先于胸腺再活化的疾病预防和疫苗接种
阅读：451发布：2020-06-17
专利汇可以提供先于胸腺再活化的疾病预防和疫苗接种专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了通过阻断患者的性类固醇 信号 途径用于 预防 或 治疗 病变、提高对免疫接种的应答性和提高患者的 基因治疗 的疗效的方法，其中没有、先于胸腺再活化或与之同时提高了骨髓和其他免疫细胞的功能性。在一些具体实施方案中，通过施与LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、抗LHRH受体 抗体 、抗LHRH 疫苗 、抗雄 激素 、抗雌激素、选择性雌激素受体调控物(SERM)、选择性雄激素受体调控物(SARM)、选择性孕 酮 应答调控物(SPRM)、ERD、芳香酶 抑制剂 或它们的各种组合中断或清除了患者的性类固醇信号途径。，下面是先于胸腺再活化的疾病预防和疫苗接种专利的具体信息内容。
1.一种用于增强患者骨髓的功能性的方法，包括阻断患者的性类固 醇介导的信号途径，其中所述骨髓的功能性或在没有患者胸腺再活化的 情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强。
2.一种用于预防患者的病变或疾病的方法，包括阻断患者的性类固 醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在没有患者胸腺再活化的 情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强， 且其中与患者的性类固醇介导的信号途径被阻断之前患者所出现的症状 相比，所述疾病的临床症状被减轻。
3.权利要求1或2的方法，其中增强HSC造血作用。
4.权利要求1或2的方法，其中增强骨髓的HSC输出。
5.权利要求1或2的方法，其中通过阉割阻断性类固醇介导的信号 途径。
6.权利要求5的方法，其中通过手术阉割阻断性类固醇介导的信号 途径。
7.权利要求6的方法，其中通过化学阉割阻断性类固醇介导的信号 途径。
8.权利要求1或2的方法，其中通过施用一或多种药物阻断性类固 醇介导的信号途径。
9.权利要求8的方法，其中一或多种药物选自由LHRH激动剂、 LHRH拮抗剂、抗LHRH疫苗、抗雄激素、抗雌激素、SERM、SARM、 SPRM、ERD、芳香酶抑制剂、抗孕激素、及其组合所组成的组。
10.权利要求9的方法，其中LHRH激动剂选自由Eulexin、戈舍 瑞林、亮丙利德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、 组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、地洛瑞林、Cystorelin、 Decapeptyl、戈那瑞林、及其组合所组成的组。
11.权利要求9的方法，其中LHRH拮抗剂选自由阿巴瑞克、西曲 瑞克、及其组合所组成的组。
12.权利要求9的方法，其中抗雄激素是Cosudex_。
13.权利要求1或2的方法，其中患者的胸腺已经至少部分萎缩。
14.权利要求13的方法，其中患者患有至少部分导致患者胸腺萎 缩的疾病或病变。
15.权利要求13的方法，其中患者已经接受了对疾病或病变的治 疗，该治疗至少部分导致患者胸腺萎缩。
16.权利要求15的方法，其中治疗是免疫抑制、化疗或放射治疗。
17.权利要求13的方法，其中患者是青春期后的。
18.权利要求14的方法，还包括给患者施用细胞，其中所述细胞 是干细胞、祖细胞、或其组合。
19.权利要求18的方法，其中干细胞选自由HSC、上皮干细胞、 及其组合所组成的组。
20.权利要求18的方法，其中祖细胞选自由淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、及其组合所组成的组。
21.权利要求19的方法，其中祖细胞选自由淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、及其组合所组成的组。
22.权利要求19的方法，其中所述细胞是HSC。
23.权利要求22的方法，其中HSC是CD34+的。
24.权利要求22的方法，其中HSC是自体的。
25.权利要求22的方法，其中HSC不是自体的。
26.权利要求22的方法，其中在开始对性类固醇介导的信号途径 进行阻断时施用HSC。
27.权利要求2的方法，其中疾病或病变由选自病毒、细菌、真菌、 寄生虫、朊病毒、癌症、过敏原、哮喘诱发物、和引起自身免疫性疾病 的自身蛋白和抗原中的病因所引起。
28.权利要求27的方法，其中病因是病毒。
29.权利要求28的方法，其中病毒选自由逆转录病毒科、小核糖 核酸病毒科、Calciviridae、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、弹状 病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、Bungaviridae、沙粒病 毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、肝DNA病毒科、微小病毒科、 乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、和虹彩病毒 科所组成的组。科
30.权利要求28的方法，其中病毒选自由流感病毒、人类免疫缺 陷病毒和单纯疱疹病毒所组成的组。
31.权利要求27的方法，其中病因是细菌。
32.权利要求31的方法，其中细菌选自由幽门螺旋杆菌、伯氏螺 旋体、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪 萨斯分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、分枝杆菌子孢子、金黄色葡萄球菌、 淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性链球菌、 无乳链球菌、粪链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌子孢 子、肠球菌子孢子、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉 棒杆菌、棒杆菌子孢子、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状 芽孢杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌子 孢子、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、钩 端螺旋体、和衣氏放线菌所组成的组。
33.权利要求31的方法，其中细菌是分枝杆菌。
34.权利要求27的方法，其中病因是寄生虫。
35.权利要求32的方法，其中寄生虫选自由恶性疟原虫、约氏疟 原虫和鼠弓形体所组成的组。
36.权利要求34的方法，其中寄生虫是疟原虫。
37.权利要求27的方法，其中病因是感染性真菌。
38.权利要求37的方法，其中感染性真菌选自由新型隐球菌、荚 膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌所 组成的组。
39.权利要求27的方法，其中病因是癌症。
40.权利要求40的方法，其中癌症选自由脑癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和血液癌症所组成的组。
41.权利要求27的方法，其中病因是过敏原。
42.权利要求41的方法，其中过敏原引起选自由湿疹、过敏性鼻 炎、过敏性鼻卡他、花粉热、支气管哮喘、风疹(荨麻疹)、和食物过敏所 组成的组的过敏性病变。
43.权利要求27的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者被暴露于病因。
44.权利要求27的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者没有被暴露于病因。
45.权利要求27的方法，还包括给患者施用至少一种细胞因子、 至少一种生长因子、或至少一种细胞因子和至少一种生长因子的组合。
46.权利要求45的方法，其中细胞因子选自由白介素2(IL-2)、白 介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、干细胞因子(SCF)、及其组合所组成的组。
47.权利要求45的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
48.权利要求46的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
49.一种用于增强HSC植入受者患者的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓，
其中HSC的植入或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、 或在胸腺再活化的同时被增强。
50.一种用于预防患者的疾病或病变的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓，
其中HSC的植入或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、 或在胸腺再活化的同时被增强，且其中与患者的性类固醇介导的信号途 径被阻断之前患者所出现的症状相比，所述疾病或病变的临床症状被减 轻。
51.权利要求49或50的方法，其中所述的HSC是自体的。
52.权利要求49或50的方法，其中所述的HSC不是自体的。
53.权利要求49或50的方法，其中通过阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
54.权利要求53的方法，其中通过手术阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
55.权利要求54的方法，其中通过化学阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
56.权利要求49或50的方法，其中通过施用一或多种药物阻断性 类固醇介导的信号途径。
57.权利要求56的方法，其中一或多种药物选自由LHRH激动剂、 LHRH拮抗剂、抗LHRH疫苗、抗雄激素、抗雌激素、SERM、SARM、 SPRM、ERD、芳香酶抑制剂、抗孕激素、及其组合所组成的组。
58.权利要求57的方法，其中LHRH激动剂选自由Eulexin、戈舍 瑞林、亮丙利德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、 组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、地洛瑞林、Cystorelin、 Decapeptyl、戈那瑞林、及其组合所组成的组。
59.权利要求57的方法，其中LHRH拮抗剂选自由阿巴瑞克、西 曲瑞克、及其组合所组成的组。
60.权利要求57的方法，其中抗雄激素是Cosudex_。
61.权利要求49或50的方法，其中患者的胸腺已经至少部分萎缩。
62.权利要求61的方法，其中患者患有至少部分导致患者胸腺萎 缩的疾病或病变。
63.权利要求61的方法，其中患者已经接受了对疾病或病变的治 疗，该治疗至少部分导致患者胸腺萎缩。
64.权利要求63的方法，其中治疗是免疫抑制、化疗或放射治疗。
65.权利要求61的方法，其中患者是青春期后的。
66.权利要求62的方法，还包括给患者施用淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、上皮干细胞、或其组合。
67.权利要求49或50的方法，其中HSC是CD34+的。
68.权利要求49或50的方法，其中在开始对性类固醇介导的信号 途径进行阻断时施用HSC。
69.权利要求50的方法，其中疾病或病变由选自病毒、细菌、真 菌、寄生虫、朊病毒、癌症、过敏原、哮喘诱发物、和引起自身免疫性 疾病的自身蛋白和抗原中的病因所引起。
70.权利要求69的方法，其中病因是病毒。
71.权利要求70的方法，其中病毒选自由逆转录病毒科、小核糖 核酸病毒科、Calciviridae、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、弹状 病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、Bungaviridae、沙粒病 毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、肝DNA病毒科、微小病毒科、 乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、和虹彩病毒 科所组成的组。
72.权利要求70的方法，其中病毒选自由流感病毒、人类免疫缺 陷病毒和单纯疱疹病毒所组成的组。
73.权利要求69的方法，其中病因是细菌。
74.权利要求73的方法，其中细菌选自由幽门螺旋杆菌、伯氏螺 旋体、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪 萨斯分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、分枝杆菌子孢子、金黄色葡萄球菌、 淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性链球菌、 无乳链球菌、粪链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌子孢 子、肠球菌子孢子、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆 菌子孢子、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产 气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌子孢子、具核梭 杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、钩端螺旋体、和 衣氏放线菌所组成的组。
75.权利要求73的方法，其中细菌是分枝杆菌。
76.权利要求69的方法，其中病因是寄生虫。
77.权利要求74的方法，其中寄生虫选自由恶性疟原虫、约氏疟 原虫和鼠弓形体所组成的组。
78.权利要求76的方法，其中寄生虫是疟原虫。
79.权利要求69的方法，其中病因是感染性真菌。
80.权利要求79的方法，其中感染性真菌选自由新型隐球菌、荚 膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌所 组成的组。
81.权利要求69的方法，其中病因是癌症。
82.权利要求81的方法，其中癌症选自由脑癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和血液癌症所组成的组。
83.权利要求69的方法，其中病因是过敏原。
84.权利要求83的方法，其中过敏原引起选自由湿疹、过敏性鼻 炎、过敏性鼻卡他、花粉热、支气管哮喘、风疹(荨麻疹)、和食物过敏所 组成的组的过敏性病变。
85.权利要求69的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者被暴露于病因。
86.权利要求69的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者没有被暴露于病因。
87.权利要求56的方法，还包括给患者施用至少一种细胞因子、 至少一种生长因子、或至少一种细胞因子和至少一种生长因子的组合。
88.权利要求87的方法，其中细胞因子选自由白介素2(IL-2)、白 介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、干细胞因子(SCF)、及其组合所组成的组。
89.权利要求87的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
90.权利要求88的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
91.一种用于增强患者的免疫细胞的功能性的方法，包括阻断患者 的性类固醇介导的信号途径，其中所述的免疫细胞功能性或在没有患者 胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的 同时被增强。
92.一种用于预防患者的疾病或病变的方法，包括阻断患者的性类 固醇介导的信号途径，其中患者的免疫细胞的功能性或在没有患者胸腺 再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时 被增强，且其中与患者的性类固醇介导的信号途径被阻断之前患者所出 现的症状相比，所述疾病或病变的临床症状被减轻。
93.权利要求91或92的方法，其中所述的免疫细胞选自由T细胞、 B细胞和树突状细胞所组成的组。
94.权利要求93的方法，其中所述的免疫细胞是T细胞。
95.权利要求91或92的方法，其中通过阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
96.权利要求95的方法，其中通过手术阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
97.权利要求96的方法，其中通过化学阉割阻断性类固醇介导的 信号途径。
98.权利要求91或92的方法，其中通过施用一或多种药物阻断性 类固醇介导的信号途径。
99.权利要求98的方法，其中一或多种药物选自由LHRH激动剂、 LHRH拮抗剂、抗LHRH疫苗、抗雄激素、抗雌激素、SERM、SARM、 SPRM、ERD、芳香酶抑制剂、抗孕激素、及其组合所组成的组。
100.权利要求99的方法，其中LHRH激动剂选自由Eulexin、戈舍 瑞林、亮丙利德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、 组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、地洛瑞林、Cystorelin、 Decapeptyl、戈那瑞林、及其组合所组成的组。
101.权利要求99的方法，其中LHRH拮抗剂选自由阿巴瑞克、西 曲瑞克、及其组合所组成的组。
102.权利要求99的方法，其中抗雄激素是Cosudex_。
103.权利要求91或92的方法，其中患者的胸腺已经至少部分萎缩。
104.权利要求103的方法，其中患者患有至少部分导致患者胸腺萎 缩的疾病或病变。
105.权利要求103的方法，其中患者已经接受了对疾病或病变的治 疗，该治疗至少部分导致患者胸腺萎缩。
106.权利要求105的方法，其中治疗是免疫抑制、化疗或放射治疗。
107.权利要求103的方法，其中患者是青春期后的。
108.权利要求104的方法，还包括给患者施用细胞，其中所述细胞 是干细胞、祖细胞、或其组合。
109.权利要求108的方法，其中干细胞选自由HSC、上皮干细胞、 及其组合所组成的组。
110.权利要求108的方法，其中祖细胞选自由淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、及其组合所组成的组。
111.权利要求109的方法，其中祖细胞选自由淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、及其组合所组成的组。
112.权利要求109的方法，其中所述细胞是HSC。
113.权利要求112的方法，其中HSC是CD34+的。
114.权利要求112的方法，其中HSC是自体的。
115.权利要求112的方法，其中HSC不是自体的。
116.权利要求112的方法，其中在开始对性类固醇介导的信号途径 进行阻断时施用HSC。
117.权利要求102的方法，其中疾病或病变由选自病毒、细菌、真 菌、寄生虫、朊病毒、癌症、过敏原、哮喘诱发物、和引起自身免疫性 疾病的自身蛋白和抗原中的病因所引起。
118.权利要求117的方法，其中病因是病毒。
119.权利要求118的方法，其中病毒选自由逆转录病毒科、小核糖 核酸病毒科、Calciviridae、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、弹状 病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、Bungaviridae、沙粒病 毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、肝DNA病毒科、微小病毒科、 乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、和虹彩病毒 科所组成的组。
120.权利要求118的方法，其中病毒选自由流感病毒科、人类免疫 缺陷病毒和单纯疱疹病毒所组成的组。
121.权利要求117的方法，其中病因是细菌。
122.权利要求121的方法，其中细菌选自由幽门螺旋杆菌、伯氏螺 旋体、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪 萨斯分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、分枝杆菌子孢子、金黄色葡萄球菌、 淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性链球菌、 无乳链球菌、粪链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌子孢 子、肠球菌子孢子、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆 菌子孢子、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产 气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌子孢子、具核梭 杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、钩端螺旋体、和 衣氏放线菌所组成的组。
123.权利要求121的方法，其中细菌是分枝杆菌。
124.权利要求117的方法，其中病因是寄生虫。
125.权利要求122的方法，其中寄生虫选自由恶性疟原虫、约氏疟 原虫和鼠弓形体所组成的组。
126.权利要求124的方法，其中寄生虫是疟原虫。
127.权利要求117的方法，其中病因是感染性真菌。
128.权利要求127的方法，其中感染性真菌选自由新型隐球菌、荚 膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌所 组成的组。
129.权利要求117的方法，其中病因是癌症。
130.权利要求129的方法，其中癌症选自由脑癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和血液癌症所组成的组。
131.权利要求117的方法，其中病因是过敏原。
132.权利要求131的方法，其中过敏原引起选自由湿疹、过敏性鼻 炎、过敏性鼻卡他、花粉热、支气管哮喘、风疹(荨麻疹)、和食物过敏所 组成的组的过敏性病变。
133.权利要求117的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者被暴露于病因。
134.权利要求117的方法，其中在阻断患者的性类固醇介导的信号 途径之前，患者没有被暴露于病因。
135.权利要求98的方法，还包括给患者施用至少一种细胞因子、 至少一种生长因子、或至少一种细胞因子和至少一种生长因子的组合。
136.权利要求135的方法，其中细胞因子选自由白介素2(IL-2)、白 介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、干细胞因子(SCF)、及其组合所组成的组。
137.权利要求135的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
138.权利要求136的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族 的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子(SCF)、粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子(GM-CSF)、及其组合所组成的组。
139.一种用于提高患者对疫苗抗原的免疫应答的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；以及
给患者施用一种疫苗，所述疫苗包括一种疫苗抗原；
其中患者产生针对所述疫苗抗原的免疫应答，与没有阻断性类固醇 信号途径的患者将会出现的免疫应答相比，其免疫应答是提高的。
140.一种用于遗传学改变患者的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；
体外遗传学修饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合 所组成的组；以及
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中患者被遗传学修饰。
141.一种用于预防或治疗患者的人类免疫缺陷病毒感染的方法，包 括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；
用抑制人类免疫缺陷病毒的感染、复制或功能的基因体外遗传学修 饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组，以及
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中预防或治疗了人类免疫缺陷病毒感染。
142.一种用于治疗患者的自身免疫性疾病的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；和
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；
其中与患有自身免疫性疾病的未治疗患者相比，所治疗的患者具有 改善的自身免疫性疾病的预后。
143.一种用于治疗患者的过敏的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；和
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；
其中与未治疗患者相比，所治疗的患者具有改善的预后。
144.一种用于提高患者对疫苗抗原的免疫应答的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在 没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺 再活化的同时被增强；
给患者施用一种疫苗，所述疫苗包括一种疫苗抗原；
其中患者产生针对所述疫苗抗原的免疫应答，与没有阻断性类固醇 信号途径的患者将会出现的免疫应答相比，其免疫应答是提高的。
145.一种用于提高患者对疫苗抗原的免疫应答的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓，其中HSC的植入或在没有患者胸腺再活 化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增 强；以及
给患者施用一种疫苗，所述疫苗包括一种疫苗抗原；
其中患者产生针对所述疫苗抗原的免疫应答，与没有阻断性类固醇 信号途径的患者将会出现的免疫应答相比，其免疫应答是提高的。
146.一种用于遗传学改变患者的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓；
体外遗传学修饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合 所组成的组；
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中HSC的植入或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸 腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强。
147.一种用于预防或治疗患者的人类免疫缺陷病毒感染的方法，包 括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓；
用抑制人类免疫缺陷病毒的感染、复制或功能的基因体外遗传学修 饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组；以及
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中HSC的植入或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸 腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强。
148.一种用于治疗患者的自身免疫性疾病的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓；
其中HSC的植入或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸 腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强，且其中与患有自身免疫 性疾病的未治疗患者相比，所治疗的患者具有改善的自身免疫性疾病的 预后。
149.一种用于治疗患者的过敏的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径；
给患者施用HSC；
容许HSC植入患者骨髓；
其中HSC的植入或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸 腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强，且其中与未治疗患者相 比，所治疗的患者具有改善的预后。
150.一种用于提高患者对疫苗抗原的免疫应答的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者的免疫细胞的功能 性或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患 者胸腺再活化的同时被增强；以及
给患者施用一种疫苗，所述疫苗包括一种疫苗抗原；
其中患者产生针对所述疫苗抗原的免疫应答。
151.一种用于遗传学改变患者的方法，包括：
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者的免疫细胞的功能 性或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患 者胸腺再活化的同时被增强；
体外遗传学修饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合 所组成的组；
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中患者对疫苗抗原的免疫应答被提高。
152.一种用于预防或治疗患者的人类免疫缺陷病毒感染的方法，包 括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者的免疫细胞的功能 性或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患 者胸腺再活化的同时被增强；
用抑制人类免疫缺陷病毒的感染、复制或功能的基因体外遗传学修 饰细胞，其中细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组；
给患者施用遗传学修饰的细胞；
其中预防或治疗了人类免疫缺陷病毒感染。
153.一种用于治疗患者的自身免疫性疾病的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者的免疫细胞的功能 性或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患 者胸腺再活化的同时被增强；
其中与患有自身免疫性疾病的未治疗患者相比，所治疗的患者具有 改善的自身免疫性疾病的预后。
154.一种用于治疗患者的过敏的方法，包括：
耗竭患者的免疫细胞；
阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中或在没有患者胸腺再活 化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时增加 患者的免疫细胞的功能性；
其中与未治疗患者相比，所治疗的患者具有改善的预后。
技术领域
本发明涉及细胞免疫学、疾病预防、疫苗接种和基因治疗领域。更 具体地，本发明涉及增强骨髓(BM)的造血和功能性、增强造血干细胞 移植(HSCT)后的BM植入(engraftment)、以及增强新的和已有的T细 胞及免疫系统的其他细胞的功能性。
背景技术
免疫系统
免疫系统的主要功能是区分“外来的”(即来源于身体以外的任何来源) 抗原和“自身的”(即来源于身体内)抗原，并据此应答以保护身体抵抗感 染。更为实用的说法是，免疫应答也已经被描述为对危险信号的应答。 这些危险信号可以是细胞或组织性能的任何变化，它们提醒免疫系统的 细胞这个有问题的细胞不再是“正常的”。这样的提醒在引起例如对外来 因素如病毒、细菌、寄生虫和真菌感染的排斥上是非常重要的，它们也 可被用于诱导抗肿瘤应答。但是，这样的危险信号也可以是启动自身免 疫性疾病的原因，因为自身细胞内的任一不适当的细胞改变都使得自身 细胞成为免疫系统所靶向的细胞(例如糖尿病中的胰腺的β胰岛细胞)。或 者，对免疫细胞本身的不适当的刺激除了诱导的初始应答的外来细胞或 微生物之外，也能导致对正常的自身细胞的损害。
在正常的免疫应答中，事件的顺序包括专职的抗原呈递细胞(APC) 捕获抗原并将它们处理成小的肽片段，这些肽片段位于APC表面的主要 组织相容性复合物(MHC)分子的裂隙(cleft)内。MHC分子可以是在 所有有核细胞上所表达的I型(被细胞毒T细胞(Tc或CTL)所识别)或 是主要在免疫系统的细胞上所表达的II型(辅助T细胞(Th)所识别)。 细胞识别APC上的MHC II/肽复合物并应答。然后这些细胞所释放的因 子促进了特异于特殊抗原的Tc细胞或产抗体的B细胞之一或两者的活 化。事实上，HIV/AIDS最好地说明了Th细胞在所有免疫应答中的重要 性，因为经病毒破坏所引起的Th细胞的缺乏造成了严重的免疫缺陷，最 终导致机会性感染而死亡。Th(以及在较低的程度上，Tc)的不适当的发 育也能导致各种不同的病变例如过敏、癌症和自身免疫。
这些细胞的不适当发育可以是因为异常的胸腺，其中胸腺的结构组 成被明显地改变了，例如在许多自身免疫性疾病中，成熟胸腺细胞发育 所需的髓质上皮细胞被异位表达于不成熟T细胞所正常位于的皮质中。 这可能意味着发育中的不成熟T细胞过早地接受了晚期的成熟信号并因 此变得对阴性选择信号不敏感，阴性选择信号正常地将去除潜在的自身 反应性细胞。在发生狼疮样症状的NZB小鼠中(Takeoka et al.，(1999)Clin. Immunol.90：388)以及更为最近的在发生I型糖尿病的NOD小鼠中 (Thomas-Vaslin et al.，(1997)P.N.A.S.USA 94：4598；Atlan-Gepner et al.， (1999)Autoimmunity 3：249-260)的确都发现了这种类型的胸腺异常。还 不知道这些形式的胸腺异常是怎样或何时发生的，但是它们的发生可以 通过自然的衰老过程或是因为破坏性因素例如病毒感染(在AIDS患者 中已经描述了胸腺的变化)、应激、化疗和放射治疗(Mackall et al.，(1995) N.Eng.J.Med.332：143；Heitger et al.，(1997)Blood 99：4053；Mackall and Gress，(1997)Immunol.Rev.160：91)。出生时即存在缺陷也是有可能的。
T和B淋巴细胞的细胞膜受体具有识别抗原的能力。这些受体是通 过一系列复杂的多种可能基因的重排随机生成的，这样每个个体的T或 B细胞都具有唯一的抗原受体。这种巨大的潜在的多样性意味着对于任 何一种机体可能会遇到的单一抗原，多个淋巴细胞能以不同程度的结合 强度(亲和力)将其识别并引发不同程度的应答。既然抗原受体的特异性 是随机出现的，那么所出现的问题是为什么机体不会通过抗自身抗原的 淋巴细胞而发生自身破坏。幸运的是，有一些机制预防T和B细胞进行 这样的自身破坏。总的来说，这些机制产生了一种免疫系统对自身耐受 的状态。
自身耐受的最有效形式是在产生潜在的反应性淋巴细胞的部位中将 它们全部都物理地去除或杀死。这些部位包括产生T细胞的胸腺和产生 B细胞的BM。这被叫做中枢耐受(central tolerance)。一种重要的、附加 的耐受方法是通过调节Th细胞，它或直接地或通过产生细胞因子抑制自 身反应性细胞。假定所有的免疫应答事实上都需要T辅助细胞的启动和 调节，任何耐受诱导方案的一个主要目标就是靶向于这些T辅助细胞。 相似地，既然Tc细胞是非常重要的效应细胞，那么它们的产物就是例如 抗癌症和抗病毒治疗策略的一个主要目标。另外，T调节细胞(Treg)例 如CD4+CD25+和NKT细胞提供了一种工具，因为它们能抑制潜在的自 身反应性细胞。
胸腺
胸腺主要包括分散在不同间质细胞(主要是上皮细胞亚组)内的发 育中的胸腺细胞(胸腺内的T淋巴细胞)，这些间质细胞构成微环境并提 供T细胞的最优化发育所必需的生长因子(GF)和细胞相互作用。
胸腺是免疫系统中的一个重要器官，因为它是产生T淋巴细胞的主 要部位。胸腺的作用是如下所述的从血液中吸引到合适的BM来源的前 体细胞(precursor cells)，并诱导它们定型为T细胞系，包括产生针对抗 原的T细胞受体(TCR)所必需的基因重排。每个T细胞都具有单一的 TCR类型并在其特异性上是唯一的。与这种TCR生成相关的是细胞分裂， 它扩增了具有TCR类型的T细胞数目并因此增加了每种外来抗原都将被 识别和清除的可能性。但是，与B细胞不同，T细胞识别抗原的唯一特 点是TCR只识别与MHC分子物理相连的肽片段。正常地，这是自身 MHC，并且在胸腺中选择识别自身MHC/肽复合物的能力或TCR。这个 过程被称为正向选择并是一种皮质上皮细胞的排他性特征。如果TCR不 能与自身MHC/肽复合物结合，T细胞将死于“忽略”，因为T细胞为了它 的持续存活和成熟需要一定程度的经TCR的信号转导。
既然TCR基因重排的结果是一个随机事件，那么一些T细胞将偶然 地发育为能以高亲和力识别自身MHC/肽复合物的T细胞。因此，这些T 细胞是潜在的自身反应性的，并涉及自身免疫性疾病，例如多发性硬化 (MS)、类风湿关节炎(RA)、糖尿病、甲状腺炎和系统性红斑狼疮(SLE)。 幸运的是，如果TCR与自身MHC/肽复合物的亲和力太高并且T细胞在 胸腺中遇到了这种特异性复合物，那么发育中的胸腺细胞被诱导为进行 自杀性活化并死于凋亡，这个过程被叫做负选择。这个过程也被叫做中 枢耐受。这些“对自身具有高亲和力”的T细胞死亡而不是应答，是因为 在胸腺中它们仍是不成熟的。胸腺中这种负选择的最有力的诱导物是被 叫做树突状细胞(DC)的APC。DC将最强烈的信号传递给T细胞，造 成了胸腺内的去除。但是，在外周淋巴器官中，T细胞是更成熟的，给相 同的TCR呈递相同的MHC/肽复合物的DC将引起具有TCR的T细胞的 活化。
胸腺萎缩和衰老
虽然胸腺对于功能性免疫系统是重要的，它每天释放约它的T细胞 含量的1％到血流中，但是哺乳动物和其他动物的中一个明显异常是性类 固醇(sex steroid)产生所造成的这个器官的严重萎缩。这种萎缩在约5-7 年时间内逐步发生，在20岁左右达到最低水平的T细胞输出(Douek et al.， Nature(1998)396：690-695)，这种萎缩与在对糖皮质激素的应激应答期间 所诱导的可逆性萎缩不同。在结构上，胸腺萎缩包括淋巴细胞含量的进 行性缺失、皮质上皮网络的塌陷、细胞外基质材料的增加以及脂肪细胞 (脂细胞)和脂类沉积物对腺体的浸润(Haynes et al.，(1999)J.Clin.Invest. 103：453)。这个过程可以开始于年幼的儿童(例如年龄5岁左右，Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332：143)，但是它在性类固醇水平达到最高峰 的青春期时是最明显的。
在外周可反映出胸腺萎缩的影响，它减少了胸腺对T细胞池的输出， 这造成了较少变化的TCR库(因为只有新的原初T细胞才能提供)。也观 察到了改变了的细胞因子值(Hobbs et al.，(1993)J.Immunol.150：3602； Kurashimaet al.，(1995)Int.Immunol.7：97)、CD4+和CD8+亚组的变化、 向与原初T细胞相反的记忆T细胞的偏倚(Mackall et al.，(1995)N.Engl.J. Med.332：143)、以及对抗原或促有丝分裂刺激的应答能力的下降。
既然胸腺是外周T细胞池的生成和维持的主要部位，这种萎缩已经 被广泛地认定为是老年人的基于免疫的疾病的发病率增加的主要原因。 特别地，病变例如普遍的免疫缺陷、对机会性感染和疫苗的弱应答性以 及自身免疫性疾病频率的增加，如多发性硬化、类风湿关节炎和狼疮 (Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95：131-142；Wey and et al.，(1998) Mech.Age.Dev.102：131-147；Castle，(2000)Clin Infect Dis 31(2)：578-585； Murasko et al.，(2002)Exp.Gerontol.37：427-439)都随着年龄增加了它们 的发病率和严重性。经常通过T细胞依赖性免疫功能(例如溶细胞性T 细胞活性和促有丝分裂的应答)的减低来说明这些免疫系统的缺陷。虽然 稳态机制保持了健康个体的T细胞数目，当例如在AIDS和化疗或放射 治疗后有着T细胞的大量丧失时，成人患者高度易感于机会性感染，因 为所有的这些病变都包括T细胞和/或其他血细胞(见下)的缺失。淋巴 细胞的恢复也是严重滞后的。萎缩的胸腺不能重建在HIV感染期间所缺 失的CD4+T细胞(Douek et al.Nature(1998)396：690-695)，以及与青春 期前患者比较，化疗之后的CD4+T细胞在青春期后患者中要花3到4 倍更长的时间才能恢复到正常水平(Mackall et al.(1995)N.Engl.J.Med. 332：143-149)。因此，这些患者缺少应答感染所必需的细胞，他们出现严 重的免疫抑制(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332：143；Heitger et al.，(2002)Blood 99：4053)。在生命的后期也有癌症和肿瘤负荷的增加 (Hirokawa，(1998)″Immunity and Ageing，″in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd；Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95：131；Castle，(2000)Clin. Infect.Dis.31：578)。
但是，Douek等最近的工作((1998)Nature 396：690)已经表明在老 年人(例如甚至65岁以上以及老年HIV患者的抗逆转录病毒治疗之后) 中仍有胸腺输出的发生，尽管只有非常少量的输出(约为青年人水平的 5％)。具有T细胞受体删除环(T Cell Receptor Excision Circles，TREC； TREC是作为针对抗原的TCR的产生过程的一部分而形成的，并且只发 现于新产生的T细胞上)的T细胞的存在举例说明了这一点。此外，Timm 和Thoman((1999)J.Immunol.162：711)已经显示尽管老龄小鼠在骨髓移 植(BMT)后再生了CD4+T细胞，但是因为衰老的外周微环境，这些T 细胞显示出了向记忆细胞的偏倚并伴有弱的胸腺原初T细胞的产生。也 已经分析了造血干细胞移植后的TREC水平(Douek et al.，(2000)Lancet 355：1875)。
胸腺和神经内分泌轴
胸腺很大程度上受其与神经内分泌系统的双向交流的影响(Kendall， (1988)″Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D.Kendall，and M. A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27)。特别重要的是垂体、 肾上腺和性腺之间对胸腺功能的相互作用，包括营养作用(trophic effects) (促甲状腺激素或TSH和生长激素或GH)和萎缩作用(atrophic effects)(促 黄体生成激素或LH、促卵泡生成激素或FSH、和促肾上腺皮质激素或 ACTH)(Kendall，(1988)″Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D. Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27； Homo-Delarche et al.，(1993)Springer Sem.Immunopathol.14：221)。事实 上，胸腺生理的一个特征性特点是结构和功能的进行性退化，这与青春 期时的循环的性类固醇产生的增加是相当的，这在人类通常是从年龄 12-14岁之前逐步发生的(Hirokawa and Makinodan，(1975)J.Immunol. 114：1659；Tosi et al.，(1982)Clin.Exp.Immunol.47：497；and Hirokawa，et al.，(1994)Immunol.Lett.40：269)。
胸腺主要包括分散于不同间质细胞(主要为上皮细胞亚组)内的发 育中的胸腺细胞，这些间质细胞构成了微环境并提供了T细胞的最优化 发育所必需的生长因子和细胞相互作用。已经确定出激素的精确靶点以 及它们诱导胸腺萎缩和提高免疫应答的机制。然而，对睾丸女性化突变 小鼠的检查表明必须在胸腺的间质细胞上表达有功能性的性类固醇受体 时才会发生萎缩。胸腺细胞与控制它们的分化和成熟的上皮细胞亚组之 间的共发育关系(Boyd et al.，(1993)Immunol.Today 14：445)意味着性类 固醇抑制能发生在任一种细胞类型的水平，然后这将影响其他细胞类型 的状态。在老年患者中，骨髓干细胞的数目被减少并且在质量上是不同 的。HSC能重新入巢胸腺，尽管是以比年轻患者更低的程度。因此，影 响胸腺萎缩的主要因素似乎是胸腺内因素。此外，老龄动物中的胸腺细 胞(例如＞18个月的动物)至少保留有一定程度的分化能力(George and Ritter，(1996)Immunol.Today 17：267；Hirokawa et al.，(1994)Immunology Letters 40：269；Mackallet al.，(1998)Eur.J.Ilnmunol.28：1886)。然而， Aspinall最近的工作已经显示在年老小鼠中，有着胸腺细胞生成的缺陷， 它表现为三阴性前体细胞群内的阻断，即CD44+CD25+(TN2)期 (Aspinall et al.，(1997)J.Immunol.158：3037)。
在AIDS的特殊情况中，免疫系统的主要缺陷是CD4+细胞的破坏以 及巨噬细胞和树突状细胞(DC)的髓系细胞的较小程度的破坏。没有这些 细胞的免疫系统是麻痹的，患者极易感于机会性感染，死亡是常见的结 果。对AIDS的现有治疗是依据多种抗病毒药物杀死或清除HIV病毒。 这些治疗现在变得越来越有效，它们将病毒负荷显著地降低到患者可被 认为是处于缓解的点。然而，免疫缺陷的主要问题仍存在，因为仍只有 非常少的功能性T细胞，它们的确在恢复但恢复得很慢。因此，免疫缺 陷的时间段仍是非常长的，在某些病例中，免疫防御机制可能从来就没 有有效地恢复过。
造血作用
骨髓和造血干细胞
免疫系统的主要细胞是B和T淋巴细胞(一种白细胞的主要类型)， 以及抗原呈递细胞(APC)。所有的免疫细胞都基本上来源于造血干细胞 和它们的子代(普通淋巴祖细胞(CLP)和普通髓系祖细胞(CMP)，两者 都是在BM中生成的)。一些前体细胞移居到胸腺并转化为T细胞和胸腺 DC。DC在诱导自身耐受上发挥着作用。
只有很少比例(在年轻动物中为近0.01％)的HSC从BM中被释放 出来并经血液供应找到到达胸腺的途径，在这里它们进行分裂和成熟以 形成T细胞，然后返回到体循环中。这些新的新近胸腺迁出(RTE)细胞 形成了免疫系统的大部分，以及它们主要是Th和Tc细胞并且在保持新 的具有不同的TCR库的T细胞的恒量供应以启动几乎所有的免疫应答上 是重要的。在离开胸腺之前，Th和Tc细胞能有效地区分外来抗原，原因 如上所述。T细胞在胸腺中被“选择”，使得留下那些将机体内的所有细胞 识别为自身的并在正常情况下不会应答对抗自身细胞的T细胞。
B细胞最终也来源于HSC，并在离开BM进入外周免疫系统之前在 BM内发育。在与T细胞及免疫系统的其它细胞相互作用之后，B细胞发 育成产生并释放大量抗体的浆细胞，这些抗体有助于机体消灭感染性有 机体和异常细胞。
BM所产的其它HSC也被用于生成所有的其它血细胞例如NK细胞、 调控细胞、普通髓系祖细胞来源的细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和 嗜酸性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血细胞和红细胞。
造血干细胞移植
通常也被称为骨髓移植(BMT)的造血干细胞移植(HSCT)是一种 用于增强例如某些严重的癌症病变中的免疫系统的恢复的治疗。可以互 换使用“HSCT”和“BMT”和“移植”，它们在此被定义为移植到受者内分移 植物，其含有或富集了HSC、BM细胞、干细胞和/或任何其他的能生成 血液、胸腺、BM和/或任何其他的免疫细胞的细胞，包括但不限于HSC、 上皮细胞、普通淋巴祖细胞(CLP)、普通髓淋巴祖细胞(CMLP)、多系 祖细胞(MLP)和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，移植可以 是外周血干细胞移植(PBSCT)。可以动员出BM的HSC，然后从血液中 收集，或HSC是包含于从供者物理地提取出的BM内。HSC可以被纯化、 浓缩，或只是所收集的BM或血液的一部分，然后HSC被注射到受者内。 移植可以是异基因的、自体的、同基因的或异种的，以及可以包括任何 数目的细胞的移植，包括“小移植(mini-transplants)”，它只包括较少数目 的细胞。在一些实施方式中，在性类固醇抑制之前、与之同时或之后进 行HSCT。
HSC是非限制性的可示范的细胞类型，它可以被移植和/或被遗传学 修饰，如在本申请书全文中所用的。然而，本领域人员在实践在此所提 供的发明时很容易明白，不需要过多的试验，HSC就可以被许多替代细 胞类型中的任何一种(或多种)细胞类型所替代，这些细胞包括，但不限 于BM细胞、干细胞和/或其他任何的能生成血液、胸腺、BM和/或任何 其他的免疫细胞的细胞，这些细胞包括但不限于HSC、上皮干细胞、CLP、 CMLP、MLP和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，HSC来源于 胎肝和/或胎脾。
化疗和放射治疗都能消灭癌细胞。但是，因为缺乏特异性，这些治 疗也杀死了健康细胞，实际上包括所有的白细胞(WBC)以及BM中的 HSC。就是因为这种对WBC和HSC的破坏导致了患者对HSCT的需求。 HSCT容许例如健康干细胞替代被例如化疗或放射治疗所损伤的干细胞 和它们的子代细胞，健康干细胞最终可以生成患者所需的血细胞。
HSCT是多种血液肿瘤例如白血病和淋巴瘤(血液和免疫系统细胞 的癌症)以及非恶性免疫疾病例如严重的联合免疫缺陷、Fanconi贫血、 骨髓异常增生综合征、淀粉样变、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan 贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、Kostmann综合征、Wiskott-Aldrich 综合征、血小板减少症和血红蛋白病如镰状细胞病和地中海贫血的基本 治疗。通常用骨髓清除或骨髓耗竭治疗白血病和淋巴瘤以清除癌细胞体， 常常紧接着的是HSCT以恢复免疫功能。本发明的方法单独或联合(同 时或依次)施与HSC动员剂例如细胞因子(如G-CSF或GM-CSF)或药 物，容许更快的和更好的植入，也可以容许给予更大剂量和/或更频繁的 化疗和放射治疗。
现代临床医学操作经常采用来源于另一个供者血液的HSC的移植 (异基因HSCT)，其所具有的优点是供者T细胞抗宿主癌细胞的作用(移 植物抗白血病(GVL))，但是这个优点通常被其他的T供者T细胞抗宿主 的作用(移植物抗宿主(GVH)病)所制约，后者可以是致命的。既然 HSCT的成功以及据此的患者的生存率与所注射的HSC的数目及植入的 时间都直接相关，使用本发明的方法意味着现有的HSCT方案将会更为 成功以及将有比现有可能的更多的患者能接受HSCT。
增强从骨髓中动员出HSC的机制对于保证从供者中收集到尽可能多 的HSC是重要的。GM-CSF和G-CSF目前已经被用于这个目的。但是其 他的药物例如化疗和细胞因子也已经显示出是有效的。更有效地动员 HSC的能力具有超出血液学修复的应用。最近研究已经显示出HSC是多 能的并且可以被用于受损组织的修复，例如心肌、骨骼肌、肝脏、骨骼、 结缔组织、上皮组织、胰腺和血管系统。
现有HSCT策略的一个限制是与长时间免疫缺陷所造成的感染相关， 特别是病毒、真菌和有荚膜细菌的感染，并且这仍是成人移植后发病率 和死亡率的重要原因。与HSCT相关的感染通常是非常难以控制的，甚 至用现代的抗微生物药物。儿童通常在HSCT后数月内恢复免疫能力 (Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.157：73)，这与成人受者的淋巴细胞 恢复的延迟有着不同，这种延迟可以持续数年并且甚至可以是年轻最适 度(young optimum)的非常差的反映。成人的这种延迟依赖于多种因素， 但是对感染的易感性主要是因为公认的T和B细胞产生随年龄的退化 (Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.157：73)。
另外，移植物植入的速度也发挥着作用，其中移植物植入的速度越 慢，机会性感染发生的可能性就越大。
当所移植的细胞“排斥”供者细胞时，出现了现有HSCT的第二个 限制。这在临床上被称作为“移植物抗宿主病”(GVHD)。自体移植可以 避免GVHD。但是，与异基因移植比较，自体移植的总抗癌成功率更低。 在癌症患者中，自体移植具有的缺点是它们不能产生移植物抗肿瘤 (GVT)作用(这与GVH作用相似)，以及具有癌细胞可能随移植回输回 到患者中的危险。已经发现在小鼠异基因HSCT模型中的性类固醇抑制 和异基因HSCT的阉割受者都提高了髓系和淋巴两系细胞的移植后重建。 在此所示的数据显示T和B细胞重建的显著增加，且没有GVHD的恶化 和GVT活性的缺失(见例如实施例19)。
HSCT治疗的另一个限制是缺乏治疗所有潜在侯选者的供者。尽管脐 带血(UCB)已经被利用到相当受限的程度，但是每个供者都只有很少的 细胞，因此这主要已经被用于儿童，其中所需的HSC的总数较少(所需 的HSC的数目与患者体重相关)。除了UCB，供者的供应量有限并且必 须是可接受的MHC匹配的，否则GVH的危险就高。如果只需要较少的 细胞，由于提高的植入或需要较不严格的匹配，因此就减少了排斥或GVH 的危险，HSCT可能可以被使用地更为广泛例如用于治疗自身免疫性疾 病，以及可以利用例如脐血的供源(例如，1.5×107细胞/kg用于植入受者)。
T细胞
T细胞是免疫系统的主要成分，它在胸腺中生成。最重要的T细胞 是Th细胞，因为它们事实上是启动所有免疫应答的细胞。这些Th细胞 的缺失(例如HIV感染、化疗、照射等所引起的)直接造成了免疫抑制 以及对感染和肿瘤的必然的易感性，并且快速地发生死亡。Th细胞亚组 的一个重要作用是调节免疫应答。对T和B细胞功能的增强和抑制之间 的平衡对例如疫苗是否有效、癌症或肿瘤是否被攻击或移植是否被耐受 或排斥都有重要作用。
胸腺在年轻时是非常有效的，随着年龄逐渐出现大小和功能输出上 的退化。这在青春期开始时特别突出。因为胸腺输出与胸腺的细胞密度 (cellularity)直接相关(Scollay et al.，(1980)Eur.J.Immunol.10：210； Berzinset al.，(1998)J.Exp.Med.187：1839)，年龄相关的胸腺萎缩造成了 新近胸腺迁出(RTEs)的逐步减少(Steffens et al.，(2000)Clin.Immunol. 97：95；Sempowski et al.，(2002)Mol.Inzmunol.38：841-848；Sutherland et al.， (submitted))和原初对记忆T细胞比值的减低(Ernst et al.，(1990) J.Inarnunol.145：1295)；Kurashima et al.，(1995)Int.hrznmunol.7：97； Utsuyamaet al.，(1992)Mech.Ageing Dev.63：57)，这造成了有限的CD4+ 和CD8+T细胞两者的TCR库(Mosley et al.，(1998)Cell.Immunol.189： 10；LeMaoult et al.，(2000)J.Immunol.165：2367)。所以，应答于非特异 的和受体介导的(CD3/TCR)刺激的T细胞增殖随着年龄是严重不足的 (Hertogh-Huijbregts et al.，(1990)Mech.Ageing Dev.53：141-155；Flurkey et al.，(1992)J.Gerontol.47：B115；Kirschmann et al.，(1992)Cell. Immunol.139：426)。
随着年龄的增加，人类的免疫功能逐步退化；儿童的应答非常好， 较年轻的成人应答适当，但是中年以上的成人的这种应答可能会非常差。 这种退化表明了在所有应答中实际所参与的三种主要细胞类型的一或多 种细胞类型的缺失或改变的存在：(i)抗原呈递细胞(它们捕获抗原并将 其呈递，并据此激活T淋巴细胞)；(ii)T淋巴细胞；和(iii)B淋巴细胞。 这三种细胞类型的任何一种细胞类型的缺失或改变都可以解释为什么对 抗原刺激的免疫应答可能是不满意的。缺失或改变可以是在细胞水平的 或可以指的是数量或功能性的。其中，最可能的缺失是包含于T细胞群 内，因为性类固醇的影响所造成的胸腺功能随年龄的显著退化。这导致 了输出到血流中的新的或“原初”T细胞的缺失，而这是对新抗原的应答 所必需的。除了潜在的应答T细胞数目缺失以外，性类固醇的存在可能 将已有T细胞抑制到了一定的程度。
癌症治疗
如上所述，用于治疗癌症的化疗和放疗对于患者的非癌细胞经常是 有害的，特别是对血细胞。增加这些治疗的频率和剂量的主要限制是患 者在治疗中幸存的能力并避免低下的免疫系统所造成的对机会性感染的 易感性的能力。因此，如果免疫恢复能更快或损伤较轻，这对患者将极 为有利。
免疫系统的主要功能是区分“外来的”(即来源于身体以外的任何来源) 抗原和“自身的”(即来源于身体内)抗原，并据此应答以保护身体抵抗感 染。更为实用的说法是，免疫应答也已经被描述为对危险信号的应答。 这些危险信号可以是细胞或组织性能的任何变化，它们提醒免疫系统的 细胞这个有问题的细胞不再是“正常的”。这样的提醒在引起例如对外来 因素如病毒、细菌、寄生虫和真菌感染的排斥上是非常重要的，它们也 可被用于诱导抗肿瘤应答。但是，这样的危险信号也可以是启动自身免 疫性疾病的原因，因为自身细胞内的任一不适当的细胞改变都使得自身 细胞成为免疫系统所靶向的细胞(例如糖尿病中的胰腺的β胰岛细胞)。或 者，对免疫细胞本身的不适当的刺激除了诱导的初始应答的外来细胞或 微生物之外，也能导致对正常的自身细胞的损害。
在正常的免疫应答中，事件的顺序包括专职的抗原呈递细胞(APC) 捕获抗原并将它们处理成小的肽片段，这些肽片段位于APC表面的主要 组织相容性复合物(MHC)分子的裂隙(cleft)内。MHC分子可以是在 所有有核细胞上所表达的I型(被细胞毒T细胞(Tc或CTL)所识别)或 是主要在免疫系统的细胞上所表达的II型(辅助T细胞(Th)所识别)。 细胞识别APC上的MHC II/肽复合物并应答。然后这些细胞所释放的因 子促进了特异于特殊抗原的Tc细胞或产抗体的B细胞之一或两者的活 化。事实上，HIV/AIDS最好地说明了Th细胞在所有免疫应答中的重要 性，因为经病毒破坏所引起的Th细胞的缺乏造成了严重的免疫缺陷，最 终导致机会性感染而死亡。Th(以及在较低的程度上，Tc)的不适当的发 育也能导致各种不同的病变例如过敏、癌症和自身免疫。
这些细胞的不适当发育可以是因为异常的胸腺，其中胸腺的结构组 成被明显地改变了，例如在许多自身免疫性疾病中，成熟胸腺细胞发育 所需的髓质上皮细胞被异位表达于不成熟T细胞所正常位于的皮质中。 这可能意味着发育中的不成熟T细胞过早地接受了晚期的成熟信号并因 此变得对阴性选择信号不敏感，阴性选择信号正常地将去除潜在的自身 反应性细胞。在发生狼疮样症状的NZB小鼠中(Takeoka et al.，(1999)Clin. Immunol.90：388)以及更为最近的在发生I型糖尿病的NOD小鼠中 (Thomas-Vaslin et al.，(1997)P.N.A.S.USA 94：4598；Atlan-Gepner et al.， (1999)Autoimmunity 3：249-260)的确都发现了这种类型的胸腺异常。还 不知道这些形式的胸腺异常是怎样或何时发生的，但是它们的发生可以 通过自然的衰老过程或是因为破坏性因素例如病毒感染(在AIDS患者 中已经描述了胸腺的变化)、应激、化疗和放射治疗(Mackall et al.，(1995) N.Eng.J.Med.332：143；Heitger et al.，(1997)Blood 99：4053；Mackall and Gress，(1997)Immunol.Rev.160：91)。出生时即存在缺陷也是有可能的。
T和B淋巴细胞的细胞膜受体具有识别抗原的能力。这些受体是通 过一系列复杂的多种可能基因的重排随机生成的，这样每个个体的T或 B细胞都具有唯一的抗原受体。这种巨大的潜在的多样性意味着对于任 何一种机体可能会遇到的单一抗原，多个淋巴细胞能以不同程度的结合 强度(亲和力)将其识别并引发不同程度的应答。既然抗原受体的特异性 是随机出现的，那么所出现的问题是为什么机体不会通过抗自身抗原的 淋巴细胞而发生自身破坏。幸运的是，有一些机制预防T和B细胞进行 这样的自身破坏。总的来说，这些机制产生了一种免疫系统对自身耐受 的状态。
自身耐受的最有效形式是在产生潜在的反应性淋巴细胞的部位中将 它们全部都物理地去除或杀死。这些部位包括产生T细胞的胸腺和产生 B细胞的BM。这被叫做中枢耐受(central tolerance)。一种重要的、附加 的耐受方法是通过调节Th细胞，它或直接地或通过产生细胞因子抑制自 身反应性细胞。假定所有的免疫应答事实上都需要T辅助细胞的启动和 调节，任何耐受诱导方案的一个主要目标就是靶向于这些T辅助细胞。 相似地，既然Tc细胞是非常重要的效应细胞，那么它们的产物就是例如 抗癌症和抗病毒治疗策略的一个主要目标。另外，T调节细胞(Treg)例 如CD4+CD25+和NKT细胞提供了一种工具，因为它们能抑制潜在的自 身反应性细胞。
胸腺
胸腺主要包括分散在不同间质细胞(主要是上皮细胞亚组)内的发 育中的胸腺细胞(胸腺内的T淋巴细胞)，这些间质细胞构成微环境并提 供T细胞的最优化发育所必需的生长因子(GF)和细胞相互作用。
胸腺是免疫系统中的一个重要器官，因为它是产生T淋巴细胞的主 要部位。胸腺的作用是如下所述的从血液中吸引到合适的BM来源的前 体细胞(precursor cells)，并诱导它们定型为T细胞系，包括产生针对抗 原的T细胞受体(TCR)所必需的基因重排。每个T细胞都具有单一的 TCR类型并在其特异性上是唯一的。与这种TCR生成相关的是细胞分裂， 它扩增了具有TCR类型的T细胞数目并因此增加了每种外来抗原都将被 识别和清除的可能性。但是，与B细胞不同，T细胞识别抗原的唯一特 点是TCR只识别与MHC分子物理相连的肽片段。正常地，这是自身 MHC，并且在胸腺中选择识别自身MHC/肽复合物的能力或TCR。这个 过程被称为正向选择并是一种皮质上皮细胞的排他性特征。如果TCR不 能与自身MHC/肽复合物结合，T细胞将死于“忽略”，因为T细胞为了它 的持续存活和成熟需要一定程度的经TCR的信号转导。
既然TCR基因重排的结果是一个随机事件，那么一些T细胞将偶然 地发育为能以高亲和力识别自身MHC/肽复合物的T细胞。因此，这些T 细胞是潜在的自身反应性的，并涉及自身免疫性疾病，例如多发性硬化 (MS)、类风湿关节炎(RA)、糖尿病、甲状腺炎和系统性红斑狼疮(SLE)。 幸运的是，如果TCR与自身MHC/肽复合物的亲和力太高并且T细胞在 胸腺中遇到了这种特异性复合物，那么发育中的胸腺细胞被诱导为进行 自杀性活化并死于凋亡，这个过程被叫做负选择。这个过程也被叫做中 枢耐受。这些“对自身具有高亲和力”的T细胞死亡而不是应答，是因为 在胸腺中它们仍是不成熟的。胸腺中这种负选择的最有力的诱导物是被 叫做树突状细胞(DC)的APC。DC将最强烈的信号传递给T细胞，造 成了胸腺内的去除。但是，在外周淋巴器官中，T细胞是更成熟的，给相 同的TCR呈递相同的MHC/肽复合物的DC将引起具有TCR的T细胞的 活化。
胸腺萎缩和衰老
虽然胸腺对于功能性免疫系统是重要的，它每天释放约它的T细胞 含量的1％到血流中，但是哺乳动物和其他动物的中一个明显异常是性类 固醇(sex steroid)产生所造成的这个器官的严重萎缩。这种萎缩在约5-7 年时间内逐步发生，在20岁左右达到最低水平的T细胞输出(Douek et al.， Nature(1998)396：690-695)，这种萎缩与在对糖皮质激素的应激应答期间 所诱导的可逆性萎缩不同。在结构上，胸腺萎缩包括淋巴细胞含量的进 行性缺失、皮质上皮网络的塌陷、细胞外基质材料的增加以及脂肪细胞 (脂细胞)和脂类沉积物对腺体的浸润(Haynes et al.，(1999)J.Clin.Invest. 103：453)。这个过程可以开始于年幼的儿童(例如年龄5岁左右，Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332：143)，但是它在性类固醇水平达到最高峰 的青春期时是最明显的。
在外周可反映出胸腺萎缩的影响，它减少了胸腺对T细胞池的输出， 这造成了较少变化的TCR库(因为只有新的原初T细胞才能提供)。也观 察到了改变了的细胞因子值(Hobbs et al.，(1993)J.Immunol.150：3602； Kurashimaet al.，(1995)Int.Immunol.7：97)、CD4+和CD8+亚组的变化、 向与原初T细胞相反的记忆T细胞的偏倚(Mackall et al.，(1995)N.Engl.J. Med.332：143)、以及对抗原或促有丝分裂刺激的应答能力的下降。
既然胸腺是外周T细胞池的生成和维持的主要部位，这种萎缩已经 被广泛地认定为是老年人的基于免疫的疾病的发病率增加的主要原因。 特别地，病变例如普遍的免疫缺陷、对机会性感染和疫苗的弱应答性以 及自身免疫性疾病频率的增加，如多发性硬化、类风湿关节炎和狼疮 (Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95：131-142；Wey and et al.，(1998) Mech.Age.Dev.102：131-147；Castle，(2000)Clin Infect Dis 31(2)：578-585； Murasko et al.，(2002)Exp.Gerontol.37：427-439)都随着年龄增加了它们 的发病率和严重性。经常通过T细胞依赖性免疫功能(例如溶细胞性T 细胞活性和促有丝分裂的应答)的减低来说明这些免疫系统的缺陷。虽然 稳态机制保持了健康个体的T细胞数目，当例如在AIDS和化疗或放射 治疗后有着T细胞的大量丧失时，成人患者高度易感于机会性感染，因 为所有的这些病变都包括T细胞和/或其他血细胞(见下)的缺失。淋巴 细胞的恢复也是严重滞后的。萎缩的胸腺不能重建在HIV感染期间所缺 失的CD4+T细胞(Douek et al.Nature(1998)396：690-695)，以及与青春 期前患者比较，化疗之后的CD4+T细胞在青春期后患者中要花3到4 倍更长的时间才能恢复到正常水平(Mackall et al.(1995)N.Engl.J.Med. 332：143-149)。因此，这些患者缺少应答感染所必需的细胞，他们出现严 重的免疫抑制(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332：143；Heitger et al.，(2002)Blood 99：4053)。在生命的后期也有癌症和肿瘤负荷的增加 (Hirokawa，(1998)″Immunity and Ageing，″in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd；Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95：131；Castle，(2000)Clin. Infect.Dis.31：578)。
但是，Douek等最近的工作((1998)Nature 396：690)已经表明在老 年人(例如甚至65岁以上以及老年HIV患者的抗逆转录病毒治疗之后) 中仍有胸腺输出的发生，尽管只有非常少量的输出(约为青年人水平的 5％)。具有T细胞受体删除环(T Cell Receptor Excision Circles，TREC； TREC是作为针对抗原的TCR的产生过程的一部分而形成的，并且只发 现于新产生的T细胞上)的T细胞的存在举例说明了这一点。此外，Timm 和Thoman((1999)J.Immunol.162：711)已经显示尽管老龄小鼠在骨髓移 植(BMT)后再生了CD4+T细胞，但是因为衰老的外周微环境，这些T 细胞显示出了向记忆细胞的偏倚并伴有弱的胸腺原初T细胞的产生。也 已经分析了造血干细胞移植后的TREC水平(Douek et al.，(2000)Lancet 355：1875)。
胸腺和神经内分泌轴
胸腺很大程度上受其与神经内分泌系统的双向交流的影响(Kendall， (1988)″Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D.Kendall，and M. A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27)。特别重要的是垂体、 肾上腺和性腺之间对胸腺功能的相互作用，包括营养作用(trophic effects) (促甲状腺激素或TSH和生长激素或GH)和萎缩作用(atrophic effects)(促 黄体生成激素或LH、促卵泡生成激素或FSH、和促肾上腺皮质激素或 ACTH)(Kendall，(1988)″Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D. Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27； Homo-Delarche et al.，(1993)Springer Sem.Immunopathol.14：221)。事实 上，胸腺生理的一个特征性特点是结构和功能的进行性退化，这与青春 期时的循环的性类固醇产生的增加是相当的，这在人类通常是从年龄 12-14岁之前逐步发生的(Hirokawa and Makinodan，(1975)J.Immunol. 114：1659；Tosi et al.，(1982)Clin.Exp.Immunol.47：497；and Hirokawa，et al.，(1994)Immunol.Lett.40：269)。
胸腺主要包括分散于不同间质细胞(主要为上皮细胞亚组)内的发 育中的胸腺细胞，这些间质细胞构成了微环境并提供了T细胞的最优化 发育所必需的生长因子和细胞相互作用。已经确定出激素的精确靶点以 及它们诱导胸腺萎缩和提高免疫应答的机制。然而，对睾丸女性化突变 小鼠的检查表明必须在胸腺的间质细胞上表达有功能性的性类固醇受体 时才会发生萎缩。胸腺细胞与控制它们的分化和成熟的上皮细胞亚组之 间的共发育关系(Boyd et al.，(1993)Immunol.Today 14：445)意味着性类 固醇抑制能发生在任一种细胞类型的水平，然后这将影响其他细胞类型 的状态。在老年患者中，骨髓干细胞的数目被减少并且在质量上是不同 的。HSC能重新入巢胸腺，尽管是以比年轻患者更低的程度。因此，影 响胸腺萎缩的主要因素似乎是胸腺内因素。此外，老龄动物中的胸腺细 胞(例如＞18个月的动物)至少保留有一定程度的分化能力(George and Ritter，(1996)Immunol.Today 17：267；Hirokawa et al.，(1994)Immunology Letters 40：269；Mackallet al.，(1998)Eur.J.Ilnmunol.28：1886)。然而， Aspinall最近的工作已经显示在年老小鼠中，有着胸腺细胞生成的缺陷， 它表现为三阴性前体细胞群内的阻断，即CD44+CD25+(TN2)期 (Aspinall et al.，(1997)J.Immunol.158：3037)。
