高产虾青素的菌株及其应用
阅读：493发布：2020-05-20
专利汇可以提供高产虾青素的菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 工程 领域，特别涉及高产虾青素的菌株及其应用。本发明对酿酒 酵母 生产虾青素菌株同时进行两种诱变的方法相对于现有单一诱变技术产生更多种类的突变，从突变产生的大量文库中可以筛选到虾青素产量显著提高的酵母菌株。，下面是高产虾青素的菌株及其应用专利的具体信息内容。
1.菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.17267。
2.如权利要求1所述的菌株在提高其代谢产物的产量中的应用；所述代谢产物包括初级代谢产物和次级代谢产物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述代谢产物为虾青素。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述菌株为酵母菌。
5.如权利要求1所述菌株的构建方法，其特征在于，构建整合有香叶基香叶基焦磷酸合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtYB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ和β-胡萝卜素酮化酶基因crtW的菌株，经等离子体诱变、SCRaMbLE诱变。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述菌株为酵母菌，基因crtE、crtYB和crtI以Leu为标签整合至合成型V号染色体，基因crtZ和crtW以His为标签整合至delta位点。
7.虾青素的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.17267的菌株接种于培养基中，发酵培养，收集发酵液。
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基；所述种子培养基包括40/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮源、2g/L氨基酸省缺混合粉末；所述发酵培养基包括40/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。
9.如权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养具体为：挑取所述菌株接种于种子培养基中，在30℃、250rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养。
高产虾青素的菌株及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 虾青素是一种天然的类胡萝卜素，具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫、预防心血管疾病等功能，在食品、医药、化妆品行业有极大的市场价值(如图1 所示)。虾青素通过猝灭单线态、清除氧氧自由基防止链式反应、抑制脂质过氧化来保护膜结构，从而起到防止氧化损伤的效果。与其他类胡萝卜素不同的是，虾青素同时连接细胞的内膜和外膜，它能同时清扫细胞内外膜的自由基。
[0003] 2009年，Ukibe等利用细菌来源的crtZ/W首次在酿酒酵母中合成虾青素，产量为29μg/g。针对中间代谢产物多，虾青素产量低的问题，研究者便开始筛选底物特异性较强的CrtZ和CrtW的来源，从而达到减少中间代谢产物的目的。Wang组合筛选了8种来源的CrtW和9种来源的CrtZ，结果发现短波单胞菌来源的CrtW和产碱杆菌来源的CrtZ的组合虾青素产量最高，但产物中仍然有大量的中间代谢产物积累。外源代谢路径的导入必然会与细胞内源代谢路径发生相互作用，对细胞的整体代谢水平产生影响，对细胞全局性的调控是虾青素高产的关键之一。
[0004] 因此，提供一株高产虾青素的菌株具有重要的现实意义。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提供了菌株及其应用。本发明利用ARTP诱变来改变细胞的整体代谢水平，从而提高目标代谢产物的产量。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了菌株，其保藏编号为CGMCC No.17267。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，所述代谢产物为虾青素。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株为酵母菌。
