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一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组及 试剂盒

阅读：712发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种单管人脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数与点突变检测、携带者分型的引物组及试剂盒。该引物组其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示。引物组设计合理，特异性高；减少了扩增偏倚性低，保证定量准确；引入识别序列，实现对SMN1和SMN2第7号外显子转换情况辨识；引入了UDG酶、切割扩增产物，避免污染。单管同时实现人肌萎缩症SMN1/2基因拷贝数检测和SMN1/2中国人群SNP位点检测、NAIP和GTF2H2基因拷贝数检测、患者(I～IV型)与携带者(“1+0”和“2+0”)分型等临床用途。本方法和试剂盒检测快速、结果准确、成本适宜，适用仪器临床占有率高，适宜在临床中应用。，下面是一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组及试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，仅仅在核苷酸序列如SEQ ID NO.1或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物的5’末端采用荧光标记物标记、核苷酸序列如SEQ ID NO.3～14所示引物不进行标记、且SEQ ID NO.15～16所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.17～18所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.19～20所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.21～22所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.23～24所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.25～26所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；且SEQ ID NO.27～28所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.29～30所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.31～32所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.33～34所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.35～36所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；且SEQ ID NO.37～38所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；
且以上5’末端采用荧光标记物标记的引物分为以下3组，每组引物带有不同的荧光标记物：
SEQ ID NO.1或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物；
SEQ ID NO.19～20所示引物中的任一条、SEQ ID NO.21～22所示引物中的任一条、SEQ ID NO.23～24所示引物中的任一条、且SEQ ID NO.25～26所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；
SEQ ID NO.15～16所示引物中的任一条、且SEQ ID NO.17～18所示引物中的任一条、SEQ ID NO.27～28所示引物中的任一条、SEQ ID NO.29～30所示引物中的任一条、SEQ ID NO.31～32所示引物中的任一条、SEQ ID NO.33～34所示引物中的任一条、SEQ ID NO.35～
36所示引物中的任一条、SEQ ID NO.37～38所示引物中的任一条。
3.利要求1所述引物组在制备人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒中的应用。
4.一种人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述权利要求1所述的引物组中各引物的在PCR反应体系中工作浓度范围为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物0.5～0.7μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物0.5～0.7μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示引物0.05～0.15μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示引物0.05～0.15μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示引物
0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物0.1～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示引物
0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物0.1～0.2μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示引物0.2～0.3μmol/L。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应混合液、PCR酶混合液、SMN校准品、SMN质控品、LIZ Size、或稀释液中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液含有Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶和UDG酶。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，SMN校准品为含有SMN1的第7号外显子、SMN2的第7号外显子、NAIP第4号外显子、NAIP第5号外显子和GTF2H2第2号外显子，其拷贝数均为2的正常人样本基因组DNA。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，SMN质控品为：SMN1基因的第7号外显子拷贝数≤1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数≥1，且NAIP基因的第4号和第5号外显子以及GTF2H2基因的第10号外显子的拷贝数为0～2的人基因组DNA。

说明书全文

一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组及 试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组及试剂盒。

背景技术

[0002] 脊髓性肌萎缩症(SMA)以脊髓前角细胞(即下运动神经元)和脑干细胞核的进行性退变和丢失导致的肌无力、肌萎缩为特征的隐性遗传病。在针对SMA的多种族研究表明，SMA的总体携带率频率为1/40～1/100，发病率约为1/11000，中国人群的携带率则约为1/50。

[0003] 运动神经元存活基因(SMN，NCBI#6606)位于人5号染色体的5q13位置，包括端粒侧的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒侧的运动神经元存活基因2(SMN2)。SMN1和SMN2高度同源，均含有9个外显子，仅存在5个碱基的差异。

[0004] SMA致病机制为运动神经元基因1(SMN1)的缺失、转换以及点突变等原因导致SMN蛋白的功能缺陷。ACMG发布的《SMA检测的技术标准和指导原则》统计发现95％的SMA患者为SMN1基因第7号外显子纯合缺失(包括缺失、SMN1转换为SMN2等突变类型)导致；5％为一条染色体上SMN1基因第7号外显子缺失，另一条染色体上SMN1基因发生点突变导致；其他的为复杂杂合突变导致，发生率极低。SMN1基因的g.27134T＞G和g.27706-27707delAT一般只出现在SMN1拷贝数≥3的样本中，若拷贝数为2的样本中出现该突变，则是2+0的可能性很高。疾病临床表型的轻重则与相关修饰基因SMN2、NAIP、GTF2H2以及H4F5存在一定的相关性，例如(1)SMN2基因，能代偿SMN1基因功能，其拷贝数情况和临床表型密切相关；(2)神经元细胞凋亡抑制蛋白基因(NAIP)，能间接抑制神经细胞凋亡，基因发生致病性缺失突变会导致SMA患者的病情加重；相关文献显示与SMA相关的基因缺失主要在该基因的第4号、第5号外显子；(3)通用转录因子II H2基因(GTF2H2)和NAIP呈正相关，也能影响SMA的表型情况；相关文献显示与SMA相关的基因缺失主要在该基因的第10号外显子。

[0005] 目前，针对该病的防治策略主要是通过携带者筛查来指导优生优育、利用遗传特征或临床表型实现分型指导患者治疗护理，具体表现在临床诊断应用包括患者的诊断、表型分型(I～IV型)以及携带者筛查(“1+0”型和“2+0”型)等方面。基于上述应用，目前涌现出来满足上述单一应用或组合应用需求检测技术及产品：

[0006] (1)聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)技术仅能检测SMN1的纯合缺失突变型患者。

[0007] (2)实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)：成本低、周期短，仪器临床应用广，相应开发的产品比较多，例如CN201310616780针对SMN1和SMN2及NAIP基因的拷贝检测，但无法针对点突变检测，无法提示“2+0”型携带者情况；CN201410767333针对SMN1/2的第7号和第8号外显子拷贝数检测以及部分点突变检测，但未对SMN基因外的修饰基因检测，也无法提示“2+0”型携带者情况；CN201510362673仅针对SMN1第7号外显子拷贝数检测；CN201510066921针对SMN1/2的第7和第8号外显子以及欧美人群发现的SNP位点检测，但未对SMN基因外的修饰基因检测，也无法提示“2+0”型携带者情况。目前qPCR开发的产品检测范围不够会导致临床应用不足、且单管检测通量不够(单管只能最多4种靶标)、相对定量不一定准确(每管需要内控作为质控、基于传统的扩增阻滞原理设计的引物不能有效区分SMN1和SMN2基因等)，并不能有效满足S MA检测多种临床应用需求。

[0008] (3)多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)：外资独家专利技术，需多对内参基因导致设计繁琐、试剂成本高、耗时长，一般多应用于科学研究，限制上述于临床场景的应用。

[0009] (4)基质辅助激光解析电离时间质谱技术(MALDI-TOF)：外资专利技术，且仪器及试剂均为闭环，导致仪器、试剂均为封闭系统其成本高昂，导致目前尚无相关SMA临床适用产品。

[0010] (5)高通量测序技术(NGS)：建库试剂开放，可自定义检测项目，但其检测成本高、周期长，因此只能配套其他检测项目进行，因此该平台开发的SMA检测产品主要发生高成本医疗费用领域，如胚胎植入前筛查临床筛查(专利号201510605049.4)或者主要是针对算法、数据分析开发优化(专利号CN201710129136)。

[0011] (6)数字PCR技术(Digital PCR)：能绝对定量，但单管通量不足，如检测荧光一般为双色，因此单管只能检测双靶标(只能检测单个目的基因和内参，如专利号CN201810874063)，因此无法其在临床上的SMA多种临床应用需求。