在AIDS的特殊情况中，免疫系统的主要缺陷是CD4+细胞的破坏以 及巨噬细胞和树突状细胞(DC)的髓系细胞的较小程度的破坏。没有这些 细胞的免疫系统是麻痹的，患者极易感于机会性感染，死亡是常见的结 果。对AIDS的现有治疗是依据多种抗病毒药物杀死或清除HIV病毒。 这些治疗现在变得越来越有效，它们将病毒负荷显著地降低到患者可被 认为是处于缓解的点。然而，免疫缺陷的主要问题仍存在，因为仍只有 非常少的功能性T细胞，它们的确在恢复但恢复得很慢。因此，免疫缺 陷的时间段仍是非常长的，在某些病例中，免疫防御机制可能从来就没 有有效地恢复过。
造血作用
骨髓和造血干细胞
免疫系统的主要细胞是B和T淋巴细胞(一种白细胞的主要类型)， 以及抗原呈递细胞(APC)。所有的免疫细胞都基本上来源于造血干细胞 和它们的子代(普通淋巴祖细胞(CLP)和普通髓系祖细胞(CMP)，两者 都是在BM中生成的)。一些前体细胞移居到胸腺并转化为T细胞和胸腺 DC。DC在诱导自身耐受上发挥着作用。
只有很少比例(在年轻动物中为近0.01％)的HSC从BM中被释放 出来并经血液供应找到到达胸腺的途径，在这里它们进行分裂和成熟以 形成T细胞，然后返回到体循环中。这些新的新近胸腺迁出(RTE)细胞 形成了免疫系统的大部分，以及它们主要是Th和Tc细胞并且在保持新 的具有不同的TCR库的T细胞的恒量供应以启动几乎所有的免疫应答上 是重要的。在离开胸腺之前，Th和Tc细胞能有效地区分外来抗原，原因 如上所述。T细胞在胸腺中被“选择”，使得留下那些将机体内的所有细胞 识别为自身的并在正常情况下不会应答对抗自身细胞的T细胞。
B细胞最终也来源于HSC，并在离开BM进入外周免疫系统之前在 BM内发育。在与T细胞及免疫系统的其它细胞相互作用之后，B细胞发 育成产生并释放大量抗体的浆细胞，这些抗体有助于机体消灭感染性有 机体和异常细胞。
BM所产的其它HSC也被用于生成所有的其它血细胞例如NK细胞、 调控细胞、普通髓系祖细胞来源的细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和 嗜酸性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血细胞和红细胞。
造血干细胞移植
通常也被称为骨髓移植(BMT)的造血干细胞移植(HSCT)是一种 用于增强例如某些严重的癌症病变中的免疫系统的恢复的治疗。可以互 换使用“HSCT”和“BMT”和“移植”，它们在此被定义为移植到受者内分移 植物，其含有或富集了HSC、BM细胞、干细胞和/或任何其他的能生成 血液、胸腺、BM和/或任何其他的免疫细胞的细胞，包括但不限于HSC、 上皮细胞、普通淋巴祖细胞(CLP)、普通髓淋巴祖细胞(CMLP)、多系 祖细胞(MLP)和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，移植可以 是外周血干细胞移植(PBSCT)。可以动员出BM的HSC，然后从血液中 收集，或HSC是包含于从供者物理地提取出的BM内。HSC可以被纯化、 浓缩，或只是所收集的BM或血液的一部分，然后HSC被注射到受者内。 移植可以是异基因的、自体的、同基因的或异种的，以及可以包括任何 数目的细胞的移植，包括“小移植(mini-transplants)”，它只包括较少数目 的细胞。在一些实施方式中，在性类固醇抑制之前、与之同时或之后进 行HSCT。
HSC是非限制性的可示范的细胞类型，它可以被移植和/或被遗传学 修饰，如在本申请书全文中所用的。然而，本领域人员在实践在此所提 供的发明时很容易明白，不需要过多的试验，HSC就可以被许多替代细 胞类型中的任何一种(或多种)细胞类型所替代，这些细胞包括，但不限 于BM细胞、干细胞和/或其他任何的能生成血液、胸腺、BM和/或任何 其他的免疫细胞的细胞，这些细胞包括但不限于HSC、上皮干细胞、CLP、 CMLP、MLP和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，HSC来源于 胎肝和/或胎脾。
化疗和放射治疗都能消灭癌细胞。但是，因为缺乏特异性，这些治 疗也杀死了健康细胞，实际上包括所有的白细胞(WBC)以及BM中的 HSC。就是因为这种对WBC和HSC的破坏导致了患者对HSCT的需求。 HSCT容许例如健康干细胞替代被例如化疗或放射治疗所损伤的干细胞 和它们的子代细胞，健康干细胞最终可以生成患者所需的血细胞。
HSCT是多种血液肿瘤例如白血病和淋巴瘤(血液和免疫系统细胞 的癌症)以及非恶性免疫疾病例如严重的联合免疫缺陷、Fanconi贫血、 骨髓异常增生综合征、淀粉样变、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan 贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、Kostmann综合征、Wiskott-Aldrich 综合征、血小板减少症和血红蛋白病如镰状细胞病和地中海贫血的基本 治疗。通常用骨髓清除或骨髓耗竭治疗白血病和淋巴瘤以清除癌细胞体， 常常紧接着的是HSCT以恢复免疫功能。本发明的方法单独或联合(同 时或依次)施与HSC动员剂例如细胞因子(如G-CSF或GM-CSF)或药 物，容许更快的和更好的植入，也可以容许给予更大剂量和/或更频繁的 化疗和放射治疗。
现代临床医学操作经常采用来源于另一个供者血液的HSC的移植 (异基因HSCT)，其所具有的优点是供者T细胞抗宿主癌细胞的作用(移 植物抗白血病(GVL))，但是这个优点通常被其他的T供者T细胞抗宿主 的作用(移植物抗宿主(GVH)病)所制约，后者可以是致命的。既然 HSCT的成功以及据此的患者的生存率与所注射的HSC的数目及植入的 时间都直接相关，使用本发明的方法意味着现有的HSCT方案将会更为 成功以及将有比现有可能的更多的患者能接受HSCT。
增强从骨髓中动员出HSC的机制对于保证从供者中收集到尽可能多 的HSC是重要的。GM-CSF和G-CSF目前已经被用于这个目的。但是其 他的药物例如化疗和细胞因子也已经显示出是有效的。更有效地动员 HSC的能力具有超出血液学修复的应用。最近研究已经显示出HSC是多 能的并且可以被用于受损组织的修复，例如心肌、骨骼肌、肝脏、骨骼、 结缔组织、上皮组织、胰腺和血管系统。
现有HSCT策略的一个限制是与长时间免疫缺陷所造成的感染相关， 特别是病毒、真菌和有荚膜细菌的感染，并且这仍是成人移植后发病率 和死亡率的重要原因。与HSCT相关的感染通常是非常难以控制的，甚 至用现代的抗微生物药物。儿童通常在HSCT后数月内恢复免疫能力 (Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.157：73)，这与成人受者的淋巴细胞 恢复的延迟有着不同，这种延迟可以持续数年并且甚至可以是年轻最适 度(young optimum)的非常差的反映。成人的这种延迟依赖于多种因素， 但是对感染的易感性主要是因为公认的T和B细胞产生随年龄的退化 (Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.157：73)。
另外，移植物植入的速度也发挥着作用，其中移植物植入的速度越 慢，机会性感染发生的可能性就越大。
当所移植的细胞“排斥”供者细胞时，出现了现有HSCT的第二个 限制。这在临床上被称作为“移植物抗宿主病”(GVHD)。自体移植可以 避免GVHD。但是，与异基因移植比较，自体移植的总抗癌成功率更低。 在癌症患者中，自体移植具有的缺点是它们不能产生移植物抗肿瘤 (GVT)作用(这与GVH作用相似)，以及具有癌细胞可能随移植回输回 到患者中的危险。已经发现在小鼠异基因HSCT模型中的性类固醇抑制 和异基因HSCT的阉割受者都提高了髓系和淋巴两系细胞的移植后重建。 在此所示的数据显示T和B细胞重建的显著增加，且没有GVHD的恶化 和GVT活性的缺失(见例如实施例19)。
HSCT治疗的另一个限制是缺乏治疗所有潜在侯选者的供者。尽管脐 带血(UCB)已经被利用到相当受限的程度，但是每个供者都只有很少的 细胞，因此这主要已经被用于儿童，其中所需的HSC的总数较少(所需 的HSC的数目与患者体重相关)。除了UCB，供者的供应量有限并且必 须是可接受的MHC匹配的，否则GVH的危险就高。如果只需要较少的 细胞，由于提高的植入或需要较不严格的匹配，因此就减少了排斥或GVH 的危险，HSCT可能可以被使用地更为广泛例如用于治疗自身免疫性疾 病，以及可以利用例如脐血的供源(例如，1.5×107细胞/kg用于植入受者)。
T细胞
T细胞是免疫系统的主要成分，它在胸腺中生成。最重要的T细胞 是Th细胞，因为它们事实上是启动所有免疫应答的细胞。这些Th细胞 的缺失(例如HIV感染、化疗、照射等所引起的)直接造成了免疫抑制 以及对感染和肿瘤的必然的易感性，并且快速地发生死亡。Th细胞亚组 的一个重要作用是调节免疫应答。对T和B细胞功能的增强和抑制之间 的平衡对例如疫苗是否有效、癌症或肿瘤是否被攻击或移植是否被耐受 或排斥都有重要作用。
胸腺在年轻时是非常有效的，随着年龄逐渐出现大小和功能输出上 的退化。这在青春期开始时特别突出。因为胸腺输出与胸腺的细胞密度 (cellularity)直接相关(Scollay et al.，(1980)Eur.J.Immunol.10：210； Berzinset al.，(1998)J.Exp.Med.187：1839)，年龄相关的胸腺萎缩造成了 新近胸腺迁出(RTEs)的逐步减少(Steffens et al.，(2000)Clin.Immunol. 97：95；Sempowski et al.，(2002)Mol.Inzmunol.38：841-848；Sutherland et al.， (submitted))和原初对记忆T细胞比值的减低(Ernst et al.，(1990) J.Inarnunol.145：1295)；Kurashima et al.，(1995)Int.hrznmunol.7：97； Utsuyamaet al.，(1992)Mech.Ageing Dev.63：57)，这造成了有限的CD4+ 和CD8+T细胞两者的TCR库(Mosley et al.，(1998)Cell.Immunol.189： 10；LeMaoult et al.，(2000)J.Immunol.165：2367)。所以，应答于非特异 的和受体介导的(CD3/TCR)刺激的T细胞增殖随着年龄是严重不足的 (Hertogh-Huijbregts et al.，(1990)Mech.Ageing Dev.53：141-155；Flurkey et al.，(1992)J.Gerontol.47：B115；Kirschmann et al.，(1992)Cell. Immunol.139：426)。
随着年龄的增加，人类的免疫功能逐步退化；儿童的应答非常好， 较年轻的成人应答适当，但是中年以上的成人的这种应答可能会非常差。 这种退化表明了在所有应答中实际所参与的三种主要细胞类型的一或多 种细胞类型的缺失或改变的存在：(i)抗原呈递细胞(它们捕获抗原并将 其呈递，并据此激活T淋巴细胞)；(ii)T淋巴细胞；和(iii)B淋巴细胞。 这三种细胞类型的任何一种细胞类型的缺失或改变都可以解释为什么对 抗原刺激的免疫应答可能是不满意的。缺失或改变可以是在细胞水平的 或可以指的是数量或功能性的。其中，最可能的缺失是包含于T细胞群 内，因为性类固醇的影响所造成的胸腺功能随年龄的显著退化。这导致 了输出到血流中的新的或“原初”T细胞的缺失，而这是对新抗原的应答 所必需的。除了潜在的应答T细胞数目缺失以外，性类固醇的存在可能 将已有T细胞抑制到了一定的程度。
癌症治疗
如上所述，用于治疗癌症的化疗和放疗对于患者的非癌细胞经常是 有害的，特别是对血细胞。增加这些治疗的频率和剂量的主要限制是患 者在治疗中幸存的能力并避免低下的免疫系统所造成的对机会性感染的 易感性的能力。因此，如果免疫恢复能更快或损伤较轻，这对患者将极 为有利。
发明内容
本发明涉及通过增强BM造血作用和功能性、增强HSCT后的BM 植入、和经阻断性类固醇及其他激素的信号途径增加已有T细胞和其他 免疫细胞的功能性，用于预防疾病或有助于患者康复的方法。通过增加 经新生的胸腺功能所生成的原初T细胞、以及经活化的BM功能所生成 的B淋巴细胞和免疫系统的其他细胞的水平也将增强免疫能力。
已经发现对性类固醇和/或其他激素的信号途径的中断通过直接作用 或通过间接作用增强了BM、HSC、T细胞和免疫系统的其他细胞的功能 性。这个发现已经被开发形成了本发明，在本发明的一个方面提供了增 强BM造血作用和/或功能性的方法。在一些实施方式中，提高了已有的 BM造血作用和/或功能性。在另一个实施方式中，患者接受HSCT，并 提高了患者的HSC造血作用和/或植入。
在一个方面，本发明提供了增强HSCT后的植入的方法。在一个实 施方式中，增强了BM的植入。在另一个实施方式中，增强了胸腺的植 入和/或重建，据此最终诱导了胸腺恢复。仍在另一个实施方式中，增强 了脾和/或其他淋巴器官、组织、和/或血液的植入和/或重建。在一些实施 方式中，HSC是异基因的，以及在其他的实施方式中，HSC是自体的。 在一个实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径(sex steroid signaling)中断的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了T细胞前 体的数目。在其他的实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径中断 的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了总白细胞、供者来源的 DC、BM前体细胞、HSC、CLP、MLP、淋巴细胞、髓细胞、粒细胞、 中性粒细胞、巨噬细胞、NK、NKT、血小板、原初T细胞、记忆T细胞、 辅助T细胞、效应T细胞、调控T细胞、RBC、B细胞、供者和/或宿主 来源的外周T细胞、APC和/或供者来源的外周B细胞的数目。仍在其他 的实施方式中，患者在HSCT之后也接受了细胞因子(例如IL-7、SCF、 IL-11、G-CSF、或GM-CSF)或激素(例如生长激素、或它的介导物胰岛 素依赖性生长因子(IGF-1)或成纤维细胞生长因子家族的任一成员例如 FGF7/角化细胞生长因子)治疗以增强免疫恢复和/或植入。在另一个实施 方式中，本发明单独或联合施与促造血药物例如生长因子(例如，G-CSF 或GM-CSF)，这容许更快的和/或更好的植入和/或入巢到靶组织中和/或 增强免疫细胞的恢复。
在本发明的第二个方面，提供了增强HSCT后的患者的免疫细胞的 功能性的方法。在一个实施方式中，免疫细胞是T细胞。在另一个实施 方式中，提高了T细胞对T细胞受体(TCR)刺激的增殖应答性。在另一 个实施方式中，提高了T细胞对抗原(例如，破伤风毒素(TT)或美洲商 陆促有丝分裂剂(PWM))刺激的应答性。在一个实施方式中，提高了T 细胞对回忆(recall)抗原的应答性(即提高的T细胞记忆应答)。仍在另 一个实施方式中，提高了T细胞与共刺激或第二信号途径相关的增殖应 答性。在一些实施方式中，提高了T细胞应答性的动力学。在其他实施 方式中，提高了T细胞对APC所呈递的抗原的应答。在本发明的一些实 施方式中，在移植后约5、4、3或2个月内提高了免疫细胞应答性。在 本发明的特定的实施方式中，在移植后约1个月内提高了免疫细胞应答 性。在本发明的其他实施方式中，在移植后2周内提高了免疫细胞应答 性。在本发明的另一个实施方式中，在移植后1周内提高了免疫细胞应 答性。仍在本发明的其他实施方式中，在移植后3天内提高了免疫细胞 应答性。在其他实施方式中，在治疗后3个月或3个月以上提高了免疫 应答，包括除了输出已有T细胞外还输出新的胸腺来源的T细胞。
在第三个方面，本发明提供了增强已有的免疫细胞功能性的方法， 已有的免疫细胞包括但不限于外周的免疫细胞。在一个实施方式中，细 胞是T细胞。在另一个实施方式中，细胞是DC或其他的APC。仍在另 一个实施方式中，细胞是NK细胞或调控细胞，例如CD4+CD25+T细胞 和自然杀伤T(NKT)细胞。在本发明的一个实施方式中，提高了患者的 T细胞对TCR刺激的增殖应答性。在另一个实施方式中，提高了T细胞 对抗原(例如TT、PWM或KLH)刺激的应答性。仍在另一个实施方式 中，提高了T细胞对共刺激或第二信号途径的增殖应答性。在其他的实 施方式中，提高了T细胞对APC所呈递抗原的应答性。在一个特殊的实 施方式中，LHRH/GnRH类似物对已有的免疫细胞的应答性有着直接作用 或间接作用。在一些实施方式中，本发明的方法使用性类固醇类似物(它 的激动剂和拮抗剂)，例如GnRH/LHRH类似物，以阻断免疫细胞或骨髓 的性类固醇介导的信号途径。在其他的实施方式中，类固醇类似物直接 刺激(即直接增加它的功能活性)胸腺、BM、和/或已有的免疫系统的细 胞例如T细胞、B细胞、和DC。
在第四个方面，本发明提供了增强患者中HSC植入和动员、或血液、 HSC或BM供者的HSC动员的方法。在一个实施方式中，阻断性类固醇 信号途径增加了外周的免疫前体细胞例如HSC、CD34+细胞、CLP、或 CMP的数目和功能性。一个实施方式提供了一种用于增强HSC动员的方 法，包括阻断性类固醇信号途径，其或单独地进行或联合施与HSC动员 剂，例如细胞因子、GM-CSF、G-CSF、CSF、化疗剂、环磷酰胺、flt-3 配体、KGF/FGF7或FGF家族的其他成员或IL-7。
在一个实施方式中，本发明提供了容许给予更高剂量和/或更频繁的 化疗及放射治疗和/或容许免疫系统在化疗及放射治疗后更快恢复或受到 更少损伤的方法。
在第五个方面，本发明提供了预防或治疗患者的病变的方法。一个 具体实施方案提供了一种用于预防或减少患者感染、病变或疾病的危险 的方法，该方法包括阻断患者的性类固醇介导的信号途径。在一个特定 的具体实施方案中，阻断了向BM的信号途径。在另一个具体实施方案 中，阻断了向胸腺的信号途径。仍在另一个具体实施方案中，阻断了向 脾的信号途径。仍在另一个具体实施方案中，阻断了向外周免疫细胞的 信号途径。
在一些具体的实施方案中，本发明的方法被用于预防或治疗病毒感 染例如HIV、疱疹、流感、和肝炎。在其他的具体实施方案中，本发明 的方法被用于预防或治疗细菌感染例如肺炎和结核(TB)。仍在另一个具 体实施方案中，本发明的方法被用于预防或治疗真菌感染、寄生虫感染、 过敏、和/或肿瘤和其他癌症，无论是恶性或良性肿瘤。
在其他的具体实施方案中，患者接受了非遗传学修饰的HSC移植。 在一些具体实施方案中，BM或HSC被移植到患者中以提供前体细胞成 分，这些前体细胞最终可被用于新生胸腺的生长。这些HSC中的一些具 有转化为DC或其他APC的能力，它们可能具有给T细胞提供更好的抗 原呈递的作用并因此具有更好的免疫应答(例如增加了Ab产量和效应细 胞数目和/或功能)。在其他的实施方案中，老龄(青春期后)患者的萎缩胸 腺处于因HSCT时性类固醇信号途径被阻断而再活化(reactivation)的过 程中。再活化的胸腺变得能从血液中吸收HSC、BM细胞和其他合适的 前体细胞，并在胸腺内将它们转化为新的T细胞和DC。
在第六个方面，本发明提供了提高患者对疫苗的免疫应答性的方法。
在第七个方面，输送给患者利用遗传学修饰的HSC、淋巴祖细胞、 髓系祖细胞或上皮干细胞、或它们的组合(在此的组和每个成员都指的是 “GM细胞”)的基因治疗，以产生对治疗或预防病变有用的特殊免疫力。
在本发明的特定方面的一些实施方案中，病变是一种具有明确的遗 传基础的病变，例如遗传缺陷所造成的病变。本领域人员熟知这些遗传 病，它们包括自身免疫性疾病、特定蛋白的过多或过少生成所造成的疾 病、肿瘤和癌症等等。通过往HSC中插入正常的基因以及利用发明的方 法修复了引起疾病的遗传缺陷，然后从这种HSC所产生的每个细胞将都 携带有该基因的修正。
在其他实施方案中，疾病是一种选自由病毒感染(例如人类免疫缺陷 病毒(HIV))、T细胞功能性疾病、和直接或间接地数量性或功能性减少T 细胞或引起T细胞以对个体有害的方式作用的任何其他的疾病或病变所 组成的组的T细胞疾病。
仍在其他的实施方案中，本发明提供了通过移植已被遗传学修饰的 GM细胞以抵抗或预防病原体的感染、活性、复制等等和它们的组合，以 治疗或预防病原体例如HIV的感染的方法，可以在胸腺再活化之前、或 与之同时给患者注射病原体。在一个实施方案中，HSC被修饰以包括其 产物能干扰HIV感染、患者的T细胞(和其他的HSC来源的细胞)的功能、 和/或复制的基因。在一个具有的实施方案中，用病毒抗性基因例如 RevM10基因(见，例如Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)或CXCR4 或PolyTAR基因(Strayer et al.，(2002)Mol.Alter.5：33)遗传学修饰HSC。 这就赋予了一定程度的对病毒的抗性，据此预防或治疗病毒所引起的疾 病。
在另一个方面，本发明提供了对性类固醇介导的对胸腺的信号途径 的阻断以及随后的胸腺的再活化(reactivation)。在一个实施方式中，用 阉割阻断性类固醇介导的信号途径。在一个特别的实施方式中，使用化 学阉割。在另一个实施方式中，使用手术阉割(例如通过去除睾丸或通过 卵巢切除术)。在一些实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的完全抑 制。在另一个实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的部分阻断。在 一个实施方式中，阉割将胸腺状态逆转到青春期前的状态，据此将其再 活化。在另一个实施方式中，阉割改变了其他分子的水平，它们通过， 例如对已有免疫细胞的直接作用，增强了免疫细胞应答性和/或增殖和/ 或活化状态。
在特定的实施方式中，通过施与性激素生成、作用、结合或信号途 径的调节物可以直接地或间接地阻断(例如，抑制、灭活或使得无效)性 类固醇介导的信号途径，这些调节物包括但不限于与性激素或它的受体 结合的药物、性激素的激动剂或拮抗剂，包括但不限于GnRH/LHRH、抗 雌激素剂和抗雄激素剂、SERM、SARM、抗雌激素抗体、抗雄激素配体、 抗雌激素配体、LHRH配体、被动的(抗体)或主动的(抗原)抗LHRH (或其他的性类固醇)接种、或它们(“阻断物”)的组合。在一个实施方 式中，使用一或多种阻断物。在一些实施方式中，通过肽持续释放制剂 施与一或多种阻断物。在WO 98/08533中提供了肽持续释放制剂的实例， 在此将其全部内容一同并入作为参考。
附图说明
图1A-B：阉割快速地再生了胸腺细胞密度。图1A-B是显示阉割之 前和之后的胸腺重量和胸腺细胞数目的变化的图解表述。如胸腺重量(图 1A)或每个胸腺的细胞数目(图1B)所测定的那样，胸腺萎缩造成了胸 腺细胞数目随年龄的显著减少。对于这些研究，年老的(即2岁大的)小 鼠被手术阉割。在年老的(1和2岁)及2-4周大的阉割后(post-cx)雄性 小鼠中分析胸腺重量与体重的相关性(图1A)和胸腺细胞密度(图1B)。 与年轻成体(2个月大)小鼠比较，看到胸腺重量和细胞密度随年老的显 著减低。阉割恢复了这种胸腺重量和细胞数目的减低，尽管在阉割后1 周仍有显著的细胞数目的减少(图1C)。在阉割后2周时，发现细胞数目 增加到近似在年轻成体小鼠中所能看到的水平(图1B)。在阉割后3周时， 细胞数目已经从年轻成体小鼠水平开始显著增加并在阉割后4周保持稳 定(图1B)。结果用每组4-8只小鼠(图1A)或每组8-12只小鼠(图1B) 的平均值±1SD表示。 **＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大) 的胸腺及阉割后2-6周的小鼠的胸腺比较。
图2A-D：阉割恢复了外周的CD4∶CD8 T细胞的比值。对于这些研 究，将年老(2岁大)小鼠手术阉割并在阉割后2-6周分析外周淋巴细胞 群。图2A和2B显示了脾内的总淋巴细胞数目。脾的淋巴细胞数目随年 龄和阉割后仍保持恒定，因为内环境稳态维持了脾内的总细胞数目(图 2A和2B)。但是，枯竭了年老的(18-24个月大)小鼠的淋巴结的细胞数 目(图2B)。阉割恢复了这种淋巴结细胞密度的减少。图3C显示脾或淋 巴结内的B细胞对T细胞的比值都没有随年龄或阉割后而变化，也没有 看到这个比值随年龄或阉割后的变化。但是，在(汇集的)淋巴结和脾内 都看到了CD4+∶CD8+T细胞比值随年龄的显著降低(p≤0.001)(图2E)。 在阉割后4-6周时，这种降低被恢复到年轻成体(即2个月大)的水平(图 2D)。
结果用每组4-8只小鼠(图2A、2C和2E)或8-10只小鼠(图2B、 2D和2F)的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01；***＝p≤0.001， 与年轻成体(2个月大)和阉割后小鼠比较。
图3：虽然有胸腺萎缩或阉割后的再生，但胸腺细胞亚群仍被保持于 相似的比例。对于这些研究，将年老(2岁大)小鼠阉割并根据标记物CD4 和CD8分析胸腺细胞亚组。显示了年轻成体(2个月大)、年老(2岁)和 年老的、阉割后动物(2岁，阉割后4周)的CD4-CD8-DN、CD4+CD8+DP、 CD4+CD8-和CD4-CD6+SP胸腺细胞群的CD4(X轴)对CD8(Y轴)的 代表性的荧光激活细胞分类器(FACS)值。在每个曲线的上方都给出了 每个象限的百分比。任何CD4/CD8所定义的亚组的比例随着年龄或阉割 后都没有看到任何的差异。因此，胸腺细胞亚群随着年龄仍为恒定，以 及胸腺细胞在阉割后的同步扩增。
图4A-B：阉割造成的胸腺细胞增殖的恢复。给小鼠注射一个脉冲量 (pulse)的BrdU并分析增殖的(BrdU+)胸腺细胞。对于这些研究，将年 老(2岁大)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确定 增殖的水平。显示了随年龄和阉割后的胸腺内的BrdU+细胞比例的代表 性直方图图形(图4A)。在胸腺内的总体增殖比例中没有观察到差异，这 个比例随着年龄和阉割后仍为恒定(图4A和图4B的左侧图形)。但是， 看到了BrdU+细胞数目随年龄的显著减少(图4B，右侧图形)。在阉割后 2周时，BrdU+细胞数目增加到了在年轻成体(即2个月大)中所能看到 的相似的数目(图4B，右侧图形)。结果用每组4-14只小鼠的平均值±1SD 表示。***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大)的对照小鼠和阉割后2-6 周的小鼠比较。
图5A-H：阉割增强了所有胸腺细胞亚组内的增殖。对于这些研究， 将年老(2岁)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确 定增殖的水平。根据胸腺内的CD4和CD8表达进行对胸腺细胞的不同亚 组内的增殖的分析。图5A显示BrdU+细胞群内的每种胸腺细胞亚组的比 例不随年龄或阉割后而变化。但是，如图5B中所示，看到DN(CD4-CD8-) 胸腺细胞增殖的比例随年龄的显著减低。图5C显示没有看到在TN亚组 内的BrdU+细胞(即增殖细胞)的总体比例随年龄或阉割后变化。但是看 到在TN1(CD44+C25-CD3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的显著减低 (图5E)以及TN2(CD44+CD25+C3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的 显著增加(图5F)。阉割后恢复了这种变化(图5D-F)。结果用每组4-17 只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显著的)；***＝p≤0.001 (非常显著的)，与年轻成体(2个月大)小鼠比较。＾＝显著不同于阉割后 2-6周的小鼠(图5-H)。
图6A-C：阉割增加了衰老胸腺的T细胞的输出。对于这些研究，将 年老的(2岁大的)小鼠阉割并胸腺内注射FITC以确定胸腺的输出率。 在24小时后计算外周的FITC+细胞的数目。如图6A所示，观察到在24 个小时时段内在外周所检测到的新近胸腺迁出(RTE)细胞数目随年龄 的显著减少。阉割后，在阉割后2周时，这些数值已经显著提高。如图 6B所示，迁出率(输出/总体胸腺细胞密度)随年龄仍保持恒定，但是在 阉割后2周时有着显著的减低。看到了CD4+对CD8+RTE比值随年龄的 显著增加，在阉割后1周时达到正常化(图6C)。
结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显 著的)；***＝p≤0.001(非常显著的)，图6A为与年轻成体(2个月大)小 鼠比较以及图6B和6C为与所有的其他组的比较。＾＝p≤0.05与年老的(1 岁和2岁大的)非阉割小鼠比较以及与阉割后1周的年老小鼠比较。
图7A-B：阉割增强了T细胞耗竭后的胸腺细胞再生。将3个月大的 小鼠或用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰胺)处 理(图7A)，或将其暴露于亚致死照射(625Rad)中(图7B)。对于两种 所研究的T细胞耗竭的模型，与它们的假阉割的(ShCx)对等实验对象 比较，阉割的(Cx)小鼠表示出胸腺再活化率的显著增加。对T细胞耗 竭(TCD)后1周和2周时的总胸腺细胞数目的分析显示阉割显著地增加 了用环磷酰胺或亚致死照射处理后的胸腺再活化率(分别为图7A和 7B)。数据用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。对于图7A，***＝p≤ 0.001，与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较；＾＝p≤0.001，与两个 阉割小鼠组比较。对于图7B，***＝p≤0.001，与对照小鼠比较；＾＝p≤0.001， 在照射后1周时与处理前1周阉割的小鼠比较以及在照射后2周时与两 个阉割小鼠组比较。
图8A-B：环磷酰胺处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。对于 这些研究，利用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰 胺)耗竭(3个月大)小鼠的淋巴细胞并在与最后一次环磷酰胺注射的同 一天将小鼠手术阉割或假阉割。分离胸腺、脾和淋巴结(汇集的)并评价 总体细胞密度。与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较，在处理后1 和4周时，假阉割的小鼠的脾内具有显著更少的细胞数目(图8A)。在处 理后1周时，两个处理组的淋巴结内都观察到了细胞数目的显著减少(图 8B)。在处理后2周时，Cx小鼠比ShCx小鼠具有显著更高的淋巴结的细 胞数目(图8B)。每一条都代表每组7-17只小鼠的平均值±1SD。*＝p≤ 0.05；**＝p≤0.01；与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较。＾＝p≤0.05； 与阉割小鼠比较。
图9：在用一种化疗药物环磷酰胺处理以及同一天进行手术或化学阉 割之后的胸腺(空条)、脾(灰条)和淋巴结(黑条)的细胞数目的变化。 当在处理后1周和2周与非阉割(单用环磷酰胺)组比较时，注意到阉割 动物内的胸腺的快速扩增。另外，与单用环磷酰胺组比较，较大地增加 了阉割组的脾和淋巴结的细胞数目。(每个处理组和时间点的n＝3-4只)。 在环磷酰胺处理后的免疫系统的再生上，化学阉割与手术阉割相当。
图10A-C：在手术阉割1周之后的照射(625Rad)后的胸腺(图 10A)、脾(图10B)和淋巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研 究，用亚致死(625Rad)照射耗竭年轻(3个月大)小鼠的T细胞。在照 射前1周，小鼠被假阉割或阉割。观察到胸腺再活化随阉割的显著增加 (即更快的胸腺再活化率)(图10A)。当在处理后1周和2周与非阉割(单 用照射)组比较时，注意到了阉割动物中的胸腺的快速扩增。(每个处理 组和时间点的n＝3-4只)。没有看到脾(图10B)或淋巴结(图10C)的细 胞数目随阉割小鼠的差异。与对照小鼠比较，淋巴结细胞数目在处理后2 周仍是长期缓慢低下的(图10C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD 表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001，与对照 和阉割小鼠比较。
图11A-C：同一天照射及阉割后的胸腺(图11A)、脾(图11B)和淋 巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研究，用亚致死(625Rad)照 射耗竭年轻的(3个月大)小鼠的淋巴细胞。在与照射的同一天，小鼠或 被假阉割或被阉割。与假阉割的小鼠比较，阉割小鼠显示出明显更快的 胸腺再活化率(图11A)。当在处理后2周与非阉割组比较时，注意到了 阉割动物的胸腺的快速扩增。在阉割小鼠中没有看到脾(图11B)或淋巴 结(图11C)的细胞数目的差异。与对照小鼠比较，淋巴结的细胞数目在 处理后2周时仍是持续低下的(图11C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值 ±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001， 与对照和阉割小鼠比较。
图12A-B：照射处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。在亚致 死照射(625Rad)之前，3个月大的小鼠或被阉割或被假阉割。在处理后 1周时，脾(图12A)和(汇集的)淋巴结(图12B)内都有显著的严重的 淋巴细胞减少。在处理后2周时，脾的淋巴细胞数目恢复到了对照水平 (图12A)，而淋巴结的细胞密度仍显著低于对照(年龄匹配的，未处理的) 小鼠(图12B)。在处理组之间没有观察到差异。每栏都表示每组6-8只 小鼠的平均值±1SD。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与对照小鼠比较。
图13A-B：阉割恢复了对HSV-1免疫接种的应答性。用4×105pfu HSV 在后肢免疫接种小鼠。在感染后第5天，分析引流淋巴结(腘淋巴结)的 应答细胞。图13A显示了在用单纯疱疹病毒-1(HSV-1)爪垫免疫接种后 的淋巴结的细胞密度。与年老的非阉割组比较，注意到了年老的阉割后 小鼠内的细胞密度的增加。图13B表明了如FACS设门于CD25对CD8 细胞所测定的总活化细胞数目(即活化细胞被设门为CD8+CD25+细胞)。 对年老小鼠的阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的 CTL细胞。结果用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻 (2个月大)且阉割的小鼠比较。
图14A-C：在HSV-1接种后的活化LN(淋巴结)的CTL(细胞毒T 淋巴细胞)上的Vβ10的表达(HSV特异的)。尽管年老(即18个月大)小 鼠总体上都具有正常的Vβ10应答性，但是在一些小鼠中观察到了Vβ10 表达的完全缺失。显示了代表性的直方图图形。注意到年老小鼠的克隆 应答的减弱以及阉割后的预期应答的复原。
图15A-B：阉割增强了HSV-1感染后的活化。图15A显示了HSV-1 感染小鼠的LN内的活化(CD8+CD25+)细胞的代表性FACS图形。没有 看到活化CTL的比例随年龄或阉割后的差异。如所示的，对年老小鼠的 阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的CTL数目。结果 用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻(2个月大)且 阉割的小鼠比较。
图16：对HSV-1的免疫应答的特异性。从用HSV-1免疫接种的小鼠 中取出腘淋巴结细胞(在HSV-1感染后5天取出)，将其培养3天，然后 检查其裂解HSV肽激活EL4靶细胞的能力。用未免疫接种的小鼠作为裂 解的背景水平的对照进行CTL检测(如用51Cr释放所测定的)。在E∶T比 例为10∶1和3∶1时，年老小鼠都显示出显著减低(p≤0.01，**)的CTL 活性，说明淋巴结内所存在的特异性CTL百分比的减低。对年老小鼠的 阉割将CTL应答恢复到了年轻成体水平，因为阉割小鼠表现出与年轻成 体(2个月大)小鼠相当的对HSV-1的应答性。结果用8只小鼠的平均值， 三次重复试验±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻成体小鼠比较；＾＝与年老 的对照小鼠有着显著差异(当E∶T为3∶1时，p≤0.05；当E∶T为0.3∶1时， p≤0.01)。
图17A-B：对在对HSV-1的免疫应答中的VβTCR表达和CD4+T细 胞的分析。在HSV-1感染后5天取出腘淋巴结，并体外分析它的CD25、 CD8和特异的TCR Vβ标记物(图17A)的表达和CD4/CD8T细胞(图 17B)。在图17A中将或表达Vβ10或表达Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+ T细胞的百分比显示为每组8只小鼠的平均值±1SD。随着年龄或阉割后 没有观察到差异。但是，看到了静息LN群中的CD4/CD8比例随年龄的 减低(图17B)。阉割后恢复了这种减低。结果用每组8只小鼠的平均值 ±1SD表示，***＝p≤0.001，与年轻且阉割后小鼠比较。
图18A-D：在Ly5同系小鼠的BM移植(BMT)之后，阉割增强了 胸腺(图18A)、脾(图18B)和BM(图18D)的再生，但没有增强淋巴 结的再生(图18C)。在用C57/BL6Ly5.2+(CD45.2+)成体BM细胞(106 个细胞)移植前1天，将3个月大的、年轻成体的、C57/BL6 Ly5.1+ (CD45.1+)小鼠照射(6.25Gy)、阉割或假阉割。2周和4周后处死小鼠， 分析胸腺(图18A)、脾(图18B)、淋巴结(图18C)和BM(图18D)的 免疫重建。用抗CD45.2(Ly5.2)确定供者/宿主来源，该抗体只与供者来 源的白细胞反应。与假阉割小鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠 的胸腺内有着明显更多的供者细胞(图18A)。注意到在处理后的所有时 间点当与非阉割组比较时，都有阉割动物胸腺的快速扩增。与假阉割小 鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠的这些脾和BM内有着明显更 多的细胞(图18B和图18D)在BMT后2、4和6周时，淋巴结的细胞 密度之间没有显著差异(图18C)。当与非阉割动物比较，阉割小鼠具有 显著增多的同系(Ly5.2)细胞。数据用每组4-5只小鼠的平均值±1SD表 示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。
图19A-C：阉割增加了同系BMT后的BM及胸腺的细胞密度。如图 19A所示，在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM内有着明显更多的 细胞。到2周时，假阉割小鼠的骨髓细胞密度达到了未处理的对照水平 (1.5×107±1.5×106)。在同系BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM细胞 密度超过了对照水平。图19B显示在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的 胸腺内有着明显更多的细胞。在同系BMT后2周和4周时，假阉割小鼠 的胸膜细胞密度低于未处理的对照水平(7.6×107±5.2×106)。在同系BMT 和阉割后4周时，胸腺的细胞密度增加超过了对照水平。图19C显示了 在BMT后2周和4周时，脾的细胞密度没有显著差异。在2周时，假阉 割及阉割小鼠的脾细胞密度都已经达到了对照水平(8.5×107±1.1×107)。每 组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏表示阉割。
图20：阉割增加了同系BMT后的HSC比例。代表性的FACS点图 图解说明了c-kit(y轴)对sca-1(x轴)的表达。HSC为c-kithisca-1hi。在 BMT后2周和4周时，供者来源的HSC的比例在阉割后有了显著增加。
图21A-B：阉割增加了同系BMT后的HSC的比例和数目。如图21A 所示，在BMT后2周和4周时，HSC的比例在阉割后有了显著增加(*p＜ 0.05)。图21B显示了在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉 割小鼠的HSC数目有着显著增加(*p＜0.05；**p＜0.01)。每组都含有4 到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图22A-B：在BMT之后，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来 源的B细胞祖细胞和B细胞。如图22A所示，与假阉割对照比较，在阉 割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的CD45.1+B220+IgM-B细胞 祖细胞(*p＜0.05)。图22B显示了与假阉割对照比较，在阉割小鼠的BM 内有着显著更多的供者来源的B220+IgM+B细胞(*p＜0.05)。每组都含 有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图23：阉割不影响同系BMT后的供者来源的胸腺细胞比例。在假 阉割和阉割后2周时，有着供者来源的双阴性(CD45.1+CD4-CD8-)的早 期胸腺细胞比例的增加。在这个早期时间点上，只有非常少的供者来源 的(CD45.1+)CD4和CD8单阳性细胞。在BMT后4周时，假阉割和阉 割小鼠的供者来源的胸腺细胞值都与未处理的对照相似。
图24：阉割不增加同系BMT后的外周B细胞比例。在同系BMT后 2周和4周时，阉割和假阉割小鼠的脾B220表达之间没有差异。
图25：阉割不增加同系BMT后的外周B细胞数目。在BMT后2 周和4周时，没有B细胞数目的显著差异。在同系BMT后2周时，假阉 割和阉割小鼠的脾内的B细胞数目接近于未处理的对照水平 (5.0×107±4.5×106)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代 表阉割。
图26：增加了在BMT后的阉割小鼠中的供者来源的三阴性、双阳 性和CD4及CD8单阳性胸腺细胞的数目。图26A显示在BMT后2周和 4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的供者来源的三阴性 (CD45.1+CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。图26B显示 在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的 双阳性(CD45.1+CD4+CD8+)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。如图26C 所示，在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著 更多的CD4单阳性(CD45.1+CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05， **p＜0.01)。图26D显示在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较， 阉割小鼠有着显著更多的CD8单阳性(CD45.1+CD3+CD4-CD8+)胸腺 细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割； 实栏代表阉割。
图27：在同系BMT后2周和4周时只有非常少的供者来源的外周T 细胞。如图27A所示，在同系BMT后2周和4周时，在假阉割和阉割 小鼠的脾内都有着非常少的供者来源的CD4+和CD8+T细胞的比例。图 27B显示在BMT后2周和4周时的供者来源的T细胞数目之间没有显著 差异。同系BMT后4周时，与未处理的年龄匹配的对照(CD4+： 1.1×107±1.4×106，CD8+：6.0×106±1.0×105)比较，假阉割和阉割小鼠都有 着显著更少的CD4+和CD8+细胞。每组都含有4到5只动物。空栏代表 假阉割；实栏代表阉割。
图28：阉割增加了同系BMT后4周时的胸腺的供者来源的DC的数 目。如图28A所示，供者来源的DC为CD45.1+CD11c+MHCII+。图28B 显示在同系BMT后4周时阉割小鼠有着显著更多的供者来源的胸腺DC (*p＜0.05)。在同系BMT后2周时，树突状细胞数目为未处理时的对照 水平(1.4×105±2.8×104)。在同系BMT后4周时，阉割小鼠的树突状细胞 数目超过了对照水平。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实 栏代表阉割。
图29A-C：阉割增强了异基因HSCT受者的免疫细胞的重建。经致 死性照射(1300cGy)的CBA/J受者(3个月大)接受了B10.BR TCD BM (5×106)的移植。在移植前1天，受者被阉割或被假阉割。在第14、28 和42天以人道的方式处死动物，并评价了BM(图29A)、胸腺(图29B)和 脾(图29C)器官的细胞密度。*(p＜0.05)。每组含有4到5只动物。
图30A-C：阉割增强了异基因HSCT受者的供者来源的HSC和B细 胞。如图29所描述的移植阉割和假阉割的受者。如图30A所示，在HSCT 后14天时，在假阉割和阉割小鼠内都只有很少的供者来源的HSC (Ly9.1-Lin-Sca+c-kit+)；但是，到第28天时，阉割组的供者HSC数高出 了4倍。另外，如图30B-C所示，在阉割小鼠的BM(图30B)和脾(图 30C)中都有着显著更多的供者来源的B细胞。利用总的BM或脾细胞计 数及多色流式细胞术分析了中心和外周B细胞群。根据CD45R、IgM和 CD43的表达，将B细胞分为各个发育期：总B细胞(CD45R+)、原B(pro-B) 细胞(CD43+CD45R+IgM-)、前B(pre-B)细胞(CD43-CD45R+IgM-)、未 成熟B细胞(CD43-CD45R+IgM+)。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该 抗体只与宿主来源的白细胞反应。每组都含有4到5只动物。空栏代表 假阉割；实栏代表阉割。*(p＜0.05)表示与假阉割对照比较，阉割组的细 胞数目有着显著增加。
图31A-E：阉割增强了异基因HSCT受者的胸腺细胞和外周T细胞 的重建以及宿主及供者来源的DC的数目。如图29所描述的移植阉割和 假阉割小鼠。在第14、28和42天以人道的方式处死动物，并用总的胸 腺(图31A-F)和脾(图31G)的细胞计数和多色流式细胞术分析胸腺细 胞和T细胞群。DC被定义为CD11chiIa-Khi。图31A描述了TN (CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞的数目。图31B描述了DP(CD4+CD8+)胸腺 细胞的数目。图31C描述了CD4+(CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞的数目。 图31D描述了CD8+(CD3+CD4-CD8+)胸腺细胞的数目。如图31E所示， 与假阉割的对照受者比较，在异基因HSCT后14天和28天时，阉割受 者都有显著更多的宿主来源的DC。另外，如图31F所示，与假阉割的对 照比较，在异基因HSCT后28天时，阉割受者有着显著更多的供者来源 的DC。图31G描述了用抗CD3、抗CD4和抗CD8所识别出的外周T 细胞的数目。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该抗体只与宿主来源的白 细胞反应。供者CD4T细胞为Ly9.1-CD3+CD4+CD8-和供者CD8T细胞 为Ly9.1-CD3+CD4-CD8+。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割； 实栏代表阉割。*(p＜0.05)和**(p＜0.01)表示与假阉割对照比较，阉割 组的细胞数目有着显著增加。
图32A-G：阉割没有改变异基因HSCT后的供者来源的T细胞的功 能。如图29所示移植阉割和假阉割受者。在移植后42天测定T细胞功 能性。图32A显示了在异基因HSCT6周后的供者来源的T细胞 (CD3+CD4+和CD3+CD8+)的数目。图32B显示了阉割对异基因HSCT 后的T细胞的增殖能力没有影响。图32C显示了在MLR的异基因反应 性T细胞增殖上没有差异。将每个组(n＝5)的脾T细胞与经照射的 (20Gy)BALCB/c脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在96孔板中孵育5天， 并在培养的最后20个小时内加入[3H]-脱氧嘧啶脱氧核苷。图32D显示在 供者来源的T细胞的细胞裂解活性上没有差异。图32E显示了异基因反 应性T细胞的细胞内IFNγ的表达。在第42天，从如上所述的假阉割或 阉割的受者中收集脾B6T细胞，并将其与经照射的(20Gy)(BALCB/c 第三个部分)脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在24孔板中孵育5天。收集 细胞，并用TCD、经照射的(20Gy)(BALB/c或B10.BR生物学的内对照) 脾刺激细胞再刺激。在照射的第1个小时后加入Brefeldin A(10mg/mL)。 用流式细胞术分析测定供者来源的CD3+CD8+细胞的细胞内IFNγ的表 达。在图32E中显示了代表性曲线，并在图32F中图解显示了表达IFNγ 的供者来源的CD8+T细胞的百分比。图32G显示当小鼠在异基因HSCT 的同时被阉割时，T细胞的功能性在攻击后48小时的时候被显著地增强 了。在异基因HSCT后6周时，对假阉割和阉割小鼠进行DTH检测，并 通过右后爪垫减去左后爪垫肿胀测定出肿胀。空栏代表假阉割；实栏代 表阉割。
图33A-B：阉割没有加重异基因HSCT受者中的GVHD或减轻其中 的GVL。对于在图33A中所述的试验，经致死性照射(1300cGy)的(B6 ×C3H)F1受者(3个月大)接受B6TCD BM细胞(5×106)+脾细胞 (0.5×106)的移植。用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有 TCD-BM移植(无T细胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及 空方块代表阉割受者。每组都含有8只动物。对于在图33B中所描述的 试验，经致死性照射的、3个月大的B6D2F1/J受者接受了P815(H-2d)细 胞(1×103)、C57/BL6TCD BM细胞(5×106)及C57/BL6T细胞(5×105)。 用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有TCD-BM移植(无T细 胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及空方块代表阉割受者。 每组都含有8-9只动物。
图34A-I：阉割和IL-7治疗对异基因HSCT后的胸腺具有累加作用。 如图1所描述的移植阉割和假阉割受者。在第14天被处死的受者(图34A) 在第0天到13天还接受了经腹腔内注射的10g/天IL-7或PBS(对照)。在 第28天被处死的受者(图34B)在第21天到28天接受了10g/天IL-7或 PBS(对照)。从总的细胞计数中计算出胸腺的细胞密度。*(p＜0.05)代表 与假阉割对照比较时，阉割组的细胞数目有着显著的增加。对照：假阉 割的，注射PBS的受者；CX：阉割的、注射PBS的受者；IL-7：假阉割 的、注射IL-7的受者；以及IL-7&CX：阉割的、注射IL-7的受者。在异 基因HSCT和阉割后2周时，对整个BM进行半定量的RT-PCR。在比较 了来自阉割和假阉割小鼠的HPRT平衡模板的TGFβ1和KGF的表达(图 34C)之后。将KGF-/-和IL-/-小鼠阉割并在2周后分析胸腺、BM和脾的 细胞密度。图34D-F显示了来自KGF-/-小鼠的胸腺(图34D)、BM(图34E)、 脾(图34F)的结果。图34G-I显示了来自IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、BM (图34H)和脾(图34I)的结果。
图35：阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT 前1天将小鼠阉割。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同的时间点(2-6周)用流式 细胞术分析BM、脾和胸腺。如图35B所示，在阉割和HSCT 2周后，与 假阉割的对照比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地， 如图35C所示，与假阉割的对照比较，阉割小鼠的胸腺细胞在移植后2、 4和6周都有着显著增加。如图35C所示，阉割受者的外周的脾细胞数 目在移植后4和6周都明显高于对照。灰栏代表阉割受者。黑栏代表假 阉割对照。
图36A-B：阉割增强了同系HSCT后HSC在BM内的植入。在同系 HSCT前1天将小鼠阉割。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照 射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析 BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图36A)。与假阉割的对照比较，在BMT移 植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的HSC (图36B)。
图37A-B：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后HSC在BM 内的植入。在同系HSCT前1天将小鼠阉割。将2.5×106(图37A-B)和 5×106(图37C-D)Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的 C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析BM的 lin-c-kit+sca-1+HSC。图37A-D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的百分比。 与假阉割的对照比较，在BMT移植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内 都有着显著增加的供者来源的HSC的比例。
图38A-B：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的 DC在胸腺内的植入率。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析胸腺 细胞(图38A)。供者来源的DC被定义为CD45.1+CD11c+MHC II+CD11b+ 或- 。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的胸腺内有着 显著增加的供者来源的CD11b+和CD11b-DC(图38B)。
图39A-D：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的B 细胞在脾内的植入率。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析脾细 胞(图39A-C)。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的 脾内有着显著更多的B220+B细胞(图39D)。
图40：分析进行抗前列腺癌的LHRH激动剂治疗的人类患者(所有 的都＞60岁)的外周血淋巴细胞的表型组成。在治疗前以及开始LHRH 激动剂治疗后4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总 淋巴细胞数目都在对照值的较低的一端。在治疗后，9例患者中的6例都 显示出总淋巴细胞计数的明显增加(在一些病例中观察到了总细胞数目 的加倍)。与此相关的是9例患者中6例都有总T细胞数目的增加。在CD4+ 亚组内，这种增加甚至是更为突出的，9例患者的8例都证实有CD4T 细胞水平的增加。在CD8+亚组内看到了这种较不突出的趋势，9例患者 的4例显示出水平的增加，虽然这种增加的程度要小于CD4+T细胞。
图41：对LHRH激动剂治疗前后的人类患者的血液的分析证实在T 细胞、CD4细胞或CD8T细胞的总比例上没有明显变化，以及CD4∶CD8 的比例在治疗后的不同的变化。这说明了尽管在治疗后明显增加了总的T 细胞数目，但是治疗对T细胞亚组的稳态维持只有很小的影响。所有的 数值都与对照值相当。
图42：对进行LHRH激动剂治疗的人类患者的外周血内的B细胞和 髓细胞(NK、NKT和巨噬细胞)的比例分析证实了亚组内的不同程度的 变化。虽然NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，但是9 例患者中的4例出现了B细胞比例的减少。
图43：对治疗后的人类患者的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目 的分析清楚地显示了治疗后NK(9例患者中的4例)、NKT(9例患者中的 4例)和巨噬细胞(9例患者中的3例)的水平的增加。B细胞数目没有 显示出明显的趋势，9例患者中的2例显示出水平的增加；9例患者中的 4例显示没有变化以及9例中的3例显示水平的减低。
图44A-B：人类的化学阉割增强了原初和记忆T细胞。如图44A所 示，在LHRH-A治疗后观察到了原初(CD62L+CD45RA+CD45RO-) CD4+T细胞的显著增加。如图44B所示，在LHRH激动剂治疗后增强 了原初和记忆(CD62L-CD45RA-CD45RO+)CD8+T细胞的数目。每栏都 代表16例患者的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与治疗前数 值比较。
图45A-B：人类的化学阉割增强了外周血淋巴细胞数目。分析了进 行作为前列腺癌的常规治疗的一部分的LHRH-A化学阉割的人类患者 (所有都＞60岁)的外周血的表型组成。在治疗前和治疗4个月时分析患 者。如图45A所示，在LHRH-A治疗后，显著地增加了每μl外周血的总 淋巴细胞数目。总T细胞、CD4+和CD8+T细胞的显著增加反映了这一 点(图45B)。
图46A-B：LHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮，并增加了胸腺功 能和T细胞输出。在图46A的试验中，用LHRH-A治疗前列腺癌患者4 个月。在治疗前和LHRH-A治疗4个月后都用FACS分析血液以及用RIA 分析血清。如图83A所示，在LHRH-A治疗4个月时，在患者的血清中 没有检测到睾酮。栏代表所分析的13例患者的平均值。在图46B的试验 中，在分析10例患者的TREC水平之后，发现了胸腺功能和T细胞输出 增加的直接证据。在CD4+和CD8+T细胞群内，到LHRH-A治疗4个月 时，10例患者中的5例都显示出绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超 过最初测定值的＞25％)。这一点也被反映于比例的增加(每1×105细胞； 数据没有显示)。与之相关的是10例患者中的6例都显示出总TREC水 平的总体增加。仅有1例患者显示出总TREC的减少(约30％的减少)。
图47：人类的化学阉割增强了NK数目。在LHRH-A治疗之前以及 治疗4个月时进行分析。观察到了NK细胞但不是B细胞随LHRH-A治 疗的显著增加。结果用13例患者的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与治 疗前数值比较。
图48A-B：人类的化学阉割没有增加T细胞的增殖。图48A-B描述 了利用Ki-67抗原检测所进行的对细胞增殖的分析。在所有患者中， LHRH-A治疗都没有改变所有CD4+(图48A)和CD8+T细胞(图48B) 的原初、活化和记忆细胞亚组内的增殖水平。
图49A-C：对对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间 点的自然杀伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在对照 的异基因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反，在HSCT前3 周给予LHRH-A治疗的异基因患者在移植后14天到5个月都显示出了显 著更高的NKT细胞的数目(图49C；数据用6-20例患者的平均值±1SEM 表示，**＝p≤0.05)。
图50：对对照患者在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35 天)的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期恢复， 主要见于移植后早期的CD8+群，这提示胸腺以外的再生途径。在移植后 1个月，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51A-B：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的B细胞重建。如图51B所示，与异基因患者比较，自体移植患者的 B细胞重建发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月， 两组中恢复到对照值(阴影)都不明显。
图52A-B：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的CD4+细胞重建。虽然B细胞数目在移植后6个月时恢复到了对照值 (见图48A-B)，但是甚至在移植后12个月时，自体(图52B)和异基因(图 52A)受者的CD4+T细胞都仍是严重减低的。
图53A-C：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的CD8+细胞重建。如图52A-B所示，在异基因和自体受者中，CD8+T 细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53所示，如TCRγδ+T 细胞、CD8ααT细胞和CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样，CD8+T 细胞主要是胸腺外来源的。
图54A-B：利用标记物Ki-67对对照患者在HSCT之前(图54A)和 之后28天(图54B)的CD4+和CD8+T细胞的不同群的增殖的FACS分 析。利用标记物CD45RO和CD27根据原初、记忆的和活化的表型分析 细胞。大部分增殖都发生在CD8+T细胞亚组，这还提示这些细胞是胸腺 外起源的以及增殖优势发生在外周T细胞亚组内。
图55A-D：对照患者和LHRH-A治疗的患者在HSCT后的不同时间 点的原初CD4+T细胞的再生。图55A描述了对对照(未LHRH-A治疗) 患者的原初CD4+T细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析， 并显示这些细胞在整个研究期间的严重缺失。如图55B-C所示，自体移 植患者直到HSCT后12个月，对照患者的原初CD4+T细胞才开始再生 (图55C)，但仍明显低于异基因对照患者的对照值(图55B)。这些结果说 明因为患者的年龄，对照患者的胸腺在移植后不能恢复足够数目的原初T 细胞。相反，在异基因HSCT前3周给予LHRH-A的患者在移植后9个 月和12个月都比对照显示出显著更高的数目(图55D)。这说明性类固醇 清除治疗增强了胸腺依赖性T细胞途径的再生。数据用6-20例患者的 ±1SEM表示，**＝p≤0.05。
图56A-D：对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间点 (1-12个月)的TREC水平。对TREC(仅见于新近胸腺迁出(RTE))水平 的分析强调了异基因(图52A)和自体(图52B)移植患者的胸腺在移植 后恢复水平的能力。这都是因为患者的年龄以及胸腺萎缩所造成的胸腺 功能的缺失，这与这些患者的发病率和死亡率都明显相关。相反，当在 异基因移植前用LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干细胞移植的患者 表现出CD4+TREC+细胞/ml血液的显著增加(移植后9个月与对照(未 LHRH-A治疗)比较，p≤0.01)。接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植 后9个月(图56C)时显示出比对照显著更高数目的CD4+TREC细胞/ml 血液。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月时也显示出显著更高 的水平(图56D)。这说明性类固醇清除治疗增强了胸腺的再生。数据用 5-18例患者的±1SEM表示，**＝p≤0.01。
图57A-C：LHRH-A给药增强了异基因(图57A-B)和自体(图57C) HSCT后对TCR特异刺激的应答性。在HSCT前3周，给予患者LHRH-A。 没有接受激动剂的患者被用作为对照患者。在移植后的不同时间点(1-12 个月)，用5μg抗CD3和10μg抗CD28交联进行对TCR特异刺激的分析。 如图57A-B所示，异基因LHRH-A治疗的患者在除了6个月和9个月(因 为此时所分析的患者数目少)的所有时间点都显示出比对照患者更强的 增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定的)。在移植后6个月和9 个月时，对照患者有着与治疗前数值相似的应答性。但是，在所有的其 他时间点上，它们都是明显更低的。相反，与治疗前比较，LHRH-A治 疗的患者在除6个月以外的所有时间点上都有着相等的应答性。LHRH-A 治疗的患者在一周后1、3和4个月都显示出比对照患者更强的增殖应答 (如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这说明了直接的外周T细胞作用 的贡献，因为直到移植后1-2个月，新的CD4+T细胞都是不明显的(图 57B；数据用5-12例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05；**＝p≤0.01)。 如图57C所示，自体LHRH-A治疗的患者在除5个月外的所有时间点都 显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定 的)。在移植后12个月时，观察到了对照和LHRH-A治疗的患者都恢复 到了治疗前的值。
图58A-B：LHRH-A给药增强了异基因HSCT后对PWM和TT有丝 分裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有 接受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(PWM) 或破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分 裂原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在所有 的时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图58A)和TT(图58B)的 应答性。
图59A-B：LHRH-A给药增强了自体HSCT后对PWM和TT有丝分 裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有接 受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(PWM)或 破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分裂 原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在大多数 时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图59A)和TT(图59B)的应 答性(3个月时p≤0.001)。到了移植后12个月时，LHRH-A治疗的患者 有着恢复了的应答性。
图60A-D：LHRH-A治疗增强了自体HSCT患者中的植入的速度。 在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图60A、C和D)。将没有接受 激动剂的患者用作为对照患者(图60B)。在移植后第14、28和35天测 定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图60A所示， 接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第14天显示出比对照(图60B) 显著更高的WBC数目(p≤0.05)。在这个时间点上，比较于对照的45％， 87％显示出粒细胞的植入(≥500个细胞/μl血液)。接受LHRH-A治疗的 自体患者在移植后第10-12天也比对照显示出显著更高的中性粒细胞的 数目(图60C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05)。 另外，尽管是不显著的，但是LHRH-A治疗的自体患者在所有时间点上 都比对照组有着更高的淋巴细胞计数(图60D)。
图61A-D：LHRH-A治疗增强了异基因HSCT患者中的植入的速度。 在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图61A、C和D)。将没有接受 激动剂的患者用作为对照患者(图61B)。在移植后第14、28和35天测 定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图61A所示， 接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后第14天显示出比对照(图61B) 显著更高的WBC数目(p≤0.05)，在这个时间点上有着87％显示出粒细 胞的植入(≥500个细胞/μl血液)，比较于对照的44％。接受LHRH-A治 疗的异基因患者在移植后第9、12&19天也比对照显示出显著更高的中性 粒细胞的数目(图61C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤ 0.05)。另外，对进行外周血干细胞移植的患者的分析证实当在异基因移 植前用LHRH-A治疗时淋巴细胞计数的显著增加(在移植后10、12、13 和17-21天时，p≤0.05)(图61D)。
图62A-F：在阉割的1周内增强了TCR特异性外周T细胞增殖应答。 将8周大的小鼠阉割并在手术后第3天(图61A、C和E)和第7天(图 62B、D和F)分析抗CD3/抗CD28刺激的T细胞增殖应答。用不同浓度 的抗CD3刺激以及用恒定浓度的10μg/ml抗CD28共刺激外周(颈部、 腋下、肱和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和D) 和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用脉冲量的氚化胸腺嘧啶处理细 胞18个小时并根据3H-T掺入测定增殖。棱形表示阉割动物，方块表示 假阉割对照动物，n＝4，*p≤0.05(非参数的、非配对的、Mann-Whitney 统计检验)。
图63：LHRH-A给药增强了慢性癌症受害者治疗后对TCR特异性刺 激的应答性。用LHRH-A治疗慢性恶性肿瘤患者。在LHRH-A给药后的 不同时间点(第7-12个月)用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性 刺激的分析。LHRH-A治疗的患者显示出比治疗前水平更强的周期式的 增殖应答(用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这反映了每月长效注射 的激动剂的给药。这些结果说明对外周T细胞的直接影响。但是，在治 疗后12个月时所看到的增强的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因 为从4个月开始就停止了所有患者的激动剂的给药。
图64是显示当60％假手术的小鼠患有糖尿病，而阉割组的少于20％ 患者患有糖尿病的线性图。
图65是显示阉割的NOD小鼠的总胸腺细胞数目有着明显增多，而 总的脾细胞没有差异的条形图。
图66A-C是显示阉割的NOD小鼠的所有胸腺细胞亚型都有着显著 增加(图66A)。与假阉割的NOD小鼠(图66C)比较，B细胞以及脾的总T 或B细胞都没有变化(图66B)。
图67A和67B显示了阉割的NZB小鼠的总的胸腺细胞(图67A)和脾 细胞(图68B)的明显增加。
图68是显示已经被阉割并免疫接种的小鼠比对照有着减低了的肿瘤 发病率的图。
图69A-C是显示阉割并免疫接种的小鼠比对照有着增加了的脾的细 胞密度的条形图。
图70A-B是显示已经阉割并免疫接种的小鼠比对照有着增加了的 γIFN生成的图。
图71A-B是显示阉割并免疫接种的小鼠表现出比对照更强的抗原特 异性CTL应答的图。
图72A-E显示胸腺切除没有影响性类固醇抑制/BMT对BM的普通 淋巴祖细胞(图72A)、总的BM B细胞(图72B)、BM的未成熟的B细胞(图 64C)、脾的总细胞数目(图72D)或对脾脏的总B细胞(图72E)的作用。
