포유동물의 난소로부터 추정 줄기세포를 수득하는 방법{METHOD FOR SEPARATING PUTATIVE STEM CELLS IN MAMMAL}

본 발명은 포유동물의 난소로부터 추정 줄기세포(PSCs, Putative stem cells)를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지 성체 난소로부터 분리한 난소세포를 DMEM-F12 배지 및 줄기세포인자(SCF, Stem cell factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 추정 줄기세포(PSCs)를 확립 및 수득하는 포유동물의 난소로부터 추정 줄기세포(PSCs)를 수득하는 방법에 관한 것이다.

난자 발생과정(Oogenesis)은 암컷 난소의 난조세포에서 성숙난자가 형성될 때까지의 과정을 말한다. 난자 형성과정은 매우 복합적이며 조직화되고 효율적인 생산체계를 갖는다.

최근, '신-난자발생'이라는 개념이 주목을 받고 있는데, 성체 포유류가 난자의 재생가능한 기원이 되는 것으로 보여지기 때문이다. 한편, 난원 줄기세포는 자기 재생과 난자를 생산할 수 있는 능력을 갖는다.

난소로부터 분리한 생식세포를 이용하여 체외에서 난자 발생과정을 재현하려 한 시도들이 있었으나 대부분 성공하지 못하였으며, 아직도 체외에서의 난자 발생은 기술적인 한계가 있다. 특히 체외에서 난자 발생과정을 재현하기 위해 줄기 세포를 발현시키는 추정 줄기세포(PSCs)를 수득하는 기술은 아직 부족한 실정이다.

이에 본 발명자들은 돼지 성체 난소 유래 추정 줄기세포(PSCs)를 수득하는 방법을 발명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 발명자들은 돼지 성체 난소로부터 분리한 난소세포를 배양하여 추정 줄기세포(PSCs)의 생성 및 확립에 성공하였고, 확립된 추정 줄기세포(PSCs)의 체외 배양에 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

결국 본 발명의 목적은 추정 줄기세포(PSCs)를 수득할 수 있는 방법을 제공함에 있으며, 본 발명의 다른 목적은 상기 추정 줄기세포(PSCs)를 수득할 수 있는 방법에 필요한 조건을 확립함에 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서 본 발명은 (1) 포유동물의 성체 난소를 수득하는 단계; (2) 상기 (1)단계에 의해 수득된 난소의 조직에 효소를 처리하여 난소세포를 분리하는 단계; (3) 상기 (2)단계에 의해 분리된 난소세포를 DMEM-F12 배지를 사용하여 배양하는 단계; (4) 상기 (3)단계에서 배양된 난소세포로부터 추정 줄기세포(PSCs, Putative stem cells)를 확립하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에서 확립된 추정 줄기세포(PSCs)를 확인하는 단계;를 포함하는 포유동물의 난소로부터 추정 줄기세포(PSCs)를 분리 및 확산시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 (3)단계에 배양하는 단계에서 DMEM-F12 배지에 줄기세포인자(SCF)를 더 포함하여 배양하는 것이 바람직하고, 상기 줄기세포인자(SCF)는 20ng/ml 이상 포함되는 것이 더 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 (4)단계의 추정 줄기세포(PSCs)의 확립에 난소 세포-유래 조절 인자가 관여함이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 (5)단계의 추정 줄기세포(PSCs)의 확인에 면역형광분석에 의해 Oct 4(Octamer binding transcription factor 4, 이하Oct 4라 한다.)의 발현을 확인하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또 본 발명은 줄기세포인자(SCF)를 유효성분으로 포함하는 추정 줄기세포(PSCs) 증식 촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 줄기세포인자(SCF)를 유효성분으로 포함하는 추정 줄기세포(PSCs)의 핵 재프로그래밍 촉진용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 추정 줄기세포(PSCs)의 핵 재프로그래밍을 촉진하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

추정 줄기세포( PSCs ) 배양 배지의 조성

하기 실시예 3에 따라 수행한 결과 배양 배지에 줄기세포인자(SCF)를 첨가한 것이 추정 줄기세포(PSCs)의 증식을 농도의존적으로 향상시켰다는 것을 알 수 있었다. 줄기세포인자(SCF)는 20ng/ml 이상 50ng/ml 이하로 포함될 때 추정 줄기세포(PSCs)의 증식이 특히 향상되었다.(도 1a) 우태아혈청의 보충은 납작한 모양의 난소 체세포의 증식을 형태학적으로 자극했으며, 추정 줄기세포(PSCs)의 성장을 방해했다. 더욱이 KSR(Knockout Serum Replacement, Invitrogen)과 함께 배양한 추정 줄기세포(PSCs)는 즉시 난소 체세포와 재 응집하여 무리(clumps)를 형성하며 추정 줄기세포(PSCs)의 증식을 저해했다.(도 1a-c) 그래서, B27로 보충된 DMEM-F12(DMEM-F12/B27)에 40ng/mL 줄기세포인자(SCF)를 더한 것은 추정 줄기세포(PSCs) 성장을 위한 가장 효과적인 배지라고 할 수 있다.(도 1d)

확립된 추정 줄기세포( PSCs )의 관찰

일차 난소 세포는 DMEM-F12/B27 배지에 줄기세포인자(SCF)를 보충물로 첨가한 배지에서 배양 후 1일째 되는 날에 빽빽한 소형 원형 추정 줄기세포(PSCs)의 클러스터(지름 5-7㎛)를 포함하는 구형 집락을 형성하며, 적혈구 세포 사이사이에 배치된다. 추정 줄기세포(PSCs) 클러스터는 어둡고 빛나게 나타나며, 컨스티튜언트 세포(constituent cell)는 적혈구 크기와 비교해서 더 작거나 비슷하다.(6-8㎛) 추정 줄기세포(PSCs)는 1일 째에 적혈구 세포와 쉽게 구별되는데, 왜냐하면 적혈구는 전형적인 오목한 원반 모양이기 때문이다.(도 2a) 추정 줄기세포(PSCs)는 완전한 원형 핵을 가지며, 이는 세포의 전체 부피의 거의 대부분을 차지하는데, 이는 DAPI 염색에 의해 확인할 수 있었다(도 2b).

