석면 독성 진단방법{Diagnostic method of toxicity of asbestos}

본 발명은 석면 독성 평가 방법에 관한 것이다.

석면은 규소, 마그네슘, 철 등이 특정 온도와 압력의 환경에서 물과 작용하여 섬유상 구조로 결정이 성장하여 생성된 것으로 직경이 0.1μm 정도 크기의 결정 구조로 석면의 종류별로 다양한 색깔과 성질을 나타내며, 시멘트 및 기타 여러 가지 결합체와 혼합되어 다양한 석면제품들이 만들어진다.

우리나라의 경우 석면 생산과 슬레이트 제조는 이미 50년 전부터 시작되었고, 석면 방직업과 브레이크 제조업은 30 여년 전부터 시작되어 주로 시멘트제품, 마찰재, 조인트시트, 방직제품 등이 포함되어 다양한 분야에서 사용되어 왔다.

주로 강도를 높여 강산이나 화학물질 또는 고열에 대한 내구성을 증가시키고, 탄성을 조절하기 위해 사용되는 석면은 증발하거나 녹거나 타지 않으며, 다른 화학물질과 심한 반응을 일으키지 않아 생분해되지 않기 때문에 일반 환경 및 작업 환경 내에 축적된다. 이 같은 성질 때문에 흡입된 석면이 사람의 생체 내에 축적되어 다양한 질병의 원인이 된다.

이러한 석면에 장시간 노출될 경우 10~40년의 잠복기를 거쳐 석면폐(Asbestosis), 폐암(Lung Cancer), 악성중피종(Mesothelioma) 등 근로자에게 치명적인 건강장해를 유발하고 있다. 이와 같은 석면관련 질병으로 인하여 전 세계적으로 매년 9만명의 사망자가 발생함에 따라, 우리나라는 2000년부터 청석면, 갈석면 제조 금지를 시작으로, 2007년부터는 백석면 사용이 단계적으로 금지되었으며, 노동부고시(제2008-26호)와 같이 석면을 1급 발암 물질로 지정하고 2009년부터는 석면함유제품의 제조, 수입 및 사용이 전면 금지되었다.

따라서, 최근에는 한국 공개특허 제10-2014-0043152호와 같이 석면 검출을 위한 방법 및 장치들의 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 석면 독성 평가 및 석면 노출에 의한 인체 손상을 진단하는 방법에 대한 연구는 보고되어 있지 않으며, 명확한 생물학적 지표가 규격화되어 있지 않은 실정이다.

본 발명의 목적은 석면 노출에 의한 인체 손상을 진단하는 석면 독성 진단방법을 제공하는 데에 있으며, 석면 독성을 동물모델을 통하여 진단하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 석면에 노출된 포유동물의 시료 샘플을 수집하는 단계; 상기 샘플 내에서 지질단백질 응집 및 분해 여부, 산화물 함량, 동맥경화성 세포 증가 여부, 노화세포 및 사멸세포 증가 여부, 및 염증반응 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 석면 독성 진단방법을 제공한다.

또한 본 발명은 석면 추출물을 제브라피쉬 배아에 처리하는 단계; 및 상기 석면 추출물이 처리된 제브라피쉬의 척추발달장애 여부, 배아 세포고사 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 석면 독성 진단방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 노출되는 석면의 농도가 증가할수록 혈청 지질단백질의 응집 및 분해가 증가하여 이동성이 빨라지고 다량화로 응집현상이 나타났으며, 혈관대식세포에서 동맥경화성 세포 산화물이 증가하였다. 또한 석면 추출물을 제브라피쉬에 노출시킨 경우, 제브라피쉬의 배아 척추기형이 발생하였으며, 배아 세포고사가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 석면 노출에 의해 발생 되는 인자들을 분석하여 석면 노출에 의한 인체 내 손상 정도를 진단하는 방법으로, 본 발명의 진단방법을 이용하면 석면 노출에 의한 각종 질병 및 건강에 미치는 영향을 진단 및 평가할 수 있다.

