治疗尤显重要。但肝纤维化的发生和发展机制十分复杂，目前研究主要围绕肝脏星状细胞的激活和转化为肌成纤维细胞和成纤维细胞，其可能途径是激活转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路、血管衍生生长因子(PDGF)受体介导的信号转导通路、TNF-α介导的信号转导通路及前列腺素内氧化还原酶(COX-2)、弥漫性细胞外基质(ECM)、血管新生及氧化应激介导的肝纤维化等。
[0011] 目前在研的抗肝纤维化药物主要通过抑制或减轻炎症反应、抗氧化应激、抑制肝纤维化过程中起主要作用的肝星状细胞激活、增殖或促进其凋亡、保护肝细胞、促进肝再生、抑制或中和促纤维化因子活性、抑制血管新生以及抑制细胞外基质合成或促进其降解等环节。近几十年来，抗肝纤维化药物研究虽然取得了一定的进展，但目前许多药物仍处于临床前或临床试验阶段，如TGFβ1拮抗剂、肝细胞生长因子、S-腺苷蛋氨酸、吡非尼酮等，但目前尚无一种化学药物被批准用于人类肝纤维化的治疗。
[0012] 3.肾纤维化
[0013] 肾纤维化(包括肾间质纤维化和肾小球硬化)是各种原因引起的肾脏损害最后阶段的主要病理基础，肾纤维化发生机制较为复杂，与多种因素有关，其中主要与细胞外基质细胞产生细胞的增值和活化，血管活性物质、细胞因子以及细胞外基质转换失衡有关，肾间质纤维化几乎是所有原发或继发肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径。
[0014] 目前大多数肾纤维化治疗药物存在毒性大、安全性低、药理作用单一等问题，多肽药物的成药性高于一般化学药物，其生物活性高，特异性强，毒性反应相对较弱，在体内不易产生蓄积。多肽可以根据其发病机制进行设计，是多靶点设计，可以从多个途径抑制肾纤维化的发生。
[0015] 4.骨髓纤维化
[0016] 骨髓纤维化(MF)简称髓纤。是一种由于骨髓造血组织中胶原增生，其纤维组织严重地影响造血功能所引起的一种骨髓增生性疾病，原发性髓纤又称“骨髓硬化症”、“原因不明的髓样化生”。本病具有不同程度的骨髓纤维组织增生，以及主要发生在脾、其次在肝和淋巴结内的髓外造血，典型的临床表现为幼红细胞及幼粒细胞性贫血，并有较多的泪滴状红细胞，骨髓穿刺常出现干抽，脾脏常明显肿大，并具有不同程度的骨质硬化。本病属少见疾病，发病率0.2/100000～2/100000。发病年龄多在50～70岁之间，也可见于婴幼儿，男性略高于女性。
[0017] 骨髓的纤维化说明成纤维细胞及TGF-β1等纤维化相关机制参与到其中；发现的很多突变基因都与炎症通路相关说明炎症反应也参与到骨髓纤维化的发生发展。事实上，己有的研宄报道炎性细胞因子表达的升高，赖氨酰氧化酶(LOX)表达上调，TGF-β1表达水平的升高，巨核细胞功能受损和其中异常的JAK-STAT信号通路的活化都被报道参与到骨髓纤维化的发病过程；骨髓纤维化的一个重要特征是炎性细胞因子水平的升高。其中一个重要因子就是对纤维化产生具有重要作用的TGF-β1。骨髓纤维化病人骨髓中TGF-β1水平明显升高。在骨髓纤维化病人中细胞外基质积聚，纤维增生，大量新生血管形成。
[0018] 5.心肌纤维化
[0019] 心肌纤维化是以心脏间质成纤维细胞过度增殖、胶原过度沉积以及异常分布为特征的心脏间质重构。心肌纤维化在病理特点上主要表现为胶原沉积的增多，各种不同胶原的比例失调，尤其是I型、III型胶原的比例升高、排列紊乱，同时伴有心肌成纤维细胞的增生。心肌纤维化与高血压病、慢性心力衰竭、扩张型心肌病等多种心血管疾病有密切的关系，并且心源性猝死的潜在的危险因素。心肌纤维化纤维化病人基质金属蛋白酶表达增高，与血管新生相关因子也呈现高表达。目前对心肌纤维化的具体发病机制并不是十分的明确，主要认为与肾素--血管紧张素-醛固酮系统、各种细胞因子、氧化应激等存在密切的关系。这些因素通过相同或者不同的传导通路影响着心肌纤维化的发与发展。
[0020] 目前还没有针对治疗心肌纤维化的上市药物，因此需要开发一种药物用于治疗心肌纤维化。
[0021] 6.皮肤纤维化