[0012] (7)定量荧光PCR(QF-PCR)和毛细管电泳技术(CE)：半自动化、检测周期短、单管检测通适中，相关仪器临床应用广泛、易于检测产品的广泛应用推广，但目前文献报道(Chun-Chi Wang等Electrophoresis 2009,30,1102–1110)的贝克曼P/ACE MDQ系统成本高、临床上应用不足，相应检测范围也不包括SMA的修饰基因、点突变以及携带者分型；而部分开发的产品(专利号CN201710120076、CN201610559028)针对临床应用广泛ABI的基因分析系统开发，但仅针对SMN1第7号外显子检测，检范围不足、且从技术上没有未引入通用序列引物、未设置校准品进行均一化，未设计质控品等，最终可能导致定量不准确；产品(专利号CN201811119369)只是针对发生率较低的点突变情况进行基因分型，应用范围不足，且明显不能满足临床需求。

[0013] 简而言之，目前尚无满足同时对人脊髓型肌萎缩症相关基因的患者诊断、表型分型(I～IV型)以及携带者筛查的多种需求，且操作简单、成本低、可靠的人运动神经元基因检测方法及试剂盒。因此，亟需开发相应检测方法及试剂盒。

发明内容

[0014] 本发明的目的是为了克服现有技术针对目前人运动神经元基因检测技术及产品无法同时满足患者诊断、表型分型、携带者筛查多临床应用需求的不足，提供一种具备操作简单、成本低、快速可靠的，基于QF-PCR技术和CE技术结合的单管检测同时实现人肌萎缩症相关基因拷贝数与SMN1/2基因中国人群SNP位点检测、携带者分型的引物和试剂盒，能够在单管中同时检测SMN1和SMN2基因的第7号外显子拷贝数情(包括转换情况)、NAIP基因第4号外显子与第5号外显子的缺失情况、GTF2H2基因的第10号外显子缺失情况、SMN1/2基因中国人群SNP位点、“2+0”携带者提示位点及其亲本分析的STR基因座等。

[0015] 本发明的第一个目的是提供一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组。

[0016] 本发明的第二个目的是提供所述引物组在制备人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒中的应用。

[0017] 本发明的第三个目的是提供一种人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒。

[0018] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

[0019] 因此本发明要求保护一种单管检测人脊髓性肌萎缩症的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示。

[0020] 该引物组可以但不限于用于人肌萎缩症SMN1基因拷贝数检测和SMN1/2基因中国人群SNP位点、SMN2、NAIP和GTF2H2基因拷贝数检测、携带者分型检测中的一种或几种。本发明主要涵盖SMA检测的分子诊断、携带者筛查、临床分型指导三种临床需求，(1)通过对SMN1基因第7号外显子拷贝数以及SMN1基因SNP位点检测，实现对SMA患者的诊断；(2)通过对SMN1第7号外显子拷贝数定量、SMN1/2基因中国人群SNP位点、SMN1基因的g.27134T＞G和g.27706-27707delAT的检测实现对“1+0”携带者的辅助诊断和“2+0”携带者的提示；(3)通过5号染色体的STR位点检测实现对患者及其亲代的分析，为“2+0”携带者提供分析依据；(4)通过对SMN2的第7号外显子、NAIP基因的第4号和第5号外显子、GTF2H2的第10号外显子的拷贝数定量，为SMA患者的临床分型提供分子遗传诊断依据。

[0021] 具体地：本发明针对SMN1/2基因中国人群SNP位点，具体为c.22dupA、C.400G＞A、c.683T>A、c.689C>T、c.835G>C以及c.836G>T等6种突变类型；

[0022] 本发明针对“2+0”携带者的提示，主要通过对待检者的SMN1基因的g.27134T＞G和g.27706-27707delAT的检测实现，结合待检者及其亲代的STR位点D5S815、D5S818、D5S1403以及D5S2500检测以及SMN1拷贝数检测，能够有效提供更多“2+0”携带者分析信息，如利用STR位点分析待检者的5号染色体的来源、利用SMN1拷贝数检测分析待检者的亲代的SMN1拷贝数情况；

[0023] 本发明针对的STR位点均为4个核心重复元件、多态性高且STR位点位于5号染色体长臂，且其位置覆盖SMN基因的5q.13位置前后范围，STR位点信息具体见表1所示。

[0024] 表1：

[0025]STR位点核心重复元件杂合度位置扩增产物大小(bp)
D5S815 TATC 0.64 5q14.3 240～320
D5S818 AGAT 0.77 5q13.1 153～221
D5S1403 ATAG 0.71 5q33.3 76～152
D5S2500 CTAG 0.82 5q11.2 345～425

[0026] 本发明采用单管PCR反应体系，包含了如下引物对：(1)公共引物对：公用上游引物P1、公用下游引物P2；(2)SMN基因引物对：SMN1第7号外显子的上游引物P3-E7-1F、SMN1第7号内含子的下游引物P4-I7-1R；SMN2第7号外显子的上游引物P5-E7-2F、SMN2第7号内含子的下游引物P6-I7-2R；(3)内参基因引物对：内参基因KRIT1的上游引物P7-KRIT1-F、下游引物P8-KRIT1-R；(4)修饰基因NAIP、GTF2H2基因引物对：NAIP基因第4号外显子的上游引物P9-N4-F、NAIP基因第4号外显子的下游引物P10-N4-R、NAIP基因第5号外显子的上游引物P11-N5-F、NAIP基因第5号外显子的下游引物P12-N5-R、GTF2H2基因的第10号外显子的上游引物序列P13-G10-F、GTF2H2基因的第10号外显子的下游引物序列P14-G10-R；(3)携带者提示位点和亲本分析位点引物对：第7号内含子上的g.27134T＞G的上下游引物P15-27134-F和P16-27134-R、第8号外显子上的g.27706-27707delAT上下游引物P17-27706-F和P18-27706-R、STR位点D5S815的上下游引物P19-S815-F和P20-S815-R、STR位点D5S818的上下游引物P21-S818-F和P22-S818-R、STR位点D5S1403的上下游引物P23-S1403-F和P24-S1403-R、STR位点D5S2500的上下游引物P25-S2500-F和P26-S2500-R；(4)SMN1/2基因中国人群SNP位点引物对：c.22dupA的上下游引物P27-22-F和P28-22-R、c.400G＞T的上下游引物P29-
400-F和P30-400-R、c.683T>A的上下游引物P31-683-F和P32-683-R、c.689C>T的上下游引物P33-689-F和P34-689-R、c.835G>C的上下游引物P35-835-F和P36-835-R、c.836G>T的上下游引物P37-836-F和P36-836-R。

[0027] 本发明的针对SMN1基因、NAIP基因以及GTF2H2基因拷贝数定量，如SMN1基因的第7号外显子和第7号内含子、NAIP基因的第4号、第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子等进行如下的引物设计，引物含有两段序列，(1)通用序列，与通用引物P1和P2碱基序列一致。用于实现使用通用引物扩增；(2)识别序列，分别能SMN1的第7号外显子和第7号内含子、NAIP基因的第4号、第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子的碱基互补配对、结合。

[0028] 本发明为了区分SMN1和SM2的第7号外显子及其发生转换时的情况，针对SMN2的第7号外显子和第7号内含子设计如下引物序列，含有三段序列，其特征如下：(1)通用序列，与通用引物P1和P2碱基序列一致。用于实现使用通用引物扩增；(2)特异序列，对比SMN1的引物，设计了含有0～8不等的不数量和组合核苷酸序列，从而区分SMN1的第7号外显子和第7号内含子与SMN2的第7号外显子和第7号内含子相互转换情况；(3)识别序列，能SMN2的第7号外显子和第7号内含子碱基互补配对、结合。

[0029] 本发明针对SMN1的第7号外显子和第7号内含子和SMN2的第7号外显子和第7号内含的设计引物长度不同，其中针对SMN1的第7号外显子设计的引物长度比SMN1的第7号外显子多出4～8bp，优选为8bp，其中针对SMN1的第7号内含子设计的引物长度比SMN1的第7号内多出4～8bp，优选为4bp；如表1所示，为引物对的核苷酸序列和修饰碱基以及各扩增产物的片段大小。

