技术领域
[0001] 本
发明涉及隐形眼镜护理领域，具体为一种隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物及其使用方法。
背景技术
[0002] 隐形眼镜(contact lens)，也叫
角膜
接触镜，是一种戴在眼球角膜上，用以矫正视
力或保护眼睛的镜片。根据材料的软硬它包括硬性、半硬性、软性三种，隐形眼镜不仅从外观上和方便性方面给近视、远视、散光等屈光不正患者带来了很大的改善。而且
视野宽阔、视物逼真，此外在控制青少年近视、散光发展，
治疗特殊的眼病等方面也发挥了特殊的功效。
[0003] 但是，隐形眼镜在佩戴、存储和处理的过程中经常会接触到
革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌，
真菌等多种
微生物，就为微生物在其上附着、生长和增殖提供了温床。而附着了微生物的隐形眼镜在佩戴的过程中可以在眼球表面停留较长的时间，当眼角膜受到一定的损伤时，微生物会快速的在创伤处生长和增殖，从而引起感染并危害人类的眼部健康。调查显示，金黄色葡萄球菌和莫阿菌，是慢性细菌性结膜炎最常见的两种病原体；而真菌是造成人类眼部感染的主要致病菌，而一旦发生真菌感染被治愈的机会较小，是造成眼盲的主要感染之一。隐形眼镜的使用者如果手部不洁净，一旦使隐形眼镜上附着具有生物活性的真菌孢子后，再进行佩戴和使用就大大增加了眼部真菌感染的
风险。因此，在隐形眼镜表面增加一层具有抗菌作用的涂层可以大大减少致病微生物在隐形眼镜表面附着的机会。
[0004] 而对于抗菌涂层的选择上，现有已知的可用涂层有抗生素、乳
铁蛋白、金属螯合剂、取代或为取代的多元氛，
氨基酚，醇，酸，以及胺衍生物，但是这些微生物涂层都有其无法克服的缺点无法达到满意效果。抗生素的过度使用会导致微生物产生抗药性，对人类的健康长生更为不利的影响。因此，需要选择一种具有较高杀菌效果和广谱抗微生物活性并且具有较低细胞毒性的涂层。从而制备出具有抗微生物涂层的隐形眼镜，使其具有广谱抗菌性和高效杀菌效果，并且对佩戴者产生最小的不适感。这样的隐形眼镜才具有长期佩戴的安全性。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有的
缺陷，提供一种隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的制备方法，其包括以下步骤：
[0006] 1)、采用化学合成法，合成抗菌肽粗品；或者利用基因工程的方法，用
生物反应器将含有抗菌肽基因的载体在细胞中表达出该抗菌肽；
[0007] 2)、用色谱纯化该抗菌肽粗品，使其纯度大于99％；使用反相高效液相色谱(rHPLC)纯化具有分离效果好、
分辨率高、回收率高的特点。经化学合成制备的抗菌肽也可采用高效液相色谱进行分离纯化。
[0008] 3)、将透明质酸用0.01～0.02g/mL缓冲溶液溶解，调节pH为7.0～8.0；
[0009] 4)向步骤3)中所得透明质
酸溶液中加入步骤2)中所得的纯化后的抗菌肽，使透明质酸分子与抗菌肽的
质量比为10～200:1，同时加入EDC或者NHS催化缩合10～24小时；
[0010] 5)、凝胶纯化步骤4)中的缩合物，去除未发生反应的抗菌肽和透明质酸以及EDC、NHS等杂质；对纯化后的缩合物进行
核磁共振确认。
[0011] 进一步的，该制备方法中所述的抗菌肽是
哺乳动物源抗菌肽，包括但不局限于以下种类：防御素(Defensins)家族，组织蛋白酶抑制素(Cathelicidins)家族，富含组氨酸蛋白(Histatins)家族，以及富含甘氨酸蛋白(Hglyrichin)家族。
[0012] 一种隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的使用方法，包括以下步骤：
[0013] 将隐形眼镜表面抗菌涂层组合物用蒸馏
水配置成0.01～0.02g/mL的溶液，将待涂层的隐形眼镜数片放入该溶液，边搅拌边滴加1～10倍于隐形眼镜表面抗菌涂层组合物的摩尔浓度的交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，室温下反应5～10个小时，取出隐形眼镜，清水淋洗干净。
[0014] 进一步的，所述的透明质酸的分子量在10000～100000 Da之间。
[0015] 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。按抗菌肽来源分为微生物抗菌肽、
植物抗菌肽、动物抗菌肽及人源性抗菌肽(Host Defense Peptide)等。动植物体每天要与环境中几百万种的病原菌接触，随时都有被感染的可能，单单依靠病原的特异性免疫应答是远远不够的，因为它们的反应速度非常慢，大致需要7天的时间，所以大自然就选择出了速度很快且具有广谱抗菌活性的抗菌肽。抗菌肽可以抑杀多种细菌和真菌(包括对抗生素产生耐药性的突变种)，它们还可以杀死某些寄生虫，甚至对含包膜的病毒都起作用。
[0016] 近年来抗菌肽得到了广泛研究，大量文献报道人工合成的人源抗菌肽具有广谱抗菌和良好的
生物相容性，对正常哺乳动物的细胞不会造成损伤，在应用过程中不会产生不良影响，但是对癌细胞株、细菌、以及部分病毒表现出明显的杀伤作用，因此在抗菌领域具有较为广阔的应用前景
[0017] 因此我们选择一种生物体内产生的天然具有广谱抗菌效果的阳离子多肽—抗菌肽(antimicrobial peptides)，也叫抗微生物肽，作为抗微生物的涂层选择。抗菌肽的氨基与低分子量透明质酸的羧基进行缩合反应，然后在产物的稀溶液里，通过加入交联剂，与隐形眼镜通过共价键涂层和固定。在保证高效杀菌效果和广谱抗菌性的前提下，增加隐形眼镜表面的保水性，增加佩戴的舒适感。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 一、本发明的隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物，不仅具有广谱抗菌消毒作用，良好的生物相容性,佩带后眼睛不会产生不适的感觉；
[0020] 二、本发明的隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物使用方法简单，且在隐形眼镜表面涂布后与隐形眼镜表面涂共价结合牢固，高压消毒或者盐水冲洗，等均不会改变涂层的生物活性，