[0011] 本发明还提供了所述菌株的构建方法，构建整合有香叶基香叶基焦磷酸 (GGPP)合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtYB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ和β-胡萝卜素酮化酶基因crtW的菌株，经等离子体诱变、SCRaMbLE诱变。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株为酵母菌，基因crtE、crtYB 和crtI以Leu为标签整合至合成型V号染色体，基因crtZ和crtW以His为标签整合至delta位点。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基；所述种子培养基包括40/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮源、2g/L氨基酸省缺混合粉末；所述发酵培养基包括40/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵培养具体为：挑取所述菌株接种于种子培养基中，在30℃、250rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2 转接于种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.1接种于发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养。
[0016] 自然界生物在长期的进化过程中，小尺度的DNA突变和大尺度的DNA 结构变异对生物表型的进化和功能的改变都有着重要意义，大尺度的DNA结构变异可以产生基因的复制乃至染色体的复制，强化某一局部代谢路径或者生化功能，小尺度的DNA突变可以在基因内部产生作用，改变蛋白的分子功能，甚至可能改变酶的作用底物，小尺度的DNA突变作用于非编码区可能影响基因的表达水平。本项目开辟新思路，首次融合传统物理化学诱变与人工基因组重排，设计建立酵母基因组DNA在多尺度水平进化的新策略，实现对细胞代谢的全局扰动与调控，强化虾青素合成能力。本发明对酿酒酵母生产虾青素菌株同时进行两种诱变的方法相对于现有单一诱变技术产生更多种类的突变，从突变产生的大量文库中可以筛选到虾青素产量显著提高的酵母菌株。
[0017] 生物保藏说明
[0018] 生物材料：SyBE_Sc3071009；分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；于2019年02月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17267。
附图说明
附图说明
[0020] 图1示利用重组酿酒酵母合成虾青素的路径图；
[0021] 图2示本方法中胡萝卜素合成路径基因结构图；
[0022] 图3示本方法中虾青素合成路径基因结构图；
[0024] 图5示单一诱变菌株，单一重排菌株与诱变结合重排菌株的虾青素摇瓶产量比较图。
具体实施方式
[0025] 本发明公开了菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种生产虾青素的重组酿酒酵母菌株的进化方法。
[0027] 本发明的第二个目的是提供一株高产虾青素的诱变酿酒酵母菌株。
[0028] 本发明的技术方案概述如下：
[0029] 一种生产虾青素的酿酒酵母菌株的进化方法，包括如下步骤：(1)构建具有合成型染色体生产虾青素酿酒酵母菌株，为生产虾青素提供优质的宿主细胞；(2)等离子体诱变结合SCRaMbLE同时对生产虾青素的酿酒酵母进行连续30天诱变，获得一株高产的诱变菌株AS30(CGMCC NO：17267)。
[0030] 本发明的优点：
[0031] 本发明对酿酒酵母生产虾青素菌株同时进行两种诱变的方法相对于现有单一诱变技术产生更多种类的突变，从突变产生的大量文库中可以筛选到虾青素产量显著提高的酵母菌株。
[0032] 本发明提供的菌株及其应用中所用原料、出发菌株及试剂均可由市场购得。
[0033] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0034] 实施例1具有合成型染色体产虾青素酿酒酵母菌株的构建
[0035] 以含有合成型V号和X号染色体酿酒酵母菌株为出发菌株，构建产虾青素菌株SyBE_SC307118具体过程如下：外源基因包括用于合成番茄红素的三种基因和用于合成虾青素的两种基因：香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因 crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtYB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及β- 胡萝卜素羟化酶基因crtZ和β-胡萝卜素酮化酶基因crtW，基因crtE、crtYB 和crtI以Leu为标签整合至合成型V号染色体(图2)，基因crtZ和crtW以 His为标签整合至delta位点(图3)。开启SCRaMbLE使用质粒Gal-Cre-URA 质粒，将该质粒通过醋酸锂法转化到合成型V号和X号染色体酿酒酵母体内，转化后采用SC-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后，将该正确菌株命名为SyBE_SC307118(Control)。
[0036] 实施例2等离子体结合SCRaMbLE同时诱变(图4)