已经发现对性类固醇和/或其他激素的信号途径的中断通过直接作用 或通过间接作用增强了BM、HSC、T细胞和免疫系统的其他细胞的功能 性。这个发现已经被开发形成了本发明，在本发明的一个方面提供了增 强BM造血作用和/或功能性的方法。在一些实施方式中，提高了已有的 BM造血作用和/或功能性。在另一个实施方式中，患者接受HSCT，并 提高了患者的HSC造血作用和/或植入。
在一个方面，本发明提供了增强HSCT后的植入的方法。在一个实 施方式中，增强了BM的植入。在另一个实施方式中，增强了胸腺的植 入和/或重建，据此最终诱导了胸腺恢复。仍在另一个实施方式中，增强 了脾和/或其他淋巴器官、组织、和/或血液的植入和/或重建。在一些实施 方式中，HSC是异基因的，以及在其他的实施方式中，HSC是自体的。 在一个实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径(sex steroid signaling)中断的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了T细胞前 体的数目。在其他的实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径中断 的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了总白细胞、供者来源的 DC、BM前体细胞、HSC、CLP、MLP、淋巴细胞、髓细胞、粒细胞、 中性粒细胞、巨噬细胞、NK、NKT、血小板、原初T细胞、记忆T细胞、 辅助T细胞、效应T细胞、调控T细胞、RBC、B细胞、供者和/或宿主 来源的外周T细胞、APC和/或供者来源的外周B细胞的数目。仍在其他 的实施方式中，患者在HSCT之后也接受了细胞因子(例如IL-7、SCF、 IL-11、G-CSF、或GM-CSF)或激素(例如生长激素、或它的介导物胰岛 素依赖性生长因子(IGF-1)或成纤维细胞生长因子家族的任一成员例如 FGF7/角化细胞生长因子)治疗以增强免疫恢复和/或植入。在另一个实施 方式中，本发明单独或联合施与促造血药物例如生长因子(例如，G-CSF 或GM-CSF)，这容许更快的和/或更好的植入和/或入巢到靶组织中和/或 增强免疫细胞的恢复。
在本发明的第二个方面，提供了增强HSCT后的患者的免疫细胞的 功能性的方法。在一个实施方式中，免疫细胞是T细胞。在另一个实施 方式中，提高了T细胞对T细胞受体(TCR)刺激的增殖应答性。在另一 个实施方式中，提高了T细胞对抗原(例如，破伤风毒素(TT)或美洲商 陆促有丝分裂剂(PWM))刺激的应答性。在一个实施方式中，提高了T 细胞对回忆(recall)抗原的应答性(即提高的T细胞记忆应答)。仍在另 一个实施方式中，提高了T细胞与共刺激或第二信号途径相关的增殖应 答性。在一些实施方式中，提高了T细胞应答性的动力学。在其他实施 方式中，提高了T细胞对APC所呈递的抗原的应答。在本发明的一些实 施方式中，在移植后约5、4、3或2个月内提高了免疫细胞应答性。在 本发明的特定的实施方式中，在移植后约1个月内提高了免疫细胞应答 性。在本发明的其他实施方式中，在移植后2周内提高了免疫细胞应答 性。在本发明的另一个实施方式中，在移植后1周内提高了免疫细胞应 答性。仍在本发明的其他实施方式中，在移植后3天内提高了免疫细胞 应答性。在其他实施方式中，在治疗后3个月或3个月以上提高了免疫 应答，包括除了输出已有T细胞外还输出新的胸腺来源的T细胞。
在第三个方面，本发明提供了增强已有的免疫细胞功能性的方法， 已有的免疫细胞包括但不限于外周的免疫细胞。在一个实施方式中，细 胞是T细胞。在另一个实施方式中，细胞是DC或其他的APC。仍在另 一个实施方式中，细胞是NK细胞或调控细胞，例如CD4+CD25+T细胞 和自然杀伤T(NKT)细胞。在本发明的一个实施方式中，提高了患者的 T细胞对TCR刺激的增殖应答性。在另一个实施方式中，提高了T细胞 对抗原(例如TT、PWM或KLH)刺激的应答性。仍在另一个实施方式 中，提高了T细胞对共刺激或第二信号途径的增殖应答性。在其他的实 施方式中，提高了T细胞对APC所呈递抗原的应答性。在一个特殊的实 施方式中，LHRH/GnRH类似物对已有的免疫细胞的应答性有着直接作用 或间接作用。在一些实施方式中，本发明的方法使用性类固醇类似物(它 的激动剂和拮抗剂)，例如GnRH/LHRH类似物，以阻断免疫细胞或骨髓 的性类固醇介导的信号途径。在其他的实施方式中，类固醇类似物直接 刺激(即直接增加它的功能活性)胸腺、BM、和/或已有的免疫系统的细 胞例如T细胞、B细胞、和DC。
在第四个方面，本发明提供了增强患者中HSC植入和动员、或血液、 HSC或BM供者的HSC动员的方法。在一个实施方式中，阻断性类固醇 信号途径增加了外周的免疫前体细胞例如HSC、CD34+细胞、CLP、或 CMP的数目和功能性。一个实施方式提供了一种用于增强HSC动员的方 法，包括阻断性类固醇信号途径，其或单独地进行或联合施与HSC动员 剂，例如细胞因子、GM-CSF、G-CSF、CSF、化疗剂、环磷酰胺、flt-3 配体、KGF/FGF7或FGF家族的其他成员或IL-7。
在一个实施方式中，本发明提供了容许给予更高剂量和/或更频繁的 化疗及放射治疗和/或容许免疫系统在化疗及放射治疗后更快恢复或受到 更少损伤的方法。
在第五个方面，本发明提供了预防或治疗患者的病变的方法。一个 具体实施方案提供了一种用于预防或减少患者感染、病变或疾病的危险 的方法，该方法包括阻断患者的性类固醇介导的信号途径。在一个特定 的具体实施方案中，阻断了向BM的信号途径。在另一个具体实施方案 中，阻断了向胸腺的信号途径。仍在另一个具体实施方案中，阻断了向 脾的信号途径。仍在另一个具体实施方案中，阻断了向外周免疫细胞的 信号途径。
在一些具体的实施方案中，本发明的方法被用于预防或治疗病毒感 染例如HIV、疱疹、流感、和肝炎。在其他的具体实施方案中，本发明 的方法被用于预防或治疗细菌感染例如肺炎和结核(TB)。仍在另一个具 体实施方案中，本发明的方法被用于预防或治疗真菌感染、寄生虫感染、 过敏、和/或肿瘤和其他癌症，无论是恶性或良性肿瘤。
在其他的具体实施方案中，患者接受了非遗传学修饰的HSC移植。 在一些具体实施方案中，BM或HSC被移植到患者中以提供前体细胞成 分，这些前体细胞最终可被用于新生胸腺的生长。这些HSC中的一些具 有转化为DC或其他APC的能力，它们可能具有给T细胞提供更好的抗 原呈递的作用并因此具有更好的免疫应答(例如增加了Ab产量和效应细 胞数目和/或功能)。在其他的实施方案中，老龄(青春期后)患者的萎缩胸 腺处于因HSCT时性类固醇信号途径被阻断而再活化(reactivation)的过 程中。再活化的胸腺变得能从血液中吸收HSC、BM细胞和其他合适的 前体细胞，并在胸腺内将它们转化为新的T细胞和DC。
在第六个方面，本发明提供了提高患者对疫苗的免疫应答性的方法。
在第七个方面，输送给患者利用遗传学修饰的HSC、淋巴祖细胞、 髓系祖细胞或上皮干细胞、或它们的组合(在此的组和每个成员都指的是 “GM细胞”)的基因治疗，以产生对治疗或预防病变有用的特殊免疫力。
在本发明的特定方面的一些实施方案中，病变是一种具有明确的遗 传基础的病变，例如遗传缺陷所造成的病变。本领域人员熟知这些遗传 病，它们包括自身免疫性疾病、特定蛋白的过多或过少生成所造成的疾 病、肿瘤和癌症等等。通过往HSC中插入正常的基因以及利用发明的方 法修复了引起疾病的遗传缺陷，然后从这种HSC所产生的每个细胞将都 携带有该基因的修正。
在其他实施方案中，疾病是一种选自由病毒感染(例如人类免疫缺陷 病毒(HIV))、T细胞功能性疾病、和直接或间接地数量性或功能性减少T 细胞或引起T细胞以对个体有害的方式作用的任何其他的疾病或病变所 组成的组的T细胞疾病。
仍在其他的实施方案中，本发明提供了通过移植已被遗传学修饰的 GM细胞以抵抗或预防病原体的感染、活性、复制等等和它们的组合，以 治疗或预防病原体例如HIV的感染的方法，可以在胸腺再活化之前、或 与之同时给患者注射病原体。在一个实施方案中，HSC被修饰以包括其 产物能干扰HIV感染、患者的T细胞(和其他的HSC来源的细胞)的功能、 和/或复制的基因。在一个具有的实施方案中，用病毒抗性基因例如 RevM10基因(见，例如Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)或CXCR4 或PolyTAR基因(Strayer et al.，(2002)Mol.Alter.5：33)遗传学修饰HSC。 这就赋予了一定程度的对病毒的抗性，据此预防或治疗病毒所引起的疾 病。
在另一个方面，本发明提供了对性类固醇介导的对胸腺的信号途径 的阻断以及随后的胸腺的再活化(reactivation)。在一个实施方式中，用 阉割阻断性类固醇介导的信号途径。在一个特别的实施方式中，使用化 学阉割。在另一个实施方式中，使用手术阉割(例如通过去除睾丸或通过 卵巢切除术)。在一些实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的完全抑 制。在另一个实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的部分阻断。在 一个实施方式中，阉割将胸腺状态逆转到青春期前的状态，据此将其再 活化。在另一个实施方式中，阉割改变了其他分子的水平，它们通过， 例如对已有免疫细胞的直接作用，增强了免疫细胞应答性和/或增殖和/ 或活化状态。
在特定的实施方式中，通过施与性激素生成、作用、结合或信号途 径的调节物可以直接地或间接地阻断(例如，抑制、灭活或使得无效)性 类固醇介导的信号途径，这些调节物包括但不限于与性激素或它的受体 结合的药物、性激素的激动剂或拮抗剂，包括但不限于GnRH/LHRH、抗 雌激素剂和抗雄激素剂、SERM、SARM、抗雌激素抗体、抗雄激素配体、 抗雌激素配体、LHRH配体、被动的(抗体)或主动的(抗原)抗LHRH (或其他的性类固醇)接种、或它们(“阻断物”)的组合。在一个实施方 式中，使用一或多种阻断物。在一些实施方式中，通过肽持续释放制剂 施与一或多种阻断物。在WO 98/08533中提供了肽持续释放制剂的实例， 在此将其全部内容一同并入作为参考。
附图说明
图1A-B：阉割快速地再生了胸腺细胞密度。图1A-B是显示阉割之 前和之后的胸腺重量和胸腺细胞数目的变化的图解表述。如胸腺重量(图 1A)或每个胸腺的细胞数目(图1B)所测定的那样，胸腺萎缩造成了胸 腺细胞数目随年龄的显著减少。对于这些研究，年老的(即2岁大的)小 鼠被手术阉割。在年老的(1和2岁)及2-4周大的阉割后(post-cx)雄性 小鼠中分析胸腺重量与体重的相关性(图1A)和胸腺细胞密度(图1B)。 与年轻成体(2个月大)小鼠比较，看到胸腺重量和细胞密度随年老的显 著减低。阉割恢复了这种胸腺重量和细胞数目的减低，尽管在阉割后1 周仍有显著的细胞数目的减少(图1C)。在阉割后2周时，发现细胞数目 增加到近似在年轻成体小鼠中所能看到的水平(图1B)。在阉割后3周时， 细胞数目已经从年轻成体小鼠水平开始显著增加并在阉割后4周保持稳 定(图1B)。结果用每组4-8只小鼠(图1A)或每组8-12只小鼠(图1B) 的平均值±1SD表示。 **＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大) 的胸腺及阉割后2-6周的小鼠的胸腺比较。
图2A-D：阉割恢复了外周的CD4∶CD8 T细胞的比值。对于这些研 究，将年老(2岁大)小鼠手术阉割并在阉割后2-6周分析外周淋巴细胞 群。图2A和2B显示了脾内的总淋巴细胞数目。脾的淋巴细胞数目随年 龄和阉割后仍保持恒定，因为内环境稳态维持了脾内的总细胞数目(图 2A和2B)。但是，枯竭了年老的(18-24个月大)小鼠的淋巴结的细胞数 目(图2B)。阉割恢复了这种淋巴结细胞密度的减少。图3C显示脾或淋 巴结内的B细胞对T细胞的比值都没有随年龄或阉割后而变化，也没有 看到这个比值随年龄或阉割后的变化。但是，在(汇集的)淋巴结和脾内 都看到了CD4+∶CD8+T细胞比值随年龄的显著降低(p≤0.001)(图2E)。 在阉割后4-6周时，这种降低被恢复到年轻成体(即2个月大)的水平(图 2D)。
结果用每组4-8只小鼠(图2A、2C和2E)或8-10只小鼠(图2B、 2D和2F)的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01；***＝p≤0.001， 与年轻成体(2个月大)和阉割后小鼠比较。
图3：虽然有胸腺萎缩或阉割后的再生，但胸腺细胞亚群仍被保持于 相似的比例。对于这些研究，将年老(2岁大)小鼠阉割并根据标记物CD4 和CD8分析胸腺细胞亚组。显示了年轻成体(2个月大)、年老(2岁)和 年老的、阉割后动物(2岁，阉割后4周)的CD4-CD8-DN、CD4+CD8+DP、 CD4+CD8-和CD4-CD6+SP胸腺细胞群的CD4(X轴)对CD8(Y轴)的 代表性的荧光激活细胞分类器(FACS)值。在每个曲线的上方都给出了 每个象限的百分比。任何CD4/CD8所定义的亚组的比例随着年龄或阉割 后都没有看到任何的差异。因此，胸腺细胞亚群随着年龄仍为恒定，以 及胸腺细胞在阉割后的同步扩增。
图4A-B：阉割造成的胸腺细胞增殖的恢复。给小鼠注射一个脉冲量 (pulse)的BrdU并分析增殖的(BrdU+)胸腺细胞。对于这些研究，将年 老(2岁大)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确定 增殖的水平。显示了随年龄和阉割后的胸腺内的BrdU+细胞比例的代表 性直方图图形(图4A)。在胸腺内的总体增殖比例中没有观察到差异，这 个比例随着年龄和阉割后仍为恒定(图4A和图4B的左侧图形)。但是， 看到了BrdU+细胞数目随年龄的显著减少(图4B，右侧图形)。在阉割后 2周时，BrdU+细胞数目增加到了在年轻成体(即2个月大)中所能看到 的相似的数目(图4B，右侧图形)。结果用每组4-14只小鼠的平均值±1SD 表示。***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大)的对照小鼠和阉割后2-6 周的小鼠比较。
图5A-H：阉割增强了所有胸腺细胞亚组内的增殖。对于这些研究， 将年老(2岁)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确 定增殖的水平。根据胸腺内的CD4和CD8表达进行对胸腺细胞的不同亚 组内的增殖的分析。图5A显示BrdU+细胞群内的每种胸腺细胞亚组的比 例不随年龄或阉割后而变化。但是，如图5B中所示，看到DN(CD4-CD8-) 胸腺细胞增殖的比例随年龄的显著减低。图5C显示没有看到在TN亚组 内的BrdU+细胞(即增殖细胞)的总体比例随年龄或阉割后变化。但是看 到在TN1(CD44+C25-CD3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的显著减低 (图5E)以及TN2(CD44+CD25+C3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的 显著增加(图5F)。阉割后恢复了这种变化(图5D-F)。结果用每组4-17 只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显著的)；***＝p≤0.001 (非常显著的)，与年轻成体(2个月大)小鼠比较。＾＝显著不同于阉割后 2-6周的小鼠(图5-H)。
图6A-C：阉割增加了衰老胸腺的T细胞的输出。对于这些研究，将 年老的(2岁大的)小鼠阉割并胸腺内注射FITC以确定胸腺的输出率。 在24小时后计算外周的FITC+细胞的数目。如图6A所示，观察到在24 个小时时段内在外周所检测到的新近胸腺迁出(RTE)细胞数目随年龄 的显著减少。阉割后，在阉割后2周时，这些数值已经显著提高。如图 6B所示，迁出率(输出/总体胸腺细胞密度)随年龄仍保持恒定，但是在 阉割后2周时有着显著的减低。看到了CD4+对CD8+RTE比值随年龄的 显著增加，在阉割后1周时达到正常化(图6C)。
结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显 著的)；***＝p≤0.001(非常显著的)，图6A为与年轻成体(2个月大)小 鼠比较以及图6B和6C为与所有的其他组的比较。＾＝p≤0.05与年老的(1 岁和2岁大的)非阉割小鼠比较以及与阉割后1周的年老小鼠比较。
图7A-B：阉割增强了T细胞耗竭后的胸腺细胞再生。将3个月大的 小鼠或用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰胺)处 理(图7A)，或将其暴露于亚致死照射(625Rad)中(图7B)。对于两种 所研究的T细胞耗竭的模型，与它们的假阉割的(ShCx)对等实验对象 比较，阉割的(Cx)小鼠表示出胸腺再活化率的显著增加。对T细胞耗 竭(TCD)后1周和2周时的总胸腺细胞数目的分析显示阉割显著地增加 了用环磷酰胺或亚致死照射处理后的胸腺再活化率(分别为图7A和 7B)。数据用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。对于图7A，***＝p≤ 0.001，与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较；＾＝p≤0.001，与两个 阉割小鼠组比较。对于图7B，***＝p≤0.001，与对照小鼠比较；＾＝p≤0.001， 在照射后1周时与处理前1周阉割的小鼠比较以及在照射后2周时与两 个阉割小鼠组比较。
图8A-B：环磷酰胺处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。对于 这些研究，利用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰 胺)耗竭(3个月大)小鼠的淋巴细胞并在与最后一次环磷酰胺注射的同 一天将小鼠手术阉割或假阉割。分离胸腺、脾和淋巴结(汇集的)并评价 总体细胞密度。与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较，在处理后1 和4周时，假阉割的小鼠的脾内具有显著更少的细胞数目(图8A)。在处 理后1周时，两个处理组的淋巴结内都观察到了细胞数目的显著减少(图 8B)。在处理后2周时，Cx小鼠比ShCx小鼠具有显著更高的淋巴结的细 胞数目(图8B)。每一条都代表每组7-17只小鼠的平均值±1SD。*＝p≤ 0.05；**＝p≤0.01；与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较。＾＝p≤0.05； 与阉割小鼠比较。
图9：在用一种化疗药物环磷酰胺处理以及同一天进行手术或化学阉 割之后的胸腺(空条)、脾(灰条)和淋巴结(黑条)的细胞数目的变化。 当在处理后1周和2周与非阉割(单用环磷酰胺)组比较时，注意到阉割 动物内的胸腺的快速扩增。另外，与单用环磷酰胺组比较，较大地增加 了阉割组的脾和淋巴结的细胞数目。(每个处理组和时间点的n＝3-4只)。 在环磷酰胺处理后的免疫系统的再生上，化学阉割与手术阉割相当。
图10A-C：在手术阉割1周之后的照射(625Rad)后的胸腺(图 10A)、脾(图10B)和淋巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研 究，用亚致死(625Rad)照射耗竭年轻(3个月大)小鼠的T细胞。在照 射前1周，小鼠被假阉割或阉割。观察到胸腺再活化随阉割的显著增加 (即更快的胸腺再活化率)(图10A)。当在处理后1周和2周与非阉割(单 用照射)组比较时，注意到了阉割动物中的胸腺的快速扩增。(每个处理 组和时间点的n＝3-4只)。没有看到脾(图10B)或淋巴结(图10C)的细 胞数目随阉割小鼠的差异。与对照小鼠比较，淋巴结细胞数目在处理后2 周仍是长期缓慢低下的(图10C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD 表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001，与对照 和阉割小鼠比较。
图11A-C：同一天照射及阉割后的胸腺(图11A)、脾(图11B)和淋 巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研究，用亚致死(625Rad)照 射耗竭年轻的(3个月大)小鼠的淋巴细胞。在与照射的同一天，小鼠或 被假阉割或被阉割。与假阉割的小鼠比较，阉割小鼠显示出明显更快的 胸腺再活化率(图11A)。当在处理后2周与非阉割组比较时，注意到了 阉割动物的胸腺的快速扩增。在阉割小鼠中没有看到脾(图11B)或淋巴 结(图11C)的细胞数目的差异。与对照小鼠比较，淋巴结的细胞数目在 处理后2周时仍是持续低下的(图11C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值 ±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001， 与对照和阉割小鼠比较。
图12A-B：照射处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。在亚致 死照射(625Rad)之前，3个月大的小鼠或被阉割或被假阉割。在处理后 1周时，脾(图12A)和(汇集的)淋巴结(图12B)内都有显著的严重的 淋巴细胞减少。在处理后2周时，脾的淋巴细胞数目恢复到了对照水平 (图12A)，而淋巴结的细胞密度仍显著低于对照(年龄匹配的，未处理的) 小鼠(图12B)。在处理组之间没有观察到差异。每栏都表示每组6-8只 小鼠的平均值±1SD。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与对照小鼠比较。
图13A-B：阉割恢复了对HSV-1免疫接种的应答性。用4×105pfu HSV 在后肢免疫接种小鼠。在感染后第5天，分析引流淋巴结(腘淋巴结)的 应答细胞。图13A显示了在用单纯疱疹病毒-1(HSV-1)爪垫免疫接种后 的淋巴结的细胞密度。与年老的非阉割组比较，注意到了年老的阉割后 小鼠内的细胞密度的增加。图13B表明了如FACS设门于CD25对CD8 细胞所测定的总活化细胞数目(即活化细胞被设门为CD8+CD25+细胞)。 对年老小鼠的阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的 CTL细胞。结果用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻 (2个月大)且阉割的小鼠比较。
图14A-C：在HSV-1接种后的活化LN(淋巴结)的CTL(细胞毒T 淋巴细胞)上的Vβ10的表达(HSV特异的)。尽管年老(即18个月大)小 鼠总体上都具有正常的Vβ10应答性，但是在一些小鼠中观察到了Vβ10 表达的完全缺失。显示了代表性的直方图图形。注意到年老小鼠的克隆 应答的减弱以及阉割后的预期应答的复原。
图15A-B：阉割增强了HSV-1感染后的活化。图15A显示了HSV-1 感染小鼠的LN内的活化(CD8+CD25+)细胞的代表性FACS图形。没有 看到活化CTL的比例随年龄或阉割后的差异。如所示的，对年老小鼠的 阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的CTL数目。结果 用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻(2个月大)且 阉割的小鼠比较。
图16：对HSV-1的免疫应答的特异性。从用HSV-1免疫接种的小鼠 中取出腘淋巴结细胞(在HSV-1感染后5天取出)，将其培养3天，然后 检查其裂解HSV肽激活EL4靶细胞的能力。用未免疫接种的小鼠作为裂 解的背景水平的对照进行CTL检测(如用51Cr释放所测定的)。在E∶T比 例为10∶1和3∶1时，年老小鼠都显示出显著减低(p≤0.01，**)的CTL 活性，说明淋巴结内所存在的特异性CTL百分比的减低。对年老小鼠的 阉割将CTL应答恢复到了年轻成体水平，因为阉割小鼠表现出与年轻成 体(2个月大)小鼠相当的对HSV-1的应答性。结果用8只小鼠的平均值， 三次重复试验±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻成体小鼠比较；＾＝与年老 的对照小鼠有着显著差异(当E∶T为3∶1时，p≤0.05；当E∶T为0.3∶1时， p≤0.01)。
图17A-B：对在对HSV-1的免疫应答中的VβTCR表达和CD4+T细 胞的分析。在HSV-1感染后5天取出腘淋巴结，并体外分析它的CD25、 CD8和特异的TCR Vβ标记物(图17A)的表达和CD4/CD8T细胞(图 17B)。在图17A中将或表达Vβ10或表达Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+ T细胞的百分比显示为每组8只小鼠的平均值±1SD。随着年龄或阉割后 没有观察到差异。但是，看到了静息LN群中的CD4/CD8比例随年龄的 减低(图17B)。阉割后恢复了这种减低。结果用每组8只小鼠的平均值 ±1SD表示，***＝p≤0.001，与年轻且阉割后小鼠比较。
图18A-D：在Ly5同系小鼠的BM移植(BMT)之后，阉割增强了 胸腺(图18A)、脾(图18B)和BM(图18D)的再生，但没有增强淋巴 结的再生(图18C)。在用C57/BL6Ly5.2+(CD45.2+)成体BM细胞(106 个细胞)移植前1天，将3个月大的、年轻成体的、C57/BL6 Ly5.1+ (CD45.1+)小鼠照射(6.25Gy)、阉割或假阉割。2周和4周后处死小鼠， 分析胸腺(图18A)、脾(图18B)、淋巴结(图18C)和BM(图18D)的 免疫重建。用抗CD45.2(Ly5.2)确定供者/宿主来源，该抗体只与供者来 源的白细胞反应。与假阉割小鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠 的胸腺内有着明显更多的供者细胞(图18A)。注意到在处理后的所有时 间点当与非阉割组比较时，都有阉割动物胸腺的快速扩增。与假阉割小 鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠的这些脾和BM内有着明显更 多的细胞(图18B和图18D)在BMT后2、4和6周时，淋巴结的细胞 密度之间没有显著差异(图18C)。当与非阉割动物比较，阉割小鼠具有 显著增多的同系(Ly5.2)细胞。数据用每组4-5只小鼠的平均值±1SD表 示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。
图19A-C：阉割增加了同系BMT后的BM及胸腺的细胞密度。如图 19A所示，在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM内有着明显更多的 细胞。到2周时，假阉割小鼠的骨髓细胞密度达到了未处理的对照水平 (1.5×107±1.5×106)。在同系BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM细胞 密度超过了对照水平。图19B显示在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的 胸腺内有着明显更多的细胞。在同系BMT后2周和4周时，假阉割小鼠 的胸膜细胞密度低于未处理的对照水平(7.6×107±5.2×106)。在同系BMT 和阉割后4周时，胸腺的细胞密度增加超过了对照水平。图19C显示了 在BMT后2周和4周时，脾的细胞密度没有显著差异。在2周时，假阉 割及阉割小鼠的脾细胞密度都已经达到了对照水平(8.5×107±1.1×107)。每 组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏表示阉割。
图20：阉割增加了同系BMT后的HSC比例。代表性的FACS点图 图解说明了c-kit(y轴)对sca-1(x轴)的表达。HSC为c-kithisca-1hi。在 BMT后2周和4周时，供者来源的HSC的比例在阉割后有了显著增加。
图21A-B：阉割增加了同系BMT后的HSC的比例和数目。如图21A 所示，在BMT后2周和4周时，HSC的比例在阉割后有了显著增加(*p＜ 0.05)。图21B显示了在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉 割小鼠的HSC数目有着显著增加(*p＜0.05；**p＜0.01)。每组都含有4 到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图22A-B：在BMT之后，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来 源的B细胞祖细胞和B细胞。如图22A所示，与假阉割对照比较，在阉 割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的CD45.1+B220+IgM-B细胞 祖细胞(*p＜0.05)。图22B显示了与假阉割对照比较，在阉割小鼠的BM 内有着显著更多的供者来源的B220+IgM+B细胞(*p＜0.05)。每组都含 有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图23：阉割不影响同系BMT后的供者来源的胸腺细胞比例。在假 阉割和阉割后2周时，有着供者来源的双阴性(CD45.1+CD4-CD8-)的早 期胸腺细胞比例的增加。在这个早期时间点上，只有非常少的供者来源 的(CD45.1+)CD4和CD8单阳性细胞。在BMT后4周时，假阉割和阉 割小鼠的供者来源的胸腺细胞值都与未处理的对照相似。
图24：阉割不增加同系BMT后的外周B细胞比例。在同系BMT后 2周和4周时，阉割和假阉割小鼠的脾B220表达之间没有差异。
图25：阉割不增加同系BMT后的外周B细胞数目。在BMT后2 周和4周时，没有B细胞数目的显著差异。在同系BMT后2周时，假阉 割和阉割小鼠的脾内的B细胞数目接近于未处理的对照水平 (5.0×107±4.5×106)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代 表阉割。
图26：增加了在BMT后的阉割小鼠中的供者来源的三阴性、双阳 性和CD4及CD8单阳性胸腺细胞的数目。图26A显示在BMT后2周和 4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的供者来源的三阴性 (CD45.1+CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。图26B显示 在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的 双阳性(CD45.1+CD4+CD8+)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。如图26C 所示，在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著 更多的CD4单阳性(CD45.1+CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05， **p＜0.01)。图26D显示在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较， 阉割小鼠有着显著更多的CD8单阳性(CD45.1+CD3+CD4-CD8+)胸腺 细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割； 实栏代表阉割。
图27：在同系BMT后2周和4周时只有非常少的供者来源的外周T 细胞。如图27A所示，在同系BMT后2周和4周时，在假阉割和阉割 小鼠的脾内都有着非常少的供者来源的CD4+和CD8+T细胞的比例。图 27B显示在BMT后2周和4周时的供者来源的T细胞数目之间没有显著 差异。同系BMT后4周时，与未处理的年龄匹配的对照(CD4+： 1.1×107±1.4×106，CD8+：6.0×106±1.0×105)比较，假阉割和阉割小鼠都有 着显著更少的CD4+和CD8+细胞。每组都含有4到5只动物。空栏代表 假阉割；实栏代表阉割。
图28：阉割增加了同系BMT后4周时的胸腺的供者来源的DC的数 目。如图28A所示，供者来源的DC为CD45.1+CD11c+MHCII+。图28B 显示在同系BMT后4周时阉割小鼠有着显著更多的供者来源的胸腺DC (*p＜0.05)。在同系BMT后2周时，树突状细胞数目为未处理时的对照 水平(1.4×105±2.8×104)。在同系BMT后4周时，阉割小鼠的树突状细胞 数目超过了对照水平。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实 栏代表阉割。
图29A-C：阉割增强了异基因HSCT受者的免疫细胞的重建。经致 死性照射(1300cGy)的CBA/J受者(3个月大)接受了B10.BR TCD BM (5×106)的移植。在移植前1天，受者被阉割或被假阉割。在第14、28 和42天以人道的方式处死动物，并评价了BM(图29A)、胸腺(图29B)和 脾(图29C)器官的细胞密度。*(p＜0.05)。每组含有4到5只动物。
图30A-C：阉割增强了异基因HSCT受者的供者来源的HSC和B细 胞。如图29所描述的移植阉割和假阉割的受者。如图30A所示，在HSCT 后14天时，在假阉割和阉割小鼠内都只有很少的供者来源的HSC (Ly9.1-Lin-Sca+c-kit+)；但是，到第28天时，阉割组的供者HSC数高出 了4倍。另外，如图30B-C所示，在阉割小鼠的BM(图30B)和脾(图 30C)中都有着显著更多的供者来源的B细胞。利用总的BM或脾细胞计 数及多色流式细胞术分析了中心和外周B细胞群。根据CD45R、IgM和 CD43的表达，将B细胞分为各个发育期：总B细胞(CD45R+)、原B(pro-B) 细胞(CD43+CD45R+IgM-)、前B(pre-B)细胞(CD43-CD45R+IgM-)、未 成熟B细胞(CD43-CD45R+IgM+)。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该 抗体只与宿主来源的白细胞反应。每组都含有4到5只动物。空栏代表 假阉割；实栏代表阉割。*(p＜0.05)表示与假阉割对照比较，阉割组的细 胞数目有着显著增加。
图31A-E：阉割增强了异基因HSCT受者的胸腺细胞和外周T细胞 的重建以及宿主及供者来源的DC的数目。如图29所描述的移植阉割和 假阉割小鼠。在第14、28和42天以人道的方式处死动物，并用总的胸 腺(图31A-F)和脾(图31G)的细胞计数和多色流式细胞术分析胸腺细 胞和T细胞群。DC被定义为CD11chiIa-Khi。图31A描述了TN (CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞的数目。图31B描述了DP(CD4+CD8+)胸腺 细胞的数目。图31C描述了CD4+(CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞的数目。 图31D描述了CD8+(CD3+CD4-CD8+)胸腺细胞的数目。如图31E所示， 与假阉割的对照受者比较，在异基因HSCT后14天和28天时，阉割受 者都有显著更多的宿主来源的DC。另外，如图31F所示，与假阉割的对 照比较，在异基因HSCT后28天时，阉割受者有着显著更多的供者来源 的DC。图31G描述了用抗CD3、抗CD4和抗CD8所识别出的外周T 细胞的数目。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该抗体只与宿主来源的白 细胞反应。供者CD4T细胞为Ly9.1-CD3+CD4+CD8-和供者CD8T细胞 为Ly9.1-CD3+CD4-CD8+。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割； 实栏代表阉割。*(p＜0.05)和**(p＜0.01)表示与假阉割对照比较，阉割 组的细胞数目有着显著增加。
图32A-G：阉割没有改变异基因HSCT后的供者来源的T细胞的功 能。如图29所示移植阉割和假阉割受者。在移植后42天测定T细胞功 能性。图32A显示了在异基因HSCT6周后的供者来源的T细胞 (CD3+CD4+和CD3+CD8+)的数目。图32B显示了阉割对异基因HSCT 后的T细胞的增殖能力没有影响。图32C显示了在MLR的异基因反应 性T细胞增殖上没有差异。将每个组(n＝5)的脾T细胞与经照射的 (20Gy)BALCB/c脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在96孔板中孵育5天， 并在培养的最后20个小时内加入[3H]-脱氧嘧啶脱氧核苷。图32D显示在 供者来源的T细胞的细胞裂解活性上没有差异。图32E显示了异基因反 应性T细胞的细胞内IFNγ的表达。在第42天，从如上所述的假阉割或 阉割的受者中收集脾B6T细胞，并将其与经照射的(20Gy)(BALCB/c 第三个部分)脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在24孔板中孵育5天。收集 细胞，并用TCD、经照射的(20Gy)(BALB/c或B10.BR生物学的内对照) 脾刺激细胞再刺激。在照射的第1个小时后加入Brefeldin A(10mg/mL)。 用流式细胞术分析测定供者来源的CD3+CD8+细胞的细胞内IFNγ的表 达。在图32E中显示了代表性曲线，并在图32F中图解显示了表达IFNγ 的供者来源的CD8+T细胞的百分比。图32G显示当小鼠在异基因HSCT 的同时被阉割时，T细胞的功能性在攻击后48小时的时候被显著地增强 了。在异基因HSCT后6周时，对假阉割和阉割小鼠进行DTH检测，并 通过右后爪垫减去左后爪垫肿胀测定出肿胀。空栏代表假阉割；实栏代 表阉割。
图33A-B：阉割没有加重异基因HSCT受者中的GVHD或减轻其中 的GVL。对于在图33A中所述的试验，经致死性照射(1300cGy)的(B6 ×C3H)F1受者(3个月大)接受B6TCD BM细胞(5×106)+脾细胞 (0.5×106)的移植。用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有 TCD-BM移植(无T细胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及 空方块代表阉割受者。每组都含有8只动物。对于在图33B中所描述的 试验，经致死性照射的、3个月大的B6D2F1/J受者接受了P815(H-2d)细 胞(1×103)、C57/BL6TCD BM细胞(5×106)及C57/BL6T细胞(5×105)。 用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有TCD-BM移植(无T细 胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及空方块代表阉割受者。 每组都含有8-9只动物。
图34A-I：阉割和IL-7治疗对异基因HSCT后的胸腺具有累加作用。 如图1所描述的移植阉割和假阉割受者。在第14天被处死的受者(图34A) 在第0天到13天还接受了经腹腔内注射的10g/天IL-7或PBS(对照)。在 第28天被处死的受者(图34B)在第21天到28天接受了10g/天IL-7或 PBS(对照)。从总的细胞计数中计算出胸腺的细胞密度。*(p＜0.05)代表 与假阉割对照比较时，阉割组的细胞数目有着显著的增加。对照：假阉 割的，注射PBS的受者；CX：阉割的、注射PBS的受者；IL-7：假阉割 的、注射IL-7的受者；以及IL-7&CX：阉割的、注射IL-7的受者。在异 基因HSCT和阉割后2周时，对整个BM进行半定量的RT-PCR。在比较 了来自阉割和假阉割小鼠的HPRT平衡模板的TGFβ1和KGF的表达(图 34C)之后。将KGF-/-和IL-/-小鼠阉割并在2周后分析胸腺、BM和脾的 细胞密度。图34D-F显示了来自KGF-/-小鼠的胸腺(图34D)、BM(图34E)、 脾(图34F)的结果。图34G-I显示了来自IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、BM (图34H)和脾(图34I)的结果。
图35：阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT 前1天将小鼠阉割。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同的时间点(2-6周)用流式 细胞术分析BM、脾和胸腺。如图35B所示，在阉割和HSCT 2周后，与 假阉割的对照比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地， 如图35C所示，与假阉割的对照比较，阉割小鼠的胸腺细胞在移植后2、 4和6周都有着显著增加。如图35C所示，阉割受者的外周的脾细胞数 目在移植后4和6周都明显高于对照。灰栏代表阉割受者。黑栏代表假 阉割对照。
图36A-B：阉割增强了同系HSCT后HSC在BM内的植入。在同系 HSCT前1天将小鼠阉割。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照 射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析 BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图36A)。与假阉割的对照比较，在BMT移 植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的HSC (图36B)。
图37A-B：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后HSC在BM 内的植入。在同系HSCT前1天将小鼠阉割。将2.5×106(图37A-B)和 5×106(图37C-D)Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的 C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析BM的 lin-c-kit+sca-1+HSC。图37A-D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的百分比。 与假阉割的对照比较，在BMT移植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内 都有着显著增加的供者来源的HSC的比例。
图38A-B：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的 DC在胸腺内的植入率。将5×106 Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析胸腺 细胞(图38A)。供者来源的DC被定义为CD45.1+CD11c+MHC II+CD11b+ 或- 。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的胸腺内有着 显著增加的供者来源的CD11b+和CD11b-DC(图38B)。
图39A-D：阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的B 细胞在脾内的植入率。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析脾细 胞(图39A-C)。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的 脾内有着显著更多的B220+B细胞(图39D)。
图40：分析进行抗前列腺癌的LHRH激动剂治疗的人类患者(所有 的都＞60岁)的外周血淋巴细胞的表型组成。在治疗前以及开始LHRH 激动剂治疗后4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总 淋巴细胞数目都在对照值的较低的一端。在治疗后，9例患者中的6例都 显示出总淋巴细胞计数的明显增加(在一些病例中观察到了总细胞数目 的加倍)。与此相关的是9例患者中6例都有总T细胞数目的增加。在CD4+ 亚组内，这种增加甚至是更为突出的，9例患者的8例都证实有CD4T 细胞水平的增加。在CD8+亚组内看到了这种较不突出的趋势，9例患者 的4例显示出水平的增加，虽然这种增加的程度要小于CD4+T细胞。
图41：对LHRH激动剂治疗前后的人类患者的血液的分析证实在T 细胞、CD4细胞或CD8T细胞的总比例上没有明显变化，以及CD4∶CD8 的比例在治疗后的不同的变化。这说明了尽管在治疗后明显增加了总的T 细胞数目，但是治疗对T细胞亚组的稳态维持只有很小的影响。所有的 数值都与对照值相当。
图42：对进行LHRH激动剂治疗的人类患者的外周血内的B细胞和 髓细胞(NK、NKT和巨噬细胞)的比例分析证实了亚组内的不同程度的 变化。虽然NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，但是9 例患者中的4例出现了B细胞比例的减少。
图43：对治疗后的人类患者的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目 的分析清楚地显示了治疗后NK(9例患者中的4例)、NKT(9例患者中的 4例)和巨噬细胞(9例患者中的3例)的水平的增加。B细胞数目没有 显示出明显的趋势，9例患者中的2例显示出水平的增加；9例患者中的 4例显示没有变化以及9例中的3例显示水平的减低。
图44A-B：人类的化学阉割增强了原初和记忆T细胞。如图44A所 示，在LHRH-A治疗后观察到了原初(CD62L+CD45RA+CD45RO-) CD4+T细胞的显著增加。如图44B所示，在LHRH激动剂治疗后增强 了原初和记忆(CD62L-CD45RA-CD45RO+)CD8+T细胞的数目。每栏都 代表16例患者的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与治疗前数 值比较。
图45A-B：人类的化学阉割增强了外周血淋巴细胞数目。分析了进 行作为前列腺癌的常规治疗的一部分的LHRH-A化学阉割的人类患者 (所有都＞60岁)的外周血的表型组成。在治疗前和治疗4个月时分析患 者。如图45A所示，在LHRH-A治疗后，显著地增加了每μl外周血的总 淋巴细胞数目。总T细胞、CD4+和CD8+T细胞的显著增加反映了这一 点(图45B)。
图46A-B：LHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮，并增加了胸腺功 能和T细胞输出。在图46A的试验中，用LHRH-A治疗前列腺癌患者4 个月。在治疗前和LHRH-A治疗4个月后都用FACS分析血液以及用RIA 分析血清。如图83A所示，在LHRH-A治疗4个月时，在患者的血清中 没有检测到睾酮。栏代表所分析的13例患者的平均值。在图46B的试验 中，在分析10例患者的TREC水平之后，发现了胸腺功能和T细胞输出 增加的直接证据。在CD4+和CD8+T细胞群内，到LHRH-A治疗4个月 时，10例患者中的5例都显示出绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超 过最初测定值的＞25％)。这一点也被反映于比例的增加(每1×105细胞； 数据没有显示)。与之相关的是10例患者中的6例都显示出总TREC水 平的总体增加。仅有1例患者显示出总TREC的减少(约30％的减少)。
图47：人类的化学阉割增强了NK数目。在LHRH-A治疗之前以及 治疗4个月时进行分析。观察到了NK细胞但不是B细胞随LHRH-A治 疗的显著增加。结果用13例患者的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与治 疗前数值比较。
图48A-B：人类的化学阉割没有增加T细胞的增殖。图48A-B描述 了利用Ki-67抗原检测所进行的对细胞增殖的分析。在所有患者中， LHRH-A治疗都没有改变所有CD4+(图48A)和CD8+T细胞(图48B) 的原初、活化和记忆细胞亚组内的增殖水平。
图49A-C：对对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间 点的自然杀伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在对照 的异基因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反，在HSCT前3 周给予LHRH-A治疗的异基因患者在移植后14天到5个月都显示出了显 著更高的NKT细胞的数目(图49C；数据用6-20例患者的平均值±1SEM 表示，**＝p≤0.05)。
图50：对对照患者在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35 天)的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期恢复， 主要见于移植后早期的CD8+群，这提示胸腺以外的再生途径。在移植后 1个月，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51A-B：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的B细胞重建。如图51B所示，与异基因患者比较，自体移植患者的 B细胞重建发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月， 两组中恢复到对照值(阴影)都不明显。
图52A-B：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的CD4+细胞重建。虽然B细胞数目在移植后6个月时恢复到了对照值 (见图48A-B)，但是甚至在移植后12个月时，自体(图52B)和异基因(图 52A)受者的CD4+T细胞都仍是严重减低的。
图53A-C：对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT 后的CD8+细胞重建。如图52A-B所示，在异基因和自体受者中，CD8+T 细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53所示，如TCRγδ+T 细胞、CD8ααT细胞和CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样，CD8+T 细胞主要是胸腺外来源的。
图54A-B：利用标记物Ki-67对对照患者在HSCT之前(图54A)和 之后28天(图54B)的CD4+和CD8+T细胞的不同群的增殖的FACS分 析。利用标记物CD45RO和CD27根据原初、记忆的和活化的表型分析 细胞。大部分增殖都发生在CD8+T细胞亚组，这还提示这些细胞是胸腺 外起源的以及增殖优势发生在外周T细胞亚组内。
图55A-D：对照患者和LHRH-A治疗的患者在HSCT后的不同时间 点的原初CD4+T细胞的再生。图55A描述了对对照(未LHRH-A治疗) 患者的原初CD4+T细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析， 并显示这些细胞在整个研究期间的严重缺失。如图55B-C所示，自体移 植患者直到HSCT后12个月，对照患者的原初CD4+T细胞才开始再生 (图55C)，但仍明显低于异基因对照患者的对照值(图55B)。这些结果说 明因为患者的年龄，对照患者的胸腺在移植后不能恢复足够数目的原初T 细胞。相反，在异基因HSCT前3周给予LHRH-A的患者在移植后9个 月和12个月都比对照显示出显著更高的数目(图55D)。这说明性类固醇 清除治疗增强了胸腺依赖性T细胞途径的再生。数据用6-20例患者的 ±1SEM表示，**＝p≤0.05。
图56A-D：对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间点 (1-12个月)的TREC水平。对TREC(仅见于新近胸腺迁出(RTE))水平 的分析强调了异基因(图52A)和自体(图52B)移植患者的胸腺在移植 后恢复水平的能力。这都是因为患者的年龄以及胸腺萎缩所造成的胸腺 功能的缺失，这与这些患者的发病率和死亡率都明显相关。相反，当在 异基因移植前用LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干细胞移植的患者 表现出CD4+TREC+细胞/ml血液的显著增加(移植后9个月与对照(未 LHRH-A治疗)比较，p≤0.01)。接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植 后9个月(图56C)时显示出比对照显著更高数目的CD4+TREC细胞/ml 血液。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月时也显示出显著更高 的水平(图56D)。这说明性类固醇清除治疗增强了胸腺的再生。数据用 5-18例患者的±1SEM表示，**＝p≤0.01。
图57A-C：LHRH-A给药增强了异基因(图57A-B)和自体(图57C) HSCT后对TCR特异刺激的应答性。在HSCT前3周，给予患者LHRH-A。 没有接受激动剂的患者被用作为对照患者。在移植后的不同时间点(1-12 个月)，用5μg抗CD3和10μg抗CD28交联进行对TCR特异刺激的分析。 如图57A-B所示，异基因LHRH-A治疗的患者在除了6个月和9个月(因 为此时所分析的患者数目少)的所有时间点都显示出比对照患者更强的 增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定的)。在移植后6个月和9 个月时，对照患者有着与治疗前数值相似的应答性。但是，在所有的其 他时间点上，它们都是明显更低的。相反，与治疗前比较，LHRH-A治 疗的患者在除6个月以外的所有时间点上都有着相等的应答性。LHRH-A 治疗的患者在一周后1、3和4个月都显示出比对照患者更强的增殖应答 (如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这说明了直接的外周T细胞作用 的贡献，因为直到移植后1-2个月，新的CD4+T细胞都是不明显的(图 57B；数据用5-12例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05；**＝p≤0.01)。 如图57C所示，自体LHRH-A治疗的患者在除5个月外的所有时间点都 显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定 的)。在移植后12个月时，观察到了对照和LHRH-A治疗的患者都恢复 到了治疗前的值。
图58A-B：LHRH-A给药增强了异基因HSCT后对PWM和TT有丝 分裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有 接受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(PWM) 或破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分 裂原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在所有 的时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图58A)和TT(图58B)的 应答性。
图59A-B：LHRH-A给药增强了自体HSCT后对PWM和TT有丝分 裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有接 受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(PWM)或 破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分裂 原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在大多数 时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图59A)和TT(图59B)的应 答性(3个月时p≤0.001)。到了移植后12个月时，LHRH-A治疗的患者 有着恢复了的应答性。
图60A-D：LHRH-A治疗增强了自体HSCT患者中的植入的速度。 在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图60A、C和D)。将没有接受 激动剂的患者用作为对照患者(图60B)。在移植后第14、28和35天测 定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图60A所示， 接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第14天显示出比对照(图60B) 显著更高的WBC数目(p≤0.05)。在这个时间点上，比较于对照的45％， 87％显示出粒细胞的植入(≥500个细胞/μl血液)。接受LHRH-A治疗的 自体患者在移植后第10-12天也比对照显示出显著更高的中性粒细胞的 数目(图60C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05)。 另外，尽管是不显著的，但是LHRH-A治疗的自体患者在所有时间点上 都比对照组有着更高的淋巴细胞计数(图60D)。
图61A-D：LHRH-A治疗增强了异基因HSCT患者中的植入的速度。 在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图61A、C和D)。将没有接受 激动剂的患者用作为对照患者(图61B)。在移植后第14、28和35天测 定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图61A所示， 接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后第14天显示出比对照(图61B) 显著更高的WBC数目(p≤0.05)，在这个时间点上有着87％显示出粒细 胞的植入(≥500个细胞/μl血液)，比较于对照的44％。接受LHRH-A治 疗的异基因患者在移植后第9、12&19天也比对照显示出显著更高的中性 粒细胞的数目(图61C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤ 0.05)。另外，对进行外周血干细胞移植的患者的分析证实当在异基因移 植前用LHRH-A治疗时淋巴细胞计数的显著增加(在移植后10、12、13 和17-21天时，p≤0.05)(图61D)。
图62A-F：在阉割的1周内增强了TCR特异性外周T细胞增殖应答。 将8周大的小鼠阉割并在手术后第3天(图61A、C和E)和第7天(图 62B、D和F)分析抗CD3/抗CD28刺激的T细胞增殖应答。用不同浓度 的抗CD3刺激以及用恒定浓度的10μg/ml抗CD28共刺激外周(颈部、 腋下、肱和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和D) 和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用脉冲量的氚化胸腺嘧啶处理细 胞18个小时并根据3H-T掺入测定增殖。棱形表示阉割动物，方块表示 假阉割对照动物，n＝4，*p≤0.05(非参数的、非配对的、Mann-Whitney 统计检验)。
图63：LHRH-A给药增强了慢性癌症受害者治疗后对TCR特异性刺 激的应答性。用LHRH-A治疗慢性恶性肿瘤患者。在LHRH-A给药后的 不同时间点(第7-12个月)用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性 刺激的分析。LHRH-A治疗的患者显示出比治疗前水平更强的周期式的 增殖应答(用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这反映了每月长效注射 的激动剂的给药。这些结果说明对外周T细胞的直接影响。但是，在治 疗后12个月时所看到的增强的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因 为从4个月开始就停止了所有患者的激动剂的给药。
图64是显示当60％假手术的小鼠患有糖尿病，而阉割组的少于20％ 患者患有糖尿病的线性图。
图65是显示阉割的NOD小鼠的总胸腺细胞数目有着明显增多，而 总的脾细胞没有差异的条形图。
图66A-C是显示阉割的NOD小鼠的所有胸腺细胞亚型都有着显著 增加(图66A)。与假阉割的NOD小鼠(图66C)比较，B细胞以及脾的总T 或B细胞都没有变化(图66B)。
图67A和67B显示了阉割的NZB小鼠的总的胸腺细胞(图67A)和脾 细胞(图68B)的明显增加。
图68是显示已经被阉割并免疫接种的小鼠比对照有着减低了的肿瘤 发病率的图。
图69A-C是显示阉割并免疫接种的小鼠比对照有着增加了的脾的细 胞密度的条形图。
图70A-B是显示已经阉割并免疫接种的小鼠比对照有着增加了的 γIFN生成的图。
图71A-B是显示阉割并免疫接种的小鼠表现出比对照更强的抗原特 异性CTL应答的图。
图72A-E显示胸腺切除没有影响性类固醇抑制/BMT对BM的普通 淋巴祖细胞(图72A)、总的BM B细胞(图72B)、BM的未成熟的B细胞(图 64C)、脾的总细胞数目(图72D)或对脾脏的总B细胞(图72E)的作用。
具体实施方式
在此所引用的专利和科学文献构成了本领域人员所能获得的知识。 在此所引用的已公开的美国、申请、已出版的外国申请和参考文献，包 括基因库序列的全部内容都被以相同的程度一同并入作为参考，如同每 个都被具体地和个别地指出在此并入作为参考。
本发明包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活化 的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加BM功 能性的方法。“增加BM功能”和“增强BM功能性”在此被定义为BM 的免疫细胞包括前体细胞例如HSC(以及因此增加了血细胞)的产量和/ 或输出的提高，包括造血作用的提高和/或HSCT后植入的增强。输出的 提高可以包括但不限于，提高的动员免疫细胞包括HSC到外周或到靶组 织特别是免疫或受损组织)的能力。在一个实施方式中，提高了HSC的 造血作用。在另一个实施方式中，提高了HSC的输出。在特定的实施方 式中，增加了血和/或免疫细胞的数目。仍在另一个实施方式中，提高了 HSCT后的HSC的植入。在另一个实施方式中，提高了HSC动员到外周 或入巢到靶组织。仍在另一个实施方式中，提高了增殖能力和/或分化为 造血或非造血的子代的能力。
本发明也包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活 化的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加T细 胞和其他免疫细胞的能力的方法。术语“免疫细胞”和“免疫系统的细 胞”在此可被互换使用，并在此被定义为HSC、T细胞、B细胞、DC、 和/或其他血细胞，包括但不限于HSC子代、CLP、MLP、淋巴细胞、髓 细胞、中性粒细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK、NKT、 血小板、红细胞、单核细胞、巨噬细胞、原初T细胞、和上面所提及的 前体细胞。细胞可以是或可以不是外周的，可在BM、血液、脾、淋巴结、 胸腺、粘膜、皮肤或其他组织的任何一或多种组织中发现这些细胞。
免疫细胞的“增加的功能性”或“增强的功能性”是指当与没有性 类固醇去除所通常预期的免疫应答比较时，免疫细胞能提供更多的所需 的免疫应答。在一种情况中，免疫细胞是T细胞。在其他实例中，免疫 细胞是B细胞、DC和/或HSC。“增加的功能性”包括但不限于提高的对 靶细胞的杀伤、增加的淋巴细胞增殖应答、提高的信号转导能力、提高 的入巢能力、提高的APC活化、增加的受体、细胞粘附分子或共刺激分 子的水平或活性、减低的凋亡、增加的细胞因子、白介素和其他生长因 子的释放、增加的血浆的抗体水平以及增加的血液和全身的天然免疫力 (例如自然杀伤(NK)细胞、DC、中性粒细胞、巨噬细胞等)的水平。每 一种都可以直接或间接地有助于抗击疾病和感染，据此增加对例如各种 外来病原体的感染的应答性、抗性、治疗和预防，以及增加对疫苗的免 疫应答。
本发明还包括用于预防患者的病变或疾病、减少患者的病变或疾病 的危险或治疗患者的病变或疾病的方法。在一个具体实施方案中，疾病 是T细胞疾病。在另一个具体实施方案中，疾病是一种自身免疫性疾病 或过敏。另外，本说明书还提供了用于通过阻断性类固醇介导的信号途 径以及引起胸腺再活化提高患者对疫苗抗原(例如一种病因的疫苗抗原) 的免疫应答的方法。在两种情况中，都可以提高并都可以通过定量地和 定性地恢复外周T细胞池特别是在原初T细胞的水平上实现外周T细胞 的功能状态。然后这些原初T细胞能以更大的程度应答于所存在的外来 抗原。
如上所述，衰老(青春期后)的胸腺造成身体的免疫细胞以低于峰值 水平(例如可见于年轻的、青春期前胸腺)的水平工作。“青春期后”在 此被定义为胸腺已经达到明显萎缩的时期。在人类，这发生在约20-25 岁，但在一个给定的个体中，这可以发生得更早或更晚。“青春期”在此 被定义为期间胸腺开始萎缩的时期，但可以是在胸腺完全萎缩之前。在 人类，这发生开始于10-20岁，但在一个所给定的个体中，这可以发生得 更早或更晚。“青春期前”在此被定义为先于个体中的性类固醇增加的时 期。在人类，这发生在约0-10岁，但在一个所给定的个体中，这可以发 生得更早或更晚。
术语“接种”、“疫苗接种”、“疫苗”、“免疫”、“免疫接种”在此定 义为给患者施用一种引发对抗原的免疫应答的制剂。疫苗可以包括预防 性和治疗性疫苗。如本领域人员所理解的那样，例如病毒或其他病原体 的感染也是一种接种个体的方法。
术语“提高”、“增强”或“增加”患者的“疫苗应答”或“疫苗应 答性”或“提高”、“增强”或“增加”“患者对疫苗的免疫应答性”以及 其他的相似的语句都可以互换使用，并在此被定义为意味着与在没有阻 断性类固醇信号途径的患者中已经发生的免疫应答比较，患者对疫苗或 疫苗抗原的免疫应答被提高了。
“病变”和“疾病”可互换使用并在此被定义为其中免疫应答、防 御或经修饰的免疫细胞将对患者是有益的任何疾病、感染或医学病变(有 症状的或无症状的)。病变可以由感染性病因、癌症、药物治疗(例如化疗)、 照射、化学中毒、遗传缺陷或其他病症所造成的。
如在此所定义的，疾病的“预防”或“预防”疾病在此被定义为完 全和部分的保护，包括但不限定于患者将会发生的临床症状的严重度的 减轻。具有提高了的或修饰了的免疫系统的个体将会减少死于或患有肿 瘤或癌症、过敏、自身免疫性疾病、传染性感染(例如，病毒、细菌、真 菌或寄生虫)或病变的可能性，和/或将表现出对疫苗接种的更好的应答 (例如增加了对疫苗或抗原特异性抗体(Ab)的水平以及效应T细胞的发 生)。通过激活或修饰免疫防御机制以抑制或减少临床症状的发生例如达 到仅仅需要减少了的或最少医学治疗的程度即可以预防病变。预防感染 也包括机体防御感染性病因例如病毒、细菌、寄生虫、真菌等或防御非 感染性病因。这可以有预防这些病因进入身体内的细胞和/或广泛的免疫 系统的细胞(例如NK、DC、巨噬细胞、中性粒细胞等)有效地清除病因的 形式。在一些情况中，没有实现对病变的完全预防，取而代之的是实现 了部分预防，其中更强的、更有力的或更有效的免疫系统将有助于机体 减少病变的程度、严重度和持续时间或病变的临床症状或恢复时间或延 迟临床症状的出现。
病变的“治疗”包括完全地或部分地减轻患者的病变的症状，当与 没有性类固醇去除或阻断性类固醇介导的信号途径的患者将会发生的那 些症状比较时。通过激活免疫防御机制以抑制、延迟或减少临床症状的 发生，可以发生对病变的治疗。在一个实例中，患者已经接触了病因或 有接触病因的高危。
已经提高了对新的(预防)或已有的(治疗)病变的应答、更好地应答或 克服的能力包括提高机体的免疫系统，这包括增加BM细胞和/或胸腺来 源的因子的数目和/或功能性，和/或增加免疫细胞的数目和功能性。免疫 系统的活化也增加了能应答于相关病因的抗原的淋巴细胞的数目，这导 致了抗原和/或外来病因的消除(完全或部分)，形成了宿主被治疗或耐受 感染或疾病的状态。具有提高了的或修饰了的免疫系统的个体将会减少 死于或患有肿瘤或癌症、过敏、自身免疫性疾病、传染性感染(例如，病 毒、细菌、真菌或寄生虫)或病变的可能性，和/或将表现出对疫苗接种的 更好的应答(例如增加了对疫苗或抗原特异性抗体(Ab)的水平以及效应T 细胞的发育)。
年老小鼠对人单纯疱疹病毒感染的显著提高举例说明了这种免疫防 御的增加(见实施例3，和图13-17)。阉割的年老小鼠最初显示出淋巴细 胞对引流淋巴结的浸润的明显增多。这种浸润是免疫应答的第一步，并 且通常是增加抗原特异性淋巴细胞与抗原接触的可能性所必需的。下一 步是抗原对淋巴细胞的活化及Ab和/或CTL的发育以及淋巴细胞的细胞 因子的释放，所有的这些联合在一起消灭病因。
“感染性病因”、“外来病因”和“病因”可被互换使用，并包括个 体的疾病或病变的任何原因。病因包括但不限定于病毒、细菌、真菌、 寄生虫、朊病毒、癌症、癌前细胞、化学或生物学毒素、过敏原、诱发 哮喘的病因、造成自身免疫性疾病的自身蛋白和抗原等等。
在一种情况中，病因是一种病毒、细菌、真菌或寄生虫，例如来自 人乳头状瘤病毒(HPV)的包膜蛋白，它可引起子宫颈癌；或流感肽(例如 血凝素(HA)、核蛋白(NP)或神经氨酸苷酶。
感染性病毒的非限制性的实例包括：逆转录病毒(例如，人类免疫缺 陷病毒，如HIV-1(也被叫做HTLV-E、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III) 和其他分离物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、 A型肝炎病毒、肠病毒、人柯莎奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；Calciviridae (例如引起胃肠炎的病毒株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)； 黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例 如冠状病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒)；弹状病毒科(例如疱疹 性口炎病毒、狂犬病病毒)、纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科 (例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)； 正粘病毒科(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如汉坦病毒、bunga病毒、 白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例 如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒 科(例如B型肝炎病毒)；微小病毒科(微小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科 (乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(绝大多数腺病毒)；疱疹病毒科(例 如单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、 疱疹病毒)；痘病毒科(例如，类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩 病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分型的病毒(例如海绵状脑病的致病 病因、丁型病毒性肝炎的病因(认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的随体)、 非甲非乙型病毒性肝炎的病因(1型＝内传播的；2型＝非肠内传播的(即丙 型病毒性肝炎)、诺沃克和相关病毒、及星状病毒)。
感染性细菌的非限制性实例包括：幽门螺旋杆菌、伯氏螺旋体、肺 炎军团菌、分枝杆菌子孢子(sporozoites)(例如，结核分枝杆菌、鸟型分枝 杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌)、金黄色葡萄 球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性 链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪 链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌属)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌、 肠球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆菌子孢子、 猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、 肺炎克雷伯杆菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链 杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、钩端螺旋体、和衣氏放线菌 (Actinomyces israelli)。