稳定性高，保水性强。
附图说明
[0021] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成
说明书的一部分，与本发明的
实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0022] 图1是本发明实施例1中隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的核磁谱图；
[0023] 图2是本发明实施例2中隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的核磁谱图；
[0024] 图3是本发明实施例4的稳定性实验的结果。
具体实施方式
[0025] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 实施例1
[0027] 一种隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的制备方法，其包括以下步骤：
[0028] 1)、采用固相化学合成方法合成出组织蛋白酶抑制素(cathelicidins)家族中的抗菌肽LL-37，其氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；
[0029] 2)、将合成的Cathelicidins LL-37粗品用含乙腈水溶液溶解后，离心，保留上清液，弃去沉淀。反相液相色谱系统为，SCL210AVP液相色谱仪(日本岛津公司),包括系统
控制器、LC210ATVP色谱
泵、进样
阀、SPD2 M10AVP
二极管阵列检测器,CLASS2VP5.33色谱工作站。色谱柱为200×4mm I.D.的不锈
钢管,用匀浆法装填德国进口Nucleosil400027 C18反相色谱填料。取一定浓度的多肽样品溶液进样至已用流动相A液[水+0.1％TFA(VPVP％)]平衡过的反相高效液相色谱(rHPLC)上,然后进行线性梯度洗脱直至达到要求的B液浓度[乙腈+0.1％TFA(VPVP％)]，分离纯化得到的分子量为4493.33的CathelicidinsLL-37，纯度大于99％，经过冻干收集白色粉末。
[0030] 3)、将400mg透明质酸HA(分子量50,000)溶于20ml缓冲溶液(2％,w/v)，调节pH为7.0；
[0031] 4)、加入250mg EDC，130mg NHS和10mg LL-37缩氨酸共轭反应10小时使反应完全，
[0032] 5)、经凝胶纯化，去除未发生反应的抗菌肽和透明质酸以及EDC、NHS等杂质；冻干，对纯化后的缩合物进行核磁共振确认，结果如图1所示。
[0033] 在10ml蒸馏水中，加入200mg所得隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物，向该溶液中放入10片某热销品牌的隐形眼镜，在均匀搅拌下，滴加20mg交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(分子量:220.26)，室温下反应5～10个小时，取出隐形眼镜，清水多次淋洗至无化学残留。
[0034] 实施例2
[0035] 一种隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物的制备方法，其包括以下步骤：
[0036] 1)、采用 使用 经典的 FMOC固相合 成方 法制备，抗菌 肽Indolicidin ILPWKWPWWPWRR-NH2，
[0037] 2)、用55％的三氟乙酸(TFA)和2.5％胰蛋白酶
抑制剂(TIS)以及2.5％的水混合溶液把该抗菌肽从
树脂上分离开来，经过
冰乙醚沉淀后，通过C18柱以水-乙腈作为洗脱液进行高效液相色谱纯化,分子量1906.32。
[0038] 3)、将300mg透明质酸HA(分子量45,000)溶于20ml缓冲溶液(2％,w/v)，调节pH为7.5；
[0039] 4)、加入200mg EDC，120mg NHS和10 mg LL-37缩氨酸共轭反应18小时使反应完全，
[0040] 5)、经凝胶纯化，去除未发生反应的抗菌肽和透明质酸以及EDC、NHS等杂质；冻干，对纯化后的缩合物进行核磁共振确认，结果如图2所示。
[0041] 在10ml蒸馏水中，加入280mg所得隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物，向该溶液中放入10片某热销品牌的隐形眼镜，在均匀搅拌下，滴加25mg交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(分子量:220.26)，室温下反应6～10个小时，取出隐形眼镜，清水多次淋洗至无化学残留。
[0042] 实施例3
[0043] 对实施例1和2中制备的隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物进行抗菌活性评价，测试其对革兰阳性和革兰阴性菌的活性，包括耐氨苄青霉素和
链霉素的大肠杆菌和多药耐药金黄色葡萄菌，结果如表1所示。细菌在肉汤培养基中37℃培养过夜。当每毫升肉汤培养4 5
基中细菌浓度为2.0×10 ～2.0×10 个时，将实施例1和实施例2的隐形眼镜表面抗菌涂层用组合物用缓冲液两倍稀释，接种后，37℃培养。18小时后，以生理盐水作为阳性对照，计算每个样品的抑制百分比。细菌的生长曲线通过分光光度计600纳米处的OD值来测量。
平均三次取平均值。
[0044] 表1 含透明质酸与抗菌肽键合物的保存液对细菌生长的抑制效果[0045]
[0046] 实施例4
[0047] 将实施例1和2中制备的具有抗菌涂层的隐形眼镜，各取三片，以未涂抗菌层的隐形眼镜为对照，放入10毫升的生理盐水中，使用磁力搅拌器均匀溶液。在37摄氏度下，连续观察7天，每天取出1ml溶液，通过在280nm的紫外吸收测定析出的抗菌肽含量，然后重新加入1ml生理盐水，保持体积不变。实验结果如图3所示。抗菌涂层非常稳定，在7天中只有多肽少数析出。
[0048] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
