本发明领域

本发明涉及包含一个在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因的核酸，还 涉及该基因的调节序列。

背景描述

植物产生和储藏多种低分子量有机化合物，包括萜类化合物、生物 碱、酚、皂角苷等等。由于以前认为这些化合物不直接参与支持生活物 质，只有微小的生物学功能，传统上称它们为“次级代谢产物。”

但是现在，已经阐明这些次级代谢产物功能是促进细胞分化和保护 细胞免受外来损伤因子影响，并且，更进一步，植物产生的这些次级代 谢产物已经用于多种大众化食物、药品、染料等等。

这些次级代谢产物由于其用途而得到重视，因而它们在植物细胞中 的产生途径也已成功阐释，表明这些化合物是通过涉及多种酶的复杂的 生物合成级联产生的。多数这种通过级联的酶反应生物合成的化合物可 以直接从植物材料提取，但是这种从植物的直接提取不但不适合大批量 生产的需要，而且通常很昂贵。因而，正在开发使用培养细胞体外合成 这些化合物的方法。

另一方面，已经阐明蛇麻，给予啤酒清爽的苦味和风味的一种主要 原料，在球果的蛇麻腺中分泌多种次级代谢产物，对啤酒的苦味和风味 起很大作用。

基于这种情况，已经对蛇麻进行了多种育种的尝试，除了改进其耕 作特征外，集中于蛇麻腺中积累的次级代谢产物诸如苦味物质、精油等。

但是，蛇麻是雌雄异株植物，特别是雄性植株不产生球果，啤酒所 需的原料，因而不是商业所需的，相应的没有得到积极地研究，根本没 能阐释它的对于啤酒酿造有益的遗传特征。所以，目前通过常规杂交方 法进行的蛇麻育种大多依靠培育者的经验和直觉，特别是在实际结球果 之前根本不能对发酵产物的质量进行预测。

另一方面，目前对多种植物已经存在使用遗传工程诸如转化技术和 标记协助的筛选等育种方法。与主要依靠培育者的经验和直觉的传统育 种方法相比，在这些方法中可以进行更客观的进行育种。转化技术是一 种通过将外源基因转入和表达在植物细胞来直接引入所需特征的技术。 通过将所需结构基因和能在植物细胞中起作用的终止子与能在植物细胞 中起作用的基因表达调节启动子连接，并将产生的转化启动子转移到植 物细胞进行外源基因的表达。实验中常用的启动子的例子是CaMV 35S， 能够在相对多种植物中的任何组织表达转移的基因，以及用于胭脂氨酸 合成酶基因的启动子(Sanders，P．R．，et al．，核酸研究，15(1987) 1543-1558)。另外，在遗传转化方面，转移的基因可能对植株的生长等 有害。因而，还需要能使外源基因在所需组织、所需时间和按所需的量 表达的启动子。与常规的传统育种方法相比，使用转化技术的育种方法 的优点是能够在短时间内以相对高的准确度将所需特征转导到植株中而 不必在意其物种种类。在蛇麻中，由于可以用根载植而增殖，不需要固 定转导特征的步骤。因而，使用转化技术的育种方法对蛇麻是特别有效 的。

标记协助选择是使用DNA标记诸如RFLP(限制性片段长度多态性) 标记的育种方法的一个实例，已经进入实际应用，特别是对稻和小麦。 通常认为，转化技术可用于转导单基因调控的特征，但不能转导多基因 调控的特征。标记协助选择能够补偿转化技术的这些缺陷。

这种使用基因技术的育种方法的先决条件是阐明与所需特征相关的 基因和调节这些基因的序列。特别地，对于作为啤酒原料和有效药物成 分来源的蛇麻，如果阐明了与雌性植株球果中含有的蛇麻腺分泌的次级 代谢产物有关的基因，可将这些基因用于利用基因技术的蛇麻育种方法， 并且亦可用于医疗领域。

                    本发明总结

因而，为了阐明在蛇麻腺中特异表达的基因和促进其实际应用，本 发明的一个目的是分离、纯化和提供这类基因，及这类基因的调节序列， 诸如启动子。

如上所述，本发明分离和纯化的核酸含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表 达的基因，特异地在蛇麻腺中起作用的启动子，及其部分。

使用这些核酸，可从全部依靠育种者的经验和直觉的的蛇麻育种常 规方法转移到使用遗传工程的更客观的方法。如上所述，由于重要的次 级代谢产物诸如啤酒原料和有效药物成分是从蛇麻球果的蛇麻腺中专有 分泌的，在蛇麻腺中特异表达起作用的基因很可能与次级代谢产物的生 物合成有关。这样，通过使用能够参与次级代谢产物生物合成的基因作 为标记，可以开发出用于蛇麻育种的改进的标记协助选择，显著有利于 食品和药物工业。另外，使用转化技术将上述基因转移到蛇麻，可以进 行工业用途品种的育种。也就是说，使用遗传工程技术用这些核酸进行 蛇麻育种，可以调节蛇麻腺中积累的次级代谢产物组分。另外，本发明 的核酸能够保持和改进用于啤酒酿造的蛇麻的质量，以及将蛇麻用于药 物产生。

通过参考下面的详细描述及其附图，可以更好的理解本发明及其多 种优点。

附图的简要描述

图1：分离蛇麻腺专一基因中的调节序列时的反向PCR步骤的图示。

图2：使用蛇麻素特异性基因作为探针，从富蛇麻素级分和贫蛇麻素 级分回收和电泳的RNA的Northern印迹检测结果。检测结果表明了蛇麻 腺中蛇麻素特异基因表达的特异性。

优选实施方案的详细描述

上述“特异表达”和“特异作用”的表述意思不仅是这些基因只在 蛇麻腺中表达和起作用，而且指在这些腺体中比在其它器官中更强。也 就是说，这些基因是否在蛇麻腺中“特异”表达或起作用可通过它们在 蛇麻腺中与在其它器官中的表达量和起作用强度来确定。

此外，“特异表达”和“特异作用”的表述不仅是指这些基因在整个 发育期等有如上定义的特异性，而且指与其它器官相比，这些基因的表 达和起作用被特定发育阶段或外界影响升高的更高。

上述核酸包括DNA和RNA。上述核酸中编码的“基因”的类型包括 任何类型诸如基因组DNA，cDNA和mRNA。

另外，本发明还包括上述核酸的部分。在有些应用中，甚至一段单 独的序列本身即能实现功能而不需所需的全长，即，使用一个具有全长 序列的所需功能特征的片段。例如，当使用基于RFLP的标记协助选择的 育种方法应用这些核酸时，通过杂交和PCR来确认分子，其中如果它们 含有上述来自蛇麻腺的特异核酸的一部分，例如，几十至几百bp长度的 部分连续序列，则使用的探针和PCR引物的大小就足够了。

