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一种采用双向固态 发酵生产低蛋白小米的方法

阅读：247发布：2020-05-21

专利汇可以提供一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法，属于生物发酵技术领域。本发明采用蛹虫草菌种，通过双向固态发酵技术降低小米蛋白质含量并产生更多功效成分。所获得小米的蛋白质含量明显比未加工的小米所含蛋白质少，原每100g小米中含蛋白质11.2～13.4g；发酵后的小米蛋白质含量相比原先下降了32％，且由于蛹虫草菌种发酵时产生大量的初、次级代谢产物和酶，使小米的成分发生了变化，赋予了小米多糖、氨基酸、核苷类物质以及甘露醇等丰富的功效成分，可供肾病病人食用，避免了资源浪费，提高了经济价值。该技术可用于谷物加工行业，是一种极具开发研究价值的发酵方法。本发明所公开的方法在药食用真菌改善谷物的领域中具有良好的应用前景。，下面是一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子液制备：将蛹虫草菌种活化后转接至液体种子培养基中，在22～30℃培养2～
5d，制备种子液；
(2)双向固态发酵：取步骤(1)制备得到的种子液，均匀洒在小米固态发酵培养基表面，在22～30℃发酵20～25d；
(3)将步骤(2)发酵完全的小米固态发酵培养基灭菌除去蛹虫草菌种，洗净烘干得到低蛋白小米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基按质量含量计为：葡萄糖4～6％、蛋白胨1～3％、酵母浸膏2～4％，磷酸二氢钾0.05～0.15％，硫酸镁0.03～
0.08％，初始pH值为6～9。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小米固态发酵培养基通过如下方法制备得到：将小米洗净浸泡，淋洗后进行烘干，烘干后蒸15～30min得到小米固态发酵培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛹虫草保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3.17859。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述种子液的培养是在避光条件下进行培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述种子液培养的转速为
200～400rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，接种量为2～5％(w/w)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述双向固态发酵是在避光条件下进行发酵。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述灭菌是在115～130℃条件下灭菌15～25min。
10.一种权利要求1～9任一项所述方法制备得到的低蛋白小米。

说明书全文

一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] 肾病是一种严重危害人类健康常见病的统称，主要包括不同类型的肾炎、急性肾衰竭、肾结石、肾囊肿等等。其中一个最基本的特征是大量蛋白尿，其是指肾病患者尿蛋白排出量>3.5g/d。在正常生理情况下，肾小球滤过膜具有分子屏障及电荷屏障，致使原尿中蛋白含量增多，当远超过近曲小管回吸收量时，形成大量蛋白尿。在此基础上，凡增加肾小球内压力及导致高灌注、高滤过的因素(如高蛋白饮食)均可加重尿蛋白的排出。患者易产生感染、高凝、微量元素缺乏、内分泌紊乱和免疫功能低下等并发症。因此肾病病人不适宜食用含高蛋白的食物。

[0003] 小米是中国北部地区的主要粮食作物，含有丰富的蛋白质，脂肪和维生素，民间常用于熬制小米粥。小米熬粥营养价值丰富，有“代参汤”之美称，具有安神之效。由于小米不需精制，所以它保留了许多的维生素和无机盐，小米中的维生素B1可达大米的几倍，无机盐含量也高于大米。小米不仅可供食用，亦可入药。中医认为小米味甘咸，性凉，有清热、清渴，滋阴，补脾肾和肠胃，利小便、治水泻等功效。小米含有丰富的蛋白质，如谷蛋白、醇蛋白、球蛋白等，且含量高于大米，每100g中含脂肪1.7g，碳水化合物76.1g，均都不低于稻、麦等谷物。其次，小米中蛋白质的质量也优于小麦、稻米和玉米。由此可见，肾病病人不适宜食用蛋白含量高的小米。因此降低小米中蛋白质的含量是改善肾病病人不适宜食用小米这一情况的一种途径。但既要降低小米中蛋白质含量，又要保证小米营养价值的方法，目前还未见相关报道。因此通过高效、绿色、环保的方法实现这一目标显得十分必要。