1주일 후에, 추정 줄기세포(PSCs)는 그 수와 크기 모두 증가해서 일부는 지름이 최대 10-12㎛까지 자란다.(도 2a; 도 7) 대부분의 추정 줄기세포(PSCs)는 배양 후 10일 째에 지름 10~12㎛가 되며, 난소 세포 집락 주위에 세포군을 형성한다.(도 2c) 이 때, 집락 및 주위의 추정 줄기세포(PSCs)는 0.05% 트립신-EDTA로 2분간 처리하여 추정 줄기세포(PSCs)를 해리시키고(dispersed) 동시에 대부분의 집락은 손상되지 않게(intact) 유지한다. 그리고 나서, 세포는 모든 남아 있는 집락을 제거하기 위해 40-㎛ 필터로 거르는 과정을 거쳐서 포막(theca) 줄기 세포 및 과립막 세포 같은 난소 세포를 얻었다. 걸러진 세포는 라미닌으로 코팅된 디쉬 또는 미토마이신 C로 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급장치 층에서 배양시켰다. 이러한 컨디션에서 배양 시작 1달 후에, 1주에 한 계대씩 추정 줄기세포(PSCs)의 증식이 감소하였다.

더욱이, 세포는 형태학적으로 원형에서 부착된 형태(adherent)로 변화하며 체세포 유형이 나타났다.(도 8a, 8b). 이러한 관찰은 현재 배양 조건이 추정 줄기세포(PSCs)의 확립 및 장기적인 유지에는 적합하지 않다는 것을 나타낸다.

추정 줄기세포(PSCs)는 일차 난소 세포에 의해 형성된 움푹 파인 곳으로 모이는 경향이 있으며(도 2a) 세포 외 분비 인자가 줄기 세포-니치(niche) 상호 작용에서 필수적인 역할을 수행하기 때문에, 본 발명자들은 난소 세포가 추정 줄기세포(PSCs)의 확립, 유지, 및 증식에 있어서 적절한 인 비트로 미세환경을 제공할 수 있다는 가설을 세웠다. 그래서, 본 발명자들은 난소 세포를 포함하는 추정 줄기세포(PSCs) 배양액을 만들었다. 배양 10일 후에, 집락 및 추정 줄기세포(PSCs) 주위를 0.25% 트립신-EDTA로 3분간 처리하였다. 이러한 처리는 난소 세포 집락 유래 세포를 포함한 대부분의 세포를 해리시킨다. 이 해리된 세포는 그리고 나서 제일 큰 포막(theca)줄기 세포의 무리만을 제거하기 위해 40-㎛ 필터를 통과시켰으며, 그 후에 젤라틴-코팅된 디쉬에 배양했다.(1:1 희석)

이러한 조건 하에서 추정 줄기세포(PSCs)는 클러스터를 형성하거나 상피세포 및 체세포의 평평한 층의 꼭대기에서 해리된 세포로서 성장한다. 세포들은 매 5-7일 마다 컨플루언스 상태에서 계대 배양을 필요로 하며, 배양액은 1:2로 희석하여 분리시켰다. 비록 세포가 성장을 계속하지만, 배양 후 1달이 넘게 지나면 남아 있는 대부분의 포막(theca) 줄기 세포 및 평평한 세포층은 점차 사라진다.(도 2c) 그래서, 추정 줄기세포(PSCs)는 장기 배양을 위해 도 6에 설명된 대로 1달 후 미토마이신 C로 처리한 MEF 공급원(feeder) 층으로 옮겨진다.

확립 이후 추정 줄기세포( PSCs )의 분자 수준에서의 특징

본 발명자들은 세포유동분석에 의해 1주일 동안 분리 및 배양 후의 충분한 추정 줄기세포(PSCs)의 증식을 밝혀내었다. 4.65%의 세포는 생식 세포 마커인 Vasa에 양성 반응을 보였고 세포 중 일부는 추가 생식 및 줄기 세포 마커(Fragilis, Thy-1, SSEA4 및 c-kit)에 양성 반응을 보였다. 이 때, 추정 줄기세포(PSCs)의 두 포퓰레이션이 관찰되었는데, 하나는 세포 지름이 5-7㎛이고, 다른 하나는 세포 지름이 10-12㎛인 것이었다. 세포는 배양 2주 후에는 크기가 10-12㎛로 똑같아지며, 생식 및 줄기 세포 마커에 대해 양성 반응을 나타내는 비율 또한 증가한다.(도 3)

본 발명자들은 PSC 포퓰레이션에서 두 가지 특징적인 부분집합을 관찰하였는데 이러한 발견은 배양 후 1달에 대부분의 추정 줄기세포(PSCs)가 높은 수준의 리프로그래밍 인자 Oct4를 발현시키는 반면에 22%의 추정 줄기세포(PSCs)만이 높은 수준의 c-kit를 발현시킨다는 것을 보여주는데, 이는 면역형광분석에 의해 확인하였다. 추정 줄기세포(PSCs)가 줄기세포인자(SCF) 없이 배양될 때는, 줄기세포인자(SCF)와 함께 배양될 때에 비해서 c-kit 양성 추정 줄기세포(PSCs)가 눈에 띄게 감소하였다.(도 4a, 4b) 또한, 줄기세포인자(SCF) 처리는 눈에 띄게 Oct4의 발현에 영향을 미쳤다.(도 4a, 4c)

줄기세포인자(SCF) 존재 하에 배양된 추정 줄기세포(PSCs)는 배양 후 1주일에 강한 세포질 염색을 나타낸 반면에(도 5b), Oct 4 발현은 세포질에서 감소했으며 배양 후 2주에 핵에서 증가되었다. (도 5c) 더욱이 줄기세포인자(SCF) 처리는 Oct4를 발현하는 큰 추정 줄기세포(PSCs)의 개수를 눈에 띄게 증가시켰다.(도 4c) 그래서, c-kit 및 줄기세포인자(SCF)는 돼지 추정 줄기세포(PSCs)의 확립에 필요한 핵 리프로그래밍에 있어서 중요하다.