此外，在本发明中，上述在蛇麻腺中特异表达的基因特征是该基因 编码与蛇麻腺中产生的次级代谢产物的生物合成有关的蛋白质。

此处使用的蛋白质包括，例如，序列1中的氨基酸序列。编码该蛋 白质的基因包括具有序列2的碱基序列，以及与序列2的碱基序列部分 地不同但保持编码上述氨基酸序列的碱基序列。在使用此碱基序列作为 探针和PCR引物时，可以进行一定程度修饰但要保持产生的序列有所需 的功能。所有编码上述氨基酸序列的氨基酸序列均在本发明范围内。除 了上述的外，使用已经建立的编码上述蛋白质的氨基酸残基的密码子的 遗传密码很容易确定特异的核酸序列。遗传密码列于L．Stryer，生物化 学，第三版，1988，W．H．Freeman and Co．，以参考文献完整并于此处。

另外，本发明的分离和纯化的核酸包括编码查耳酮合成酶的基因。 这种查耳酮合成酶是与苯丙氨酸和酪氨酸代谢有关的酶，并且更具体地， 确定它在类黄酮的生物合成中能将1摩尔香豆酰辅酶A和3摩尔丙二酰 辅酶A催化转化为4，2，4，6-四羟基查耳酮(柚配基-查耳酮)。因而，上 述核酸可用于调节涉及植物的类黄酮生物合成的代谢系统。更进一步， 最近，已经查明查耳酮合成酶-样酶可能具有戊酰苯(valerophenone)合 成酶活性，能够催化苦味物质α-酸和β-酸的前体根皮异戊酰苯和根皮异 丁酰苯的生物合成(欧洲酿造大会，26届会议的会议录，第215页 (1997))。这些事实表明，本发明分离的基因编码的蛋白质作用是戊酰 苯合成酶，参与苦味物质的生物合成。相应地，上述核酸可用于调节与 蛇麻中苦味物质生物合成有关的代谢系统，以及用作与苦味物质有关的 特征的基因标记。

本发明分离和纯化的核酸还包括用于基因在蛇麻腺中特异表达的调 节序列，以及含有在蛇麻腺中活化的启动子的序列。这种序列包括，例 如，由序列7所示的碱基序列的序列。这种在蛇麻腺中特异的调节序列 可用于促进连接在其下游的基因在蛇麻腺中的表达。

此外，本发明的一个目标是提供一种载体，它携带在蛇麻腺中特异 表达的基因或专一调节基因在蛇麻腺中表达的调节序列。

使用一种携带在上述蛇麻腺中特异表达基因的载体转化包括蛇麻的 植物，可以进行诸如蛇麻等植物育种。特别地，这种载体通过提高／抑制 次级代谢产物的产生而可有效用于育种。进一步，此载体不但可用于植 物育种，而且通过在培养细胞中表达与次级代谢产物生物合成有关的基 因来产生次级代谢产物。如果可能在培养细胞中产生次级代谢产物，可 以容易地分离次级代谢产物。

同时，上述携带调节序列的载体不仅可用于特定基因的表达，而且 可通过将从蛇麻或不同植物物种衍生的基因连接到调节序列的下游来实 现所需基因在蛇麻中的特异表达。这样可以在蛇麻腺中表达任何所需基 因。

另外，本发明还包括由上述载体转化的植物细胞。在这里，不为它 们的形态或生长阶段所限制，植物细胞可包括多种类型的细胞诸如培养 细胞、愈伤组织、原生质体、植株等。本发明不仅可包括第一代植物细 胞，而且可包括从第一代植物细胞产生的植株。

通过上述载体的转移，上述转化的植物可以实现所需基因包括编码 次级代谢产物的基因的表达，增加了植物作为食品和药物原料的用途。

在下列描述中，将参考优选实施方案详细描述本发明。 1．分离核酸，该核酸包含蛇麻腺特异基因及其表达调节序列。 (1)制备总RNA和mRNA

通过现有方法可以制备总RNA，例如“植物PCR实验方法(Protocols of Plant PCR Experiment)，”Shujun-sha，56页(1995)中描述的方 法，并于此处作为参考。通过现有方法可以从总RNA制备mRNA，例如根 据Takara-Shuzo的附于“Oligotex-dT30”的方法。 (2)制备cDNA库

通过现有技术可以从mRNA制备cDNA库。可以按照例如Amersham附 于“cDNA合成组件(cDNA sythesis module)”的方法制备cDNA。也可 以按照例如Amersham的附于“cDNA快速衔接子连接组件(cDNA rapid adaptor ligation module)”和“cDNA快速克隆组件(cDNA rapid cloning module)”以及Stratogene的“GIGAPACK Ⅱ加包装提取物(GIGAPACK ⅡPlus Packaging Extract)”的方法制备cDNA库。上面引用的所有 出版物并于此处作为参考。 (3)制备蛇麻素专一探针

蛇麻素专一探针是指与在蛇麻腺中特异表达的基因互补的基因片 段。在本优选实施方案中，可通过下面方法获得蛇麻素专一探针。

将开花大约15天后的球果分为主要含有蛇麻腺和小苞片基 (bracteole base)且蛇麻腺密集的部分(富蛇麻腺级分)和主要含有 托叶苞叶(stipular bract)且有极少量蛇麻腺的部分(贫蛇麻腺级分)。 从富蛇麻腺级分表达的一组基因中减去亦在贫蛇麻腺级分中表达的一组 基因，认为剩余的一组基因更可能是在蛇麻腺中特异表达的基因。

可通过现有方法从在富蛇麻腺级分中表达的一组基因中减去亦在贫 蛇麻腺中表达的基因，方便地例如根据附于Invitrogen的“减法试剂 盒(Subtractor Kit)”的方法。 (4)分离蛇麻素特异的cDNA

“蛇麻素特异cDNA”是指从在蛇麻腺中特异表达的基因衍生的cDNA。 使用蛇麻素专一探针筛选从富蛇麻素级分制备的cDNA库，可以分离蛇麻 素特异cDNA。可通过现有方法进行筛选，例如“使用DIG系统进行杂交 的使用指南”(Boehringer Mannheim，第37页(1995))中所述的方法， 并于此处作为参考。

蛇麻素特异探针的标记也可使用现有技术进行，例如，根据附于 “DIG-High Prime，”Boehringer Mannheim的方法。 (5)制备蛇麻基因组DNA