发明内容

[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用双向固态发酵，以小米为固态培养基发酵蛹虫草，一方面为蛹虫草提供生长的营养需要，又不会引入其他试剂对蛹虫草产生损伤，另一方面，蛹虫草产生的次生代谢产物改变了发酵菌质原有的功效成分，起到降低蛋白质以及增加其他功效成分的作用，在一定程度上提高了小米丰富的营养和功能。

[0005] 本发明的第一个目的是提供一种采用双向固态发酵生产低蛋白小米的方法，包括如下步骤：

[0006] (1)种子液制备：将蛹虫草菌种活化后转接至液体种子培养基中，在22～30℃培养2～5d，制备种子液；

[0007] (2)双向固态发酵：取步骤(1)制备得到的种子液，均匀洒在小米固态发酵培养基表面，在22～30℃发酵20～25d；

[0008] (3)将步骤(2)发酵完全的小米固态发酵培养基灭菌除去蛹虫草菌种，洗净烘干得到低蛋白小米。

[0009] 进一步地，所述的种子培养基按质量含量计为：葡萄糖4～6％、蛋白胨1～3％、酵母浸膏2～4％，磷酸二氢钾0.05～0.15％，硫酸镁0.03～0.08％，初始pH值为6～9。

[0010] 进一步地，所述小米固态发酵培养基通过如下方法制备得到：将小米洗净浸泡，淋洗后进行烘干，烘干后蒸15～30min得到小米固态发酵培养基。

[0011] 进一步地，所述的蛹虫草保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3.17859。

[0012] 进一步地，在步骤(1)中，所述种子液的培养是在避光条件下进行培养。

[0013] 进一步地，在步骤(1)中，所述种子液培养的转速为200～400rpm。

[0014] 进一步地，在步骤(2)中，接种量为2～5％(w/w)。

[0015] 进一步地，在步骤(2)中，所述双向固态发酵是在避光条件下进行发酵。

[0016] 进一步地，在步骤(3)中，所述灭菌是在115～130℃条件下灭菌15～25min。

[0017] 本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的低蛋白小米。

[0018] 本发明的有益效果是：

[0019] 本发明提供了一种适用于工业化改良生产谷物的方法，并优化了相应的发酵条件。所获得小米的蛋白质含量明显比未加工的小米所含蛋白质少，原蛋白质含量为11.2％～13.4％，即每100g中含蛋白质11.2～13.4g；发酵后的小米蛋白质含量相比原先下降了32％，即每100g中含蛋白7.6g～9.1g，且由于蛹虫草菌种发酵时产生大量的初、次级代谢产物和酶，使小米的成分发生了变化，赋予了小米多糖、氨基酸、核苷类物质以及甘露醇等丰富的功效成分，可供肾病病人食用，避免了资源浪费，提高了经济价值。该技术可用于谷物加工行业，是一种极具开发研究价值的发酵方法。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0021] 蛋白质检测：①采用凯氏定氮法测定总氮。称取1g样品于消化管里，分别依次称取加入1g K2SO4，0.5g CuSO4，20mL浓硫酸搅拌均匀后进行消化处理，直至管内液体变为淡绿色透明液体为止，待处理液完全冷却后定容于100mL容量瓶中，摇匀后用凯氏定氮法测定。总氮计算：

[0022]

[0023] 式中：x为样品中氮含量，g/100g；V1为样品滴定消耗盐酸标准溶液体积，mL；V2为空白滴定消耗盐酸标准溶液体积，mL；V3为测定样品时消化液的体积，mL；c为盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；14.008为每摩尔氮原子质量，g/mol；m为样品的质量，g；F为氮转化系数，6.25。

