技术领域
[0001] 本
发明涉及一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
[0002] 自身免疫性
疾病(以下简称“自免”)是免疫系统对自身
机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下，免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移
植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当作外来物并对其进行攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的
抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。若不及时有效地加以控制，其后果十分严重：免疫系统的攻击会影响人体器官，且通常会终身对其进行攻击；有时还可能同时对身体众多部位造成损伤。早期筛查、诊断对管理和
治疗自免来说非常重要，在早期阶段发现可避免或延迟目标器官或组织发生无法补救的损伤。
[0003] 重症肌无
力(MG)是由自身抗体引起的、细胞免疫依赖的、补体参与的主要累及神经肌肉接头突触后膜，引起神经肌肉接头传递障碍，出现骨骼肌收缩无力的获得性
自身免疫性疾病。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。MG在各个年龄阶段均可发病。在40岁之前，女性发病率高于男性；40～50岁男女发病率相当；50岁之后，男性发病率略高于女性。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆
碱酯酶
抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、
预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。
[0004] MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶
抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体 (AChR)，乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)与NMJ上的乙酰胆碱受体(AChR)相结合，导致AChR数量减少和功能的丧失，AchR-Ab阳性是MG的主要免疫学致病机制，AchR-Ab在MG 中的阳性率为80％以上。但AchR-Ab并非存在于所有的MG患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无相关性。近年研究发现，部分MG患者血清中存在针对骨骼肌和心肌横纹肌组分的抗体，包括肌球蛋白、肌动蛋白、细丝蛋白等，这些抗体称为横纹肌抗体。在约95％重症肌无力伴胸腺瘤(MGT)及50％晚发型MG患者血清中存在2种横纹肌抗体，即肌联蛋白(titin)和兰尼碱受体(RyR)抗体[2]。其中Titin-Ab对诊断MGT的敏感性高，而RyR-Ab 对诊断MGT的特异性高[3]。
[0005] 兰尼碱受体(RyR)是肌浆网中的
钙离子释放通道，连接肌
纤维膜的T管和肌质网。T管的压力
感受器二氢吡啶受体传递神经冲动至RyR，导致通道开放。肌浆网中的钙离子顺浓度差释放到胞质中，胞质中的钙离子与肌钙蛋白(troponin C,TnC)结合触发肌肉收缩。RyR受体有2种亚型：心肌RyR 2受体和骨骼肌RyR 1受体，MG患者血清中的RyR抗体可与这2种受体产生交叉反应。RyR-Ab可能通过干扰RyR和二氢吡啶受体的作用，从而抑制RyR通道的开放和钙离子的释放，使骨骼肌不能有效的收缩，导致肌无力的发生[4]。RyR-Ab在MG患者中的阳性率为13％～38％，在MGT中的阳性率为70％～80％，并且与MG患者的病情严重程度相关。 RyR-Ab对MGT的灵敏度为70％，特异度为95％[5]。目前RyR-Ab的检测方法主要包括ELISA 检测和免疫印迹法(Western blotting)检测[6]。这两种方法都存在重现性不高，结果不够准确，操作不便等
缺陷。目前随着免疫检测技术的发展，
磁珠法化学发光技术的优势愈发明显，特别是磁珠法电化学发光技术的准确性，灵敏度，重现性等性能明显好于ELISA等方法。目前尚无电化学发光技术用于RyR-Ab的检测。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是：为解决
现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测 RyR-Ab的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及制法。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，
生物素标记的RyR工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，RyR-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
[0009] 优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2 mol/L的
磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的BSA(
牛血清
白蛋白)和/或
酪蛋白、0.05～1wt％的Brij-35(月桂醇聚
氧乙烯醚)和/或Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)和/或Tween-20(山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚)、0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮化钠。
[0010] 优选地，所述抗人IgG抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab
片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
[0011] 优选地，所述生物素标记的RyR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH 为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO 缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％
氯化钠、1～5 wt％
蔗糖、0.05～2wt％
小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100 和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0012] 优选地，所述检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒还包括RyR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述RyR-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、 0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～
0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0013] 优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris 缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L三丙胺、0.01～2wt％的Brij-35和/或 Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0014] 优选地，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的氢氧化
钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类
表面活性剂。
[0015] 本发明还提供一种上述检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的RyR工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
[0016] 优选地，所述生物素标记的RyR抗原的制备方法为：将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化的生物素与RyR按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，