感染性真菌的非限制性实例包括：新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、 粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌。
其他感染性有机体(即原生生物)包括但不限定于恶性疟原虫和鼠弓 形体。
在其他具体实施方案中，病因是一种过敏原。过敏性病变包括但不 限定于湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、花粉热、风疹(荨麻疹)、和食物过敏以 及其他的特应性病变。
仍在另一个具体实施方案中，病因是一种癌症或肿瘤。癌症或肿瘤 可以是恶性的或非恶性的。在此所用的肿瘤或癌症包括例如，脑部、肺 部(例如小细胞的和非小细胞的)和胸膜、妇科、泌尿生殖道和内分泌细胞 (例如子宫颈、子宫、内膜、膀胱、肾脏、卵巢、乳腺和/或前列腺)、胃 肠道(例如，肛门、胆道、类癌、胆囊、胃的或胃、肝、食道、胰腺、直 肠、小肠和/或结肠)、以及其他的癌、和骨、皮肤和结缔组织(例如，黑 素瘤和/或肉瘤)、和/或血液系统(例如，血液、骨髓增生异常综合征、骨 髓增生性疾病、浆细胞肿瘤、淋巴瘤和/或白血病)的肿瘤。
本发明可被用于任何具有性类固醇驱动的成熟和免疫系统的动物物 种(包括人)，例如哺乳动物和有袋类动物。在一些实例中，发明被用于 大型哺乳动物例如人。
术语胸腺“再生”、“再活化”和“重建”以及它们的衍生物在此可 以互换使用，以及在此被定义为萎缩的或受损的(例如被化学物、照射、 移植物抗宿主病、感染、遗传倾向)胸腺恢复到它的活化状态。“活化状 态”在此被定义为意思是其中性类固醇激素介导的信号途径已经被阻断 的患者的胸腺所完成的T细胞输出是青春期前胸腺(没有到达青春期的 患者的胸腺)的输出的至少10％、或至少20％、或至少40％、或至少60％、 或至少80％、或至少90％。
“受者”、“患者”和“宿主”在此可被互换使用，以及在此被定义 为接受性类固醇去除治疗和/或阻断性类固醇介导的信号途径的治疗的对 象，在适当的时候，为接受了HSC移植的对象。“供者”在此被定义为 移植的来源，它可以是同基因的、异基因的或异种的。在一些情况中， 患者可以提供用于在晚些的时间点上被移植到患者内的例如他的或她的 自体细胞。可以使用异基因SHC移植物，以及这些异基因移植物是发生 在同一物种的不匹配成员之间的移植物，而在异种HSC移植物中，供者 和受者是不同物种的。也可以使用匹配动物之间的同基因HSC移植物。 参照于HSC移植物的术语“匹配的”、“不匹配的”、“错配的”和“不完 全一致的”在此被定义为供者和受者的MHC和/或次要组织相容性标记 物是相同的(匹配的)或不是(不匹配的、错配的和不完全一致的)相同 的。
在本说明书的全文中，术语“包括”和“包含”将被理解为意思是 包含所述的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组，但不排 除其他任何的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组。
性类固醇介导的信号途径的阻断
本发明还提供了阻断患者的性类固醇介导的信号途径的方法，其中 患者的胸腺随后可以被或不被再活化。另外，本发明提供了提高患者的 免疫细胞(例如T细胞)的功能状态的方法。就T细胞而言，胸腺开始 增加早期前体细胞(CD3-CD4-CD8-细胞)的增殖速度并将它们转化为 CD4+CD8+以及随后的新的成熟的CD3hiCD4+CD8-(T辅助(Th)淋巴细 胞)或CD3hiCD4-CD8+(细胞毒T淋巴细胞(CTL))。复活的胸腺也增加 了其对血流中的HSC、或其他干细胞或能形成T细胞的前体细胞的摄取， 并将它们转化为新的T细胞和胸腺内DC。所增加的胸腺的活性在很多方 面都类似于在正常的更年轻的胸腺(例如青春期前)中所发现的活性。这 种更新的胸腺输出的结果增加了血液中的原初T细胞(那些还没有遇到 过抗原的T细胞)的水平。这也增加了外周T细胞对刺激例如通过与抗 CD28Ab的交联、或通过用例如抗CD3抗体的TCR刺激、或有丝分裂 原例如美洲商陆有丝分裂原(PWM)的刺激的应答的能力，并且这种增 加的T细胞应答性可以发生在胸腺再活化之前，例如2、3、4、5、6、7、 14或21天内。这种事件的组合物造成机体变得能更好地防御感染和其他 的免疫系统的攻击(例如癌症)，或从免疫系统攻击中恢复(例如，变得能 更好地从化疗和放疗中恢复)。因此，本发明的方法可以被用于预防或治 疗病变或疾病，增加患者对疫苗的免疫应答性以及任选用于基因治疗。
如在此所用的，“性类固醇清除”、“性类固醇介导的信号途径的抑 制”、“性类固醇阻断”、性类固醇信号途径的中断”和其他相似的术语在 此被定义为至少部分阻断性类固醇(和/或其他激素的)的产生和/或性类 固醇(和/或其他激素的)信号途径，无论是直接或间接的作用。在一个 实施方式中，中断了到胸腺的性类固醇信号途径。容易理解的是，用本 领域人员熟知的各种方法可以阻断性类固醇介导的信号途径，在此描述 了一些方法。例如，对性激素产生的抑制或阻断一或多种性激素受体将 达到所需的阻断，如施与性类固醇激动剂和/或激动剂，或主动的(抗原) 或被动的(抗体)抗性类固醇接种。
一种非限制性的用于形成性类固醇介导的信号途径的阻断的方法是 通过阉割。用于阉割的方法包括但不限于化学阉割和手术阉割。
“阉割”在此被定义为性类固醇产生、活性和/或体内的分布的减少 或消除。这最终有效地将患者恢复到青春期前状态，此时胸腺比阉割前 即刻是更为有功能的。手术阉割去除了患者的性腺。用于手术阉割的方 法对于受常规训练的兽医和医生都是熟知的。在下面的实施例中描述了 用于阉割雄性动物的一种非限制性的方法。其他用于阉割人类患者的非 限制性的方法包括子宫切除术或卵巢切除术操作(阉割女性)和手术阉 割去除睾丸(阉割男性)。在一些临床病例中，经物理阉割永久地去除性 腺可能是合适的。
化学阉割是一种较不永久的阉割形式。如在此所定义的，“化学阉割” 是施与一种化学物一段时间，造成了性类固醇产生、作用和/体内分布的 减少或消除。多种化学物能以这种方式发挥作用。这些化学物的非限制 性实例是性类固醇抑制物和/或下面所描述的类似物。在给予化学物期间 和在给予一段时间之后，患者的激素产生可以被停止或减少。终止化学 物的给予或通过给予相关的性激素可以逆转阉割。
术语“性类固醇类似物”、“性类固醇清除剂”、“性类固醇抑制剂”、 “性类固醇信号途径的抑制剂”、“性类固醇信号途径的修饰剂”和其他 相似的术语在此被定义为任何一或多种能减少、阻断、预防或终止性类 固醇(和/或其他激素)介导的信号途径的药用试剂。GnRH(在此也被叫 做LHRH或GnRH/LHRH)和它们的类似物是在本申请书的全文中所用 的性类固醇信号途径的抑制剂的非限制性的实例。然而，本领域人员容 易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可以用多种替代的性类固醇 抑制剂或类似物中(或其他阻断剂或物理阉割)的任何一种(或多种)替 代在此所描述的GnRH/LKRH或它们的类似物，而不需要过多的试验。
任何可以阻断性类固醇或阻断性类固醇介导的信号途径的药物或其 他的阉割方法都可以被用于本发明的方法。例如，抑制性类固醇信号途 径、再活化胸腺和/或增强BM和免疫细胞的功能性的一个非限制性方法 是通过修饰GnRH对垂体的正常作用(即释放促性腺激素，FSH和LH) 并最终减少性腺产生或释放正常的性类固醇。因此，在一种情况中，性 类固醇清除是通过施与一或多种性激素类似物例如GnRH类似物实现的。 GnRH是一种刺激垂体分泌促性性腺激素，促黄体激素(LH)和促卵泡激 素(FSH)的下丘脑的十肽。因此，GnRH激动剂(例如Synarel_或 Lupron_的形式)最初造成受体的过度刺激并经反馈机制通过LHRH受 体的失敏将抑制垂体生成FSH和LH。这些促性腺激素正常地作用于性 腺以释放性类固醇，特别是女性的雌激素和男性的睾酮，FSH和LH的 缺失显著地减少了这些性激素的释放。它的直接结果是性类固醇的血浆 水平的下降以及因此对胸腺的抑制信号的逐步释放。例如通过使用GnRH 拮抗剂可以实现循环的性类固醇水平的更快速的下降。
在一些实施方式中，通过施与性类固醇类似物例如促黄体激素释放 激素(LHRH)的类似物阻断了性类固醇介导的信号途径。性类固醇类似 物和它们在治疗及化学阉割中的应用是熟知的。性类固醇类似物是产品 化的以及它们在治疗和化学阉割上的应用是熟知的。这些类似物包括但 不限于，下面的LHRH受体(LHRH-R)的激动剂：布舍瑞林(例如醋酸 布舍瑞林，商品名Suprefact_(例如0.5-02mg/天，皮下用)，Suprefact Depot_、和Suprefact_喷鼻剂(例如2μg/鼻孔，每8小时)，Hoechst，也 被描述于美国No.4,003,884、4,118,483和4,275,001)、Cystorelin_(例如 双乙酸促性腺激素四水化合物，Hoechst)、地洛瑞林(例如，醋酸地洛瑞 林，Deslorell_，Balance Pharmaceuticals)、戈那瑞林(例如，盐酸戈那瑞 林，商品名Factrel_(100μg静脉或皮下用)，Ayerst Laboratories)、戈舍瑞 林(醋酸戈舍瑞林，商品名Zoladex_，AstraZeneca，Aukland，NZ，也被 描述于描述于美国No.4,100,274和4,128,638、GB 9112859和GB 9112825)、组氨瑞林(例如，醋酸组氨瑞林，Supprelin_(皮下10μg/kg/d)， Ortho，也被描述于EP 217659)、亮丙瑞林(leuprolide)(亮丙利德，商品 名Lupron_，或Lupron Depot_，Abbott/TAP，Lake Forest，IL，也被描 述于美国No.4,490,291、3,972,859、4,008,209、4,992,421、和4,005,063、 DE 2509783)、亮丙瑞林(leuprorelin)(例如，亮丙利德，商品名Prostap SR_(例如，每月单次剂量3.75mg皮下或肌注)、Prostap3_(例如每3个 月单次剂量11.25mg皮下)，Wyeth，USA，也被描述于Plosker et al.，(1994) Drugs 48：930)、黄体瑞林(Wyeth，USA，也被描述于美国No.4,089,946)、 美替瑞林_(例如，Avorelina(10-15mg缓释剂型)，也被描述于EP 23904 和WO 91/18016)、那法瑞麟(例如，商品名Synarel_(i.n.200-1800μg/d)， Syntex，也被描述于美国No.4,234,571、WO 93/15722、和EP 52510)、以 及曲普瑞林(例如，扑酸曲普瑞林，商品名Trelstar LA_(3个月内 11.25mg)、Trelstar LA Debioclip_(预先填充的，单次剂量给予)、LA Trelstar Depot_(1个月内3.75mg)、和Decapeptyl_，Debiopharm S.A.，Switzerland， 也被描述于美国No.4,010,125、4,018,726、4,024,121、和5,258,492、EP 364819)。LHRH类似物也包括但不限于下面的LHRH-R的拮抗剂：阿巴 瑞克(商品名PlenaxisTM(例如，在第1、15和29天肌注100mg，之后每 4周肌注100mg)，Praecis Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，MA)和西 曲瑞克(例如，醋酸西曲瑞克，商品名CetrotideTM(例如，皮下0.25或 3mg)，Zentaris，Frankfurt，Germany)。另外的性类固醇类似物包括Eulexin_ (例如，氟他胺(例如，2个胶囊，每天2次，总量750mg/d)，Schering-Plough Corp.，也被描述于FR 7923545、WO 86/01105和PT 100899)、以及二噁 烷衍生物(例如，在EP413209中所描述的)、以及例如在EP 181236、美 国No.4,608,251、4,656,247、4,642,332、4,010,149、3,992,365、和4,010,149 中所描述的其他LHRH类似物。也包括激动剂的组合、拮抗剂的组合、 以及激动剂和拮抗剂的组合。本发明的一种非限制性的类似物是地洛瑞 林(美国No.4,218,439所描述的)。对于类似物的更广泛的列表，见Vickery et al.(1984)LHRH AND ITS ANALOGS：CONTRACEPTIVE& THERAPEUTIC APPLICATIONS(Vickery etal.，eds.)MTP Press Ltd.， Lancaster，PA。也可以使用每种类似物的修饰形式，例如它的醋酸、柠 檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟知的。
性类固醇清除药物的给药的一个非限制性的实例是皮下/皮内注射 GnRH激动剂的“缓释的”储存剂(depot)(例如，1、3或4个月的Lupron_ 注射剂)或皮下/皮内注射“缓释的”含GnRH的植入物(例如，1或3 个月的Zoladex_，例如3.6mg或10.8mg植入物)。根据合适的剂型，也 可以肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)或口服给予这些药物。另一个实例是通 过皮下注射含有约30mg Lupron_(例如，Lupron Depot_(亮丙利德的储 存悬浮液)，TAP Pharmaceuticals Products，Inc.，Lake Forest，IL)的“储 存剂”或“浸透性植入物”。30mg Lupron_足以清除性类固醇4个月以容 许胸腺恢复并往血流内输出新的原初T细胞。
在此所描述的许多移植性类固醇信号途径的机制是熟知的，以及其 中的一些药物特别是GnRH激动剂已经被用于治疗生殖器官疾病例如一 些激素敏感性癌症包括乳腺癌和前列腺癌、子宫内膜异位症、生殖疾病、 多毛症、早熟、性变异以及控制生育很多年。
在某些实例中，性类固醇清除和/或性类固醇介导的信号途径的中断 或阻断最终再活化了患者的胸腺。在一些情况中，阻断逆转了患者的激 素状态。根据本发明的方法，受者的激素状态被逆转了，使得受者的激 素状态接近青春期前水平。通过降低受者的性类固醇激素的水平，降低 了这些激素对胸腺的信号途径，据此容许再活化胸腺。患者可以是青春 期的或青春期后的，或患者有过(或曾有过)至少部分萎缩胸腺的疾病。 同样的，患者有过(或曾有过)疾病的治疗，其中对疾病的治疗至少部分 导致患者胸腺萎缩。这些治疗可以是抗病毒的、免疫抑制、化疗和/或放 射治疗。在其他的实施方式中，患者是绝经的或已经采取其他方式例如 外伤、药物等所减少了性类固醇(或其他激素水平)。
性类固醇清除或对性类固醇介导的信号途径的阻断对BM和/或免疫 系统的细胞具有一或多种直接作用，其中提高了功能性。这些作用可以 在胸腺再活化之前或与之同时发生。
在一些实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其 他的阉割方法施与一种抗雄激素例如雄激素阻断剂(例如，比卡鲁胺，商 品名Cosudex_或Casodex_，例如5-500mg，例如50mg口服QID， AstraZeneca，Aukland，NZ)实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的 抑制。也可以通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其他的阉割方 法施与醋酸环丙氯地孕酮(商品名，Androcor_，Shering AG，Germany， 例如10-1000mg，100mg bd或tds，或每周IM 300mg)、作用为孕酮的醋 酸17-羟孕酮实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。可以使用 其他的抗雄激素(例如，咪唑类的抗真菌药物，例如利阿唑(Liazol_， 例如，150mg/天，一种芳香酶抑制剂)和酮康唑、氟他胺(商品名Euflex_ 和Eulexin_，Shering Plough Corp，N.J，例如250或750mg口服QID)、 醋酸甲地孕酮(Megace_，例如480-840mg/天，或尼鲁米特(商品名 Anandron_和Nilandron_，Roussel，France，例如150-300mg/天)。抗雄 激素在治疗上经常是重要的，因为它们通常被用于缓解GnRH类似物所 造成的短期增强作用。一些抗雄激素通过抑制雄激素受体的移位发挥作 用，这干扰了负反馈，造成了睾酮水平的增加和性欲/能力的最小缺失。 用于本发明的另一种类型的抗雄激素是选择性雄激素受体调节物 (SARMs)(例如，喹啉衍生物、比卡鲁胺(商品名Cosudex_或Casodex_， 同上)、和氟他胺(商品名Eulexin_，例如口服250mg/天))。其他熟知的 抗雄激素包括5α还原酶抑制剂(例如，度他雄胺(例如，口服0.5mg/天)， 它抑制了两种5α还原酶同功酶并造成更多和更快的DHT抑制；非那雄 胺(商品名Proscar_，0.5-500mg，例如每天口服5mg)，它抑制了5α还 原酶2并最终抑制DHT的产生，但是对睾酮或LH水平只有很小的或没 有作用)。
在其他的实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何 其他的阉割方法施与抗雌激素实现类固醇耗竭或对性类固醇介导的信号 途径的抑制。一些抗雌激素(例如，阿那曲唑(商品名Arimidex_、和氟 维司群(商品名Faslodex_，10-1000mg，例如每月250mg IM)通过以类 似于雌二醇的高亲和力与雌激素受体(ER)结合发挥作用，并最终抑制 了雌激素与受体的结合。Faslodex_的结合也靶向于受体的构象变化以及 下调雌激素受体，而FSH或LH水平没有显著变化。抗雌激素的其他非 限制性的实例是他莫昔芬(商品名Nolvadex_)；氯米芬(商品名 Clomid_)，例如50-250mg/天，一种具有混和的激动剂/拮抗剂性能的非 类固醇的ER配体，它刺激了促性腺激素的释放；己烯雌酚(商品名 Stilphostrol_)，例如1-3mg/天，它显示出与雌酮相似的但更强的雌激素活 性，因此它被认为是一种雌激素激动剂，但它可与雄激素和雌激素受体 结合以诱导对垂体的FSH和LH产生的反馈抑制，己烯雌酚二磷酸盐例 如50到200mg/天；以及达那唑、屈洛昔芬和Iodoxyfene，每一种都作用 为拮抗剂。可以单独或联合其他的阉割方法使用的另一类抗雌激素是选 择性雌激素受体调节物(SERMs)(例如，托瑞米芬(商品名Fareston_， 5-1000mg，例如60mg口服QID)、Raloxofene(商品名Evista_)、和他莫 昔芬(商品名Nolvadex_，1-1000mg，例如20mg口服bd)，它作用为骨 和心血管系统的雌激素受体的激动剂以及乳腺的雌激素受体的拮抗剂)。 雌激素受体下调物(ERD)(例如他莫昔芬(商品名Nolvadex_))也可被 用于本发明。
可以单独地或联合其他的阉割方法使用的抑制性类固醇信号途径的 方法的其他非限制性的实例包括芳香酶抑制剂和其他的性腺阻断剂(例 如，氨鲁米特、福美坦、vorazole、依西美坦、阿那曲唑((商品名Arimidex_； 0.1-100mg，例如1mg口服QID)，它降低了雌二醇并增加了LH和睾酮)、 来曲唑(商品名Femarat_，例如2.5mg口服QID)、和依西美坦(商品名 Aromasin_，1-2000mg，例如25mg/天)；醛固酮拮抗剂(例如，螺内酯(商 品名Aldactone_)，例如100到400mg/天)，它作用为阻断雄激素细胞色 素P-450受体)；和依普利酮，一种选择性醛固酮受体拮抗剂)；抗孕激素 (例如醋酸甲羟孕酮，例如5mg/天，它抑制了睾酮合成和LH合成)；以及 黄体酮和抗黄体酮例如选择性黄体酮应答调节物(SPRM)(例如，醋酸甲 地孕酮，例如160mg/天，米非司酮(RU486，Mifeprex_，例如200mg/ 天)；以及其他的具有雌激素/抗雌激素活性的化合物(例如，植物雌激素、 黄酮、异黄酮和coumestan衍生物、木脂素和具有酚环的工业化学物(例 如DDT)。也可以使用抗GnRH疫苗(见，例如Hsu et al.，(2000)Cancer Res. 60：3701；Talwar，(1999)Immunol.Rev.171：173-92)或其他任何的能模拟 上述药物所产生的作用的药品。另外，也可以发展并使用基于类固醇受 体的调节物，它可以被靶向于胸腺和/或BM特异的。这些抑制性类固醇 信号途径的机制中的多种机制都是熟知的。也可以使用每种药物的修饰 形式，例如它们的醋酸、柠檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟 知的。
因为激素系统的复杂的和交互编织的反馈机制，性类固醇的施与可 能造成性类固醇信号途径的抑制。例如，雌二醇减少了促性腺激素的产 生以及对GnRH作用的敏感性。但是，更高水平的雌二醇造成促性腺激 素大量释放(surge)。同样的，孕酮影响LH释放的频率和数目。在男性， 睾酮抑制了促性腺激素的产生。施与到男性中的雌激素降低了LH和睾 酮，以及抗雌激素增加了LH。
在其他实施方式中，抑制了患者的泌乳素。抑制性类固醇介导的信 号途径的另一个方法可以是通过直接或间接调节泌乳素水平的方法。泌 乳素是一种合成作为激素原的单链蛋白激素。雄性和非孕雌性的泌乳素 的正常值范围通常是从约0到20ng/ml，但是在怀孕雌性中，范围通常是 约10到300ng/ml。已经报道了泌乳素的总的数百种不同的作用。泌乳素 刺激雌性的乳腺发育和乳汁产生。已知异常泌乳素涉及于垂体肿瘤、月 经不调、不育、阳痿和泌乳(乳汁生成)。相当数量的研究正在逐步地探 讨泌乳素在正常及病理的免疫应答中的作用。发现泌乳素在免疫功能的 多个方面都有调节作用，还有证据说明高泌乳素血症是免疫抑制的 (Matera L，Neuroimmunomodulation.1997Jul-Aug；4(4)：171-80)。施与药 用剂量的泌乳素与感染小鼠的生存率的下降以及细胞免疫功能的抑制相 关(Oberbeck R，J Surg Res.2003 Aug；113(2)：248-56)。也有多种药物能 损害对泌乳素的多巴胺能的抑制并造成高泌乳素血症。抗多巴胺能药物 包括氟哌啶醇、氟奋乃静、硫苯酰胺、甲氧氯普胺和促胃肠动力药物(例 如，溴必利、氯波必利、多潘立酮和左舒必利)，它们已经被临床用于治 疗上胃肠道的运动病变。
应答于促性腺激素在性腺中所生成的抑制素A和B肽下调了垂体并 抑制FSH。活化素(Activin)通常上调GnRH受体并刺激FHS合成，但 是过量的产生可以终止性类固醇的产生。因此这些激素也可以是对性类 固醇介导的信号途径的抑制的靶点。
在某些实施方式中，将一种LHRH-R拮抗剂施用给患者，随后是一 种LHRH-R激动剂。例如，可以以足够剂量的单次注射施与拮抗剂以造 成5-8天内的阉割(这对于例如Abarelix是正常的)。当性类固醇已经达 到了这个阉割水平时，给予激动剂。这个方案消除或限制了在性类固醇 产生减少之前的性类固醇产生的任何尖峰，施与激动剂可能产生这样的 尖峰。在另一个替代实施方式中，使用了产生很小的或不产生性类固醇 产生尖峰的LHRH-R激动剂，这可以预先施用或不施用LHRH-R拮抗剂。
对性类固醇信号途径的抑制
性激素包括大量的雄激素、雌激素和黄体酮家族的激素分子。C21 类固醇的黄体酮家族的非限制性的成员包括孕酮、17α-羟孕酮、20α-羟 孕酮、孕二酮、孕二醇和孕烯醇酮。C19类固醇的雄激素家族的非限制 性的成员包括睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮(DHT)、雄烷二酮、 Androstandiol、脱氢表雄酮和17α-羟雄烯二酮。C17类固醇的雌激素家族 的非限制性的成员包括雌酮、雌二醇-17α、和雌二醇-17β。
性类固醇的信号途径是包括生物合成、分泌、代谢、区室化 (compartmentalization)和作用的途径组成部分的复杂后果的净结果。这 个途径的一部分还没有被完全了解，然而，仍有多种已有的和潜在的机 制用于实现对性类固醇信号途径的抑制。在本发明的一个方面，通过在 细胞水平即所谓的“游离”水平修饰生物可获得的性类固醇水平、通过 改变生物合成或代谢、与靶细胞上或内的性类固醇受体的结合、和/或性 类固醇的细胞内信号途径都可以实现对性类固醇信号途径的抑制。
直接或间接地影响信号途径是有可能的。直接方法包括影响性类固 醇的生物合成和代谢、与相应受体的结合以及信号的细胞内修饰的方法。 间接方法包括那些已知影响性类固醇激素的产生和作用的方法例如垂体 腺体和性腺中所存在的肽激素和生长因子。后者包括但不限于垂体腺体 所生成的FSH、LH和活化素、以及性腺所生成的抑制素、活化素和胰岛 素样生长因子-1(IGF-1)。
本领域人员将认识到通过在相关的激素、酶、受体、结合分子和/或 配体的水平或通过对分子的直接作用或通过对分子的前体包括编码或调 节它的核酸、或能修饰性类固醇作用的分子的作用上进行上述的修饰可 以发生对性类固醇信号途径的抑制。
抑制信号途径的直接方法
生物合成
生物合成的速度是类固醇激素产生以及血清“游离”激素的生物利 用度的主要限速步骤。对途径中早期的关键酶例如P450胆固醇侧链裂解 (P450scc)的抑制将减少所有主要性类固醇的产生。在另一方面，对途径 中后面的酶例如将雄激素转化为雌激素的P450芳香酶(P450arom)或将 睾酮转化为DHT的5α还原酶的抑制，将仅仅分别影响雌激素或DHT的 产生。性类固醇激素生物合成的另一个重要的方面是催化非活化的与生 物活性的类固醇之间相互转换的氧化还原酶家族，例如17-羟类固醇脱氢 酶(17-HSD)催化雄烯二酮与睾酮或雌酮与雌二醇-17的相互转换。这些 酶是组织和细胞特异的并通常催化还原或氧化反应，例如只在睾丸的 Leydig细胞内发现了3型17βHSD，而在卵巢内发现了1型17βHSD。 因此它们提供了特异地减少雄激素或雌激素的活性形式的产生的可能 性。
有许多种已知的类固醇生物合成途径中的酶的抑制剂已经被用于临 床应用或在发展中。下面罗列了这些抑制剂中的一些实例以及它们的治 疗模式。重要的是这些酶抑制剂的作用没有过度地影响其他类固醇例如 对代谢稳定是重要的肾上腺的糖皮质激素和盐皮质激素的产生。当使用 这些抑制剂时，给患者提供替代的糖皮质激素和有时提供盐皮质激素可 能是必需的。
性类固醇的生物合成发生在多个部位并利用多种途径，主要是在卵 巢和睾丸中产生，但是有一些是在肾上腺内产生，以及在其他的组织例 如脂肪内合成衍生物。因此，可能需要抑制性类固醇信号途径的多个机 制以保证充分的抑制实现本发明。
代谢和区室化(compartmentalization)
性类固醇在血液中的半衰期短，通常仅为数分钟，这是因为快速代 谢，特别是肝脏，以及肾脏和脂肪的清除。代谢包括糖基化和硫酸化的 结合反应，以及还原反应。这些代谢物中的一些保留有生物学活性，这 生物学活性或是激素原的例如雌激素硫酸盐，或是通过内在的生物学活 性例如还原雄激素。对代谢速度的任何干扰都能影响性类固醇激素的“游 离”水平。但是，还没有得到与影响生物合成的方法一样的实现这一点 的方法。
减少“游离的”性类固醇激素水平的另一个方法是通过性类固醇激 素与血清中的蛋白例如性激素结合球蛋白、皮质醇激素结合球蛋白、白 蛋白和睾酮-雌二醇结合球蛋白的结合的区室化。与性类固醇配体例如载 体分子的结合使得不能获得与受体结合的性类固醇。载体水平例如SHBG 的增加或引入其他的与性类固醇结合的配体例如可溶性受体可以造成结 合的增加。或者，降低水平的载体分子可以使得性类固醇对降解更为敏 感。
抗特殊的性类固醇激素的主动或被动的免疫接种是一种形式的区室 化。在这种方法在抗雌激素或雄激素的免疫接种之后成功地增加了动物 的排卵率的文献中有着实例。从分泌囊泡中分泌出性类固醇。对分泌机 制的抑制或修饰是抑制性类固醇信号途径的另一种方法。
受体和细胞内信号途径
性类固醇经在细胞内或如最近所示的在靶细胞膜上的特异受体作用 于细胞。
细胞内受体是核受体超家族的成员。它们位于细胞的细胞浆内并在 与性类固醇激素结合后被转运到核内，在这里它们改变了特异基因的转 录。性类固醇激素的受体以多种形式存在。在文献中熟知的是两种形式 的孕酮受体，PRA和PRB，以及三种形式的雌激素受体，ERα、ERβ1 和ERβ2。可以以多种方法修饰应答于性类固醇激素受体与基因启动子区 域内的类固醇应答元件结合的基因的转录。存在于靶细胞核内的辅激活 物和辅抑制物都能修饰性类固醇-受体复合物与DNA的结合并据此影响 转录。对这些辅激动物和辅抑制物中的多种的鉴定是已知的，以及修饰 它们对性类固醇受体的作用的方法是目前研究的热点。性类固醇激素作 用中所包含的转录因子的实例是NF-1、SP1、Oct-1和TFIID。类固醇的 完全作用需要这些辅助调节物。修饰这些核调节物的作用的方法可能涉 及激动物和抑制物之间的平衡，通过使用拮抗剂或经过控制编码调节物 的基因的表达。另外，c-AMP。
最近，在细胞膜上已经鉴定出雌激素和孕酮的特异受体，它们的结 构不同于细胞内PR。不象经典的作用于基因组的类固醇受体，这些受体 通过还没有被完全认识的细胞内途径传递快速的、非基因组的作用。一 个报道表明，与膜受体相互作用的雌激素激活了与细胞增殖相关的鞘氨 醇途径。
已经有可获得的或发展中的经性类固醇的细胞浆受体改变性类固醇 的作用的方法。在这个情况中，与特异的类固醇受体相互作用的抗雄激 素、抗雌激素和抗孕激素在文献中是熟知的并被用于临床应用中，如上 所描述的。它们的作用可能是竞争或阻断受体、修饰受体的水平、敏感 性、构象、联合或信号途径。这些药物可以是各种形式的，类固醇的和 非类固醇的、竞争性的和非竞争性的。特别相关的是选择性受体调节物， SARM、SERM和SPRM，它们是靶向于特殊组织的并被如上说明的。
有两种方法可以实现对受体的下调：第一，通过过量的激动剂(类固 醇配体)，以及第二，通过抑制编码受体的相应基因的转录。通过使用选 择性激动剂例如他莫昔芬可以实现第一种方法。
抑制信号途径的间接方法
生物合成
其中一种抑制性类固醇信号途径的间接方法包含通过对负责驱动性 腺内的性类固醇激素的生物合成的垂体促性腺激素FSH和LH的利用度 或作用的修饰下调相关类固醇的生物合成。一种已建立的FSH分泌的抑 制剂是抑制素，一种性腺应答于FSH所产生的激素。已经显示给动物施 与抑制素减少了血清的FSH水平，因为垂体分泌FSH的减少。实现两种 促性腺激素的减少的最好的已知方法是经下丘脑激素GnRH/LHRH，它驱 动垂体合成并分泌FSH和LH。减少了FSH和LH的分泌并因此减少了 性腺的类固醇产生的GnRH的激动剂和拮抗剂现在已经被用于临床应用， 如在此所描述的。
另一种减少性类固醇激素的生物合成的间接方法是在性腺水平修饰 FSH和LH的作用。通过使用直接对抗FSH和LH的抗体、或设计用于 与FSH和LH竞争产性类固醇激素的性腺细胞上的它们的相关受体的分 子可以实现这一点。另一种修饰FSH和LH对性腺细胞的作用的方法是 通过一种促性腺激素作用的辅助调节物。例如，活化素可以减弱卵巢的 膜细胞和睾丸的Leydig细胞应答LH产生雄激素的能力。
修饰可以发生在激素前体的水平例如对信号肽例如GnRH的信号肽 的裂解的抑制。
受体和细胞内信号途径
改变性类固醇激素的信号途径作用的间接方法包括下调导致类固醇 的基因组和非基因组作用的受体途径。它的一个实例是孕酮下调靶组织 的ER水平的能力。未来的方法包括利用对已知影响细胞核内的受体的辅 助调剂物的分子的处理，导致细胞对类固醇的应答的能力的降低。
其他因素
虽然用于对BM功能性、BM淋巴细胞生产和免疫细胞功能性的直 接及间接作用的刺激主要是依据于对性类固醇的作用的抑制和/或LHRH 类似物的直接作用，可作用为一起增强或增加(累加、协同或补充)胸腺、 BM、和/或免疫细胞作用和功能性的附加物也可能是有用的。可以使用或 不使用附加物。这些化合物包括，但不限于细胞因子和生长因子，例如 白介素-2(IL-2，100,000到1,000,000IU，例如600,000IU/kg，每8小时重 复剂量)、白介素-7(IL-7，10ng/kg/天到100ng/kg/天，根据治疗的需要)、 白介素-15(IL-15；0.1-20mμg/kg/天)、白介素-11(IL-11；1-1000μg/kg)； 上皮和成纤维细胞生长因子家族成员，干细胞因子(SCF；也已知为青灰 因子(steel factor)或c-kit配体；0.25-12.5mg/ml)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF；1和15μg/kg/天，IV或SC)、粒细胞巨核集落刺激因子(GM-CSF； 50-1000μg/平方米/天，SC或IV)、胰岛素依赖性生长因子(IGF-1)、和角 化细胞生长因子(KGF；1μg/kg到100mg/kg/天)(见例如Sempowski et al.， (2000)J.Immunol.164：2180；Andrew和Aspinall，(2001)J.Immunol.166： 1524-1530；Rossi et al.，(2002)Blood 100：682)；促红细胞生成素(EPO； 10-500单位/kg，IV或SC)。用于与本发明同时或连续地共施与的其他合 适的造血因子、CSF、细胞因子、淋巴因子、造血生长因子和白介素的非 排它性的实例包括Meg-CSF(巨核细胞集落刺激因子，最近被称为c-mpl 配体)、MIF(巨噬细胞抑制因子)、LIF(白血病抑制因子)、TNF(肿瘤坏 死因子)、IGF、血小板衍生生长因子(PDGF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、LIF、flt3/flk2、人生长激素、B 细胞生长因子、B细胞分化因子和嗜酸性粒细胞分化因子或它们的组合。
在最初的LHRH类似物(或其他的阉割方法)应用时，可以给予一 次这些附加化合物的一或多种。可以联合激动剂、拮抗剂或性类固醇阻 断的其他任何形式给予每种治疗。因为生长因子具有相对快的半衰期(例 如数小时)，它们可能需要每天给药(例如每天给药共7天或更长时间)。 如生产商所规定的，可以给予最佳形式的生长因子/细胞因子以保存它们 的生物活性，如纯化蛋白的形式。但是，可以在任何时间给予这些物质 的任何一种或组合的附加剂量以进一步刺激BM和其他免疫细胞的功能 性。在某些情况中，与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给 药同时进行性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。在其他情况中， 与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给药依次进行性类固醇 清除或对性类固醇信号途径的阻断。
术语“动员剂”在此被定义为是指例如SDF(例如AMD3100)、生长 激素、GM-CSF、G-CSF和化疗(例如环磷酰胺)等药剂，它们增强了 BM干细胞的动员。
已知G-CSF和GM-CSF能分别动员粒细胞(主要是中性粒细胞)和 巨噬细胞的产生，以及也造成增加了BM的DC的产生，这有助于给处 于抗原攻击中的患者提供非特异性免疫应答(Janeway et al.，(2001) Immunobiology 5th Ed.，p.325)。例如，临床上使用G-CSF和GM-CSF减 少了接受骨髓抑制性抗肿瘤药物的非髓系恶性肿瘤患者的感染(表现为 发热性粒细胞缺乏症)的发生率，这通常与严重的粒细胞缺乏症以及发热 的显著的发病率相关。另外，临床上证实这两种药物都能预防接受HSCT 患者的感染。G-CSF和GM-CSF两者目前都被用于进行外周血前体细胞 收集或治疗的患者。刺激BM干细胞的分化和/或增殖的集落刺激因子 (CSF)已经产生了很多兴趣，因为它们对恢复造血干细胞来源的细胞的 受抑制水平的治疗能力。根据它们的活性，已经鉴定并区别出人和小鼠 系统的CSF。例如，粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞-CSF(M-CSF)分 别刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的体外形成，而GM-CSF和白介素-3 (IL-3)具有更广泛的活性，它们刺激巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒 细胞集落的形成。IL-3也刺激肥大细胞、巨核细胞和纯的及混和的红系 集落(当加入促红细胞生成素时)的形成。GM-CSF加速了中性粒细胞的 恢复并保留其功能性，但对血小板恢复只有很小的可证实的作用。相反 地，IL-3促进了中性粒细胞和单核细胞的更为缓慢增加的恢复，但加速 了血小板的恢复。
因此，在本发明方法的一些实施方式中使用了G-CSF和/或GM-CSF。 与G-CSF和/或GM-CSF治疗一起的性类固醇清除(依次的或同时的)造 成了BM的淋巴及髓细胞输出的增加，这反过来显著地提高了患有或可 能患有感染的患者的短期及长期结果。在另一个方法中，在化疗或放射 治疗后3-4天施与CSF。通过对性类固醇信号途径的中断也极大地增强了 与应用CSF所已经相关的临床结果。特别地，与CSF一起使用本发明的 方法容许更好地控制对接受例如肿瘤放疗或化疗的患者的感染。另外， 如果可以有效地和迅速地“重启”免疫系统，可以使用增加了剂量和频 率的化疗药物或放射治疗。这可以发生于有或没有异基因或自体HSC的 引入，HSC的引入将进一步地增强免疫系统功能性的及时恢复。阉割也 将造成更低数目的必需被移植的HSC，当只能从供者中得到有限数量的 HSC或当脐血干细胞被用于移植时，这将是有用的。
例如，同时使用两种不同类型的药物(例如一种GnRH类似物，例 如Lupron_；和一种雄激素阻断剂，例如Cosudex_)可以容许相同的免 疫系统的再生，但可能需要减少了剂量的G-CSF或GM-CSF。相似地， 当利用相同剂量的G-CSF或GM-CSF时，同时使用这两种不同类型的药 物可以容许免疫系统细胞的更大的或更长时间的复壮(rejuvenation)。另 外，同时使用两种不同类型的药物同样可以容许免疫系统细胞复壮，但 利用了减少了剂量(即与用于治疗前列腺癌、子宫内膜异位症或乳腺癌的 “通常”使用的剂量比较时有所减少)的能耗竭或中断性类固醇信号途径 的药物、或药物的组合。另外，当利用了减少剂量了的用于耗竭或中断 性类固醇信号途径的药物或药物的组合时，同时使用两种不同类型的药 物容许免疫系统细胞的更大程度或更长时间的复壮。
适应证
已知引起性类固醇去除或阻断性类固醇信号途径的药物，可单独或 与或不与上面所提及的生长因子和细胞因子联合使用，用于：与多种治 疗方案相关的感染的减少、耗竭治疗后BM的复壮(见，例如实施例19)、 作为一种促进HSC植入的辅助治疗(见，例如实施例22)、作为一种异基 因或自体器官或细胞移植的有效处理的辅助治疗(见例如，实施例21和 22，以及共同未决、共拥有的美国No.10/419,039和10/749,119)、疫苗接 种方案(见，例如实施例10-13、29和共拥有的、共同未决美国 No.10/418,747和10/748,450)、各种自身免疫性疾病的处理(见，例如实 施例32-35和共拥有的、共同未决美国No.10/419,066和0/749,118)、各 种感染性疾病的后果的治疗或处理(见，例如实施例3和14)、对各种癌 症的预防及治疗的提高(见，例如实施例13和共拥有的、共同未决美国 No.10/418,727和10/749,122)、和各种基因治疗方案(见实施例14和共拥 有的、共同未决美国No.10/419,068和10/748,851)。
这些药物在这些疾病中的应用将造成更有效的治疗结果或将造成更 有效的总体治疗方案。另外，如实施例25和26所描述的，可以变更各 种化疗药物的剂量或给药(或放射治疗的剂量)，使得它们现在产生更少的 副作用和/或造成患者的更好的生活质量的结果。此外，各种细胞因子和 生长因子的共施用可以容许减少移植所必需的HSC数目。例如，利用本 发明的方法，使用人脐血的成人HSCT现在可能是可能的，因为减少了 获得植入所需的细胞数目。
药用组合物
可以以任何可药用的载体施用或者可以无载体施用本发明所用的化 合物。根据标准的方法可以制备药用组合物的剂型(见，例如Remington， The Science and Practice of Pharmacy.Gennaro A.R.，ed.，20th edition， Williams&Wilkins PA，USA(2000))。可药用载体的非限制性的实例包括 生理上相兼容的包膜、溶剂和稀释剂。对于肠外、皮下、静脉内和肌肉 内给药，组合物可以受例如封装的保护。或者，可以与保护活性成分(复 数)的同时容许这些成分缓慢释放的载体一起提供组合物。本领域已知有 很多种聚合物和共聚物被用于制备定时释放的剂型，例如乳酸/乙醇酸共 聚物的各种版本。见，例如美国No.5,410,016，它将经修饰的聚乙二醇聚 合物用作为生物可降解的涂层。
拟用于口服给药的剂型可以被制备为液体、胶囊、片剂等等。这些 组合物可以包括例如，赋形剂、稀释剂、和/或保护活性成分不被降解的 涂层。这样的剂型是熟知的(见，例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro A.R.，ed.，20th edition，Williams&Wilkins PA，USA (2000))。
在本发明的任何一种剂型中，都可以包括不会负性影响LHRH类似 物的活性的其他化合物(即不会阻断LHRH类似物阻断性类固醇激素信 号途径的能力的化合物)。实例是在此所描述的各种生长因子和其他细胞 因子。
剂量
经常规训练的医生或兽医可以容易地确定出本发明所用的性类固醇 类似物或抑制剂阻断性类固醇激素信号途径的剂量，也可以通过查询医 学文献将其确定(例如，THE PHYSICIAN′S DESK REFERENCE，52ND EDITION，Medical Economics Company，1998)。
主治医师结合各种将修饰药物作用的因素例如患者的病变、体重、 性别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素将确定出用 于治疗上述病变的方法所相关的剂量方案。通过定期测定血液指标例如 血细胞分类计数等等可以监测所治疗患者的进展。
调整上面所叙述的剂量以补偿治疗组合物中的其他成分。这些成分 包括与其他CSF、细胞因子、淋巴因子、白介素、造血生长因子的共同 给药、与化疗药物和/或放射的共同给药、以及主治医师所识别到的各种 患者相关的内容例如修饰药物作用的因素，例如患者的病变、体重、性 别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素。
除了上述的剂量外，例如，可以以将持续一段时间(例如3到6个月) 的单次剂量施与LHRH类似物和其他的性类固醇类似物。在某些情况中， 剂型将有效1到2个月。标准剂量随所用类似物的类型而有所不同，但 是这对本领域人员是容易决定的，不需过多的试验。一般而言，剂量是 在约0.01mg/kg和约10mg/kg之间，或约0.01mg/kg和约5mg/kg之间。
性类固醇抑制或LHRH/GnRH类似物的治疗时间的长度随着胸腺萎 缩和损伤的程度而有所不同，这对本领域人员是容易决定的，不需过多 的试验。患者越老，或他们已经被暴露于T细胞耗竭物例如化疗或放疗 越多，他们需要例如GnRH的治疗似乎就越长。四个月通常被认为足以 检测到血液中的新的T细胞。检测血液中的新的T细胞的方法在本领域 是已知的。例如，通过确定T细胞受体删除环(TREC)的存在是一种T 细胞检测的方法，当在TCR形成时形成了TREC，而当细胞分裂时它从 细胞内缺失。因此，TREC只见于新的(原初)T细胞中。TREC水平是人 类胸腺功能的一个指示。在WO/00 230,256中详细地描述了这些及其他 的方法。
剂量因所用的性类固醇抑制剂或例如抗性类固醇疫苗或其他阻断剂 而不同。在某些情况中，一个剂量可以被制备为持续与周期性传染的持 续时间一样长的时间。例如，“流感季节”通常发生在冬季的月份中。可 以从流感季节开始时就开始如在此所述的制备并给予LHRH类似物的一 种剂型以保护一段2个月以上的时间，每2个月以上给予附加剂量，直 到感染的危险减低或消失。
可以制备出增强免疫系统的剂型。或者，可以制备特异地终止例如 流感病毒的感染同时增强免疫系统的剂型。后者的剂型可以包括已经被 遗传工程加工产生了对流感病毒的耐受性(见下)的经遗传学修饰的(GM) 细胞。可以与性类固醇类似物或LHRH类似物一起或在空间上和/或时间 上都分开地施与GM细胞。与用非GM细胞一样，可以随着时间给患者 施用多次剂量以在流感季节期间内产生对流感病毒的保护并预防感染。
本领域人员可以明白，至少一些阻断性类固醇信号途径的方法的有 效时间只与施与合适化合物的时间一样长。因此，本发明的某些实施方 式的优点是一旦已经实现了本发明所需的免疫效应，就可以终止治疗 (2-3个月)，并且这些对象的生殖系统将恢复到正常。
化学阉割药物的施用
可以通过任何将药物给予到体内的方法施与性类固醇清除除药物。 因此，根据发明，可以用任何途径包括但不限于静脉内、皮内、皮下、 肌肉内、局部和口服的给药途径施与性类固醇清除药物。
除了上述的方法外，经本领域人员已知的多种方法可以完成用于本 发明的方法的化合物的给予。一个用于施与化学抑制剂以抑制性类固醇 介导的信号途径的标准方法利用了有效3个月的单次剂量的LHRH激动 剂。对此，单个时间的简单的静脉内或肌肉内注射都是不够的，因此早 在三个月过去之前激动剂就已经被从患者的体内清除出去。取而代之的 是，可以使用储存剂注射液或植入物、或任何其他的给予容许缓慢释放 抑制剂的工具。同样地，可以使用用于增加抑制剂在体内的半衰期同时 保留在此所需的功能的方法，例如通过修饰化学物。
有用的施用机制包括，但不限于，对皮肤的激光照射。在共拥有的、 共同未决美国No.10/418,727以及也在美国No.4,775,361、5,643,252、 5,839,446、6,056,738、6,315,772、和6,251,099中更详细地描述了这个实 施方式。另一种有用的施用机制包括在皮肤上产生高压脉冲暂态(也叫做 应力波或脉冲暂态)。在共拥有的、共同未决美国No.10/418,727以及也 在美国No.5,614,502和5,658,822中更详细地描述了这个实施方式。通过 将化合物与载体或没有载体放置在相同的位置可以完成或进行每种方 法。这种放置的一个方法是被放置在并在皮肤上被保持一段治疗的持续 时间的垫片内。
时机
在一个情况中，耗竭性类固醇或阻断性类固醇信号途径的药物(或其 他的阉割方法)的给药发生在例如可能引起一些BM骨髓细胞耗竭和/或 损伤循环的免疫细胞的化疗或照射方案之前。
细胞
或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活 化的同时，注射造血前体细胞例如被明确定义为CD34+的造血细胞(理 想的是自体的)能增强胸腺再活化的程度和动力学和/或增加免疫细胞和 BM功能性以及植入。HSC也还可以被定义为低Thy-1和CD38-、 CD34+CD38-；缺少其他细胞系(lin阴性)的标记物的低Thy-1的细胞是 更为原始的HSC，它可以更长时间地持续或具有更长期的重新入巢的能 力。
通过添加例如CD34+HSC和/或上皮干细胞可以补充在此所述的各 种发明的方法。在一种情况中，这些细胞是自体的或同基因的并在胸腺 再活化之前已经从患者或孪生子中得到的。通过分选患者的血液和/或 BM的CD34+或CD34lo细胞可以得到HSC。可以有多种方法用于增强 HSC的数目，包括(但不限于)通过在收集细胞之前给患者施用G-CSF (Neupogen，Amgen)、将所收集的细胞培养在SCSF中、和/或在补充CD34+ 细胞之后给患者施用G-CSF。或者，如果通过之前给患者施用G-CSF增 强了CD34+细胞群，那么就不必从血液或BM中分选出CD34+。
HSC可被用于遗传学修饰。这些HSC可以来源于BM、外周血或脐 带、或任何其他的HSC来源、以及可以是自体的或非自体的。也有用的 是淋巴或髓系祖细胞、也在骨髓中发现的间质干细胞以及上皮干细胞， 也可以是自体的或非自体的。干细胞也可以包括脐带血。它们也可以包 括具有分化成多种不同的细胞类型的潜能的干细胞，例如胚胎干细胞和 现在在许多组织例如BM、胰腺、脑和嗅系统中所发现的成人干细胞。
在使用非自体的(供者)细胞的情况中，在胸腺再活化期间或之后产 生了对这些细胞的耐受性。在开始阻断性类固醇介导的信号途径期间或 之后，将相关的(经遗传学修饰的(GM)或未经遗传学修饰的)供者细 胞移植到受者内。这些细胞，理想的是干细胞或祖细胞被胸腺所结合并 接受，其中它们通过消除任何偶尔可以有活性对抗供者细胞的新产生的T 细胞生成了对供者的耐受性。然后它们“属于受者”并可以称为胸腺的 新的T细胞和DC的产生的一部分。所形成的T细胞都把受者和供者识 别为自身的，据此生成了对来自供者的移植物的耐受性(见，共拥有的、 共同未决美国No.10/419,039和PCT/IBO1/02740)。
在另一个实施方式中，所施与的受者干细胞或祖细胞(经遗传学修饰 的或未经遗传学修饰的)包括来自多个个体的细胞，使得受者发展出对一 组MHC类型的耐受性，使得受者被认为是更容易的或快速的细胞、组织 或器官移植的合适的侯选者，因为它们具有与更大范围的供者匹配的 MHC。
本发明也提供了用于将外来DC整合到患者胸腺内的方法。通过给 受者施与供者细胞以形成受者内的耐受性可以实现这一点。供者细胞可 以是DC、上皮干细胞、成体或胚胎干细胞、或造血前体细胞。供者细胞 可以是CD34+HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在一些情况中，供者 细胞是CD34+或CD34lo HSC。供者HSC在受者中可以发育为DC。供 者细胞可以被施与到受者并通过外周血液系统或直接或经BM迁移到再 活化的胸腺内。为了增强诱导耐受性的胸腺整合，也可以联合通过使用 性类固醇抑制剂例如LHRH/GnRH类似物对胸腺再活化的活化，往胸腺 内注射干细胞。在胸腺的微环境及其中合适的细胞生长因子的含量内， 甚至非HSC似乎也可被诱导形成DC。
对性类固醇的抑制或缺失显著地增加了胸腺对造血前体细胞的摄 取。这些细胞被整合到胸腺内并按与受者细胞相同的方式产生DC、NK、 NKT、和T细胞。结果是T细胞、DC和其他细胞的嵌合体。供者细胞 在受者胸腺内的整合意味着这个胸腺所产生的T细胞将被选择，使得它 们能耐受供者细胞。这样的耐受性容许从受者中进一步移植它的细胞、 组织和器官，减少了对免疫抑制药物的需要，因为所移植的材料将被受 者的免疫系统识别为自身的材料。
任选地对干细胞或祖细胞的遗传学修饰
本说明书也包括用于任选地改变个体的免疫系统的方法和基因治疗 的方法。通过将GM细胞施用给受体以及通过阻断性类固醇介导的信号 途径可以实现这一点。发明还包括基因治疗的方法，通过联合再生胸腺 增强BM和/或免疫细胞的功能性，或与胸腺再活化同时或在此之前或没 有胸腺再活化的情况下进行。
遗传学修饰的细胞可以是HSC、上皮干细胞、胚胎或成体干细胞、 或髓系或淋巴祖细胞。在一个具体实施方案中，遗传学修饰的细胞是 CD34+或CD34lo HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在另一个具体实施 方案中，遗传学修饰的细胞是CD34+或CD34lo HSC。遗传学修饰的细胞 被施用给患者并经外周血流迁移到胸腺。在缺少性类固醇时，显著地增 加了胸腺对这些造血前体细胞的摄取。这些细胞被整合到胸腺内并产生 携带有来自被改变的细胞的遗传学修饰的树突状细胞和T细胞。结果是 带有所需的遗传改变的T细胞群循环在受体的外周血中，以及伴随着患 者的胸腺再活化所引起的细胞、组织和器官群的增加。
在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3-4周内(开始LHRH治疗后 的近2-3周)，血流中出现了最初的新的T细胞。但是，T细胞群的完全 发育可能要3-4个(或更多个)月。
本说明书也包括利用遗传学修饰的造血干细胞、淋巴祖细胞、髓系 祖细胞、上皮干细胞或它们的组合(GM细胞)的基因治疗的方法。其他 人所进行的先前的输送这些细胞作为基因治疗的尝试已经是不成功的， 造成修饰细胞的不可计数的水平。本说明书提供了一种新的用于输送这 些细胞的方法，它促进了细胞的摄取并分化为所需的T细胞。将修饰的 细胞注射到患者内。胸腺摄取修饰的干细胞和祖细胞并转化为T细胞、 树突状细胞和其他胸腺内产生的细胞。这些新细胞的每一个细胞都含有 亲代干细胞/祖细胞的遗传学修饰。
在一个实施方案中，发明的方法使用遗传学修饰的HSC、淋巴祖细 胞、髓系祖细胞、上皮干细胞或它们的组合(共同地被称为GM细胞)产 生免疫系统对特殊抗原攻击的抗性。
将一种生成或诱导对一或多种感染性或其他病因的抗性的合适的基 因或多核苷酸(即，定义特定蛋白的核酸序列)遗传工程地加工到干细胞和 /或祖细胞内。通过将特异基因引入到HSC内，细胞分化成例如APC， 它表达作为在MHC I型或II型背景中所表达的肽的蛋白。这种表达将比 正常发生的数目极大地增加了“呈递”所需抗原的APC的数目，据此增 加了合适的T细胞识别特异抗原并应答的机会。
现今在临床中所用的多种抗肿瘤或细胞毒的抗癌药物都造成了中度 到重度的骨髓毒性(例如，长春碱、顺铂、甲氨蝶呤、烷化剂、抗叶酸药 物、长春花生物碱和蒽环类抗生素)。在本发明的另一个实施方案中，可 以将耐药基因引入到HSC内以赋予其对抗癌药物的耐药性。这些基因包 括例如二氢叶酸还原酶。本发明提供对这些化疗药物的细胞毒作用有耐 药性的HSC的用法可以通过减少骨髓抑制的发生率和严重度，容许这些 药物的更多的使用和/或更少的副作用(Podda et al.，(1992)Proc.AM.Acad. Sci.USA 89：9676；Banerjee et al.，(1994)Stem Cells 12：378)。
胸腺可以摄取修饰的干细胞和祖细胞并将其转化为T细胞、DC和其 他胸腺所产生的细胞。这些新细胞的每一个细胞都含有亲代的干细胞/祖 细胞的遗传学修饰，并据此能完全或部分耐受病因所造成的感染或损伤。 在例如阉割的2周内，也增加了骨髓、血液和外周淋巴器官例如脾和淋 巴结内的B细胞的数目。在一个具体实施方案中，患者已经与病因接触 或是处于与病因接触的高度危险中。
患者可以被给予性类固醇类似物以激活他们的胸腺，和/或提高他们 的骨髓功能，这包括增加了摄取并产生HSC的能力。患者可以被注射他 们自己的HSC，或可以被注射来自合适供者的HSC，他们例如已经被 G-CSF治疗3天(每天两次皮下注射)，随后在第4和5天从血液中收集 HSC。HSC可以被基因(例如编码来自病因的蛋白、肽或抗原)转染或转导 以产生所需的蛋白或抗原。在注射到患者体内后，HSC进入骨髓以及一 些HSC最后发育成全身各处的抗原呈递细胞(APC)。抗原被表达于这些 APC的表面的I型MHC和/或II型MHC分子的背景中。通过表达所需 的抗原，APC提高了对T和B淋巴细胞的活化。被移植的HSC也可以 进入胸腺，发育成DC并将相关抗原呈递给发育中的T淋巴细胞。如果 只有小数目的DC(例如＜0.1％胸腺细胞)，DC能将对新T细胞的选择偏倚 向与抗原反应的那些T细胞。如果存在大量的特殊DC，可以用相同的原 理删除可能能与抗原反应的新的T细胞，这可以被用于自身免疫性疾病 的预防或治疗。
在一个实施方案中，患者感染了HIV。在一个特异的具体实施方案 中，用于治疗该患者的方法包括下面更为详细提供的步骤：(1)用高效抗 逆转录病毒疗法(HAART)治疗以降低病毒滴度，在整个过程中持续该治 疗以预防或减少新的T细胞的感染；(2)清除T细胞(免疫抑制)；(3)通过 施与性类固醇类似物例如LHRH类似物阻断性类固醇介导的信号途径； (4)在胸腺开始再活化时施与已经被修饰含有表达将预防HIV感染、预防 HIV复制、灭活HIV病毒或其他能阻止HIV感染T细胞的作用的蛋白的 基因的GM细胞；(5)如果GM细胞不是自体的，在胸腺再活化之前或与 之同时施与供者细胞使得免疫系统将供者细胞识别为自身细胞；和(6)当 胸腺嵌合体被建立以及新的成熟T细胞组已经开始脱离胸腺时，减少并 最终消除了免疫抑制。
在阉割步骤期间或之后，可以将来自供者的造血干细胞或祖细胞、 或上皮干细胞移植到受体患者内。胸腺接受这些细胞为属于受体的细胞 并开始成为胸腺的新的T细胞和DC产物的一部分。所形成的T细胞群 将供者和受体(对于非自体移植的情况)都识别为自身的。在受体中也可以 生成对来自供者的移植物的耐受性。移植物可以是供者的细胞、组织或 器官、或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的方法可以使用胸腺的移植物以提高供 者细胞的植入或对供者的移植物的耐受性。在一些具体实施方案中，胸 腺移植物是当患者是无胸腺时、当患者的胸腺对再生有抗性时、或对快 速再生有抗性时。在某些具体实施方案中，使用了诱导耐受性的胸腺的 异种移植物(见，例如美国No.5,658,564)。在其他的具体实施方案中， 可以使用异基因的胸腺移植物。
如在此所定义的，用语在患者中“产生耐受性”或“诱导耐受性” 和其他的相似用语都指的是完全的以及部分的耐受性诱导(例如，与没有 被本发明的方法所治疗的患者比较，患者可以是更耐受或完全耐受移植 物)。利用本领域已知的方法例如通过MLR反应可以测试耐受性诱导。
因此，在一种方法中，患者在阉割期间或之后接受HSCT。在一种情 况中，患者被注射了他们自身的HSC。在另一种情况中，患者被注射了 来自合适供者的HSC。可以用或不用G-CSF预处理患者或供者(例如，每 天两次皮下注射共三天，随后在第4和5天从血液中收集HSC)。在一种 情况中，在胸腺再活化之前或与之同时，给患者供给造血细胞，这增加 了患者机体的免疫能力。所移植的细胞可以被或不被遗传学修饰。所移 植的细胞可以是HSC、上皮干细胞或造血祖细胞。所移植的细胞可以是 CD34+HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在某些情况中，所移植的细 胞是CD34+或CD34lo HSC。HSC可以被或不被遗传学修饰。
在某些方法中，用基因(例如，编码来自病因的蛋白、肽或抗原的基 因或其他相关的基因)转染或转导HSC以产生相关的蛋白或抗原。在一个 实例中，本发明的方法使用了遗传学修饰的HSC、淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、上皮干细胞、或其组合(共同被称作为“GM细胞”)以产生耐受 特殊抗原攻击的免疫系统(见，例如实施例14)。在共拥有的美国No. 09/758,910、10/419,068、和10/399,213中更详细地描述了这个方法。
在缺少性类固醇时，显著地增加了胸腺对HSC的摄取。这些细胞整 合到胸腺内并产生了携带有来自变更细胞的遗传学修饰的DC和T细胞。 结果是具有所需的遗传改变的T细胞群循环在受体的外周血中，以及伴 随有再活化胸腺所引起的细胞、组织和器官群的增加，它们能快速、特 异地应答于抗原。在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3到4周内(开 始LHRH治疗后的近2到3周内)，在血流中可以出现最初的新的T细胞。 T细胞池的完全发育可能要3到4个月。
在被注射到患者内之后，HSC从血液进入骨和骨髓中，然后一些脱 离回到血液内，并最终被转化为全身各处的T细胞、DC和APC。抗原 被表达于这些APC表面的I型MHC和/或II型MHC分子的背景中。对 于GM细胞，通过表达所需的抗原，APC提高了T和B淋巴细胞的活化。 所移植的HSC也可以进入胸腺，发育为DC，并将相关抗原呈递给发育 中的T淋巴细胞。
如果只有小数目的DC(例如＜0.1％胸腺细胞)，DC能将对新T细胞的 选择偏向于与抗原反应的那些T细胞。如果存在大量的特殊DC，可以用 相同的原理删除可能与抗原反应的新的T细胞，这可以被用于自身免疫 性疾病的预防或治疗。在例如阉割的2周内，也增加了骨髓、血液和外 周淋巴器官例如脾和淋巴结内的B细胞的数目。
对于HSC是具有特异性能的GM时，每个新细胞都含有亲代干细胞 /祖细胞的遗传学修饰，并据此完全或部分耐受于病因的感染或损害。
本领域人员熟知用于分离和转导干细胞和祖细胞的方法。例如在 PCT文献WO 95/08105、WO 96/33281、WO96/33282、美国No.5,681,559、 5,199,942、5,559,703、5,399,493、5,061,620中描述了这些类型方法的实 例。
反义多核苷酸
术语“反义”在此被定义为互补于本发明的多核苷酸的多核苷酸序 列。多核苷酸可以是DNA或RNA。可以用任何方法生成反义分子，方 法包括通过将反向定位的相关基因连接到允许互补链合成的病毒启动子 上的合成。一旦被引入到细胞内，这个转录链与细胞所生成的天然序列 结合形成双链体。然后这些双链体阻断了进一步的转录或转译。通过这 种方式，可以生成突变的表型。
催化核酸
术语“催化核酸”在此被定义为特异地识别一种特殊底物并催化底 物的化学修饰的DNA分子或含DNA的分子(在本领域也被叫做“脱氧 核酶”或“DNA酶”)或RNA分子或含RNA的分子(也叫做“核酶”)。 催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生 物。这些碱基的衍生物在领域是熟知的。
催化核酸通常含有用于特异识别靶核酸的反义序列以及裂解酶的活 性的核酸。催化链裂解靶核酸内的特异位点。在本发明中特别有用的核 酶类型是锤头状核酶(Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334：585)， Perrimanet al.，(1992)Gene 113：157)和发夹结构核酶(Shippy et al.， (1999)Mol.Biotechnol，12：117)。
dsRNA
双链RNA(dsRNA)对于特异地抑制特殊蛋白的产生是特别有用的。 虽然不愿被理论所限制，但是一个小组已经提供了一种用于通过其可以 用dsRNA减少蛋白产生的机制的模型(Dougherty and Parks，(1995)，Curr. Opina.Cell Biol.7：399)。最近这个模型已经被修饰并扩展(Waterhouse et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959)。这个技术依赖于存在含有 与相关基因的mRNA基本一致的序列的dsRNA，其中mRNA编码本发 明的第一个方面的多肽。便利地，可以在重组载体或宿主细胞的单个开 发阅读框中生成dsRNA，其中用无关序列侧面连接有义和反义序列，这 使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，具有与无关序列形成的环结 构。对本发明的合适的dsRNA分子的设计及产生都是在本领域人员的能 力范围内，特别是结合于Dougherty和Parks，(1995)，Curr.Opin.Cell Biol 7：399；Waterhouse et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959；和 PCT出版物No.WO 99/32619、WO99/53050、WO99/49029、和 WO01/34815。
抗HIV构建体
本领域人员能发展出用于本发明的合适的抗HIV构建体。事实上， 已经发展出多种抗HIV反义构建体和核酶，并被描述于美国No. 5,811,275、5,741,706、和5,144,019、和PCT出版物No.WO 94/26877和 澳大利亚专利申请No.56394/94中。
基因
在本发明的方法包括GM HSCT中所用的有用的基因和基因片段(多 核苷酸)包括那些编码T细胞对特殊感染性病因感染的抗性的基因。这些 感染性病因包括，但不限定于HIV、T细胞白血病病毒和其他引起淋巴 增殖性疾病的病毒。
对于HIV/AIDS，可以使用多种基因和/或基因片段，包括但不限定 于：nef转录因子；一种编码特异地切割HIV基因的核酶的基因例如tat 和rev(Bauer et al.，(1997)Blood 89：2259)；HIV rev基因的转显性突变形 式，RevM10，它已经显示出抑制HIV复制(Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol. 71：4707)；HIV-1rev反应元件(RRE)的过度表达构建体(Kohn et al.，(1999) Blood 94：368)；编码其的表达能抑制HIV感染细胞或复制的RNA或蛋白 的任何基因；和它们的片段及组合物。
可以使用这些基因或基因片段的可稳定表达的形式。术语“可稳定 表达的”在此被定义为在基因或基因片段被转移到细胞之后，能够至少 在宿主细胞的半永久性基础上以及在分裂和/或分化后的细胞子代中表达 基因或基因片段(“功能片段”)的产物(RNA和/或蛋白)。这要求无论 是否是包含在载体中的基因或基因片段都要具有合适的用于将DNA转 录为RNA的信号序列。另外，当基因或基因片段所编码的蛋白是影响患 者的状态的活性分子时，DNA也编码转译信号。
在绝大多数情况中，基因或基因片段被包含于载体中。本领域一般 人员都知道可以被用于表达所需的RNA或蛋白的表达载体。
表达载体是能指导在此所含的DNA序列的转录及所形成的RNA的 转译的载体。表达载体能在细胞内复制，能被遗传学修饰，它包括质粒、 噬菌体、病毒和微型染色体。同样地，基因或基因片段可以成为细胞的 染色体DNA的整合部分。重组载体和方法学通常是熟知的。
用于表达本发明的蛋白的表达载体可以包括复制起点。适当构建的 表达载体包括用于细胞内的自主复制的复制起点，或能整合到宿主细胞 的染色体中。这些载体也可以包含选择性标记物，有限数目的有用的限 制性酶位点、高拷贝数目和强启动子。启动子是指导RNA聚合酶与DNA 结合并启动RNA合成的DNA序列；强启动子引起了高频率的启动。
在一个实施方式中，DNA载体构建体包括一个启动子、增强子和多 腺苷酸化信号。启动子可以选自由HIV，例如长末端重复(LTR)、猴病 毒40(SV40)、Epstein Bar病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、Rous肉瘤 病毒(RSV)、莫洛尼病毒、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人肌动蛋白、 人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酐、人金属硫蛋白(metalothionein)所 构成的非限制性的组。在另一个实例中，使用了诱导型启动子，使得可 以控制所插入的基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
增强子可以选自包括但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋 白、人肌肉肌酐和病毒增强子例如那些来自CMV、RSV和EBV的增强 子的组。启动子和增强子可以来自相同的或不同的基因。
例如，可以从由LTR多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号、特 别是其中的SV40最小腺苷酸化信号所组成的组中选出多腺苷酸化信号。
本发明的表达载体可以被可操纵地连接到编码本发明所用的RNA 或蛋白的DNA上，即载体能指导所连接的DNA分子的复制以及DNA 分子所编码的RNA或蛋白的表达。因此，对于蛋白，表达载体必须在所 连接的DNA分子的上游具有转录起始信号，保持正确的阅读框以容许 DNA分子在控制序列的控制下的表达和DNA分子所编码的所需蛋白的 产生。表达载体可以包括但不限于，克隆载体、经修饰的克隆载体和特 别设计的质粒或病毒。可以使用诱导型启动子，使得可以控制所插入的 基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
本领域人员能生成在细胞内有功能的DNA构建体。为了测试表达， 利用对与被遗传学修饰的那些细胞相同类型的细胞的组织培养可以在体 外测定遗传构建体的表达水平。
遗传学修饰的方法
可以用标准的重组方法将遗传学修饰引入到正被用于基因治疗的细 胞内。例如，对培养的HSC的逆转录病毒载体的转导是一种本领域已知 的成功方法(Belmont and Jurecic(1997)″Methods for Efficient Retrovirus-Mediated Gene Transfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells，″in Gene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)Humana Press，pp.223-240； Bahnson et al.，(1997)″Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer toCD34+-Enriched Cells，″in Gene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)， Humana Press，pp.249-263)。其他的载体包括但不限于那些腺病毒来源的 或慢病毒来源的、和莫洛尼小鼠白血病病毒来源的载体。
下面的方法对HSC的遗传学修饰也是有用的：颗粒介导的基因转移 例如用基因枪(Yang，N.-S.and P.Ziegelhoffer，(1994)″The Particle Bombardment System for Mammalian Gene Transfer，″In PARTICLE BOMBARDMENT TECHNOLOGY FOR GENE TRANSFER(Yang，N.-S. and Christou，P.，eds.)，Oxford University Press，New York，pp.117-141)、脂 质体介导的基因转移(Nabel et al.，(1992)Hum.Gene Ther.：3：649)， coprecipitation of genetically modified vectors with calcium phosphate (Graham and Van Der Eb，(1973)Virol.52：456)、电穿孔(otter et al.，(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7161)、和微注射(Capecchi，(1980)cell 22：479)，以及其他的能稳定地将可能是在载体内的基因或寡核苷酸转移 到HSC和其他被遗传学修饰的细胞内使得基因被表达至少部分时间的方 法。
发育中的TCR库偏向或偏离特异抗原：过敏和自身免疫性疾病
增强胸腺对造血干细胞的摄取的能力意味着可以操纵树突状细胞的 性能和类型。例如，可以用最终被表达于胸腺(以及体内的其他部位)的树 突状细胞内的特异基因转染干细胞。这些基因可以包括那些编码特异抗 原的基因，针对这些特异抗原的免疫应答可能是有害的，例如在自身免 疫性疾病和过敏中。
本发明的这个部分是立足于一个发现，就是性类固醇抑制对BM功 能性和免疫细胞功能性具有直接作用，以及最终对自身免疫性患者的胸 腺的再活化将有助于克服患者所患的自身免疫性疾病。这一相同的原理 也被应用于患有过敏的患者。当胸腺被再活化时，形成了新的或修饰的 免疫系统，它们不再识别和/或应答于自身抗原。
根据本发明，可以应用如下方案。首先将诊断为自身免疫性疾病(例 如I型糖尿病)的患者免疫抑制以终止疾病进展。可以通过单独地或与抗 T细胞和抗B细胞抗体(例如去除T细胞的抗CD3或抗T细胞伽玛球蛋 白和去除B细胞的抗CD19、CD20或CD21)一起施与免疫抑制剂(例如环 孢菌素或雷帕霉素)实现这一点。在患者被免疫抑制的同时，可以施与性 类固醇类似物(或其他的阉割方法)。然后可以用G-CSF动员其自身的T 细胞。如果他的自身免疫性是由其T细胞与他之前所遇到过的病因的交 叉反应所引起的，那么T细胞的清除将去除自身反应性T细胞，以及新 发育的T细胞将不会继续识别他的细胞(例如他的β胰岛细胞)为外来细 胞。通过这种方式，缓解了其自身免疫性疾病。此外，一旦其自身免疫 性疾病已经被缓解，可以停止性类固醇去除治疗，由此恢复患者的生育 力。
在本发明的另一个非限制性的实例中，用异基因干细胞重建自身免 疫性疾病。在一些具体实施方案中，这些异基因干细胞是脐带血细胞， 它不包含成熟T细胞。
在一些实施方案中，所移植的HSC可以在完全的骨髓清除或骨髓耗 竭之后，因此造成了完全的HSC移植(例如，每次移植每kg体重5×106 细胞)。在一些具体实施方案中，只需要实现较小的骨髓清除，例如在 2-3Gy照射(或300rad)后施与约3-4×105个细胞/kg体重。在一些具体实施 方案中，使用了T细胞清除(TCD)、和/或另一种免疫细胞清除的方法(见， 例如实施例2)。最小到10％嵌合体就可能足以缓解患者的过敏或自身免 疫性疾病的症状。在一些具体实施方案中，供者HSC是来自脐带血(例如， 1.5×107细胞/kg用于受体的植入)。
在其他实施方式中，直到骨髓清除化疗前45天，患者开始接受Lupron 并与BMT同时连续接受Lupron，使得暴露于药物的总长在9个月左右 (等于3次注射，每次注射给药可维持3个月)。在研究期间的不同的间隔 内，可以收集血样分析T细胞的数目(特别是新近胸腺迁出)和功能(具 体的是体外对T细胞刺激的应答)。这个实施方式也通常适用于在此所描 述的其他目的的HSCT(例如癌症放疗和化疗后的HSCT)。
在其他实施方式中，可以在淋巴清除之后移植HSC。在一些实施方 式中，可以选择性清除T细胞和/和B细胞，按需去除细胞(例如那些涉 及自身免疫性和过敏的细胞)。选择可以包括去除活化细胞或涉及自身免 疫或过敏应答的细胞类型。可以根据细胞表面标记物例如CD4、CD8、 B220、thy1、TCR、CD3、CD5、CD7、CD25、CD26、CD23、CD30、 CD38、CD49b、CD69、CD70、CD71、CD95、CD96、抗体特异性或Ig 链、或上调调细胞因子受者例如IL-2R B链和TGFβ选择细胞。一种熟知 的用于耗竭的方法是使用抗淋巴细胞球蛋白。其他选择和分选细胞的方 法是熟知的，包括磁性和荧光细胞分离、离心和更具体的是血浆置换、 白细胞分离术和淋巴细胞分离术。
在一些实施方式中，在没有骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴耗竭、T细 胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除时进行HSCT。
