一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及构建的菌株与
应用
技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物育种和生物技术领域，具体涉及一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及构建的菌株，及其在工业微生物的菌种改造中的应用。
背景技术
[0002] 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖
水解酶，广泛存在于高等动物组织及分泌物、
植物及各种微生物中。溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用，与抗生素复合应用能增强抗生素疗效。它还是人体内的非特异性免疫因子，可提高
机体的免疫
力，并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子具有很好的协同作用。目前溶菌酶已广泛应用于各种加工食品和饮料中，集药理、保健和防腐为一体，具有广泛的应用价值。但目前尚未有通过调节溶菌酶的表达来用于微生物育种的报道。
[0003] 对于微生物育种而言，目前所涉及的育种方法主要有诱变育种技术、定向进化育种技术和基因工程改造等，以棒状链酶菌为例，克拉维酸是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)合成的一种
次级代谢产物，是临床上常用的β-内酰胺酶
抑制剂，可与阿莫西林或替卡西林联合用药，用于
治疗耐药性致病菌感染，具有重要的临床价值。棒状链霉菌的
发酵水平是决定克拉维酸生产成本的重要因素，因此选育克拉维酸高产菌株具有重要的工业价值。多种新型育种方法已经在棒状链霉菌育种工作中得到应用，比如报告基因辅助的诱变育种技术、定向进化育种技术和基因工程改造等，但是这些技术都集中在对克拉维酸合成基因和调控基因的改造上，希望通过提高克拉维酸合成酶或正调控基因的表达水平，或通过增强克拉维酸合成酶活性进而提高克拉维酸的合成效率。但是由于克拉维酸属于次级代谢产物，其合成途径受到广泛的调控，仅改造单个或数个基因往往无法预料整个代谢流向的改变，影响理想高产菌株的获得。因此，开发一种新的棒状链霉菌的改造方法，并获得高产克拉维酸的菌株具有非常重要的实际应用价值。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术，本发明的目的是提供一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及其在工业微生物菌种改造中的应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌及其构建方法。本发明不直接改造克拉维酸的合成基因或调控基因，而是通过提高内源性溶菌酶的表达量来增强细胞通透性，进而提高底物摄取效率和克拉维酸产量。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的一个方面涉及一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法。
[0008] 本发明提供的方法，包括如下步骤：首先构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。
[0009] 本发明通过上述构建方法提高了菌株内源性溶菌酶活性，进而增强细胞通透性和产物合成效率。
[0010] 上述菌株的构建方法在工业微生物菌种改造中的应用也是本发明的保护范围。所述工业微生物菌种改造是指提高工业微生物代谢产物的合成量。
[0011] 本发明的另一方面涉及一种超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012] 以生产克拉维酸的棒状链霉菌菌株作为出发菌株，构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。
[0013] 所述超表达载体的构建方法为：采用PCR克隆棒状链霉菌的内源性溶菌酶基因，将PCR产物用Xba I和BamH I进行酶切，凝胶琼脂糖
电泳分离后回收酶切产物，并与同样酶切的穿梭载体pHZ1272进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子提取质粒进行酶切鉴定。
[0014] 优选的，所述内源性溶菌酶基因为带有强启动子的内源性溶菌酶基因SCN_RS20110。
[0015] PCR克隆所采用的引物为：
[0016] 上游引物：GCTCTAGA ATGACCACTTCCAGATACTCT；(SEQ ID NO.1)
[0017] 下游引物：GCGAATTC TCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC。(SEQ ID NO.2)
[0018] PCR克隆所采用的扩增体系为：
[0019] 棒状链霉菌基因组DNA 2μl、PCR缓冲液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，补加超纯水至50μl。
[0020] PCR克隆所采用的扩增条件为：
[0021] 97℃预变性10分钟；97℃变性30秒，62℃
退火30秒，72℃延伸1分钟，循环28次；终延伸8分钟。
[0022] 本发明的再一方面涉及一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌，该菌株为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)LY6，已于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.12830。
[0023] 该棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)LY6，是以棒状链霉菌工业菌株B02作为出发菌株，采用上述超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌的构建方法而构建得到。
[0024] 进一步的，本发明还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)LY6。
[0025] 上述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)LY6和/或上述菌剂在制备克拉维酸中的应用也是本发明的保护范围。
[0026] 进一步的，上述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)LY6和/或上述菌剂在制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用也是本发明的保护范围。