[0022] 皮肤纤维化(skinfibrosis)为皮肤的过度瘢痕形成，且为病理性伤口愈合反应的结果。主要特征是小血管功能和结构发生异常,皮肤、内脏处于纤维化状态,免疫系统处于活化状态。多年来国内外学者对瘢痕的发生、发展及消退的机理进行了多角度、多层面的深入研究，但直至目前对其机制的研究尚无明确的结论，防治方面也尚无良方，较一致的看法有：①皮肤纤维化主要的效应细胞是成纤维细胞，并以细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为特征；②胶原代谢紊乱是其主要的生物学层面表现；③TGF-β1/Smad信号通路与成纤维细胞的增殖、分化、迁徙、凋亡及胶原代谢等多种生理、病理过程密切相关，Smads根据不同分型对成纤维细胞胶原代谢具有双向调控作用。
[0023] 用于治疗皮肤纤维化的最常用的方法是采用免疫抑制的疗法。基本原理在于，自身免疫性病因造成疾病的炎症方面以及后续组织损伤和纤维化。所常用的药物包括甲胺喋呤、环磷酰胺和环孢菌素。尽管已观察到免疫抑制疗法的一些改进，但关于药物安全性的担忧以及确定的临床数据和可证实的功效的缺乏仍然存在。因此需要开发用于治疗皮肤纤维化、纤维化皮肤疾病和皮肤的病理性瘢痕形成的有效药物制剂。
[0024] 7.肺组织病变
[0025] 很多疾病能在肺部形成广泛多灶性或弥漫性病变，凡引起肺间质或实质性双肺广泛性病变的疾病，统称为肺部弥漫性病变。致病病因有感染性、吸入性、肿瘤性药物反应性、血管结缔组织病、呼吸道疾病及一些原因不明疾病。大多是由于慢性炎症引起的，采用抗炎、抗氧化等方法进行治疗。
发明内容
[0026] 要解决的技术问题
[0027] 针对现有的治疗纤维化的药物大多都是化学药物，化学药物存在毒性大、安全性低、药理作用靶点单一等问题。本发明提供的一种多肽的应用，在肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化以及肺组织病变均有很好的治疗效果。本发明的多肽包含多个结构域可以靶向多个靶点，可以从多个途径抑制纤维化的发生。
[0028] 技术方案
[0029] 为了解决上述的问题，本发明采用的技术方案如下：
[0030] 一种多肽，其特征在于，多肽中含有的结构域
[0031] Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu，其中X是Trp,Tyr；Y是Arg,Cys；和Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala；或者上述结构域中突变其中的任意氨基酸后的序列。
[0032] 即：多肽中含有的结构域为Pro-Arg-Cys-Trp-Arg-Gly-Glu，Pro-Arg-Cys-Tyr-Arg-Gly-Glu，Pro-Arg-Cys-Trp-Cys-Gly-Glu，Pro-Arg-Cys-Tyr-Cys-Gly-Glu，Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly。
[0033] 所述的多肽用linker连接，所述的linker为Gly-Gly-Gly-Gly、Ser-Ser-Ser或其它氨基酸组成的柔性linker，即
[0034] Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-linker-Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu。。
[0035] 所述的多肽的氨基酸序列为以下氨基酸序列或含有以下具有80％的同源性的氨基酸序列：
[0036] Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-limker-Pro-Arg-Cys-X-Y-Gly-Glu
[0037] 多肽I:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Trp-Arg-Gly-Glu(见SEQ NO ID：1)；
[0038] 多肽II：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Trp-Cys-Gly-Glu(见SEQ NO ID：2)；
[0039] 多肽III:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Tyr-Arg-Gly-Glu(见SEQ NO ID：3)；