可通过现有方法制备蛇麻基因组DNA，例如“植物PCR实验方法 (Protocols for plant PCR experiment)”(Shu-jun Sha，54页，(1995)) 中所述的方法，并于此处作为参考。 (6)分离含有蛇麻素特异基因表达的调节区的核酸。

“含有蛇麻素特异基因表达的调节区的核酸”是指含有调节区域的 核酸，该区域包括在蛇麻腺中可特定行使功能的启动子。使用反向PCR (reverse PCR)以蛇麻素特异cDNA的DNA序列为探针，可根据现有方 法分离核酸，例如“植物PCR实验方法(Protocols for plant PCR experiment)”(Shu-jun Sha，69页，(1995))中所述的方法，并于此处 作为参考。 (7)DNA测序

可根据现有方法测定这样分离的DNA序列，例如根据附于“ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”(Perkin-Elmer) 的方法，并于此处作为参考。可检测这样确定的DNA序列与其它植物物 种的现存基因的同源性。 (8)Northern杂交检测(后面称为Northern检测)

以分离的蛇麻素特异基因为探针，通过Northern检测可以证实是否 分离的蛇麻素特异基因确实在蛇麻腺中特异表达以及分离的含能够调节 基因的蛇麻素特异表达的调节区的核酸是否确实在蛇麻腺中特异的起作 用。可根据现有方法进行Northern检测，例如基于“非同位素实验DIG 杂交方法(Protocols for non-isotope experiments-DIG hybridization)”(Shu-Jun Sha，45页，(1994))和“使用DIG系统进 行杂交的使用指南(User’s guide for performing the hybridization using DIG system)”(Boehringer Mannheim，40页(1995))中所述的 方法，均并于此处作为参考。 2．制备携带上述分离的蛇麻素特异基因或蛇麻素特异表达调节序列的 载体

根据现有技术，通过将基因插入到携带表达调节序列的适当载体中 的表达调节序列的下游和随后将转化的载体转移到合适的细胞，可以表 达如上所述证实了在蛇麻腺中的特异性的蛇麻素特异基因。对于携带表 达调节序列的载体类型没有限制，可以使用下面所述的携带蛇麻素特异 表达调节序列的载体和市售的表达载体(例如，pBI121(CLONTECH))。

也可以根据目的从现存质粒中选择合适的载体并插入上述表达调节 序列例如序列7，来类似的构建携带蛇麻素特异表达调节序列的载体。这 种情况下，可任选的在表达调节序列的下游包括含有用于连接结构基因 的多种限制性位点的克隆区。 3．应用

由于在蛇麻腺中大量分泌了次级代谢产物，上面分离的蛇麻素特异 基因很可能是与次级代谢产物的生物合成有关的基因。因此，将上述获 得基因应用于转化技术和标记协助选择可以使例如基于蛇麻腺中形成的 次级代谢产物的改进的蛇麻育种能够进行。对于上述的转化技术，可以 使用熟知的方法。

已经概括描述了本发明，参考此处提供的一些特定实施例可以得到 进一步理解，除非另外说明，实施例的目的仅是为了说明而不是为了限 制本发明的范围。

实施例 实施例1：制备富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分

开花15天后收获蛇麻球果，在液氮中冷冻。在干冰中解剖这些冷冻 球果，并使用解剖钳分为主要含有蛇麻腺和内囊基(endocyte base)的 有密集蛇麻腺的级分和主要含有内囊(endocyst)的有少量蛇麻腺的级 分。这些级分分别称为富蛇麻腺级分和贫蛇麻腺级分，并贮存于-80℃。 实施例2：从富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分制备总RNA和mRNA

如下制备了富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分的总RNA和mRNA。将各级 分在液氮中冷冻和研成粉末，悬浮于2％CATB溶液(由2％十六烷基三甲 基溴化铵，0．1M Tris(pH 9．5)，20 mM EDTA，1．4M NaCl和1％β-巯 基乙醇组成)，在65℃温育30分钟。用氯仿／异戊醇(24:1)将悬浮液 提取两次后，向提取液中加入四分之三体积的异丙醇以沉淀DNA和RNA。 将沉淀的DNA和RNA溶解于水，加入1／3体积的10M氯化锂，将混合液 在-20℃放置过夜，然后在15，000 rpm离心10分钟。用70％乙醇洗涤获 得的沉淀并溶于DNA酶反应缓冲液(含有100mM乙酸钠(pH5．2)和5mM 氯化镁)。向混合物中加入DNA酶，将产生的混合物在37℃温育以降解 DNA。向温育混合液加入1／3体积10M氯化锂，将混合物在-20℃放置过 夜，然后在15，000rpm离心10分钟。将获得的沉淀溶于水，通过酚-氯 仿的抽提纯化产生的溶液，并用乙醇沉淀。将获得的沉淀溶于水用作总 RNA制备物，使用“Oligotex-dT30”(Takara-Shuzo)按照所附 的方法从中制备mRNA。 实施例3：制备蛇麻素特异性探针

此处，通过从富蛇麻素级分的mRNA中减去亦在贫蛇麻素级分中存在 的mRNA制备蛇麻素专一性探针。更具体的，使用“减法试剂盒(Subtractor Kit)”按照试剂盒所附的方法制备蛇麻素专一性探针。

首先，从富蛇麻素级分的mRNA合成cDNA。同时，用生物素标记贫 蛇麻素级分中的mRNA。然后，将制备的富蛇麻素级分的cDNA与贫蛇麻素 级分的生物素化mRNA混合形成杂交体，然后加入链霉亲和素与杂交体上 的生物素化mRNA结合。然后通过用酚-氯仿抽提杂交体除去了生物素化 mRNA，导致从富蛇麻素级分的cDNA中删除了亦在贫蛇麻素中存在的从 mRNA衍生的cDNA。结果是，获得了只从富蛇麻素中衍生的cDNA，用作探 针。然后使用“DIG-High Prime”(Boehringer Mannheim)用地高辛配基 标记了获得的蛇麻素专一性探针。 实施例4：分离蛇麻素特异性cDNA

使用“cDNA合成组件(cDNA sythesis module)”、“cDNA快速衔接 子连接组件(cDNA rapid adaptor ligation module)”和“cDNA快速 克隆组件-MOSSlox(cDNA rapid cloning module-MOSSlox)”(Amersham) 以及-MOSSlox作为载体的“GIGAPACK Ⅱ包装提取物(GIGAPACK Ⅱ packaging Extract)”(Stratogene)，从富蛇麻素中的mRNA制备了cDNA 库。使用地高辛配基标记的蛇麻素专一性探针通过杂交方法筛选了此库。

