성별 특이적 혈청을 이용한 ＢＨＫ－２１ 세포의 증식방법{Method for proliferating ＢＨＫ－２１ cell using gender－specific serum}

본 발명은 성별 특이적 혈청을 이용한 BHK-21 세포의 증식방법, 및 상기 BHK-21 세포를 이용한 구제역 등의 바이러스 백신의 생산수율 증대방법에 관한 것이다.

2008년 광우병 관련 미국산 소에 대한 포괄적인 수입금지조치가 내려지면서 동물세포 배양에 주원료로 사용되고 있는 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)도 국내 반입이 금지되었다. 이에 따라 우태아 혈청의 물량을 미리 확보해놓지 못한 대부분의 국내 생명과학분야 실험실에서는 실험중단 위기에 처한 바 있었다.

혈청은 여러 물질이 혼합된 복합 산물이며 세포 배양실에서 기본 배양 배지에 첨가제로 사용되며, 세포배양에 있어서 성장인자, 호르몬 그리고 세포를 자극하는 성분 등을 포함하고 있으며, 세포의 종류에 따라 다양하게 사용되고 있으나 일반적으로 우태아 혈청을 가장 많이 이용하고 있다. 우태아 혈청은 임신기간 중에 송아지의 태아 혈액으로부터 분리되는 혈청으로, 특히 바이오기술 관련 실험의 기초적 단계에 속하는 동물세포 배양 뿐만 아니라 최근 몇년 동안 전 세계적으로 기술속도가 점점 더 빨라지고 있는 백신, 단백질의약품, 치료용 항체 등 개발에 사용되는 원료물질이다.

혈청의 종류는 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 우아 혈청(bovine calf serum; BCS) 및 소 혈청(bovine serum; BS) 세 가지가 일반적으로 세포배양에 많이 사용되며, 우아 혈청은 대개 16개월 된 송아지에서 혈청을 채취한 것으로 우태아 혈청과 비교해 볼 때, 항체와 호르몬의 양에 차이가 난다.

우태아 혈청을 더 보편적으로 사용하고 있으며, 거의 모든 세포주가 우태아 혈청에서 자란다. 반대로 우아 혈청은 우태아 혈청을 필요로 하지 않는 몇몇 세포주의 배양 시 우태아 혈청을 대신하여 사용할 수 있다. 어떤 경우에는 우태아 혈청보다 우아 혈청에서 세포성장이 훨씬 잘 되는 경우도 있고 가격 면에서도 우아 혈청이 더 경제적이다.

그 외, 사람 혈청과 말 혈청이 사용되기도 하는데, 사람 혈청은 몇몇 인체 세포주 배양에 사용되고, 경우에 따라서는 우아 혈청보다 말 혈청을 선호하는데, 폐쇄된 무리에서 말의 혈청을 얻을 수 있어서 혈청을 채취할 때마다 그 내용물이 일정하기 때문이다. 또한, 말 혈청에는 폴리아민 산화효소(polyamine oxidase)의 농도가 낮아, 몇몇 세포에 대해서는 세포증식을 촉진하는 폴리아민이 대사되지 않고 남아 있을 가능성이 많다.

국내 한우 도체두수는 2008년에 769,432두로 전년도 비해 12.5% 증가되었고, 성별로는 암소 34.3%로 전년대비 3.2% 증가, 수소는 전년(41.1%) 대비 1.2% 증가, 거세는 전년(27.8%) 대비 4.4% 감소하였다. 결론적으로 한우 도체는 매년 계속 증가하고 있는 추세이다.

우태아 혈청의 국내시장은 약 200억원대이며, 전 세계 시장크기는 약 2조원에 이른다. 이 중 미국산이 85%를 차지하고 호주와 뉴질랜드산이 15%를 이룬다. 국내의 생산판매는 전무하며 수입금지 조치가 내려지면 대처할 수 있는 상황이 현재로서는 매우 미흡한 상황이다.

한편, 구제역(Foot-and-Mouth Disease)은 전 세계적으로 발생하고 있는 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 동물(우제류)에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병으로서, 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 사이 등에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승되며 식욕이 저하되는 등의 증상이 나타나다가 급성폐사에 이르게 된다.