[0030] 本发明针对不同的扩增靶标的引物组采用不同荧光修饰，具体地分为三组：(1)拷贝数定量靶点组：内参基因KRIT1、SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子、NAIP基因第4号外显子、NAIP基因第5号外显子、GTF2H2第10外显子以及SMN1转化子、SMN2转换子等；(2)SMN1基因点突变靶点组：c.22dupA、C.400G＞A、c.683T>A、c.689C>T、c.835G>C、c.836G>T、g.27134T＞G和g.27706-27707delAT；(3)STR位点靶点组：包括D5S815、D5S818、D5S1403以及D5S2500基因座。从而区分不同的扩增产物，将所述引物组分为三组，每组引物带有不同的荧光标记物；三组引物分别在每一对的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物，但是针对拷贝数定量靶点组是在通用引物序列P1或P2的的5’末端采用荧光标记物标记，不需要针对每个扩增靶点的引物对进行标记。

[0031] 优选地，仅仅在核苷酸序列如SEQ ID NO.1或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物的5’末端采用荧光标记物标记、核苷酸序列如SEQ ID NO.3～14所示引物不进行标记、且SEQ ID NO.15～16所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.17～18所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.19～20所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.21～22所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.23～24所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.25～26所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；且SEQ ID NO.27～28所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.29～30所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.31～32所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.33～34所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记、且SEQ ID NO.35～36所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；且SEQ ID NO.37～38所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；

[0032] 且以上5’末端采用荧光标记物标记的引物分为以下3组，每组引物带有不同的荧光标记物：

[0033] SEQ ID NO.1或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物；

[0034] SEQ ID NO.19～20所示引物中的任一条、SEQ ID NO.21～22所示引物中的任一条、SEQ ID NO.23～24所示引物中的任一条、且SEQ ID NO.25～26所示引物中的任一条5’末端采用荧光标记物标记；

[0035] SEQ ID NO.15～16所示引物中的任一条、且SEQ ID NO.17～18所示引物中的任一条、SEQ ID NO.27～28所示引物中的任一条、SEQ ID NO.29～30所示引物中的任一条、SEQ ID NO.31～32所示引物中的任一条、SEQ ID NO.33～34所示引物中的任一条、SEQ ID NO.35～36所示引物中的任一条、SEQ ID NO.37～38所示引物中的任一条。

[0036] 优选地，仅仅在核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、和SEQ ID NO.37所示引物的5’末端采用荧光标记物标记。

[0037] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物的5’末端采用FAM荧光标记物标记。

[0038] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0039] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0040] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记。

[0041] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记。

[0042] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记。

[0043] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记。

[0044] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0045] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0046] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0047] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0048] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0049] 更优选地，在核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0050] 最优选地，具体的引物及修饰情况如表2所示(小写字母为识别序列或近3’端的则为错配碱基，下划线为通用序列)：

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055] 同时本发明要求保护所述引物组在制备人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒中的应用。

[0056] 优选地，所述剂盒中用于人肌萎缩症SMN1、SMN2、NAIP和GTF2H2基因拷贝数检测的患者辅助诊断、分型及携带者分析，或SMN1/2基因中国人群SNP位点检测的患者辅助诊断，或基于STR基因座和点突变的携带者分型检测中的一种或几种。

[0057] 优选地，所述试剂盒为单管检测试剂盒。

[0058] 所示试剂盒能够用于人脊髓性肌萎缩症SMN1基因的拷贝数与点突变检测、修饰基因拷贝数检测、或携带者分型检测，具体的包括但不限于：同时检测SMN1和SMN2基因的第7号外显子(包括转换情况)、NAIP基因第4号外显子与第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子的拷贝数定量检测，SMN1/2基因中国人群SNP位点检测，“1+0”携带者检测、“2+0”携带者提示突变位点及STR位点的亲本检测等等。

[0059] 进一步，本发明要求保护一种人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒，包括所述的引物组。

[0060] 优选地，所述权利要求1所述的引物组中各引物的PCR反应体系中工作浓度范围为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物0.5～0.7μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物0.5～0.7μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示引物0.05～0.15μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示引物0.05～0.15μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物
0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物0.1～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示引物
0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物0.1～0.2μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示引物0.3～0.4μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物0.2～0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示引物0.2～0.3μmol/L。

[0061] 最优选地，所述的引物组中各引物的工作浓度为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物0.5μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示引物0.6μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示引物0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示引物0.35μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示引物0.3μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示引物0.10μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示引物0.10μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示引物0.20μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示引物0.24μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示引物0.35μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示引物0.32μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示引物0.22μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示引物0.26μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物0.35μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示引物0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物
0.22μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示引物0.26μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示引物0.24μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物0.20μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物0.22μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示引物0.27μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物0.21μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示引物
0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物0.27μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示引物0.22μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示引物0.23μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示引物0.35μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物
0.25μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示引物0.24μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物0.16μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示引物0.22μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物0.27μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示引物0.33μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物0.26μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示引物
0.22μmol/L。

[0062] 优选地，所述试剂盒还包括PCR反应混合液、PCR酶混合液、SMN校准品、SMN质控品、LIZ Size(Liz片段大小分布如下140、160、180、200、214、220、240、250、260、280、300、314、320、340、360、380、400、414、420、440、460、480、500)、或稀释液中的一种或几种。

[0063] 更优选地，所述PCR反应混合液含有Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，

[0064] 进一步优选地，所述PCR反应混合液中Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP各组分在PCR反应体系中的工作浓度依次为10～50mmol/L、20～45mmol/L、10～20mmol/L、50～300μg/mL、0.001～0.1％、0.05％～0.1％、5～15mmol/L、50～300nM、50～300nM、50～300nM、50～200nM、50～
300nM。

[0065] 进一步更优选地，所述PCR反应体系中Tris-HCl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，各组在PCR反应体系中分的工作浓度依次为35mol/L、40mmol/L、16.6mmol/L、100μg/mL、0.01％、1％、5mmol/L、200nM、200nM、200nM、100nM、200nM。

[0066] 更优选地，PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶和UDG酶。

[0067] 进一步优选地，所述Taq Hs聚合酶和UDG酶的酶活性比为Taq Hs聚合酶:UDG酶＝(10～5)：1。

[0068] 更进一步优选地，所述Taq Hs聚合酶和UDG酶的酶活性比为Taq Hs聚合酶:UDG酶＝5：1。

[0069] 进一步优选地，PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶2.5～5U/μL，UDG酶0.5～2U/μL。

[0070] 更进一步优选地，PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶5U/μL，UDG酶1U/μL。

[0071] 进一步优选地25μL的反应体系中，Taq HS酶的酶活总量为1～5U，UDG酶的酶活总量为0.5～2U。

[0072] 最优选地，25μL的反应体系中，Taq HS酶的酶活总量为2.5U，UDG酶的酶活总量为0.5U。

[0073] 更优选地，稀释液为为TE缓冲液、tris-Hcl缓冲液、无核酸酶水中的一种。

[0074] 更优选地，SMN校准品为含有SMN1的第7号外显子、SMN2的第7号外显子、NAIP第4号外显子、NAIP第5号外显子和GTF2H2第2号外显子，其拷贝数均为2的人基因组DNA。

[0075] 更优选地，SMN质控品为SMN1基因的第7号外显子拷贝数≤1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数≥1，且NAIP基因的第4号和第5号外显子以及GTF2H2基因的第10号外显子的拷贝数为0～2的人基因组DNA。

[0076] 进一步优选地，SMN1基因的第7号外显子拷贝数为1、SMN2基因的第7号外显子拷贝数为2，且NAIP基因的第4号拷贝数为1、和第5号外显子拷贝数为2、且GTF2H2基因的第10号外显子的拷贝数为2的人基因组DNA。