更具体的，将从上述cDNA库衍生的各蚀斑转移到滤膜上，并在杂交 缓冲液中(含有5×SSC，100mM磷酸盐缓冲液，7％SDS，2％封闭试剂， 0．1％N-月桂酰肌氨酸，50％甲酰氨和50g／ml鱼精DNA)封闭。然后，向 杂交缓冲液中加入上述探针，将膜在产生的缓冲液中42℃温育过夜。在 56℃用清洗溶液(含有1％SDS和2×SSC)5分钟洗膜两次，进一步在68℃ 用清洗溶液(含有0．1％SDS和0．1×SSC)5分钟洗膜两次。然后，通过检 测阳性蚀斑，分离蛇麻素专一性cDNA。 实施例5：测定蛇麻素专一性cDNA的DNA序列及翻译产物的氨基酸序列

然后测定了含有蛇麻素专一性cDNA和蛇麻素专一性启动子的基因 片段的DNA序列。测序时，将各基因片段亚克隆到pUC载体或pBluescript 载体。使用“ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”在DNA测序仪(ABI373S model)(Perkin-Elmer)上进行了测序。

这样测定的蛇麻素专一性cDNA的DNA序列示于序列2。从DNA序列 推定的翻译产物的氨基酸序列示于序列1。这样，序列1的氨基酸序列对 应序列2中从位置36-38的起始密码子(ATG)至位置1218-1220的终止 密码子(TAA)的DNA序列。 实施例6：制备蛇麻基因组DNA

如下制备了蛇麻基因组DNA。将蛇麻的叶和球果在液氮中冷冻和研 成粉末，悬浮于2％CATB溶液(含有2％十六烷基三甲基溴化铵，0．1M Tris (pH 9．5)，20 mM EDTA，1．4M NaCl和1％β-巯基乙醇)，在65℃温育 30分钟。用氯仿／异戊醇(24:1)将悬浮液提取两次后，向提取液中加入 3／4体积的异丙醇以沉淀DNA和RNA。将沉淀的DNA和RNA溶解于高盐 TE缓冲液(含1M氯化钠，10mM Tris(pH8．0)和1 mM EDTA)，加入RNA 酶，将产生的混合物在60℃温育以降解RNA。向反应混合液中加入2体 积异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇清洗，然后溶于水获得基因组DNA样品。 实施例7：分离蛇麻素特异基因的表达调节序列。

使用如下的反向(inverse)PCR方法分离了蛇麻素特异基因的表达 调节序列。图1的表是实施例7的流程。

首先，用限制性酶Xho I(S1和S2)消化实施例6中获得的蛇麻基 因组DNA。依据 DNA 连接试剂盒版本1(DNA Ligation Kit Ver．l)” (Takara-Shuzo)所附的方法将Xho Ⅰ消化物自环化。

随后，使用具有蛇麻素特异eDNA中的序列的引物，以这种连接反应 混合液的一部分为模板(S4)，通过PCR扩增了含有蛇麻素特异基因启动 子的侧翼区。此处使用的成对引物的序列示于序列3(引物1)和序列4 (引物2)。这里，序列3是与序列2的位置137至166的序列互补的序 列，序列4的序列是序列2的位置303至332的序列。

上述PCR是使用“扩展高可信度PCR系统(Expand Hig-Fidelity PCR System)”按照所附的方法进行的，以参考文献并于此处。反应条件如下： 在94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和68℃ 4分钟温育30个循环后，将混合液 在72℃再温育6分钟。

将获得的反应溶液电泳以鉴定PCR产物。由于除了扩增片段1之外， 在上述PCR产物中可能含有非特异性扩增片段，使用不同的引物(S5) 进一步尝试了仅对所需片段的选择性扩增。也就是说，为了只选择性扩 增含蛇麻素特异性启动子的片段，使用引物3(序列5)和上述引物2(S6) 以部分上述PCR溶液为模板进行了PCR，引物3(序列5)与比引物1在 蛇麻素特异基因更上游的序列互补。引物3(序列5)含有与蛇麻素特异 cDNA(序列2)的位置114至143的序列互补的序列。使用与上述相同的条 件和装置进行PCR。然后，将使用引物2和3获得的PCR-扩增片段进行 了DNA测序。 实施例8：蛇麻素特异基因的表达调节序列的DNA序列测定

类似上面实施例5所述，通过将扩增片段亚克隆到pUC载体或 pBluescript载体，使用ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit在DNA测序仪(ABI373S model)(Perkin-Elmer)对上述 扩增片段2上进行了碱基序列测定。结果示于序列6。

由于这种扩增片段是通反向PCR方法获得的，预期扩增片段含有如 蛇麻素特异基因中的启动子(其部分)的表达调节序列。因而，为了鉴 定该表达调节序列，将扩增的DNA片段与蛇麻素特异性cDNA的DNA序列 进行了比较。比较揭示扩增的DNA片段(序列6)含有蛇麻素特异cDNA 中启动子序列。更具体的，序列6的位置1-690的序列对应蛇麻素特异 cDNA(序列2)的位置303-992的序列，序列6的位置3296-3438的序 列对应蛇麻素特异cDNA(序列2)的位置1-143的序列。因此，这样表 明了表达调节序列，诸如蛇麻素特异基因的启动子包括在序列6的 691-3295的区域位置，示于序列7。 实施例9：蛇麻素特异cDNA和蛇麻素特异基因的表达调节序列的Northern印迹检测。

使用实施例5中的基于蛇麻素特异cDNA(序列2)制备的标记DNA， 通过Northern印迹检测对从富蛇麻素和贫蛇麻素级分中提取的总RNA测 定了是否上述蛇麻素特异cDNA在蛇麻腺中确实表达以及是否上述蛇麻素 特异基因的启动子确实在蛇麻腺中起作用。

首先，通过类似实施例2的方法从富蛇麻素和贫蛇麻素级分制备了 总RNA，并通过变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖，18％甲醛，20mM MOPS， 5mM乙酸钠和1mM EDTA(pH7))分级分离。将在琼脂糖凝胶上分级分离 的RNA转移到尼龙膜，并按照DIG系统杂交使用指南 (Boehringer-Mannheim，40页(1995))以上述得到的cDNA为探针进 行杂交，以参考文献并于此处。

在下面条件下进行杂交。使用如实施例4中相同成分的杂交缓冲液 封闭上述膜。向上述杂交缓冲液加入用地高辛配基标记的蛇麻素特异 cDNA作为探针，将封闭的膜浸入混合液，并50℃温育过夜。然后，用清 洗液(含1％SDS和2×SSC)在56℃10分钟洗涤膜两次，再用清洗液(含 0．1％SDS和0．1×SSC)在68℃30分钟洗涤膜两次，然后寻找与探针融合 的带。图2图示结果。