배양 후 1주일에, 세포 지름이 5-7㎛의 작은 추정 줄기세포(PSCs)가 생식 세포 마커 Vasa, Stella 및 SSEA-4의 세포질 지역화를 보였다.(도 5a, 5b, 5g) 추가로, Oct 4 단백질 발현은 전체 난소 세포의 집락을 통틀어서 관찰되며, 반면에 Stella는 오직 집락 주위에 모인 작은 추정 줄기세포(PSCs)에서만 관찰된다.(도 5b) 즉, 이들은 어떠한 생식 세포 마커도 발현하지 않기 때문에 난소 세포 집락이 포막 줄기 세포 또는 체세포를 포함한다는 사실을 확인하였다.

배양 후 2주에, 추정 줄기세포(PSCs)는 세포질에서 훨씬 더 커지고 풍부해지며, 난소 세포 집락에 느슨하게 부착되며 생식 세포 마커의 발현을 유지한다.(도 5c) 생식세포낭(cyst)에서 발견되는 Sohlh1 단백질은 2주차 추정 줄기세포(PSCs)에서도 발견된다.(도 5c) 비록 모든 작은 추정 줄기세포(PSCs)가 1주 후에 생식 세포 마커를 발현하기는 하지만(도 5d) 줄기 세포 마커(예: Oct4, Nanog, Sox2, Rex1, cMyc 및 KLF4)의 발현 수준은 상당한 세포-세포 변화(variation)를 보였다.(도 5e) 4주 후에, 모든 추정 줄기세포(PSCs)는 지름이 10-12㎛이고, 줄기 및 생식 세포 마커를 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 강하게 발현하였다.(도 5c, d, e) 난모세포 마커인 SCP3 및 ZP는 배양 동안에 세포에서 관찰되지 않았다.(도 5d)

낭배 외피( epiblast )와 추정 줄기세포( PSCs )의 공통된 특징

본 발명자들은 돼지 추정 줄기세포(PSCs)의 발달 기원에 대해 조사하였다. 본 발명에서, 작은 Vasa-양성 돼지 추정 줄기세포(PSCs)(지름 5-7㎛)는 Nanog, Sox2 및 Rex1의 발현을 배양 1주 후에 감소하기 시작하는데,(도 5e) 이는 분화 상태로 변형됐음을 나타낸다. 본 발명의 돼지 추정 줄기세포(PSCs)가 유사하게 다수의 전형적인 초기 성선 원시 생식 세포 마커를 발현하기 때문에, 이러한 관찰은 추정 줄기세포(PSCs)와 Vasa-양성 매우 작은 배아-유사(Very small embryonic-like, 이하 VSEL이라 한다.) 줄기세포 및 낭배외피-유래 원시 생식 세포 간의 밀접한 연관성을 보여주는 것이다.

또한, 배양 후 4주 된 돼지 추정 줄기세포(PSCs)에서 배아줄기세포 마커(예:Nanog, Sox2, Rex1, cMyc 및 KLF4)의 강한 발현은 추정 줄기세포(PSCs)가 적절한 조건 하에서 탈분화될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.(도 5e) 본 발명자들은 때때로 작고, 아메바 과정-베어링 PSCs(amoeboid process-bearing PSCs)을 관찰했는데, 이는 아마도 성선 원시 생식 세포의 카운터파트일 것이고, 이것들은 운동능력을 유지하여 난소 조직에서 돌아다닐 것이다. 관찰된 추정 줄기세포(PSCs)의 분자 수준에서 진전(progression)을 하나로 합쳐 보면, 본 발명에서 나타난 결과는 초기 원시 생식 세포의 특징을 가지는 Vasa-양성 세포가 성체 돼지 난소에 존재하거나 생성되며, 이 작은 Vasa-양성 추정 줄기세포(PSCs)는 난소표면상피(OSE)에서 VSEL 줄기 세포로부터 유래했을 것이라는 사실을 시사한다.

인 비트로에서 추정 줄기세포( PSCs )의 유지 및 OLC 에서 유도된 분화

새롭게 확립된 새롭게 확립된 추정 줄기세포(PSCs)는 인 비트로에서 최소 6개월 간 확산되며 증식 잠재능 의 손실 없이 30번 계대 배양하였다.(도 9a) 더욱이 세포는 생식선 마커 확인의 발현을 유지했다.(도 9b) 계산된 세포 배가 시간은 48-72시간이다.(도 9c) 그 후에, 비록 추정 줄기세포(PSCs) 중에서 분화된 세포가 장기간 배양 후에 증가했을지라도 그것들은 대다수의 추정 줄기세포(PSCs)가 BrdU 및 Oct4 또는 Vasa에 대해 두 배로 양성반응을 보인 것에서 볼 수 있듯이 높은 증식률을 유지했다.(도 9d, e) 살아있는 세포 이미지는 원자 과립(germinal granule)이 세포 분열 후에 똑같이 딸 추정 줄기세포(PSCs)로 분리됨을 보여준다.(도 9f, 화살표) 이러한 결과는 살아 있는 추정 줄기세포(PSCs)가 배양액에서 유사 분열을 거쳐서 인 비트로 난자 형성의 가장 명확한 증거를 제공함을 보여준다.

또한 추정 줄기세포(PSCs)는 양성 알칼라인 포스페이트 염색을 보였으며, 염색의 강도는 세포의 다른 영역보다 원자 과립(germinal granule)에서 더 강했다.(도 9g) 세포 유전학 분석은 또한 추정 줄기세포(PSCs)가 38, XX의 정상 핵형을 가지고 있음을 보여준다.(도 9h) 추정 줄기세포(PSCs)를 면역결핍 마우스에 이식한 것은 기형종 형성에 실패했는데, 이는 이러한 세포가 다능성(다분화능, pluripotent) 줄기 세포가 아니라는 것을 나타낸다.(도 9i)