[0027] 本发明的有益效果：
[0028] (1)本发明首次提供了一种超表达内源性溶菌酶菌株的构建方法，采用超表达技术，通过高表达内源性溶菌酶基因，改善工业菌株的细胞通透性，增强营养物质的摄取和次级代谢产物的分泌效率，最终提高了代谢产物的表达水平。本发明并且首次提出将该菌株的构建方法应用于工业微生物的菌种改造，为微生物育种提供了一条全新的方法。
[0029] (2)通过采用本发明的菌株构建方法，本发明构建得到了一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌，发酵验证发现，采用本发明方法构建的棒状链霉菌，其克拉维酸发酵水平比出发菌株高1.5倍以上，可应用于工业化发酵生产，具有重要的经济价值。
[0030] (3)本发明通过改善工业菌株的细胞通透性来提高目标产物的发酵水平，针对性非常强，符合工业生产菌株的育种需要，易于在其他工业微生物菌种的育种改造中推广应用。
附图说明
[0031] 图1：Real-time PCR分析内源性溶菌酶的转录水平差异；
[0032] 图2：克拉维酸发酵水平比较。
具体实施方式
[0033] 结合
实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0034] 实施例1：内源性溶菌酶基因的超表达重组菌株的构建
[0035] 采用PCR克隆棒状链霉菌的内源性溶菌酶基因(内源性溶菌酶基因带有强启动子的内源性溶菌酶基因SCN_RS20110)，构建到链霉菌超表达载体pHZ1272中(pHZ1272为常规的市售质粒载体)。
[0036] PCR的引物为：
[0037] 上游引物LYSForward序列是GCTCTAGA ATGACCACTTCCAGATACTCT(SEQ ID NO.1)；
[0038] 下游引物LYSReverse序列是GCGAATTC TCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC(SEQ ID NO.2)。
[0039] PCR体系：棒状链霉菌基因组DNA 2μl、PCR缓冲液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，补加超纯水至50μl。
[0040] PCR条件：预变性97℃10分钟，变性97℃30秒，退火62℃30秒，延伸72℃1分钟，循环28次，终延伸8分钟。
[0041] 将PCR产物用Xba I和BamH I进行双酶切，凝胶琼脂糖电泳分离后回收酶切产物，并与同样双酶切的载体pHZ1272进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子提取质粒进行双酶切鉴定。
[0042] 采用接合转移技术将重组pHZ1272转入棒状链霉菌工业菌株B02(来源于发明
专利ZL201510776880.6中采用的棒状链霉菌工业菌株B02)，得到一系列接合子。
[0043] 实施例2：接合子的平板筛选
[0044] 按下列配方配制BSCA固体培养基：麦芽提取物8g/L、
酵母提取物4g/L、
葡萄糖4g/L、琼脂粉15g/L、pH 8.5、0.15MPa灭菌30分钟。(麦芽提取物和酵母提取物均为常规的市售产品)。
[0045] 利用含硫链丝菌素抗生素的BSCA平板筛选棒状链霉菌接合子，共选出接合子8株，分别编号为LY1-LY8，继续培养至产孢并编号，经过二次硫链丝菌素抗性验证最终选择LY6菌株。
[0046] 采用Real-time PCR分析LY6菌株的内源性溶菌酶转录水平，将LY6和出发菌株孢子分别稀释至105个/ml，取100ul涂布BSCA固体平板上25℃培养6天，分别在第2天、第3天、第4天和第5天收集菌丝体，提取总RNA，检测溶菌酶基因的转录水平变化，结果如图1所示，结果表明LY6菌株的溶菌酶水平显著高于出发菌株，并且表达时间延长，在第4和第5天都有较高的表达。
[0047] 实施例3：摇瓶发酵验证
[0048] 按照下列配方配制液体培养基：大豆蛋白提取物20g/L、酵母提取物8g/L、麦芽糊精15g/L、
磷酸氢二
钾0.5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30分钟。每250ml三
角瓶装30ml液体培养基。(大豆蛋白提取物和酵母提取物均为常规的市售产品)。
[0049] 将实施例2选出的重组菌株的孢子稀释至107个/ml，按2％V/V接种于上述发酵摇瓶，25℃、200rpm振荡培养6天，3000rpm离心10min吸取上清液，用HPLC检测克拉维酸的发酵水平；同时，将出发菌株B02按照同样的方法进行摇瓶发酵试验。结果显示LY6菌株的发酵水平比出发菌株B02提高幅度超过38％(结果见图2)。
[0050] 将菌株LY6于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.12830。
[0052] 将工程菌株LY6的孢子悬液稀释涂布在BSCA固体培养基上25℃培养6天，分离单孢菌落并进行扩大培养，连续分离单孢五次，每次扩大培养，并进行摇瓶发酵验证克拉维酸发酵水平，结果见表1，结果表明高产菌株LY6具有较好的遗传稳定性，满足工业生产的需求。
[0053] 表1不同传代次数LY6的克拉维酸发酵水平(g/L发酵液)
[0054]传代次数 重复1 重复2 重复3 平均值
LY6第一代 5.12 4.83 4.85 4.93
LY6第二代 4.92 4.85 5.05 4.94
LY6第三代 4.92 4.88 4.94 4.91
LY6第四代 5.07 4.84 4.86 4.92
LY6第五代 4.81 4.87 5.08 4.92
LY6第六代 4.84 5.06 4.97 4.96
[0055] 实施例5：应用超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌LY6生产克拉维酸[0056] 1.
种子液培养：
[0057] 将工程菌株LY6和出发菌株B02的孢子分别接种到液体种子摇瓶，25℃200rpm振荡培养2天，然后接种到50L种子罐，25℃培养2天获得种子液；同时以出发菌株作为对照。
[0058] 2.发酵培养：
[0059] 将种子液按5％(体积分数)接种量接种到1m3
发酵罐，通气量1.5VVM，搅拌转速120rpm，25℃发酵培养6天，放罐检测克拉维酸的发酵水平。
[0060] 种子培养和发酵培养的液体培养基的组成为：大豆蛋白提取物20g/L、酵母提取物8g/L、麦芽糊精15g/L、
磷酸氢二钾0.5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30min。
[0061] 其中，大豆蛋白提取物和酵母提取物均为常规的市售产品。
[0062] 3.克拉维酸含量测定：
[0063] 采用HPLC法测定发酵液中克拉维酸的含量，结果为：工程菌株LY6发酵液中克拉维酸含量为5.02g/L，出发菌株B02发酵液中克拉维酸含量为3.62g/L。