如图2所示，虽然有些上面获得的基因的mRNA亦在贫蛇麻素级分中 存在，它们明显的在富蛇麻素级分中的量更大，表明该基因在蛇麻腺中 有强烈表达。该基因的表达是受含有表达调节区域的核酸控制的，该区 域含有在基因组DNA中位于结构基因上游的启动子，并且含有表达调节 区域的核酸是上述实施例中分离和鉴定的序列，表明上述分离的含表达 调节区域的核酸在蛇麻腺中有特异的强功能。认为在低分子量一侧检测 到的信号带是上述获得的基因的mRNA的降解产物。

实施例10：同源性检查

将获得的蛇麻素特异cDNA的DNA序列衍生的推定的氨基酸序列与现 存氨基酸序列进行同源性比较。结果是，该基因与相关植物类黄酮生物 合成的催化柚配基(nalingenin)合成的查耳酮合成酶的基因有高同源 性。更具体的，与来自其它植物诸如拟南芥(Plant J．，8(5)， 659-671(1995))、大麦(Plant Mol．Biol．16：1103-1106(1991))、豌豆 (EMBL／GenBank／DDBJ databases X80007)、矮牵牛(J．Biotechnol．， 11(2)，131-135(1995))和黑麦(EMBL／GenBank／DDBJ databases X92547) 的查耳酮合成酶相比，该蛇麻酶在DNA水平显示65-70％同源性并在氨基 酸水平显示70-75％同源性。

最近，已经查明查耳酮合成酶可能具有戊酰苯合成酶活性，能够催 化苦味物质，α-酸和β-酸的前体，根皮异戊酰苯 (phlorisovalerophenone)和根皮异丁酰苯(phlorisobutyrophenone) (欧洲酿造大会，26届会议的会议录，第215页(1997))，表明上述获 得的基因的翻译产物可能如戊酰苯合成酶参与苦味物质的生物合成。

因而，如果该蛇麻腺中特异表达的基因编码查耳酮合成酶，该核酸 可用于增进植物中的类黄酮。并且，如果该基因编码戊酰苯合成酶，该 核酸可用于增进蛇麻中的苦味物质。另外，由于蛇麻苦味物质，α-酸和 β-酸，具有医学活性(Biosci．Biotech．Biochem．61(1)，158(1997))， 可能将上述核酸用于药物产品。

工业应用

如上所述，含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因的核酸可以通过 集中于蛇麻腺中表达的次级代谢产物的遗传工程技术进行蛇麻育种。并 且，在使用携带上述蛇麻素特异基因的载体时，期望可以在植物体外诸 如培养细胞中获得次级代谢产物的产生。由于这类次级代谢产物包括重 要的原料诸如食物和药物，并且由于查耳酮合成酶参与类黄酮的生物合 成以及戊酰苯合成酶参与苦味物质的生物合成，预期本发明可大大有益 于开发和改进食物和药物原料。

另外，本发明的蛇麻素特异性启动子可通过将感兴趣基因插入到启 动子下游来增进次级代谢产物诸如蛇麻腺中积累的精油成分和苦味物 质。该启动子也可用于向蛇麻引入其它新特征。

明显的，按照上述教导，本发明可以进行多种修改和变化。应当理 解在附的权利要求范围内，可不同于此处的具体描述实施本发明。

                      本发明的背景

本申请基于1998年2月19日提交的日本专利申请号Hei 10-37266 和1998年6月22日提交的日本专利申请号Hei 10-174235，两者均完 整并入本发明作为参考。

序列表 (1)一般资料： (ⅰ)申请人

(A)名字：SAPPORO BREWERIES LTD。

(B)街道：20-1，Ebisu-4chome

(C)城市：Shibuya-ku

(D)州：TOKYO

(E)国家：日本

(F)邮编：450-8686 (ⅱ)发明题目

分离和纯化的含有一个基因及该基因的基因表达的调节区域的核酸 (ⅲ)序列数目：7 (ⅳ)通讯地址

(A)联系：YOSHIDA Kenji

(B)街道：34-12，Kichijoji-honcho 1-chome

(C)城市：Musashino-shi

(D)州：TOKYO

(E)国家：日本

(F)邮编：180-0004 (ⅴ)计算机可读形式

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：ZBM P兼容机

(C)操作系统：WINDOWS 95

(D)软件：Microsoft Word(文本) (ⅵ)目前申请资料

(A)申请号：未知

(B)提交时间：1999年2月16日 (ⅶ)在先申请资料

(A)申请号

日本专利申请号Hei 10-37266和

日本专利申请号Hei 10-174235

(B)提交时间：1998年2月19日和1998年6月22日 (ⅷ)律师／代理人资料

(A)名字：YOSHIDA Kenji

(B)注册号：7525

(C)参考号：1TP1-0043 (ⅸ)电信资料

(A)电话：0422-21-2501

(B)电传：0422-21-2431 (2)序列1资料 (ⅰ)序列特征

(A)序列长度：394

(B)类型：氨基酸 (ⅱ)序列描述：序列1 1                          10                             20 MetAlaSerValThrValGluGlnIleArgLysAlaGlnArgAlaGluGlyProAlaThr

                       30                             40 IleLeuAlaIleGlyThrAlaValProAlaAsnCysPheAsnGlnAlaAspPheProAsp

                       50                             60 TyrTyrPheArgValThrLysSerGluHisMetThrAspLeuLysLysLysPheGlnArg

                      70                             80 MetCysGluLysSerThrIleLysLysArgTyrLeuHisLeuThrGluGluHisLeuLys

                      90                            100 GlnAsnProHisLeuCysGluTyrAsnAlaProSerLeuAsnThrArgGlnAspMetLeu

                     110                            120 ValValGluValProLysLeuGlyLysGluAlaAlaIleAsnAlaIleLysGluTrpGly

                     130                            140 GlnProLysSerLysIleThrHisLeuIlePheCysThrGlySerSerIleAspMetPro

                     150                            160 GlyAlaAspTyrGlnCysAlaLysLeuLeuGlyLeuArgProSerValLysArgValMet

                     170                            180 LeuTyrGlnLeuGlyCysTyrAlaGlyGlyLysValLeuArgIleAlaLysAspIleAla

                     190                            200 GluAsnAsnLysGlyAlaArgValLeuIleValCysSerGluIleThrAlaCysIlePhe

                     210                            220 ArgGlyProSerGluLysHisLeuAspCysLeuValGlyGlnSerLeuPheGlyAspGly