[0077] 本发明针对拷贝数定量检测，其扩增程序采用两次循环扩增，具体为：第1次循环，采用低于第二次循环扩增的Tm，循环数少于等于5次，实现模板的识别和扩增，同时引入通用序列；第2次循环，采用较高Tm，保证只有通用引物结合延伸，且循环数控制少于等于30次，实现通用引物的同步低偏倚扩增；针对STR位点和SNP位点检测则保证其引物Tm能在两次循环均能实现扩增，其实际扩增循环数为35次。

[0078] 本试剂盒PCR扩增体系如下：

[0079]

[0080] 本试剂盒PCR扩增程序如下：

[0081]

[0082]

[0083] 最优选地，本发明提供一种人脊髓性肌萎缩症相关基因检测试剂盒，含有以下成分：5×PCR反应混合液、引物混合液、PCR酶混合液、SMN校准品、SMN质控品、稀释液。

[0084] 其中，5×PCR反应混合液包括Tris-Hcl缓冲液175mmol/L、氯化钾200mmol/L、硫酸铵83mmol/L、小牛血清蛋白500μg/mL、明胶0.05％、吐温-200.5％、二硫苏糖醇25mmol/L、dATP 1000nM、dGTP 1000nM、dCTP 1000nM、dTTP 500nM、dUTP 1000nM。

[0085] 引物混合液含有：P1引物(SEQ ID NO.1)5μmol/L、P2引物(SEQ ID NO.2)6μmol/L、P3-E7-1F引物(SEQ ID NO.3)2.5μmol/L、P4-I7-1R引物(SEQ ID NO.4)2.0μmol/L、P5-E7-2F引物(SEQ ID NO.5)3.5μmol/L、P6-I7-2R引物(SEQ ID NO.6)3.0μmol/L、P7-KRIT1-F引物(SEQ ID NO.7)1.0μmol/L、P8-KRIT1-R引物(SEQ ID NO.8)1.0μmol/L、P9-N4-F引物(SEQ ID NO.9)2.0μmol/L、P10-N4-R引物(SEQ ID NO.10)2.4μmol/L、P11-N5-F引物(SEQ ID NO.11)3.5μmol/L、P12-N5-R引物(SEQ ID NO.12)3.2μmol/L、P13-G10-F引物(SEQ ID NO.13)2.2μmol/L、P14-G10-R引物(SEQ ID NO.14)2.6μmol/L、P15-27134-F引物(SEQ ID NO.15)3.5μmol/L、P16-27134-R引物(SEQ ID NO.16)2.5μmol/L、P17-27706-F引物(SEQ ID NO.17)2.2μmol/L、P18-27706-R引物(SEQ ID NO.18)2.6μmol/L、P19-S815-F引物(SEQ ID NO.19)2.4μmol/L、P20-S815-R引物(SEQ ID NO.20)2.0μmol/L、P21-S818-F引物(SEQ ID NO.21)2.2μmol/L、P22-S818-R引物(SEQ ID NO.22)2.7μmol/L、P23-S1403-F引物(SEQ ID NO.23)2.1μmol/L、P24-S1403-R引物(SEQ ID NO.24)2.5μmol/L、P25-S2500-F引物(SEQ ID NO.25)2.7μmol/L、P26-S2500-R引物(SEQ ID NO.26)2.2μmol/L、P27-22-F引物(SEQ ID NO.27)2.5μmol/L、P28-22-R引物(SEQ ID NO.28)2.3μmol/L、P29-400-F引物(SEQ ID NO.29)3.5μmol/L、P30-400-R引物(SEQ ID NO.30)2.5μmol/L、P31-683-F引物(SEQ ID NO.31)2.5μmol/L、P32-683-R引物(SEQ ID NO.32)2.4μmol/L、P33-689-F引物(SEQ ID NO.33)1.6μmol/L、P34-689-R引物(SEQ ID NO.34)2.2μmol/L、P35-835-F引物(SEQ ID NO.35)2.7μmol/L、P36-835-R引物(SEQ ID NO.36)3.3μmol/L、P37-836-F引物(SEQ ID NO.37)2.6μmol/L、和P38-836-R引物(SEQ ID NO.38)2.2μmol/L，

[0086] 在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物的5’末端采用FAM荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记；在核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0087] PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶5U/μL，UDG酶1U/μL。

[0088] SMN校准品为含有SMN1的第7号外显子、SMN2的第7号外显子、NAIP第4号外显子、NAIP第5号外显子和GTF2H2第2号外显子，其拷贝数均为2的人基因组DNA。

[0089] SMN质控品为含有SMN1第7号外显子拷贝数为1，SMN2第7号外显子拷贝数为2，NAIP基因的第4号外显子拷贝数为1、第5号外显子拷贝数为2，GTF2H2基因的第10号外显子为2的人基因组DNA。

[0090] 稀释液为Tris-Hcl缓冲液。

[0091] 所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

[0092] 1、样本的采集、运输和保存

[0093] (1)标本采集：标本可为血卡、血液、羊水、绒毛组织等。血卡≥2cm，血液为常规取静脉血2mL或者胎儿脐带血0.5-1mL，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5mL或者绒毛组织数条(≥20mg)。

[0094] (2)保存：标本可立即检测，4℃保存一周，-20±5℃保存期可达一年。

[0095] (3)运输：标本应在2～8℃条件下运送，运输时间不超过5天。

[0096] 2、检测方法

[0097] (1)DNA提取：按照市售的适用核酸提取试剂盒说明书进行操作，收集到体积≥20μL，经紫外分光光度计定量，要求浓度≥10ng/uL，将DNA溶液并稀释成10ng/μL，DNA纯度要求为OD260/OD280在1.6-2.0之间。

[0098] (2)多重PCR扩增

[0099] 对于每管PCR反应体系，进行PCR反应配制，涡旋混匀，并瞬时离心，以使液体聚集在管底。

[0100] PCR反应体系：PCR反应混合液5.0μL、引物混合液2.5μL、DNA样本(2～5)μL、PCR酶混合液0.5μL、稀释液Up to 25μL。

[0101] PCR反应条件：37℃10分钟；95℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃20秒，5个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟。

[0102] 在同一批次进行的PCR反应中必须有一个SMN校准品、一个SMN质控品、待测样本若干。

[0103] (3)扩增产物电泳

[0104] (a)上样操作

[0105] 每份检测取1μL PCR产物和13.5μL甲酰胺、0.5μL LIZ Size混合。将混合物95℃加热变性5分钟。放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。在ABI 3500Dx基因分析仪(适用仪器包括3730、3130、3500、3500DX等)上样进行毛细管电泳，具体操作参照A相应型号的基因分析仪用户手册进行。

[0106] (b)质控标准

[0107] (i)LIZ Size在ABI 3500Dx电泳后检测峰显示均匀的橙色荧光峰，说明毛细管电泳成功。

[0108] (ii)SMN校准品：校准品的SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子、NAIP基因的第4号和第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子与内参基因(KRIT1基因)比值范围如表3所示。

[0109] 表3：

[0110]

[0111] SMN质控品SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子、NAIP基因的第4号外显子、第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子与内参基因(KRIT1基因)比值范围如表4所示。其中SMN1转换子，即为“SMN1的第7号外显子+SMN2的第7号内含子部分序列”；SMN2转换子，即为“SMN2的第7号外显子+SMN1的第7号内含子部分序列”

[0112] 表4：

[0113]

[0114] 以上标准(i)、(ii)需要同时满足，否则需重新实验(质控品的各基因外显子拷贝数比值情况根据实际质控品拷贝数会有变动)。

[0115] 3、结果分析

[0116] (1)SMN1和SMN2的第7号外显子各检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0117] (a)样本SMN1第7号外显子检测峰比值

[0118] S1＝(样本SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)；

[0119] (b)样本SMN2第7号外显子检测峰比值

[0120] S2＝(样本SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)；

[0121] (c)样本SMN2第7号外显子转换为SMN1第7号外显子的检测峰比值ST1＝比值A/比值B；

[0122] 比值A＝样本SMN2第7号外显子转化为SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积；

[0123] 比值B＝(标准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积+标准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)/2；