[0024] ②采用三氯乙酸法测定非蛋白氮。称取1g待测样品粉末，加入100mL蒸馏水振荡30min后加入20mL 10％的三氯乙酸溶液，混匀后静置25min～35min后过滤，滤渣用三氯乙酸洗涤3次，收集滤液转入旋转蒸发仪中浓缩，将样品加入石墨消解仪的消化管里消化，消化后用凯氏定氮法测定。空白对照为1mL蒸馏水，处理方法同上样品。蛋白质含量/g＝总氮含量－非蛋白氮含量。

[0025] 多糖检测方法：①采用水提醇沉法提取粗多糖。②用硫酸苯酚法测定粗多糖中总糖含量。将葡萄糖分别配成浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL标准液。1mL标准液分别加入现配的5％苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀30℃放置30min，于490nm处测定吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程。吸取1mL样品液，按照上述步骤测定吸光值，并代入标准曲线计算反应体系中的葡萄糖含量(mg/mL)。总糖含量(μg/mg)＝葡萄糖浓度/1000×稀释倍数×提取液体积/提取物质量。③用3，5－二硝基水杨酸比色法测定粗多糖中还原糖含量。在6支试管中分别加入1mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL，补蒸馏水至0.5mL，然后加入DNS试剂1.5mL，充分混匀。置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速流水冷却，并分别向试管中加入4mL蒸馏水混匀。在540nm处测定吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到其线性回归方程。
取1mL样品溶液，按上述步骤测定吸光值，代入标准曲线计算反应体系中的葡萄糖浓度(mg/mL)。还原糖含量(μg/mg)＝葡萄糖浓度/1000×稀释倍数×提取液体积/提取物质量。多糖含量(μg/mg)＝总糖含量－还原糖含量。

[0026] 氨基酸检测方法：采用茚三酮方法测定。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准氨基酸溶液于6支试管中，蒸馏水补足至1mL，再加入1mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，1mL茚三酮显色液，0.1mL 0.1％的抗坏血酸溶液，充分混匀后封管，于100℃水浴中加热15min，取出后迅速用流水冷却，静置5min，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，于570nm处测其吸光度，以吸光值为纵坐标，氨基酸含量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。精确称取干燥粉碎过的样品粉末1g，在90℃的水浴锅中以1∶20(g/mL)的料液比，加乙酸振荡提取5h，然后加5mL 10％三氯乙酸溶液，振荡1min后静置30min，4000r/min离心10min，上清液经过滤定容至
50mL即得待测样品。取其中滤液1mL，按上述步骤测定570nm下吸光值，带入标准曲线计算氨基酸溶液浓度。最后按公式计算氨基酸含量：氨基酸含量/％＝(测定的氨基酸溶液浓度×稀释倍数×测定的氨基酸溶液体积)/样品质量×100。

[0027] 核苷类物质(主要是虫草素)检测方法：①将500mg/mL的虫草素标准储备液稀释成0、5、10、15、20、25μg/mL虫草素标准液，采用HPLC进行测定，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。②精确称取样品干粉1g，定容至10mL，超声处理30min，
13000r/min离心5min，取上清液3次处理后合并滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，取1mL滤液定容至10mL容量瓶，采用HPLC进行测定，结果代入标准曲线进行计算样品虫草素浓度。③色谱条件为色谱柱：Waters C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：15％甲醇+水；流速1mL/min；柱温：20℃；紫外检测波长260nm，10μL进样。虫草素含量(μg/mg)＝虫草素浓度×提取液体积/提取物质量。