                     230                            240 AlaSerSerValIleValGlyAlaAspProAspAlaSerValGlyGluArgProIlePhe

                     250                            260 GluLeuValSerAlaAlaGlnThrIleLeuProAsnSerAspGlyAlaIleAlaGlyHis

                     270                            280 ValThrGluAlaGlyLeuThrPheHisLeuLeuArgAspValProGlyLeuIleSerGln

                     290                            300 AsnIleGluLysSerLeuIleGluAlaPheThrProIleGlyIleAsnAspTrpAsnAsn

                     310                            320 IlePheTrpIleAlaHisProGlyGlyProAlaIleLeuAspGluIleGluAlaLysLeu

                     330                            340 GluLeuLysLysGluLysMetLysAlaSerArgGluMetLeuSerGluTyrGlyAsnMet

                     350                            360 SerCysAlaSerValPhePhelleValAspGluMetArgLysGlnSerSerLysGluGly

                     370                            380 LysSerThrThrGlyAspGlyLeuGluTrpGlyAlaLeuPheGlyPheGlyProGlyLeu

                     390           394 ThrValGluThrValValLeuHisSerValProThrAsnVal (3)序列2资料 (ⅰ)序列特征

(A)长度：1359

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅹⅰ)序列描述：序列2 TTTCACAGTA CTACTAGCTA TATATATATC AGGTAATGGC GTCCGTAACT GTAGAGCAAA  60 TCCGAAAGGC TCAGCGAGCT GAAGGTCCGG CCACCATCCT CGCCATTGGC ACCGCCGTTC  120 CTGCCAACTG TTTCAACCAA GCTGATTTTC CCGACTACTA CTTTCGTGTC ACCAAAAGTG  180 AACACATGAC TGATCTCAAA AAGAAGTTCC AACGAATGTG TGAAAAATCC ACTATAAAAA  240 AGCGTTACTT GCACTTGACC GAAGAGCATC TGAAGCAGAA CCCACATCTG TGCGAGTACA  300 ATGCACCATC TCTGAACACA CGCCAAGACA TGTTGGTGGT TGAAGTTCCC AAGCTTGGGA  360 AGGAGGCTGC AATCAATGCC ATCAAAGAAT GGGGCCAACC CAAGTCCAAG ATCACCCATC  420 TCATCTTCTG CACCGGCTCC TCCATCGACA TGCCAGGAGC CGATTACCAA TGCGCCAAGC  480 TTCTCGGCCT CCGACCCTCG GTGAAGCGAG TGATGCTGTA TCAACTCGGC TGTTATGCCG  540 GTGGAAAAGT TCTTCGCATA GCCAAGGACA TAGCAGAGAA CAACAAGGGC GCTAGAGTTC  600 TCATTGTGTG CTCTGAGATC ACAGCTTGTA TCTTTCGCGG GCCCTCGGAG AAACATTTGG  660 ATTGCTTGGT GGGGCAATCT CTGTTCGGAG ACGGGGCATC TTCGGTCATC GTTGGTGCCG  720 ACCCTGATGC CTCGGTAGGC GAGCGGCCGA TCTTCGAGTT GGTTTCAGCT GCGCAGACGA  780 TTTTGCCTAA CTCGGATGGA GCCATAGCCG GGCACGTAAC GGAAGCCGGG CTGACATTTC  840 ACTTGCTGAG GGACGTGCCA GGGTTGATCT CCCAAAACAT TGAGAAGAGC TTGATTGAGG  900 CCTTCACTCC GATTGGGATT AATGACTGGA ACAACATATT CTGGATTGCA CATCCCGGTG  960 GACCTGCCAT TCTGGACGAG ATAGAGGCCA AGCTCGAGCT GAAGAAGGAG AAGATGAAGG  1020 CGTCTCGTGA AATGCTGAGC GAGTATGGGA ACATGTCATG TGCAAGCGTT TTCTTCATAG  1080 TAGATGAGAT GAGGAAACAG TCGTCGAAGG AAGGGAAGTC TACCACCGGA GATGGACTGG  1140 AGTGGGGCGC TCTCTTCGGG TTTGGACCGG GTCTGACGGT GGAGACGGTG GTCTTGCACA  1200 GCGTGCCCAC AAACGTCTAA TGAATAATTT GTTATCGCTA GCTTGTCAAA TCAAGCTTTA  1260 CTATGTATTG TGGTCGTTAA TTAGTTTATA CTTTGATGTT GATCAATAAT TATATACCTC  1320 ATCTAATAAA ATGATCAAAT ATATTTTTAT ATAAAAAAA                         1359 (4)序列3资料 (ⅰ)序列特征

(A)长度：31

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：其它核酸 (ⅹⅰ)序列描述：序列3 CGAAAGTAGT AGTCGGGAAAATCAGCTTGG    30 (5)序列4资料 (ⅰ)序列特征

(A)长度：30

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：其它核酸 (ⅹⅰ)序列描述：序列4 GCACCATCTC TGAACACACG CCAAGACATG    30 (6)序列5资料

(ⅰ)序列特征

(A)长度：30

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：其它核酸 (ⅹⅰ)序列描述：序列5 AGCTTGGTTG AAACAGTTGG CAGGAACGGC    30 (7)序列6资料 (ⅰ)序列特征