在其他实施方式中，本发明的方法还包括通过例如施予免疫抑制剂 (例如，环孢菌素、强的松、Ozothioprine、FK506、依木兰和甲氨碟呤)将 患者免疫抑制(见美国No.5,876,708)。在一个实施方式中，在无HSCT 时进行免疫抑制。在一个实施方式中，结合HSCT(例如在其之前、与之 同时和之后)进行免疫抑制。在另一个实施方式中，在不存在骨髓清除、 淋巴清除、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭时 进行免疫抑制。仍在另一个实施方式中，结合骨髓清除、淋巴清除、T 细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭进行免疫抑制 (例如在其之前、与之同时和之后进行)。
如上所述，骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清除、免疫抑制、T细胞清 除和/和其他选择性的免疫细胞清除是在本申请书的全文中都被使用的免 疫细胞清除的非限制性的实例类型。通用术语“免疫细胞耗竭”在此被 定义为包括这些方法中的每一种方法，即骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清 除、T细胞清除和/或其他的选择性的免疫细胞清除(例如B细胞和NK 细胞耗竭)。本领域人员容易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可 以用任何一种(或多种)其他的“耗竭”方法取代这些“耗竭”方法中的 任何一种。
在一个实施方式中，耗竭了NK细胞。NK抗体用于耗竭NK细胞群 在本领域是已知的。例如，抗NK抗体的一个来源是抗人胸腺细胞的多 克隆抗血浆。美国No.6,296,846描述了NK和T细胞耗竭的方法以及非 骨髓清除治疗和嵌合淋巴造血细胞群的形成，所有的这些都可被用于本 发明的方法。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括例如在HSCT之前，通过 血流灌注从供者中所获得的器官(例如肝或肾)中吸附受者血液中的天 然抗体。
在另一个实施方式中，本发明还包括减少T辅助细胞的治疗(T cell help-reducing treatment)，例如增加直接和间接(例如通过对第二细胞因子 活性水平的刺激或抑制)促进对移植物的耐受性的细胞因子(例如 IL-10、IL-4和TGFβ)的活性水平，和减低促进对移植物的排斥的细胞因 子的活性(例如，一种抵抗和抑制耐受性的细胞因子(例如，IFNβ、IL-1、 IL-2和IL-12)。在一些实施方式中，施予细胞因子以促进耐受性。细胞 因子可以来源于供者物种和来源于受者物种(见，例如，美国No. 5,624,823，它描述了用于这种用途的编码猪白介素-10的DNA)。辅助诱 导治疗的持续时间可以近似等于和少于受者物种的成熟T细胞在首次被 抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间(在人类这通常是8-12天)。 在其他实施方式中，持续时间是近似等于或少于受者的成熟T细胞在首 次被抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间的2、3、4、5和10倍。 在存在和缺少可以刺激受者的成熟T细胞释放细胞因子的治疗时，例如 缺少强的松(17，21-dihydroxypregna-1，4-diene-3，11，20-trione)时可以施予 短期的辅助减少治疗。可以在引入移植物之前或大致时间时，开始辅助 减少治疗。短期的辅助减少治疗可以是术前和术后的。在一些实施方式 中，供者和受者是I型匹配的。
仍在进一步的具体实施方案中，其中抗原不是一种自身抗原而是一 种外来抗原(例如，花粉和海产品)，可以采用相似的策略。如果过敏是异 常T和B细胞克隆的一些机会性活化所引起的，那么去除T细胞和B细 胞的免疫抑制，以及随后的(和与之同时的)胸腺再活化将去除引起过敏应 答的细胞。因为过敏是异常T和B细胞克隆的机会性活化所引起的，那 么它就不像会再次出现，并且新再生的胸腺也可以生成调节T细胞。虽 然可能仍有自身反应性IgE循环在患者体内，但它们最终会消失，因为 有效地去除了分泌它们的细胞。一旦免疫系统已经被重建，可以停止性 类固醇清除治疗，并恢复患者的生育力。
本发明提供了用于治疗自身免疫性疾病的方法，该方法或者不进行 如在此所述的BMT、或进行BMT或使用GM细胞。本发明的方法还可 以包括器官和细胞移植以修复和取代受损的细胞、组织和器官。例如， 在IDDM中，患者可能需要胰岛细胞移植以取代受损的胰岛细胞。利用 本发明的方法可以实现对自身免疫性疾病的临床症状的预防，其中患者 有临床前症状和家族易感性。
在本发明的进一步的具体实施方案中，如果已知涉及自身免疫性疾 病和过敏的抗原，可以采用对HSC的遗传学修饰。例如，在多发性硬化 中，抗原可以是髓鞘糖蛋白(MOG)、髓鞘少突神经胶质蛋白、髓鞘碱性 蛋白和蛋白脂质蛋白。在恶性贫血中，抗原可以是胃的质子泵。在I型糖 尿病中，抗原可以是前胰岛素(J Clin Invest.(2003)111：1365.，GAD or an islet cell antigen.T cell epitopes of type II collagen have been described with rheumatoid arthritis in(Ohnishi etal.(2003)Int.J.Mol.Med.1：331)。对于桥 本氏甲状腺炎，抗原是甲状腺过氧化物酶，以及对于Graves病，抗原是 甲状腺刺激激素受体(Dawe etal.，(1993)Springer Semin.Immunopathol.14： 285)。系统性红斑狼疮抗原包括DNA、组蛋白、核糖体、snRNP、scRNP 例如H1组蛋白。特别的，Ro(SS-A)和La(SS-B)核糖核蛋白抗原(例如Ro60 和Ro52)与系统性红斑狼疮(SLE)及类风湿关节炎相关。重症肌无力抗原 包括乙酰胆碱受体α链和一些在Atassi eta l.，(2001)Crit.Rev.Immunol. 21：1中所描述的T细胞抗原决定簇。同样的，某些过敏反应是对已知抗 原的应答(例如在猫过敏中，对猫唾液抗原过敏)。在这些情况中，在被施 予给受体之前，可以首先将供者HSC遗传学修饰以表达抗原。根据它们 的CD34的表达可以分离出HSC。可以给患者一起施予这些细胞和增强 BM功能性的性类固醇介导的信号途径的抑制剂例如GnRH类似物。因 此，遗传性修饰的HSC不仅发育成DC并因此耐受新形成的T细胞，它 们还进入BM作为DC并删除新的、自身反应的和过敏的B细胞。因此， 在胸腺和骨髓中都实现了对自身抗原或过敏原的中枢耐受，据此缓解了 患者的自身免疫性疾病或过敏的症状。在一些具体实施方案中，也使用 免疫细胞耗竭和抑制。
在另一个用于耗竭高敏T细胞的实例中，当靶抗原为已知抗原时， 可以用编码需要对其耐受性的特异抗原的基因转染胸腺的上皮干细胞(例 如自体上皮干细胞)。通过用Ab MTS 24和它的人类对应物对胸腺上皮前 体细胞的标记可以将其从胸腺(特别是胚胎的胸腺)中分离出来(见Gill et al.，(2002)Nat.Immunol.3：635)。
因此，发明的基本原理是用T细胞和/或B细胞(如果合适)耗竭、随 后的重建新的耐受性的免疫系统终止正患有的自身免疫性疾病和预防高 度预测病例(例如家族性分布)发展为自身免疫性疾病。首先诊断自身免疫 性疾病，并确定是否存在家族(遗传)易感性。下一步，确定可能通过抗原 模拟和偶然的克隆活化所导致的自身免疫性疾病的患者内是否已经存在 近期的长时间感染。事实上确定疾病的病因可能是不可能的。下一步， 进行T细胞耗竭，以及如果合适，进行B细胞耗竭(和其他免疫细胞耗竭)， 联合化疗、放射治疗和/或抗B细胞试剂(例如，CD19、CD20和CD21) 或特异的Ig亚型的抗体(抗IgE)。通过给患者施予GnRH，提高了骨髓和 免疫细胞的功能性。与之同时注射HSC，HSC已经在体外被编码自身抗 原的基因所转染，HSC进入复壮的胸腺并转化为DC，以给发育中的T 细胞呈递自身抗原，据此诱导耐受性。所转染的HSC也将在骨髓内产生 抗原并将抗原呈递给发育中的B细胞，据此造成它们的删除，这与发生 于胸腺T细胞上的相似。免疫抑制方案(抗T、B治疗)的用法将克服预先 存在的潜在自身反应性T和B细胞的任何不适当的活化。此外，在无明 显的遗传易感性的情况中，GnRH可以联合G-CSF注射以增加血液中的 自体HSC的水平以增强胸腺再活化。
在一些实施方案中，将来自供者(如MHC相配的供者)的造血和淋 巴干细胞和/或祖细胞移植到受体体内以增加胸腺的最终的再生速度。在 另一个具体实施方案中，这些所移植的细胞来自无自身免疫性疾病或过 敏的健康供者，它们取代了患者的异常干细胞和/或祖细胞。
在一个实施方案中，通过清除患者的T细胞群至少部分消除了患者 的自身免疫性疾病。性类固醇介导的信号途径被阻断。在新的T细胞对 外周血的重新分群后，仍不能诱导对自身的耐受性的异常T细胞被从T 细胞群中清除。
在另一个实施方案中，通过相同的淋巴细胞耗竭治疗，并同时通过 对性类固醇介导的信号途径进行阻断而增强胸腺T细胞发育，以容许“干 净的”T细胞群对外周血流重新入住，消除了患者的引起过敏的免疫系统 细胞。在其他情况中，在阻断性类固醇信号途径之后，因为BM和其他 免疫细胞的功能性的增加缓解了过敏和自身免疫性疾病。
预防
本发明还提供了通过联合胸腺再活化，或者先于胸腺再活化或在没 有胸腺的再活化的情况下，增强BM和/或其他免疫细胞的功能性，以预 防感染、增加感染抵抗力、和治疗患者的感染的方法。在这个阶段，患 者的免疫系统被增强、复壮和再活化，据此增加了它对外来抗原例如病 毒和细菌的应答。例如，如用病毒(HSV)攻击所证实的那样，在图13-17 中显示了胸腺再活化对小鼠的免疫系统的作用。先前具有胸腺再活化的 小鼠表现出对HSV感染的抗性，而没有胸腺再活化(衰老的胸腺)的那些 小鼠有着更高水平的HSV感染。已知小鼠的免疫系统是非常类似于人的 免疫系统并被用作为人类疾病的模型。因此，小鼠的结果可以被用于显 示人类的应答。显示了胸腺再活化对人的作用的数据再次验证了这一点。 在实施例23中举例说明了增加免疫细胞的功能性的能力，其中最早到阉 割后3-7天以及在胸腺再活化之前增加了阉割小鼠的TCR的应答性和增 殖。
疫苗应答的提高
本说明书涉及“主动疫苗接种”的领域，其中将抗原施予给患者， 然后其免疫系统通过形成抗抗原的免疫应答应答于抗原。疫苗接种可以 包括预防性和治疗性疫苗。如本领域人员所知道的那样，使用本发明的 方法，实际上可以用任何疫苗接种的方法结合性类固醇抑制，不需过多 的试验。在一些实施方案中，可以先于胸腺再活化或与之同时给予疫苗 接种。按需也可以使用多个剂量(例如强化免疫接种)。
在一个实施方案中，疫苗是死的和或灭活的疫苗(例如经热火其他化 学物)。在另一个实施方案中，疫苗是减毒疫苗(例如脊髓灰质炎和天花疫 苗)。在一个实施方案中，疫苗是亚单位疫苗(例如乙型肝炎病毒疫苗、其 中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是抗原特异性蛋白)。
在另一个实施方案中，疫苗是重组疫苗。一种类型的重组疫苗是其 中病因(例如病毒)已经被删除了特异的引起病毒毒性的基因使得病毒为 无毒的减毒疫苗。另一种类型的重组疫苗采用了感染性的但无病毒毒性 的载体的用法，载体被遗传学修饰为插入了编码靶抗原的基因。重组疫 苗的实例是痘苗病毒疫苗。
仍在另一个具体实施方案中，疫苗是DNA疫苗。基于DNA的疫苗 通常使用细菌质粒在被接种的宿主中表达蛋白免疫原。用重组DNA技术 将编码相关免疫原的cDNA克隆到真核表达载体中。然后在细菌内扩增 疫苗质粒，并将其纯化、直接整合到被接种的宿主体内。可以通过针头 注射盐水中的DNA、或通过将DNA涂层的金珠输送到皮肤内的基因枪 设备接种DNA。本领域人员熟知并容易明白制备和使用这些疫苗的方法。
有一些能影响免疫应答的性能和程度的参数：抗原的水平和类型、 疫苗接种的部位、合适APC的利用度、个体的一般健康状况、以及T和 B细胞池的状态。其中，T细胞是最脆弱的，因为在青春期开始后变得显 著的性类固醇所诱导的明显的胸腺输出的减少和性类固醇对T细胞应答 的普遍抑制。仅仅当潜在的应答T细胞在呈递广泛的特异性组分的原初T 细胞的存在和存在正常的Th1对Th2细胞及Th到Tc细胞的比例上都是 最优化的时，逻辑上才能实施任何的疫苗接种项目。T细胞的类型有助于 支持免疫应答决定是否所生成的抗体是C’依赖性抗体及巨噬细胞非依赖 性的防御将被动员(1型应答)，或是否所生成的抗体是C’非依赖性抗体及 巨噬细胞依赖性的防御将被动员(2型应答)(综述见，Fearon and Locksley(1996)Science 272：50；Seder and Paul(1994)Annu.Rev.Immunol. 12：635)。传统上，1型应答与细胞毒T细胞的产生有关以及2型应答与 抗体的产生有关。因此，所生成的细胞因子的水平和类型也可以被放大 到足以应付所需的应答(例如，一些疾病要求Th1应答，一些要求Th2应 答，例如保护性免疫力)。这包括辅助地给予Th1和Th2型细胞因子(例 如，给予重组细胞因子和编码细胞因子的DNA)以变换患者的免疫应答模 式。免疫刺激性CpG寡核苷酸也已经被用于将对各种疫苗剂型的免疫应 答变换为更多的Th1型应答。
通过在此所述的方法，性类固醇抑制造成了BM和免疫细胞功能性 的增加，在没有胸腺再活化或先于胸腺再活化的情况下或与胸腺再活化 同时，它容许产生对疫苗的免疫应答性。
这个方法可以联合任何其他形式的免疫系统刺激，包括佐剂、附加 分子和细胞因子治疗。例如，有用的细胞因子包括，但不限定于作为普 通免疫生长因子的白介素2(IL-2)和IL-15、将应答偏向到Th2(体液免疫) 的IL-4、和将应答偏向到Th1(细胞介导的炎性应答)的IFNγ、促进Th1 的IL-12和促进Th2细胞的IL-10。附加分子包括但不限定于CTLA4的 抑制剂，它通过促进正常地被CTLA4所抑制的CD28/B7.1，B7.2刺激途径 增强了免疫应答。
重组基因表达载体可以被用于发明的疫苗接种方法。重组载体可以 是质粒或粘粒，它包含编码抗原的发明的多核苷酸，但也可以是病毒和 逆转录病毒。在多核苷酸疫苗中所用的载体可以是“裸的”(即不与转运 载体例如脂质体、胶状颗粒等相关)。为了方便起见，在本说明书中所用 的术语“质粒”将指的是质粒或粘粒，根据哪个是适合用于表达相关肽(其 中编码所需肽的基因的大小决定了两者之间的选择)。常用的质粒可以是 pBR322。
在本发明的疫苗接种方法中可以利用的各种病毒载体包括腺病毒、 疱疹病毒、痘苗病毒和RNA病毒例如逆转录病毒。逆转录病毒载体可以 使用小鼠和鸟逆转录病毒的衍生物。逆转录病毒的实例包括，但不限定 于莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMuS-V)、 小鼠乳房肿瘤病毒(MuMTV)和Rous肉瘤病毒(RSV)。其他可用于发明的 疫苗接种方法中的质粒和病毒载体在疫苗领域是熟知的。
对BM和HSC的作用
本发明提供了用于增加患者的BM的功能包括增加HSC的产生和增 强造血作用的方法。这些方法在多个应用中都是有用的。例如，无论是 用于癌症或其他的目的，化疗和放疗的其中一种困难的副作用就是它们 对患者BM的负性影响。根据化疗的剂量，BM可以被损伤或清除以及血 细胞的产生可以被阻碍。根据本发明，在化疗治疗后施予一个剂量的性 类固醇类似物(例如LHRH类似物)有助于化疗对BM和血细胞的损伤 的恢复。同样的，在给予化疗前数周施予LHRH类似物增加了HSC和其 他的血细胞群，使得减少了化疗的一些有害作用。
例如，BM功能的提高可以应用于患有血液疾病的患者。术语“血液 疾病”在此被定义为直接或间接地累及血液系统的细胞的任何疾病和病， 包括但不限于与造血相关的疾病例如白血病。因此，例如，本发明的方 法可用于在异基因HSCT中用来自受者的新细胞(匹配的和不匹配的)， 或在自体HSCT后用患者自己的细胞取代血液系统的癌细胞。
BM所增加的HSC产生引起了红细胞的增加，反过来它对处理RBC 产生是有用的。通过寻找例如增加的红细胞比容可以容易地确定出这一 点。
在一些实例中，所增加的HSC是CD34+或CD34lo HSC。所动员的 HSC(例如用G-CSF)能有助于“修复”和复壮组织例如心脏组织和肺组 织。HSC具有生成非造血组织的能力。虽然在体外已经进行了很多这方 面的工作，一项在Mayo Clinic Rochester的研究已经显示在BMT之后的 少量心肌细胞是供者来源的。相似的，密西根的Beuamont医院已经用 HSC修复受损的心肌，尽管HSC是否成为肌细胞和血管还不清楚。小鼠 试验也已经显示出HSC变成产胰岛素的β细胞的能力。其他工作已经显 示出HSC能成为骨骼肌(肌细胞)、肝脏(肝细胞)、骨骼、结缔组织、上 皮组织(例如肺、胃肠道和皮肤的上皮组织)、血管、神经元和胰岛β细胞。
在此所述的方法可用于修复对BM的损害和/或有助于取代已经被各 种治疗(例如癌症化疗药物、放射治疗)和疾病(例如HIV、慢性肾功能 衰竭)所损害或破坏的血细胞。
在一些化疗方案中，例如治疗任何血液肿瘤的大剂量化疗，对BM 的清除是必需的作用。在清除发生后可以马上使用发明的方法以刺激BM 并增加HSC和它们的子代血细胞的产生，以缩短患者的恢复时间。在施 予化疗之后，从患者体内清除化疗药物通常需要一天或更多天，给患者 施予在此所述的方法的一个剂量的LHRH类似物。这可以联合施予自体 或异基因BM或造血干细胞或祖细胞、以及其他的因子例如集落刺激因 子(CSF)和干细胞因子(SCF)。
或者，患者可以具有不好的(或“疲劳的”)BM功能并可能不能产 生足够多的或正常数目的HSC及其他的血细胞。多种病变都可以造成这 一点，包括正常的衰老、长时间的感染、化疗后、放疗后、慢性疾病状 态包括癌症、遗传异常和移植诱导的免疫抑制。另外，照射例如全身照 射可以对BM的生产能力有着重大影响。这些病变也可以或被预先治疗 以最小化负面作用(例如化疗和/或放射治疗的负面作用)，或在发生后被 治疗以逆转作用。
对T细胞的作用
通过摄取性类固醇介导的信号途径的阻断剂(例如GnRH激动剂) 可以暂时地抑制雄性和雌性的性类固醇。已知类固醇的缺失造成了胸腺 功能的再活化并增强了原初T细胞的产生。此外，甚至在那些新的T细 胞有机会离开胸腺之前，原有的T细胞对刺激是更为敏感的，造成了更 为有效的免疫应答。所增加的应答性在缺失性类固醇的数天内是明显的 (见，例如实施例23)。这可能是因为没有了性类固醇的抑制作用。这可 能是因为再活化的和被再活化的胸腺所产生的“辅助”和“辅佐”因子， 它们能联合外来刺激共刺激T细胞。也因为免疫系统的许多细胞都具有 GnRH的表面受体，GnRH本身可以给T细胞提供其他的刺激。因为性类 固醇的缺失对外周T细胞的作用是如此的快，可以与给予例如疫苗的同 时给予GnRH作为单次治疗。一个月的剂型是有用的，它具有刺激免疫 应答的好的作用但没有性类固醇的更长时间缺失的副作用。也可以施予 随后的抗原的“强化”注射。
性类固醇抑制剂(例如GnRH类似物)对于强化癌症患者的所有形 式的免疫治疗都是有用的，特别是对逃离化疗和手术的癌细胞的清除， 对预防抵抗机会性感染也是有用的。可以预防性使用这些类似物以提高 设计用于预防例如感染或癌症的疫苗接种计划的免疫应答。
本发明的方法利用了对性类固醇信号途径的抑制。性类固醇抑制了 胸腺、BM和全身的T及B淋巴细胞的功能，这些淋巴细胞聚集在身体 的主要淋巴区域内，包括但不限于血液、淋巴结、粘膜组织(例如呼吸道 的、胃肠道的和生殖道的)。已经惊奇地发现对性类固醇的清除和/或对性 类固醇介导的信号途径的阻断不仅可以被用于再生胸腺(以及因此的T 细胞的数目和“质量”)，还可以被用于或在没有胸腺再活化的情况下、 或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，提高原有的和新产生的T 细胞(和免疫系统的其他细胞)的功能性。
差的免疫应答可以有着快速的和临床重要的结果。这可以意味着对 常见感染(例如流感)的易感性增加、对癌症和肿瘤的易感性增加、和/ 或对疫苗接种的应答性差。
总T细胞池中的原初T细胞的数目和/或比例的增加对多种临床(亚 临床)病变和疾病都有着正面的快速的治疗作用，这些病变和疾病包括但 不限于癌症、免疫缺陷(特别是病毒感染，例如获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)和严重急性呼吸综合症(SARS)和流感)、自身免疫性、移植、 过敏以及提高疫苗接种计划的一般效率。在共拥有的和共同未决美国申 请No.10/418,747、10/419,039、10/418,953、10/418,727、10/419,066、和 10/419,068中都详细地描述了这些申请中的每个申请。
关于本发明的方法在预防病毒感染上的应用，在SARS病毒来临时 观察到了功能差的免疫系统的作用的新近实例。这个病毒尽管与感冒病 毒相关，但却是非常不同的，使得成熟的免疫系统不能识别它。仅仅原 初T细胞能对付先前未知的感染例如SARS。但是，因为只有少量的原初 T细胞以及不能产生合理的附加数量，一般成人都对该疾病高度易感，而 儿童似乎能对付这个疾病。在死亡率图上可以反映出这个人口统计学， 平均死亡年龄为近50岁，没有记录到青春期前的死亡病例。
在一个实例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类 似物)被用于强化T和B淋巴细胞对抗原刺激的应答性。这个刺激可以是 进入人体内的微生物(例如细菌、病毒、真菌、寄生虫等)。
在另一个实例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH 类似物)被用于增强对疫苗抗原的免疫应答。
在一个非限制性的实施例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用 LHRH/GnRH类似物)发生在免疫系统攻击之前。这容许出现性类固醇缺 失的时间。也可以与作用为用于直接增强免疫应答(经细胞表面的信号途 径介导，增加了细胞因子，减少了抑制物等)的刺激物的给药同时或依次 完成对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类似物)。也可以分 次给予对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类似物)的快速 作用是因为增强了原有的淋巴细胞(和非淋巴细胞)的功能性。随着时间的 性类固醇的减少增加了T细胞、B细胞和APC的产生和功能性，它们累 加地、协同地和互补地持续增强应答。然后可以用新的T细胞、B细胞 和其他免疫细胞例如APC的增加以及原有T细胞、B细胞和APC对刺 激的敏感性的增加产生对原发感染、继发感染、疫苗接种等的更为有效 的免疫应答。
因此，根据本发明的方法，用性类固醇信号途径的阻断剂通过启动 这些免疫细胞的活性或功能性的增加引起了临床正向作用，甚至在这些 药物能引起显著的胸腺再活化之前。
根据本发明，这些药物也可以被用于有助于取代可能已经被各种其 他的治疗和疾病包括但不限定于癌症化疗药物、和/或放射治疗以及疾病 例如慢性肾功能衰竭所损伤和破坏的血细胞。如在此的其他地方所更详 细描述的那样，性类固醇抑制药物联合G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成 素(EPO)、SCF、或其他激素和细胞因子的用法也可以被用于进一步提高 对这些化合物增强血细胞产生的作用。
用语“修饰T细胞群组成”在此被定义为改变由功能性所定义的以 及通过特征性分子的表达所定义的T细胞亚组的性质和/或比例。这些特 征性分子的实例包括但不限定于T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、 CD28、CD44、CD45、CD62L和CD69。
“增加细胞的数目”，例如增加T细胞的数目，在此被定义为一个对 象中的胸腺和/或循环和/或脾和/或BM和/或外周组织例如淋巴结、胃肠 道、泌尿生殖道和呼吸道中的T细胞的数目的绝对增加。这个词也表示T 细胞的相对增加，例如当与B细胞比较时。
“具有受抑的或异常的T细胞群或功能的对象”包括人类免疫缺陷 病毒所感染的个体，特别是患有AIDS、或任何其他的攻击T细胞的病毒 或感染的个体，或患有已经鉴定出缺陷基因的任何T细胞疾病的个体。 此外，这个词包括任何的青春期后个体，特别是具有青春期后胸腺萎缩 所造成的免疫应答性的减低和疾病发病率的增加的老年人。
在对象感染有HIV的情况中，将HSC遗传性修饰使得它们和它们的 子代特别是T细胞、巨噬细胞和DC能耐受HIV病毒的感染和/或破坏是 有用的。遗传学修饰可以包括将一个或多个阻止病毒复制、装配和/或感 染的核酸分子引入到HSC内。这些核酸分子可以是编码抗病毒蛋白的基 因、反义构建体、核酶、dsRNA和催化核酸分子。
在对象具有缺陷T细胞的情况中，HSC可以被遗传性修饰使得缺陷 正常化。对于疾病例如T细胞白血病，修饰可以包括引入核酸构建体或 基因使得HSC正常化并抑制或减少它们成为癌细胞的可能性。
本领域人员明白本发明在治疗具有明确的遗传基础的任何T细胞疾 病中都可能是有用的。
本发明的方法对于治疗AIDS也是有用的，其中治疗包括减少病毒负 荷、增加T细胞数目和功能性、通过对性类固醇信号途径的抑制再活化 胸腺功能。患者可以接受已经被遗传性修饰的HSC，使得所有子代(例如 T细胞和DC)能耐受HIV的进一步感染。这意味着不仅患者被清除了HIV 病毒，而且患者不再易感于常见感染，因为T细胞已经恢复到正常水平， 而能耐受HIV的新的T细胞能去除任何残余病毒所感染的细胞。理论上， 相似的策略可以被应用于对任何T细胞缺陷和任何靶向于T细胞的病毒 感染的HSC的基因治疗。
对B细胞的作用
和其他的免疫系统的细胞一样，B细胞的功能随着年老也被减低了， 这部分是因为T细胞产生的减少和所造成的T细胞辅助的缺乏。但是， 也有着显著的年龄相关的B细胞功能的变化(Hu et al.，(1993)Int，Immunol. 5：1035-1039)。尽管因为牢固调节的内环境稳态机制，B细胞数目在整个 生命中仍是相对恒定的，但是减少了BM的输出、外周B细胞的克隆扩 增，以及免疫应答的减弱(LeMaoult et al.，(1999)J.Immunol. 162：6384-6391)。在老龄中对外来抗原的抗原应答的减低被认为主要是归 结于T细胞辅助的减少(Hu et al.，(1993)Int.Immunol.5：1035-1039， LeMaoult et al.，(I999)J.Immunol.162：6384-6391)。不过，类别转换缺陷 (Weksler et al.，(2000)Vaccine 18：1624-1628)以及高亲和力抗体的选择性 缺失可能有着作用(Nicoletti et al.，(1993)J.Immunol.150：543-549)。
对年老小鼠的阉割造成了IL-7敏感的B细胞祖细胞包括晚期原B细 胞、前B细胞和未成熟B细胞的增加(Ellis et al.，(2001)Int.Immunol.13： 553-558)。这种循环B细胞的增加大部分是因为新近BM迁出 (CD45RloCD24hi)数目的增加，并且这些细胞直到阉割后54天仍处于上升 的水平(Ellis et al.，(2001)Int Immunol.13：553-558)。
因此，可以在没有胸腺再活化或先于胸腺再活化的情况下或与胸腺 再活化同时，用本发明的方法增加B细胞的数目和功能性。这对于增加 对正常患者和有缺陷的免疫系统的患者例如那些接受疾病治疗方案的患 者中的细菌感染的控制(通过预防或治疗)可能是有用的。所增加的B细胞 数目和功能性在术后、和/或烧伤幸存者、和其中患者的免疫系统是受损 的其他情况中可能也是有用的。
对DC的作用
本发明也提供了增加DC功能性和/或DC数目的方法。在性类固醇 清除之后(例如给予LHRH类似物之后)，增加了胸腺和外周的DC，外周 DC可能也有助于T细胞刺激。DC是重要的抗原呈递细胞，所增加的数 目和/或功能在提高对病因例如癌症的应答性上可能是有用的。增强了的 DC功能性在实现对病因例如过敏原或自身抗原(对于自身免疫性疾病)的 耐受性上可能也是有用的。
对血小板的作用
本发明也提供了增加血小板数目和/或功能性的方法。血小板减少症 是常见的并有着多种病因，包括但不限定于贫瘠的BM和脾大。病变通 常造成非常难以治疗的出血性疾病。与血小板减少症相关的最常见的疾 病包括白血病、再生障碍性贫血、肝硬化和戈谢病。常常需要大量的血 液置换，因为用于输血的储存血中的血小板的半衰期很短。
对NK、NKT和Treg细胞的作用
本发明也提供了增加NK和NKT细胞的数目和/或功能性的方法(见 例如实施例17和图43及49)。这在对表现出NK缺陷的疾病例如克隆病、 Chediak-Highashi综合征的治疗上可能是有用的。在结缔组织病包括狼疮 和类风湿关节炎的患者中已经报告了受损的NK细胞功能。NK细胞在防 御癌症和感染性病因上是重要的。可能从发明的方法中受益的其他非限 制性的与NK细胞缺陷(数目的和/或功能的)相关的疾病包括疱疹病毒感 染(例如水痘-带状疱疹病毒(VZV、水痘、带状疱疹)、HSV、CMV和EBV)、 其他病毒感染(例如，麻疹、腮腺炎病毒、流感病毒和HIV，现在认为这 些都是至少部分被NK细胞所控制的)、分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌、 鸟型分枝杆菌，这些明显受NK和巨噬细胞的控制)、其他恶性肿瘤(例如， 实体瘤包括黑素瘤、乳腺癌和直肠癌)、用单倍体相同或不匹配的受者对 急性髓系白血病的BMT。NKT细胞是免疫应答的重要调节物，因为它们 是细胞因子的非常高产量的生产者，且不需要预先的活化。它们不仅在 预防自身免疫性疾病上有着作用，也促进了抗癌作用。Treg(常被定义为 CD4+CD25+)也是免疫应答的主要调节物，主要是通过它们的细胞因子产 物。
巨噬细胞
本发明也提供了用于增加巨噬细胞数目和功能的方法(见，例如实施 例17和图43)，它在帮助去除感染性病因特别是细菌上发挥着主要作用。
实施例
下面的实施例部分提供了发明的方法的具体实施例，但其不能被解 释为将发明限制为实施例的内容。
实施例1：逆转衰老造成的胸腺萎缩
材料和方法
动物：从Monash大学的中心动物服务处得到CBA/CAH和C57B16/J 雄性小鼠，并将其在常规条件中圈养。从Monash大学的中心动物服务处、 Walterand Eliza Hall医学研究研究所(Parkville，Vicotoria)和A.R.C. (Perth，Western Australia)得到C57B16/J Ly5.1，并将其在常规条件中圈 养。年龄从4-6周到26个月大不等，在相关的地方会指示出年龄。
手术阉割：经腹腔注射0.3ml 0.3mg甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NS W，Australia)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar_； Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)的盐水溶液将小鼠麻醉。通过阴 囊切口进行手术阉割：显露睾丸，用缝线将其结扎，然后与外周脂肪组 织一起将其取出。用手术订关闭伤口。假阉割就是在上述步骤后没有取 出睾丸，并被用作为所有研究的对照。
溴代脱氧尿苷(BrdU)掺入：小鼠接受了两次BrdU(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的腹腔内注射，每次剂量为100μl PBS内的100mg/kg 体重的BrdU，隔开4小时(即4小时的间隔)。对照小鼠只接受载体注射。 在第二次注射1个小时后，切开胸腺，或制成细胞悬浮液用于FACS分 析，或即刻将其包埋在Tissue Tek中(O.C.T.compound，Miles Inc.， Indiana)，在液氮中瞬间冷冻并在储存-70℃直到使用。
流式细胞术分析：用CO2窒息处死小鼠，并取出胸腺、脾和肠系膜 淋巴结。经一个200μm筛在冷PBS/1％FCS/0.02％Azide轻轻地洗涤器官， 离心(650g，5分钟，4℃)，并重悬于任一的PBS/FCS/Az中。将脾细胞 在红细胞裂解缓冲液中4℃孵育10分钟，洗涤并重悬于PBS/FCS/Az中。 利用血细胞计数器和溴化乙啶/吖啶橙以及在荧光显微镜(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下的观察重复测定细胞浓度和活力。
对于三色免疫荧光，用抗αβTCR-FITC、抗CD4-PE和抗CD8-APC(都 购自Pharmingen，San Diego，CA)标记细胞，随后是流式细胞术分析。或 用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或用B220-B(Sigma)和CD4-PE及 CD8-APC标记脾和淋巴结悬浮液。用购自Caltag Laboratories，Inc.， Burlingame，CA的抗生物素蛋白链菌素-三色结合体(conjugate)显示出 B220-B。
对于细胞的BrdU检测，用CD4-PE和CD8-APC表面标记细胞，随 后是如前所述的固定和透化作用(Carayon and Bord，(1989)J.Imm.Meth. 147：225)。简单地，将染色细胞在4℃，1％多聚甲醛(PFA)/0.01％ Tween-20中固定过夜。将洗涤后的细胞在500μl DNA酶(100Kunitz units， Roche，USA)，37℃下孵育30分钟以变性DNA。最后，将细胞与抗 BrdU-FITC(Becton-Dickinson)在室温下孵育30分钟，洗涤并重悬细胞 用于FACS分析。
对于TN亚组的BrdU分析，将细胞全体设门在APC的Lin细胞之 外，随后在BrdU检测之前检测CD44-生物素和CD25-PE。所有的抗体都 来自Pharmingen(San Diego，CA)。
对于四色免疫荧光，将胸腺细胞标记CD3、CD4、CD8、B220和 Mac-1，用抗鼠Ig-Cy5(Amersham，U.K.)共同检测，并设门分析阴性细 胞(TN)。它们还被染色CD25-PE(Pharmingen，San Diego，CA)和CD44-B (Pharmingen，San Diego，CA)，随后是如前所述的抗生物素蛋白链菌素-三 色(Caltag，CA)(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14：547)。然 后如上所述的进行BrdU的检测。
在FACSCaliburTM(Becton-Dickinson)上分析标本。根据0度和90 度散射光数值将不同的淋巴细胞设门，并用CellQuestTM软件 (Becton-Dickinson)分析数据。
免疫组织学：用恒冷切片机(Leica)切割出冷冻的胸腺切片，并将 其马上固定于100％丙酮中。
对于两色免疫荧光，用一组单克隆抗体双染切片：在该实验室所产 的MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey et al.，(1990) Immunol.70：66；表1)，以及用多价的兔抗细胞角蛋白抗体(Dako， Carpinteria，CA)测定上皮细胞决定物的共表达。用FITC结合的羊抗鼠 Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示出所结合的mAb，以及用 TRITC结合的山羊抗兔Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示 出抗角蛋白抗体。
对于切片的BrdU检测，或用抗角蛋白抗体和紧接着的抗兔TRITC 或用能用抗鼠Ig-Cy3(Amersham，Uppsala，Sweden)所显示出的特异的 mAb染色切片。然后如前所述进行BrdU检测(Penit et al.，(1996)Proc. Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。简单地，将切片在70％乙醇中固定30分 钟。将半干的切片孵育于4M HCl中，通过在硼酸缓冲液(Sigma)中洗 涤中和，随后是在PBS中洗涤两次。用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson) 检测BrdU。
对于三色免疫荧光，用特异的MTS mAb和抗角蛋白抗体一起标记切 片。然后如上进行BrdU检测。
用Leica荧光和Nikon共聚焦显微镜分析切片。
迁移研究(即对新近胸腺迁出(RTE)的分析)：经腹腔注射0.3ml 0.3mg甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia) 的盐水溶液将小鼠麻醉。
对FITC标记胸腺细胞的技术细节与其他地方所描述的那些计数相 似(Scollay et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547；Berzins et al.， (1998)J.Exp.Med.187：1839)。简单地，暴露出胸腺叶，每叶注射近10μl 350μg/ml FITC(PBS中)。用手术订关闭伤口。加温小鼠直到从麻醉中完 全复苏。在注射后近24个小时，用CO2窒息处死小鼠，并取出淋巴器官 进行分析。
在细胞计数之后，用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色标本，然后用流 式细胞术分析。迁移细胞被识别为表达CD4或CD8的活(live)的设门 的FITC+细胞(以略去自发荧光的细胞和双联体)。加入FITC+CD4和 CD8细胞的百分比以分别给淋巴结和脾提供总的迁移百分比。如Berzins et al.，((1998)J.Exp.Med.187：1839所描述的进行对每日输出率的计算。
使用非成对的学生t检验或非参数的Mann-Whitney U检验所分析的 数据被用于确定对照和至少进行过三次的试验的测试结果之间的统计学 显著性。用下面的表示试验数值与对照熟知有着显著差异：*p≤0.05；**p ≤0.01和***p≤0.001.
结果
I.年龄对胸腺细胞群的作用
(i)胸腺重量和胸腺细胞数目
随着年龄的增加，小鼠的胸腺重量(图1A)和总的胸腺细胞数目(图 1B)都有着非常显著的下降(p≤0.001)。年轻成体的相对胸腺重量(mg 胸腺/g身体)的平均值为3.34，而18-24个月的小鼠就下降到0.66(脂肪 的沉积限制了精确的计算)。胸腺重量的下降可以归结于总的胸腺数目的 减少：1-2个月大(即年轻成体)的胸腺含有约6.7×107胸腺细胞，到了 24个月时减少到了约4.5×106。通过阉割去除了性类固醇对胸腺的作用， 恢复了胸腺细胞的数目，在阉割后4周时，胸腺在重量(图1A)和细胞 密度(图1B)上都等于年轻成体。有趣的是，在阉割后2周时，显著地 增加了胸腺细胞数目(1.2×108)(p≤0.001)，到了阉割后4周时，胸腺数 目恢复到了正常的年轻小鼠的水平。
在外周没有反映出胸腺所产的T细胞数目的减少，脾细胞数目随着 年龄仍是恒定的(图2A和2B)。外周的内环境稳态机制是显而易见的， 因为脾和淋巴结的B细胞对T细胞的比例不受年龄的影响，以及到达外 周的T细胞数目的随之减少(图2C)。但是，CD4+对CD8+T细胞的比 例随着年龄显著下降，从2个月大时的2∶1到2岁大时的1∶1(图2D)。在 阉割以及到达外周的T细胞数目随之增加之后，没有观察到外周T细胞 数目的变化：脾T细胞数目和脾及淋巴结的B∶T细胞的比例随着阉割都 没有改变(图2A-C)。随着年龄减少的外周的CD4∶CD8比例在阉割后2 周仍是明显减低的，但是到了阉割后4周就完全恢复了(图2D)。
(ii)随着年龄和阉割后的胸腺细胞亚群
为了确定所看到的胸腺细胞数目随着年龄的减少是否是特异的细胞 群的耗竭的结果，用特定的标记物标记胸腺细胞以分析不同的亚群。另 外，这容许对阉割后的胸腺复群的动力学的分析。将主要胸腺细胞亚群 的比例与那些年轻成体(2-4个月)的胸腺的细胞亚群比例进行比较(图 3)，发现该比例随着年龄仍保持一致。另外，通过αβTCR的表达对胸腺 细胞的进一步亚组分型发现这些群的比例随着年龄没有变化。在阉割后2 周和4周时，胸腺细胞亚群仍为相同的比例，虽然阉割后的胸腺细胞数 目增加了100倍，这说明是所有胸腺细胞亚组的同步扩增，而不是不同 进度的扩增。
因此，在年老(2岁)动物的胸腺中所见的细胞数目的减少表明是所 有细胞亚型的平衡减少，并没有所检测的T细胞群的显著变化。胸腺再 活化以同步的方式出现，同时而不是依次再补充所有的T细胞亚群。
II.胸腺细胞的增殖
如图4A-4B所示，在2-4个月时，有15-20％的胸腺细胞正在增殖。 这些细胞中的大部分(约80％)是双阳性的(DP)(即CD4+CD8+)，以及 三阴性(TN)(即CD3-CD4-CD8-)亚组构成了占约6％的第二大群(图 5A)。这些TN细胞是胸腺内的最不成熟的细胞并包括胸腺内前体细胞。 因此，免疫组织学可见绝大多数的分裂在包膜下和皮质中。一些分裂可 见于FACS分析所定位的髓质区域，FACS分析显示了年轻(2个月)的、 分裂的胸腺的单阳性(即CD4+CD8-或CD4-CD8+)细胞的比例(9％ CD4+T细胞和25％CD8+T细胞)(图5B)。
尽管年老小鼠胸腺(2岁大)内的细胞数目被限制地减少了，增殖的 胸腺细胞的总比例仍是恒定的(图4B和5C)，但是CD4-CD8-中的分裂 细胞的比例有着下降，以及也显著地减少了CD4-CD8+T细胞的增殖(数 据没有显示)。免疫组织学显示分裂细胞在1岁时的分布反映了在年轻成 体(2-4个月)中的所见，但是，到了2岁时，增殖主要见于皮质外层以 及在血管外周，在髓质内的分裂很少。
最早到阉割后1周时，有着增殖的CD4-CD8-细胞和CD4-CD8+细胞 的比例的显著增加(数据没有显示)。阉割明显克服了年龄对这些细胞的 增殖的阻断。阉割后有着增殖CD4+CD8-细胞的相应的比例下降(数据没 有显示)。在阉割后2周时，尽管显著地增加了胸腺细胞数目，但是正在 增殖的胸腺细胞的总比例没有变化，在此说明了细胞的同步扩增(图4A、 4B和5C)。免疫组织学显示了阉割后2周时的胸腺细胞扩增的位置和分 裂细胞的程度都接近于2个月大的胸腺的状态。
除了胸腺前体细胞外，DN亚群还包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞， 认为它们在转化为SP细胞的过程中，已经都下调了两种共受体(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14：547)。通过对这些成熟细胞的设门， 分析真正的TN部分(CD3-CD4-CD8-)和它们的表达CD44及CD25的 亚群是有可能的。图5E-H说明了年轻、年老和阉割小鼠中的每个TN亚 组内的增殖程度。这显示了TN1亚组(CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-)的 增殖的显著减低(p＜0.001)，从正常年轻小鼠中的10％到18个月大的约 2％(图5)，在阉割后1周就恢复了。
III.胸腺细胞迁出
在年轻小鼠中，每天都有近1％的T细胞从胸腺内迁出(Scollay et al.， (1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。发现阉割小鼠发生迁出的比例 率等于14个月大的正常年轻小鼠以及甚至2岁大的小鼠，尽管数目上已 经被显著地减少了(p≤0.0001)(图6A和6B)。新近胸腺迁出的CD4∶CD8 比例有所增加，从2个月大的3∶1到26个月大的7∶1(图6C)。在阉割后 1周时，该比例已经正常化(图6C)。到阉割后2周时，迁出到外周的细 胞数目已经显著增加，总的迁出率减少到了0.4％，这反映了胸腺的扩增 (图6B)。
讨论
已经显示衰老的胸腺尽管是严重萎缩的，但随着年龄仍保持着它的 功能能力，发生T细胞增殖、分化和迁出的水平等于年轻成体小鼠。尽 管胸腺功能受神经-内分泌-免疫轴中间的一些复杂的相互作用的调节，但 是阉割后的胸腺再活化的程度说明了性类固醇产生所诱导的萎缩有着最 显著的和长时间的作用。
如前所示，胸腺重量随着年龄被显著的降低了(Hirokawa and Makinodan，(1975)J.Immunol.114：1659，Aspinall，(1997)J.Immunol.158： 3037)，这与胸腺细胞数目的显著减少有关。阉割操作所诱导的应激可以 因为糖皮质激素的作用造成胸腺的进一步的萎缩，这一点可以被在阉割 后2周对性类固醇去除的影响所忽略，它使得胸腺的细胞密度增加到了 阉割前的20-30倍。到了阉割后3周，衰老的胸腺显示出胸腺大小和细胞 数目上的显著增加，优于年轻成体的胸腺，预测是因为性类固醇已经对2 个月大的小鼠本身所施加的作用。
数据确认了先前的发现，注重于胸腺随着年龄持续分化并保持恒定 的亚组比例的能力(Aspinall，(1997)J.Immunol.158：3037)。另外，胸腺 细胞分化已经显示与阉割后同时发生，说明了胸腺细胞亚组的同步扩增。 因为胸腺细胞数目随着年龄的显著减少，分析了胸腺细胞的增殖以确定 它是否是胸腺萎缩的引发因素。
年龄诱导的胸腺萎缩或阉割后对性类固醇去除的影响都没有影响到 胸腺细胞的增殖，约所有胸腺细胞的14％是正在增殖的。但是，这种分 裂的位置随着年龄而所有不同：2个月大小鼠胸腺显示出整个包膜下和皮 质区域内的丰富的分裂(TN和DPT细胞)，以及也有着一些分裂发生在 髓质。因为胸腺上皮结构随着年龄的瓦解，增值的位置是难以区别的， 但表现为比年轻的小鼠更少统一的模式，并移行到皮质外层。在阉割后2 周时，分裂细胞在整个皮质中都能检测到，以及在髓质内是明显的，有 着与2个月大的胸腺相似的分布。
如用CD4和CD8分析所确定的增殖群的表型没有随年龄和阉割后而 改变。但是，对胸腺亚群内的增殖的分析发现TN和CD8+细胞的增殖随 年龄的显著减低。根据标记物CD44和CD25对T细胞亚组内的进一步 分析发现了TN1(CD44+CD25-)群增殖的显著减低，通过TN2 (CD44-CD25+)群的增加弥补了这一点。TN群内的这些异常反映了 Aspinall((1997)J.Immunol.158：3037)的发现。惊奇的是，到阉割后2 周时，TN亚组以正常水平增殖，这说明了该群对性类固醇作用的抑制的 快速反应。另外，在阉割后2周和4周时，增殖的CD8+T细胞的比例要 明显高于对照胸腺，可能说明了它们在外周T细胞池的建立中的作用。
显示随着年龄，恒定比例的胸腺细胞发生了胸腺迁移，这一点与 Scollay et al.，((1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)的先前的数据 矛盾，他们显示胸腺细胞迁移到外周的迁移率的10倍的减少。这些结果 的差异可能是因为对2岁大的胸腺的胸腺内FITC标记的难度或脂肪沉积 对FITC摄取的作用。但是，如Scollay所发现的一样，迁移的T细胞的 绝对数目被显著地减少了，造成了RTEs到外周T细胞池的比例的显著减 低。这将造成外周主要影响T细胞库的改变(Mackall et al.，(1995)N.Eng. J.Med.332：143)。先前的文章(例如，Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med. 332：143)已经显示T细胞库随着年龄偏倚向记忆而不是原初T细胞表 型。但是如果个体遇到了新的抗原，被缩小的T细胞库可能不能应付， 这可能造成年老者中的免疫缺陷。显而易见的是，有着重建免疫功能不 全的个体中的T细胞池的需要。阉割容许胸腺通过显著地增加原初T细 胞的产量而实现外周再生。
如脾和淋巴结的B∶T比例所显示的，外周的T细胞数目仍为恒定水 平，可能是因为外周的内环境稳态。(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med. 332：143；Berzins et al.，(1998)J.Exp.Med.187：1839)。但是，对外周细 胞组成的干扰随着衰老的胸腺是明显的，表现为CD4∶CD8比例的显著下 降，从年轻成体的2∶1到2岁小鼠的1∶1，可能说明了CD4+T细胞对年 龄的更为敏感的性能或胸腺外来源的CD8+T细胞产生的增加。到了阉割 后2周时，这个比例已经被正常化，在此反映了免疫系统对手术阉割的 快速应答。
上述发现已经首次显示了衰老的胸腺能行使功能，其性质等同于青 春期前胸腺。在这个方面，虽然T细胞数目被显著地减少了，但胸腺细 胞分化的能力却没有被阻断。它们的总的增殖和最终迁移到外周的能力 也不受年龄相关的胸腺萎缩的影响。但是，注意到了两个重要的发现。 第一，在对T细胞增殖能力上显示出对T细胞的有害作用，这与Aspinall ((1997)J.Immunol.158：3037)的发现相关。这个缺陷可以归结于胸腺细 胞本身的内在缺陷。仍在此显示的数据以及先前的工作已经显示尽管胸 腺细胞的分化有所减少但仍有发生，以及来自BM的干细胞的迁入不受 年龄的影响(Hirokawa，(1998)，″Immunity and Ageing″in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd；Mackall and Gress，(1997)ImmunoL Rev.160：91)。第二，随 着年龄显著地减少了CD8+T细胞的增殖能力，以及在阉割后、与2个月 的小鼠比较，显著地增加了增殖CD8+T细胞的比例。成熟T细胞的增 殖被认为是迁移前的最后步骤(Suda and Zlotnik，(1991)J.Immunol.146： 3068)，因此CD8+增殖的显著减少可能说明它们的迁移能力的减低。 RTEs中的CD4∶CD8T细胞比例随着年龄的增加的发现支持了这种假说， 这提示了迁移的CD8T细胞的减少。同样的，如果胸腺上皮给CD8T细 胞维持提供了关键因素，无论是淋巴间质分子或细胞因子的影响，通过 增加的性类固醇产生可能阻断了这个因素。通过去除性类固醇的影响， 可以在此最优化地增殖CD8T细胞群。
所观察到的TN1亚组的增殖缺陷提示皮质上皮的缺失影响胸腺细胞 在TCR基因重排的关键阶段上的发育，其中皮质上皮提供了胸腺细胞生 成所必需的因子例如IL-7和SCF(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol. Today 14：547；Aspinall，(1997)J.Immunol.158：3037)。事实上，IL-7-/-和 IL-7-/+小鼠显示出与在年老小鼠中所见的相似的胸腺形态(Wiles et al.， (1992)Eur.J.Immunol.22：1037；Zlotnik and Moore，(1995)Curr.Opin. Immunol.7：206)；von Freeden-Jeffry，(1995)J.Exp.Med.181：1519)。
总而言之，衰老的胸腺仍保持它的功能能力，但是年老小鼠中的胸 腺细胞的发育不处于在正常年轻小鼠中所见的胸腺上皮细胞的严格控制 之下，这是因为胸腺微环境的结构完整性的缺失。因此，这些细胞的增 殖、分化和迁移将不在最优化的调节之下，并可能造成增加了外周的自 身反应性/免疫功能不全的T细胞的释放。TN以及特别是CD8+群内的缺 陷都可能造成在外周T细胞池内的随年龄的变化。阉割对胸腺功能的重 建将提供了一种用于再生外周T细胞池并因此用于重建免疫抑制的、免 疫缺陷的、或免疫失代偿的个体的重要工具。
实施例2：逆转化疗或放疗诱导的胸腺萎缩
材料和方法
材料和方法是如在实施例1中所描述的那样。另外，使用了以下的 方法。
BM重建：受者小鼠(3-4个月大的C57BL6/J)接受了5.5Gy照射两 次，间隔3个小时。在第二次照射剂量后1个小时，给小鼠静脉内注射 5×106供者BM细胞。通过将RPMI-1640培养基流经供者(2个月大的同 系的C57BL6/J Ly5.1+)小鼠的胫骨和股骨，然后收获在培养基中所收集 到的细胞得到BM细胞。
照射：3-4个月大的小鼠接受625Rad的全身照射。
使用环磷酰胺的T细胞耗竭：给年老小鼠(例如2岁大)注射环磷酰 胺(200mg/kg体重，2天内)并将其阉割。
结果
阉割增强了严重T细胞耗竭(TCD)后的再生。对于两种所研究的T 细胞耗竭的模型(使用环磷酰胺的化疗或使用625Rad的亚致死照射)，与 它们的假阉割(SHCx)的对照比较，阉割小鼠都显示出胸腺再活化率的 显著增加(图7A和7B)。到了治疗后1周，阉割小鼠甚至在早期就显示 出胸腺的再生(图7和9-11)。在比较中，未阉割动物显示出DN和DP 胸腺细胞(快速分裂细胞)的严重缺失以及随后的CD4和CD8细胞(耐 放射的)比例的增加。与甚至在治疗后1周就显示出胸腺大小至少增加4 倍的阉割后动物的胸腺细胞数目的差异最好地例证了这一点。在2周时， 未阉割动物显示出相对的胸腺细胞的正常化，伴有DN和DP胸腺细胞的 再生。但是，胸腺细胞的比例仍没有等同于年轻的成体对照的胸腺。事 实上，在2周时，阉割和未阉割小鼠之间的调节率之间的巨大差异是最 大的(到4周时，治疗组之间的胸腺细胞的数目相同)。
在环磷酰胺治疗1周后，SHCx小鼠的胸腺细胞密度要显著地少于对 照(未治疗的、年龄匹配的；p≤0.001)和Cx小鼠(p≤0.05)(图7A)。 在这个时间点上，1周前阉割的小鼠和与治疗同一天阉割的小鼠之间没有 观察到胸腺再活化率上差异，两组都显示出它们的细胞数目至少是SHCx 小鼠的两倍(图7A和7B)。相似的，在环磷酰胺治疗后2周时，两组Cx 小鼠具有比SHCx小鼠显著更高的(5-6倍)胸腺细胞的数目(p≤0.001) (图7A)。在对照小鼠中，在4周时间内逐渐恢复了胸腺细胞数目，但是 阉割明显增强了这一点，甚至在1周内(数据没有显示)。在阉割后1周， 相似地增加了阉割小鼠内的脾和淋巴结的细胞数目(数据没有显示)。
通过在照射前1周(图10)或与照射同一天(图11)的阉割检测了阉 割时机对胸腺恢复的作用。当在1周前进行阉割时，阉割对胸腺恢复具 有更快的作用(图10A与图11的比较)。在2周时，同一天的阉割已经“赶 上了”在治疗前1周阉割的小鼠中的胸腺再活化。在两种情况中，各自 对脾或淋巴结都没有大的作用(图10B和10C、及图11B和11C)。
在照射之后，都在与治疗同一天被假阉割和阉割的小鼠显示出胸腺 细胞密度要显著地少于对照小鼠(p≤0.001)(图7B和11A)和在治疗前1 周被阉割的小鼠(p≤0.01)(图7B)。在治疗后2周时，阉割方案对胸腺细 胞数目的恢复没有区别，两组阉割小鼠都表现出照射后的胸腺细胞比 SHCx小鼠中的显著增强(p≤0.001)(图7B、10A和11A)。因此，阉割 显著地增强了严重T细胞耗竭后的胸腺再活化，可以在先于免疫系统受 损前至少1周进行阉割。
有趣的是，胸腺大小表现出“超过了”对照胸腺的基线。这提示了 胸腺内的快速扩增，这些新形成的胸腺细胞还没有迁移(胸腺细胞需约 3-4迁出并进入外周)。因此，尽管在被释放到外周之前每个亚群内的比 例是相同的，但是建立了胸腺细胞的数目。
在对年轻小鼠(约2-3个月大)环磷酰胺处理之后，尽管减少了Cx 小鼠的脾内的总淋巴细胞数目，但是在整个分析的时相内与对照小鼠都 没有显著的差异(数据没有显示)。但是，ShCx小鼠在治疗后1周和4周 都显示出总脾细胞数目的显著减少(p≤0.05)(图8A)。在淋巴结内，在治 疗后1周，假阉割和阉割小鼠内都观察到了细胞密度的显著减少(p≤0.01) (图8B)，可能反映了应激类固醇的影响。到治疗后2周时，阉割小鼠的 淋巴结细胞密度与对照小鼠相当，但是假阉割小鼠直到治疗后4周也没 有恢复它们的淋巴结细胞数目，其细胞密度要显著地少于(p≤0.05)对 照和治疗后2周的Cx小鼠(图8B)。这些结果表明阉割可以增强总淋巴 细胞数目在环磷酰胺治疗后的恢复的速度。
亚致死照射(625Rad)诱导了严重的淋巴细胞减少，这样在治疗后1 周时，治疗组(Cx和SHCx)部显示出脾和淋巴结的细胞密度要显著地少 于(p≤0.001)对照小鼠(图12A和12B)。到照射后2周时，阉割和假阉 割小鼠的脾细胞数目与对照值相似(图12A)，而淋巴结细胞数目仍显著 地低于对照值(假阉割小鼠p≤0.001；阉割小鼠p≤0.01)(图12B)。在 Cx和ShCx小鼠之间没有观察到显著差异。
图19举例说明了化学阉割的用法与手术阉割在增强T细胞再生上的 比较。注射在这个实施例中所用的化学物地洛瑞林(LHRH-A)4周，并 显示出环磷酰胺治疗后的再生速度与手术阉割的相当。增强作用在胸腺 扩增上是相等的，在脾和淋巴结的恢复上也是相等的。化学阉割的动力 学比手术慢，也就是说，小鼠需要花约3周以上的时间降低它们的性类 固醇水平。但是，化学阉割仍与手术阉割一样有效，可以认为是具有相 同的作用。
讨论
在免疫耗竭的动物模型中探讨了阉割对胸腺的结构和T细胞产生的 影响。具体的，实施例2检查了阉割对亚致死照射和环磷酰胺治疗后的 免疫系统的恢复的作用。这些形式的免疫耗竭作用于抑制DNA合成并因 此靶向于快速分裂的细胞。在胸腺中，这些细胞是非常不成熟的皮质胸 腺细胞，但是所有的亚组都受到了影响(Fredrickson and Basch，(1994) Dev.Comp.Immunol 18：251)。在正常健康的年老动物中，外周T细胞的 定量及定性的差异很少导致病理状态。但是，在T细胞的严重耗竭之后 出现了严重的问题，因为减少了胸腺的T细胞再生的能力。这些结果发 生在HIV/AIDS中，特别是在癌症治疗的化疗及放疗后(Mackall et al.， (1995)N.Eng.J.Med.332：143)。
在亚致死照射和环磷酰胺治疗的小鼠中，阉割明显增强了胸腺再活 化。为了评价主要是糖皮质激素诱导的作用、手术阉割对胸腺再活化的 应激应答，在免疫耗竭的同一天以及7天之前进行阉割。尽管最早到免 疫耗竭后的1周就看到了胸腺细胞密度和组织结构的增加，但是在阉割 后2周观察到了较大的差异。这是是否在免疫耗竭的同一天或1周前进 行阉割的情况。
免疫组织学证实，在所有情况中，阉割后2周的胸腺组织结构表现 为表型正常的，而未阉割小鼠的组织结构被瓦解了。全上皮标记物表明 免疫耗竭引起了皮质上皮的塌陷和对未阉割小鼠的胸腺中的胸腺组织结 构的普遍阻断。髓质标记物支持这个发现。有趣的是，阉割诱导的再生 的其中一种首发特征是MTS 16所鉴定的细胞外基质的明显上调。
流式细胞术分析数据表明了阉割小鼠内的所有胸腺细胞亚组的细胞 数目的显著增加。在每个时间点上，有在免疫耗竭和阉割后的所有CD4、 CD8和αβTCR所定义的亚组的同步增加。这是罕见的但一致的结果，因 为T细胞发育是一个进行性的过程，预计将有着前体细胞(包含在 CD4-CD8-门内)的最初增加以及它可能发生在第一个时间点之前。而且， 因为前体细胞代表着非常小比例的总胸腺细胞，可能没有检测到在它们 的数目上的转换。也分析了阉割对其他细胞包括巨噬细胞和粒细胞的作 用。通常，胸腺内的巨噬细胞和粒细胞数目只有很小的变化。
在免疫耗竭的照射和环磷酰胺的模型中，胸腺细胞数目都在治疗后2 周达到高峰并在4周后减少。几乎在或化疗后的即刻，胸腺重量和细胞 密度戏剧化地减低并在近5天后开始胸腺再活化的第一期。耐照射的胸 腺细胞的再生引起了重建的第一波(第5-14天)，它可生成所有的胸腺亚 组(Penit and Ezine，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。在第16和 22天之间所观察到的第二个减低是因为耐放射的细胞的受限的增殖能力 伴有BM减少了胸腺前体细胞的产生(也受照射的影响)。第二个再生期 是因为BM起源的前体细胞对胸腺的再补充(Huiskamp et al.，(1983) Radiat.Res.95：370)。
在成体小鼠中，从HSC到成熟T细胞的发育要花近28天(Shortman et.al.，(1990)Sem.immunol.2：3)。因此，一直到治疗后4周才看到外周T 细胞的很小变化。外周受一些胸腺输出的支持，但预计一直到治疗后4 周在外周所发现的T细胞的大部分是增殖的耐环磷酰胺或照射克隆在不 存在被耗竭细胞时的扩增。预计阉割后的外周的一些长期变化包括最重 要的胸腺输出增加所引起的TCR库的多样化。
实施例3：抑制性类固醇后的胸腺再活化使得有缺陷的外周T细胞功能恢 复
材料和方法
材料和方法如实施例1和2中所描述的。另外，使用了下面的方法。
HSV-1免疫接种：手术阉割年老(≥18个月)小鼠。在阉割后6周(胸 腺再活化后)。麻醉后，用20号针头在小鼠后肢上注射无菌PBS中的4×105 噬斑形成单位(pfu)的HSV-1(KOS株)。将感染后的小鼠圈养在独立的 笼子中，并在免疫接种后第5天以人道的方式处死小鼠，同时取出腘(引 流)淋巴结用于分析。
病毒来自Assoc.Prof.Frank Carbone(Melbourne University)。将病毒 储存株生长并滴定于加有5％FCS(Gibco-BRL，Australia)的MEM中的 VERO单层细胞上。
在感染后第5天进行对引流(腘)淋巴结的分析。对于HSV-1研究， 用抗CD25-PE、抗CD8-APC和抗Vβ10-生物素染色腘淋巴结细胞。对于 DC的检测，在用CD45.1-FITC、I-Ab-pE和CD11c-生物素染色之前使用 FcR阻断。用抗生物素蛋白链菌素-PerCP检测所有的生物素化的抗体。 对于HSC的检测，通过用抗CD3、CD4、CD8、Gr-1、B220和Mac-1(所 有的都与FITC结合)共同染色将BM细胞设门于Lin-细胞。通过用 CD11c-APC和Sca-1-PE的染色检测HSC。对于TN胸腺细胞分析，将所 有细胞设门于Lin-群并通过用CD44-生物素、CD25-PE和c-kit-APC的染 色检测。
对淋巴结细胞的细胞毒性检测：将淋巴结细胞在37℃、6.5％CO2中 孵育3天。用加有gB498-505肽(gBp)的非转染细胞株(EL4)确定特异性， 单独EL4细胞作为对照。使用30∶1的起始效应物：靶比。将板在37℃、 6.5％CO2中孵育4个小时，然后在650gmax下离心5分钟。从每个孔中收 集上清液(100μl)并转移到玻璃发酵管中，用于Packard Cobra自动伽玛 计数器的测定。
结果
为了确定胸腺再活化的功能性后果(例如阉割是否能增强免疫应 答)，检测了单纯疱疹病毒(HSV)免疫接种，它容许对疾病进展及CTL 作用的研究。发现阉割小鼠具有定量和定性提高的对病毒的应答性。
在爪垫免疫接种小鼠并在免疫接种后第5天分析腘(引流)淋巴结。 另外，取爪垫并匀浆化以确定在整个试验期间的特殊时间点上的病毒滴 度。检测了区域(腘)淋巴结对HSV-1感染的应答(图13-17)。
观察到了淋巴结细胞密度随年龄的显著减少(图13A、13B和14)。 在免疫接种后第5天(即5天)，阉割小鼠具有比年老小鼠显著更高的淋 巴结细胞密度(数据没有显示)。尽管没有看到活化(CD8+CD25+)细胞 的比例随年龄或阉割后的差异，但是当与年老的对照比较时，淋巴结内 的活化细胞数目随着阉割显著地增加了(数据没有显示)。另外，活化细 胞数目与年轻成体中所发现的相当(数据没有显示)，提示阉割小鼠中的 CTL正被活化到更大的程度，但是因为B细胞活化，年轻成体可能具有 一个增大了的淋巴结。用检测随年龄和阉割后出现的特异裂解的比例的 CTL检测确认了这一点(图16)。与年轻成体(2个月大)小鼠比较，年 老小鼠显示出在效应物：靶为10∶1和3∶1时的靶向细胞裂解的显著减少 (图16)。阉割恢复了小鼠生成HSV感染后的特异性CTL应答的能力(图 16)。
另外，虽然活化细胞的Vβ的总表达随着年龄仍保持恒定(数据没有 显示)，但是年老(18个月)小鼠的一个亚组显示出这种克隆应答的减少 (图14A-C)。到阉割后6周时，浸润的淋巴结细胞的总数目和活化 CD25+CD8+细胞的数目已经增加到了年轻成体水平(数据没有显示)。但 是，更重要的是阉割显著地增强了在年老小鼠中被极大地减低了的对 HSV感染的靶细胞的CTL应答性(图16)并恢复了淋巴结内的CD4∶CD8 比例(图17B)。事实上，与年轻成体和阉割小鼠比较，随着年龄都看到 了引流淋巴结内的CD4+T细胞的减少(图17B)，因此说明了在整个生命 中，对增加胸腺的T细胞的产生的极为重要的需要，为了达到最大的免 疫应答性。
实施例4：对性类固醇的抑制增强了胸腺对新的造血前体细胞的摄取，造 成了宿主和供者淋巴细胞(T、B和DC)的嵌合混合物
材料和方法如实施例1-3中所描述的。另外，使用了下面的方法。
先前的试验已经显示微嵌合体形成在器官移植接受上起到了重要作 用。DC也已经显示在对移植物抗原的耐受性上有着整合作用。因此，研 究了阉割对胸腺嵌合体形成和树突状细胞数目的影响。
为了测定干细胞摄取对胸腺再活化的作用，如实施例2所述的进行 了BM重建。
对于同基因动物的试验，每个治疗组都使用3个月大的小鼠(n＝4)。 所有的对照都是年龄匹配的和未治疗的。
比较了阉割和假阉割重建小鼠与未治疗的年龄匹配的对照的总胸腺 细胞数目，在图18A中概括了这一点。在重建前1天阉割的小鼠中，与 假阉割对照小鼠比较，有着胸腺再活化率的显著增高(p≤0.01)。假阉割 小鼠的胸腺细胞密度要低于同系BMT后2周和4周的未治疗的对照水平 (7.6×107±5.2×106)，而阉割小鼠的胸腺密度在BMT后4周时已经增加到 超过了对照水平(图18A)。在6周时，细胞数目仍低于对照水平。但是， 阉割小鼠的细胞数目比假阉割小鼠高3倍(p≤0.05)(图18A)。
在BMT 4周后，阉割小鼠的BM内也有着显著更多的细胞(p≤0.05) (图18D)。到了2周时，假阉割的BM细胞密度达到了未治疗的对照水平 (1.5×107±1.5×106)，而阉割小鼠的BM细胞密度在同系BMT后2周和4 周都超过了对照水平(图18D)。在照射和重建后2周，阉割和未阉割的 小鼠中的肠系膜淋巴结细胞数目都减少了；但是，到了4周的时间点时， 细胞数目已经达到了对照水平。在阉割和未阉割治疗组之间的淋巴结细 胞数目没有统计学显著差异(图18C)。假阉割和阉割的脾细胞密度在2 周时到达了未治疗的对照水平(1.5×107±1.5×106)，但是假阉割组在4-6周 后出现减少，而阉割小鼠仍有高水平的脾细胞(图18B)。与未阉割的小 鼠比较，阉割小鼠在这些时间点(即重建后4周和6周)都显示出更多的 淋巴细胞(p≤0.05)，尽管在2周时没有看到阉割和未阉割治疗组之间的 总脾细胞的差异(图18B)。
因此，在重建前1天阉割的小鼠中，与假阉割(ShCx)对照小鼠比 较，有着胸腺再活化率的显著增加(p≤0.01)(图18A)。在同系BMT后2 周和4周时，假阉割小鼠的胸腺细胞密度要低于未治疗的对照水平 (7.6×107±5.2×106)，而在BMT后4周时，阉割小鼠的胸腺细胞密度已经 增加超过了对照水平(图18A)。阉割小鼠比未阉割动物有着显著更多的 同系细胞(Ly5.2)。
在未阉割小鼠中，在4周的时间内有着胸腺细胞数目的显著减少， 有着很少或没有再生的证据(数据没有显示)。但是在阉割组中，到2周 时已经存在广泛的胸腺细胞生成，到4周时已经恢复到了对照水平，这 比未阉割小鼠高10倍多。对胸腺的CD45.2(供者来源的抗原)的流式细 胞术分析证实4周时在未阉割组中没有检测到供者来源的细胞，但是实 际上明显地是，在这个时间点上的阉割小鼠的所有胸腺细胞都是供者来 源的(数据没有显示)。假定这种胸腺细胞生成的广泛增强来自供者来源 的造血前体细胞，那么确定T细胞分化是否已经正常进行是重要的。用 流式细胞术分析了CD4、CD8和TCR所定义的亚组。在重建后2周的胸 腺细胞亚组比例上没有相称的差异(数据没有显示)。这种观察在4周时 是不可能的，因为未阉割小鼠仍没有供者来源的细胞的重建。但是，在 这个时间点上，阉割小鼠的胸腺细胞比例表现为正常。
在一组平行试验中，在BMT前1天阉割或假阉割3个月大的、年轻 成体C57/BL6小鼠。对于同系BMT，小鼠接受了800RAD TBI及IV注 射5×106 Ly5.1+BM细胞。2周和4周后处死小鼠，并分析BM、胸腺和 脾的免疫重建。用抗CD45.1抗体确定供者/宿主来源，该抗体只与供者 来源的白细胞反应。
在图19-28中显示了来自这组平行试验的结果。
图20和21显示了阉割动物的BM中的供者来源的HSC的数目和比 例的增加。这说明了提高的植入并提示BMT的更快的恢复。
图22显示了阉割小鼠的BM中的供者来源的B细胞祖细胞和B细 胞的增加。但是，图24和25显示了阉割没有改变阉割后2周和4周时 的外周B细胞的数目或比例。
图26显示阉割增加了胸腺的供者来源的TN、DP、CD4和CD8细 胞的数目。但是，图23显示阉割没有改变供者胸腺细胞的CD4和CD8 细胞的比例。在外周，有着非常少的CD4或CD8细胞，以及在所考虑到 的时间点上，这些细胞没有随阉割而增加。
重要的是，图28显示了到阉割后4周时胸腺的供者DC的数目的增 加。
讨论
实施例4显示了阉割对同基因和同系BM移植的影响。Starzl et al.， (1992)Lancet 339：1579报告了淋巴和非淋巴组织的明显的微嵌合体是异 基因移植的好的预后指标。已经公认为它们对于诱导对移植物的耐受是 必要的(Starzl et al.，(1992)Lancet 339：1579)。供者来源的DC存在于这 些嵌合体中并被认为是在避免移植物排斥上发挥着整合的作用 (Thomson and Lu，(1999)Immunol.Today 20：20)。已知DC是胸腺的阴性 选择步骤中的关键因素，如果供者来源的DC存在与受者胸腺内，就可 以去除移植物反应性T细胞。
为了确定阉割是否能增加嵌合体形成，用同基因的胎肝移植进行了 一项研究。结果显示了阉割小鼠的胸腺的再生被增强了。当用同系的 (Ly5)小鼠重复试验时，再次看到了这些趋势。因为同系标记物的存在， 测定小鼠的嵌合体状态是有可能的。早到胎肝重建后2周时，在胸腺内 就能检测到供者来源的树突状细胞，阉割小鼠的数目是未阉割小鼠的4 倍。在重建后4周时，未阉割小鼠没有表现出供者来源的细胞的重建， 说明阉割事实上可以增加嵌合体形成的可能性。假定阉割不仅能增加致 死性照射和胎肝重建后的胸腺再活化，它还增加了胸腺内供者来源的树 突状细胞的数目，对于干细胞移植，这种方法增加了移植物接受的可能 性。
实施例5：免疫细胞耗竭
为了预防潜在的移植物受者患者中的现有T细胞对移植物的干扰， 患者进行了T细胞耗竭(清除)。这个步骤的一个标准方法如下。患者接 受每日注射15mg/kg Atgam(异种的抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn) 形式的抗T细胞抗体10天，联合应用T细胞活化抑制剂环孢菌素A， 3mg/kg连续输注3-4周，接着是按需服用每日9mg/kg的片剂。这个治疗 不影响患者胸腺内的早期T细胞发育，因为具有这样作用所必需的量的 抗体因为人类胸腺的尺寸和构型而不能被转运到胸腺内。持续治疗近4-6 周以容许性类固醇缺失后的胸腺重建。
也可以联合应用第二信号水平的抑制剂进行对T细胞反应性的预 防，这些抑制剂例如白介素、附加分子(例如阻断例如CD28的抗体)、 增强T细胞清除或其他免疫细胞清除的信号途径分子或细胞粘附分子。 胸腺重建期将与供者HSC的注射结合(与取得相关器官或组织的同时从 血液中得到的，用G-CSF(每天皮下注射2次，共3天)从血液中预先动 员的；或直接从供者BM中所采集的)。增强了的循环HSC的水平将促进 胸腺的摄取(性类固醇的缺失和/或提高的GnRH水平所激活的)。这些供 者HSC将发育成胸腺内DC并引起任何新形成的偶尔将是“供者反应性 的”T细胞的去除。这将建立对供者细胞和组织的中枢耐受并据此预防或 最大程度地最小化宿主的任何排斥。新的T细胞库的发育也将克服T细 胞耗竭方案所引起的免疫缺陷。
外周T细胞的耗竭使得移植物排斥的危险最小化，因为它非特异性 地耗竭了所有的T细胞包括那些潜在地与外来供者反应的T细胞。但是， 同时因为T细胞的缺失，这个方法诱导了普遍的免疫缺陷状态，这意味 着患者对感染特别是病毒感染是高度易感的。
实施例6：性类固醇耗竭治疗
患者接受了给予LHRH激动剂形式的性类固醇耗竭治疗。给予了 Leucrin_(储存剂注射液；22.5mg)或Zoladex_(植入物；10.8mg)形式 的LHRH激动剂，每一种都是单次剂量有效3个月。这能有效地将性类 固醇水平减少到足以再活化胸腺的水平。在一些情况中，施与性类固醇 的肾上腺产物的抑制剂也是必要的。也可以在性类固醇耗竭治疗的持续 时间内每天给予一片Cosudex_(5mg/天或50mg/天)。或者，给予患者 GnRH拮抗剂例如皮下注射的西曲瑞克或阿巴瑞克。
在手术阉割后，血液中的性类固醇减少到最低只需要1-3周，而化学 阉割后要花3-4周。在一些情况中，需要将治疗延长到第二个3个月的注 射/植入。作为异基因供者(对于外来组织的移植物)或自体的HSC的血 液HSC的同时增强(通过给宿主注射G-CSF以将这些HSC从BM中动 员到胸腺)可以增加胸腺扩增。
实施例7：其他的给药方法
可以用其他的方法取代LHRH激动剂的3个月储存剂或植入物的给 药方法。在一个实例中，可以用例如Er：YAG激光的激光照射患者的皮肤， 以消融或改变皮肤，以减少角质层的阻抗作用。
在美国No.6,251,100、6,419,642和4,775,361中描述了激光消融或变 更。
在另一个实例中，给药是通过激光产生的压力波的方式。将合适容 器例如塑料柔软垫圈(直径约1英寸及厚度约1/16英寸)内的一个剂量 的LHRH激动剂放置在皮肤的产生压力波的位点上。然后用例如约1mm 厚的黑色聚苯乙烯片的靶材料覆盖该位点。用Q转换的固态红宝石激光 (20ns脉冲持续时间，每个脉冲能产生最大到2焦耳的能量)生成单个脉 冲暂态，该暂态冲击靶材料。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光照射， 使得皮肤仅仅暴露于脉冲暂态，而不暴露于激光照射。可以每天重复操 作，或按所需的经常重复，以保持激动剂的循环的血液水平。
实施例8：供者细胞的施用
在可行的情况下，通过在细胞采集之前给供者注射10μg/kg粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)2-5天(例如，每天注射10μg/kg一次或两次，共2-5 天)增强供者血液中的造血干细胞(HSC)的水平。也可以在采集之前 (7-14天前)给供者注射LHRH激动剂和/或细胞因子例如G-CSF或 GM-CSF，以增强血液中的干细胞的水平或质量。例如通过流式细胞术或 免疫磁珠从供者血液或BM中纯化出CD34+供者细胞。与人CD34特异 性结合的抗体是商品化的(来自例如Research Diagnostics Inc.，Flanders， NJ；Miltenyi-Biotec，Germany)。流式细胞术将供者来源的HSC确定为是 CD34+细胞。也可以通过使用喂养细胞(例如成纤维细胞)、生长因子例 如干细胞因子(SCF)和预防分化为特异细胞类型的LIF的体外培养扩增 这些CD34+HSC。在给予LHRH激动剂后近3-4周(即胸腺刚刚开始再 生的之前或同时)时，给患者注射供者HSC，最优化剂量约为2-4×106细 胞/kg。也可以给受者注射G-CSF以有助于供者HSC的扩增。如果因为 临床病变的严重程度使得这个时间方案不可能时，可以同时施与HSC和 GnRH。近2-3周后给予第二个剂量的HSC可能是必要的，这有助于胸 腺再活化及供者DC的发育(特别是在胸腺内)。一旦HSC已经植入到(即 结合到)和/或迁移到BM和胸腺，作用将是明显的，因为HSC是自我更 新的。