[0040] 多肽IV:Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Cys-Tyr-Cys-Gly-Glu(见SEQ NO ID：4)；
[0041] 上述的一种多肽在抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化和抗肺部组织病变药物中的应用。
[0042] 优选地，所述的肺部组织病变包括所述的抗肺组织病变包括细菌性肺炎、病毒性肺炎、支原体肺炎、真菌性肺炎、衣原体肺炎、原虫性肺炎。
[0044] 有益效果
[0045] 相比于现有的技术，本发明的有益效果为：
[0046] (1)本发明的多肽可以用于治疗多种纤维化疾病，包括肺、肝、肾、心肌，皮肤以及骨髓纤维化。其组成的成分均为天然的氨基酸，易于合成，没有明显的毒副作用，安全性高；
[0047] (2)本发明的多肽在治疗肺纤维化动物模型中，可以改善肺部组织结构，降低炎症反应，降低肺纤维化的评分，明显改善肺纤维化的状况，延长其生命周期；
[0048] (3)本发明的多肽可以抑制成纤维细胞的增殖和活化，可以抑制肝星状细胞的增殖和活化，抑制其HYP的产生；
[0049] (4)本发明的多肽在治疗肾纤维化的动物模型中，可以显著降低肾组织中TGF-β1的表达含量，明显改善肾纤维化的状况；
[0050] (5)本发明的多肽可以抑制大鼠心肌成纤维细胞的增殖；
[0051] (6)本发明多肽可以抑制骨髓纤维化的进程，降低TGF-β1的表达含量；
[0052] (7)本发明的融合多肽可以治疗皮肤纤维化，在皮肤纤维化的模型中，多肽可以显著降低皮肤中HYP的表达含量，明显改善皮肤瘢痕增生的情况；
[0053] (8)本发明的多肽对肺部疾病的感染，也具有良好的抑制作用，抑制率达60％以上；
[0055] 图1是本发明的多肽I、II、III、IV肺组织中HE染色的图；
[0056] 图2是本发明的多肽I、II、III、IV肺组织中Masson染色的图；
[0057] 图3是本发明的多肽I、II、III、IV可以降低肝星状细胞中HYP含量的图；
[0058] 图4是本发明的多肽I、II、III、IV可以降低肾纤维化模型中TGF-β1含量的图；
[0059] 图5是本发明的多肽I、II、III、IV可以抑制骨髓纤维化中TGF-β1含量的图；
[0060] 图6是本发明的融合多肽I、II、III、IV抑制皮肤纤维化模型中HYP的表达含量；
[0061] 图7是本发明的多肽I、II、III、IV对肺部感染的抑制效果；
具体实施方式
[0062] 所述多肽I、II、III、IV委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0063] 实施例1、肺纤维化动物模型
[0064] 实验动物及材料：
[0065] 1.实验动物：
[0066] 来源、种系、品系：SPF级、SD大鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司[0067] 提供(实验动物许可证：SCXK(沪)2013-0016)
[0068] 体重：采购时体重180-200g,开始造模时体重180-220g
[0069] 性别：雄性。
[0070] 每组动物数：每组14只。
[0071] 2.实验材料：
[0072]
[0073] 3.实验方法：
[0074] SD大鼠，腹腔注射1mL/100g、4％的水合氯醛进行麻醉，大鼠麻醉后，固定大鼠，用75％酒精棉消毒大鼠颈部。用剪刀纵向剪开大鼠颈部皮肤，用镊子纵向钝性撕开筋膜与肌肉，暴露气管。注射器刺入气管注入博来霉素5mg/kg，空白组注入等量生理盐水。然后迅速将鼠板直立，旋转鼠板，观察大鼠呼吸情况，旋转后消毒颈部伤口，缝合伤口，并在缝合撒上阿莫西林消炎药。将术后大鼠放回干燥洁净的鼠笼休息，等待苏醒，大约l-2h后苏醒，之后正常饲养。造模后第7天造模组动物随机分为模型组、阳性药尼达尼布组、多肽I、II、III、IV各个剂量组、正常对照组，并分别进行给药，给药周期为14天。每天观察老鼠的生存状况，称量其体重。给药14天之后，将其解剖，取肺，取右肺上叶放入在组织固定液中，包埋，进行切片，HE染色和Masson染色。