인 비보 난자 형성의 존재를 확인하기 위해, 본 발명자들은 돼지 추정 줄기세포(PSCs)에 EGFP를 코딩하는 이식 유전자(transgene)를 형질 도입(transduce)하였고, EGFP-추정 줄기세포(PSCs)를 만들기 위해 6개월 동안 배양하였다. EGFP-추정 줄기세포(PSCs)는 해리된 성체 돼지 난소 피질 조직(OCT, Ovarian Cortical Tissue, 이하 OCT라 한다.)세포를 5개의 OCT 세포 당 1개의 EGFP-추정 줄기세포(PSCs)의 비율로 재 응집시킨다. 배양 후 2주일 째에, 많은 원시 난모세포-유사세포(OLCs)가 관찰되며, 이는 EGFP-추정 줄기세포(PSCs)로부터 유래된 EGFP-양성 난모세포-유사세포(OLCs), OCT 세포로부터 유래된 EGFP-음성 난모세포-유사세포(OLCs)로 구성된다.(도 10a) 그래서, 난모세포-유사세포(OLCs)는 난소 조직과 재응집된 추정 줄기세포(PSCs)로부터 생성되는 것이 자연스러우며, 이는 마우스 및 인간 모델로부터의 초기 보고와도 일관된다.

난모세포-유사세포(OLCs)의 분화 잠재능에 대해 더 분석하기 위해 분리 후 3주 된 추정 줄기세포(PSCs)를 4주간 분화 조건 하에서 배양하였다. 이 기간 동안에, 추정 줄기세포(PSCs)의 일부는 크기가 크게 자랐으며(지름~50㎛) 다른 것들과 응집하여 난모세포-난구세포 복합체(oocyte-cumulus complex) 같은 구조를 형성한다.(도 10b, 화살표) 비록 모든 추정 줄기세포(PSCs)가 같은 배양액에 노출되더라도, ~0.1%만이 OCC-유사 구조로 발달한다.(도 11a) 이는 난소에서 일어나는 상황과 비슷한데, 난소에서는 난모 세포 성장과 분화를 위해 필수적인 미세환경을 제공하기 위하여 난모세포 대 체세포 비율이 높을 것이 요구된다.

유전자 발현 분석은 난모세포-유사세포(OLCs)가 추정 줄기세포(PSCs)같은 다수의 동일한 생식 세포 마커를 발현함을 보여주었다.(도 10c) 그러나, 난모 세포 마커인 ZP, ZPC, SCP3 및 GDF9는 분화 2주 후에 오직 난모세포-유사세포(OLCs)에서만 발견된다. 분화 3-4주 후에 이러한 난모 세포 마커들은 난모세포-유사세포(OLCs)에서 발현 수준에 도달하는데, 이는 정상 원자 소포 (germinal vesicle)-단계 난모세포에서와 유사하다(도 10c).

면역염색은 확실하게 생식 세포 마커인 Blimp1 및 DAZL이 모든 추정 줄기세포(PSCs)에서 발현되는 반면에 난모세포-유사세포(OLCs)만이 난모 세포 마커인 GDF9 및 LHX8에 대해 양성 염색을 나타냈음을 보여주었다.(도 11b; 도 12a) 또한, 난모세포-유사세포(OLCs)는 Vasa, c-kit, DAZL, Stella, SCP3 및 GDF9에 대해 양성 염색을 보인 반면에 인접한 체세포는 음성 염색을 보였는데, 이는 난모세포-유사세포(OLCs)에서 이러한 생식 세포 마커의 특정한 발현을 나타낸다.(도 12a, b) 정상 원시 난모 세포와에서와 같이 PSC-생성 난모세포-유사세포(OLCs)는 많은 세포질 원자 과립(germinal granules)을 포함한다.(도 12c) 배양 2주 후에, ~10%의 추정 줄기세포(PSCs)가 다 성장한 난모 세포의 크기와 거의 유사한 크기로 자랐다.(>100㎛; 도 7D) 세포는 또한 난모세포 및 생신 세포 마커를 발현하였다.

생성된 난모 세포가 정말로 유사분열로 활성화된 추정 줄기세포(PSCs)로부터 유래한 것인지 및 대신 일차 난소 세포로부터 유래된 난모세포를 나타내지 않는지 확인하기 위해서 본 발명자들은 SSEA4-기초 마그네틱 구슬 정렬(magnetic bead sorting)을 이용하여 추정 줄기세포(PSCs)를 분리 및 정제했는데, 이는 인간 난소 세포 배양액으로부터 얻은 작은 SSEA4-양성 세포는 배아줄기세포배아줄기세포원자 계통(germinal lineage)과 관련이 있기 때문이며(Virant-Klun et al., 2013) 작은 돼지 추정 줄기세포(PSCs)는 SSEA4의 세포질 발현을 보였다.(도 5g) 세포 정렬은 10개의 다른 난소로부터 얻은 세포에서의 결과는 759±46세포수였다.(3번의 반복된 실험의 표준편차) SSEA4-양성 세포는 그리고 나서 EGFP와 트랜스팩션하였다. 난소 유래 조절 인자의 돼지 추정 줄기세포(PSCs) 확립에 있어서의 중요한 역할 때문에, GFP-양성 SSEA 세포는 해리된 성체 돼지 OCT 세포와 위에 설명한 대로 응집하며 1달 간 배양시켰다.

마지막으로, EGFP-양성 SSEA 세포는 인 비트로에서 난모세포-유사세포(OLCs)로 분화되며, 면역결핍 암컷 마우스로 이식되었다. 인 비트로에서 더 분화된 난모세포-유사세포(OLCs)는 EGFP-양성 살아 있는 난모 세포에 대한 직접적인 증거를 제공한다.(도 12e) 난모세포-특이 전사 인자 LHX8 또는 초기 난소 여포 특이 성장 및 분화 인자 GDF9 탐지와 마찬가지로 인 비보에서 EGFP에 대한 이중 면역형광분석은 이종 이식을 통해 분포된 많은 GFP/LHX8 또는 GFP/GDF9 더블-포지티브 세포의 존재를 확인하였다.(도 12f, 화살표) 이러한 결과는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 추정 줄기세포(PSCs)의 난모 세포로의 분화 능력을 확실하게 보여주는 것이다.