正再活化的或已再活化的胸腺摄取供者HSC并将它们转化为供者型 的T细胞和DC，而将受者的HSC转化为受者型T细胞和DC。通过细 胞死亡诱导去除，或通过经免疫调节细胞诱导耐受性，供者和宿主DC 能耐受能与供者或受者细胞可能反应的任何新的T或NK细胞。
实施例9：移植物HSC的移植
在本发明的一个实施方式中，当受者仍进行持续的T细胞耗竭和/或 其他的免疫细胞耗竭和/或免疫抑制治疗时，一个器官、或一组已经被部 分耗竭供者T细胞的细胞被从供者移植到受者患者内。受者胸腺已经被 GnRH治疗所活化并被外来的HSC所浸润。
在LHRH治疗约3-4周内，首批新的T细胞出现在了受者的血流内。 但是，为了容许产生宿主和供者造血细胞的稳定的嵌合体，可以持续免 疫抑制资料约3-4个月。因为在再活化胸腺内存在着供者和宿主的DC， 去除了新T细胞内的可能的供者反应性和宿主反应性的细胞。已经经宿 主胸腺上皮的阳性选择，T细胞通过识别受者的外周血中的宿主APC所 呈递的肽，保留了对正常感染的应答的能力。供者DC对受者淋巴器官 的结合建立了事实上与单独宿主的免疫系统一致的免疫系统状态，除了 对供者细胞、组织和器官的耐受性以外。因此，存在着正常的免疫调节 机制。这些也可以包括调节T细胞的发育，它利用细胞因子例如IL-4、5、 10、TGF-β、TNFα打开或关闭免疫应答。
实施例10：病毒感染(流感)的免疫接种和预防
流感病毒是片段的RNA病毒，它引起了高度传染性的急性呼吸道感 染。与抗流感的疫苗发展相关的主要问题是，这些病毒通过经所谓的抗 原漂移和抗原转变现象改变血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(N)被膜糖蛋白 上的抗原位点，具有了逃脱免疫监督并保留在宿主群中的能力。对抗流 感病毒的主要相关物是抗经历了抗原漂移和转变的强选择的HA的中和 抗体。但是，在内在蛋白例如核蛋白(NP)之间发生了对不同的流感病毒 株的更为保守的抗原交叉反应(Shu et al.，(1993)J.Virol.67：2723)。先前 已经显示了在用编码NP的多核苷酸的免疫接种后的对流感攻击的CTL 和保护作用(Ulmer et al.(1993)Science 259：1745)。
材料和方法
手术阉割：通过腹腔内注射30-40μl溶于盐水的5ml 100mg/ml盐酸 氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)加上1ml 20mg/ml甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 的混和物麻醉BALB/c小鼠。如在其他地方所描述的进行手术阉割，通 过阴囊切口，显露睾丸，将其用缝线结扎，然后与外周脂肪组织一起取 出睾丸。并手术订关闭伤口。将按上述的但没有取出睾丸的方法所制备 的假阉割小鼠作为对照。
化学阉割：给小鼠肌肉注射10mg/kg作为1个月缓释剂型的Lupron_ (一种GnRH激动剂)。否则就给小鼠注射GnRH拮抗剂(例如西曲瑞克或 阿巴瑞克)。按照产品说明书，用血浆标本的标准放射免疫测定法进行对 性类固醇缺失的确认。到了阉割后3-4周正常地应当达到阉割水平 (＜0.5ng睾酮或雌激素/ml)。
流感A/PR/8/34亚单位疫苗的制备：按照本领域已知的方法制备纯化 的流感A/PR/8/34(H1N1)亚单位疫苗制剂。简单地，用非离子型去污剂 (7.5％N-辛基-β-o-硫代吡喃葡萄糖苷)从流感A/PR/8/34颗粒中提取出血 凝素(HA)和神经氨酸糖苷酶(NA)抗原。离心后，将富含HA/NA的上清 液(55％HA)用作为亚单位疫苗。
流感A/PR/8/34亚单位免疫接种：在手术阉割后近6周或化学阉割后 约8周，用皮下注射的100μl福尔马林灭活的流感A/PR/8/34病毒(约 7000HAU)免疫接种小鼠。
在初次免疫接种后约4周(或更晚)时，可以任选地进行强化免疫接 种。弗氏完全佐剂(CFA)被用于初次免疫接种以及弗氏不完全佐剂被用于 任选的强化免疫接种。
或者，可以将流感A/PR/8/34亚单位疫苗制剂(见上)直接肌肉内注射 到例如四头肌内，剂量为约1μg到约10μg的稀释于40μl 0.9％盐水内的 疫苗制剂。
质粒DNA：对质粒DNA表达载体的制备在本领域是熟知的(见，例 如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)， Wiley and Sons，New York，NY(1994)，and yearly updates including 2002)。 简单地，将完全的流感A/PR/8/34核蛋白(NP)基因或血凝素(HA)编码序列 克隆到表达载体例如pCMV中，它处于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动 子的转录调控之下。
空质粒(例如没有插入物的pCMV)被用作为阴性对照。用标准计数 将质粒培养在大肠杆菌DH5α或HB101细胞中，并根据产品家说明书用 Qiagen_Ultra-Pure_-100柱(Chatsworth，CA)将其纯化。用合适的限制性 内切酶和琼脂糖凝胶电泳验证所有的质粒。用在260nm和280nm所读取 的光密度确定出DNA产品的纯度。将所有的质粒重悬于TE缓冲液中并 在-20℃下储存直到使用。
DNA免疫接种：DNA免疫接种的方法在本领域是熟知的。例如，在 Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)， Wiley and Sons，New York，NY(1994)，and yearly updates including 2002)中 详细描述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)DNA免疫接种的方法。
任选地施用编码细胞因子的DNA，以将免疫应答转换为所需的Th1 或Th2型免疫应答。诱导Th1的遗传学佐剂包括例如IFNγ和IL-12。诱 导Th2的遗传学佐剂包括例如IL-4、IL-5和IL-10。对诱导Th1和Th2 的遗传学佐剂的制备及其在诱导免疫应答中的用法的综述见例如 Robinson，et al.，(2000)Adv.Virus Res.55：1)。
流感A/PR/8/34病毒攻击：为了确定阉割小鼠是否能比它们的假阉割 对照更好地对抗流感病毒的攻击(有和没有免疫接种)，用50μl的10-4倍 稀释于PBS/2％BSA的含有流感A/PR/8/34(H1N1)流感病毒的尿囊液 (50-100LD50；0.25HAU)鼻内接种攻击甲氧氟烷麻醉的小鼠。每日称量 小鼠，并在体重缺失＞20％攻击前体重后将其处死。在这个剂量的病毒攻 击中，100％原初小鼠将在4-6天屈服于流感感染。
任选地用亚致死感染以激活记忆T细胞，但是使用了10-7的病毒稀 释液。也可以任选地用亚致死感染确定出未免疫的、阉割小鼠是否比假 阉割对照具有更好的免疫应答，如下面所列出的ELISA、细胞因子测定 (Th)、CTL测定等等所确定的那样。在用于这些试验之前，可以优化出 致死性和亚致死性感染的病毒滴度。
酶联免疫吸附测定法：在免疫接种之前和之后(或感染之前和之后) 的不同时间段，将每组的小鼠放血，并用标准的定量酶联免疫吸附测定 法(ELISA)测定个体小鼠的血清以检测血清中的抗HA或NP特异性IgG 水平。可以任选地测定IgG1和IgG2a水平，已知它们分别与Th2和Th1 型抗体反应有关。
用于细胞因子产生的脾细胞的制备和刺激：从不同组的小鼠中无菌 收集脾并将其汇集在含有约4ml RPMI-10培养基(RPMI-1640，10％胎牛 血清，50μg/ml庆大霉素)的p60培养皿中。用标准的方法制备脾并裂解 RBC。然后计数细胞并将其重悬于含有80U/ml鼠IL-2(Sigma，St.Louis， MO)的RPMI-10中，使得最终的细胞浓度为2×107细胞/ml。将100微升 细胞分散到96孔组织培养板的各个孔中，使得终浓度为2×106细胞/孔。 通过加入100μl溶解在RPMI-10中的合适的肽或灭活流感病毒实施刺激。 或用Kd-限制性HA533-541肽(IYSTVASSL；SEQ ID NO：1))(Winter，Fields， and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或用Kd-限制性NP147-155肽 (TYQRTRALV；SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252) 刺激CD8+T细胞。用灭活的流感病毒(每孔13,000HAU煮沸的流感病 毒加上每孔13,000HAU福尔马林灭活的流感病毒)加上抗CD28(1μg/ml) 和抗CD49d(1μg/ml)刺激CD4+T细胞(Waldrop et al.，(1998)J.Immunol. 161：5284)。单用培养基进行阴性对照刺激。然后孵育细胞，如下所述的 用ELISA检测细胞外细胞因子或用FACS检测细胞内细胞因子。
CTL的铬释放测定：利用本领域人员熟知的方法测定CTL对流感 HA和NP的应答(见，例如Current Protocols In Immunology，John E. Coligan etal.，(eds)，Unit 3，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的 更新版本包括2002年)。合成肽HA533-541IYSTVASSL(SEQ ID NO：1) (Winter，Fields，and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或NP147-155 TYQRTRALV(SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252)被 用作制靶步骤中的肽。用RPMI-10洗涤每只动物的应答型脾细胞并将其 按6.3×106细胞/ml的终浓度重悬于含有10U/ml鼠IL-2(Sigma，St.Louis， MO)的RPMI-10中。从原初的、同基因的小鼠中制得刺激型脾细胞，并 将其按1×107细胞/ml的浓度悬浮于RPMI-10中。加入终浓度为25μg/ml 的丝裂霉素C。将细胞在37℃/5％CO2中孵育30分钟，然后用RPMI-10 洗涤3次。然后将刺激型细胞重悬于RPMI-10培养基及10U/ml IL-2中， 使其浓度为2.4×106细胞/ml，并加入终浓度为9×10-6M的HA肽或终浓度 为2×10-6M的NP肽，在37℃/5％CO2中孵育2小时。将肽激活的(pulsed) 刺激型细胞(2.4×106)和应答型细胞(6.3×106)在24孔板的2ml体积的SM 培养基(RPMI-10，1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠)中37℃/5％CO2 共孵育5天。用铬释放测定法测定体外刺激的应答细胞(现在叫做效应细 胞)裂解肽激活的小鼠肥大细胞瘤P815细胞(MHC匹配的，H-2d)的能力。 通过取出0.1ml的溶于RPMI-10的P815并加入25μl FBS和0.1mCi溶解 在0.2ml生理盐水中的放射性标记的铬酸钠(MEN，Boston，MA)，用51Cr标记P815细胞。将靶细胞在37℃/5％CO2中孵育2个小时，用RPMI-10 洗涤3次并重悬于含有RPMI-10加上HA(9×10-6M)或NP(1×10-6M)肽的 15ml聚丙烯试管中。将靶细胞在37℃/5％CO2孵育2个小时。将溶于RPMI 中的放射性标记的、肽激活的靶细胞按每孔5×104细胞加入到96孔板的 每个孔中。收集每个免疫接种组中的受刺激的应答细胞(现在叫做效应细 胞)，用RPMI-10洗涤3次，并将其加入到含有靶细胞的终体积为0.2ml/ 孔的96孔板的每个孔中。效应物：靶细胞比例为50∶1、25∶1、12.5∶1和 6.25∶1。将细胞在37℃/5％CO2孵育5个小时，用液态闪烁计数法测定25μg 上清液的细胞裂解。低于给定的效应细胞标本，标记靶细胞的特异性裂 解的百分比为[100x(标本中的Cr释放-标本的自发性释放)/(最大量Cr释 放-标本的自发性释放)]。自发性铬释放是没有加入效应细胞时从靶细胞 所释放出的放射性的量。最大量铬释放是在加入Triton-100到终浓度为 1％之后靶细胞裂解所释放出的放射性的量。自发性释放不应当超过15％。
ELISA对大量培养上清液的IFNγ或IL-5的检测：可以测定大量培养 上清液的IFNγ和IL-5细胞因子水平，已知它们分别与Th1和Th2型应答 相关。将汇集的脾细胞在37℃/5％CO2孵育2天，然后收集并汇集上清 液。所有的ELISA抗体和纯化的细胞因子都购自Pharmingen(San Diego， CA)。将50微升在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 8.2)中被稀释到 5μg/ml(大鼠抗小鼠IFNγ)或3μg/ml(大鼠抗小鼠IL-5)的纯化的抗细胞因子 单克隆抗体分散到96孔板(Corning，Corning，NY)的每个孔中并在4℃孵育 过夜。用PBS-T洗涤、封闭和再洗涤板。将标准物(重组的小鼠细胞因子) 和标本按在RPMI-10中的不同的稀释浓度加入到孔中，并在4℃孵育过 夜以达到最大的敏感性。用PBS-T洗涤板6次。将生物素化的大鼠抗小 鼠细胞因子检测抗体在PBS-T中稀释到终浓度为2μg/ml，往每孔加入 100μl。将板在37℃孵育1个小时，然后用PBS-T洗涤6次。按照产品说 明书将抗生物素蛋白链菌素-AP(Gibco BRL，Grand Island，NY)按1∶2000 稀释，并往每孔加入100μl。将板孵育30分钟，用PBS-T再洗涤6次。 通过加入每孔100μl AP显影溶液(BioRad，Hercules，CA)并再室温下孵育 50分钟，将板显影。通过加入100μl/孔NaOH终止反应并在OD405处读 取数据。用Softmax Pro 2.21版计算机软件(Molecular Devices，Sunnyvale， CA)分析数据。
细胞内细胞因子染色和FACS分析：可以测定脾细胞的细胞内IFNγ 和IL-5细胞因子水平，已知它们分别与Th1和Th2型应答相关。将汇集 的脾细胞在37℃，含有5％CO2的潮湿空气中孵育5-6个小时。按照产品 说明书，按0.14μl/孔加入Golgi转运抑制剂Monensin(Pharmingen，San Diego，CA)，并将细胞再孵育5-6个小时(Waldrop et al.，(1998)J.Immunol. 161：5284)。将细胞彻底重悬并转移到96孔的U型底板中。除非其他说明 的，所有的试剂(GolgiStop试剂盒和抗体)都购自Pharmingen(San Diego， CA)，在冰上用冰冷的试剂进行所有的FACS染色步骤。用FACS缓冲液 (1×PBS，2％BSA，0.1％w/v叠氮化钠)洗涤板2次。用50μl的大鼠抗 小鼠CD8β-APC、-D69-PE和-CD16/CD32(FcγIII/RII；“Fc阻断”)的1∶100 的FACS缓冲液的稀释溶液表面染色细胞。对于四聚体染色(见下)，用 CD8β-TriColor、CD69-PE、CD16/CD32、和HA-或NP-四聚体-APC的 FACS缓冲液相似地染色细胞。将细胞在暗处孵育30分钟，用FACS缓 冲液洗涤3次。通过将细胞彻底地重悬于每孔100μl Cytofix/Cytoperm溶 液中并在暗处孵育20分钟，将细胞透化处理。用Permwash溶液洗涤细 胞3次。通过与每孔50μl的大鼠抗小鼠IFNγ-FITC的1∶100的Permash 溶液的稀释液在暗处孵育30分钟完成细胞内染色。用Permwash溶液洗 涤细胞2次并用FACS缓冲液洗涤1次。将细胞固定于200μl的1％多聚 甲醛溶液中，并转移到按96孔格式排列的微量管中。将管子包裹于箔中 并储存在4℃直到分析(少于2天)。在FACScan流式细胞仪(Becton Dickenson，San Jose，CA)中分析标本。利用以大鼠抗小鼠的CD8-FITC、 -PE、-TriColor、或-APC染色的单染对照细胞进行比较。用FlowJo 2.7 版软件(Tree Star，San Carlos，CA)分析结果。
四聚体：可以用HA和NP四聚体定量HA或NP免疫接种后的HA 和NP特异性的CD8+T细胞应答。基本上按照先前所述的制备四聚体 (Flynn et al.，(1998)Immunity 8：683)。本实施例利用了复合有合成的流感 A/PR/8/34病毒肽HA533-541(IYSTVASSL；SEQ ID NO：1)(Winter，Fields， and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或NP147-155(TYQRTRALV；SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252)的H-2Kd I型MHC分子。
要注意，只要做较小的变化，在本实施例中所描述的方法就可适用 于广泛的检测试剂，这一点对于本领域人员是很容易确定的。
实施例11：寄生虫感染(疟疾)的免疫接种和预防
环孢子蛋白(CSP)是这种前红细胞环的免疫力的靶点(Hoffman et al.， (1991)Science 252：520)。在约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)的啮齿动物 模型中，被动转移P.yoelii CSP特异性单克隆抗体(Charoenvit et al.，(1991) J.Immunol.146：1020)，以及过继性转移P.yoelii CSP特异性CD8+T细 胞(Rodrigues et al.，(1991)int.Immunol 3：579，Weiss et al.，(1992)J. Immunol.149：2103)和CD4+T细胞(Renia et al.，(1993)J.Immunol.150： 1471)都是有保护作用的。已经评价了通过诱导抗P.yoelii CSP的免疫应 答所设计的保护小鼠对抗子孢子的多种疫苗。
可以使用可用于本发明的能诱导对疟原虫的保护作用的本领域已知 的任何疟原虫的子孢子蛋白，例如镰状疟原虫、间日疟原虫、三日疟原 虫、和卵形疟原虫CSP；SSP2(TRAP)；Pfs16(Sheba)；LSA-1；LSA-2； LSA-3；MSA-1(PMMSA、PSA、p185、p190)；MSA-2(Gymmnsa、gp56、 38-45kDa抗原)；RESA(Pf155)；EBA-175；AMA-1(Pf83)；SERA(p113、 p126、SERP、Pf140)；RAP-1；RAP-2；RhopH3；PfHRP-II；Pf55；Pf35； GBP(96-R)；ABRA(p101)；Exp-1(CRA、Ag5.1)；醛缩酶；间日疟原虫的 Duffy结合蛋白；网织红细胞结合蛋白；HSP70-1(p75)；Pfg25；Pfg28； Pfg48/45；和Pfg230。
材料和方法
阉割：如上进行手术和/或化学阉割。
寄生虫：如先前所述的使用P.yoelii的17XNL(非致死的)株(美国 No.5,814,617)。
经照射的P.yoelii子孢子的制备：先前已经描述了用于免疫接种的经 照射的P.yoelii子孢子的制备(见，例如Franke et al.，(2000)Infect.Immun. 68：3403)。简单地，用不连续梯度技术从已经受10,000rads(137Ce)照射的 被感染的Anopheles stephen蚊中分离出子孢子(Pacheco et al.，(1979)J. Parisitol.65：414)。
用经照射的P.yoelii子孢子的免疫接种：在手术阉割后近6周或在化 学阉割后约8周，用50,000子孢子经尾部静脉静脉内免疫接种小鼠。在 初次接种后4周和6周，任选地给予20,000到30,000子孢子的强化免疫 接种(见，例如Franke et al.，(2000)Infect Immun.68：3403)。
质粒DNA和DNA免疫接种：编码全长P.yoelii CSP的质粒DNA在 本领域是已知的。例如，可以使用在Sedegah et al.，((1998)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95：7648)中所详细描述的pyCSP载体。
DNA免疫接种的方法在本领域也是熟知的。例如，在Current Protocols In Immunology，Unit 2.14(John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括2002年)中详细地描 述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)的DNA免疫接种的方法。
肽免疫接种：P.yoelii CSP肽制备的方法在本领域是已知的(见，例如 Franke et al.，(2000)Infect Immun.68：3403)。
CTL的铬释放测定法：因为抗P.yoelii的CD8+CTL已经显示为是 过继性转移保护(Weiss et al.，(1992)J.Immunol.149：2103)，并且CD8+T 细胞是经照射的子孢子的免疫接种所诱导的抗P.yoelii的保护作用所需 要的细胞(Weiss et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：573)，因此必 须要确定P.yoelii CSP疫苗接种(例如，经照射的子孢子、CSP肽或CSP DNA免疫接种)是否引发了CSP特异性CTL。
用本领域人员熟知的方法测定了CTL应答(见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括2002年)。使用了在 本说明书的其他地方所描述的用于流感HA和NP的常用方法，除了用合 成的P.yoelli CSP肽(281-296；SYVPSAEQILEFVKQI；SEQ ID NO：3)激 活细胞。
对肝脏发育阶段抑制的测定：先前已经描述了肝脏发育阶段测定及 通过原位胶原酶灌注对小鼠肝脏的小鼠肝细胞的采集(Franke et al.， (1999)Vaccine 17：1201；Franke et al.，(2000)Infect.Immun.68：3403)。将 肝细胞按每室1×105个细胞播种到8室的Lab-Tek塑料载片上，并与 7.5×104个P.yoelli子孢子孵育3个小时。然后洗涤培养物并在37℃/5％CO2 再培养24个小时。如上得到并加入用于CTL的铬释放测定的效应细胞， 将其与受感染的肝细胞培养约24-48个小时。然后洗涤培养物，并在冰冷 的无水甲醇中固定分室载片10分钟。然后在与FITC标记的山羊抗鼠Ig 孵育之前，将分室载片与直接抗P.yoelii的肝脏阶段寄生虫的单克隆抗体 (NYLS1或NYLS3，两者都已经被描述于美国No.5,814,617)孵育。然后 用落射荧光显微镜计数三次重复试验中的肝脏阶段的裂殖体的数目。用 公式[((对照-测试)/对照)×100]计算出抑制百分比。
感染和攻击：对于致死性攻击剂量，必须在试验性攻击之前确定出 P.yoelli子孢子的ID50。但是，最初经尾部静脉给小鼠静脉内注射约50 到100个P.yoelli子孢子的剂量(非致死的，17XNL株)也是可能的。再 静脉内接种42个小时后，处死小鼠并取出肝脏。制备肝细胞的单细胞的 培养基悬浮液，并往多室载片的10孔的每个孔内都放入2×105个肝细胞。 可以将载片干燥并冷冻在-70℃直到分析。为了计数子孢子的数目，将载 片干燥并在与FITC标记的山羊抗鼠Ig孵育之前先与NYLS1孵育，用荧 光显微镜计数每室内的肝脏阶段子孢子的数目。
一旦证实阉割和/或免疫接种减少了受感染的肝细胞的数目，获得血 涂片以确定免疫接种是否保护对抗了血液阶段的感染。如果在攻击后的 5-14天内，没有在血涂片中找到寄生虫就认为小鼠是受保护的。
为了检验单独阉割(无免疫接种)对P.yoelli子孢子原发感染的保护 疗效，如上所述的感染并分析了阉割小鼠。假阉割小鼠被当作对照。
人体研究：在建立了小鼠中的有效性之后，在双盲安慰剂对照现场 试验中，免疫接种了很多人。
实施例12：对细菌感染(TB Ag85)的免疫接种和预防
结核病(TB)是一种结核分枝杆菌病因所引起的肺部的慢性感染性疾 病，是世界范围内的临床最重要的感染之一(见，例如美国No.5,736， 524；综述见Bloom and Murray，(1993)，Science 257，1055)。
结核分枝杆菌是一种感染巨噬细胞的细胞内病原体。对TB的免疫力 包括一些类型的效应细胞。细胞因子例如IFNγ对巨噬细胞的活化是一种 最小化细胞内分枝杆菌增殖的有效方法。
抗TB的保护作用的获得需要CD8+和CD4+T细胞(见，例如Orme et al.，(1993)J.Infect.Dis.167：1481)。已知这些细胞应答于感染分泌Th1型 细胞因子，例如IFNγ，并具有抗原特异性的细胞毒活性。事实上，本领 域已知CTL应答对于抗结核分枝杆菌的保护作用是有用的(见，例如 Flynn et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：12013)。
TB的主要的T细胞抗原是那些分枝杆菌在它们停留于巨噬细胞期间 所分泌的蛋白。这些T细胞抗原包括，但不限定于，抗原85蛋白复合物 (85A、85B、85C)(Wiker and Harboe，(1992)Microbiol.Rev.56：648)和 ESAT-6(Andersen，(1994)Infect.Immunity，62：2536)。在本领域也已经描 述了其他的T细胞抗原(见，例如Young and Garbe，(1991)Res.Microbiol. 142：55；Andersen，(1992)J.Infect.Dis.166：874；Siva and Lowrie，(1994) Immunol.82：244；Romain et al(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5322； and Faith et al.，(1991)Immunol.74：1)。
已经克隆并测序了三种抗原85蛋白(A、B和C)的每种蛋白的基因 (见，例如Borremans et al.，(1989)Infect.Immunity 57：3123)；DeWit et al.， (1994)DNA Seq.4：267)，并且已经显示它们在感染和疫苗接种后能引发 强烈的T细胞应答。
材料和方法
小鼠的阉割：如上进行对BALB/c或C57BL/6小鼠的手术和/或化学 阉割。
蛋白免疫接种：用于结核分枝杆菌(TB)纯化和免疫接种的常用方法 在本领域是已知的(见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14， John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年 的更新版本包括2002年)。用预备的SDS-PAGE可以制备纯化的TB。将 近2mg TB蛋白加样在用大齿梳所形成的标准1.5mm平板凝胶的孔中。 在电泳后可以取出凝胶的边缘并染色以鉴定凝胶中的TB蛋白带。然后从 凝胶中切下含有TB蛋白带的凝胶区域，并将其放置在PBS中，终浓度 为每ml 0.5mg纯化的TB蛋白，并储存在4℃直到使用。然后可以用等体 积的弗氏完全佐剂(CFA)乳化所纯化的TB蛋白用于免疫接种。
在手术阉割后的近6周或化学阉割后的约8周，用2ml CFA乳化2ml 纯化的TB(0.5ml/ml PBS)并储存于4℃。经连接有19号针头的3ml玻璃 注射器缓慢地吸推TB/CFA混和物，一定要避免过度的气泡。一旦乳状 液为均质浓度时，用22号针头替代19号针头，排出所有的气泡。给阉 割和假阉割小鼠肌肉内注射50μl体积的TB/CFA乳状液(也可以经皮内或 皮下途径进行免疫接种)。疫苗制剂也可使用牛型分枝杆菌BCG。
可以在初次免疫接种后4-8(或更晚)任选地实施强化免疫接种。按上 述相同的方式制备TB佐剂乳状液，除了用弗氏不完全佐剂(IFA)取代CFA 用于所有的强化免疫接种。还可以在此后2-4周(或更晚的间隔)进行强化 免疫接种。
质粒DNA：先前已经描述了适用的编码Ag85的DNA序列和载体 (见，例如美国No.5,736,524)。本领域人员能容易地确定出其他适用的 表达载体。
抗原85DNA免疫接种：DNA免疫接种的方法在本领域也是熟知的。 例如，在例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14(John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括 2002年)中详细地描述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)的DNA免 疫接种的方法。
任选地施用编码细胞因子的DNA，以将免疫应答转换为所需的Th1 或Th2型免疫应答。诱导Th1发生的佐剂包括例如IFNγ和IL-12。诱导 Th2发生的佐剂包括例如IL-4、IL-5和IL-10。对诱导Th1和Th2发生的 佐剂的制备及其在诱导免疫应答中的用法的综述见例如Robinson，et al.， (2000)Adv.Virus Res.55：1)。
在手术阉割后近6周或在化学阉割后约8周，给小鼠肌肉内注射稀 释于100μl盐水中的200μg DNA。
在初次接种后4周和强化后2周时，任选地施用DNA强化免疫接种。
酶联免疫吸附测定法：在免疫接种之前和之后(或感染之前和之后) 的不同时间段，将每组的小鼠放血，并用标准的定量酶联免疫吸附测定 法(ELISA)测定个体小鼠的血清以检测血清中的抗Ag85的特异性IgG水 平。可以任选地测定IgG1和IgG2水平，已知它们分别与Th2和Th1型 抗体反应有关。
在初次接种之前和之后以及强化后的不同时间点收集血清，并分析 血清中的抗Ag85特异性抗体的存在。在本说明书的其他地方描述了基本 的ELISA方法，除了使用纯化的Ag85蛋白。
细胞因子测定：分析了来自被接种小鼠的脾细胞应答于Ag85再刺激 的细胞因子的分泌，如例如在Huygen et al.，(1992)Effect.Immunity 60： 2880，和美国No.5,736,524中所描述的。简单地，将脾细胞与牛型分枝 杆菌BCG纯化的Ag85A的培养滤液蛋白或C57BL/6T细胞抗原决定簇 肽(氨基酸241-260)一起孵育。
在初次接种后4周和强化后2周(或更晚)，测定细胞因子，用标准生 物测定法测定IL-2、IFNγ和IL-6，利用本领域熟知的方法用ELISA测定 IL-4和IL-10。见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 6(John E. Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版 本包括2002年)。
分枝杆菌感染和攻击：为了检验疫苗接种的疗效，用静脉内注射活 的牛型分枝杆菌BCG(0.5mg)攻击小鼠。在攻击后的不同的时间点，分析 BCG在小鼠脾和肺内的增殖。阳性对照是接受了攻击剂量的原初小鼠 (按需为阉割和/或假阉割小鼠)。
为了检验性类固醇清除对预防原发感染的疗效，如上述攻击试验所 描述的相似地注射活的牛型分枝杆菌BCG。假阉割小鼠被当作对照。
预计受攻击的、疫苗接种的小鼠的脾和肺内以及阉割的、原发感染 小鼠的肺内的集落形成单位(CPU)的数目都要显著地低于阴性对照动物， 这说明了在活的牛型分枝杆菌攻击模型中的保护作用。
实施例13：癌症的免疫接种和预防
为了确定性类固醇清除在预防癌症和/引发癌症抗原疫苗接种后的保 护性免疫应答上是否是有效的，进行了以下研究。
材料和方法
阉割：如上进行对C57BL/6小鼠的手术和/或化学阉割。
CEA免疫接种：在手术阉割后近6周或化学阉割后约8周，用编码 人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry et al.，(1995)Cancer Gene Ther.2：33)的腺病毒载体例如是在美国No.6,348,450中所描述的 AdCMV-hcea接种小鼠。或者利用在本说明书的其他地方所描述的各种 DNA疫苗接种的方法将编码人CEA基因的质粒DNA注射到小鼠内(例 如，肌肉内注射到四头肌内)。
肿瘤攻击：为了测定性类固醇清除对CEA免疫的小鼠的抗肿瘤活性 的疗效，小鼠接受了肿瘤攻击。在免疫接种后的不同时间点上，将表达 人CEA基因(MC38-CEA-2)的同基因肿瘤细胞(Conry et al.，(1995)Cancer Gene Ther.2：33)接种到小鼠内。每隔一天观察小鼠的可触及的肿瘤结节 的发育。当肿瘤结节直径超过1cm时，处死小鼠。接种和处死之间的时 间为生存时间。
为了检验性类固醇清除预防肿瘤的疗效，用表达人CEA基因的肿瘤 细胞接种到阉割的、未疫苗接种的小鼠内，如上所列的。假阉割小鼠当 作对照。
实施例14：遗传学修饰HSC的移植(基因治疗)
I.SCID-hu小鼠模型
材料和方法
小鼠：基本上如先前所述的通过将人胎肝和胸腺片段手术移植到 CB-17scid/scid小鼠内制备SCID-hu小鼠中(见例如，Namikawa et al.，(1990) J.Exp.Med.172：1055和Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。构建 SCID-hu Thy/Liv小鼠的方法也可见于例如Current Protocols In Immunology，Unit 6，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York， NY(1994)，和每年更新版本包括2002年。
小鼠的手术阉割：通过腹腔内注射30-40μl溶于盐水的5ml 100mg/ml 盐酸氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)加上1ml 20mg/ml甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 的混和物麻醉SCID-hu小鼠。如在其他地方所描述的进行手术阉割，通 过阴囊切口，显露睾丸，将其用缝线结扎，然后与外周脂肪组织一起取 出睾丸。并手术订关闭伤口。将按上述的但没有取出睾丸的方法所制备 的假阉割小鼠作为对照。
化学阉割：如上进行化学阉割。
人CD34+HSC的分离：用本领域人员所熟知的技术收集并处理人脐 血(CB)HSC(见，例如DiGusto et al.，(1997)Blood，87：1261(1997)， Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。每个CB标本的一部分都进行了 MA2.1表面分子的HLA表型分型。利用Bonyhadi et al.((1997)J.Virol.71： 4707)所描述的方法用免疫磁珠富集CD34+细胞。简单地，将CB细胞与 抗CD34抗体(QBEND-10，Immunotech)孵育，然后洗涤并以2×107/ml的终 浓度重悬。然后按照产品说明书用山羊抗小鼠IgG1磁珠(Dynal)富集 CD34+细胞。然后将CD34+细胞与50μl糖蛋白酶(O-唾液糖蛋白内肽酶) 孵育，该酶造成CD34+细胞从免疫磁珠上的释放。用磁铁去除磁珠，然 后细胞被用于利用所结合的抗CD34-PE抗体的流式细胞术，以确定细胞 群中所存在的CD34+细胞的总水平。或者，细胞被用抗CD34抗体磁性 标记并储存于autoMACSTM中。autoMACSTM可被用于在进一步的流式细 胞术分选之前进行对细胞的磁性预分选。例如，可以往FITC或PE染色 的细胞内加入抗FITC或抗PE的MACS_MicroBeads。然后autoMACSTM 根据细胞的磁性标记分选细胞。可以选择阳性或阴性部分用于流式细胞 术的分选。
任选地，可以用IL-3、IL-6以及或用SCF或LIF(每种10ng/ml)体外 扩增HSC。
RevM10载体和遗传学修饰的(GM)HSC的制备：RevM10在本领域 是已知的，并且在对用于HIV感染患者的T细胞存活的GM HSC的研究 中已经广泛地描述了本载体(见，例如，Woffendin et al.，(1996)Proc.Natl. Acad.Sci.USA，93：2889；for review，see Amado et al.，(1999)Front.Biosci. 4：d468)。已知HIV Rev蛋白能影响HIV感染细胞内的病毒潜伏期，并对 HIV复制是至关重要的。RevM10是Rev的衍生物，因为与细胞因子相 互作用的Rev的富含亮氨酸区域内的突变。RevM10具有78位点上的门 冬氨酸对亮氨酸的取代以及79位点上的亮氨酸对谷氨酸的取代。这些突 变的结果是RevM10能与野生型HIV Rev有效地竞争与Rev反应元件 (RRE)的结合。
可以使用本领域已知的并被描述的任何一种RevM10基因转移载体。 例如，逆转录病毒的RevM10载体，pLJ-RevM10被用于转化HSC。 pLJ-RevM10载体已经显示出在转运到HIV感染的个体后能增强T细胞 植入(Ranga et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1201)。构建的其他 方法和适用于制备GM HSC的逆转录病毒载体在本领域是熟知的(见，例 如，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。
在另一个实例中，pRSV/TAR RevM10质粒被用于利用颗粒介导的基 因转移将非病毒载体转运到所分离的靶向HSC内，基本上同Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11581所描述的。也可以使用含 有Rous肉瘤病毒(RSV)启动子以及来自HIV的-18到+72的tat激活反应 元件(TAR)被用于表达RevM10的开放阅读框的pRSV/TAR RevM10质粒 (Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11581；Liu et al.， (1997)Gene Ther.1：32)。先前已经显示该质粒对人PBL的体外转染提供 了对HIV感染的抗性(Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 91：11581)。
一种标记基因例如Lyt-2α(小鼠CD8α)基因也可以被结合到RevM10 载体内，以方便在随后步骤中的对GM HSC的纯化和分析的FACS分析 (见，例如，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。
构建了含有甲硫氨酸(Met)起始密码子(ATG)的缺失以及包括一系列 在框架内插入到RevM10基因的BgIII位点内的终止密码子的连接物的 ΔRev10，并被用作为阴性对照(见，例如Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71： 4707)。
GM HSC被注射到小鼠内：在胸腺和肝植入后约4个月分析了 SCID-hu小鼠。为了清除细胞群，被确定为与人供者HSC HLA不匹配的 (MA2.1)的小鼠接受了近400rads的全身照射(TBI)。TBI之后，如先前所 述的用RevM10GM HSC(见上)重建小鼠(DiGusto et al，(1997)Blood， 87：1261，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。给对照小鼠注射未修饰 的HSC或已经用ΔRevM10基因或无关基因修饰的HSC。
流式细胞术对GM HSC的分析：在GM HSC重建后近8到12周， 取出Thy/Liv移植物，得到胸腺细胞并用本领域人员容易知道的流式细胞 术和FACS分析的方法分析其的HLA表型(MA2.1)以及CD4+、CD8+、 和Lyt2(“标记物”，CD8α的小鼠同系物)表面表达的分布(见，例如 Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707；也见Current Protocols In Immunology，Unit 6，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York， NY(1994)，和每年更新版本包括2002年)。利用标准PCR方法用特异于 RevM10基因的引物测定了胸腺细胞的转基因DNA。
对GM HSC对HIV感染抗性的分析：在GM HSC重建后近8到12 周，取出Thy/Liv移植物并从GM HSC重建的SCID-hu小鼠中得到胸腺 细胞。如先前所述的(Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)，用HIV-1 的JR-CSF分子分离物体外刺激并感染胸腺细胞。简单地，含有10％FCS、 50μg/ml链霉素、50U/G青霉素G、1×MEM维生素溶液、1×转移胰岛素 的亚硒酸钠培养基补充物(Sigma)、40U人rIL-2/ml、和2μg/ml植物凝血 素(PHA)(Sigma)的RPMI培养基中，在有着经照射的异基因喂养细胞(106 外周血单个核细胞/ml和105JY细胞/ml)时，体外刺激胸腺细胞。约每10 天如先前在Vandekerckhove et al.，(1992)J.Exp.Med.1：1033中所述的用 喂养细胞和PHA再刺激细胞。在刺激后近5天时，根据HLA表型(MA2.1) 和Lyt2(“标记物”，CD8α的小鼠同系物)分选细胞。所分选的细胞被再 刺激并可以被扩增到增加细胞组成到超过约90％纯度。然后分选出 CD4+/Lyt2+细胞，将一部分近5×104个所分选的细胞放入到96孔U底组 织培养板的多个孔内。往每个孔中加入约200TCD50的EW、HIV-1初级 分离物，或1000TCD50的JR-CSF、HIV-1分子分离物。先前已经描述了 病毒储存液制备的方法(Bonyhadi et al.，(1993)Nature，363：728)。从第3 天到12天每天更换培养基。隔天收集上清液部分并储存在-80℃直到使 用。然后按照产品说明书(Coulter)用p24ELISA分析组织培养上清液。
II.HIV感染个体的治疗
材料和方法
人CD34+HSC的分离：因为绝大多数HIV感染患者有着非常低滴 度的HSC，因此用供者供给细胞是可能的。在实践中，通过在收集细胞 之前给供者注射10μg/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天，增强了供 者血液中的HSC水平。
在这个实施例中，用本领域人员熟知的技术收集并处理人脐血 (CB)HSC(见，例如DiGusto et al.，(1997)Blood，87：1261；Bonyhadi et al.， (1997)J.Virol.71：4707)。每个CB标本的一部分被用于进行HLA表型分 型，例如用流式细胞术或免疫磁珠从供者血液(或BM)中纯化出CD34+ 供者细胞，基本上如上述的。用流式细胞术所鉴定的供者来源的HSC是 CD34+细胞。
任选地，可以用IL-3、IL-6以及或用SCF或LIF(每种10ng/ml)离体 扩增HSC。
RevM10载体和遗传学修饰的(GM)HSC的制备：可以使用在本领域 已知的并被描述的任一RevM10基因转移载体，包括那些在上面的小鼠 研究中所描述的载体。利用GM逆转录载体的基因转导或利用颗粒介导 的输送的基因转染的方法在本领域也是熟知的，并在本说明书的其他地 方有所描述。
如上所述，可以构建逆转录病毒载体含有HIV-1rev基因的反式显性 突变形式Rem10，该突变形式已经显示能抑制HIV复制(Bonyhadi et al.， (1997)J.Virol.71：4707)。通过用来自载体转染的亲嗜性(ecotropic)生产细 胞的过滤上清液的感染生成了含有双向载体的上清液。
在加有IL-3、IL-6和SCF或LIF(每种10ng/ml)的LCTM培养基中， 任选地预刺激所收集的CD34+细胞，以诱导细胞进入细胞周期。
在这个实施例中，利用颗粒介导的(“基因枪”转移)用线性RevM10 质粒对富含CD34+的HSC进行转染，基本上如在Woffendin et al.，(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：2889中所述的。但是，如果进行逆转录病 毒转导，就反复地往细胞内加入含有载体的上清液2-3天，以容许载体转 导到细胞内。
对HIV感染患者的HAART治疗：在T细胞耗竭和性类固醇清除之 前开始HAART治疗，在整个过程中都保持治疗以减少病毒滴度。
T细胞耗竭：如在实施例5中所给的，进行T细胞耗竭以尽可能地 去除许多HIV感染细胞。
性类固醇清除治疗：如在实施例6中所述，给予HIV感染患者性类 固醇清除治疗。
将GM HSC注射到患者体内：在注射之前，将GM HSC在包括IL-2 (Chiron，300IU/ml)的X-Vivo15培养基中培养扩增近10天。在给予LHRH 激动剂后近1-3周，在胸腺刚刚开始再活化之前或同时，给患者注射遗传 学修饰的HSC，任选的剂量为约2-4×106个细胞/kg。也可以任选地给受 者注射G-CSF，有助于GM HSC的扩增。
在给患者输注之前即刻，用Dulbecco PBS洗涤GM HSC 4次。将细 胞重悬于100ml含有1.25％人白蛋白和4500U/ml IL-2的盐水中，并在30 分钟内输注到患者体内。
在给HIV感染患者性类固醇清除和注射GM HSC之后，所有新的T 细胞(以及DC、巨噬细胞等)都耐受于该病毒随后的感染。给进行胸腺再 活化的患者注射异基因HSC意味着HSC将进入胸腺。正再活化或已再 活化的胸腺摄取遗传学修饰的SHC并将其转化为供者型T细胞和DC， 而将受者的HSC转化为受者型T细胞和DC。通过细胞死亡诱导删除， 或通过免疫调节细胞诱导耐受性，供者DC将耐受任何的可能与受者反 应的T细胞。
当建立了胸腺嵌合体时，新的成熟T细胞群已经开始离开胸腺，出 现了免疫抑制的减轻以及最终的消失。
输注后治疗：在输注之后，利用对从患者中得到的PBL标本的限制 性稀释PCR定期测定GM HSC在HIV感染患者中的保留时间和半衰期， 基本上如在Woffendin et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：2889中 描述的。比较了被感染患者与接受ARevM10载体的阴性对照患者中的 GM HSC相对水平。
也利用本领域熟知的方法进行各种标准的血液学的(例如CD34+T 细胞计数)、免疫学的(例如中和抗体滴度)和病毒学的(例如病毒滴度)研 究。
免疫抑制的终止：如在实施例16中所给出的终止免疫抑制。
实施例15：可供选择的方案
在缩短供者细胞、组织或器官的移植所需的时间方面，修改了实施 例1-14中所用的时间线。同时开始T细胞清除或其他免疫细胞耗竭及性 类固醇清除。T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续约10天，而性类固醇 清除持续3个月左右。在一个实施方式中，在开始联合治疗后10-12天左 右，当胸腺开始再活化时，进行HSC移植。
在一个甚至更短的时间表中，同时开始两种类型的耗竭和HSC移植。 在这种情况中，T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续了3-12个月，例如 3-4个月。
实施例16：免疫抑制的终止
当建立了胸腺嵌合体以及新的成熟T细胞群开始离开胸腺时，从患 者中取血，并在标准的混和淋巴细胞反应中体外检查T细胞的对供者细 胞的应答性的缺失(见，例如，Current Protocols InImmunology.John E. Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版 本包括2002年)。如果没有应答，逐步减少免疫抑制治疗以容许对感染的 防御作用。如果没有排斥的征象，如血液中所存在的活化T细胞的存在 所部分提示的那样，最终完全停止免疫抑制治疗。因为HSC具有很强的 自我更新的能力，所形成的造血嵌合体理论上将在患者的终生都是稳定 的(也就是正常的、未耐受的和未植入的人)。
实施例17：使用LHRH激动剂再活化人胸腺
材料和方法
为了显示人胸腺可以被本发明的方法所再活化，这些方法被用于已 经用化疗治疗前列腺癌的患者。
患者：选择了16例I-III期前列腺癌患者(用他们的前列腺特异性抗 原(PSA)积分所评价)。所有的对象都是年龄在60和77岁之间的男性， 这些患者在按需接受前列腺癌的局部放疗之前，都经受了标准的联合的 雄激素阻断治疗，治疗依据每月注射GnRH激动剂，每月3.6mg醋酸戈 舍瑞林(Zoladex_)或7.5mg亮丙瑞林(Lupron_)治疗共4-6个月。
FACS分析：将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl全血中，并 在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其重悬于 1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、 CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE (都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
统计学分析：通过比较治疗前和治疗后结果，每个患者都作为内对 照，并用配对学生t检验或Wilcoxon标记的秩和检验分析结果。
结果
在性类固醇清除治疗之前和4个月后评价前列腺癌患者。在图19-23 中概述了结果。数据共同地证实了许多患者内的T细胞状态的定量和定 性的提高。
I.LHRH治疗对淋巴细胞和其中T细胞亚组的总数的作用
分析了进行前列腺癌的LHRH激动剂治疗的患者(都＞60岁)的外周 血淋巴细胞的表型组成(图40)。在治疗前和在开始LHRH激动剂治疗后 4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总淋巴细胞数目 都在对照值的低限。
在治疗之后，9例患者中的6例显示出总淋巴细胞计数的显著增加 (在一些病例中观察到了总细胞数目的翻倍)。与此相关的是9例患者中的 6例有总T细胞数目的增加。在CD4+亚组内，这种增加在9例患者的8 例中甚至是更为明显的，证实了CD4+T细胞水平的增加。在9例患者的 4例患者中看到了CD8+亚组内的较不突出的趋势，表现为水平的增加， 虽然通常增加的程度要小于CD4+T细胞。
II.LHRH治疗对T细胞亚组的比例的作用：
对在LHRH激动剂治疗之前和之后的患者血液的分析证实在T细胞、 CD4+或CD8+T细胞的总体比例上没有显著变化以及CD4+∶CD8+比例在 治疗后有着不同的变化(图41)。这说明治疗对T细胞亚组的内环境稳态 的保持上有着很小的作用，尽管治疗后显著地增加了总T细胞数目。所 有数值都与对照值相当。
III.LHRH治疗对B细胞和髓细胞的比例的作用
对进行LHRH激动剂治疗的患者的外周血内的B细胞和髓细胞 (NK、NKT和巨噬细胞)的比例的分析证实在亚组内有着不同程度的变 化(图42)。NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，而9 例患者中的4例出现了B细胞比例的下降。
IV.LHRH激动剂治疗对B细胞和髓细胞总数的作用
对治疗后的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目的分析清楚地显示 治疗后增加了NK(9例患者中的5例)、NKT(9例患者中的4例)和巨噬 细胞(9例患者中的3例)的细胞数目的水平(图43)。B细胞数目没有显 示出突出的趋势，其中9例患者中的2例显示出水平的增加，9例患者中 的4例显示出没有变化，以及9例患者中的3例显示出水平的减少。
V.LHRH治疗对原初细胞相对于记忆细胞的水平的作用
LHRH激动剂治疗后所看到的主要变化是在外周血的T细胞群内。 特别是，有着原初(CD45RA+)CD4+细胞的比例的增加，以及在CD4+T 细胞亚组内，9例患者中的6例出现了原初(CD45RA+)对记忆 (CD45RO+)的比例的增加(数据没有显示)。
VI.结论
因此可以推论：对动物例如具有萎缩胸腺的人的LHRH激动剂治疗 能诱导胸腺的再生。已经显示了已经接受性类固醇清除治疗的这些前列 腺癌患者的血T淋巴细胞状态的普遍提高。似乎这些细胞是来源于胸腺， 因为已经描述了没有主流的(TCRαβ+CD8αβ链)T细胞的其他来源。胃 肠道T细胞主要是TCRγδ或CD8αα链。
实施例18：人的外周免疫细胞池在造血干细胞移植后的再生
I. 异基因和自体HSCT
这个实施例涉及用HSCT患者所进行的临床试验。为了评价恢复人 的胸腺和骨髓功能的临床可能性，已经分析了常规进行基于LHRH激动 剂(化学阉割)的性类固醇清除治疗的前列腺癌患者(＞60岁)。在治疗开 始时和在此时所有患者的血清睾酮浓度都处于阉割水平的治疗后4个月， 检查患者。
材料和方法：
患者：82例患者都因为恶性疾病或骨髓衰竭进行了大剂量化疗 (HDT)和PBSCT(异基因对照患者22例，异基因LHRH-A治疗患者20 例；自体对照20例；自体LHRH-A治疗患者20例)。在自体或异基因干 细胞移植前3周，给予测试患者3.6mg(有效4周)Zoladex(LHRH-A)， 然后每月注射共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周、和此后的每 个月直到12个月分析所有患者。从Alferd人体研究伦理委员会得到伦理 许可(试验编号01/006)。
对全外周血的FACS分析：将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl 全血中，并在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其 重悬于1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、 CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE (都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
Ki67分析：为了检测增殖细胞，用CD27-FITC、CD45RO-CyChrome、 and CD4-或CD8-APC(Pharmingen，San Diego，CA)表面染色标本。在红 细胞裂解后，将标本在500μl 1X FACS透化溶液(Becton-Dickinson，USA； 从RO水的10X溶液中制得1X溶液)中暗处，RT下孵育20分钟，将洗 涤过的标本(2ml FACS缓冲液，5分钟，600gmax，RT)与抗Ki-67-PE或 抗Ki67-FITC(或合适的同型对照)在室温下暗处一起孵育30分钟。然后 洗涤标本并将其重悬于1％PFA中用于分析。
PBMC的制备：通过聚蔗糖-泛影葡胺分离和随后的离心制备出纯化 的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分析，取出血浆层，在分析性 类固醇水平之前将其储存在-20℃。没有被用于T淋巴细胞刺激检测的细 胞被重悬于冷冻培养基中，并在TREC分析之前将其储存在液氮中。
T淋巴细胞刺激检测：对于促有丝分裂原刺激，按每孔100μl RPMI-FCS内的1×105个细胞的浓度将纯化的淋巴细胞平铺在96孔圆底 板中。将细胞与剂量从1-10μg/ml的PHA在37℃，5％CO2下一起孵育。 对于TCR特异性刺激，将细胞在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗 CD28(10μg/ml)涂层的板中孵育48个小时。在空斑形成后(48-72个小 时)，往每孔内加入1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。 收集板到过滤包(mats)中，并在β计数器(Packard-Coulter，USA)上用液 态闪烁法测定3H-胸腺嘧啶核苷的掺入情况。
TREC分析：
细胞分选：将冷冻的标本快速融化并用抗CD4-FITC和抗CD8-APC 在冰中染色30分钟，将其洗涤(2ml FACS缓冲液)以及用3％福尔马林 PBS溶液固定(搅拌下)。再孵育标本30分钟，洗涤并将其重悬在500μl用 于分选的FACS缓冲液中。在MoFlo_细胞分选仪(Cytomation Inc.)中分 选出CD4+和CD8+细胞群。
DNA分离：分选细胞并将其重悬于蛋白酶K(PK)消化缓冲液中 (2×105个细胞/20μl 0.8mg/mL溶液)。将标本在56℃下孵育1个小时，随 后在95℃下孵育10分钟以灭活蛋白酶。
利用分子信标的实时PCR：如先前所述的(Zhang et al.，(1999)J.Exp. Med.190：725)进行用于分析所选细胞内的TREC含量的实时PCR。引 物为：有义引物，5′-GGATGGAAAACACAGTGTGACATGG-3′(SEQ ID NO：4)，反义引物，5′-CTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCC-3′(SEQ ID NO：5)。进行1个循环的变性(95℃10分钟)，随后是45个循环的扩增 (94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒)。为了标准化输入DNA中的细胞等 价物，用分开的实时PCR检测定量CCR5编码序列，它不含有假基因。
统计学分析：用Instat II软件进行统计学分析。对于前列腺癌HSCT 研究，进行Mann-Whitney U检验。对于人体研究，通过比较治疗前和治 疗后的结果，每个患者都作为内对照，并用配对的学生t检验或wilcoxon signed秩合检验分析结果。
结果：
图49描述了在HSCT后的不同时间点(2-8周)对对照患者的自然杀 伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在两个对照的异基 因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反地，在HSCT前3周 接受LHRH-A治疗的异基因患者从移植后第14天到5个月都显示出了显 著更高的NKT细胞(Vα24+Vβ11+)数目(图49C，数据表示为6-20例患 者的平均值±1SEM，*p≤0.05)。根据它们的Vα24+Vβ11+表型分析NKT 细胞。
图50描述了在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35天)对 对照患者的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期 恢复，这主要见于移植后早期的CD8+群内，这说明了胸腺外途径的再生。 从移植后1个月开始，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的B 细胞重建。如图51B所示，自体移植患者中的B细胞重建比异基因患者 中的发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月，两组内 的向对照值(阴影部分)的恢复仍不明显。
图52描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的 CD4+重建。当B细胞数目在移植后6个月恢复到对照值时(见图48A-B)， 自体的(图52B)和异基因的(图52A)受者中的CD4+T细胞数目仍是 严重减低的，甚至在移植后12个月时。
图53描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的 CD8+细胞再生。如图53A-B所示，相应地在异基因和自体受者中，CD8+ T细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53C所示，CD8+T细 胞主要是胸腺外来源的，如TCRγδ+T CD8+T细胞、CD8ααT细胞和 CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样。
图54描述了利用标记物Ki-67对HSCT之前(图54A)和28天后(图 54B)的对照患者的不同的CD4+和CD8+T细胞群的增殖的FACS分析。 利用标记物CD45RO和CD27，根据原初、记忆和活化表型分析细胞。 大多数的增殖发生在CD8+T细胞亚组，这还说明这些细胞是胸腺外来源 的以及主要的增殖都发生在外周T细胞亚组内。
图55描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者及 LHRH-A治疗患者的原初CD4+T细胞再生。图55描述了对原初CD4+T 细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析，并显示这些细胞在整 个研究过程中的严重缺失。如图55B-C所示，自体移植患者中的原初 CD4+T细胞到HSCT后12个月时开始再生(图55C)，但异基因患者中 的仍显著地低于对照值(图55B)。这些结果说明胸腺因为患者的年龄而 不能在移植后恢复足够多的原初T细胞的数目。相反地，在异基因前3 周接受LHRH-A的患者中，到移植后9&12个月时都显示出比对照显著 更高数目的原初CD4+T细胞(与对照(未LHRH-A治疗的)比较，移植 后9&12个月的p≤0.05)(图55D)。这说明胸腺依赖性T细胞途径的再生 随着性类固醇清除治疗而增强。
图56描述了在HSCT后不同时间点(1-12个月)的对照患者的 TREC水平。对仅见于新近胸腺迁出细胞(RTE)的TREC水平的分析着 重于异基因(图52A)和自体(图52B)患者的胸腺在移植后恢复水平的 无能。这再次被归结于患者的年龄，以及因为胸腺萎缩所造成的胸腺功 能的缺失，已经认为这对这些患者的发病率和死亡率都有着相当的影响。 相反地，当在异基因移植前接受LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干 细胞移植的患者都表现出CD4+TREC+细胞/ml血的显著增加(与对照 (未LHRH-A治疗的)比较，移植后9个月的p≤0.01)。接受LHRH-A治 疗的异基因患者在移植后9个月时显示出比对照显著更高数目的CD4+ TREC+细胞/ml血。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月也显示 出显著更高的水平(图56D)。这说明胸腺再活化随性类固醇清除治疗的 增强。数据表示为5-18例患者的平均值±1SEM，*p≤0.01。
LHRH-A给药显著地增加了外周血的NK但不是B细胞的数目。总 体而言，没有观察到B细胞数目随LHRH-A治疗的显著变化(图47)。但 是，观察到了NK细胞数目随治疗的显著增加(p≤0.01)(图47)。因此， 性类固醇的去除造成了T细胞和NK细胞数目的显著增加。
与对用LHRH-激动剂所治疗的患者的先前研究一致(Garzetti et al.， (1996)Obstet.GynecoL 88：234-40；Oliver et al.，(1995)Urol.Int，54： 226-229；Umesaki et al.，(1999)Gynecol.Obstet.Invest.48：66-8)，观察到了 总淋巴细胞、T细胞(主要是CD4+)和NK细胞的显著增加(图45和47)。 对T细胞群的更为详细的分析发现了原初CD4+T细胞以及原初和记忆 CD8+T细胞数目在LHRH-A治疗后的显著增加(图44)。
为了确定原初T细胞的增加是否是通过外周扩增(见例如用IL-7给 药的实例(Soares et al.，J.Immunol.(1998)161：5909-5917))或是作为胸 腺再活化的直接结果，进行了对细胞增殖(Ki-67抗原+)以及TREC水平 的分析(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79：631-40)。在CD4+(图48A) 和CD8+T细胞(图48B)的原初、活化或记忆细胞群中，都没有看到增 殖水平随激动剂治疗的任何变化(仍为2-4％的低水平)。这说明治疗没有 直接诱导T细胞的增殖，以及外周的过度增殖不会影响TREC的水平。 这没有除外在更早时间点的外周扩增的可能性。但是，预计这将仅仅造 成活化/记忆细胞水平的增加。在对10例患者的TREC水平的分析之后， 发现了胸腺功能和T细胞数目的增加的直接证据(图46B)。在CD4+和 CD8+T细胞群内，10例患者中的5例到LHRH-A治疗4个月时显示出 绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超过最初显示值的＞25％)。这也被 反映于比例的增加(每1×105个细胞)。与此相关的10例患者中的6例都 显示出总TREC水平的总体增加。仅仅1例患者显示出总TREC(减少约 10％)的减少。因为能在胸腺内发生作为正常T细胞发育的一部分或输出 后的有丝分裂(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79：631-40)稀释了 TREC(Zhang et al.，(1999)J.Exp.Med.190：725-732)，绝对TREC水平将 表示对T细胞输出的非常的低估值。因此，激动剂治疗后的外周的总 TREC+细胞的显著增加与胸腺依赖性T细胞途径的再生(Douek et al.， (1998)Nature 396：690-695(1998)；Douek et al.，(2001)J.Immunol.167： 6663-8；Hochberg et al.，(2001)Blood 98：1116-21)完全一致。总的，这些 数据证实了性类固醇抑制提高了成人的胸腺输出的能力并提供了恢复在 多种临床病变中的严重T细胞耗竭后的原初T细胞数目的基础。
实施例19：性类固醇清除增强了小鼠的造血干细胞移植后的免疫重建
进行这个试验是为了检验异基因HSCT受者的性类固醇抑制能提高 它们的移植后免疫重建的假说。因此，这些试验旨在建立性类固醇清除 是否影响异基因HSCT后的造血恢复。在HSCT后14天时，阉割小鼠比 假阉割对照显著地增加了胸腺细胞数目。到28天时，这些细胞仍在增多， 此时阉割小鼠的脾细胞密度也有增加。在胸腺中，T细胞前体和DC在 HSCT和阉割后都有着显著增加。在HSCT和阉割后，也显著地增加了 BM前体细胞和发育中的B细胞。这些中心增加转变为异基因HSCT后 的供者来源的外周T和B细胞的显著增加。每一种免疫增强策略都带来 了加重发生移植物抗宿主病(GVHD)的危险。在异基因组中，在诱导 GVHD的同时阉割小鼠。当比较阉割和假阉割小鼠时，GVHD发生率或 严重度都没有显著差异。此外，在缺乏性类固醇时，GVT活性没有消失。 先前已经显示在IL-7治疗后增强了异基因HSCT受者的淋巴细胞恢复。 IL-7治疗和阉割的联合表现出对HSCT后的胸腺具有累加作用。这些结 果说明阉割及所造成的性类固醇的清除增强了异基因HSCT后的造血恢 复，且没有加重GVHD并保留了GVT。
材料和方法
试剂：抗小鼠CD16/CD32FcR封闭剂(2.4G2)和所有下面的荧光团 标记的抗小鼠抗原的抗体都来自Pharmingen(San Diego，CA)：Ly-9.1 (30C7)、CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8.2(53-5.8)、T细胞受体β (TCR-β；H57-597)、CD45R/B220(RA3-6B2)、CD43(S7)、IgM-FITC (R6-60.2)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(Gr-1)(RB6-8C5)、c-kit(2B8)、Sca-1 (D7)、CD11c(HL3)I-Ak(11-5.2)、同型对照物：鼠IgG2a-k(R35-95)、鼠 IgG2a-1(B39-4)、鼠IgG2b-(A95-1)、鼠IgGl-k(R3-34)、仑鼠IgG-group l-k (A19-3)、仑鼠IgG-group 2-1(Ha4/8)、和2.4G2及Fcr(FcR封闭剂)。抗生 物素蛋白链球菌-FITC、PercP-藻红蛋白(PE)也来自Pharmingen(San Diego，CA)。重组人IL-7由Michel Morre博士(Cytheris，Vanves，France) 提供。
为了确认人重组IL-7能刺激小鼠细胞，用IL-7依赖性小鼠前B细胞 株2E8进行了胸腺嘧啶核苷掺入增殖检测，并发现在研究中所用的人IL-7 对小鼠细胞具有与小鼠IL-7相等的增殖作用。组织培养基由加有10％热 灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺 的RPMI 1640(以及用于培养32Dp210细胞和增殖检测的50mM 2-巯基乙 醇)构成。
小鼠和HSCT：雄性C57BL/6J(B6，H-2b)、C3FeB6Fl/J([B63C3H]F1； H-2b/k)、B10.BR(H-2k)、B6D2F1/J(H-2b/d)、CBA/J(H-2k)、Balb/c(H2-d)、 IL7-/-和KGF-/-小鼠都来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)，并当它们 为8到12周大之间时将其用于试验中。使用4个月到7个月中间大的 KGF-/-和IL7-/-小鼠。HSCT方案得到了Memorial Sloan-Kettering癌症中 心研究所的动物照顾和使用委员会的许可。从股骨和胫骨中无菌取出BM 细胞。通过与抗Thy-1.2抗体在4℃孵育30分钟，紧接着与低TOX-M兔 补体(Cedarlane Laboratories，Hornby，ON，Canada)在37℃孵育1个小时， 取出了供者BM的T细胞。通过在尼龙绒毛柱上的纯化及随后用氯化氨 红细胞裂解缓冲液去除红细胞，得到了脾T细胞(用于GVHD分析)。将 细胞(有或没有脾T细胞和白血病细胞的5×106个BM细胞)重悬于 Dulbecco改良基本培养基(Life Technologies，Grand Island，NY)中，并在 第0天将其通过尾部静脉输注(0.25mL总体积)移植到致死性照射的受 者中。在移植前的第0天，受者接受了1300cGy全身照射(137Cs源)，分 次给予，每次剂量之间间隔3小时(以减少胃肠道毒性)。将小鼠圈养在 无菌的微隔离笼中，并接受正常的食物和高压灭菌的次氯酸化的饮用水 (pH 3.0)。
手术阉割：将小鼠麻醉并切出小的阴囊切口以显露睾丸，将睾丸结 扎并与外周的脂肪组织一起取出。用手术订关闭伤口。假阉割除了取出 睾丸外要求相同的手术操作。在BM移植前1天进行阉割，用于免疫重 建和GVHD研究。
IL-7的给药：或从第0到13天或从第21到27天腹腔内给予10μg/ 天IL-7，用于免疫重建研究。在相同的时间点给对照小鼠注射PBS。
流式细胞术分析：在FACS缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS)/2％小牛血 清蛋白(BSA)/0.1％叠氮化合物)中洗涤BM细胞、脾细胞或胸腺细胞， 并将1-3×106个细胞与CD16/CD32FcR封闭剂在4℃下一起孵育30分钟。 然后将细胞与第一抗体在4℃下孵育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤两 次。根据需要，将细胞与结合的抗生物素蛋白链菌素在4℃下再孵育30 分钟。将所染色的细胞重悬在FACS缓冲液中并在FACSCaliburTM流式细 胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuestTM软件进行分析。
增殖检测：将脾细胞(4×105个细胞/孔)在96孔内与作为刺激物的 经照射的(2000cGy)BALB/C脾细胞(2×105个细胞/孔)孵育5天，并用 αCD3(145-2c11)和αCD28(37.51)(终浓度为2.5mg/mL)刺激脾细胞 (4×105个细胞/孔)4天。在最后18个小时期间，用1mCi/孔[3H]胸腺嘧啶 核苷激动(pulse)培养物，并用Harvester 96(Packard)收集DNA。将刺 激指数(SI)计算为刺激细胞(cpm)对未刺激细胞(cpm)的比值。
51Cr释放测定法：在37℃和5％CO2下，用100mCi51Cr标记2×106 个细胞/mL的靶细胞2个小时。在洗涤三次后，将所标记的靶细胞按 2.5×103个细胞/孔平铺在U底板(Costar，Cambridge，MA)中。将终体积 为200mL的与经照射的BALB/C脾细胞(1∶2比例)培养2天的脾细胞按 不同的效应物：靶细胞比例加入到4到6个孔中，并在37℃和5％CO2下 孵育4到6个小时。最后，从每个孔中取出35mL上清液，并在伽马计 数仪上计数以确定出试验释放。从只接受靶细胞和培养基的孔中得到自 发释放，从接受5％Triton X-100的孔中得到总释放。用下面的公式计算 出细胞毒性百分比：毒性百分比＝100×[(试验释放-自发释放)/(总释放-自 发释放)]。
用细胞内IFN-γ染色对异基因反应性T细胞克隆的检测：简单地，将 细胞与布雷菲德菌A(10mg/mL)孵育12到15个小时(对于用T细胞耗 竭的[TCD]、经照射的刺激型细胞的异基因刺激)，收集并洗涤细胞，然 后用第一(表面)荧光团(FITC、PerCP、和APC)结合的抗体染色、固 定、并用Cytofix/Cytoperm试剂盒(Pharmingen)透化细胞，以及最后用 αIFNγ-PE染色。通过给所设定的群设门进行FACS分析。使用如下面所 提及的流式细胞仪和软件。
迟发型过敏发应检测：在异基因BMT后42天时，经尾部静脉注射 200μl 0.01％羊红细胞(Colorado Serum，Denver，CO)的PBS溶液致敏假 阉割和阉割小鼠。在第46天时，用50μl 20％羊RBC悬液攻击致敏动物 的右后爪垫，同时左后爪垫接受了相同体积的50μl PBS溶液作为对照。 用标识厚度的计量器(Mitutoyo，Kanagawa，Japan)测定24小时和48小 时后的爪垫肿胀。通过试验右侧的爪垫测定值减去PBS注射的左侧爪垫 的测量值测定出反应的强度。