透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的RyR。
[0017] 优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将Ru-NHS(NHS活化的三联吡啶钌)与pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘
氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 本发明提供了一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素
信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现
血液样本中RyR-Ab的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试
软件，只需测试样本即可定量检测样本中的RyR-Ab含量，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
[0020] 现在对本发明作进一步详细的说明。
[0021]
实施例1检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制备方法
[0022] 1)包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备
[0023] 将链霉亲和素包被磁珠微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用pH＝7.4，浓度为0.1mol/L 的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬至浓度为0.75mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的BSA、 0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮化钠。
[0024] 2)生物素标记的RyR抗原的制备
[0025] 准确称取1mg RyR抗原，加入适量PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)调整抗体总浓度至1mg/mL，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次
透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
[0026] 准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量
水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；
[0027] 将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1 小时，得生物素标记的RyR抗原溶液粗产品；
[0028] 将生物素标记的RyR抗原溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的RYR抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
[0029] 3)三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备
[0030] 用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗人IgG抗体溶液；
[0031] 于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
[0032] 4)生物素标记的RyR抗原工作液以及三联吡啶钌标记抗人IgG抗体工作液的制备[0033] 配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的RYR抗原工作液，以及抗体浓度为8 mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液。
[0034] 5)校准品和质控品工作液的配制
[0035] 配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、 0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制RyR-Ab校准品和质控品工作液，校准品共6个点， RyR-Ab的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、4ng/mL、15ng/mL、40ng/mL。质控品分高、低两个浓度，RyR-Ab的浓度分别为0.8ng/mL、15ng/mL。
[0036] 6)清洗液的配制
[0037] 配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％Brij-35。
[0038] 7)化学发光底物液的配制
[0039] 配制pH＝6.5，0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。
[0040] 8)试剂分装及组装
[0041] 将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的RyR抗原工作液12mL/瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独
包装，保存于 20～25℃。
[0042] 实施例2使用本发明的试剂盒检测RyR-Ab的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
[0043] 将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的RyR抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；
[0044] 于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液，37℃孵育10 分钟，形成
磁性复合物悬浮液；
[0045] 将磁性复合物悬浮液置于
磁场内，清洗液流过并洗涤所述磁性复合物；
[0046] 向洗涤后的磁性复合物中注入电化学发光底物液，使用
光电倍增管检测其发光强度。由光电倍增管所得信号值和定标曲线推算出RyR-Ab的含量。
[0047] 实施例3本发明的试剂盒的性能评估
[0048] 1)试剂灵敏度的研究
[0049] 试剂灵敏度是根据最低
检测限(Limit of Blank,LoB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M 和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(0.2ng/mL) 之间的浓度-RLU均值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即LoB。
[0050] 以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂LoB为0.009ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.01ng/mL以下。
[0051] 表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
[0052]
[0053] 2)本发明试剂盒的重复性的研究
[0054] 检测抗RyR抗体浓度为1.89ng/mL、10.65ng/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。优良的重复性是电化学发光平台的一个显著优点，可实现准确可重现的测定。
[0055] 表2本发明试剂盒的重复测定结果
[0056]
[0057] 3)本发明试剂盒的准确度测定结果
[0058] 由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为0.5ng/mL、2ng/mL、8ng/mL三个浓度的RyR-Ab标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于5％。
[0059] 表3本发明试剂盒的准确度测定结果
[0060]
[0061] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的
权利要求。
[0062] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
[0063] 参考文献
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