구제역 바이러스는 치사율이 55%에 이르는 질병으로서, 국제수역사무국(OIE)에서 A급 질병으로 분류하였고 우리나라에서도 제 1종의 가축 전염병이며, 축산물 자유무역의 증대로 인해 발생국인 경우 무역규제 대상국가가 되는 등 경제적으로 큰 피해를 주는 질병이다.

따라서, 이러한 구제역의 예방을 위하여 예방 백신의 개발은 매우 중요한 일이며, 구제역 예방 백신을 효율적으로 제조할 수 있는 제조방법의 개발이 시급한 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 성별 특이적 혈청을 이용한 구제역 백신 생산용 BHK-21 세포의 효율적인 증식방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 성별 특이적 혈청으로 배양한 BHK-21 세포를 이용하여 구제역 등을 포함한 바이러스 백신을 효율적으로 제조할 수 있는 바이러스 백신의 생산수율 증대방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성별 특이적 혈청을 이용한 것을 특징으로 하는 BHK-21 세포의 증식방법을 제공한다.

상기 성별 특이적 혈청은 도체폐기 되는 포유동물로부터 혈액을 준비하는 단계; 준비된 혈액을 1차 원심분리하는 단계; 원심분리 후 정치하는 단계; 상등액을 회수하여 급속동결하는 단계; 실온에서 녹인 후 2차 원심분리하는 단계; 상등액을 비활성화하는 단계: 및 필터하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

특히, 상기 성별 특이적 혈청은 수컷 혈청 또는 거세수컷 혈청인 것이 바람직하다.

상기 1차 원심분리는 4,000 내지 6,000 rpm에서 10 내지 30분 동안 수행하여 응집력을 높일 수 있다.

상기 정치는 0 내지 10℃에서 25 내지 30 시간 동안 수행할 수 있다.

상기 2차 원심분리는 6,000 내지 8,000 rpm에서 20 내지 40분 동안 수행하여 필터를 용이하게 할 수 있다.

상기 비활성화는 45 내지 65℃에서 20 내지 40분 동안 수행할 수 있다.

상기 필터는 페이퍼 필터 또는 시린지 필터 중에서 선택된 어느 하나 또는 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 BHK-21 세포를 계대 배양하여 단층을 형성하는 단계; 상기 BHK-21 세포에 바이러스를 감염시켜 배양하는 단계; 및 상기 배양액에 성별 특이적 혈청이 첨가된 배지를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이러스 백신의 생산수율 증대방법을 제공한다.

상기 바이러스로는 구제역 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 셈리키삼림열 바이러스(Semliki forest virus) 및 치쿤군야 바이러스(chikungunya virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 구제역 바이러스일 수 있다.

상기 성별 특이적 혈청은 앞서 기술된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 성별 특이적 혈청은 전체 배지 중에 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 내지 10 중량%의 범위로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 성별 특이적 혈청 특히, 수컷 혈청이나 거세수컷 혈청을 이용하여 BHK-21 세포를 효율적으로 증식시킬 수 있으며 이는 종래 사용하던 우태아 혈청(FBS)보다 낮은 농도의 성별 특이적 혈청을 이용하여 우태아 혈청(FBS)보다 뛰어난 세포 증식을 유도할 수 있으므로, 세포 증식 단가의 절감, 도체폐기물의 환경부담비 절감, 고품질의 혈청생산으로 인한 수익증대 등에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 이러한 세포 증식 효과는 Vero 세포와 같은 다른 세포주에 비해 BHK-21 세포에서 유의적으로 증가하므로, 성별 특이적 혈청을 이용하여 배양한 BHK-21 세포를 사용하여 구제역 예방 백신을 보다 저렴하면서도 효과적으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 성별 특이적 혈청의 분리 및 정제과정을 나타낸 순서도이고,
도 2는 성별 특이적 혈청을 이용한 BHK-21 세포의 세포증식율을 수입 혈청과 비교 검토한 것이고,
도 3은 다양한 농도의 성별 특이적 혈청을 이용한 BHK-21 세포의 세포증식율을 수입 혈청과 비교 검토한 것이고,
도 4는 성별 특이적 혈청을 이용한 Vero 세포의 세포증식율을 수입 혈청과 비교 검토한 것이고,
도 5는 다양한 농도의 성별 특이적 혈청을 이용한 Vero 세포의 세포증식율을 수입 혈청과 비교 검토한 것이다.