도 1은 석고보드에서 추출된 석면을 편광현미경으로 확인한 사진이다.
도 2는 석면 추출물에 따른 저밀도 지단백질 변화를 확인한 전기영동 결과와 지질산화물 정량 결과이다.
도 3은 석면 추출물을 72시간 및 96시간 처리한 후 고밀도 지단백질 변화를 확인한 전기영동 결과이다.
도 4는 석면 노출에 따른 혈관대식 세포에서 세포 산화물 수준 변화와 세포 사멸을 DHE 염색하여 확인한 결과이다.
도 5는 혈관대식세포에서 석면추출물 처리 4시간 이후 세포사멸을 AO 염색하여 확인한 결과이다.
도 6은 석면 추출물이 포함된 용액에 제브라피쉬 배아 노출시 척추 발달 장애, 산화물 증가 및 배아 사멸율 증가를 확인한 결과이다.
도 7은 석면 추출물이 포함된 용액에 배아 노출시 배아 사멸율 증가를 확인한 결과이다.
도 8은 석면 추출물 용액을 배아에 미세주입시 배아 사멸율 증가를 확인한 결과이다.
도 9는 석면 추출물 용액을 배아 미세주입시 배아 발달 장애, 배아 세포 고사 증가를 확인한 결과이다.

본 발명은 석면에 노출된 포유동물의 시료 샘플을 수집하는 단계; 상기 샘플 내에서 지질단백질 응집 및 분해 여부, 산화물 함량, 동맥경화성 세포 증가 여부,노화세포 및 사멸세포 증가 여부, 및 염증반응 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 석면 독성 진단방법을 제공한다.

상기 석면은 열수 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 시료는 혈청, 조직 또는 세포 중에서 선택될 수 있으며, 상기 세포는 혈관 대식 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 산화물 함량은 석면 노출에 의해 혈청 지질단백질 산화물 또는 세포 산화물 함량이 증가할 수 있다.

본 발명의 지질단백질 응집 및 분해 여부는 혈청에서 분리된 지질단백질의 전기영동 이동성 분석을 통하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 산화물 함량은 석면 노출에 의한 혈청 지질단백질 산화물 또는 세포 산화물의 함량 증가로 확인할 수 있다. 상기 혈청 지질단백질 또는 세포의 산화물 증가 여부는 산화 생성물인 공액 디엔(Conjugated dienes)양을 측정하는 분광학 분석 방법 또는 DHE(Dihydroethidium) 염색 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 2 및 도 3과 같이 노출되는 석면의 농도 및 노출시간이 증가할수록 혈청 지질단백질의 응집 및 분해가 증가하여 전기영동상 이동성이 빨라지고 다량화로 응집현상이 나타났다. 또한, 도 4와 같이 석면 시료 1 추출액이 처리된 혈관 대식세포에서는 세포산화물이 2.8배 증가하였으며, 석면 시료 2 추출액이 처리된 혈관 대식세포에서는 세포산화물이 2.2배 증가하였다. 또한 석면 시료 3 추출액이 처리된 혈관 대식세포에서는 세포산화물이 2.3배 증가하였으며, 석면 시료 4 추출액이 처리된 혈관 대식세포에서는 세포산화물이 2.6배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명은 석면 추출물을 제브라피쉬 배아에 처리하는 단계; 및 상기 석면 추출물이 처리된 제브라피쉬의 척추발달장애 여부, 배아 세포고사 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 석면 독성 진단방법을 제공할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 석면 추출물은 열수 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 도 8 및 도 9와 같이 시료 1번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 3배 증가하였으며, 척추기형 발생율이 93 %로 나타났고, 배아 생존율을 19 %로 감소하였다. 또한 시료 2번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 2.4배 증가하였으며, 척추기형 발생율은 26 %로 나타났으며, 배아생존율은 56 %로 감소하였다.

시료 3번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 2배 증가하였으며, 척추기형 발생율은 11 %로 나타났으며, 배아생존율이 67 %로 감소하는 것으로 나타났으며, 시료 4번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 2.4배 증가하였으며, 척추기형 발생율은 33 %로 나타났고, 배아생존율은 53 %로 감소하는 것으로 나타났다.