[0075] 4.实验分组及剂量设置
[0076] 表1 实验分组及给药方案
[0077]
[0078]
[0079] 5.实验结果
[0080] 1.多肽对博来霉素诱导SD大鼠存活率的影响
[0081] 如表2所示，较模型组SD大鼠存活率(64.3％)而言，各受试药的SD大鼠存活率均高于模型组，而且各受试药能够明显提高SD大鼠的存活率，多肽II和阳性药的存活率相当为(85.7％)，而且多肽I和III的存活率(78.6％)、IV的存活率(92.9％)。
[0082] 表2 多肽对博来霉素诱导的SD大鼠肺纤维化的存活率(％)的影响
[0083]
[0084] 2.多肽对博来霉素诱导的SD大鼠肺纤维化病理分析
[0085] 研究结果显示，本研究成功建立了SD大鼠肺纤维化模型，肺组织病变主要表现为肺泡壁和肺内支气管、血管分支周围间质出现成纤维细胞增生并形成胶原纤维，Masson染色时呈蓝绿色染色反应，并出现炎细胞浸润、肺泡壁充血、细胞变性排列紊乱等病变。给予药物之后，肺组织纤维化程度和其它病变较模型组减轻。HE染色和Masson染色的图见附图1、2。
[0086] 实施例2、体外肝纤维化模型的建立及多肽治疗
[0087] 1.实验材料：
[0089] 2.实验方法：
[0090] 用含10％的FBS的1640培养基培养LX-2细胞，将其放在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔2天换液一次，根据细胞的密度进行传代。取对数生长期的LX-2细胞，用0.25％的胰酶进行消化，制成细胞悬液，将细胞的密度调整为4×105个/mL，将其接种在96孔板中，每孔100μL，过夜培养，第二天加入TGF-β1诱导LX-2细胞增殖活化，同时给予多肽药物1μmol/L，除了空白组不加入TGF-β1，其余各组均加入TGF-β1(10ng/mL)，在培养箱中培养48h，随后每孔加入10μL的MTT，4小时之后将MTT吸出，加入150μL的DMSO，反应5min，酶标仪570nm检测OD值。
[0091] 细胞中HYP含量的测定：用含10％的FBS的1640培养基培养LX-2细胞，将其放在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔2天换液一次，根据细胞的密度进行传代。取对数生长期的LX-2细胞，用0.25％的胰酶进行消化，制成细胞悬液，将细胞的密度调整为2.5×105个/mL,将细胞接种在6孔板中，每孔1mL,过夜培养第二天加入TGF-β1(10ng/mL)进行诱导其活化，同时加入多肽进行干预，除空白组外不加入TGF-β1诱导，培养48h后，收集细胞，用HYP试剂盒检测LX-2细胞中HYP的表达含量。
[0092] 3.实验结果
[0093] (1)多肽对TGF-β1诱导LX-2细胞增殖的影响
[0094] TGF-β1可以诱导LX-2细胞的增殖活化，促进肝星状细胞的活化，给予多肽药物之后，可以抑制LX-2的增殖和活化，结果见表3，多肽II的抑制效果最明显，与模型组相比具有极显著性的差异(**P<0.01)，多肽I、III、IV与模型组相比具有显著性的差异(*P<0.05)。
[0095] 表3 多肽对TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖的影响
[0096]
[0097] ***P＜0.001,**P＜0.01 vs model；
[0098] (2).多肽对TGF-β1诱导的LX-2细胞的HYP含量的影响
[0099] 人体标本实验显示，肝纤维化间质中堆积大量的胶原，胶原含量的多少反映了肝纤维化的水平。而羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，因此羟脯氨酸的含量能反应肝纤维化过程中胶原堆积的情况，进而反应肝纤维化的程度。HYP如图3所示，给予多肽药物之后均可以显著抑制HYP的含量，抑制纤维化的进程。
[0100] 实施例3、肾纤维化模型的建立
[0101] 1.实验动物
[0102] 清洁级雄性SD大鼠，购买自南京青龙山动物养殖场，采购时体重180-200g,开始造模时体重190-210g，开始给药时为180-200g。
[0103] 2.实验材料：