본 발명에 따른 BHK-21 세포의 증식방법은 성별 특이적 혈청을 이용하며, 상기 성별 특이적 혈청은 도체폐기 되는 포유동물로부터 혈액을 준비하는 단계; 준비된 혈액을 1차 원심분리하는 단계; 원심분리 후 정치하는 단계; 상등액을 회수하여 급속동결하는 단계; 실온에서 녹인 후 2차 원심분리하는 단계; 상등액을 비활성화하는 단계: 및 필터하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 1차 원심분리는 4,000 내지 6,000 rpm에서 10 내지 30분 동안 수행하는 것이 바람직하며, 5,000 rpm에서 20분 동안 수행하는 것이 보다 바람직하다. 이러한 1차 원심분리에 의해 응집력을 높일 수 있다. 만약, 상기 범위를 벗어나 원심분리를 수행하면 혈색소응괴의 문제가 야기될 수 있다.

또한, 상기 정치는 0 내지 10℃에서 25 내지 30시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 4℃에서 25 내지 30시간 동안 수행하는 것이 보다 바람직하다. 만약, 상기 범위를 벗어나 정치를 수행하면 혈액응고가 파괴되는 문제가 야기될 수 있다.

또한, 상기 2차 원심분리는 6,000 내지 8,000 rpm에서 20 내지 40분 동안 수행하는 것이 바람직하며, 7,000 rpm에서 30분 동안 수행하는 것이 보다 바람직하다. 이러한 2차 원심분리에 의해 필터를 용이하게 할 수 있다. 만약, 이 단계에서 원심분리를 수행하지 않으면 필터에 어려움이 발생할 수 있다.

또한, 상기 비활성화는 45 내지 65℃에서 20 내지 40시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 56℃에서 30분 동안 수행하는 것이 보다 바람직하다. 만약, 상기 범위를 벗어나 비활성화를 수행하면 온도 변화에 따른 단백질 변성의 문제가 야기될 수 있다.

또한, 상기 필터는 페이퍼 필터 또는 시린지 필터 중에서 선택된 어느 하나 또는 하나 이상을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 범위를 벗어나 필터를 수행하면 배양 시 오염의 문제가 야기될 수 있다.

특히, 본 발명은 혈청을 분리하고 정제하기 위한 여과의 어려움을 급속 동결과 원심분리 필터 페이퍼 및 시린지 필터를 이용함으로써 비용을 경감시키며, 도축된 성체의 폐기혈액을 재사용함으로써 환경오염을 예방할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 바이러스 백신의 생산수율 증대방법은 BHK-21 세포를 계대 배양하여 단층을 형성하는 단계; 상기 BHK-21 세포에 바이러스를 감염시켜 배양하는 단계; 및 상기 배양액에 성별 특이적 혈청이 첨가된 배지를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 바이러스로는 구제역 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 셈리키삼림열 바이러스(Semliki forest virus) 및 치쿤군야 바이러스(chikungunya virus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 구제역 바이러스일 수 있다.

상기 성별 특이적 혈청은 전체 배지 중에 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 내지 10 중량%의 범위로 포함되는 것이 바람직하다. 이때, 성별 특이적 혈청의 함량을 상기 범위보다 소량으로 사용하면 BHK-21 세포가 제대로 증식하지 않아 구제역 등의 백신을 생산할 수 없는 반면, 상기 범위보다 과량으로 사용하면 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.

BHK-21 세포가 50~80% 정도 형성되면 특정 바이러스를 감염시킨다. 감염 소요 시간과 증식 기간은 바이러스 종류에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 감염 소요 시간은 대개 3시간에서 12시간 정도이며, 증식 기간은 3일에서 1주일간이다. 이때, 세포 배양은 배치(batch) 배양, 반복 배치 배양, 페드-배치(fed-batch) 배양 또는 관류(perfusion) 배양 등에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 감염은 세포 농도가 최소 약 4백만, 바람직하게는 6백만 세포/㎖, 더욱 바람직하게는 8백만 세포/㎖일 때, 배치 또는 페드-배치 배양에서 수행될 수 있다. 관류 방법이 사용되는 경우, 상기 감염은 세포 농도가 최소 8백만 세포/㎖, 바람직하게는 약 9 내지 10 백만 세포/㎖, 또는 그 이상일 때 수행될 수 있다.