[0037] 实验组(S+A)：将菌株SyBE_SC307118在SC-URA液体培养基过夜培养，隔天以OD＝1接入新鲜SC-URA-Gal培养基，加入1ul/5ml雌激素，开启 SCRaMbLE，时间6h。取1mlSCRaMbLE后的菌液于1.5mL离心管中，4500 rpm离心1min，用1mLddH2O洗涤两次，取10ul至金属片上，处理20s。将诱变处理后的菌液放入装有1mL生理盐水的1.5mL EP管中；将EP管在涡旋振荡器上振荡1min，使附着在金属片上的菌液完全溶于生理盐水中，4500 rpm离心1min，将离心后菌液转入新鲜SC-URA培养基，过夜孵育复苏 16-18h，此时菌液即为第一天混菌库，隔天重复，共进行30天。将第10天，第20天，第30天的菌悬液稀释10倍、100倍，取100μL涂布于Sc-Ura平板上，做3个平行。30℃培养3天，计数并观察菌落形态和颜色。获得基因组重排结合等离子体诱变迭代进化第30轮的酵母菌(AS30)SyBE_Sc3071009。
[0038] 对照组(A)：将菌株SyBE_SC307118过夜培养，隔天以OD＝0.1接入新鲜SC-URA培养基6h，取1mL培养至对数期的菌液于1.5mL离心管，4500 rpm离心1min，先用1mL生理盐水洗涤两次，再用适量蒸馏水稀释制成 OD600＝1的菌悬液。取10ul至金属片上，处理20s。将诱变处理后的菌液放入装有1mL生理盐水的1.5mL EP管中；将EP管在涡旋振荡器上振荡1min，使附着在金属片上的菌液完全溶于生理盐水中，形成新的菌悬液；4500rpm 离心1min，离心后菌液转入新鲜SC-URA培养基，过夜孵育复苏16-18h，此时菌液即为第一天混菌库，隔天重复，共进行30天。将第10天，第20天，第30天的菌悬液稀释10倍、100倍，取100μL涂布于Sc-Ura平板上，做3 个平行。30℃培养3天，计数并观察菌落形态和颜色。本实验的ARTP参数设置为：输出功率120W、处理距离2mm、气体流速10L/min。ARTP等离子体处理样品的时间为20s。
[0039] 对照组(S)：将菌株SyBE_SC307118在SC-URA液体培养基过夜培养，隔天以OD＝1接入新鲜培养基，加入1ul/5ml雌激素，开启SCRaMbLE，时间 6h。取1mlSCRaMbLE后的菌液于1.5mL离心管中，4500rpm离心1min，用1mLddH2O洗涤两次，4500rpm离心1min，将离心后菌液转入新鲜SC-URA 培养基，过夜孵育复苏16-18h，此时菌液即为第一天混菌库，隔天重复，共进行30天。将第10天，第20天，第30天的菌悬液稀释10倍、100倍，取 100μL涂布于Sc-Ura平板上，做3个平行。30℃培养3天，计数并观察菌落形态和颜色。
[0040] 实施例3比较菌株的虾青素摇瓶产量
[0041] 试验材料：菌株试验方法：
[0042] 种子培养基：40/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮源、2g/L氨基酸省缺混合粉末；
[0043] 发酵培养基：40/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。
[0044] 将实施例2制得的实验组(S+A)、对照组(A)、对照组(S)制得的菌株分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的5mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.1分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)及虾青素产量(图5)。
[0045] 虾青素定量方法：取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸 5min，然后立即冰浴5min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，用
2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，虾青素检测波长为470nm。
2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，虾青素检测波长为470nm。
[0046] 如图5所示，通过基因组重排结合等离子体诱变迭代进化第30轮的酵母菌(AS30)SyBE_Sc3071009，合成虾青素产量显著高于单一诱变菌株(A)或者重排(S)。
[0047] 自然界生物在长期的进化过程中，小尺度的DNA突变和大尺度的DNA 结构变异对生物表型的进化和功能的改变都有着重要意义，大尺度的DNA结构变异可以产生基因的复制乃至染色体的复制，强化某一局部代谢路径或者生化功能，小尺度的DNA突变可以在基因内部产生作用，改变蛋白的分子功能，甚至可能改变酶的作用底物，小尺度的DNA突变作用于非编码区可能影响基因的表达水平。本项目开辟新思路，首次融合传统物理化学诱变与人工基因组重排，设计建立酵母基因组DNA在多尺度水平进化的新策略，实现对细胞代谢的全局扰动与调控，强化虾青素合成能力。
[0048] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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