[0124] (d)样本SMN1第7号外显子转换为SMN2第7号外显子的检测峰比值ST2＝比值C/比值B

[0125] 比值C＝样本SMN1第7号外显子转化为SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积；

[0126] 比值B＝(标准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积+标准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)/2。

[0127] SMN1和SMN2基因第7号外显子的拷贝数判定如下：①当比值S1或S2范围为≤0.250，判定拷贝数为0；②当比值S1或S2范围为0.300～0.650，判定拷贝数为1；③当比值S1或S2范围为1.100～1.800，判定拷贝数为3；④当比值S1或S2范围为≥1.850，判定拷贝数为
4或4以上。

[0128] 当SMN1和SMN2基因第7号外显子发生相互转换时，其检测峰判定分析情况如下：①当比值ST1或ST2范围为≤0.350，判定拷贝数为0；②当比值ST1或ST2范围为0.300～0.770，判定拷贝数为1；③当比值ST1或ST2范围为＞0.770，判定拷贝数为2或2以上。

[0129] (2)NAIP第4号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0130] 样本NAIP第4号外显子检测峰比值N4＝(样本NAIP第4号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品NAIP第4号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0131] NAIP基因第4号外显子的拷贝数判定：①当比值N4或N5范围为≤0.450，判定拷贝数为0；②当比值N4或N5范围为0.550～0.800，判定拷贝数为1；③当比值N4或N5范围为≥0.950，判定拷贝数为2或2以上。

[0132] (3)NAIP第5号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0133] 样本NAIP第5号外显子检测峰比值N5＝(样本NAIP第5号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品NAIP第5号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0134] NAIP基因第5号外显子的拷贝数判定：①当比值N4或N5范围为≤0.450，判定拷贝数为0；②当比值N4或N5范围为0.550～0.800，判定拷贝数为1；③当比值N4或N5范围为≥0.950，判定拷贝数为2或2以上。

[0135] (4)GFT2H2基因的第10号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0136] 样本GTF2H2第10号外显子检测峰比值G10＝(样本GFT2H2基因的第10号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品GFT2H2基因的第10号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0137] GFT2H2基因的第10号外显子的拷贝数判定：①当比值G10范围为≤0.350，判定拷贝数为0；②当比值G10范围为0.450～0.750，判定拷贝数为1；③当比值G10范围为≥0.900，判定拷贝数为2或2以上。

[0138] (5)STR位点检测峰判定如下：

[0139] (a)、关于人5号染色体是否为非整倍体的判定：(i)正常结果判定：至少有两个STR位点为正常位点(表现为双峰，前后峰高比值在0.8-1.4之间，两峰分子量间隔超过24bp时，前后峰高比值在0.8-1.5之间)，其余为无效位点(单峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间)；(ii)异常结果：判定染色体上STR位点，至少两个为异常位点(表现为三峰，且峰高比值0.8-
1.4之间；或双峰，且峰高比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余为无效位点(单峰，三峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间，双峰峰高比值小于0.45或大于2.4)。

[0140] (b)、关于人5号染色体来源的判定：同时进行父亲、母亲等亲代的样本进行检测，通过对比待测者各STR位点检测峰的位置，判断待测者的5号染色体来源以及染色体数目。

[0141] (6)SNP位点检测峰判定如下：(1)当SNP位点的检测峰的峰面积大于等于300时，判定为突变阳性；(2)当SNP位点的检测峰峰面积小于300或无检测峰时为阴性。

[0142] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0143] 本发明采用如下方法减少针对拷贝数定量的扩增子的扩增偏倚性，以保证相对定量的准确性：(1)先利用识别序列实现对内参基因、SMN1、SMN2、NAIP、GTF2T2的识别并引入通用序列，再利用正反向通用引物序列实现同步扩增内参基因、SMN1第7外显子、SMN2基因第7外显子以及NAIP基因的第4号外显子和第5号外显子、GTF2H2基因第10号外显子；(2)通过控制扩增子长度减少扩增的偏倚性，最大和最小的扩增子长度差异不超过90bp。

[0144] 本发明采用如下方法增加对SMN、NAIP、GTF2H2基因拷贝数定量、SNP位点的的特异性：(1)针对SMN1和SMN2的第7外显子和第7内含子上的差异碱基，按照ARMS引物设计原则进行设计引物，且正反向引物均为ARMS引物；(2)针对SMN1基因上的SNP位点，按照ARMS引物设计原则进行设计引物；(3)上述基于扩增阻滞设计的引物除了3’末端设计了错配碱基外，在接近3’末端处引入了数量上小于或等于3个的错配碱基，进一步提高引物特异性；(4)STR位点、NAIP基因的第4号和第5号外显子以及GTF2H2基因的10号外显子的引物只需按照普通引物设计。

[0145] 本发明的检测范围广，涵盖了SMN1和SMN2以及NAIP、GTF2H2基因的缺失、点突变、Indel突变类型以及STR位点等；引物设计合理，避免SMN1和SMN2基因高度同源情况下单向引物单碱基错配的扩增阻滞的特异性不足；特异性高，合理地设计拷贝数定量扩增子的长度、引入通用引物、采用两次循环的同步扩增等多种方法结合，来减少了扩增偏倚性低，保证拷贝数定量准确；通过采用不同荧光修饰和不同扩增子长度，实现多靶标的单管多重扩增；合理引入识别序列，实现对SMN1和SMN2第7号外显子相互转换情况辨识，提供更多拷贝数信息；体系中引入了UDG酶、扩增程序中加入UDG酶避免扩增产物污染。能够单管同时实现人肌萎缩症相关基因拷贝数检测、SNP位点检测、携带者分型等多种临床用途，如同时检测SMN1和SMN2基因的第7号外显子拷贝数情(包括转换情况)、NAIP基因第4号外显子与第5号外显子的缺失情况、GTF2H2基因的第10号外显子缺失情况、SMN1/2基因中国人群SNP位点、“2+0”携带者提示位点及其亲本分析的STR等。本方法和试剂盒检测快速、结果准确、成本适宜、适用仪器临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。附图说明

[0146] 图1为扩增阻滞优化后核酸分析结果。

[0147] 图2为SMN校准品的检测峰图。

[0148] 图3为SMN质控品的检测峰图。

[0149] 图4为含有SMN1转换子的检测峰图。

[0150] 图5为含SMN2转换子峰且GFT2H2基因第10号外显子缺失的检测峰图。

具体实施方式

[0151] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0152] 实施例1高度同源的SMN1和SMN2的引物设计位置的选择

[0153] 扩增引物包括通用序列(或特异序列)以及识别序列，其中通用引物用于实现不同扩增子的同步扩增，能与不同的识别序列的扩增产物结合、延伸，最终在为扩增程序上Tm值更高第二次循环扩增；特异序列，类似于二代测序方法上的标签序列，不同靶标的设计引物包括不同的核苷酸长度，用于在长度上区分不同的SMN扩增子长度；识别序列，不同引物上的识别序列能分别特异性结合到SMN1和SMN2的第7号外显子、NIAP基因的第4号和第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子上、并延伸、扩增。如下主要针对SMN1与SMN2的引物设计思路进行说明。

[0154] SMN1与SMN2高度同源，仅相差5个核苷酸，分别在内含子6(-45G→A)、外显子7(+6C→T)、内含子7(+100A→G和+214A→G)、外显子8(+245G→A)存在碱基差异。

[0155] (1)针对SMN1、SMN2的△exon7情况检测，除了在外显子7(+6C→T)设计其中的一条引物外，在不同的位置设计另外一条引物。

[0156] 本实施例设计了两种实施路径：

[0157] 路径一：在外显子7的上游或者下游的非差异核苷酸的位置设计另一条引物，这样可能导致无法有效地区分SMN1和SMN2，因此不采用此方法；

[0158] 路径二：在内含子6(-45G→A)的差异碱基位置或者在内含子7(+100A→G和+214A→G)位置设计另一条引物，则可以通过双向扩增阻滞引物设计，进一步提高扩增产物特异性，避免对SMN1和SMN2间的错误识别、扩增。内含子6的差异碱基位置设计引物，但其设计的引物(5’→3’)，TCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTcTG，其引物出现引物二聚体、错配、发夹结构等，质量较差，故不采用。