추정 줄기세포(PSCs)는 인 비트로에서 최소 6개월 간 확산되며 증식 잠재능 의 손실 없이 30번 계대배양하였다.(도 9a) 더욱이 세포는 생식선 마커 확인의 발현을 유지했다.( 도 5h; 도 9b) 계산된 세포 배가 시간은 48-72시간이다.(도 9c) 그 후에, 비록 추정 줄기세포(PSCs) 중에서 분화된 세포가 장기간 배양 후에 증가했을지라도 그것들은 대다수의 추정 줄기세포(PSCs)가 BrdU 및 Oct4 또는 Vasa에 대해 두 배로 양성반응을 보인 것에서 볼 수 있듯이 높은 증식률을 유지했다.(도 9d, e) 살아있는 세포 이미지는 원자 과립(germinal granule)이 세포 분열 후에 똑같이 딸 추정 줄기세포(PSCs)로 분리됨을 보여준다.(도 9f, 화살표) 이러한 세포질 구조는 특징적으로 생식선 세포에서 관찰되며, 생식 세포 분화의 나중 단계에서 식별할 수 있게 된다. 이러한 결과는 살아 있는 추정 줄기세포(PSCs)가 배양액에서 유사 분열을 거쳐서 인 비트로 난자 형성의 가장 명확한 증거를 제공함을 보여준다.

또한 추정 줄기세포(PSCs)는 양성 알칼라인 포스페이트 염색을 보였으며, 염색의 강도는 세포의 다른 영역보다 원자 과립(germinal granule)에서 더 강했다.(도 9g) 세포 유전학 분석은 또한 추정 줄기세포(PSCs)가 38, XX의 정상 핵형을 가지고 있음을 보여준다.(도 9h) 추정 줄기세포(PSCs)를 면역결핍 마우스에 이식한 것은 기형종 형성에 실패했는데, 이는 이러한 세포가 다능성(다분화능, pluripotent) 줄기 세포가 아니라는 것을 나타낸다.(도 9i)

인 비보 난자 형성의 존재를 확인하기 위해, 본 발명자들은 돼지 추정 줄기세포(PSCs)에 EGFP를 코딩하는 이식 유전자(transgene)를 형질 도입(transduce)하였고, EGFP-추정 줄기세포(PSCs)를 만들기 위해 6개월 동안 배양하였다. EGFP-추정 줄기세포(PSCs)는 해리된 성체 돼지 난소 피질 조직(OCT, Ovarian Cortical Tissue)세포를 5개의 OCT 세포 당 1개의 EGFP-추정 줄기세포(PSCs)의 비율로 재 응집시킨다. 배양 후 2주일 째에, 많은 원시 난모세포-유사세포(OLCs)가 관찰되며, 이는 EGFP-추정 줄기세포(PSCs)로부터 유래된 EGFP-양성 난모세포-유사세포(OLCs), OCT 세포로부터 유래된 EGFP-음성 난모세포-유사세포(OLCs)로 구성된다.(도 10a) 그래서, 난모세포-유사세포(OLCs)는 난소 조직과 재응집된 추정 줄기세포(PSCs)로부터 생성되는 것이 자연스러우며, 이는 마우스 및 인간 모델로부터의 초기 보고와도 일관된다.

난모세포-유사세포(OLCs)의 분화 잠재능에 대해 더 연구하기 위하여, 분리 후 3주 된 추정 줄기세포(PSCs)(도 5i)를 4주간 분화 조건 하에서 배양하였다. 이 기간 동안에, 추정 줄기세포(PSCs)의 일부는 크기가 크게 자랐으며(지름~50㎛) 다른 것들과 응집하여 난모세포-난구세포 복합체(oocyte-cumulus complex) 같은 구조를 형성한다.(도 10b, 화살표) 비록 모든 추정 줄기세포(PSCs)가 같은 배양액에 노출되더라도, ~0.1%만이 OCC-유사 구조로 발달한다.(도 11a) 이는 난소에서 일어나는 상황과 비슷한데, 난소에서는 난모 세포 성장과 분화를 위해 필수적인 미세환경을 제공하기 위하여 난모세포 대 체세포 비율이 높을 것이 요구된다.

유전자 발현 분석은 난모세포-유사세포(OLCs)가 추정 줄기세포(PSCs)같은 다수의 동일한 생식 세포 마커를 발현함을 보여주었다.(도 10c) 그러나, 난모 세포 마커인 ZP, ZPC, SCP3 및 GDF9는 분화 2주 후에 오직 난모세포-유사세포(OLCs)에서만 발견된다. 분화 3-4주 후에 이러한 난모 세포 마커들은 난모세포-유사세포(OLCs)에서 발현 수준에 도달하는데, 이는 정상 원자 소포 (germinal vesicle)-단계 난모세포에서와 유사하며(도 10c) 이는 추정 줄기세포(PSCs)의 분화에 대한 과정에 요약되어 있다.(도 6b)

면역염색은 확실하게 생식 세포 마커인 Blimp1 및 DAZL이 모든 추정 줄기세포(PSCs)에서 발현되는 반면에 난모세포-유사세포(OLCs)만이 난모 세포 마커인 GDF9 및 LHX8에 대해 양성 염색을 나타냈음을 보여주었다.(도 12a; 도 11b) 또한, 난모세포-유사세포(OLCs)는 Vasa, c-kit, DAZL, Stella, SCP3 및 GDF9에 대해 양성 염색을 보인 반면에 인접한 체세포는 음성 염색을 보였는데, 이는 난모세포-유사세포(OLCs)에서 이러한 생식 세포 마커의 특정한 발현을 나타낸다.(도 12a, 12b) 정상 원시 난모 세포와에서와 같이 PSC-생성 난모세포-유사세포(OLCs)는 많은 세포질 원자 과립(germinal granules)을 포함한다.(도 12c) 배양 2주 후에, ~10%의 추정 줄기세포(PSCs)가 다 성장한 난모 세포의 크기와 거의 유사한 크기로 자랐다.(>100㎛; 도 12d) 세포는 또한 난모세포 및 생신 세포 마커를 발현하였다.(도 11c, 11d)