상기 결과로부터 석면 추출물은 제브라피쉬 배아의 세포고사를 증가시키고, 제브라피쉬 배아의 기형 및 척추 발달 장애의 원인이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 제브라피쉬 배아 독성 측정을 통하여 석면 독성을 확인할 수 있는 방법을 제안할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 석면 시료

석면의 물 추출물을 330 mg 고형분/mL 물이 되도록, 파쇄한 석고보드 분말 10 g에 3 mL 초순수를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 흔들어 1차 추출한 후, 다시 100 ℃에서 10시간 동안 교반하여 추출하였다. 그 후, 석면 추출물을 슬라이드 글라스 중앙에 0.1 mL 떨어뜨린 후, 건조오븐기를 사용하여 100 ℃에서 10분 동안 추출물을 완전히 건조시키고, 각각의 석면시료는 편광현미경(Nikon Eclipse LV150, Tokyo, Japan)에 Polarizer slider를 장착하여 200배의 배율에서 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 석고보드에서 추출된 석면을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 석면 추출물에 의한 지질단백질 영향 확인

1. 사람 지질단백질 ( lipoprotein ) 정제

하룻밤 금식한 젊은 남성(평균 22±2세) 18명으로부터 제공받은 혈청을 초원심분리하여, LDL (1.019<d<1.063), HDL ₂ (1.063<d<1.125), 및 HDL ₃ (1.125<d<1.225)를 분리한 후 이전에 보고된 방법 또는 표준 방법에 따라, 각각 NaCl 및 NaBr을 적절히 첨가하여 밀도를 조절하였다.

영남대학교 분석센터의 Himac CP-90α(Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 각각의 시료들을 10℃에서 100,000g로 24시간 동안 원심분리하였다.

2. 석면 추출물에 의한 지질단백질 영향 확인

실시예 1과 같이 최종농도 33 mg/mL이 되도록 추출된 석면 추출물을 각각 일정농도별로 0.1 mL를 정제된 1 mg의 LDL, HDL ₂ 및 HDL ₃ 에 각각 처리한 후 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 각 실험의 지정된 시간까지 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후 SDS-PAGE 및 아가로스 겔 전기영동 및 분광학으로 지질단백질산화 정도 및 변형을 분석하였다. 그 후 지질단백질 일정량을 트리스 완충용액(tris-buffered saline, TBS; pH 8.0)으로 투석한 후 4℃에서 보관하였다. 그 결과, 도 2 및 도 3과 같이 석면 노출 정도가 증가할수록 혈청 지단백질의 변형이 증가함에 따라, 아가로스 겔 전기영동 이동성이 빨라진 것을 확인할 수 있었으며, LDL 내 산화물(MDA)이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 석면 추출물에 의한 혈관 대식세포 손상 확인

사람 단핵세포주인 THP-1 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, #TIB-202 ^TM ; Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% 태아소혈청(FBS)가 포함된 RPMI-1640 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 유지시켰다.

20 계대 이상 배양된 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 1×10 ⁵ 세포로 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; final concentration of 150 nM)가 포함된 배지에서 37℃, 5% CO ₂ 및95% 공기 조건의 습식 인큐베이터로 48시간 동안 배양하여 사람 혈관 대식세포로의 분화를 유도하였다.

사람 혈관 대식세포의 동맥경화 속성을 비교하기 위해, 분화되고 부착된 대식세포를 따뜻한 PBS로 세척한 후, 1% 태아소혈청(FBS), oxLDL(LDL 단백질 50 μg이 포함된 PBS) 50μL과 실시예 1에서 추출된 석면 시료가 각각 최종 50 mg/mL 추출 농도로 포함된 신선한 RPMI-1640 배지 400μL로 37℃에서 48시간 동안 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

그 후, 산화물의 수준 변화를 확인하기 위해서, 사람 혈관 대식세포에 DHE(Dihydroethidium) 염색을 수행하였으며, 세포 배양 배지 0.2 mL을 말론디알데하이드(malondialdehyde; MDA)를 표준으로 이용하여, 바비튜릭산 활성 기질(TBARS) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4와 같이 대조군과 비교하여 석면 시료 1 추출액이 처리된 대식세포에서는 세포산화물이 2.8배 증가하였으며, 석면 시료 2 추출액이 처리된 대식세포에서는 세포산화물이 2.2배 증가하였다. 또한 석면 시료 3 추출액이 처리된 대식세포에서는 세포산화물이 2.3배 증가하였으며, 석면 시료 4 추출액이 처리된 대식세포에서는 세포산화물이 2.6배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 석면 추출물을 4시간 동안 처리한 혈관 대식세포를 Acridine orange(AO)로 염색하여 세포고사를 확인하였다.