对GVHD的判定：用首先由Cooke et al.((1996)Blood 88：3230-9)所 描述的临床GVHD积分系统判定GVHD的严重度。简单地，每周给编码 笼内的耳部标记的动物个体化地计分5个临床参数(体重减轻、姿态、活 力、皮毛和皮肤)，分值从0到2分。通过累加整个5个条件的积分(0-10) 得出临床GVHD指标。每日监测生存率。积分大于等于5分的动物被认 为是濒死的，并被以人道的方式处死。
对GVT-P815(H-2d)肥大细胞瘤诱导作用的评价以及对肥大细胞瘤 死亡对GVHD造成的死亡的评价：B6D2F1/J受者在异基因HSCT(5×106 个T细胞耗竭的(TCD)BM细胞和5×105个C57/BL6来源的T细胞)的 第0天静脉内接受了1×103个P815(H-2d)细胞。每日检测生存率，如先 前所述的用尸解确定HSCT后的死亡原因。简单地，死于白血病的特征 是肝脾肿大以及显微镜检查在肝和脾内发现有肥大细胞瘤细胞，而死于 GVHD被定义为缺少肝脾肿大及肝和脾内的白血病细胞，以及在死亡时 存在有临床GVHD积分系统所评价的GVHD的临床症状。
半定量RT-PCR：用Superscript II逆转录酶(Life Technologies， Rockville，USA)逆转录全BM的总细胞RNA。用PCR Master Mix (Promega，Madison，USA)PCR扩增cDNA 35个循环(94℃30秒；56℃30 秒；72℃60秒)。HPRT：5′CACAggACTAgAACACCTgC3′和 gCTggTgAAAAggACCTCT3′；TGFβ1：5′CTACTgCTTCAgCTCCACAg3′ 和5′TgCACTTgCAggAgCgCAC3′；KGF：5′gCCTTgTCACgACCTgTTTC 3′和5′AgTTCACACTCgTAgCCgTTTg 3′。
对IL7-/-胸腺的酶消化：IL7-/-小鼠包含有很大比例的CD45-胸腺间 质细胞，每个胸腺都在0.125％(w/v)胶原酶/分散酶(Roche Applied Sciences，Indianapolis，USA)和0.1％(w/v)DNA酶中接受酶消化，从胸腺 中释放出绝大多数的间质和造血细胞，以容许精确地计算胸腺的细胞密 度。用抗CD45抗体鉴别CD45-间质细胞。
统计学：所有的数据都被表示为平均值±SEM。用Mantel-Cox对数 秩合检验分析生存数据，用非参数的、非配对的Mann-Whitney U检验进 行所有其他的统计学分析。小于0.05的P值被认为是统计学显著的。
结果
I.阉割增加了异基因HSCT后的BM、胸腺和脾的细胞密度。在异 基因HSCT前1天阉割胸腺CBA小鼠。小鼠接受了1300cGy全身照射， 和随后的5×106个B10.BR TCD BM细胞。在早到HSCT后14天时(图 29A-B)，与假阉割的对照比较(分比为9.5×106±3.0×105和 25×106±2.6×106)，阉割小鼠的BM(16×106±1.4×106)和胸腺内 (55.4×106±1.8×106)有着显著更多的细胞。在HSCT后28天时，这些数 目在阉割小鼠中仍有显著的提高(BM：22×106±4.0×106对 14×106±2.2×106；胸腺：72×106±5.9×106对45×106±2.9×106)。在第28天时， 阉割小鼠中的脾细胞密度也显著地增高超过了假阉割的脾细胞数目 (253×106±28.4×106对126×106±13.9×106)(图29C)。到28天时，阉割小鼠 开始接近移植前的细胞密度。到了HSCT后42天时，阉割小鼠和假阉割 小鼠之间的胸腺及脾细胞密度不再有显著的差异。因为假阉割受者都是 年轻小鼠，它们具有活跃的移植后淋巴细胞生成，但是与阉割受者比较， 显著地延长达到生成初级和二级淋巴组织的正常细胞密度所需的时间。
II.在HSCT后28天的阉割小鼠的BM中有着显著更多的供者来源 的HSC。一些研究已经显示性类固醇抑制了早期造血前体细胞的增殖和/ 或分化(Thurmond et al.，(2000)Endocrmol.141：2309-2318；Medina et al.， (2001)Nat.Immunol.2：718；Kouro et al.，(2001)Blood 97：2708)。因此，已 经探讨了阉割对异基因移植组中的HSC数目的影响。供者来源的HSC 数目在异基因HSCT后14天的假阉割和阉割小鼠中都是非常低的(分别 为2.98×102±1.25×102和2.66×102±8.8×101)(图30A)。但是，到第28天时， 与假阉割对照比较(1.1×103±4.1×102)，阉割小鼠有着显著更多的 Ly9.1+Lin-Sca-1+c-kit+供者来源的HSC(4.8×103±1.1×103)(图30A)。
III.先于异基因HSCT的阉割增强了供者来源的B细胞的恢复。在 对B细胞恢复的分析中，区分开B细胞发育的三个阶段：原B细胞 (CD45R+CD43+IgM-)、前B细胞(CD45R+CD43-IgM-)和未成熟B细胞 (CD45R+CD43-IgM+)。在异基因HSCT后14天时，与假阉割对照 (2.08×106±5.0×104)比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的前B细胞 (5.5×106±1.7×106)(图30B)。在28天时，在阉割小鼠的BM内也有显著更 多的前B细胞(sham-cx：3.1×106±3.7×105c.f.cx：6.6×106±6.6×105)和未成熟 B细胞(sham-cx：1.3×106±2.6×105c.f.cx：3.0×106±3.4×105)(图30B)。在 HSCT后28天时，BM B细胞和它们的祖细胞的增加转化为阉割小鼠的 脾的未成熟B细胞数目的显著增加(sham-cx：64.9×106±6.4×105 c.f.cx：112.0×106±10.0×105)(图30C)。这些结果与先前的结果吻合，说明阉 割增强了BM的B细胞产生及输出。
IV.阉割增强了异基因HSCT后的T细胞重建。根据CD3、CD4和 CD8的表达，将胸腺细胞和外周细胞分成发育阶段：三阴性(TN) (CD3-CD4-CD8-)、双阳性(DP)(CD4+CD8+)、单阳性CD4(SP CD4) CD3+CD4+CD8-和单阳性CD8(SP CD8)CD3+CD4-CD8+(图31A-D)。早 到异基因HSCT后14天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内有着显著更 多的TN、DP、SP CD4和SP CD8胸腺细胞。在HSCT后28天时，阉割 组内的DP和CD4SP细胞数目仍有显著地提高。到第42天时，假阉割 和阉割小鼠内的所有的胸腺细胞亚群都相同。宿主和供者来源的DC都 被认为在避免移植物排斥上发挥着完全的作用(Morelli et al.，(2001) Semin.Immunol.13：323-335)。在异基因HSCT后14天时，在阉割小鼠 的胸腺内有着显著更多的宿主来源的CD11chiDC。在异基因HSCT后28 天时，阉割小鼠的胸腺内的宿主和供者来源的DC都有着显著地增加(图 31E-F)。在第28天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内的胸腺细胞数目 的增加转化为了阉割小鼠的脾内的供者来源的成熟CD4+和CD8+T细胞 数目的显著增加(图31G)。
V.就每个细胞而言，假阉割和阉割小鼠的T细胞之间没有显著差异。 为了确定异基因HSCT后的阉割小鼠的外周T细胞的功能潜能，进行了 一系列的体外检测。图32A展示了异基因HSCT后6周的阉割小鼠和假 阉割对照的供者来源的T细胞的数目。以两种方式测定了脾T细胞的增 殖能力：αCD3/αCD8交联(图32B)和3rd部分MLR(用经照射的BALB/C 脾细胞作为刺激物)(图32C)。当在这两个组中比较假阉割和阉割小鼠时， 在外周T细胞的增殖能力上都没有显著差异。异基因HSCT后6周，将 脾细胞与经照射的BALB/C脾细胞(3rd部分)培养5天。在异基因刺激5 天后，培养中的绝大多数细胞都是CD8+T细胞。这些细胞的半数被用于 CTL(51Cr)检测以确定出假阉割和阉割小鼠的脾细胞的细胞毒性。测试 了在不同的效应物：靶细胞比值的脾细胞杀伤带有51Cr的A20(BALB/C B 细胞淋巴瘤肿瘤细胞株)细胞的能力(图32D)。在细胞毒性方面，假阉 割和阉割小鼠之间没有显著差异。用3rd部分(BALB/C)或同基因的 (B10.BR)经照射的脾细胞和布雷菲德菌素A重新刺激培养了5天的其他 一半的细胞以确定出IFNγ的产量。图32E显示了供者来源的CD8+T细 胞在BALB/C原初刺激和BALB/C或B 10.BR二次刺激(对照)后的IFNγ 的产量。图32F图解地展示了这一点。当比较假阉割和阉割小鼠时，产 IFNγ的供者来源的CD8+细胞的比例没有显著差异。
为了体内评价免疫功能，使用了DTH检测，其中在阉割和异基因 BMT后42天时，用sRBC致敏小鼠。在第46天，攻击小鼠并在24和 48小时后，测定爪垫肿胀。当与异基因HSCT同时被阉割的小鼠与假阉 割对照比较时，显著地增强了攻击后48小时的DTH应答(图32G)。
这些功能性检测证实，就每个细胞而言，阉割受者的T细胞与假阉 割受者的T细胞相当，并能应答于新的抗原，具有完整的增殖、细胞毒 性和细胞因子的产生。但是，甚至在移植后6周，阉割受者中的显著更 快的T细胞重建转变为了DTH应答的增强。
VI.先于异基因HSCT的阉割没有加重GVHD并保留了GVT活性。 GVHD和GVT都是主要由异基因移植物所转入的异基因反应性供者来源 的T细胞所介导的。任何用于增强免疫重建的治疗都有可能加重GVHD 或相反地减弱GVT活性。为了建立阉割对供者来源的异基因反应性T细 胞没有刺激作用，通过往异基因移植物内加入异基因供者T细胞诱导 GVHD。当比较阉割和假阉割小鼠时，因为GVHD所造成的发病率或死 亡率都没有显著差异(图33A)。为了评价阉割对GVT活性的作用，在移 植的同时将肥大细胞瘤细胞株P815(H-2d)注射到B6D2F1/J受者中。尸 解在试验期间死亡的动物，并确定出死亡的原因(肿瘤对GVHD)。肥大 细胞瘤所造成的死亡率在阉割后仍未改变(9只小鼠中的6只)，当与假 阉割对照比较时(8只小鼠中的5只)。这说明阉割没有消除HSCT后的 GVT应答(图33B)。
VII.异基因HSCT后的IL-7和阉割具有累加作用。先前已经显示 IL-7治疗能增加没有其他治疗的动物的T和B细胞的数目，以及也能增 强环磷酰胺、照射、同基因和异基因HSCT治疗后的淋巴系的复原 (Alpdogan et al.，(2001)Blood 98：2256；Bolotin et al.，(1996)Blood 88： 1887；Faltynek etal.，(1992)J.Immunol.149：1276；Morrissey et al.，(1991)J. Immunol.146：1547)。已知IL-7通过增加胸腺活性和外周扩增增加了T 细胞数目。
因此，决定在异基因HSCT的受者中联合阉割施与IL-7。治疗后14 天时，在阉割小鼠和那些接受联合治疗(阉割和IL-7给药)的小鼠的胸 腺中有着显著更多的细胞。在这早期时间点上，在PBS治疗的、假阉割 对照和IL-7治疗的、假阉割小鼠中都没有看到差异。在阉割组和接受联 合治疗的小鼠之间也没有看到显著差异，说明在异基因HSCT、IL-7治疗 和阉割后14天时，这仅仅是阉割所造成的作用(图34A)。在异基因HSCT 后28天的这个较晚的时间点上，单独阉割组和单用IL-7组的胸腺的细胞 密度都显著地高于对照组。当在异基因HSCT后28天分析时，IL-7治疗 和阉割的联合治疗对胸腺细胞密度具有累加作用(图34B)。
VIII.对IL-7、TGFβ1和KGF的半定量RT-PCR发现异基因HSCT 和阉割后的KGF的增加和TGFβ1的减少。对全骨髓细胞的RT-PCR发现 晚到异基因HSCT后6周时在假阉割和阉割小鼠中都没有可检测到的 IL-7转录的水平。当使用来自对照的、未移植的小鼠的模板时，检测到 了IL-7(数据没有显示)。已知TGFβ1和KGF是造血的关键介导物。在阉 割和异基因BMT后2周时，使用HPRT equibrated模板显示TGFβ1的减 少和KGF的增加(图34C)。
IX.在KGF-/-小鼠而不是在IL-7-/-小鼠中看到了阉割后所发生的变 化。为了进一步地研究隐藏在阉割后所增强了的免疫重建后面的可能机 制，阉割了KGF-/-和IL-7-/-小鼠，2周后分析了胸腺、脾和BM(TGFβ1-/- 小鼠在青春期前死亡，Shull et aL(1992)Nature 359：693)。当比较假阉割 和阉割的KGF-/-小鼠时，显著地增加了胸腺的细胞密度。尽管在这个早 期时间点上没有看到BM和脾的总细胞密度上的差异，如先前在野生型 小鼠中所看到的一样，在BM的B细胞组内看到了变化(Ellis et al.(2001) Int.Immunol.13：553；数据没有显示)。因为IL-/-小鼠的胸腺内的细胞的 大部分都是CD45-间质细胞的事实，当使用这些小鼠时，用酶消化得到 了细胞悬浮液。通过进行酶消化，更多的细胞被释放到悬浮液中，这造 成了这个试验中所看到的比先前文献中的稍微更高的胸腺细胞密度(von Freeden-Jeffry et al.(1995)J.Exp.Med.181：1519)。当比较阉割小鼠和假 阉割对照时，在IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、脾(图34H)或BM(图34I)中 都没有看到差异。这些发现说明IL-7在阉割和异基因HSCT后所看到的 增强了的免疫重建中的重要作用。
讨论
异基因HSCT的受者经历了一段长时间的免疫缺陷期，这与致命性 的感染相关。随着受者年龄的增加，这种感染的危险增加，因为完全的 免疫学重建所需的时间更长。HSCT后的免疫缺陷期可以超过1年，最近 长期的研究证实更老的HSCT患者比他们的供者减少了TREC+CD4+T 细胞(Storek et al.，(2001)Blood 98：3505；Lewin etal.，(2002)Blood 100： 2235)。这说明胸腺的损伤和随后的T细胞产量的下降可能比所想象的更 长。绝大部分的HSCT后的感染与外周CD4+T细胞的缺乏相关(Storek et al.，(1997)Am.J.Hematol.54：131)。因此，阉割后所发生的外周T细胞数 目的增加可能减少这些感染的发病率，导致移植患者的总生存率的增加。
多个小组都已经把它们的研究的重点集中在HSCT后的造血重建上， 绝大多数有希望的结果都来自造血生长因子和细胞因子的应用。例如， G-CSF被用于动员供者干细胞(Dreger et al.，(1993)Blood 81：1404)。 Noach等显示用SCF和IL-1II或SCF和Flt-3配体的预处理造成了供者细 胞植入的增强((2002)Blood 100：312)。KGF表现出增强了同基因和异基 因组的植入和重建并改善了GVHD(Panoskaltsis-Mortari et al.，(2000) Blood 96：4350；Kriianovski，et al.，(1999)Blood 94：825)。IL-7增强了同基 因HSCT后的免疫重建(Bolotin et al.，(1996)Blood 88：1887)，并能增强 异基因HSCT后的免疫重建和保持GVT活性而不加重GVHD(Alpdogan et al.，(2001)Blood 98：2256)。
一些研究已经显示手术或化学阉割所造成的雄性小鼠的性类固醇清 除增加了BM和脾B细胞的数目(Ellise et al.，(2001)Int.Immunol.13：553； Erben et al.，(2001)Hor7n.Metab.Res.(2001)33：491；Wilson et al.，(1995) Blood 85：1535；Masuzawa et al.，(1994)J.Clin.Invest.94：1090)。外周B细 胞数目的增加主要是因为B220loCD24hi新近BM迁出的增加(Ellis et al.， (2001)Int.Immunol.13：553)。Olsen等已经证实雄激素增强了BM内间质 细胞的TGFβ的产量，这反过来抑制了B细胞发育(J.Clin.Invest.(2001) 108：697)。另外，对TGFβ的体外中和逆转了二氢睾酮对B细胞的抑制。 TGFβ也已经显示出下调了间质的IL-7产生并随后抑制了B细胞前体的增 殖(Tang et al.，(1997)J.Immunol.159：117)。因此，在这个情况中，对阉 割/雄激素清除的作用的一个可能的解释是它在异基因HSCT后抑制了 TGFβ的产生，反过来增强了B细胞发育，解释了阉割小鼠比假阉割对照 增加了BM和脾的B细胞数目。
TGFβ也调节了造血干细胞的增殖。Batard等已经证实生理浓度的 TGFβ抑制了HSC的体外增殖和分化((2000)J.Cell.Sci.113：383-90)。此 外，对HSC的TGFβ信号途径的阻断(经突变的II型受体的暂时表达)增 强了这些细胞的存活和增殖(Fan et al.，(2002)J.Immunol.168：755-62)。 因此，异基因HSCT和阉割后28天所看到的HSC数目的增加可能是因 为BM间质细胞的TGFβ产量的减少是可能的。
雌激素和雄激素都能影响HSC的分化和增殖(Thurmond et al.， Endocrinol.，(2000)141：2309-18；Medina et al.，(2001)Nat.Immunol. 2：718-24；Kouro et al.，(2001)Blood 97：2708-15)。雌激素直接地抑制了 HSC和一些淋巴祖细胞亚组的增殖和分化(Medina et al.，(2001)Nat. Immunol.2：718；Kouro et al.(2001)Blood 97：2708)。HSC表达功能性的雌 激素受体(ER)以及雌激素给药减少了Lin-c-kit+Sca-1+HSC的数目 (Thurmond et al.，(2000)Endocrinol.141：2309；Kouro et al.，Blood(2001) 97：2708)。Thurmond等所进行的研究说明当BM(Endocrinol.(2000)141： 2309)的造血细胞中存在有ERoc时，阻断了c-kit+Sca-1+前体细胞和更 成熟的亚组(c-kit+Sca-1-和c-kit-Sca-1-)之间的转化。ER也存在与BM 间质细胞中(Girasole et al.，(1992)J.Clin.Invest.89：883；Smithson et al.， (1995)J.Immunol.155：3409)，说明雌激素也可能对间质细胞产生生长因 子有着作用，这反过来影响了HSC增殖和/或分化。尽管绝大多数证据说 明雌激素经BM间质对HSC的间接作用，BM的淋巴系中存在有功能性 雌激素受体并没有排除直接作用。
Olsen等已经显示功能性雄激素受体存在于胸腺上皮上而不是胸腺 细胞上，该受体对于年龄相关的胸腺退化以及随后的经性类固醇清除的 再生都是关键的(Olsen et al.，(2001)Endocrinol.142：1278)。
尽管胸腺退化和/或再生的分子机制仍不清楚，但这里有着一些可能 的侯选机制。胸腺IL-7水平随着年龄而减低(Aspinall，et al.，(2000) Vaccine 18：1629；Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37：455；Ortman et al.， (2002)Int.Immunol.14：813)。仍不清楚是否这是因为产IL-7的细胞数目 的减少或已有细胞产细胞因子的能力减低。但是，对老年小鼠的IL-7治 疗可以逆转年龄相关的胸腺凋亡的增加并增强造血作用(Andrew et al.， (2001)J.Immunol.166：1524)。小鼠胸腺的干细胞因子(SCF)和M-CSF mRNA表达也随着年龄而减少(Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37： 455)。在细胞内的信号途径水平，减少了对DN胸腺发育关键的转录因子 E2A，也减少了存在于胸腺上皮细胞上，并涉及该细胞的增殖和发育的转 录因子Foxnl(whn)(Ortman et al.，(2002)Unit.Immunol.14：813)。 Sempowski等已经监测了老年人的mRNA稳态水平，并显示出白血病抑 制因子(LIF)、制瘤素M、IL-6和SCF mRNA的显著增加(J.Immunol. (2000)164：2180)。
上述研究说明了对阉割的应答是多因素的。阉割IL-/-小鼠的试验说 明IL-7产生的增加是阉割作用的重要组成部分。但是，当用大剂量IL-7 和阉割治疗小鼠时，观察到了对胸腺细胞密度的累加作用，这说明阉割 提供了比单独增加IL-7水平更多的胸腺生成的作用。
DC是胸腺内的阴性选择的关键媒介物(Jenkinson et al.，(1985) Transplantat.39：331；Matzinger et al.，(1989)Nature 338：74-60)，以及在暂 时设定中，已经被涉及于通过移植后呈递胸腺的异基因抗原和去除供者 特异性T细胞诱导移植物接受性。Tomita已经证实MHC I型错配的受者 的胸腺的供者来源的细胞介导了供者反应性细胞的去除(Tomita et al.， (1994)J.Immunol.153：1087-1098)。他们也显示静脉内注射的胸腺来源的 DC被转运到了宿主胸腺内。此外，已经显示胸腺内注射宿主细胞加上异 基因的抗原、供者细胞、或供者可溶性肽都增加了移植物接受性 (GalTovillo et al.，(1999)Transplantation68：1827；Ali et al.，(2000) Transplantation 69：221；Garrovillo et al.，(2001)Am.J.Transplant.1：129； Oluwole et al.，(1993)Transplantation 56：1523-1527)。这些结果显示阉割显 著地增加了异基因HSCT后的胸腺的宿主和供者来源的DC的数目。也 就是说，性类固醇清除增强了胸腺DC的分化和/或增殖。因此，与造血 干细胞和实体器官移植联合应用的阉割增加了移植物接受性。
结论
当前的研究已经发现阻断性类固醇对骨髓清除和HSCT后的免疫重 建具有显著的正向作用。HSC、和B和T祖细胞被明显地增强。这提供 了一个用于增加植入的效率的重要平台和依赖于完整的造血系统的移植 后策略，例如抗肿瘤或微生物抗原的疫苗接种或靶向于供者HSCT的基 因治疗。胸腺内DC的增加对诱导和保持对异基因抗原的耐受性是重要 的。另外，在阉割受者中没有加重GVHD和消除GVT活性。这些结果 证实暂时的性类固醇清除(例如用LHRH类似物)作为增强免疫重建的 预防性治疗是有用的。
实施例20：性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的TCR特异性刺激
为了评价再生的T细胞的功能特性，分析了患者对TCR特异性刺激 的应答性。
材料和方法
患者：在干细胞移植前3周给予测试患者Zoladex(LHRH-A)，然后 每月注射1次共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周和每个月直到 12个月分析了所有的患者。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许可 (试验编号01/006)。
PBMC的制备：将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分 析，并如上制备。
T淋巴细胞刺激检测：除非有其他的说明，从移植后1-12个月起利 用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺激的分析。对于TCR特 异性刺激，在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)涂 层的板上孵育细胞48个小时。在形成空斑后(48-72个小时)，往每个孔 内加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收 集到过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定 出3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后的对TCR特异性刺激的 应答性。LHRH-A治疗的患者比对照患者在所有的时间点都表现出增强 了的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)，除了在第6个月和9 个月，因为此时所分析的患者数目少；(图57A-B)。在用LHRH-A所治 疗的异基因移植患者中，在移植后4和5个月时观察到了比对照患者显 著增加了的对抗CD3/CD28刺激的应答性。虽然对照患者在移植后6和9 个月显示出增强了的应答，而LHRH-A治疗的患者在移植后12个月显示 出更强的应答性。在移植后6和9个月，对照患者具有与治疗前数值相 似的应答性。但是，在所有的其他时间点上，他们都是明显更低的。相 反地，LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都具有与治疗前相同的应 答性，除了移植后6个月。LHRH-A治疗的患者在移植后1、3和4个月 显示出比对照患者增强了的应答性(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)。 这提示了外周T细胞的直接作用的结果，因为直到移植后1-2个月，新 的CD4+T细胞仍是不明显的(图57A-B)。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后的对TCR特异性刺激的应 答性。用自体移植的受者也观察到了在异基因移植受者中所看到的相似 的应答(图57C)。那些用LHRH-A治疗的患者证实了在移植后4和9个 月都具有增强了的对TCR刺激的增殖应答。LHRH-A治疗的患者在所有 时间点都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所 评价的)，除了移植后5个月。在移植后12个月，在对照和LHRH-A治 疗患者中都观察到恢复到了治疗前数值。
III.LHRH-A给药增强了慢性癌症患者治疗后的TCR特异性刺激的 应答性。
在本研究中入选了患有慢性血液恶性肿瘤且为免疫抑制的患者，其 免疫状态被如下确定：有资料证实的与CD4＜0.4×109/L相关的严重感染； 或淋巴增殖性疾病(例如，CLL、骨髓瘤、淋巴瘤)并接受常规的预防性 静脉内免疫球蛋白(有资料证实的低伽马球蛋白血症)；或先前4年内有 氟达拉滨、deoxycorfomycin和2-CdA的治疗；或先前2年内有异基因干 细胞移植或自体干细胞移植。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许 可(试验编号01/006)。如下给予患者LHRH-A，展示一直到LHRH-A给 药后6周的结果。
d-1(或之前)：签署知情同意，以及进行治疗前调查；
d0：施与Zoladex(男性10.8mg，女性3.6mg)；
d+28：女性-施与Zoladex 3.6mg
d+56：女性-施与Zoladex 3.6mg
d+84：女性和男性-施与Zoladex 3.6mg
从给药后第7天起，用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺 激的分析。与治疗前水平比较，LHRH-A治疗的患者显示出“循环”方 式的增殖应答的增强(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)(图63)。也就 是说，在注射的当天就观察到了T细胞增殖的增加，以及该增殖在下次 注射之前表现为轻度减少。这也说明LHRH-A对已有的外周T细胞的直 接影响的可能性。这反映了用每月储存剂注射液的激动剂的给药。这些 结果提示了对外周T细胞的直接影响。但是，在治疗后12个月所看到的 增强了的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因为所有患者从4个月 起就停止了激动剂的给药。
结论
因为早到移植后第35天就观察到了增加的对TCR特异性刺激的应 答性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅在这个阶段 才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T 细胞的影响，所以可以得出的结论是所增加的T细胞功能是因为已有T 细胞的提高而不是来源于再生胸腺的T细胞。
实施例21：性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的促有丝分裂刺激
为了评价再生T细胞的功能特性，分析了患者的对促有丝分裂刺激 的应答性。
材料和方法
患者：患者为如上所入选于No.01/006临床试验方案的那些患者。 在干细胞移植之前，给予患者LHRH-A(3周之前)。没有接受激动剂的患 者被用作为对照患者。
PBMC的制备：将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分 析，并如上制备。
促有丝分裂剂刺激检测：从移植后1-12个月起，用美洲商陆有丝分 裂原(PWM)和破伤风毒素(TT)进行对促有丝分裂应答性的分析。对 于促有丝分裂剂刺激，将PBMC以100μl RPMI-FCS内1×105个细胞/孔 的密度平铺在96孔圆底板中。将细胞与TT(2LFAU/ml)或PWM(10μg/ml) 在37℃，5％CO2下孵育。在空斑形成之后(48-72小时)，往每个孔内加 入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收集到 过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定出 3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应 答性。对促有丝分裂应答性的分析显示进行LHRH-A治疗的异基因患者 在移植后所有的时间点上都比对照具有增强了的对PWM的应答性(图 58A)。也就是说，先于干细胞移植用LHRH治疗的患者在所有的时间点 上都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性。
在分析对TT的应答性之后，相似的结果是显而易见的(图58B)。 LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都比对照患者具有增强了的应答 性，除了在移植后12个月。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应答 性。先于干细胞移植用LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上 都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性(3个月时的P≤ 0.001)(图59A)。到了移植后12个月时，LHRH-A所治疗的患者已经将 应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当减低的。
与上述的异基因患者相似(图58B)，当在治疗前给予LHRH-1时， 自体移植患者也显示出增强了的对TT的应答。先于干细胞移植用 LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上都显示出比对照患者增 强了的对TT刺激的应答性(图59B)。到了移植后12个月时，LHRH-A 所治疗的患者已经将应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当 减低的。
结论
因为早到移植后第35天就观察到了增加的对促有丝分裂刺激的应答 性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅仅在这个阶段 才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T 细胞的影响。
实施例22：性类固醇清除增强了造血干细胞移植患者中的植入的速度
材料和方法：
上面描述了用于这些试验的材料和方法。附加的材料和方法如下：
分析了异基因和自体患者(对照或LHRH-A治疗的)的HSCT后的 总WBC和总粒细胞或中性粒细胞数目。在HSCT前3周，用LHRH-A 治疗患者。没有接受激动剂的患者作为对照患者。确定出每μl血的总白 细胞(WBC)计数、粒细胞(G)或中性粒细胞计数，一直到移植后35 天。或用Cell-Dyn 1200自动化细胞计数仪(Abbott)或血细胞计数器重 复两次分析全外周血标本。这容许计算出移植后的全白细胞、淋巴细胞 和粒细胞数目。从移植后第14到35天起进行对植入的分析。
结果
I.先于移植进行LHRH-A治疗的自体干细胞移植患者增强了植入的 速度。在移植后第14、28和35天，确定出每μl血的总白细胞(WBC)计 数和粒细胞(G)计数。如图60A-D所示，接受LHRH-A治疗的自体患 者在移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图60B)(P≤ 0.05)，其中在这个时间点上，与对照的45％比较，87％显示出粒细胞植 入(≥500细胞/μl血)(P≤0.05)。接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后 第10-12天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图60C，数据被 表示为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，尽管没有显著差 异，LHRH-A治疗的自体患者在整个时间点都比对照组具有更高的淋巴 细胞计数(图60D)。这说明LHRH-A治疗显著地增加了干细胞移植后的 淋巴细胞水平。
II.先于移植进行LHRH-A治疗的异基因干细胞移植患者增强了植 入的速度。如图61A、C和D所示，接受LHRH-A治疗的异基因患者在 移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图61A)(P≤0.05)， 其中在这个时间点上，与对照的44％比较，64％显示出粒细胞植入(≥500 细胞/μl血)。另外，接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第9、12和 19天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图61C，数据被表示 为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，对进行外周血干细胞 移植的患者的分析证实当在异基因移植之前用LHRH-A治疗时，有着淋 巴细胞计数的显著增加(移植后第10、12、13和17-21天时的P≤0.05)(图 61D)。
结论
在异基因和自体移植的模型中，都观察到了LHRH-A治疗患者在移 植后第14天的WBC和粒细胞数目要显著地高于对照(图60和61)。这 种增强了的植入的速度对于有着预示感染率增加的粒细胞缺乏(≤200中 性粒细胞/ml血)的患者的总死亡率是重要的。因此，WBC和粒细胞数 目的早期恢复表明了LHRH-A治疗患者的更好的生存率。对性类固醇的 抑制增强了完全胸腺再活化或完全胸腺再活化所造成的新T细胞释放之 前的植入和重建。
实施例23：性类固醇清除在1周内增加了T细胞增殖应答。
进行这些研究以确定小鼠的性类固醇清除是否早到阉割后3到7天 就能增强增殖应答。
材料和方法
阉割8周大的小鼠，并分析手术3天(图62A、C和E)和7天(图 62B、D和F)后的抗CD3/抗CD28所刺激的T细胞增殖应答。用不同浓 度的抗CD3刺激以及用恒定浓度10μg/ml的抗CD28共刺激外周(颈部、 腋窝、肱骨和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和 D)、和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用氚化胸腺嘧啶激活细胞 18个小时，并将增殖测定为3H-T掺入。对照小鼠为假阉割，n＝4，*P≤0.05 (非参数的、非配对的、Mann-Whitney统计检验)。
结果
性类固醇清除的小鼠显示在阉割后第3天(图62A、C、和E)和7 天(图62B、D和F)就增强了CD28/CD3刺激的T细胞的增殖。在阉割 后第3天(10μg/ml抗CD3)和7天(2.5μg/ml和1.25μg/ml抗CD3)从 外周LN所分离到的T细胞显示出增殖应答的显著增加。
另外，在阉割后第3天从肠系膜淋巴结(图62C和D)和脾(图62E 和F)所分离到的T细胞也显示出抗CD3刺激的增殖的显著增加超过了 假阉割小鼠。
结论
早到阉割后第3-7天(先于新T细胞从胸腺迁出)，就有着T细胞对 抗CD3和CD28交联刺激的应答性的增加。这些数据提示在胸腺再活化 之前，性类固醇清除对外周血T细胞池的功能性具有直接作用。
为了确定LHRH-A对人类患者的外周T细胞的直接作用的程度，进 行了研究。将对照患者的T细胞与各种剂量的LHRH-A一起孵育，并在 不同的时间点(D3、D7和D14)分析相比较于对照标本(只用培养基)的 增殖水平。这容许确定出是否LHRH-A通过引起已有T细胞的活化而直 接作用于这些细胞，如在小鼠模型中所观察到的那样。
实施例24：性类固醇清除增强了同系HSCT后的造血作用
结果：
I.阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT前1 天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad) 的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同时间点(2-6周)分析BM、脾和胸 腺(图35)。如图35B所示，在阉割和HSCT后2周，当与假阉割对照比 较时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地，如图35C所示， 在移植后2、4和6周，阉割小鼠比假阉割对照有着显著增加的胸腺细胞 数目。如图35C所示，在外周，阉割受者在移植后4和6周的脾细胞数 目也显著地高于对照。
II.阉割增强了同系HSCT后的HSC在BM内的植入。在同系HSCT 前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM的 lin-c-kit+sca-1+HSC(图36)。在BMT移植和阉割后2周，在阉割小鼠的 BM内比假阉割对照有着显著更多的供者来源的HSC。
III.阉割增强了同系HSCT(2.5×106)后的HSC在BM内的植入。在 同系HSCT前1天阉割小鼠。将2.5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到 经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分 析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37A-B)。图37A描述了BM内的普通 淋巴祖细胞的百分比。图37B描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。 BMT移植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了 供者来源的HSC的比例。
IV.阉割增强了同系HSCT(5×106)后的HSC在BM内的植入。在同 系HSCT前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照 射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM 的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37C-D)。图80A描述了BM内的普通淋巴祖 细胞的百分比。图37D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。BMT移 植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了供者来 源的HSC的比例。
V.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的DC在胸腺内的植入的速 度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6 小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析胸腺细胞。供者来源的DC 被定义为CD45.1+CD11c+MHC I型+CD11b+或-。在BMT后2周时，与 假阉割对照比较，显著地增加了阉割小鼠的胸腺内的供者来源的CD11b+ 和CD11b-DC(图38)。
VI.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的B细胞在脾内的植入的 速度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的 C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析脾细胞。在同系BMT 后2周时，与假阉割对照比较，在阉割小鼠的脾内有着显著更多的B220+ B细胞(图39)。
实施例25：用G-CSF和/或GM-CSF对癌症患者的治疗减少了化疗后中 性粒细胞缺乏症的发病率
这个实施例举例说明了G-CSF和/或GM-CSF用于增加中性粒细胞水 平和减少接受化疗的患者的感染发病率的用法。
材料和方法
在100例小细胞肺癌患者中进行了一项双盲的、安慰剂对照研究。
G-CSF给药：根据产品说明书，从化疗后第4-17天皮下施与 4-8μg/kg/d剂量的Neupogen_(Amgen，Thousand Oaks，CA)。
GM-CSF给药：在第一个研究中，根据产品说明书，患者在每个化 疗周期的第2天接受了单一SC剂量的6mg Neulasta_(Amgen，Thousand Oaks，CA)或从每个周期的第2天开始接受皮下的5μg/kg/d Filgrastim_ (Amgen，Thousand Oaks，CA)。在第二个研究中，将对象随机分组接受为 在第2天接受单次皮下注射100μg/kg Neulasta_或从每个化疗周期的第2 天开始接受5μg/kg/d Filgrastim_。
患者：所有患者都已经被诊断为小细胞肺癌并给予了标准周期的环 磷酰胺、阿霉素和依托泊苷的治疗。GM-CSF患者被诊断为转移性乳腺 癌。
结果
以这种方式的G-CSF(Neupogen_)的治疗造成了如发热性中性粒细 胞缺乏症、感染率、患者入院和抗生素使用所确定的感染发病率的临床 及统计学地显著减少。多个该公司(www.neupogen.com)所报道的III期临 床试验报告G-CSF的应用造成了中性粒细胞的可测定的增加，据此支持 G-CSF治疗在接受免疫抑制性化疗的癌症患者中的临床应用。
在利用GM-CSF(Neulasta_)的随机双盲主动控制研究中看到了相 似的结果，该研究在转移性乳腺癌的治疗中采用了每21天给予60mg/m2 阿霉素和175mg/m2紫杉醇，共4个周期的方案(www.neulasta.com)。
选择中性粒细胞缺乏症的持续时间作为主要终点(明显得到了FDA 许可)。没有接受Neulasta_的患者有着100％的严重中性粒细胞缺乏症的 发病率，平均持续时间为5-7天，以及30-40％发热性中性粒细胞缺乏症 的发病率。
在两个研究中，都在第2天给患者施用Neulasta_(c.f.Neupogen_， 其中在第4天施与药物)。
两个研究(对于Neulasta_，一个研究是固定剂量的，另一个是重量调 整的剂量)都证实每种药物在严重中性粒细胞缺乏症的平均天数的主要终 点上没有差异。在两种情况中，平均天数都接近于1.7天(c.f.未治疗的5-7 天)。两个研究中的发热性中性粒细胞缺乏症的发病率相当，都接近于 10-20％。
实施例26：用性类固醇清除治疗和G-CSF(和/或GM-CSF)对癌症患者的 治疗减少了化疗后的中性粒细胞缺乏症的发病率和感染率
在一个随机的双盲研究中，80例小细胞肺癌患者被随机分组到接受 G-CSF(Neupogen_)或接受G-CSF和Lupron_的1-4组中；在化疗周期的 前4天每天和此后的每三天监测所有组内的所有患者。利用本领域熟知 的技术监测所有患者的CBC、中性粒细胞计数、红细胞压积和T细胞分 类分型。另外，每天两次监测搜有患者的体温和其他的副作用。
组#1：仅用G-CSF
第一组包括一组在环磷酰胺(1g/m2/天)、阿霉素(50mg/m2/天)和依托 泊苷(120mg/m2/天x3)的标准化疗后第4-17天接受G-CSF的患者(n＝20)。 根据相关包装说明书内的给药和剂量说明，静脉内(I.V.)施与所有药物。 所有患者都接受21天周期的这个治疗方案。在这个组中，根据Neupogen_ 的包装说明书(任选范围为0-10μg/kg/d)所设定的剂量说明书皮下给予 5μg/kg/d剂量的G-CSF。根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给 予随后的化疗周期。根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向 10,000/mm3，治疗临床医师也能任选地减少所用的剂量，在ANC达到 10,000/mm3时停用G-CSF。
组#2：G-CSF加上化疗前21天的“大剂量”Lupron_
第二组包括一组在化疗前21天给予“大剂量”Lupron_(3个月恒定 释放产品，剂量22.5mg，S.C.)以及也根据前述方案从环磷酰胺(1g/m2/ 天)、阿霉素(50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天 给予G-CSF(5μg/kg/d)(任选范围为0-10μg/kg/d)的患者(n＝20)。所有患者 都接受21天周期的这个治疗方案。根据ANC最低值的持续时间和严重 度任选地给予随后的化疗周期。根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加 朝向10,000/mm3，治疗临床医师也能任选地减少所用的剂量，在ANC达 到10,000/mm3时停用G-CSF。根据相应包装说明书内的给药和剂量说明 施与所有药物。
组#3：G-CSF加上化疗前21天的“小剂量”Lupron_
第三组包括一组在化疗前21天给予“小剂量”Lupron_(3个月恒定 释放产品，剂量11.25mg，S.C.)以及从环磷酰胺(1g/m2/天)、阿霉素 (50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天给予 G-CSF(5μg/kg/d)的患者(n＝20)。所有患者都接受21天周期的这个治疗方 案。根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给予随后的化疗周期。 根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向10,000/mm3，治疗临床医师 也能任选地减少所用的剂量，在ANC达到10,000/mm3时停用G-CSF。 根据这些药物的包装说明书施与化疗药物、G-CSF和Lupron_。
组#4：G-CSF加上化疗前14天的“大剂量”Lupron_
第四组包括一组在开始化疗前14天给予“大剂量”Lupron_(3个月 恒定释放产品，剂量22.5mg，S.C.)的患者(n＝20)，从环磷酰胺(1g/m2/天)、 阿霉素(50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天给予 这些患者G-CSF(5μg/kg/d)。所有患者都接受21天周期的这个治疗方案。 根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给予随后的化疗周期。根据 常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向10,000/mm3，治疗临床医师也能 任选地减少所用的剂量，在ANC达到10,000/mm3时停用G-CSF。根据 这些药物的包装说明书施与化疗药物、G-CSF和Lupron_。
结果
预期当与G-CSF治疗组(组1)比较时，G-CSF和“大剂量”Lupron_ 的治疗(组2)将造成如感染率、抗生素使用、WBC计数、严重中性粒细 胞缺乏(ANC＜500/mm3)和发热性中性粒细胞缺乏症所证实的感染发病 率的临床和统计学显著的减少。也预期G-CSF和“小剂量”Lupron_的 治疗(组3)将产生与来自更大剂量Lupron_治疗(组2)的患者的结果没有 显著差异的结果。最后，预期在化疗前第14天给予3个月恒定释放的、 22.5mg S.C.剂量的Lupron_将产生与组2的那些患者的结果没有显著差 异的数据。但是，预期有多个数据点说明在治疗周期的更早阶段施与 Lupron_对于一些患者可能是有益的。
实施例27：用性类固醇清除治疗对骨髓移植患者的治疗减少了WBC计 数、严重中性粒细胞缺乏症、发热性中性粒细胞缺乏症和感染的发生率
在一项随机非盲研究中，20例患者在接受BMT之前给予了GnRH 类似物的治疗。也进行BMT但没有接受GnRH类似物的这个患者组是对 照组(n＝19)。
根据认可的医学技术，所有患者都接受了来自匹配供者的异基因移 植物(Lincz et al.，(2001)Leuk.and Lymph.40：373)。
治疗组中的所有患者都接受了4个每月剂量的GnRH类似物 (Lupron_7.5mg，S.C.)。最初在BMT前21天施与Lupron_。
在移植之前，用标准的清除药物和技术清除所有患者的BM(Segeren et al.，(1999).Br.J.Haem.105：127-130)。
在第-21、-2、0、1、2、3、7、10、14和21天抽取每个患者的血样。 然后利用在本说明书的其他地方所详细描述的方法以及本领域人员所熟 知的方法评价血样的WBC、中性粒细胞、T细胞(经FACS分析，如上 面所详细描述的那样)、粒细胞水平和红细胞比容。
另外，监测所有患者的感染率(包括病毒感染)、抗生素的使用、发 热性中性粒细胞缺乏症、和严重中性粒细胞缺乏症(ANC＜500/mm3)的平 均天数。如上面所列的进行这些分析，从移植日期开始起的1个月、3个 月、6个月和9个月随诊患者。
结果
预期一直到移植后的第21天，当与无GnRH激动剂治疗组比较时， GnRH激动剂(Lupron_)的治疗将造成WBC计数、严重中性粒细胞缺乏 症(ANC＜500/mm3)的平均天数和发热性中性粒细胞缺乏症的临床及统计 学显著的减少。
也预期由于患者的数量少，一直到1个月，两组间的病毒和其他感 染率的发病率将没有统计学显著差异。但是，预期在移植后3、6和9个 月，两组间的这些感染率将是有统计学差异的，其中GnRH激动剂治疗 的患者将治疗得更好(即，更容易处理和恢复更快)。
实施例28：用性类固醇清除治疗对癌症患者的治疗增加了造血作用和中 性粒细胞计数
在一个随机非盲研究中，转移性前列腺癌的男性患者(n＝30)在他们正 常的治疗过程中接受了GnRH激动剂(Lupron_，注射(7.5mg s.c.每月一 次))。所有患者也都接受了抗雄激素药物。也可以给予Cosudex_(5mg/ 天或50mg/天口服)1个月。
所有患者在开始治疗前进行全血分析(FBA)。FB包括对淋巴细胞、 白细胞、红细胞比容和红细胞含量的标准的病理分析。另外，进行了对 免疫学参数的分析包括T细胞刺激、细胞因子产生、免疫细胞亚组和 TREC分析。
另外，在第-2、0、1、2、3、7、10、14、21和28天、以及此后的 每个月共6个月抽取每个患者的血样。然后利用在本说明书的其他地方 所详细描述的方法以及本领域人员所熟知的方法评价血样的WBC、中性 粒细胞、T细胞(经FACS分析，如上面所详细描述的那样)、粒细胞水平 和红细胞比容。
预期在GnRH激动剂治疗的最初14天内，当与基线水平(第-2和0 天)比较时，大多数患者(近70％)都将有着造血作用和中性粒细胞计数的 增加。
实施例29：性类固醇清除疗法对患者的治疗增加了流感疫苗接种的疗效
在一个随机非盲研究中，转移性前列腺癌的男性患者(n＝45)在他们正 常的治疗过程中接受了GnRH激动剂(Lupron Depot_，注射(7.5mg s.c. 每月一次))。所有患者也都接受了抗雄激素药物。也可以给予Cosudex_ (5mg/天或50mg/天口服)1个月。
所有患者在开始治疗前进行全血分析(FBA)。
接受GnRH激动剂和Cosudex_的患者被如下随机分组到每组15例 患者的三个组中的其中一组：
组#1：
第1组包括15例根据产品说明书在第0天接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#2：
第2组包括15例根据产品说明书在第21天接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#3：
第3组包括15例根据产品说明书在第8周接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#4：对照：
第4组是对照组，包括15例没有前列腺疾病并没有接受药物的相似 年龄的男性的附加组。对照组根据产品说明书在第0天接受流感疫苗接 种(例如，Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)。
在整个研究中(在第-2、0、1、2、3、5、7、14、21、28天、以及此 后的每个月共6个月)，利用在本说明书的其他地方所详细描述的方法以 及本领域人员所熟知的方法评价血样的WBC、中性粒细胞、T细胞(经 FACS分析，如上面所详细描述的那样)、粒细胞水平和红细胞比容。在 每个时间点，也利用鼻咽部拭子和FLU OIA(Thermo BioStar)监测患者是 否存在流感(A和B型)病毒。
在第-2天以及流感免疫接种后的所有时间点，还利用本领域人员熟 知的技术监测每组内的患者是否存在抗流感H1N1株的凝血抑制抗体。
结果：
当与组4内的对照患者有1例拭子流感病毒阳性比较时，预期在组 1-3的任一组内都没有一例患者报告有任何的流感的感染性式件。
也预期所有组内的患者将有着比GnRH激动剂治疗前更高的血凝抑 制抗体滴度。预期组2和3内的患者比那些组1和4内的患者产生了更 高的抗体滴度。但是，预期所有患者从12周开始将有相似的抗体滴度。
另外，预期保护率(对流感H1N1株大于40％的患者具有血凝抑制物) 在组2中是最高的，以及在组4中是最低的。
实施例30：LHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮
材料和方法
利用125I-睾酮放射免疫测定法(RIA)进行对患者血清中的性类固醇 水平的检测。在检测之前，将所有试剂、标本和对照都放在室温。对照 管或有单独缓冲液-非特异结合(NSB)管或有0ng/ml标准睾酮(B0)。将 单独缓冲液、标准液(0-10ng/ml睾酮)或测试标本加入到每个管中，随 后加入性结合球蛋白抑制剂(SBGI)以限制放射性标记的睾酮的非特异 性结合。往每个管中加入125I-睾酮，随后加入抗睾酮抗体(除了NSB管 外)。然后将管在37℃下孵育2个小时。之后，往所有管中加入第二抗体， 涡旋并再孵育60分钟。将管离心(1000gmax)15分钟，去除上清液，在 Packard Cobra自动贝塔计数仪上计数沉淀物。平均三次cpm结果并用结 合睾酮百分比(B/B0)的公式构建出标准曲线：
％B/B0＝(标本-NSB)/B0-NSB
标本＝特定测试标本的平均cpm
NSB＝非特异性结合管的平均cpm
B0＝0ng/ml标准液的平均cpm(总结合管)
从标准曲线中确定出每个测试标本的睾酮水平。
结果
给前列腺癌患者施与LHRH-A造成了阉割水平的血清睾酮。为了确 定LHRH-A治疗的有效性，在治疗前和LHRH-A治疗4个月时，分析了 所有患者的血清睾酮水平。利用125I-睾酮的放射免疫测定法(RIA)进行 分析。在激素治疗之前，血清睾酮的浓度是在1-3ng/ml睾酮(平均值 ＝2.3ng/ml)的范围之内(图46A)。在治疗4个月时，患者基本上没有可 测定到的血清睾酮，提示对性类固醇释放的成功清除。
LHRH-A给药没有影响外周血内的淋巴细胞亚组的百分比。在用 LHRH-A治疗4个月后，与治疗前数值比较，没有观察到任何淋巴细胞 亚组的比例的任何变化。这些数值都在正常范围内(数据没有显示)。用 FACS分析了外周血淋巴细胞的T、B和髓系来源的(NK和巨噬细胞)的 比例和细胞数目。在LHRH-A给药后没有观察到任何细胞亚组的比例的 任何变化。此外，所有淋巴细胞亚组的比例都在整个年龄组的正常范围 内(图84C)(Hannet et al.，1992；Xu et al.，1993)。
实施例31：在用醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)对性类固醇的暂时清除后进 行自体或异基因干细朐移植患者的胸腺再活化
在这个实施例中，在自体或异基因外周血干细胞移植(PBSCT)之前 给予醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)。主要终点是如体外检测所测定的胸腺再 活化。患者在移植后随诊6个月。20例患者(10例异基因移植和10例自 体移植)将进入研究。这个实施例探讨了在LHRH水平抑制性类固醇产 生的作用，利用LHRH的激动剂脱敏垂体并因此阻止了LH和FSH的释 放。反过来，这造成了性腺的雄激素和雌激素产生的阻断，这就去除了 对胸腺功能的抑制作用。在这个试验中所检测的组是进行大剂量化放疗 (HDT)和PBSCT的患者。
醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)是一种LHRH的有效的、合成的十肽类 似物。当急性给药时，醋酸戈舍瑞林将从垂体中释放出LH。但是，在慢 性给药后，醋酸戈舍瑞林是一种促性激素激素产生的有效的抑制剂，造 成了性腺抑制以及最终造成了性器官退化。在动物和人类中，在对垂体 的最初刺激、LH分泌和血清睾酮的短暂提高之后，慢性给药造成了对促 性腺激素分泌的抑制。结果是发生在最初治疗的近3周之内的对垂体LH 的持续抑制以及男性中的血清睾酮水平减少到了如在手术阉割男性中正 常所看到的范围。然后保持这种抑制与持续治疗一样长的时间。
患者是男性或女性，年龄大于等于18岁，因恶性疾病或BM衰竭进 行了大剂量治疗(HDT)和PBSCT。10.8mg Zoladex_的植入物剂型(男 性用)被分散在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形棒 内，在皮下注射后持续释放超过12周。3.6mg植入物(女性用)被分散 在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形杆内并在皮下注 射后持续释放超过28天。植入物是商品化的，置于用专用目的设计的带 有14-16号针头的给样器内。
血液中的性类固醇减少到最小值可能要花费数周。因此，在PBSC 输注(第0天)前21天，给患者注射LHRH激动剂Zoladex_(植入物)形 式的性类固醇清除治疗。对于男性，在第-21天给予单一剂量的10.8mg 戈舍瑞林(有效3个月)以及在第63天再次注射3.6mg(有效28天)。对 于女性，在第-21天、第7、35和63天施与3.6mg(有效28天)。这对于 减少性类固醇水平到足以再活化胸腺的水平应当是有效的(预计在 PBSCT后4个月)。因此，在这个实施例中，仅仅给予4-6个月的治疗。 本领域人员容易确定出可被接受的其他剂量。
在第0天输注PBPC。再活化的胸腺摄取所输注的前体细胞并将它们 转化为新的T淋巴细胞和上皮胸腺细胞。最大的性类固醇“清除”是在 PBSCT输注的时候，因此所输注的PBSC能有助于胸腺重建。预计在 PBSCT后3-4周内，最初的新的T细胞将出现在血流中，但是治疗应当 在PBSCT后维持3个月以容许免疫系统的完全正常化。
通过流式细胞术、体外T细胞应答和TREC的产生对T细胞的评价 确定出胸腺功能。
在开始研究之前，进行了常规的HDT前的调查，记录基础的FBE、 电解质和LFT。其他治疗前分析包括血清HCG(女性)、胸腺CT、骨密度 研究、蛋白电泳和免疫电泳、激素研究：TFT、FSH、LH、雌激素、孕 激素、睾酮。另外，进行了各种基线的T细胞检测。从50ml血液中纯化 出白细胞，并如下检测：
(a)流式细胞术
原初T细胞对记忆T细胞
CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PerCP、CD4-或CD8-APC
CD27-FITC、CD45RO-PerCP、CD4/CD8-APC、Ki-67-PE
CD62L、CD45RO-PerCP、CD103、CD4/CD8-APC
T细胞亚组
CD4-FTTC、CD8-APC、αβTCR-PE、γδTCR-B/S-PerCP
CD25-PE、CD69-CyChrome、CD4-FITC、CD8-APC
CD28-CyChrome、αβTCR-PE、CD4-FITC、CD8-APC
B细胞/髓系细胞
CD19-FITC、CD3-PerCP、CD56-PE、CD34-APC
CD11b-CyChrome、CD11c-PE、CD4-FITC、CD8-FITC
细胞因子
IL-4-PE、IFNγ-APC、CD4-FITC、CD8
其他标记物
CD11a、CD95、HLA-DR、CD2、CD5
所有患者都作为内对照，因为在治疗前和后都检查他们。染色特异 性对照将包括FITC/PE/APC等的同型物对照，并在染色前阻断FcR。
(b) T细胞功能
将体外检查血淋巴细胞的对CD3交联的应答的能力。
(c) TREC分析
分离并探查原初T细胞的T细胞受体删除环的存在，它是因为上述 的TCR基因重排所形成的。它们的存在是胸腺输出的非常强的提示(因 为这是主流的T细胞产生的唯一来源)。因为细胞分裂与TCR基因的重 排后的胸腺发育相关，TREC水平可能低估了胸腺的迁出(实际水平的约 10％)。
实施例32：对恶性贫血的治疗
一个成年女性患者(例如，35岁)患有恶性贫血，一种自身免疫性疾 病。在G-CSF治疗(每天两次，共3天，每次10μg/kg)3天后，她的CD34+ 造血干细胞(HSC)收集自她的血液。用CD34可以从血液中纯化出她的 HSC。为了收集CD34+细胞，收集供者(即将给受者提供他/她的器官或皮 肤的人)的外周血，根据标准方法从外周血中分离出CD34+细胞。一个非 限制性的方法是将外周血与特异地结合于人CD34的抗体(例如，购自 Abcam Ltd.，Cambridge，UK的小鼠单克隆抗人CD34+抗体)孵育，用可 检测的标记的抗小鼠抗体(例如FITC标记的山羊抗小鼠抗体)二次染色 细胞，并经荧光活化细胞分选术(FACS)分离出FITC标记的CD34+细胞。 因为循环的外周血中只有少数的CD34+细胞，可能需要对供者进行对此 的采集和细胞分选。CD34+可以被冷冻保存，直到收集到足够多的使用 的量。
因为恶性贫血的抗原，用任何方式转染患者的所采集的HSC以表达 该抗原(称为，胃质子泵)。通过利用各种技术包括但不限定于电穿孔、病 毒载体、基于激光的压力波技术、脂质输注(见，例如在Bonyhadi等1997 中所描述的方法)可以转染HSC。在一个实例中，用H/K-ATP酶质子泵的 C1链转染她的HSC，将II型MHC启动子用于表达。
为了终止进展中的自身免疫性疾病，患者将进行T细胞耗竭和/或其 他免疫细胞耗竭。她也将进行胸腺再活化以取代这些T细胞，并因此克 服免疫缺陷状态。为了达到这一点，她将接受4次每月一次的Lupron (7.5mg)的注射以耗竭性类固醇(到3周时)，据此容许她的胸腺的再活化。 这也将容许摄取HSC并建立对相关自身抗原的中枢耐受。虽然还不清楚 自身免疫性疾病为什么会发生，但是对微生物的交叉反应是一种可能性； 因此耗竭所有的T细胞将去除这些交叉反应的细胞。如果疾病是这些交 叉反应所启动的，那么可能没有必要用名义上的自身抗原转染HSC。简 单地耗竭T细胞，紧接着通过阻断性类固醇信号途径的胸腺再活化可能 是足够的。用于去除T细胞的一种标准的方法如下。患者接受了每日注 射15mg/kg Atgam(异种抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn)形式的抗T 细胞抗体共10天，以及联合一种T细胞活化的抑制剂环孢菌素A，3mg/kg 连续输注3-4周，随后是按需的每日9mg/kg的片剂。这个治疗不影响患 者胸腺内的早期T细胞发育，因为人胸腺的大小和构型而不能输送具有 这样的作用所必需的抗体的量。保持这个治疗近4-6周以容许性类固醇的 缺失及随后的胸腺重建。对T细胞反应性的阻止也可以联合于第二信号 水平例如白介素、辅助分子(阻断剂，例如CD28)、信号途径分子或细胞 粘附分子的抑制剂，以增强T细胞清除或其他免疫细胞耗竭。
实施例33：对I型糖尿病患者的治疗
I型糖尿病患者接受了与实施例32中所述的相似的方法。用广谱的 耗竭方法去除T细胞(见上)，4个月的Lupron治疗促进了胸腺复壮以及 通过注射预先采集的经使用II型MHC启动子的前胰岛素基因所转染的 自体HSC增强了患者的免疫系统恢复。HSC将进入胸腺，分化成DC(和 所有的胸腺细胞)，并将前胰岛素呈递给发育中的T细胞。凋亡将杀死所 有的那些可能与前胰岛素反应的T细胞，只留下攻击外来的感染性病原 体的T细胞库。
对于与感染的交叉反应或只是“坏运气”所引起的自身免疫性疾病， 使用自体HSC足以帮助强化胸腺再活化。如果存在有对疾病的遗传易感 性(家族成员经常患自身免疫性疾病)，最好用异基因的高度纯化的HSC 进行胸腺恢复，以预防经由过路T细胞(passenger T cell)的移植物抗宿 主反应。脐带血也是一种好的HSC来源，通常没有或只有非常少量的异 基因反应性T细胞。尽管脐血没有高水平的CD34+HSC，它们对于建立 微嵌合体是足够的-甚至10％血细胞最终就能足以建立足够多的胸腺内树 突状细胞对自体抗原的耐受性。
实施例34：对患有过敏的患者的治疗
对于过敏，可以采用与实施例32和33相似的原理。如上耗竭过敏 患者的T细胞。在通过产IgE或IgG的B细胞(浆细胞)所加重的严重病 例中，利用化疗的骨髓清除可能是必要的。或者，可以使用全身照射(例 如6Gy)。通过应用3-4个月的GnRH和静脉内注射HSC(按需为异基因的 或自体的HSC)将复壮整个免疫系统。对于具有过敏的遗传学易感性的情 况，可以使用异基因的，否则就使用所动员的自体HSC。
实施例35：阉割对NOD和NZB小鼠的作用
非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)是I型糖尿病的一种非常具有特征性 的模型。大量研究已经确认该疾病的病理是因为对胰腺的异常的T细胞 浸润和对产胰岛素的胰岛细胞自身免疫性破坏。这些动物中的胸腺的结 构是异常的，这里有着髓质上皮细胞(mAb MTS 10所鉴定的)的异位表 达、大量B细胞滤泡和缺少上皮细胞的富含胸腺细胞区域的存在。
为了检查性类固醇对这些小鼠的影响，将20只3周大的雌性NOD 小鼠手术切除卵巢，以及20只进行假手术。选择这个阶段是因为它早于 疾病的发生。从10周大开始监测血糖。到了21周大时，超过60％的假 阉割小鼠已经发展为糖尿病，但＜20％的阉割组小鼠患有糖尿病。在手术 阉割后，也有着胸腺缺陷的正常化，包括界限明确的皮质和髓质、B细 胞滤泡的缺失和CD25+调节细胞的增加。调节T细胞的增加是非常重要 的，因为它们能改变迁出胸腺细胞的致病性细胞因子的量。因此，阉割 对NOD小鼠的糖尿病的发生和进展都具有显著的影响。
检查了16只卵巢切除的和16只假手术的NOD小鼠的糖尿病及胰岛 炎的发生(提高了的血糖水平；BGL)21周。在尸解中，也检查了胸腺结 构异常的出现。如图45所示，其中60％的假手术的NOD小鼠患有糖尿 病，少于20％的阉割组小鼠患有糖尿病。这清楚地显示了延缓或甚至预 防了糖尿病。
如图64所示，阉割NOD小鼠有着总的胸腺细胞数目的显著增加， 但在总脾细胞上没有差异。在糖尿病的阉割小鼠中，有着总的胸腺细胞 数目的显著减少，它们可能使得这些小鼠易患该疾病并提示在阉割之前 已经出现了糖尿病触发物。
这里有着所有的胸腺细胞亚型的显著增加(图66A)，但是它们的比例 没有变化(数据没有显示)。有趣的是，与假阉割小鼠(图66C)比较，B细 胞和脾的总T或B细胞都没有变化(图66B)。
与阉割后总胸腺细胞增加所平行的是，CD25+调节细胞的明显增加 (数据没有显示)。在脾内没有这样的变化。
也检查了阉割对NZB小鼠的作用，它是一种系统性红斑狼疮(SLE) 的模型。NZB小鼠具有明显的胸腺异常，它出现在疾病发生之前并与疾 病紧密相关。这些缺陷包括不明确的皮质-髓质界限、和异常的B细胞簇 (见Takeoka et al.，(1999)Clin.Immunol.90：388)。
在4-7周大时将小鼠阉割或假阉割，并在4周后检查。
有着总胸腺细胞(图67A)和脾细胞(图67B)的明显增加。也有着胸腺 调节细胞(CD25+和NKT细胞)的明显增加。来自这些小鼠的细胞因子 可能影响效应T细胞并调控它们可能的致病性。通过免疫化学法，阉割 小鼠具有正常的胸腺结构以及B细胞滤泡的缺失(数据没有显示)。
实施例36：阉割对肿瘤特异性抗原的免疫接种的作用
人乳头状瘤病毒(HPV)感染引起生殖道疱疹，这可能导致一些妇女的 宫颈癌。事实上，超过90％的所有宫颈癌中都含有HPV DNA。乳头状瘤 病毒是感染皮肤和粘膜表面的双链DNA病毒。至今已经鉴定出了80多 种类型的HPV。HPV16是其中一种与宫颈癌相关的主要类型。
E7是与HPV16诱导的宫颈癌相关的主要的致癌蛋白。其他小组已 经显示具有活化ras的E7开放阅读框的表达足以将培养物中的初级上皮 细胞转化为恶性表型(Lin et al.(1996)Cancer Res.56：21)。因此，E7是 一种用于宫颈癌和癌前病变的免疫治疗和/或疫苗接种的吸引人的肿瘤特 异性抗原。事实上，其他小组已经显示用50μg/ml最佳剂量的E7-GST融 合蛋白以及Qiul A作为佐剂所免疫的小鼠被保护性地对抗了用HPV16 E7所转染的肿瘤细胞株的继发攻击(Fernando et al.，(1999)Clin.Exp. Immunol.115：397)。
进行这个试验以确定对小鼠的阉割是否能增强亚最佳剂量的HPV E7的疫苗接种(作为预防性疫苗)和/或免疫治疗(作为治疗性疫苗)的疗效。
材料和方法
成体(＞9个月)C57BL/6小鼠接受了皮下注射来源于经HPV-16E6和 E7及c-Ha-ras癌基因共转化的C57BL/6小鼠的初级上皮细胞的E7阳性 的同系E7+TC1肿瘤细胞。5天后，如上述的手术阉割小鼠，经阴囊切 口，显露睾丸，用缝线将其结扎，然后与外周脂肪组织一起去除。然后 用手术订关闭伤口。按上面的方法但不取出睾丸制备假阉割小鼠，并将 其作为阴性对照。在肿瘤攻击后7天，给阉割或假阉割小鼠注射亚最佳 剂量(5μg/ml)的E7GST融合蛋白。阳性对照接受了最佳剂量50μg/ml的 E7GST融合蛋白。25天后，分析小鼠的肿瘤(肉眼观察和肿瘤重量)以及 T细胞应答性(如上所述，利用标准的ELIspot法分析INFγ产量和利用 HPV16E7刺激的靶细胞经51Cr释放检测分析CTL裂解活性)。
结果
如图68所示，与假阉割的亚最佳剂量对照中所出现的47％(9/19)相 比较，仅仅22％(4/18)接受了亚最佳剂量E7GST的阉割小鼠具有肿瘤。 值得注意的是，受保护的接受亚最佳剂量E7GST疫苗的阉割小鼠的比例 (78％)与受保护的阳性对照的比例相当，阳性对照接受了高出10倍剂量 (最佳)的疫苗(3/4，75％)。所有的没有接受疫苗的阉割小鼠都有肿瘤。
如图69所示，与其他所有组相比较，接受亚最佳剂量E7GST的阉 割小鼠在皮内具有显著更高的细胞数目(图69A)(P≥0.01)。但是，与所测 试的其他所有组相比较，阉割的亚最佳E7GST组的脾内的活化 (CD25+)CD4+(图69B)和CD8+(图50C)T细胞的总数目保持了相同的数 目。
如图70A所示，接受亚最佳剂量GST-E7的阉割小鼠的脾细胞的非 特异的IFNγ产量与接受高出10倍剂量(最佳)的疫苗的阳性对照小组相 当。接受亚最佳剂量疫苗的假阉割小鼠具有中等水平的IFNγ产量，其中 阴性对照动物具有很少到没有脾细胞的非特异的IFNγ产物。这个数据与 在肿瘤发病率中所看到的平行(见图68)，说明脾细胞的IFNγ产量与这些 动物的肿瘤发病率直接平行。这是不奇怪的，假定Th1细胞所介导的应 答是主要作用于肿瘤保护。
如图70B所示，E7特异性产生的水平遵循着上述所讨论的关于非特 异性IFNγ产生的相同的趋势。虽然接受亚最佳GST-E7剂量的阉割小鼠 的E7特异性IFNγ产生的水平要稍低于接受高出10倍(最佳)剂量的疫苗 的阳性对照小鼠的水平，但是它仍高出在接受亚最佳剂量的假阉割小鼠 中所观察到的水平。再一次，阴性对照动物只有很少到没有E7特异性脾 细胞产生的IFNγ。
最后，分析了小鼠对HPV16E7所感染的靶细胞的E7特异性CTL杀 伤作用。如图71A所示，当与接受高出10倍(最佳)剂量的疫苗的阳性对 照小鼠比较时，接受亚最佳E7GST剂量的阉割小鼠具有相当水平的E7 特异性CTL。接受亚最佳剂量疫苗的假阉割小鼠具有中等水平的E7特异 性CTL应答，其中阴性对照只有很少到没有E7特异性CTL。这个数据 与在肿瘤发病率(见图49)和IFNγ产量(见图70)中所看到的数据平行。图 71B显示E7特异性CTL活性与肿瘤重量反向平行。也就是说，具有最 高水平的CTL活性的小鼠没有肿瘤，而有肿瘤的少数小鼠显示出具有较 弱的E7特异性CTL裂解活性。
结论
这些试验显示阉割能有效地增加患者的疫苗疗效。当与接受亚最佳 剂量疫苗的阉割小鼠比较时，在接受高出10倍(最佳)剂量的HPV16-E7 疫苗的未阉割小鼠中实现了相等的IFNγ产量、CTL活性和对肿瘤攻击的 保护。
可以进行相似的试验以确定阉割加上E7疫苗接种在免疫治疗的疫 苗接种方面的疗效。在这种情况中，将如上述的阉割小鼠。在阉割后6 周时给小鼠注射TCl细胞，并在1周后用GSTE7疫苗免疫小鼠。然后分 析小鼠的肿瘤(肉眼观察和肿瘤重量)以及T细胞应答性(如上所述，利用 标准的ELIspot法分析INFγ产量和利用加有HPV16E7的靶细胞经51Cr释放检测分析CTL裂解活性)。预期接受这个治疗性疫苗接种方案的小鼠 将具有比假阉割对照更少的肿瘤肿瘤。另外，预期阉割小鼠将比假阉割 的副本具有更小剂量的疫苗。