[0028] 甘露醇检测方法：①精密称取5g样品于圆底烧瓶，加50mL蒸馏水回流2h，4500r/min离心20min，用蒸馏水清洗残渣，定容至50mL待测。②精密称取干燥的纯品甘露醇50mg，蒸馏水定容至50mL，配成浓度为1.0mg/mL标准样品。然后分别精密吸取标准样品1.0、2.0、4.0、5.0、6.0mL定容于100mL容量瓶中，各吸取1mL置于试管中，依次加入浓度为0.015mol/L高碘酸钠溶液1mL，混匀室温静置10min，再精密加入0.1％的L-鼠李糖溶液2mL，摇匀后精密加入4mL新配置的Nash试剂并充分混匀，于53℃恒温水浴锅中加热15min使其充分显色并等到冷却，用蒸馏水坐空白对照，在413nm测吸光值。以甘露醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。③准确吸取样品1mL，按上述步骤处理。在413nm测吸光值。结果代入标准曲线计算样品甘露醇浓度。甘露醇含量(mg/g)＝甘露醇浓度×提取液体积/提取物质量。

[0029] 实施例1：双向固态发酵条件优化

[0030] 蛹虫草菌种取于中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3.17859。

[0031] 采用单因素优化策略，选取不同的碳源、氮源、无机盐和温度、pH及转速，对蛹虫草菌种的液体种子培养基及培养条件和固体发酵培养基及固态发酵条件进行优化。得到最适液体种子培养基配方按照质量含量计为：葡萄糖5％、蛋白胨2％、酵母浸膏3％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，初始pH值为6～9。液体培养条件为：避光，培养温度22～30℃，转速
200～400rpm，培养周期3～5d。最适固体发酵培养基配方为：籼小米洗净后加清水在20℃条件下浸泡5h，淋洗，烘干水分后放于蒸笼中蒸20min左右灭菌。固态发酵条件为：避光，发酵温度22～30℃，发酵周期20～25d。发酵成品经成分检测，含有多糖、氨基酸、核苷类物质以及甘露醇等丰富的功效成分，多糖含量为69.2％～77.1％(692～771μg/mg)；氨基酸含量为
1.06％～1.28％(10.6～12.8mg/g)；核苷类物质含量为；0.023％～0.026％(235.2～264.7μg/g)；甘露醇含量为3.58％～4.33％(35.8～43.3mg/g)。且原蛋白质含量为11.2％～
13.4％，即每100g中含蛋白质11.2～13.4g；发酵后的小米蛋白质含量相比原先下降了
32％，即每100g中含蛋白7.6g～9.1g。

[0032] 实施例2：双向固态发酵中试制种

[0033] 为满足工程化生产过程对大量液体种子的需求，根据实验室之前的研究结果进行3t 发酵罐种子扩培试验，设置3个平行试验。试验结果表明：发酵罐载液量75％。培养基在
121℃，20min条件下灭菌，冷却至22～30℃，接种7.0‰的摇瓶种子液，转速200～300r/min，通气比1.5vvm，培养温度22～30℃，培养至生长对数中期即菌丝体含量达到40g/L后接种固态发酵培养基。该条件下种子生长周期比较短，菌种的生长状态，感官特征和形态特征都很好，生长旺盛，菌丝比较浓，培养工艺稳定，达到了理想的结果。见表1。

[0034] 表1液体种子扩培试验结果

[0035]

[0036] 实施例3：双向固态发酵中试生产

[0037] 为实现工程化生产低蛋白小米，根据实验室之前的研究结果和中试制种试验结果，进行750kg级别的固态发酵中试生产试验，设置3个平行试验。试验结果表明：籼小米洗净后加清水在20℃条件下浸泡5h，捞出，沥干水分，装入蒸米车，通蒸汽30min左右灭菌，倒入摊凉机，温度降至22～30℃，用接种机进行接种。将长满蛹虫草菌种的籼米培养基转运到发酵池中发酵。培养基pH、发酵时间、接种量、发酵温度、均参考前述试验结果。发酵过程中，通过温度传感器控制鼓风机进行恒温控制和氧气补充，每天早晚各翻料一次。发酵结束后，灭菌，60℃烘干得到低蛋白小米。见表2。

[0038] 表2固态发酵培养中试试验结果

[0039]

[0040] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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