[0159] 所以选择路径一进行引物设计，在外显子7的差异核苷酸位置设计正向的扩增阻滞引物，而其在内含子7(+100A→G和+214A→G)位置可以分别设置不同反向扩增阻滞引物。不同反向扩增阻滞引物：针对内含子7(+100A→G)的差异核苷酸序列位置设计的反向扩增阻滞引物，反向引物1(5’→3’)GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTT、反向引物2(5’→3’)GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACCTCT；针对内含子7(+214A→G)的差异核苷酸序列位置设计的反向扩增阻滞引物，反向引物3(5’→3’)TTATTGTGAAAGTATGTTTCTTCCACAC、反向引物4(5’→
3’)TTATTGTGAAAGTATGTTTCTTCAATTAC。

[0160] 经引实验验证，内含子7(+100A→G和+214A→G)位置处的引物质量接近，能够设计扩增阻滞引物，其同一模板、同一扩增程序下的多组扩增产物经对产物相同提取试剂盒、相同体积下洗脱后，对其浓度进行检测，发现，反向引物1、反向引物2、反向引物3以及反向引物4浓度均值分别为478ng/μl、456ng/μl、453ng/μl、448ng/μl，说明扩增产物量接近。基于扩增子长度越短，扩增耗时越少，扩增效率也相对较高的考虑，所以采用内含子7(+100A→G)处进行后续实验。

[0161] 实施例2SNP位点差异的扩增阻滞引物的扩增阻滞引物设计以及针对SMN1/2的拷贝数定量和“2+0”携带者的扩增阻滞引物设计

[0162] 针对SMN1和SMN2的差异碱基、SMN1基因上SNP突变位点等，其序列的3’末端采用扩增阻滞设计，不同于一般扩增阻滞设计只在3’末端能够针对模板匹配，而与同源模板存在错配，本发明在3’末端倒2～5个碱基中引入额外的1～3个不等错配碱基。基于碱基匹配的强弱，同时确保引物质量(尽量避免引物二聚体、错配、发夹结构等)，引入额外错配碱基。

[0163] 不同位置的引物设计：

[0164] (1)在SMN1的第7号内含子(+100A)的差异碱基设计引物，除了引物的3’末端为T，能与SMN1模板匹配，而与SMN2模板错配外，在倒数第3个碱基处引入错配碱基G，序列为5’-GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTT-3’(SEQ ID NO.4)的识别序列。

[0165] (2)同理，在SMN2的第7号内含子(+100A→G)的差异碱基设计引物，除了引物的3’末端为C外，在倒数第2位置引入了A、倒数第4位置引入了C，序列为5’-TTGTTTTACATTAACCTTTCAACcTaC-3’(SEQ ID NO.6)的识别序列，这样设计，除了既能够增强引物特异性外，同时尽量保证了引物质量。

[0166] (3)根据同样设计思路，针对不同SMN1的点突变位点，进行了扩增阻滞设计，针对c.22dupA的SNP位点的特异性引物，除了3’末端碱基与突变型匹配，而与野生型错配外，在3’末端倒数第4个碱基也设计错配碱基A，序列5’-CGATGAGCAGCGGCGaCAA-3’(SEQ ID NO.27)；

[0167] 针对c.400G＞T的SNP位点，直接采用有义链进行设计，其引物质量较差，本实施例针对其互补的无义链进行设计，引物质量明显提高，且在3’末端倒数第3个碱基也设计了错配碱基T，引物质量提高，且进一步提高其特异性，序列5’-GTAGATCGGACAGATTTTGCTCtTT-3’(SEQ ID NO.29)；

[0168] 另外针对c.683T>A的SNP位点设计也和c.400G＞T一样根据无义链设计，并在在3’末端倒数第2个碱基也设计了错配碱基G，提高其特异性。

[0169] (4)SMN1/2的拷贝数定量引物设计方法：引物中特异序列添加至正向引物或反向引物处，添加入针对SMN1模板设计的引物或针对SMN2模板设计的，特异序列的核苷酸序列可以0～8bp不等。通过此方式，实现不同引物的长度不一致，以区分SMN1和SMN2的扩增子，SMN1针对第7号外显子的正向引物5’-CTCCAGACGCAGATGACCAACGTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTC-3’(SEQ ID NO.3)，引物核苷酸长度为47，特异序列核苷酸长度为0；SMN1针对第7号内含子的反向引物5’-TCGCTCGCCCAAGATAGCAGACGATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTT-3’(SEQ ID NO.4)，核苷酸长度为51，特异序列核苷酸长度为0；SMN2针对第7号外显子的正向引物5’-CTCCAGACGCAGATGACCAACGgttcctgaTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTT-3’(SEQ ID NO.5)，引物的核苷酸长度为55，特异序列核苷酸为GTTCCTGA，长度为8；SMN2针对第7号内含子的反向引物5’-TCGCTCGCCCAAGATAGCAGACgagtacTTGTTTTACATTAACCTTTCAACcTaC-3’(SEQ ID NO.6)，核苷酸长度为55，特异序列核苷酸为GAGTAC，长度为6。通过此方式，实现SMN1拷贝数定量检测峰、SMN1转化子、SMN2转换子、SMN2检测峰的扩增子长度为245bp、249bp、253bp、
257bp，依次相差4个核苷酸的长度。

[0170] 如附图1为分别采用SMN1引物、SMN2引物扩增人工合成的SMN1模板的扩增产物，等体积混合后的的核酸分析仪检测结果。由附图1可知，SMN1和SMN2的扩增产物相差12bp，符合预期设计，且SMN2的识别引物采用上述增加错配后的检测结果后，SMN2扩增产物明显减少，说明SMN2引物特异性进一步增强。

[0171] (5)“2+0”携带者筛查位点在SMN1上，因此根据上述设计思路(即双向引物在SMN1/2的差异碱基上设计扩增阻滞引物)，将筛查位点和SMN1特异性位点(即和SMN2的差异碱基的位点)结合，设计扩增子以区分SMN1和SMN2，具体的设计如下：

[0172] ①SMN1的第7号内含子上的g.27134T＞G位点设计。在SMN1上第7号外显子差异核苷酸位点(+6C→T)设计，设计正向引物；而在SMN1的第7号内含子上的筛查位点g.27134T＞G设计反向引物，双向引物也采用扩增阻滞设计，经设计分析，采用正向引物(SEQ ID NO.15)(5“→3’):TCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTC、反向引物(SEQ ID NO.16)(5“→3’)TAACATCTGAACTTTTcAAC；

[0173] ②SMN1第8号外显子上的g.27706-27707delAT位点的设计。在SMN1的第7号内含在的第2个差异碱基(+214A→G)上设计，设计正向引物，而在SMN1的第8号外显子的筛查位点g.27706-27707delAT上设计反向引物，双向引物均采用扩增阻滞设计，经设计分析采用采用正向引物(SEQ ID NO.17(5“→3’):ATTCTCATACTTAACTGGTTGGTcA、反向引物(SEQ ID NO.18)(5“→3’)TCTTTTACAGATGGTTTTTCAAtAG；

[0174] 实施例3单管人脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数与点突变检测、携带者分型的试剂盒

[0175] 一、组成

[0176] 本发明试剂盒各按照50人份设计，包括：5×PCR反应混合液，1管(275μL/管)；引物混合液，1管(138μL/管)；PCR酶混合液，1管(28μL/管)；SMN校准品，1管(275μL/管)；SMN质控品，1管(275μL/管)；稀释液，1管(1000μL/管)。

[0177] 其中，5×PCR反应混合液包括Tris-Hcl缓冲液175mmol/L、氯化钾200mmol/L、硫酸铵83mmol/L、小牛血清蛋白500μg/mL、明胶0.05％、吐温-200.5％、二硫苏糖醇25mmol/L、dATP 1000nM、dGTP 1000nM、dCTP 1000nM、dTTP 500nM、dUTP 1000nM。