[0104] 生理盐水 厂家：安徽双鹤药业有限公司
[0105] 大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 厂家：天津安诺瑞康生物科技有限公司[0106] 碱性HYP试剂盒 厂家：南京建成
[0107] 3.实验方法
[0108] 肾纤维化动物模型的建立，SD大鼠用4％的水合氯醛进行麻醉，腹腔注射1mL/100g，将SD大鼠固定在手术板上，手术区域消毒备用，在腹中线偏左约3-4mm剪开腹腔，手术组分理处左肾输尿管，在靠近肾下极处结扎分离输尿管，然后双结扎后，在两个结扎中间剪短输尿管，卓曾缝合肌层及腹壁，酒精消毒，待SD大鼠苏醒后，放回笼内进行饲养。空白组不结扎输尿管，其余步骤相同。随后将动物分为空白组，模型组，多肽给药组，于手术后第二天开始给药，1天2次，给药14天，给药14天之后，取血，取上清检测血清中TGF-β1的含量。
[0109] 4.实验分组及剂量设置
[0110] 表4 实验分组及给药方案
[0111]
[0112] 5.实验结果
[0113] (1)多肽对肾纤维化SD大鼠血清中TGF-β1含量的影响
[0114] TGF-β1是最为重要的致纤维化因子，在肾纤维化中，TGF-β1的表达含量明显增高，结果如图4所示，模型组与空白组相比具有极显著性差异(***P<0.001)给药之后，各组均可以显著降低血清中TGF-β1的含量，多肽II与模型组相比均有极其显著性的差异(***P<0.001)，多肽I、III、IV与模型组相比具有极显著性的差异(**P<0.01)。
[0115] 实施例4、心肌纤维化体外模型
[0116] 1.实验方法
[0117] 多肽抑制大鼠心肌成纤维细胞的作用，用MTT方法进行检测。细胞用含10％的FBS的DMEM培养基进行培养，将细胞质成1×105/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板中。待细胞贴壁后换无血清DMEM培养基，24小时后弃去无血清培养基，用1μmol/L不同的多肽进行培养，每个浓度设置5个复孔。分别于12、24、48h后，每孔加入MTT 10μL，4小时后将MTT吸出，每孔加入DMSO 150μL，反应5min后，酶标仪570nm测OD值。
[0118] 2.实验结果
[0119] 在24h和48h，多肽I、II、III、IV在1μmol/L均可以抑制大鼠心肌成纤维细胞的增殖，结果如表5；
[0120] 表5 多肽对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响
[0121]
[0122] ***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05 vs control；
[0123] 实施例5、骨髓纤维化模型的建立
[0124] 1.实验动物
[0125] 4周龄雌性昆明小鼠购买自南京青龙山动物养殖场，
[0126] 2.实验材料：
[0127] 注射用rh EPO 厂家：上海克隆高技术公司
[0128] 小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 厂家：天津安诺瑞康生物科技有限公司[0129] 3.造模方法
[0130] 每组10只；除正常对照组注射生理盐水(0.3mL/只)，其他各组每天腹腔注射rh EPO(0.1单位/克，体重，0.3mL/只)；在诱导第二天之后，开始给予药物治疗，每天皮下注射，一天两次，连续给药28天之后，对小鼠心脏穿刺取血，一部分血对小鼠进行外周血分析，一部分离心取上清，检测小鼠血清中TGF-β1的含量。
[0131] 4.实验分组及给药方案
[0132] 表6 实验分组及给药方案
[0133]
[0134] 5.实验结果
[0135] (1)各组外周血细胞的分析
[0136] 模型组的白细胞数明显高于正常对照，给予药物之后与模型组相比白细胞数也降低，但是均无显著性的差异，模型组的Hb、MCV、RDW的水平显著增高与空白组相比具有极显著性的差异(P＜0.01)，给予药物之后可以降低Hb、MCV、RDW的表达水平，与模型组相比具有显著性的差异(P＜0.5)。结果见表8；
[0137] 表7 各组外周血细胞的分析
[0138]