생성된 난모 세포가 정말로 유사분열로 활성화된 추정 줄기세포(PSCs)로부터 유래한 것인지 및 대신 일차 난소 세포로부터 유래된 난모세포를 나타내지 않는지 확인하기 위해서 본 발명자들은 SSEA4-기초 마그네틱 구슬 정렬(magnetic bead sorting)을 이용하여 추정 줄기세포(PSCs)를 분리 및 정제했는데, 이는 인간 난소 세포 배양액으로부터 얻은 작은 SSEA4-양성 세포는 배아줄기세포s 및 원자 계통(germinal lineage)과 관련이 있기 때문이며(Virant-Klun et al., 2013) 작은 돼지 추정 줄기세포(PSCs)는 SSEA4의 세포질 발현을 보였다.(도 5g) 세포 정렬은 10개의 다른 난소로부터 얻은 세포에서의 결과는 759±46 세포수였다.(3번의 반복된 실험의 표준편차) SSEA4-양성 세포는 그리고 나서 EGFP와 트랜스팩션하였다. 난소 유래 조절 인자의 돼지 추정 줄기세포(PSCs) 확립에 있어서의 중요한 역할 때문에, GFP-양성 SSEA 세포는 해리된 성체 돼지 OCT 세포와 위에 설명한 대로 응집하며 1달 간 배양시켰다.

마지막으로, EGFP-양성 SSEA 세포는 인 비트로에서 난모세포-유사세포(OLCs)로 분화되며, 면역결핍 암컷 마우스로 이식되었다. 인 비트로에서 더 분화된 난모세포-유사세포(OLCs)는 EGFP-양성 살아 있는 난모 세포에 대한 직접적인 증거를 제공한다.(도 11e) 난모세포-특이 전사 인자 LHX8 또는 초기 난소 여포 특이 성장 및 분화 인자 GDF9 탐지와 마찬가지로 인 비보에서 EGFP에 대한 이중 면역형광분석은 이종 이식을 통해 분포된 많은 GFP/LHX8 또는 GFP/GDF9 더블-포지티브 세포의 존재를 확인하였다.(도 11f, 화살표) 이러한 결과는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 추정 줄기세포(PSCs)의 난모 세포로의 분화 능력을 확실하게 보여주는 것이다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 돼지 성체 난소로부터 분리한 난소세포를 DMEM-F12 배지 및 줄기세포인자(SCF)를 포함하는 배지를 이용하여 추정 줄기세포(PSCs)를 확립 및 수득하는 방법을 제공함으로써, 포유동물의 난소로부터 추정 줄기세포(PSCs)를 간편한 방법으로 분리 및 정제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 추정 줄기세포(PSCs)의 확립을 위한 배지와 배지 보충물의 비교를 나타낸 그림임. a)는 MEM-알파, StemPro-34, DMEM-F12 배지를 사용한 경우의 비교. bc)는 DMEM-F12 배지를 사용한 경우 추정 줄기세포(PSCs)의 증식이 가장 뛰어남을 나타냄. d)는 줄기세포인자(SCF)의 첨가 용량 별 추정 줄기세포(PSCs) 증식의 효과를 나타냄.
도 2는 추정 줄기세포(PSCs)의 형태학적 특징을 나타내는 그림임. a)는 난소에서 분리 후 적혈구와 구별되는 추정 줄기세포(PSCs)의 형태를 나타냄. b)는 DAPI 염색에 의해 추정 줄기세포(PSCs)의 핵을 염색한 결과를 나타냄. c)는 추정 줄기세포(PSCs)의 배양 후 10일 째, 1달 째 되는 시점에서 형태학적 관찰 결과를 나타냄.
도 3은 배양 1주일 후 추정 줄기세포(PSCs)의 세포유동분석 결과를 나타냄.
도 4는 확립 도중 줄기세포인자(SCF) 제외 또는 첨가 배지에서 추정 줄기세포(PSCs) 배양 실험에 대한 결과로, 줄기세포인자(SCF) 첨가에 의한 리프로그래밍의 촉진을 나타냄. a)는 면역염색에 의한 Oct 4 및 c-kit의 탐지의 결과를 나타냄. b)는 c-kit에 양성반응을 보이는 추정 줄기세포(PSCs)의 퍼센티지를 나타내는 결과임. c)는 추정 줄기세포(PSCs)에서 Oct 4의 핵 대 세포질 지역화의 정량 결과를 나타냄.
도 5는 추정 줄기세포(PSCs)의 확립 이후 분자적 수준의 변화를 나타냄. a)-c)는 배양 후 특정 시점에서 각 마커와의 관계에서 세포질 염색 결과를 나타냄. d)-e)는 난모세포-특이 마커, 생식세포-특이 마커, 줄기세포-특이 마커에 대한 mRNA 발현 결과를 나타냄. f)는 Alexa Fluor 결과를 나타냄.
도 6a)는 추정 줄기세포(PSCs)의 분리 및 증식을 위한 과정을 나타냄. 도 6b)는 추정 줄기세포(PSCs)의 배양 도중 분화를 위한 과정과 발현된 마커를 나타냄.
도 7은 배양 후 1주일 경과 후의 추정 줄기세포(PSCs)의 형태학적 특징을 나타내는 그림임. b)는 a)를 더 확대한 그림임.
도 8a)는 라미닌-코팅된 디쉬에서 배양된 추정 줄기세포(PSCs)의 형태학적 특징을 나타내고, 도 8b)는 미토마이신 C-처리된 MEF 피더 층에서 배양된 추정 줄기세포(PSCs)의 형태학적 특징을 나타냄.
도 9는 추정 줄기세포(PSCs)의 특징 및 유지를 나타냄. a)는 MEF 공급원 세포 장기 배양 후 추정 줄기세포(PSCs)의 유지 결과를 나타냄. b)는 추정 줄기세포(PSCs) 배양 후 생식 세포 마커 염색 결과를 나타냄. c)는 추정 줄기세포(PSCs)의 세포 배가시간을 분석한 결과임. d), e)는 Oct 5와 함께 결합한 BrdU 결과를 나타냄. f)는 추정 줄기세포(PSCs)에 대한 세포 이미징 결과를 나타냄. g)는 추정 줄기세포(PSCs)에 대한 알칼라인 포스페이트 염색 결과를 나타냄. h)는 추정 줄기세포(PSCs)에 대한 핵형 분석 결과를 나타냄. i)는 추정 줄기세포(PSCs)이식 후 기형종 형성 결과를 나타냄.
도 10은 추정 줄기세포(PSCs)의 난모세포-유사세포(OLCs)로의 유도 분화를 나타냄. a)는 EGFP-양성 추정 줄기세포(PSCs)의 발현을 관찰한 결과임. b)는 분화 조건에서 배양 후의 추정 줄기세포(PSCs)의 형태학적 특징을 나타냄. c)는 난모세포-특이 마커, 생식세포-특이 마커에 대한 mRNA 발현 분석 결과임.
도 11은 추정 줄기세포(PSCs)가 OCC-유사 구조로는 거의 분화하지 않음을 나타냄. a)는 분화 조건에서 배양 후 추정 줄기세포(PSCs)에 대한 형태학적 관찰 결과를 나타냄. b)는 세포들에 대한 면역 염색결과를 나타냄. c)는 증식 조건에서 배양된 경우 각 세포 마커의 발현 결과를 나타냄.
도 12는 추정 줄기세포(PSCs)로부터 생성된 난모세포-유사세포(OLCs)의 특징을 나타냄. a), b)는 특정 마커에 대해 양성 또는 음성 반응을 나타내는 난모세포-유사세포(OLCs)에 대한 염색 결과를 나타냄. c)는 추정 줄기세포(PSCs)로부터 생성된 난모세포-유사세포(OLCs)의 특징인 생식세포 과립에 대한 관찰 결과를 나타냄. d)는 분화 조건에서 난모세포-유사세포(OLCs)의 성장에 대한 형태학적 관찰 결과를 나타냄. e)는 인 비트로에서 난모세포-유사세포(OLCs)의 분화에 대한 형태학적 관찰 결과를 나타냄. f)는 마커 발현 확인을 위한 듀얼 면역형광분석 결과를 나타냄.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 성체 돼지 난소 세포의 처리