[0178] 本试剂盒根据第7号外显子和第7号内含子差异碱基设计引物，PCR产物一般为“SMN1的第7号外显子+第7号内含子部分序列”或“SMN2的第7号外显子+第7号内含子部分序列”。

[0179] 引物混合液含有：P1引物(SEQ ID NO.1)5μmol/L、P2引物(SEQ ID NO.2)6μmol/L、P3-E7-1F引物(SEQ ID NO.3)2.5μmol/L、P4-I7-1R引物(SEQ ID NO.4)2.0μmol/L、P5-E7-2F引物(SEQ ID NO.5)3.5μmol/L、P6-I7-2R引物(SEQ ID NO.6)3.0μmol/L、P7-KRIT1-F引物(SEQ ID NO.7)1.0μmol/L、P8-KRIT1-R引物(SEQ ID NO.8)1.0μmol/L、P9-N4-F引物(SEQ ID NO.9)2.0μmol/L、P10-N4-R引物(SEQ ID NO.10)2.4μmol/L、P11-N5-F引物(SEQ ID NO.11)3.5μmol/L、P12-N5-R引物(SEQ ID NO.12)3.2μmol/L、P13-G10-F引物(SEQ ID NO.13)2.2μmol/L、P14-G10-R引物(SEQ ID NO.14)2.6μmol/L、P15-27134-F引物(SEQ ID NO.15)3.5μmol/L、P16-27134-R引物(SEQ ID NO.16)2.5μmol/L、P17-27706-F引物(SEQ ID NO.17)2.2μmol/L、P18-27706-R引物(SEQ ID NO.18)2.6μmol/L、P19-S815-F引物(SEQ ID NO.19)2.4μmol/L、P20-S815-R引物(SEQ ID NO.20)2.0μmol/L、P21-S818-F引物(SEQ ID NO.21)2.2μmol/L、P22-S818-R引物(SEQ ID NO.22)2.7μmol/L、P23-S1403-F引物(SEQ ID NO.23)2.1μmol/L、P24-S1403-R引物(SEQ ID NO.24)2.5μmol/L、P25-S2500-F引物(SEQ ID NO.25)2.7μmol/L、P26-S2500-R引物(SEQ ID NO.26)2.2μmol/L、P27-22-F引物(SEQ ID NO.27)2.5μmol/L、P28-22-R引物(SEQ ID NO.28)2.3μmol/L、P29-400-F引物(SEQ ID NO.29)3.5μmol/L、P30-400-R引物(SEQ ID NO.30)2.5μmol/L、P31-683-F引物(SEQ ID NO.31)2.5μmol/L、P32-683-R引物(SEQ ID NO.32)2.4μmol/L、P33-689-F引物(SEQ ID NO.33)1.6μmol/L、P34-689-R引物(SEQ ID NO.34)2.2μmol/L、P35-835-F引物(SEQ ID NO.35)2.7μmol/L、P36-835-R引物(SEQ ID NO.36)3.3μmol/L、P37-836-F引物(SEQ ID NO.37)2.6μmol/L、和P38-836-R引物(SEQ ID NO.38)2.2μmol/L。

[0180] 同时在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示引物的5’末端采用FAM荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示引物的5’末端采用ROX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记、在核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示引物的5’末端采用HEX荧光标记物标记。

[0181] PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶5U/μL，UDG酶1U/μL。

[0182] SMN校准品为含有SMN1的第7号外显子、SMN2的第7号外显子、NAIP第4号外显子、NAIP第5号外显子和GTF2H2第2号外显子，其拷贝数均为2的人基因组DNA。

[0183] SMN质控品含有SMN1第7号外显子拷贝数为1，SMN2第7号外显子拷贝数为2，NAIP基因的第4号外显子拷贝数为1、第5号外显子拷贝数为2，GTF2H2基因的第10号外显子为2的人基因组DNA。

[0184] 稀释液为Tris-Hcl缓冲液。

[0185] 二、使用方法

[0186] 1、样本的采集、运输和保存

[0187] (1)标本采集：标本可为血卡、血液、羊水、绒毛组织等。血卡≥2cm，血液为常规取静脉血2mL或者胎儿脐带血0.5～1mL，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5mL或者绒毛组织数条(≥20mg)。

[0188] (2)保存：标本可立即检测，4℃保存一周，-20±5℃保存期可达一年。

[0189] (3)运输：标本应在2～8℃条件下运送，运输时间不超过5天。

[0190] 2、检测方法

[0191] (1)DNA提取：按照市售的适用核酸提取试剂盒说明书进行操作，收集到体积≥20μL，经紫外分光光度计定量，要求浓度≥10ng/uL，将DNA溶液并稀释成10ng/μL，DNA纯度要求为OD260/OD280在1.6-2.0之间。

[0192] (2)多重PCR扩增

[0193] 对于每管PCR反应体系，进行PCR反应配制，涡旋混匀，并瞬时离心，以使液体聚集在管底。

[0194] PCR反应体系：PCR反应混合液5.0μL、引物混合液2.5μL、DNA样本(2～5)μL、PCR酶混合液0.5μl、稀释液Up to 25μL。

[0195] PCR反应条件：：37℃10分钟；95℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃20秒，5个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟。

[0196] 在同一批次进行的PCR反应中必须有一个SMN校准品、一个SMN质控品、待测样本若干。

[0197] (3)扩增产物电泳

[0198] (a)上样操作

[0199] 每份检测取1μL PCR产物和13.5μL甲酰胺、0.5μL LIZ Size混合。将混合物95℃加热变性5分钟。放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。在ABI 3500Dx基因分析仪(适用仪器可以是3730、3130、3500、3500DX等)上样进行毛细管电泳，具体操作参照ABI 3500Dx基因分析仪用户手册进行。

[0200] (b)质控标准

[0201] (i)LIZ Size在ABI 3500Dx电泳后检测峰显示均匀的橙色荧光峰，说明毛细管电泳成功。

[0202] (ii)SMN校准品：校准品的SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子、NAIP基因的第4号和第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子与内参基因(KRIT1基因)比值范围如表5所示。

[0203] 表5：

[0204]

[0205] SMN质控品SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子、NAIP基因的第4号外显子、第5号外显子、GTF2H2基因的第10号外显子与内参基因(KRIT1基因)比值范围如表6所示。其中SMN1转换子，即为“SMN1的第7号外显子+SMN2的第7号内含子部分序列”；SMN2转换子，即为“SMN2的第7号外显子+SMN1的第7号内含子部分序列”

[0206] 表6：

[0207]

[0208] 以上标准(i)、(ii)需要同时满足，否则需重新实验(质控品的各基因外显子拷贝数比值情况根据实际质控品拷贝数会有变动)。

[0209] 3、结果分析

[0210] (1)SMN1和SMN2的第7号外显子各检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0211] (a)样本SMN1第7号外显子检测峰比值

[0212] S1＝(样本SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)；

[0213] (b)样本SMN2第7号外显子检测峰比值

[0214] S2＝(样本SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)；

[0215] (c)样本SMN2第7号外显子转换为SMN1第7号外显子的检测峰比值ST1＝比值A/比值B；

[0216] 比值A＝样本SMN2第7号外显子转化为SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积；

[0217] 比值B＝(标准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积+标准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)/2；

[0218] (d)样本SMN1第7号外显子转换为SMN2第7号外显子的检测峰比值ST2＝比值C/比值B

[0219] 比值C＝样本SMN1第7号外显子转化为SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积；

[0220] 比值B＝(标准品SMN1第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积+标准品SMN2第7号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)/2。

[0221] SMN1和SMN2基因第7号外显子的拷贝数判定如下：①当比值S1或S2范围为≤0.250，判定拷贝数为0；②当比值S1或S2范围为0.300～0.650，判定拷贝数为1；③当比值S1或S2范围为1.100～1.800，判定拷贝数为3；④当比值S1或S2范围为≥1.850，判定拷贝数为
4或4以上。