[0139] **P＜0.01,*P＜0.05 vs model；
[0140] (2).多肽对小鼠血清中TGF-β1含量的影响
[0141] TGF-β1是最为重要的致纤维化因子，在骨髓纤维化中，TGF-β1的表达含量明显增高，结果如图5所示，模型组与空白组相比具有极显著性差异(***P<0.001)给药之后，各组均可以显著降低血清中TGF-β1的含量，多肽II与模型组相比均有极其显著性的差异(***P<0.001)，多肽I、III、IV与模型组相比具有极显著性的差异(**P<0.01)。
[0142] 实施例6、皮肤纤维化模型的建立
[0143] 1.实验动物
[0144] 6-8周龄的C57/BL雄性小黑鼠购自南京青龙山养殖场。
[0145] 2.实验材料
[0146] 博来霉素 厂家：海正辉瑞药业。
[0147] 生理盐水 厂家：安徽双鹤药业有限公司
[0148] 大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 厂家：天津安诺瑞康生物科技有限公司
[0149] 碱性HYP试剂盒 厂家：南京建成
[0150] 3.造模方法
[0151] 每天皮下注射博来霉素(10μg/mL),连续注射28天，使其形成皮肤纤维化，给药组在造模期间每天给予多肽药物进行治疗，每组10只；造模结束之后，第二天，小鼠处死，取其小鼠背部皮肤组织，检测皮肤组织中HYP的含量。
[0152] 4.实验分组及给药方案
[0153] 表8 实验分组及给药方案
[0154]
[0155] 5.实验结果
[0156] (1)各组小鼠皮肤组织中HYP含量的表达
[0157] 取小鼠背部皮肤组织检测皮肤组织中羟脯氨酸的含量，羟脯氨酸作为胶原蛋白的特征蛋白，可以侧面反映皮肤组织胶原的含量。如图6所示，多肽各组别均可以降低皮肤组织中HYP的表达；多肽I、II可以显著降低肺组织中HYP的表达，与模型组相比有极显著性差异(***P<0.001)。多肽III、IV可降低SD大鼠肺组织中HYP的含量，与模型组相比有显著性差异(*P<0.05)。
[0158] 实施例7、本发明的多肽对多种肺部感染的抑制作用
[0159] 利用滴鼻法成功建立了小鼠肺炎模型，选择体质量为18-24g的BALB/C小鼠，分别在第0天、第1天和第2天用乙醚麻醉后，将制备好的肺炎链球菌菌液、腺病毒浓缩液、肺炎支原体、肺炎衣原体、原虫、肺炎真菌缓慢滴入小鼠的鼻腔，使其进入气管支气管后，在操作的过程中药防止菌液流入食道，导致菌液灭活，构建小鼠肺炎模型。待模型建立成功后，给予本发明的多肽，见图7和表9结果显示与青霉素给药组相比，本发明的多肽对多种肺部感染有更显著的改善作用，实验结果以平均值±标准差表示；
[0160] 表9 本发明的多肽对多种肺部感染的抑制效果
[0161]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途 | 2020-05-11 | 777 |
| 用于引起细胞内化的CD20结合免疫毒素及其使用方法 | 2020-05-08 | 776 |
| 白介素-13结合蛋白 | 2020-05-11 | 852 |
| 包含核酸及TCR修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用 | 2020-05-11 | 694 |
| 包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用 | 2020-05-11 | 79 |
| 抗PD-1抗体及其用途 | 2020-05-12 | 898 |
| 工程化抗微生物两亲性肽及使用方法 | 2020-05-13 | 742 |
| 用于提高免疫活性的TGFβ和ActRII拮抗剂 | 2020-05-14 | 234 |
| 无杀微生物剂的保存 | 2020-05-13 | 865 |
| 用于改良植物性状的方法 | 2020-05-12 | 878 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
抗真菌多肽热门专利
-
2 抗菌活性多肽
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