(1) 본 발명에 사용된 돼지의 처리는 동물시험윤리위원회(수원, 대한민국)의 가이드라인에 따라서 진행하였다.(승인번호. 2009-004, D-등급)

(2) 난소(각 실험군 별로 10-12개 사용)는 사춘기 진입 전의 암퇘지로부터 지역 도살장에서 얻었다. 피질 절단(0.1-0.5mm 두께)은 외과 칼(21번, Feather Safety Razor, 오사카, 일본)을 사용하였으며 절단된 피질을 갈아서 해리시킨 후 HBSS( Hank's Balanced Salt Solution)에 용해시킨 콜라게나제 Ⅳ(Sigma-Aldrich) 1mg/ml와 함께 15분간 배양시키고 10분간 38.5℃에서 0.25% 트립신-EDTA로 처리하는 2단계 효소적 소화를 거쳤다. 트립신은 10% 우태아혈청을 첨가함으로써 중화시켰고, 조직은 약한 피펫팅에 의해 단일 세포로 해리되었다. 해리된 세포는 40㎛ 필터에 통과시킨 후 해리된 세포를 60mm 젤라틴-코팅된 조직 배양액 디쉬에 위치시킨 후 밤새 배양하였다. 일차(primary) 난자 세포를 준비하기 위해, 섬유아세포는 젤라틴-코팅 배양 플레이트의 밑바닥에 부착시켰으며 부유하는 세포들은 격렬한(vigorous) 피펫팅 후 2차 배양 플레이트를 통과시켰다. 세포는 5% CO ₂ 환경에서 38.5℃에서 유지시켰다. 그 후 젤라틴-코팅된 24-웰 플레이트(Corning)의 한 웰 당 1-2x10 ⁴ 개의 세포를 플레이팅하였다. 배양액의 절반은 하루 걸러 교체시켰다.

실시예 2. 추정 줄기세포( PSCs )의 확립

추정 줄기세포(PSCs)는 자석 구슬 정렬(Magnetic bead sorting)을 통한 SSEA4에 의한 추정 줄기세포(PSCs)의 발현에 기초하여 분리시켰다. 2단계의 효소적 소화를 거친 후에, 난소 세포는 항-SSEA4 항체와 함께 얼음 위에서 30분간 배양시켰다. HBSS로 세척 및 재현탁 후에, 마우스 항-IgG 자석 구슬(Miltenyi Biotec)을 세포 현탁액에 추가시켰고 그 후 얼음 위에서 30분 간 더 배양시켰다. 한번 더 세척한 후에, 준비된 세포는 MACS Cell Separation 컬럼에 로딩하였고 제조자의 지시에 따라 분리시켰다.(Miltenyi Biotec) 작은(지름 5-7㎛) SSEA4- 포지티브 추정 줄기세포(PSCs)를 얻고 하기에 설명한 것에 따라 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)과 함께 트랜스팩션하였다.

실시예 3. 추정 줄기세포( PSCs )의 배양 배지의 조성

처음에 MEM-Alpha, StemPro-34 및 DMEM-F12는 추정 줄기세포(PSC) 배양액 조건의 최적화를 위해 사용하였다. 비록 본 발명에서 GDNF, bFGF(FGF2), EGF, LIF 같은 배양액 보충물을 사용하였음에도 불구하고, 이러한 배양 조건은 돼지 추정 줄기세포(PSCs의 확립을 위해서는 불충분하다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 10% 우태아혈청으로 보충된 DMEM-F12의 유용성 또는 10% KSR(Knockout Serum Replacement, Invitrogen)의 유용성을 실험했고, B27(Invitrogen) 또는 다양한 농도의 줄기세포인자(SCF; 키트 리간드로도 알려져 있음)로 보충된 DMEM의 유용성에 대해 검토하였다. (첨가된 줄기세포인자(SCF)의 농도는 각각 0. 10, 20, 30, 40, 50 ng/mL; STEMCELL Technologies, Vancouver, Cananda) (도 1)

실시예 4. 강화된 녹색 형광 단백질( EGFP ) 이식 유전자의 추정 줄기세포( PSCs )로의 형질 도입

HIV-1를 기초로 한 자가-활성 렌티바이러스 벡터 플라스미드(pLV-EGFP, lentiviral vector plasmid)를 사용하여 형질 도입을 수행하였다. 렌티바이러스 벡터 형질 도입을 위하여, 추정 줄기세포(PSCs) 단일-세포 현탁액(1-2x10 ⁶ 개의 세포)를 렌티바이러스 벡터 100mL와 혼합하여 6시간 동안 방치하였다.(최종 농도 10 ⁷ U) 추정 줄기세포(PSCs) 배양액을 세척한 후에, 형질 도입된 세포는 MEF feeder 세포의 층(layer) 위에서 배양시켰다.