[0222] 当SMN1和SMN2基因第7号外显子发生相互转换时，其检测峰判定分析情况如下：①当比值ST1或ST2范围为≤0.350，判定拷贝数为0；②当比值ST1或ST2范围为0.300～0.770，判定拷贝数为1；③当比值ST1或ST2范围为＞0.770，判定拷贝数为2或2以上。

[0223] (2)NAIP第4号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0224] 样本NAIP第4号外显子检测峰比值N4＝(样本NAIP第4号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品NAIP第4号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0225] NAIP基因第4号外显子的拷贝数判定：①当比值N4或N5范围为≤0.450，判定拷贝数为0；②当比值N4或N5范围为0.550～0.800，判定拷贝数为1；③当比值N4或N5范围为≥0.950，判定拷贝数为2或2以上。

[0226] (3)NAIP第5号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0227] 样本NAIP第5号外显子检测峰比值N5＝(样本NAIP第5号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品NAIP第5号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0228] NAIP基因第5号外显子的拷贝数判定：①当比值N4或N5范围为≤0.450，判定拷贝数为0；②当比值N4或N5范围为0.550～0.800，判定拷贝数为1；③当比值N4或N5范围为≥0.950，判定拷贝数为2或2以上。

[0229] (4)GFT2H2基因的第10号外显子检测峰的计算方法及拷贝数判定方法如下：

[0230] 样本GTF2H2第10号外显子检测峰比值G10＝(样本GFT2H2基因的第10号外显子的检测峰峰面积/样本内参基因的检测峰峰面积)/(校准品GFT2H2基因的第10号外显子的检测峰峰面积/校准品内参基因的检测峰峰面积)，

[0231] GFT2H2基因的第10号外显子的拷贝数判定：①当比值G10范围为≤0.350，判定拷贝数为0；②当比值G10范围为0.450～0.750，判定拷贝数为1；③当比值G10范围为≥0.900，判定拷贝数为2或2以上。

[0232] (5)STR位点检测峰判定如下：

[0233] (a)、关于人5号染色体是否为非整倍体的判定：(i)正常结果判定：至少有两个STR位点为正常位点(表现为双峰，前后峰高比值在0.8-1.4之间，两峰分子量间隔超过24bp时，前后峰高比值在0.8-1.5之间)，其余为无效位点(单峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间)；(ii)异常结果：判定染色体上STR位点，至少两个为异常位点(表现为三峰，且峰高比值0.8-
1.4之间；或双峰，且峰高比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余为无效位点(单峰，三峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间，双峰峰高比值小于0.45或大于2.4)。

[0234] (b)、关于人5号染色体来源的判定：同时进行父亲、母亲等亲代的样本进行检测，通过对比待测者各STR位点检测峰的位置，判断待测者的5号染色体来源以及染色体数目。

[0235] (6)SNP位点检测峰判定如下：

[0236] (1)当SNP位点有检测峰，且峰面积大于等于300时，判定为突变阳性；

[0237] (2)当SNP位点的检测峰峰面积小于300或无检测峰时为阴性。

[0238] 实施例4单管人脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数与点突变检测、携带者分型的试剂盒检测样本

[0239] 一、实验方法

[0240] 使用实施例3的试剂盒检测以下四个样本：SMN校准品、SMN质控品、临床含有SMN1转换子的样本(样本1)、临床含SMN2转换子峰且GFT2H2基因第10号外显子缺失的样本(样本2)。

[0241] 二、实验结果

[0242] 附图2所示为SMN校准品的检测峰图，校准品的NAIP基因的第4号和第5号外显子、内控(内参)KRIT1基因、SMN1基因的第7号外显子、SMN2基因的第7号外显子以及GTF2H2的第10号外显子均有出峰，校准品在SMN1基因上相关的SMN1/2基因中国人群SNP位点以及“2+0”携带者提示突变没有相关检测峰，5号染色体的STR检出两个峰高接近的等位基因峰；

[0243] 如附图3所示为SMN质控品，质控品的NAIP基因的第4号和第5号外显子、内参基因KRIT1基因、SMN1基因的第7号外显子、SMN2基因的第7号外显子以及GTF2H2的第10号外显子均有出峰，SMN1/2基因中国人群SNP位点以及“2+0”携带者提示突变没有相关检测峰，5号染色体的STR检出两个峰高接近的等位基因峰，

[0244] 附图4所示为含有SMN1转换子的检测峰图，该样本的NAIP基因的第4号和第5号外显子、内参基因KRIT1基因、SMN1基因的第7号外显子、SMN2基因的第7号外显子、SMN1转换子以及GTF2H2的第10号外显子均有相关检测峰，在SMN1/2基因中国人群SNP位点中c.689C＞T有检测峰，其余的SMN1/2基因中国人群SNP位点以及“2+0”携带者提示突变没有相关检测峰，5号染色体的STR检出两个峰高接近的等位基因峰；

[0245] 附图5为含SMN2转换子峰且GFT2H2基因第10号外显子缺失的检测峰图，该样本的NAIP基因的第4号和第5号外显子、内参基因KRIT1基因、SMN1基因的第7号外显子、SMN2基因的第7号外显子、SMN2转换子均有相关检测峰，而GTF2H2的第10号外显子无检测峰，在SMN1/2基因中国人群SNP位点未检测出相关峰，“2+0”携带者提示突变g.27134T＞G和g.27706-
27707delAT均有检测峰(经计算SMN1的第7号外显子的拷贝数为3，研究表明上述两种突变类型主要和“SMN1的第7号外显子的拷贝数为3”相关；当SMN1的第7号外显子的拷贝数为2时，提示为“2+0”携带者)，5号染色体的STR检出两个峰高接近的等位基因峰；

[0246] SMN校准品、SMN质控品、含有SMN1转换子的样本(样本1)、含SMN2转换子峰且GFT2H2基因第10号外显子缺失的样本(样本2)的拷贝数定量检测峰、比值、拷贝数、SMN1/2基因中国人群SNP位点以及STR位点等位基因检测峰的检测结果汇总表如表7～9所示，校准品和质控品的SMN1、SMN2、NAIP以及GTF2H2基因拷贝数符合预期，且样本1和样本2均能实现对拷贝数判定、SMN1/2基因中国人群SNP位点检测、携带筛查。

[0247] 表7：

[0248]

[0249] 表8：

[0250]

[0251]

[0252] 表9：

[0253]

[0254] 实施例5SMA基因检测产品的比较

[0255] 一、实验方法

[0256] 选取市售SMA基因检测产品荷兰MRC-Holland P021-100R、美国的AsuragenPCR/CE SMN1/2Kit以及国内上海五色石的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒和本发明实施例3的试剂盒关于技术原理、检测范围、通量、检测周期、成本等因素进行对比分析。

[0257] 二、实验结果

[0258] 结果如表10所示，相比其他厂家的SMA检测试剂盒，本发明的检测覆盖度大大增加，能同时检测SMN1和SMN2的第7号外显子的转换情况、SMN1点突变情况、SMA修饰基因NAIP、GTF2H2基因的部分外显子缺失情况、提示“2+0”携带者情况并进行亲代分析。除此之外，相比MRC-Holland P021-100R，本发明的检测周期更短、检测成本更低；相比美国的Asuragen PCR/CE SMN1/2Kit，本发明成本更低，因采用通用引物和两轮循环，其检测特异性更高、相对定量准确性也更高；相比上海五色石的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒，本发明能够还能同时检测SMN1/2的第7号外显子的拷贝数情况以及SMN1和SMN2的第7号外显子的转换情况，且针对靶基因能够单管检测。简而言之，本发明在同时解决了SMA患者诊断、SMA表型分型、携带者筛查等多种临床应用需求，且具备检测成本低、通量高、检测周期短、特异性高、相对定量准确等优点，具备一定创新性、临床应用价值。

[0259] 表10：

[0260]

[0261]

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