상기 바이러스에 따른 감염과 증식이 종료되면, 배양 상층액을 회수한다. 그리고, 생독 백신 또는 불활성화 백신의 제조방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 특히, 불활성화 백신을 제조하고자 하는 경우, 포르말린 또는 제조사의 지시서에 따른 특정한 방법으로 바이러스를 처리하여 이를 불활성화시키고, 불활성화된 바이러스를 통상의 방법으로 정제하여, 바이러스 원액의 무균실험 및 바이러스 함량실험 등을 실시하고, 보존제 및 완충액 생리식염수를 가하여 희석 혼합 또는 안정제를 첨가한다. 최종 원액은 무균 실험과 보존제 함량 시험을 실시할 수 있다. 최종 백신은 원하는 바에 따라 동결건조, 액상 등의 상태로 제조될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 설명일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 성별 특이적 혈청분리

1. 실험 재료

-20℃ 냉동고, 고속 냉동 원심분리기(GRX-220; TOMY TECH, California, USA), 0.2㎛ 및 0.8㎛ 1회용 시린지 필터(Advantec, Seoul, Korea), 10㎖ 1회용 시린지(화지메디칼, Seoul, Korea), 필터 페이퍼(#2, #5; Advantec, Seoul, Korea)를 사용하였다.

2. 추출 방법

한우의 시료는 도축장에서 도축된 직후 항응고제가 들지 않은 멸균된 용기를 이용하여 회수하였다(암컷: 500-550kg, 5-6세, 수컷: 650-700kg, 2세, 거세수컷: 600-650kg, 2세). 회수된 혈액시료를 1시간 안에 실험실로 운반하여 5,000rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 4℃에서 25-30시간 동안 정치하고 상등액을 회수하여 -20℃에서 급속동결 하였다.

급속동결을 마친 시료를 실온에서 녹여 7,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 회수하여 56℃에서 30분 동안 비활성화 과정을 수행하였다. 비활성화 과정을 마친 혈청은 #2.5 페이퍼 필터로 필터링한 후, 0.8㎛ 필터 및 0.2㎛ 필터 순으로 필터링하여 혈청을 추출하고 정제하였다.

<실시예 2> 성별 특이적 혈청의 함량 분석

앞서 추출한 혈청을 에스트라디올(Estradiol), 에스트론(Estrone), 테스토스테론(Testosterone) ELlSA 키트를 이용하여 각 스테로이드의 함량 분석을 수행하였다. 즉, 각 웰에 대조군, 실시예 1에서 준비된 혈청시료, 표준물질을 각각 분주하고 효소 접합체(Enzyme conjugate)를 첨가한 후 실온 또는 냉장에 방치하였다.

방치를 마친 분석 플레이트는 세정 완충액으로 3번 세척 후 기질 용액을 첨가하여 30분 동안 방치하였다. 15분 후 정지 용액을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 표 1과 같다.

에스트라디올과 에스트론은 암컷 혈청 > 수컷 혈청, 거세수컷 혈청 > 우태아 혈청(FBS)이고 테스토스테론은 수컷 혈청 > 거세수컷 혈청, 암컷 혈청 > FSB로 나타났다. 본 발명에서 추출된 혈청은 FBS보다 스테로이드 호르몬의 양이 많았으며 개체별에 따라 다른 농도의 혈청을 획득할 수 있었다.

<실시예 3> 성별 특이적 혈청을 이용한 백신 생산용 세포주 배양

1. 세포 배양

먼저, 본 실시예에서 사용된 BHK-21 세포(Baby Hamster Kidney 유래) 및 Vero 세포(Monkey Kidney 유래)는 한국 세포주은행에서 구입하였다. 세포는 100mm dish에 4 x 10 ⁴ 로 준비된 배지와 함께 흩뿌린 후 60~70% 정도 성장시켰다. 이때, 상기 배지는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 0.1% 암포테리신 B를 함유한 배지를 사용하였다. 성장된 각 세포는 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 모은 후 12well plate에 5 x 10 ⁴ /well 로 세포를 분주한 후 항온기 (37℃, 5% CO ₂ )에서 24시간 배양하였다. 부착된 세포는 기존 배지를 제거하고, 각 혈청 [FBS(fetal bovine serum), BS(bovine serum), 앞서 준비한 성별 특이적 한우 혈청인 FS(female serum), MS(male serum), C-MS(castrated male serum)]을 배지에 각각 첨가한 후 지속적으로 배양하였다. 이때, 사용한 우태아 혈청과 소 혈청은 각각 HYCLONE사의 제품(CAT.NO SH30919.03, CAT.NO SH30409.03)인 수입 혈청이다.