(A)长度：3439

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：基因组DNA (ⅹⅰ)序列描述：序列6 GCACCATCTC TGAACACACG CCAAGACATG TTGGTGGTTG AAGTTCCCAA GCTTGGGAAG  60 GAGGCTGCAA TCAATGCCAT CAAAGAATGG GGCCAACCCA AGTCCAAGAT CACCCATCTC  120 ATCTTCTGCA CCGGCTCCTC CATCGACATG CCAGGAGCCG ATTACCAATG CGCCAAGCTT  180 CTCGGCCTCC GACCCTCGGT GAAGCGAGTG ATGCTGTATC AACTCGGCTG TTATGCCGGT  240 GGAAAAGTTC TTCGCATAGC CAAGGACATA GCAGAGAACA ACAAGGGCGC TAGAGTTCTC  300 ATTGTGTGCT CTGAGATCAC AGCTTGTATC TTTCGCGGGC CCTCGGAGAA ACATTTGGAT  360 TGCTTGGTGG GGCAATCTCT GTTCGGAGAC GGGGCATCTT CGGTCATCGT TGGTGCCGAC  420 CCTGATGCCT CGGTAGGCGA GCGGCCGATC TTCGAGTTGG TTTCAGCTGC GCAGACGATT  480 TTGCCTAACT CGGATGGAGC CATAGCCGGG CACGTAACGG AAGCCGGGCT GACATTTCAC  540 TTGCTGAGGG ACGTGCCAGG GTTGATCTCC CAAAACATTG AGAAGAGCTT GATTGAGGCC  600 TTCACTCCGA TTGGGATTAA TGACTGGAAC AACATATTCT GGATTGCACA TCCCGGTGGA  660 CCTGCCATTC TGGACGAGAT AGAGGCCAAG CTCGAGGAGT TTGGAGACTG TCCGAGGTCC  720 TTCTCCTAGG GTGATCACCA GCTCGATAGT CCCTATAGCC GTTGATCCTT CTCCCGAAAA  780 ACCGCACAGC ATCATGGAGG TCGCCTTCAG CTCGGCGACA GTCAAACCCA TCTTCTCCAA  840 CGTGGACCGG AATAGAAGGT TTACCGAGCT CCCATTATCG ATCAACACCC TCCTAACCCT  900 CCGAATAGCG AGCTGAACTG CTACGACCAG AGGGTCGTTA TGAGGGAACT GGACATGGCC  960 CGCATCTTCT TCTGTAAAAA TGATCGGTTG CCTCTCCAAT CGCTGCTGCT TTGGCAGACG  1020 CTGCTCCGGG ACGAACTCTA CTCCATTATG CGCCTTGAGT TCGTTTACGT ATCTCTTTTG  1080 GGCACCCCTA CTCACGCTAG CTAAATGCGG ACCTCCAGAG ATTGTGGATA TCTCTCCTCC  1140 AATCACTGGA GGAGGGACGT CTTGATCTAT CCGAGACCCA GAAATCTATA CAAAAAAAAA  1200 ACTATGTATA AGGTTCATAA ACACATTATA TTCATTAATT TAACCTTAAA ATTAAAAAAA  1260 ATGAAAAAAA CTCACCAAAA TTGGTCTAGG AAGTCGGAGA CGCCGCTAGT TCTTGGGAGA  1320 AAACCTAAGT TTTGAATTTG GGAGAATGAA GGGCTTGGGG TCGATGGCTG AGATTTAATA  1380 CTGGGTGCAC TGTTTGCGTT AGTGGGCAAC TGACGCTAAC GGCTTGTTTG CATCAGTGCC 1440 AAACTGACGC AAACACACCG TTAGCGTTAG TTGCCCACTG ACGCAAACGG TGCATTAAGA 1500 GCATCAGTTG GCCACTGACG CAAACTTCAC CAATTAACAG TGTCAGTGTT ATCACTGATG 1560 CAAATGCCCC TGAATTTGTG GTAGTACTCA ACTTCCACAA ATGCTGATTC TCGGTCAACG 1620 GCGTCAGTCA ACTGTGTTGA GTGACGCGTT TGACTGACAC AAAATAAGTA TTTTGGTGTA 1680 GTGGAAGATT AACTAAGAAG GTAAAATTGG AGGTTATTGT TATCACTCCT TCATCATTTA 1740 TAAAAGTAGA AATACGTTCC ATTTAATATA CTAACCAACC TTGCTGCCAC ATATCCCCTG 1800 AAAAAAATAA AACAACAACA ACCTTTCTAC CATAAAATTA GGCATATGAT GATATATAAC 1860 CTAACTATAA CACAAAATTA GGCATATGAT GATATATATA ACCTAACTAT AACACAAAAT 1920 TAGGCATATA TATATACACT CACAAATAGT GGCTGCTATA CCCAACACCT TAATTAATTA 1980 ATAGTTAATG CTCCTCTAGA AGACTGGACG AGATCAAGTG CTATTATGCG GAATCAAGAT 2040 CTCCTATCAA AAAAAGATGT CCCAGCCTAT GTTTAGAAAA TGTTAAATCA AATTCTGTTA 2100 ACTAATTTCT ATATTTCTCA TCCCTACTCC TTTTTTTTTA ACAATCAACA ATTCATTGAA 2160 AATAATCAAA ATGTAATACA ACTAATAATA AGATGATATA TATAGTAACT ATCCATACAA 2220 GTTCATTATC CACTCTAAGT GCATGCACAA TTCATGAACG GCCTTATTGG CCAAACGTCA 2280 AACACAAATT AGAGATACCT TAGAAAAATT GGATAATAAA CTTGTTATAT TTTCTAACAA 2340 AGACCCTAAT TCATTACTAC TCCATTAAAT GACGTGTATC TTTCATTTTT TTTTAAAAAT 2400 TTTAGAAACT AATAGAGTAT GGATTGATGC TGCATTATAA GAAATCGATC ACACCTTCAG 2460 TTATGAACTT TCCGGCTAAG CACCATCGGG CATCTATGTC CTCCTCTTTT GCCACATTAT 2520 CATATGAAAT ACCACTGTTT TCCTCCTCTT CCAAGCTTAT GGTCAAGACC GGCCCTGAAC 2580 TAAGGTGGGT TAGACCCACG CCTAGGGCCT ATTTTTTTTT ACATTTCTTT TAAAAATACT 2640 ATAAATTTTT AAAAAGTTTT TACAAAAAGG GCCCCTAATC ACCAATTTTT CCTAAGGCTC 2700 AAAACTCTTC AGGGCCAGCC CTGCCTATGG TAGCATATCT AGATTCTAAA TCTTGCTTAT 2760 GAGAACTGCT CGATGCCATA ACTTCCTTCG CCACCAAGAC TAATAACACA AACAATAGAG 2820 AACGAACACA CCAATAGCAA TACAAAACAC CTTACGTCAA CTGACCCAAC AGAGAGCTAC 2880 CATGTCAAAA GACAATACTA GTTTGAGACT TCACCACTGT CAAAATTCTA GTTCTCAACA 2940 CTAGCAAAAA AAAAAGTGTT AAACACCATC AATCACATAA CGACATACTT CTTGGCCATA 3000 TTTTTTTTCC CATGTAATCA TGTAAAAGGT GGGGAAAATA AATCAATACA CATAAAGAAC 3060 AATGAAAAAA TAAATAAACA AGTCAAATTA TTATAATTTA ACATTAATAA AAAGTTGAGA 3120 ATCACAAACA TTGGTACGTA GGTATTAGGG TTGGTGTTTA CACATATTAT CCATAGGCCA 3180 TGCACACCTT ACCTAACCCA TGCACCACTT TGTACATATT ATATATATAA CTCCAATTTG 3240 GCTTTGCATT TCAACACTTG TAATCATTAC ACTATATTTG TGTATATAGT GTAAGTTTTC 3300 ACAGTACTAC TAGCTATATA TATATCAGGT AATGGCGTCC GTAACTGTAG AGCAAATCCG 3360 AAAGGCTCAG CGAGCTGAAG GTCCGGCCAC CATCCTCGCC ATTGGCACCG CCGTTCCTGC 3420 CAACTGTTTC AACCAAGCT                                              3439 (8)序列7资料 (ⅰ)序列特征