그 결과, 도 5 및 표 2와 같이 시료 1의 경우, 세포생존율이 54% 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 시료 2는 31%, 시료 3은 15%, 시료 4는 31% 각각 감소한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 석면 추출물에 의한 제브라피쉬 배아 독성 확인

1. 제브라피쉬 및 배아 배양

야생형 제브라피쉬 및 배아를 표준 방법에 따라 유지시켰다.

제브라피쉬 유지 및 실험 과정은 영남대학교(Gyeongsan, Korea)의 동물 관리 및 사용 위원회에의 승인을 받아 수행하였다.

제브라피쉬 및 배아를 3L 용량의 아크릴 탱크 시스템 케이지 및 6-웰 플레이트에 약물 투여 후 28℃, 낮 14시간: 밤 10시간 싸이클 조건으로 배양하였다.

유지 및 실험기간 동안 Tetrabit powder (47.5% crude protein; 6.5% crude fat; 2.0% crude fiber; 10.5% crude ash; vitamin A [29770 IU/kg]; vitamin D ₃ [1860 IU/kg]; vitamin E [200 mg/kg]; 및 vitamin C [137 mg/kg]; Tetrabit Gmbh D49304, Melle, Germany)를 제브라피쉬의 사료로 사용하였다.

2. 제브라피쉬 배아 독성 확인

선행논문 (Park KH, Cho KH. A zebrafish model for the rapid evaluation of pro-oxidative and inflammatory death by lipopolysaccharide, oxidized low-density lipoproteins, and glycated high-density lipoproteins. Fish Shellfish Immunol. 2011;31:904-910 )에 따라 수정 후 1일(dpf)째 배아에게 장막 (chorion)을 제거하지 않은 채로 석면추출액을 노출하고, 노출 48 시간 후 DHE 및 OA(Acridine orange)로 염색하고, a stereomicroscope (Motic SMZ 168; Hong Kong)로 살아있는 배아를 관찰하였으며, Motic cam2300 CCD 카메라를 이용하여 촬영하였다.

그 결과, 도 6과 같이 석면 추출물이 포함된 용액에 노출된 배아의 사멸율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 7과 같이 석면 추출물이 포함된 용액에 노출된 배아에서는 척추 발달 장애 및 산화물이 증가한 것으로 확인되었다.

또한, 수정 후 1일(dpf)째 배아에 마이크로 모세혈관 피펫을 이용한 장치(PC-10; Narishigen, Tokyo, Japan)와 magnetic manipulator (MM33; Kantec, Bensenville, IL, USA)를 갖춘 pneumatic picopump (PV820; World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 배아에 각각의 석면 추출액 33mg/mL 농도를 10 nl(nano liter)로 주입하였으며, 오차를 줄이기 위해, 난황의 동일한 위치에 미세주입하였다.

미세 주입 48 시간 후 DHE 및 OA(Acridine orange)로 염색하고, a stereomicroscope (Motic SMZ 168; Hong Kong)로 살아있는 배아를 관찰하였으며, Motic cam2300 CCD 카메라를 이용하여 촬영하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9와 같이 시료 1번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 3배 증가하였으며, 척추기형 발생율이 93 %로 나타났다. 또한 시료 2번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 2.4배 증가하였으며, 척추기형 발생율은 26 %로 나타났다.

또한, 시료 3번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 1.9배 증가하였으며, 척추기형 발생율이 11 %로 나타났으며, 시료 4번 석면 추출액을 주입한 제브라피쉬 배아는 대조군보다 세포고사가 2.4배 증가하였으며, 척추기형 발생율은 33 %로 나타났다.

상기 결과로부터 석면 추출물은 제브라피쉬 배아의 세포고사를 증가시키고, 제브라피쉬 배아의 기형 및 척추 발달 장애의 원인이 되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.