실시예 5. 면역세포화학염색

세포와 조직을 고정시킨 후에, 정량분석을 수행하였다.(Bui et al., 2010) 항체와 사용한 희석액은 표 1에 요약하였다.

[표 1]

표 1은 면역조직화학에 사용된 항체와 희석 비율을 나타냄.

실시예 6. BrdU ( 브로모데옥시유리딘 ) 결합 분석

추정 줄기세포(PSCs)를 BrdU(50㎍/mL; Sigma-Aldrich)을 포함하는 배양액과 함께 5일간 배양시켰다. DNA 합성의 확인을 위해 수행하였다.(Bui et al., 2010)

실시예 7. 세포유동분석 및 RT ( Reverse Transcription )- PCR

세포는 하기 선행문헌에 공지된 대로 준비되고 처리되었다. (Bui et al., 2010) 합성된 cDNA에 대한 RT-PCR 수행에 필요한 프라이머는 하기 표 2에 표시하였다.

[표 2]

표 2는 RT-PCR에 사용한 프라이머를 나열함.

실시예 8. 추정 줄기세포(PSCs)의 난모세포-유사세포(OLCs)로의 분화

(1) PSC 분화와 (2) PSC 성장의 2단계 배양 시스템을 확립하였다. 먼저, 추정 줄기세포(PSCs)를 24-웰 조직 배양 플레이트(Corning)의 한 웰 당 폴리-D-라이신(0.05mg/mL; Sigma-Aldrich) 및 라미닌(laminin, 0.005mg/mL; Sigma-Aldrich)으로 처리한 1x10 ⁴ 개의 세포를 플레이팅 하였다. 세포는 분화 배양액 내에서 5% CO2 환경에서 38.5℃를 유지하였으며, 분화 배양액은 DMEM(Invitrogen), 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen), 5% 우태아혈청(Invitrogen), 5% 돼지 여포액(Sigma-Aldrich), 0.23mM 피루브산나트륨(Sigma-Aldrich), 0.1mM 비필수아미노산(Invitrogen), 2mM L-글루타민(Millipore) 및 0.1mM β-머캅토에탄올(Millipore)을 함유한다. 배양액의 절반은 매 2-3일 마다 교체하였다. 거대세포를 함유하는 다수의 집합체(aggregate)는 3-4주 후에 형성되었다.

다음으로 추정 줄기세포(PSCs)의 성장을 위해, 집합체를 수집한 후에 TCM199(Invirogen), 3mg/mL BSA(Sigma-Aldrich), 5㎍/mL 인슐린/트랜스페린(transferrin)/셀레늄 A(Invitrogen), 0.23mM 피루브산나트륨(Sigma-Aldrich), 1mg/mL 페투인(fetuin), 1ng/mL EGF, 0.05 IU 여포자극호르몬(Sigma-Aldrich), 0.03 IU 황체 호르몬(Sigma-Aldrich), 0.01mM 디부티릴 cAMP(Sigma-Aldrich) 및 1% 폴리비닐피롤리딘(PVP) 360(Sigma-Aldrich)을 함유하는 성장 배양액으로 옮겼다. 집합체로 된 세포는 2주간 배양시켰으며, 배양액의 절반은 매 2-3일 마다 교체하였다.

실시예 9. 난소 내 PSC 주입 및 이종 이식( xenografting )

24 개의 돼지 OCT 조각(2x2x1mm)에 각각 ~1x10 ³ EGFP-PSCs)를 주입시켰는데, 이 때 10㎕ NanoFil 시린지 및 35-게이지의 비스듬한 바늘(World Precision Instruments)를 사용하였다. 수여자 누드 암컷 마우스는 마취시킨 후 돼지 난소 조직의 피하 삽입을 위해 마우스의 등쪽 측면을 따라서 작은 절개부위를 만들었다. (마우스 당 네 번의 이식) 이종 이식은 이식 후 1-2주 후에 제거되었으며, 4% 포름알데히드로 고정시켰고, 파라핀을 단단히 박아넣은 후에 GFP에 대한 마우스 단일항체를 사용하여 면역조직화학분석을 하기 위해 연속으로 절단(6㎛)하였다. 고온 항체 회수를 0.01M 구연산나트륨 완충용액(pH 6.0)을 사용하여 수행하였다. 식힌 후에, 절단된 부분은 제조자의 지시에 따라 내인성 과산화효소의 활성을 막기 위해서 10분간 메탄올에 용해시킨 3% 과산화수소에서 10분간 배양시켰다.(Vector Laboratories) 절단 부위는 1시간 동안 1% 정상 염소 혈청을 사용하여 블락되었고 그 후에 면역염색을 위해 GFP 항체와 함께 배양되었다. 음성 대조군(운반체를 주사한 이종이식된 조직)도 유사하게 수행하였는데 양성 신호를 보이지 않았다. 이 관찰 결과를 확인하고 확장하기 위해서, 이중 면역형광-기초 GFP탐지 및 이종이식된 인간 난소 조직에서 GDF9 또는 LHX8에 대해 DAPI 대비염색을 수행하였다.

실시예 10. 핵형 및 기형종 형성

세포는 하기 선행문헌에 공지된 방법대로 준비되고 처리되었다.(Bui et al., 2012)

실시예 11. 통계학적 분석

각 실험은 최소 5번 반복하였다. 50개 이상의 면역염색 시료는 각 그룹별로 실험하였다. 결과는 평균±표준편차(SEM)로 나타냈다. 데이터는 Student's t-시험을 적용하여 분석하였다.