(A)长度：2606

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线性 (ⅱ)分子类型：基因组DNA (ⅹⅰ)序列描述：序列7 CTCGAGGAGT TTGGAGACTG TCCGAGGTCC TTCTCCTAGG GTGATCACCA GCTCGATAGT  60 CCCTATAGCC GTTGATCCTT CTCCCGAAAA ACCGCACAGC ATCATGGAGG TCGCCTTCAG  120 CTCGGCGACA GTCAAACCCA TCTTCTCCAA CGTGGACCGG AATAGAAGGT TTACCGAGCT  180 CCCATTATCG ATCAACACCC TCCTAACCCT CCGAATAGCG AGCTGAACTG CTACGACCAG  240 AGGGTCGTTA TGAGGGAACT GGACATGGCC CGCATCTTCT TCTGTAAAAA TGATCGGTTG  300 CCTCTCCAAT CGCTGCTGCT TTGGCAGACG CTGCTCCGGG ACGAACTCTA CTCCATTATG  360 CGCCTTGAGT TCGTTTACGT ATCTCTTTTG GGCACCCCTA CTCACGCTAG CTAAATGCGG  420 ACCTCCAGAG ATTGTGGATA TCTCTCCTCC AATCACTGGA GGAGGGACGT CTTGATCTAT  480 CCGAGACCCA GAAATCTATA CAAAAAAAAA ACTATGTATA AGGTTCATAA ACACATTATA  540 TTCATTAATT TAACCTTAAA ATTAAAAAAA ATGAAAAAAA CTCACCAAAA TTGGTCTAGG  600 AAGTCGGAGA CGCCGCTAGT TCTTGGGAGA AAACCTAAGT TTTGAATTTG GGAGAATGAA  660 GGGCTTGGGG TCGATGGCTG AGATTTAATA CTGGGTGCAC TGTTTGCGTT AGTGGGCAAC  720 TGACGCTAAC GGCTTGTTTG CATCAGTGCC AAACTGACGC AAACACACCG TAGCGTTAG   780 TTGCCCACTG ACGCAAACGG TGCATTAAGA GCATCAGTTG GCCACTGACG CAAACTTCAC  840 CAATTAACAG TGTCAGTGTT ATCACTGATG CAAATGCCCC TGAATTTGTG GTAGTACTCA  900 ACTTCCACAA ATGCTGATTC TCGGTCAACG GCGTCAGTCA ACTGTGTTGA GTGACGCGTT  960 TGACTGACAC AAAATAAGTA TTTTGGTGTA GTGGAAGATT AACTAAGAAG GTAAAATTGG  1020 AGGTTATTGT TATCACTCCT TCATCATTTA TAAAAGTAGA AATACGTTCC ATTTAATATA  1080 CTAACCAACC TTGCTGCCAC ATATCCCCTG AAAAAAATAA AACAACAACA ACCTTTCTAC  1140 CATAAAATTA GGCATATGAT GATATATAAC CTAACTATAA CACAAAATTA GGCATATGAT  l200 GATATATATA ACCTAACTAT AACACAAAAT TAGGCATATA TATATACACT CACAAATAGT  1260 GGCTGCTATA CCCAACACCT TAATTAATTA ATAGTTAATG CTCCTCTAGA AGACTGGACG  1320 AGATCAAGTG CTATTATGCG GAATCAAGAT CTCCTATCAA AAAAAGATGT CCCAGCCTAT  1380 GTTTAGAAAA TGTTAAATCA AATTCTGTTA ACTAATTTCT ATATTTCTCA TCCCTACTCC  1440 TTTTTTTTTA ACAATCAACA ATTCATTGAA AATAATCAAA ATGTAATACA ACTAATAATA  1500 AGATGATATA TATAGTAACT ATCCATACAA GTTCATTATC CACTCTAAGT GCATGCACAA  1560 TTCATGAACG GCCTTATTGG CCAAACGTCA AACACAAATT AGAGATACCT TAGAAAAATT  1620 GGATAATAAA CTTGTTATAT TTTCTAACAA AGACCCTAAT TCATTACTAC TCCATTAAAT  1680 GACGTGTATC TTTCATTTTT TTTTAAAAAT TTTAGAAACT AATAGAGTAT GGATTGATGC  1740 TGCATTATAA GAAATCGATC ACACCTTCAG TTATGAACTT TCCGGCTAAG CACCATCGGG 1800 CATCTATGTC CTCCTCTTTT GCCACATTAT CATATGAAAT ACCACTGTTT TCCTCCTCTT 1860 CCAAGCTTAT GGTCAAGACC GGCCCTGAAC TAAGGTGGGT TAGACCCACG CCTAGGGCCT 1920 ATTTTTTTTT ACATTTCTTT TAAAAATACT ATAAATTTTT AAAAAGTTTT TACAAAAAGG 1980 GCCCCTAATC ACCAATTTTT CCTAAGGCTC AAAACTCTTC AGGGCCAGCC CTGCCTATGG 2040 TAGCATATCT AGATTCTAAA TCTTGCTTAT GAGAACTGCT CGATGCCATA ACTTCCTTCG 2100 CCACCAAGAC TAATAACACA AACAATAGAG AACGAACACA CCAATAGCAA TACAAAACAC 2160 CTTACGTCAA CTGACCCAAC AGAGAGCTAC CATGTCAAAA GACAATACTA GTTTGAGACT 2220 TCACCACTGT CAAAATTCTA GTTCTCAACA CTAGCAAAAA AAAAAGTGTT AAACACCATC 2280 AATCACATAA CGACATACTT CTTGGCCATA TTTTTTTTCC CATGTAATCA TGTAAAAGGT 2340 GGGGAAAATA AATCAATACA CATAAAGAAC AATGAAAAAA TAAATAAACA AGTCAAATTA 2400 TTATAATTTA ACATTAATAA AAAGTTGAGA ATCACAAACA TTGGTACGTA GGTATTAGGG 2460 TTGGTGTTTA CACATATTAT CCATAGGCCA TGCACACCTT ACCTAACCCA TGCACCACTT 2520 TGTACATATT ATATATATAA CTCCAATTTG GCTTTGCATT TCAACACTTG TAATCATTAC 2580 ACTATATTTG TGTATATAGT GTAAGT