세포는 각 혈청이 첨가된 배지에서 48시간 동안 키운 후 이하의 MTT 분석 방법을 이용하여 세포의 증식을 관찰하였다. 또한 일부 세포의 경우 48 내지 96시간 동안 시간대별로 세포배양을 하면서 동일한 방법으로 세포증식을 관찰하였다.

2. MTT 분석

MTT 분석은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마존으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로서, MTT 용액은 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1% 암포테리신 B가 포함된 DMEM 배지와 치아졸릴 블루 테트라졸리움 브로마이드(Sigma-Aldrich) 0.05 mg/ml를 혼합하여 제조하였다. 상기 혼합액을 각 well의 기존 배지를 제거하고 500 ㎕/well를 주입하여 항온기에서 3시간 배양시켰다. 혼합액을 제거한 후 완전히 건조시킨 후 디메틸설폭사이드(DUKSAN PURE CHEMICALS)를 500 ㎕/well 넣은 후 SHAKER-SK-600 (동방하이테크 상사, 한국)에서 10분 정도 흔들어 주었다. 충분히 섞인 디메틸설폭사이드는 96-well에 100 ㎕/well 넣은 후 SUNRISE-BASIC (TECAN, AUSTRIA)를 이용하여 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

따라서, MTT 분석을 통하여 평가한 각 혈청별 BHK-21 세포 및 Vero 세포에 대한 세포 증식 결과는 도 2 내지 도 5와 같다.

도 2는 우태아 혈청 및 소 혈청을 포함한 수입혈청과, 실시예에 따른 성별 특이적 혈청을 각각 이용한 BHK-21 세포의 증식을 관찰한 것으로서, 성별 특이적 혈청을 이용하여 배양한 BHK-21 세포의 증식이 우태아 혈청을 이용한 경우보다 약 20 내지 60% 정도 더 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 특히 성별에 따른 BHK-21 세포의 증식에 차이가 있는 것으로 확인되는데, 수컷 혈청 또는 거세수컷 혈청이 뛰어난 세포 증식율을 나타내었다.

도 3은 다양한 농도별로 우태아 혈청 및 소 혈청을 포함한 수입 혈청과, 실시예에 따른 성별 특이적 혈청을 각각 이용한 BHK-21 세포의 증식을 관찰한 것으로서, 우태아 혈청 10%, 소 혈청 5%, 수컷 혈청 2% 및 거세수컷 혈청 3%를 포함한 배지에서 BHK-21 세포가 비슷한 증식율을 나타내므로, 수컷 혈청이 가장 뛰어난 세포 증식율을 나타내었다.

도 4는 우태아 혈청 및 소 혈청을 포함한 수입혈청과, 실시예에 따른 성별 특이적 혈청을 각각 이용한 Vero 세포의 증식을 관찰한 것으로서, 성별 특이적 혈청은 우태아 혈청에 비해 20 내지 30% 정도 낮은 세포 증식율을 나타내었다.

도 5는 다양한 농도별로 우태아 혈청 및 소 혈청을 포함한 수입혈청과, 실시예에 따른 성별 특이적 혈청을 각각 이용한 Vero 세포의 증식을 관찰한 것으로서, 혈청의 농도 증가에 따라 조금의 개체별 증식이 확인되었으나, 이러한 수치의 차이가 작아 농도 증가에 대한 효과는 기대할 수 없는 것으로 확인되었다.

따라서, 성별 특이적 혈청을 포함한 배지를 이용하여 세포를 배양할 경우, BHK-21 세포에서는 우태아 혈청에 비해 낮은 농도에서도 효과적으로 세포 증식을 증가시킨 반면, Vero 세포에서는 우태아 혈청에 비해 세포 증식 효과가 떨어지는 것으로 확인된 바, 성별 특이적 혈청 특히 수컷 혈청을 포함한 배지를 이용하여 특이하게 BHK-21 세포만을 효과적으로 증식시킬 수 있으며, 특히 2%의 낮은 농도로도 효과적인 증식이 가능하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.