实施例37：其他的病毒疫苗接种策略
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他的 阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高各种本领域认可 的病毒疫苗的疗效。除了上面所提供的实施例外，非限制性的病毒疫苗 的实施例如下：
I.乙型肝炎病毒疫苗
病毒疫苗和重组DNA疫苗的一个实例是Glaxo Smith Kline(Engerix B_)、和Merck Sharpe和Dohme(HBVaxII_)分别开发的乙型肝炎病毒疫 苗。Engerix B_疫苗制剂是每1ml 20μg的剂量，按产品说明书给药。 HBVaxII_疫苗制剂是1ml 10μg/ml的剂量，按产品说明书给药。也可以 得到这些和其他疫苗的各种儿科剂型。这些疫苗可以或不可以含有防腐 剂例如硫柳汞(Australian Immunization Handbook，8th edition)。疫苗剂量 通常是在经肌肉内注射施与0.5ml到1ml的范围内。疫苗接种的一般疗程 可以不同，但通常包括单一的、初次免疫接种，之后是至少一次间隔近1 个月以上的强化免疫接种。
II.甲型肝炎病毒疫苗
灭活病毒疫苗的实例是那些Aventis Pasteur(Avaxim_)、Glaxo Smith Kline(Havrix 14400和Havrix Junior_)和其他所开发的用于治疗甲型肝 炎的疫苗。对于Avaxim_，每0.5ml剂量含有160ELISA单位的甲型肝 炎(GBM株)病毒抗原。对于Havrix 1440_，每0.5ml剂量含有1440ELISA 单位的甲型肝炎病毒(HM 175株)。这些单价疫苗的疫苗剂量是在经IM 注射的0.5ml到1ml的范围内。疫苗接种的一般疗程可以不同，但通常包 括在6个月间隔内的三次疫苗接种。
III.甲型肝炎和乙型肝炎多价疫苗
或者，可以使用多价疫苗，它含有超过一种的病毒抗原。例如，Glaxo Smith Kline的Twinrix_含有720ELISA单位的甲型肝炎病毒抗原和20μg 重组DNA乙型肝炎B表面抗原蛋白，在0、3和6个月时经肌肉注射给 药。另一种多价疫苗是Aventis Pasteur的Vivaxim_。每1ml剂量含有160 ELISA单位的灭活甲型肝炎病毒抗原和25μg纯化的伤寒荚膜多糖，经双 腔注射器提供，肌肉施与2个或3个剂量的该多价疫苗。
IV.巨细胞病毒疫苗
Vical公司已经开发出了一种抗CMV的免疫治疗性的基于DNA的疫 苗。按产品说明书中所提供的，按1或5mg三次剂量施与疫苗。DNA质 粒编码CMV磷蛋白65(pp65)和糖蛋白B(gB)，以及与Poloxamer一起制 成疫苗。
V.EBV疫苗
Medlmmune、GlaxoSmithKline、和Henogen已经共同开发了一种抗 EBV的可溶性重组亚基疫苗。已经用活的重组疫苗载体表达EBV gp220/350，并已经显示赋予了灵长类和EBV阴性婴儿的保护作用。另外， 已经在澳大利亚进行了对EBNA-3A肽的临床试验(对于这种病毒疫苗和 其他疫苗的综述，见例如THEJORDAN REPORT 2000：ACCELERATED DEVELOPMENT OF VACCINES，published by the Division of Microbiology and Infectious Diseases，National Institute of Allergy and Infectious Diseases，National Institutes of Health(可在 http://www.niaid.nih.gov/publications/pdf/Jordan.pdf-last visited Apr.2004获 得))。
实施例38：其他的癌症疫苗策略
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他的 阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高各种本领域认可 的癌症疫苗的疗效。除了上面所提供的实施例外，非限制性的癌症疫苗 的实施例如下：
I.黑素瘤疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高黑素瘤疫苗的 疗效。这样的黑素瘤疫苗的一个实例是AVAX公司(Philadelphia，PA)所开 发出的自体黑素瘤细胞疫苗。切除转移癌，保持在4℃，并在切除的48h 内运送到实验室。通过胶原酶和DNA酶的酶性分离提取肿瘤细胞，分装 并在可控速的冷冻箱中冷冻，和含有人白蛋白及10％二甲基亚砜的培养 基一起储存在液氮中直到需要时。在治疗患者的当天，融化一部分细胞， 洗涤并经2500cGy照射。然后洗涤肿瘤细胞，并与二硝基氟苯孵育30分 钟，然后用盐水洗涤(Miller et al.(1976)J.Immunol 117：1519)。在洗涤之 后，计数细胞并重悬在0.2ml含有人白蛋白的Hanks溶液中，并保持于4℃ 直到给药。
疫苗剂量是在0.5-25.0×106个细胞的范围内。正在注射之前，可以往 疫苗中加入0.1ml BCG(Tice，Organon Teknika，Durham，N.C.)。可以逐步 减弱BCG剂量，以产生包括无溃疡的炎性丘疹的局灶反应。将混和物皮 内注射到一个或多个部位，例如上臂。在不同的时间段内(例如每月一次 共12个月，或每周一次共6-12周)进行多个剂量疫苗接种，以及可以包 括施与低剂量(300mg/m2)的环磷酰胺，当在与免疫接种相关的合适时间给 予时，环磷酰胺能似非而是地增加细胞介导的免疫力。
II.肺癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高肺癌疫苗的 疗效。这样的肺癌疫苗的一个实例是Corixa公司的非小细胞肺癌的DNA 疫苗。疫苗是一种与重组腺病毒佐剂一起施与的重组DNA疫苗。 ABiojector_设备(Bioject，Tualatin，OR)被用于疫苗给药，它是一种可重复 使用的压缩CO2筒供能的无针头注射器。
本发明的方法可以使用的其他非限制性的肺癌疫苗包括用于非小细 胞肺癌的L523S(Wang et al.(2003)Br.J.Cancer 88：887)和用于小细胞肺 癌的BEC-2、GM2、Globo H、fucosyl GM1、和聚硅酸(Krug(2004)Sem. Oncol.31：112)。
III.前列腺癌
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高前列腺癌疫 苗的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是Provenge_ (Dendreon Corp.)，它是一种用于雄激素非依赖性前列腺癌的疫苗。这种 疫苗造成了对前列腺癌的与抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)相关的T细胞免 疫应答的形成。经白细胞分离术从患者中得到DC前体细胞，并用细胞 分离设备将其与其他白细胞分开。然后将这些细胞与重组的PAP融合的 输送盒共培养约36个小时，以容许DC成熟。然后成熟的DC被用于疫 苗。在两周的间隔内，30分钟静脉内输注转运Provenge疫苗。用于本发 明的其他侯选的前列腺癌疫苗在本领域是已知的(见，例如Shaffer and Scher(2003)Lancet Ocol.4：407)。
IV.结直肠癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高结直肠癌疫 苗的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是TrovaxTM(Oxford BioMedica)。该疫苗是一种经肌肉内注射通过修饰的痘苗病毒Ankara (MVA)所运送的实体瘤相关抗原5T4。在0、4和8周与化疗同时给予疫 苗。用于结直肠癌患者的其他细胞毒性T淋巴细胞前体导向的肽疫苗在 本领域是已知的(见，例如Sato et al.(2004)Br.J.Cancer 90：1334)。
V.卵巢癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高卵巢癌疫苗 的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是用于治疗转移性卵巢 癌的M-FP(CancerVac Pty.Ltd.)。它是一种自体发生的细胞疫苗，其中皮 下注射DC。将重组的MUC1融合到甘露聚糖中以促进患者的纯化树突 状前体细胞对抗原的摄取。然后给患者皮下注射呈递MUC1肽的活化 DC。
实施例39：阉割对胸腺切除小鼠的BM和脾的作用
进行这些预试验是为了确定阉割作用在胸腺切除的患者(小鼠)中 是否是明显的。结果说明对性类固醇信号途径的阻断对免疫系统(例如 BM和胸腺内的免疫细胞)具有直接或间接的作用，无论是否存在再活化 的胸腺。
材料和方法
利用本领域已知的常规方法将小鼠阉割和胸腺切除。小鼠被分到下 面的组中：未治疗(即天然的、“未治疗的”)、假阉割(“sham-cx”)、 和阉割(“cx”)，以及这三组的每一组都被胸腺切除(“tx”)或假胸腺 切除(“shtx”)，总共有6个被分析的组。在骨髓清除和BMT(见上面的 方法)后2周和4周时，分析6组中的每一组。
结果
I.胸腺切除没有影响性类固醇抑制对BM的作用
如图72A所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有数目增加的BM 普通淋巴祖细胞(CLP)，该数目与ShTx/Cx小鼠的相当。
如图72B所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有总数目增加的 BM B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有数目增加的BM B细 胞。
如图72C所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也具有总数目增加的 BM未成熟B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或 ShamCx/ShTx对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有数目增 加的BM未成熟B细胞。
因此，图72A-C的结果支持这样的结论，就是阉割对增加BM细胞 的数目和功能性包括增加植入的作用不需要再活化的胸腺，取而代之的 是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
II.胸腺切除不影响性类固醇抑制对脾的作用
如图72D所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出具有脾的细 胞总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。当与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照小鼠比较时，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠也具有增加了总数目的脾 细胞。
如图72E所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出脾的B细胞 总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠也具有数目增加的脾的B细胞。
因此，图72D-E的结果支持这样的结论，就是阉割对增加脾的免疫 细胞的数目和功能性包括增强重建的作用不需要再活化的胸腺，取而代 之的是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
在此一同并入参考在上面说明书中所提及的所有文献。只要不脱离 发明的范围和精神，对所述的本发明的方法和系统的各种修饰和变异对 于本领域人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选的实施方式描述了 发明，但应当明白所要求的发明不应当被过度地限制于这些特殊的实施 方式。事实上，对生物学或相关领域的人员显而易见的是对所述的实施 发明的方式的各种修饰都在下面的权利要求书的范围内。
本领域人员利用常规试验将认识到、或能确定出多种与在此所特异 描述的特异的实施方式相等价的实施方案。这些等价方案包含在下面的 权利要求书的范围内。
本发明包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活化 的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加BM功 能性的方法。“增加BM功能”和“增强BM功能性”在此被定义为BM 的免疫细胞包括前体细胞例如HSC(以及因此增加了血细胞)的产量和/ 或输出的提高，包括造血作用的提高和/或HSCT后植入的增强。输出的 提高可以包括但不限于，提高的动员免疫细胞包括HSC到外周或到靶组 织特别是免疫或受损组织)的能力。在一个实施方式中，提高了HSC的 造血作用。在另一个实施方式中，提高了HSC的输出。在特定的实施方 式中，增加了血和/或免疫细胞的数目。仍在另一个实施方式中，提高了 HSCT后的HSC的植入。在另一个实施方式中，提高了HSC动员到外周 或入巢到靶组织。仍在另一个实施方式中，提高了增殖能力和/或分化为 造血或非造血的子代的能力。
本发明也包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活 化的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加T细 胞和其他免疫细胞的能力的方法。术语“免疫细胞”和“免疫系统的细 胞”在此可被互换使用，并在此被定义为HSC、T细胞、B细胞、DC、 和/或其他血细胞，包括但不限于HSC子代、CLP、MLP、淋巴细胞、髓 细胞、中性粒细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK、NKT、 血小板、红细胞、单核细胞、巨噬细胞、原初T细胞、和上面所提及的 前体细胞。细胞可以是或可以不是外周的，可在BM、血液、脾、淋巴结、 胸腺、粘膜、皮肤或其他组织的任何一或多种组织中发现这些细胞。
免疫细胞的“增加的功能性”或“增强的功能性”是指当与没有性 类固醇去除所通常预期的免疫应答比较时，免疫细胞能提供更多的所需 的免疫应答。在一种情况中，免疫细胞是T细胞。在其他实例中，免疫 细胞是B细胞、DC和/或HSC。“增加的功能性”包括但不限于提高的对 靶细胞的杀伤、增加的淋巴细胞增殖应答、提高的信号转导能力、提高 的入巢能力、提高的APC活化、增加的受体、细胞粘附分子或共刺激分 子的水平或活性、减低的凋亡、增加的细胞因子、白介素和其他生长因 子的释放、增加的血浆的抗体水平以及增加的血液和全身的天然免疫力 (例如自然杀伤(NK)细胞、DC、中性粒细胞、巨噬细胞等)的水平。每 一种都可以直接或间接地有助于抗击疾病和感染，据此增加对例如各种 外来病原体的感染的应答性、抗性、治疗和预防，以及增加对疫苗的免 疫应答。
本发明还包括用于预防患者的病变或疾病、减少患者的病变或疾病 的危险或治疗患者的病变或疾病的方法。在一个具体实施方案中，疾病 是T细胞疾病。在另一个具体实施方案中，疾病是一种自身免疫性疾病 或过敏。另外，本说明书还提供了用于通过阻断性类固醇介导的信号途 径以及引起胸腺再活化提高患者对疫苗抗原(例如一种病因的疫苗抗原) 的免疫应答的方法。在两种情况中，都可以提高并都可以通过定量地和 定性地恢复外周T细胞池特别是在原初T细胞的水平上实现外周T细胞 的功能状态。然后这些原初T细胞能以更大的程度应答于所存在的外来 抗原。
如上所述，衰老(青春期后)的胸腺造成身体的免疫细胞以低于峰值 水平(例如可见于年轻的、青春期前胸腺)的水平工作。“青春期后”在 此被定义为胸腺已经达到明显萎缩的时期。在人类，这发生在约20-25 岁，但在一个给定的个体中，这可以发生得更早或更晚。“青春期”在此 被定义为期间胸腺开始萎缩的时期，但可以是在胸腺完全萎缩之前。在 人类，这发生开始于10-20岁，但在一个所给定的个体中，这可以发生得 更早或更晚。“青春期前”在此被定义为先于个体中的性类固醇增加的时 期。在人类，这发生在约0-10岁，但在一个所给定的个体中，这可以发 生得更早或更晚。
术语“接种”、“疫苗接种”、“疫苗”、“免疫”、“免疫接种”在此定 义为给患者施用一种引发对抗原的免疫应答的制剂。疫苗可以包括预防 性和治疗性疫苗。如本领域人员所理解的那样，例如病毒或其他病原体 的感染也是一种接种个体的方法。
术语“提高”、“增强”或“增加”患者的“疫苗应答”或“疫苗应 答性”或“提高”、“增强”或“增加”“患者对疫苗的免疫应答性”以及 其他的相似的语句都可以互换使用，并在此被定义为意味着与在没有阻 断性类固醇信号途径的患者中已经发生的免疫应答比较，患者对疫苗或 疫苗抗原的免疫应答被提高了。
“病变”和“疾病”可互换使用并在此被定义为其中免疫应答、防 御或经修饰的免疫细胞将对患者是有益的任何疾病、感染或医学病变(有 症状的或无症状的)。病变可以由感染性病因、癌症、药物治疗(例如化疗)、 照射、化学中毒、遗传缺陷或其他病症所造成的。
如在此所定义的，疾病的“预防”或“预防”疾病在此被定义为完 全和部分的保护，包括但不限定于患者将会发生的临床症状的严重度的 减轻。具有提高了的或修饰了的免疫系统的个体将会减少死于或患有肿 瘤或癌症、过敏、自身免疫性疾病、传染性感染(例如，病毒、细菌、真 菌或寄生虫)或病变的可能性，和/或将表现出对疫苗接种的更好的应答 (例如增加了对疫苗或抗原特异性抗体(Ab)的水平以及效应T细胞的发 生)。通过激活或修饰免疫防御机制以抑制或减少临床症状的发生例如达 到仅仅需要减少了的或最少医学治疗的程度即可以预防病变。预防感染 也包括机体防御感染性病因例如病毒、细菌、寄生虫、真菌等或防御非 感染性病因。这可以有预防这些病因进入身体内的细胞和/或广泛的免疫 系统的细胞(例如NK、DC、巨噬细胞、中性粒细胞等)有效地清除病因的 形式。在一些情况中，没有实现对病变的完全预防，取而代之的是实现 了部分预防，其中更强的、更有力的或更有效的免疫系统将有助于机体 减少病变的程度、严重度和持续时间或病变的临床症状或恢复时间或延 迟临床症状的出现。
病变的“治疗”包括完全地或部分地减轻患者的病变的症状，当与 没有性类固醇去除或阻断性类固醇介导的信号途径的患者将会发生的那 些症状比较时。通过激活免疫防御机制以抑制、延迟或减少临床症状的 发生，可以发生对病变的治疗。在一个实例中，患者已经接触了病因或 有接触病因的高危。
已经提高了对新的(预防)或已有的(治疗)病变的应答、更好地应答或 克服的能力包括提高机体的免疫系统，这包括增加BM细胞和/或胸腺来 源的因子的数目和/或功能性，和/或增加免疫细胞的数目和功能性。免疫 系统的活化也增加了能应答于相关病因的抗原的淋巴细胞的数目，这导 致了抗原和/或外来病因的消除(完全或部分)，形成了宿主被治疗或耐受 感染或疾病的状态。具有提高了的或修饰了的免疫系统的个体将会减少 死于或患有肿瘤或癌症、过敏、自身免疫性疾病、传染性感染(例如，病 毒、细菌、真菌或寄生虫)或病变的可能性，和/或将表现出对疫苗接种的 更好的应答(例如增加了对疫苗或抗原特异性抗体(Ab)的水平以及效应T 细胞的发育)。
年老小鼠对人单纯疱疹病毒感染的显著提高举例说明了这种免疫防 御的增加(见实施例3，和图13-17)。阉割的年老小鼠最初显示出淋巴细 胞对引流淋巴结的浸润的明显增多。这种浸润是免疫应答的第一步，并 且通常是增加抗原特异性淋巴细胞与抗原接触的可能性所必需的。下一 步是抗原对淋巴细胞的活化及Ab和/或CTL的发育以及淋巴细胞的细胞 因子的释放，所有的这些联合在一起消灭病因。
“感染性病因”、“外来病因”和“病因”可被互换使用，并包括个 体的疾病或病变的任何原因。病因包括但不限定于病毒、细菌、真菌、 寄生虫、朊病毒、癌症、癌前细胞、化学或生物学毒素、过敏原、诱发 哮喘的病因、造成自身免疫性疾病的自身蛋白和抗原等等。
在一种情况中，病因是一种病毒、细菌、真菌或寄生虫，例如来自 人乳头状瘤病毒(HPV)的包膜蛋白，它可引起子宫颈癌；或流感肽(例如 血凝素(HA)、核蛋白(NP)或神经氨酸苷酶。
感染性病毒的非限制性的实例包括：逆转录病毒(例如，人类免疫缺 陷病毒，如HIV-1(也被叫做HTLV-E、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III) 和其他分离物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、 A型肝炎病毒、肠病毒、人柯莎奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；Calciviridae (例如引起胃肠炎的病毒株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)； 黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例 如冠状病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒)；弹状病毒科(例如疱疹 性口炎病毒、狂犬病病毒)、纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科 (例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)； 正粘病毒科(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如汉坦病毒、bunga病毒、 白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例 如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒 科(例如B型肝炎病毒)；微小病毒科(微小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科 (乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(绝大多数腺病毒)；疱疹病毒科(例 如单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、 疱疹病毒)；痘病毒科(例如，类天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩 病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分型的病毒(例如海绵状脑病的致病 病因、丁型病毒性肝炎的病因(认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的随体)、 非甲非乙型病毒性肝炎的病因(1型＝内传播的；2型＝非肠内传播的(即丙 型病毒性肝炎)、诺沃克和相关病毒、及星状病毒)。
感染性细菌的非限制性实例包括：幽门螺旋杆菌、伯氏螺旋体、肺 炎军团菌、分枝杆菌子孢子(sporozoites)(例如，结核分枝杆菌、鸟型分枝 杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌)、金黄色葡萄 球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性 链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪 链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌属)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌、 肠球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆菌子孢子、 猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、 肺炎克雷伯杆菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链 杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、钩端螺旋体、和衣氏放线菌 (Actinomyces israelli)。
感染性真菌的非限制性实例包括：新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、 粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌。
其他感染性有机体(即原生生物)包括但不限定于恶性疟原虫和鼠弓 形体。
在其他具体实施方案中，病因是一种过敏原。过敏性病变包括但不 限定于湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、花粉热、风疹(荨麻疹)、和食物过敏以 及其他的特应性病变。
仍在另一个具体实施方案中，病因是一种癌症或肿瘤。癌症或肿瘤 可以是恶性的或非恶性的。在此所用的肿瘤或癌症包括例如，脑部、肺 部(例如小细胞的和非小细胞的)和胸膜、妇科、泌尿生殖道和内分泌细胞 (例如子宫颈、子宫、内膜、膀胱、肾脏、卵巢、乳腺和/或前列腺)、胃 肠道(例如，肛门、胆道、类癌、胆囊、胃的或胃、肝、食道、胰腺、直 肠、小肠和/或结肠)、以及其他的癌、和骨、皮肤和结缔组织(例如，黑 素瘤和/或肉瘤)、和/或血液系统(例如，血液、骨髓增生异常综合征、骨 髓增生性疾病、浆细胞肿瘤、淋巴瘤和/或白血病)的肿瘤。
本发明可被用于任何具有性类固醇驱动的成熟和免疫系统的动物物 种(包括人)，例如哺乳动物和有袋类动物。在一些实例中，发明被用于 大型哺乳动物例如人。
术语胸腺“再生”、“再活化”和“重建”以及它们的衍生物在此可 以互换使用，以及在此被定义为萎缩的或受损的(例如被化学物、照射、 移植物抗宿主病、感染、遗传倾向)胸腺恢复到它的活化状态。“活化状 态”在此被定义为意思是其中性类固醇激素介导的信号途径已经被阻断 的患者的胸腺所完成的T细胞输出是青春期前胸腺(没有到达青春期的 患者的胸腺)的输出的至少10％、或至少20％、或至少40％、或至少60％、 或至少80％、或至少90％。
“受者”、“患者”和“宿主”在此可被互换使用，以及在此被定义 为接受性类固醇去除治疗和/或阻断性类固醇介导的信号途径的治疗的对 象，在适当的时候，为接受了HSC移植的对象。“供者”在此被定义为 移植的来源，它可以是同基因的、异基因的或异种的。在一些情况中， 患者可以提供用于在晚些的时间点上被移植到患者内的例如他的或她的 自体细胞。可以使用异基因SHC移植物，以及这些异基因移植物是发生 在同一物种的不匹配成员之间的移植物，而在异种HSC移植物中，供者 和受者是不同物种的。也可以使用匹配动物之间的同基因HSC移植物。 参照于HSC移植物的术语“匹配的”、“不匹配的”、“错配的”和“不完 全一致的”在此被定义为供者和受者的MHC和/或次要组织相容性标记 物是相同的(匹配的)或不是(不匹配的、错配的和不完全一致的)相同 的。
在本说明书的全文中，术语“包括”和“包含”将被理解为意思是 包含所述的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组，但不排 除其他任何的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组。
性类固醇介导的信号途径的阻断
本发明还提供了阻断患者的性类固醇介导的信号途径的方法，其中 患者的胸腺随后可以被或不被再活化。另外，本发明提供了提高患者的 免疫细胞(例如T细胞)的功能状态的方法。就T细胞而言，胸腺开始 增加早期前体细胞(CD3-CD4-CD8-细胞)的增殖速度并将它们转化为 CD4+CD8+以及随后的新的成熟的CD3hiCD4+CD8-(T辅助(Th)淋巴细 胞)或CD3hiCD4-CD8+(细胞毒T淋巴细胞(CTL))。复活的胸腺也增加 了其对血流中的HSC、或其他干细胞或能形成T细胞的前体细胞的摄取， 并将它们转化为新的T细胞和胸腺内DC。所增加的胸腺的活性在很多方 面都类似于在正常的更年轻的胸腺(例如青春期前)中所发现的活性。这 种更新的胸腺输出的结果增加了血液中的原初T细胞(那些还没有遇到 过抗原的T细胞)的水平。这也增加了外周T细胞对刺激例如通过与抗 CD28Ab的交联、或通过用例如抗CD3抗体的TCR刺激、或有丝分裂 原例如美洲商陆有丝分裂原(PWM)的刺激的应答的能力，并且这种增 加的T细胞应答性可以发生在胸腺再活化之前，例如2、3、4、5、6、7、 14或21天内。这种事件的组合物造成机体变得能更好地防御感染和其他 的免疫系统的攻击(例如癌症)，或从免疫系统攻击中恢复(例如，变得能 更好地从化疗和放疗中恢复)。因此，本发明的方法可以被用于预防或治 疗病变或疾病，增加患者对疫苗的免疫应答性以及任选用于基因治疗。
如在此所用的，“性类固醇清除”、“性类固醇介导的信号途径的抑 制”、“性类固醇阻断”、性类固醇信号途径的中断”和其他相似的术语在 此被定义为至少部分阻断性类固醇(和/或其他激素的)的产生和/或性类 固醇(和/或其他激素的)信号途径，无论是直接或间接的作用。在一个 实施方式中，中断了到胸腺的性类固醇信号途径。容易理解的是，用本 领域人员熟知的各种方法可以阻断性类固醇介导的信号途径，在此描述 了一些方法。例如，对性激素产生的抑制或阻断一或多种性激素受体将 达到所需的阻断，如施与性类固醇激动剂和/或激动剂，或主动的(抗原) 或被动的(抗体)抗性类固醇接种。
一种非限制性的用于形成性类固醇介导的信号途径的阻断的方法是 通过阉割。用于阉割的方法包括但不限于化学阉割和手术阉割。
“阉割”在此被定义为性类固醇产生、活性和/或体内的分布的减少 或消除。这最终有效地将患者恢复到青春期前状态，此时胸腺比阉割前 即刻是更为有功能的。手术阉割去除了患者的性腺。用于手术阉割的方 法对于受常规训练的兽医和医生都是熟知的。在下面的实施例中描述了 用于阉割雄性动物的一种非限制性的方法。其他用于阉割人类患者的非 限制性的方法包括子宫切除术或卵巢切除术操作(阉割女性)和手术阉 割去除睾丸(阉割男性)。在一些临床病例中，经物理阉割永久地去除性 腺可能是合适的。
化学阉割是一种较不永久的阉割形式。如在此所定义的，“化学阉割” 是施与一种化学物一段时间，造成了性类固醇产生、作用和/体内分布的 减少或消除。多种化学物能以这种方式发挥作用。这些化学物的非限制 性实例是性类固醇抑制物和/或下面所描述的类似物。在给予化学物期间 和在给予一段时间之后，患者的激素产生可以被停止或减少。终止化学 物的给予或通过给予相关的性激素可以逆转阉割。
术语“性类固醇类似物”、“性类固醇清除剂”、“性类固醇抑制剂”、 “性类固醇信号途径的抑制剂”、“性类固醇信号途径的修饰剂”和其他 相似的术语在此被定义为任何一或多种能减少、阻断、预防或终止性类 固醇(和/或其他激素)介导的信号途径的药用试剂。GnRH(在此也被叫 做LHRH或GnRH/LHRH)和它们的类似物是在本申请书的全文中所用 的性类固醇信号途径的抑制剂的非限制性的实例。然而，本领域人员容 易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可以用多种替代的性类固醇 抑制剂或类似物中(或其他阻断剂或物理阉割)的任何一种(或多种)替 代在此所描述的GnRH/LKRH或它们的类似物，而不需要过多的试验。
任何可以阻断性类固醇或阻断性类固醇介导的信号途径的药物或其 他的阉割方法都可以被用于本发明的方法。例如，抑制性类固醇信号途 径、再活化胸腺和/或增强BM和免疫细胞的功能性的一个非限制性方法 是通过修饰GnRH对垂体的正常作用(即释放促性腺激素，FSH和LH) 并最终减少性腺产生或释放正常的性类固醇。因此，在一种情况中，性 类固醇清除是通过施与一或多种性激素类似物例如GnRH类似物实现的。 GnRH是一种刺激垂体分泌促性性腺激素，促黄体激素(LH)和促卵泡激 素(FSH)的下丘脑的十肽。因此，GnRH激动剂(例如Synarel_或 Lupron_的形式)最初造成受体的过度刺激并经反馈机制通过LHRH受 体的失敏将抑制垂体生成FSH和LH。这些促性腺激素正常地作用于性 腺以释放性类固醇，特别是女性的雌激素和男性的睾酮，FSH和LH的 缺失显著地减少了这些性激素的释放。它的直接结果是性类固醇的血浆 水平的下降以及因此对胸腺的抑制信号的逐步释放。例如通过使用GnRH 拮抗剂可以实现循环的性类固醇水平的更快速的下降。
在一些实施方式中，通过施与性类固醇类似物例如促黄体激素释放 激素(LHRH)的类似物阻断了性类固醇介导的信号途径。性类固醇类似 物和它们在治疗及化学阉割中的应用是熟知的。性类固醇类似物是产品 化的以及它们在治疗和化学阉割上的应用是熟知的。这些类似物包括但 不限于，下面的LHRH受体(LHRH-R)的激动剂：布舍瑞林(例如醋酸 布舍瑞林，商品名Suprefact_(例如0.5-02mg/天，皮下用)，Suprefact Depot_、和Suprefact_喷鼻剂(例如2μg/鼻孔，每8小时)，Hoechst，也 被描述于美国No.4,003,884、4,118,483和4,275,001)、Cystorelin_(例如 双乙酸促性腺激素四水化合物，Hoechst)、地洛瑞林(例如，醋酸地洛瑞 林，Deslorell_，Balance Pharmaceuticals)、戈那瑞林(例如，盐酸戈那瑞 林，商品名Factrel_(100μg静脉或皮下用)，Ayerst Laboratories)、戈舍瑞 林(醋酸戈舍瑞林，商品名Zoladex_，AstraZeneca，Aukland，NZ，也被 描述于描述于美国No.4,100,274和4,128,638、GB 9112859和GB 9112825)、组氨瑞林(例如，醋酸组氨瑞林，Supprelin_(皮下10μg/kg/d)， Ortho，也被描述于EP 217659)、亮丙瑞林(leuprolide)(亮丙利德，商品 名Lupron_，或Lupron Depot_，Abbott/TAP，Lake Forest，IL，也被描 述于美国No.4,490,291、3,972,859、4,008,209、4,992,421、和4,005,063、 DE 2509783)、亮丙瑞林(leuprorelin)(例如，亮丙利德，商品名Prostap SR_(例如，每月单次剂量3.75mg皮下或肌注)、Prostap3_(例如每3个 月单次剂量11.25mg皮下)，Wyeth，USA，也被描述于Plosker et al.，(1994) Drugs 48：930)、黄体瑞林(Wyeth，USA，也被描述于美国No.4,089,946)、 美替瑞林_(例如，Avorelina(10-15mg缓释剂型)，也被描述于EP 23904 和WO 91/18016)、那法瑞麟(例如，商品名Synarel_(i.n.200-1800μg/d)， Syntex，也被描述于美国No.4,234,571、WO 93/15722、和EP 52510)、以 及曲普瑞林(例如，扑酸曲普瑞林，商品名Trelstar LA_(3个月内 11.25mg)、Trelstar LA Debioclip_(预先填充的，单次剂量给予)、LA Trelstar Depot_(1个月内3.75mg)、和Decapeptyl_，Debiopharm S.A.，Switzerland， 也被描述于美国No.4,010,125、4,018,726、4,024,121、和5,258,492、EP 364819)。LHRH类似物也包括但不限于下面的LHRH-R的拮抗剂：阿巴 瑞克(商品名PlenaxisTM(例如，在第1、15和29天肌注100mg，之后每 4周肌注100mg)，Praecis Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，MA)和西 曲瑞克(例如，醋酸西曲瑞克，商品名CetrotideTM(例如，皮下0.25或 3mg)，Zentaris，Frankfurt，Germany)。另外的性类固醇类似物包括Eulexin_ (例如，氟他胺(例如，2个胶囊，每天2次，总量750mg/d)，Schering-Plough Corp.，也被描述于FR 7923545、WO 86/01105和PT 100899)、以及二噁 烷衍生物(例如，在EP413209中所描述的)、以及例如在EP 181236、美 国No.4,608,251、4,656,247、4,642,332、4,010,149、3,992,365、和4,010,149 中所描述的其他LHRH类似物。也包括激动剂的组合、拮抗剂的组合、 以及激动剂和拮抗剂的组合。本发明的一种非限制性的类似物是地洛瑞 林(美国No.4,218,439所描述的)。对于类似物的更广泛的列表，见Vickery et al.(1984)LHRH AND ITS ANALOGS：CONTRACEPTIVE& THERAPEUTIC APPLICATIONS(Vickery etal.，eds.)MTP Press Ltd.， Lancaster，PA。也可以使用每种类似物的修饰形式，例如它的醋酸、柠 檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟知的。
性类固醇清除药物的给药的一个非限制性的实例是皮下/皮内注射 GnRH激动剂的“缓释的”储存剂(depot)(例如，1、3或4个月的Lupron_ 注射剂)或皮下/皮内注射“缓释的”含GnRH的植入物(例如，1或3 个月的Zoladex_，例如3.6mg或10.8mg植入物)。根据合适的剂型，也 可以肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)或口服给予这些药物。另一个实例是通 过皮下注射含有约30mg Lupron_(例如，Lupron Depot_(亮丙利德的储 存悬浮液)，TAP Pharmaceuticals Products，Inc.，Lake Forest，IL)的“储 存剂”或“浸透性植入物”。30mg Lupron_足以清除性类固醇4个月以容 许胸腺恢复并往血流内输出新的原初T细胞。
在此所描述的许多移植性类固醇信号途径的机制是熟知的，以及其 中的一些药物特别是GnRH激动剂已经被用于治疗生殖器官疾病例如一 些激素敏感性癌症包括乳腺癌和前列腺癌、子宫内膜异位症、生殖疾病、 多毛症、早熟、性变异以及控制生育很多年。
在某些实例中，性类固醇清除和/或性类固醇介导的信号途径的中断 或阻断最终再活化了患者的胸腺。在一些情况中，阻断逆转了患者的激 素状态。根据本发明的方法，受者的激素状态被逆转了，使得受者的激 素状态接近青春期前水平。通过降低受者的性类固醇激素的水平，降低 了这些激素对胸腺的信号途径，据此容许再活化胸腺。患者可以是青春 期的或青春期后的，或患者有过(或曾有过)至少部分萎缩胸腺的疾病。 同样的，患者有过(或曾有过)疾病的治疗，其中对疾病的治疗至少部分 导致患者胸腺萎缩。这些治疗可以是抗病毒的、免疫抑制、化疗和/或放 射治疗。在其他的实施方式中，患者是绝经的或已经采取其他方式例如 外伤、药物等所减少了性类固醇(或其他激素水平)。
性类固醇清除或对性类固醇介导的信号途径的阻断对BM和/或免疫 系统的细胞具有一或多种直接作用，其中提高了功能性。这些作用可以 在胸腺再活化之前或与之同时发生。
在一些实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其 他的阉割方法施与一种抗雄激素例如雄激素阻断剂(例如，比卡鲁胺，商 品名Cosudex_或Casodex_，例如5-500mg，例如50mg口服QID， AstraZeneca，Aukland，NZ)实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的 抑制。也可以通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其他的阉割方 法施与醋酸环丙氯地孕酮(商品名，Androcor_，Shering AG，Germany， 例如10-1000mg，100mg bd或tds，或每周IM 300mg)、作用为孕酮的醋 酸17-羟孕酮实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。可以使用 其他的抗雄激素(例如，咪唑类的抗真菌药物，例如利阿唑(Liazol_， 例如，150mg/天，一种芳香酶抑制剂)和酮康唑、氟他胺(商品名Euflex_ 和Eulexin_，Shering Plough Corp，N.J，例如250或750mg口服QID)、 醋酸甲地孕酮(Megace_，例如480-840mg/天，或尼鲁米特(商品名 Anandron_和Nilandron_，Roussel，France，例如150-300mg/天)。抗雄 激素在治疗上经常是重要的，因为它们通常被用于缓解GnRH类似物所 造成的短期增强作用。一些抗雄激素通过抑制雄激素受体的移位发挥作 用，这干扰了负反馈，造成了睾酮水平的增加和性欲/能力的最小缺失。 用于本发明的另一种类型的抗雄激素是选择性雄激素受体调节物 (SARMs)(例如，喹啉衍生物、比卡鲁胺(商品名Cosudex_或Casodex_， 同上)、和氟他胺(商品名Eulexin_，例如口服250mg/天))。其他熟知的 抗雄激素包括5α还原酶抑制剂(例如，度他雄胺(例如，口服0.5mg/天)， 它抑制了两种5α还原酶同功酶并造成更多和更快的DHT抑制；非那雄 胺(商品名Proscar_，0.5-500mg，例如每天口服5mg)，它抑制了5α还 原酶2并最终抑制DHT的产生，但是对睾酮或LH水平只有很小的或没 有作用)。
在其他的实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何 其他的阉割方法施与抗雌激素实现类固醇耗竭或对性类固醇介导的信号 途径的抑制。一些抗雌激素(例如，阿那曲唑(商品名Arimidex_、和氟 维司群(商品名Faslodex_，10-1000mg，例如每月250mg IM)通过以类 似于雌二醇的高亲和力与雌激素受体(ER)结合发挥作用，并最终抑制 了雌激素与受体的结合。Faslodex_的结合也靶向于受体的构象变化以及 下调雌激素受体，而FSH或LH水平没有显著变化。抗雌激素的其他非 限制性的实例是他莫昔芬(商品名Nolvadex_)；氯米芬(商品名 Clomid_)，例如50-250mg/天，一种具有混和的激动剂/拮抗剂性能的非 类固醇的ER配体，它刺激了促性腺激素的释放；己烯雌酚(商品名 Stilphostrol_)，例如1-3mg/天，它显示出与雌酮相似的但更强的雌激素活 性，因此它被认为是一种雌激素激动剂，但它可与雄激素和雌激素受体 结合以诱导对垂体的FSH和LH产生的反馈抑制，己烯雌酚二磷酸盐例 如50到200mg/天；以及达那唑、屈洛昔芬和Iodoxyfene，每一种都作用 为拮抗剂。可以单独或联合其他的阉割方法使用的另一类抗雌激素是选 择性雌激素受体调节物(SERMs)(例如，托瑞米芬(商品名Fareston_， 5-1000mg，例如60mg口服QID)、Raloxofene(商品名Evista_)、和他莫 昔芬(商品名Nolvadex_，1-1000mg，例如20mg口服bd)，它作用为骨 和心血管系统的雌激素受体的激动剂以及乳腺的雌激素受体的拮抗剂)。 雌激素受体下调物(ERD)(例如他莫昔芬(商品名Nolvadex_))也可被 用于本发明。
可以单独地或联合其他的阉割方法使用的抑制性类固醇信号途径的 方法的其他非限制性的实例包括芳香酶抑制剂和其他的性腺阻断剂(例 如，氨鲁米特、福美坦、vorazole、依西美坦、阿那曲唑((商品名Arimidex_； 0.1-100mg，例如1mg口服QID)，它降低了雌二醇并增加了LH和睾酮)、 来曲唑(商品名Femarat_，例如2.5mg口服QID)、和依西美坦(商品名 Aromasin_，1-2000mg，例如25mg/天)；醛固酮拮抗剂(例如，螺内酯(商 品名Aldactone_)，例如100到400mg/天)，它作用为阻断雄激素细胞色 素P-450受体)；和依普利酮，一种选择性醛固酮受体拮抗剂)；抗孕激素 (例如醋酸甲羟孕酮，例如5mg/天，它抑制了睾酮合成和LH合成)；以及 黄体酮和抗黄体酮例如选择性黄体酮应答调节物(SPRM)(例如，醋酸甲 地孕酮，例如160mg/天，米非司酮(RU486，Mifeprex_，例如200mg/ 天)；以及其他的具有雌激素/抗雌激素活性的化合物(例如，植物雌激素、 黄酮、异黄酮和coumestan衍生物、木脂素和具有酚环的工业化学物(例 如DDT)。也可以使用抗GnRH疫苗(见，例如Hsu et al.，(2000)Cancer Res. 60：3701；Talwar，(1999)Immunol.Rev.171：173-92)或其他任何的能模拟 上述药物所产生的作用的药品。另外，也可以发展并使用基于类固醇受 体的调节物，它可以被靶向于胸腺和/或BM特异的。这些抑制性类固醇 信号途径的机制中的多种机制都是熟知的。也可以使用每种药物的修饰 形式，例如它们的醋酸、柠檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟 知的。
因为激素系统的复杂的和交互编织的反馈机制，性类固醇的施与可 能造成性类固醇信号途径的抑制。例如，雌二醇减少了促性腺激素的产 生以及对GnRH作用的敏感性。但是，更高水平的雌二醇造成促性腺激 素大量释放(surge)。同样的，孕酮影响LH释放的频率和数目。在男性， 睾酮抑制了促性腺激素的产生。施与到男性中的雌激素降低了LH和睾 酮，以及抗雌激素增加了LH。
在其他实施方式中，抑制了患者的泌乳素。抑制性类固醇介导的信 号途径的另一个方法可以是通过直接或间接调节泌乳素水平的方法。泌 乳素是一种合成作为激素原的单链蛋白激素。雄性和非孕雌性的泌乳素 的正常值范围通常是从约0到20ng/ml，但是在怀孕雌性中，范围通常是 约10到300ng/ml。已经报道了泌乳素的总的数百种不同的作用。泌乳素 刺激雌性的乳腺发育和乳汁产生。已知异常泌乳素涉及于垂体肿瘤、月 经不调、不育、阳痿和泌乳(乳汁生成)。相当数量的研究正在逐步地探 讨泌乳素在正常及病理的免疫应答中的作用。发现泌乳素在免疫功能的 多个方面都有调节作用，还有证据说明高泌乳素血症是免疫抑制的 (Matera L，Neuroimmunomodulation.1997Jul-Aug；4(4)：171-80)。施与药 用剂量的泌乳素与感染小鼠的生存率的下降以及细胞免疫功能的抑制相 关(Oberbeck R，J Surg Res.2003 Aug；113(2)：248-56)。也有多种药物能 损害对泌乳素的多巴胺能的抑制并造成高泌乳素血症。抗多巴胺能药物 包括氟哌啶醇、氟奋乃静、硫苯酰胺、甲氧氯普胺和促胃肠动力药物(例 如，溴必利、氯波必利、多潘立酮和左舒必利)，它们已经被临床用于治 疗上胃肠道的运动病变。
应答于促性腺激素在性腺中所生成的抑制素A和B肽下调了垂体并 抑制FSH。活化素(Activin)通常上调GnRH受体并刺激FHS合成，但 是过量的产生可以终止性类固醇的产生。因此这些激素也可以是对性类 固醇介导的信号途径的抑制的靶点。
在某些实施方式中，将一种LHRH-R拮抗剂施用给患者，随后是一 种LHRH-R激动剂。例如，可以以足够剂量的单次注射施与拮抗剂以造 成5-8天内的阉割(这对于例如Abarelix是正常的)。当性类固醇已经达 到了这个阉割水平时，给予激动剂。这个方案消除或限制了在性类固醇 产生减少之前的性类固醇产生的任何尖峰，施与激动剂可能产生这样的 尖峰。在另一个替代实施方式中，使用了产生很小的或不产生性类固醇 产生尖峰的LHRH-R激动剂，这可以预先施用或不施用LHRH-R拮抗剂。
对性类固醇信号途径的抑制
性激素包括大量的雄激素、雌激素和黄体酮家族的激素分子。C21 类固醇的黄体酮家族的非限制性的成员包括孕酮、17α-羟孕酮、20α-羟 孕酮、孕二酮、孕二醇和孕烯醇酮。C19类固醇的雄激素家族的非限制 性的成员包括睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮(DHT)、雄烷二酮、 Androstandiol、脱氢表雄酮和17α-羟雄烯二酮。C17类固醇的雌激素家族 的非限制性的成员包括雌酮、雌二醇-17α、和雌二醇-17β。
性类固醇的信号途径是包括生物合成、分泌、代谢、区室化 (compartmentalization)和作用的途径组成部分的复杂后果的净结果。这 个途径的一部分还没有被完全了解，然而，仍有多种已有的和潜在的机 制用于实现对性类固醇信号途径的抑制。在本发明的一个方面，通过在 细胞水平即所谓的“游离”水平修饰生物可获得的性类固醇水平、通过 改变生物合成或代谢、与靶细胞上或内的性类固醇受体的结合、和/或性 类固醇的细胞内信号途径都可以实现对性类固醇信号途径的抑制。
直接或间接地影响信号途径是有可能的。直接方法包括影响性类固 醇的生物合成和代谢、与相应受体的结合以及信号的细胞内修饰的方法。 间接方法包括那些已知影响性类固醇激素的产生和作用的方法例如垂体 腺体和性腺中所存在的肽激素和生长因子。后者包括但不限于垂体腺体 所生成的FSH、LH和活化素、以及性腺所生成的抑制素、活化素和胰岛 素样生长因子-1(IGF-1)。
本领域人员将认识到通过在相关的激素、酶、受体、结合分子和/或 配体的水平或通过对分子的直接作用或通过对分子的前体包括编码或调 节它的核酸、或能修饰性类固醇作用的分子的作用上进行上述的修饰可 以发生对性类固醇信号途径的抑制。
抑制信号途径的直接方法
生物合成
生物合成的速度是类固醇激素产生以及血清“游离”激素的生物利 用度的主要限速步骤。对途径中早期的关键酶例如P450胆固醇侧链裂解 (P450scc)的抑制将减少所有主要性类固醇的产生。在另一方面，对途径 中后面的酶例如将雄激素转化为雌激素的P450芳香酶(P450arom)或将 睾酮转化为DHT的5α还原酶的抑制，将仅仅分别影响雌激素或DHT的 产生。性类固醇激素生物合成的另一个重要的方面是催化非活化的与生 物活性的类固醇之间相互转换的氧化还原酶家族，例如17-羟类固醇脱氢 酶(17-HSD)催化雄烯二酮与睾酮或雌酮与雌二醇-17的相互转换。这些 酶是组织和细胞特异的并通常催化还原或氧化反应，例如只在睾丸的 Leydig细胞内发现了3型17βHSD，而在卵巢内发现了1型17βHSD。 因此它们提供了特异地减少雄激素或雌激素的活性形式的产生的可能 性。
有许多种已知的类固醇生物合成途径中的酶的抑制剂已经被用于临 床应用或在发展中。下面罗列了这些抑制剂中的一些实例以及它们的治 疗模式。重要的是这些酶抑制剂的作用没有过度地影响其他类固醇例如 对代谢稳定是重要的肾上腺的糖皮质激素和盐皮质激素的产生。当使用 这些抑制剂时，给患者提供替代的糖皮质激素和有时提供盐皮质激素可 能是必需的。
性类固醇的生物合成发生在多个部位并利用多种途径，主要是在卵 巢和睾丸中产生，但是有一些是在肾上腺内产生，以及在其他的组织例 如脂肪内合成衍生物。因此，可能需要抑制性类固醇信号途径的多个机 制以保证充分的抑制实现本发明。
代谢和区室化(compartmentalization)
性类固醇在血液中的半衰期短，通常仅为数分钟，这是因为快速代 谢，特别是肝脏，以及肾脏和脂肪的清除。代谢包括糖基化和硫酸化的 结合反应，以及还原反应。这些代谢物中的一些保留有生物学活性，这 生物学活性或是激素原的例如雌激素硫酸盐，或是通过内在的生物学活 性例如还原雄激素。对代谢速度的任何干扰都能影响性类固醇激素的“游 离”水平。但是，还没有得到与影响生物合成的方法一样的实现这一点 的方法。
减少“游离的”性类固醇激素水平的另一个方法是通过性类固醇激 素与血清中的蛋白例如性激素结合球蛋白、皮质醇激素结合球蛋白、白 蛋白和睾酮-雌二醇结合球蛋白的结合的区室化。与性类固醇配体例如载 体分子的结合使得不能获得与受体结合的性类固醇。载体水平例如SHBG 的增加或引入其他的与性类固醇结合的配体例如可溶性受体可以造成结 合的增加。或者，降低水平的载体分子可以使得性类固醇对降解更为敏 感。
抗特殊的性类固醇激素的主动或被动的免疫接种是一种形式的区室 化。在这种方法在抗雌激素或雄激素的免疫接种之后成功地增加了动物 的排卵率的文献中有着实例。从分泌囊泡中分泌出性类固醇。对分泌机 制的抑制或修饰是抑制性类固醇信号途径的另一种方法。
受体和细胞内信号途径
性类固醇经在细胞内或如最近所示的在靶细胞膜上的特异受体作用 于细胞。
细胞内受体是核受体超家族的成员。它们位于细胞的细胞浆内并在 与性类固醇激素结合后被转运到核内，在这里它们改变了特异基因的转 录。性类固醇激素的受体以多种形式存在。在文献中熟知的是两种形式 的孕酮受体，PRA和PRB，以及三种形式的雌激素受体，ERα、ERβ1 和ERβ2。可以以多种方法修饰应答于性类固醇激素受体与基因启动子区 域内的类固醇应答元件结合的基因的转录。存在于靶细胞核内的辅激活 物和辅抑制物都能修饰性类固醇-受体复合物与DNA的结合并据此影响 转录。对这些辅激动物和辅抑制物中的多种的鉴定是已知的，以及修饰 它们对性类固醇受体的作用的方法是目前研究的热点。性类固醇激素作 用中所包含的转录因子的实例是NF-1、SP1、Oct-1和TFIID。类固醇的 完全作用需要这些辅助调节物。修饰这些核调节物的作用的方法可能涉 及激动物和抑制物之间的平衡，通过使用拮抗剂或经过控制编码调节物 的基因的表达。另外，c-AMP。
最近，在细胞膜上已经鉴定出雌激素和孕酮的特异受体，它们的结 构不同于细胞内PR。不象经典的作用于基因组的类固醇受体，这些受体 通过还没有被完全认识的细胞内途径传递快速的、非基因组的作用。一 个报道表明，与膜受体相互作用的雌激素激活了与细胞增殖相关的鞘氨 醇途径。
已经有可获得的或发展中的经性类固醇的细胞浆受体改变性类固醇 的作用的方法。在这个情况中，与特异的类固醇受体相互作用的抗雄激 素、抗雌激素和抗孕激素在文献中是熟知的并被用于临床应用中，如上 所描述的。它们的作用可能是竞争或阻断受体、修饰受体的水平、敏感 性、构象、联合或信号途径。这些药物可以是各种形式的，类固醇的和 非类固醇的、竞争性的和非竞争性的。特别相关的是选择性受体调节物， SARM、SERM和SPRM，它们是靶向于特殊组织的并被如上说明的。
有两种方法可以实现对受体的下调：第一，通过过量的激动剂(类固 醇配体)，以及第二，通过抑制编码受体的相应基因的转录。通过使用选 择性激动剂例如他莫昔芬可以实现第一种方法。
抑制信号途径的间接方法
生物合成
其中一种抑制性类固醇信号途径的间接方法包含通过对负责驱动性 腺内的性类固醇激素的生物合成的垂体促性腺激素FSH和LH的利用度 或作用的修饰下调相关类固醇的生物合成。一种已建立的FSH分泌的抑 制剂是抑制素，一种性腺应答于FSH所产生的激素。已经显示给动物施 与抑制素减少了血清的FSH水平，因为垂体分泌FSH的减少。实现两种 促性腺激素的减少的最好的已知方法是经下丘脑激素GnRH/LHRH，它驱 动垂体合成并分泌FSH和LH。减少了FSH和LH的分泌并因此减少了 性腺的类固醇产生的GnRH的激动剂和拮抗剂现在已经被用于临床应用， 如在此所描述的。
另一种减少性类固醇激素的生物合成的间接方法是在性腺水平修饰 FSH和LH的作用。通过使用直接对抗FSH和LH的抗体、或设计用于 与FSH和LH竞争产性类固醇激素的性腺细胞上的它们的相关受体的分 子可以实现这一点。另一种修饰FSH和LH对性腺细胞的作用的方法是 通过一种促性腺激素作用的辅助调节物。例如，活化素可以减弱卵巢的 膜细胞和睾丸的Leydig细胞应答LH产生雄激素的能力。
修饰可以发生在激素前体的水平例如对信号肽例如GnRH的信号肽 的裂解的抑制。
受体和细胞内信号途径
改变性类固醇激素的信号途径作用的间接方法包括下调导致类固醇 的基因组和非基因组作用的受体途径。它的一个实例是孕酮下调靶组织 的ER水平的能力。未来的方法包括利用对已知影响细胞核内的受体的辅 助调剂物的分子的处理，导致细胞对类固醇的应答的能力的降低。
其他因素
虽然用于对BM功能性、BM淋巴细胞生产和免疫细胞功能性的直 接及间接作用的刺激主要是依据于对性类固醇的作用的抑制和/或LHRH 类似物的直接作用，可作用为一起增强或增加(累加、协同或补充)胸腺、 BM、和/或免疫细胞作用和功能性的附加物也可能是有用的。可以使用或 不使用附加物。这些化合物包括，但不限于细胞因子和生长因子，例如 白介素-2(IL-2，100,000到1,000,000IU，例如600,000IU/kg，每8小时重 复剂量)、白介素-7(IL-7，10ng/kg/天到100ng/kg/天，根据治疗的需要)、 白介素-15(IL-15；0.1-20mμg/kg/天)、白介素-11(IL-11；1-1000μg/kg)； 上皮和成纤维细胞生长因子家族成员，干细胞因子(SCF；也已知为青灰 因子(steel factor)或c-kit配体；0.25-12.5mg/ml)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF；1和15μg/kg/天，IV或SC)、粒细胞巨核集落刺激因子(GM-CSF； 50-1000μg/平方米/天，SC或IV)、胰岛素依赖性生长因子(IGF-1)、和角 化细胞生长因子(KGF；1μg/kg到100mg/kg/天)(见例如Sempowski et al.， (2000)J.Immunol.164：2180；Andrew和Aspinall，(2001)J.Immunol.166： 1524-1530；Rossi et al.，(2002)Blood 100：682)；促红细胞生成素(EPO； 10-500单位/kg，IV或SC)。用于与本发明同时或连续地共施与的其他合 适的造血因子、CSF、细胞因子、淋巴因子、造血生长因子和白介素的非 排它性的实例包括Meg-CSF(巨核细胞集落刺激因子，最近被称为c-mpl 配体)、MIF(巨噬细胞抑制因子)、LIF(白血病抑制因子)、TNF(肿瘤坏 死因子)、IGF、血小板衍生生长因子(PDGF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、LIF、flt3/flk2、人生长激素、B 细胞生长因子、B细胞分化因子和嗜酸性粒细胞分化因子或它们的组合。
在最初的LHRH类似物(或其他的阉割方法)应用时，可以给予一 次这些附加化合物的一或多种。可以联合激动剂、拮抗剂或性类固醇阻 断的其他任何形式给予每种治疗。因为生长因子具有相对快的半衰期(例 如数小时)，它们可能需要每天给药(例如每天给药共7天或更长时间)。 如生产商所规定的，可以给予最佳形式的生长因子/细胞因子以保存它们 的生物活性，如纯化蛋白的形式。但是，可以在任何时间给予这些物质 的任何一种或组合的附加剂量以进一步刺激BM和其他免疫细胞的功能 性。在某些情况中，与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给 药同时进行性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。在其他情况中， 与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给药依次进行性类固醇 清除或对性类固醇信号途径的阻断。
术语“动员剂”在此被定义为是指例如SDF(例如AMD3100)、生长 激素、GM-CSF、G-CSF和化疗(例如环磷酰胺)等药剂，它们增强了 BM干细胞的动员。
已知G-CSF和GM-CSF能分别动员粒细胞(主要是中性粒细胞)和 巨噬细胞的产生，以及也造成增加了BM的DC的产生，这有助于给处 于抗原攻击中的患者提供非特异性免疫应答(Janeway et al.，(2001) Immunobiology 5th Ed.，p.325)。例如，临床上使用G-CSF和GM-CSF减 少了接受骨髓抑制性抗肿瘤药物的非髓系恶性肿瘤患者的感染(表现为 发热性粒细胞缺乏症)的发生率，这通常与严重的粒细胞缺乏症以及发热 的显著的发病率相关。另外，临床上证实这两种药物都能预防接受HSCT 患者的感染。G-CSF和GM-CSF两者目前都被用于进行外周血前体细胞 收集或治疗的患者。刺激BM干细胞的分化和/或增殖的集落刺激因子 (CSF)已经产生了很多兴趣，因为它们对恢复造血干细胞来源的细胞的 受抑制水平的治疗能力。根据它们的活性，已经鉴定并区别出人和小鼠 系统的CSF。例如，粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞-CSF(M-CSF)分 别刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的体外形成，而GM-CSF和白介素-3 (IL-3)具有更广泛的活性，它们刺激巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒 细胞集落的形成。IL-3也刺激肥大细胞、巨核细胞和纯的及混和的红系 集落(当加入促红细胞生成素时)的形成。GM-CSF加速了中性粒细胞的 恢复并保留其功能性，但对血小板恢复只有很小的可证实的作用。相反 地，IL-3促进了中性粒细胞和单核细胞的更为缓慢增加的恢复，但加速 了血小板的恢复。
因此，在本发明方法的一些实施方式中使用了G-CSF和/或GM-CSF。 与G-CSF和/或GM-CSF治疗一起的性类固醇清除(依次的或同时的)造 成了BM的淋巴及髓细胞输出的增加，这反过来显著地提高了患有或可 能患有感染的患者的短期及长期结果。在另一个方法中，在化疗或放射 治疗后3-4天施与CSF。通过对性类固醇信号途径的中断也极大地增强了 与应用CSF所已经相关的临床结果。特别地，与CSF一起使用本发明的 方法容许更好地控制对接受例如肿瘤放疗或化疗的患者的感染。另外， 如果可以有效地和迅速地“重启”免疫系统，可以使用增加了剂量和频 率的化疗药物或放射治疗。这可以发生于有或没有异基因或自体HSC的 引入，HSC的引入将进一步地增强免疫系统功能性的及时恢复。阉割也 将造成更低数目的必需被移植的HSC，当只能从供者中得到有限数量的 HSC或当脐血干细胞被用于移植时，这将是有用的。
例如，同时使用两种不同类型的药物(例如一种GnRH类似物，例 如Lupron_；和一种雄激素阻断剂，例如Cosudex_)可以容许相同的免 疫系统的再生，但可能需要减少了剂量的G-CSF或GM-CSF。相似地， 当利用相同剂量的G-CSF或GM-CSF时，同时使用这两种不同类型的药 物可以容许免疫系统细胞的更大的或更长时间的复壮(rejuvenation)。另 外，同时使用两种不同类型的药物同样可以容许免疫系统细胞复壮，但 利用了减少了剂量(即与用于治疗前列腺癌、子宫内膜异位症或乳腺癌的 “通常”使用的剂量比较时有所减少)的能耗竭或中断性类固醇信号途径 的药物、或药物的组合。另外，当利用了减少剂量了的用于耗竭或中断 性类固醇信号途径的药物或药物的组合时，同时使用两种不同类型的药 物容许免疫系统细胞的更大程度或更长时间的复壮。
适应证
已知引起性类固醇去除或阻断性类固醇信号途径的药物，可单独或 与或不与上面所提及的生长因子和细胞因子联合使用，用于：与多种治 疗方案相关的感染的减少、耗竭治疗后BM的复壮(见，例如实施例19)、 作为一种促进HSC植入的辅助治疗(见，例如实施例22)、作为一种异基 因或自体器官或细胞移植的有效处理的辅助治疗(见例如，实施例21和 22，以及共同未决、共拥有的美国No.10/419,039和10/749,119)、疫苗接 种方案(见，例如实施例10-13、29和共拥有的、共同未决美国 No.10/418,747和10/748,450)、各种自身免疫性疾病的处理(见，例如实 施例32-35和共拥有的、共同未决美国No.10/419,066和0/749,118)、各 种感染性疾病的后果的治疗或处理(见，例如实施例3和14)、对各种癌 症的预防及治疗的提高(见，例如实施例13和共拥有的、共同未决美国 No.10/418,727和10/749,122)、和各种基因治疗方案(见实施例14和共拥 有的、共同未决美国No.10/419,068和10/748,851)。
这些药物在这些疾病中的应用将造成更有效的治疗结果或将造成更 有效的总体治疗方案。另外，如实施例25和26所描述的，可以变更各 种化疗药物的剂量或给药(或放射治疗的剂量)，使得它们现在产生更少的 副作用和/或造成患者的更好的生活质量的结果。此外，各种细胞因子和 生长因子的共施用可以容许减少移植所必需的HSC数目。例如，利用本 发明的方法，使用人脐血的成人HSCT现在可能是可能的，因为减少了 获得植入所需的细胞数目。
药用组合物
可以以任何可药用的载体施用或者可以无载体施用本发明所用的化 合物。根据标准的方法可以制备药用组合物的剂型(见，例如Remington， The Science and Practice of Pharmacy.Gennaro A.R.，ed.，20th edition， Williams&Wilkins PA，USA(2000))。可药用载体的非限制性的实例包括 生理上相兼容的包膜、溶剂和稀释剂。对于肠外、皮下、静脉内和肌肉 内给药，组合物可以受例如封装的保护。或者，可以与保护活性成分(复 数)的同时容许这些成分缓慢释放的载体一起提供组合物。本领域已知有 很多种聚合物和共聚物被用于制备定时释放的剂型，例如乳酸/乙醇酸共 聚物的各种版本。见，例如美国No.5,410,016，它将经修饰的聚乙二醇聚 合物用作为生物可降解的涂层。
拟用于口服给药的剂型可以被制备为液体、胶囊、片剂等等。这些 组合物可以包括例如，赋形剂、稀释剂、和/或保护活性成分不被降解的 涂层。这样的剂型是熟知的(见，例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro A.R.，ed.，20th edition，Williams&Wilkins PA，USA (2000))。
在本发明的任何一种剂型中，都可以包括不会负性影响LHRH类似 物的活性的其他化合物(即不会阻断LHRH类似物阻断性类固醇激素信 号途径的能力的化合物)。实例是在此所描述的各种生长因子和其他细胞 因子。
剂量
经常规训练的医生或兽医可以容易地确定出本发明所用的性类固醇 类似物或抑制剂阻断性类固醇激素信号途径的剂量，也可以通过查询医 学文献将其确定(例如，THE PHYSICIAN′S DESK REFERENCE，52ND EDITION，Medical Economics Company，1998)。
主治医师结合各种将修饰药物作用的因素例如患者的病变、体重、 性别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素将确定出用 于治疗上述病变的方法所相关的剂量方案。通过定期测定血液指标例如 血细胞分类计数等等可以监测所治疗患者的进展。
调整上面所叙述的剂量以补偿治疗组合物中的其他成分。这些成分 包括与其他CSF、细胞因子、淋巴因子、白介素、造血生长因子的共同 给药、与化疗药物和/或放射的共同给药、以及主治医师所识别到的各种 患者相关的内容例如修饰药物作用的因素，例如患者的病变、体重、性 别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素。
除了上述的剂量外，例如，可以以将持续一段时间(例如3到6个月) 的单次剂量施与LHRH类似物和其他的性类固醇类似物。在某些情况中， 剂型将有效1到2个月。标准剂量随所用类似物的类型而有所不同，但 是这对本领域人员是容易决定的，不需过多的试验。一般而言，剂量是 在约0.01mg/kg和约10mg/kg之间，或约0.01mg/kg和约5mg/kg之间。
性类固醇抑制或LHRH/GnRH类似物的治疗时间的长度随着胸腺萎 缩和损伤的程度而有所不同，这对本领域人员是容易决定的，不需过多 的试验。患者越老，或他们已经被暴露于T细胞耗竭物例如化疗或放疗 越多，他们需要例如GnRH的治疗似乎就越长。四个月通常被认为足以 检测到血液中的新的T细胞。检测血液中的新的T细胞的方法在本领域 是已知的。例如，通过确定T细胞受体删除环(TREC)的存在是一种T 细胞检测的方法，当在TCR形成时形成了TREC，而当细胞分裂时它从 细胞内缺失。因此，TREC只见于新的(原初)T细胞中。TREC水平是人 类胸腺功能的一个指示。在WO/00 230,256中详细地描述了这些及其他 的方法。
剂量因所用的性类固醇抑制剂或例如抗性类固醇疫苗或其他阻断剂 而不同。在某些情况中，一个剂量可以被制备为持续与周期性传染的持 续时间一样长的时间。例如，“流感季节”通常发生在冬季的月份中。可 以从流感季节开始时就开始如在此所述的制备并给予LHRH类似物的一 种剂型以保护一段2个月以上的时间，每2个月以上给予附加剂量，直 到感染的危险减低或消失。
可以制备出增强免疫系统的剂型。或者，可以制备特异地终止例如 流感病毒的感染同时增强免疫系统的剂型。后者的剂型可以包括已经被 遗传工程加工产生了对流感病毒的耐受性(见下)的经遗传学修饰的(GM) 细胞。可以与性类固醇类似物或LHRH类似物一起或在空间上和/或时间 上都分开地施与GM细胞。与用非GM细胞一样，可以随着时间给患者 施用多次剂量以在流感季节期间内产生对流感病毒的保护并预防感染。
本领域人员可以明白，至少一些阻断性类固醇信号途径的方法的有 效时间只与施与合适化合物的时间一样长。因此，本发明的某些实施方 式的优点是一旦已经实现了本发明所需的免疫效应，就可以终止治疗 (2-3个月)，并且这些对象的生殖系统将恢复到正常。
化学阉割药物的施用
可以通过任何将药物给予到体内的方法施与性类固醇清除除药物。 因此，根据发明，可以用任何途径包括但不限于静脉内、皮内、皮下、 肌肉内、局部和口服的给药途径施与性类固醇清除药物。
除了上述的方法外，经本领域人员已知的多种方法可以完成用于本 发明的方法的化合物的给予。一个用于施与化学抑制剂以抑制性类固醇 介导的信号途径的标准方法利用了有效3个月的单次剂量的LHRH激动 剂。对此，单个时间的简单的静脉内或肌肉内注射都是不够的，因此早 在三个月过去之前激动剂就已经被从患者的体内清除出去。取而代之的 是，可以使用储存剂注射液或植入物、或任何其他的给予容许缓慢释放 抑制剂的工具。同样地，可以使用用于增加抑制剂在体内的半衰期同时 保留在此所需的功能的方法，例如通过修饰化学物。
有用的施用机制包括，但不限于，对皮肤的激光照射。在共拥有的、 共同未决美国No.10/418,727以及也在美国No.4,775,361、5,643,252、 5,839,446、6,056,738、6,315,772、和6,251,099中更详细地描述了这个实 施方式。另一种有用的施用机制包括在皮肤上产生高压脉冲暂态(也叫做 应力波或脉冲暂态)。在共拥有的、共同未决美国No.10/418,727以及也 在美国No.5,614,502和5,658,822中更详细地描述了这个实施方式。通过 将化合物与载体或没有载体放置在相同的位置可以完成或进行每种方 法。这种放置的一个方法是被放置在并在皮肤上被保持一段治疗的持续 时间的垫片内。
时机
在一个情况中，耗竭性类固醇或阻断性类固醇信号途径的药物(或其 他的阉割方法)的给药发生在例如可能引起一些BM骨髓细胞耗竭和/或 损伤循环的免疫细胞的化疗或照射方案之前。
细胞
或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活 化的同时，注射造血前体细胞例如被明确定义为CD34+的造血细胞(理 想的是自体的)能增强胸腺再活化的程度和动力学和/或增加免疫细胞和 BM功能性以及植入。HSC也还可以被定义为低Thy-1和CD38-、 CD34+CD38-；缺少其他细胞系(lin阴性)的标记物的低Thy-1的细胞是 更为原始的HSC，它可以更长时间地持续或具有更长期的重新入巢的能 力。
通过添加例如CD34+HSC和/或上皮干细胞可以补充在此所述的各 种发明的方法。在一种情况中，这些细胞是自体的或同基因的并在胸腺 再活化之前已经从患者或孪生子中得到的。通过分选患者的血液和/或 BM的CD34+或CD34lo细胞可以得到HSC。可以有多种方法用于增强 HSC的数目，包括(但不限于)通过在收集细胞之前给患者施用G-CSF (Neupogen，Amgen)、将所收集的细胞培养在SCSF中、和/或在补充CD34+ 细胞之后给患者施用G-CSF。或者，如果通过之前给患者施用G-CSF增 强了CD34+细胞群，那么就不必从血液或BM中分选出CD34+。
HSC可被用于遗传学修饰。这些HSC可以来源于BM、外周血或脐 带、或任何其他的HSC来源、以及可以是自体的或非自体的。也有用的 是淋巴或髓系祖细胞、也在骨髓中发现的间质干细胞以及上皮干细胞， 也可以是自体的或非自体的。干细胞也可以包括脐带血。它们也可以包 括具有分化成多种不同的细胞类型的潜能的干细胞，例如胚胎干细胞和 现在在许多组织例如BM、胰腺、脑和嗅系统中所发现的成人干细胞。
在使用非自体的(供者)细胞的情况中，在胸腺再活化期间或之后产 生了对这些细胞的耐受性。在开始阻断性类固醇介导的信号途径期间或 之后，将相关的(经遗传学修饰的(GM)或未经遗传学修饰的)供者细 胞移植到受者内。这些细胞，理想的是干细胞或祖细胞被胸腺所结合并 接受，其中它们通过消除任何偶尔可以有活性对抗供者细胞的新产生的T 细胞生成了对供者的耐受性。然后它们“属于受者”并可以称为胸腺的 新的T细胞和DC的产生的一部分。所形成的T细胞都把受者和供者识 别为自身的，据此生成了对来自供者的移植物的耐受性(见，共拥有的、 共同未决美国No.10/419,039和PCT/IBO1/02740)。
在另一个实施方式中，所施与的受者干细胞或祖细胞(经遗传学修饰 的或未经遗传学修饰的)包括来自多个个体的细胞，使得受者发展出对一 组MHC类型的耐受性，使得受者被认为是更容易的或快速的细胞、组织 或器官移植的合适的侯选者，因为它们具有与更大范围的供者匹配的 MHC。
本发明也提供了用于将外来DC整合到患者胸腺内的方法。通过给 受者施与供者细胞以形成受者内的耐受性可以实现这一点。供者细胞可 以是DC、上皮干细胞、成体或胚胎干细胞、或造血前体细胞。供者细胞 可以是CD34+HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在一些情况中，供者 细胞是CD34+或CD34lo HSC。供者HSC在受者中可以发育为DC。供 者细胞可以被施与到受者并通过外周血液系统或直接或经BM迁移到再 活化的胸腺内。为了增强诱导耐受性的胸腺整合，也可以联合通过使用 性类固醇抑制剂例如LHRH/GnRH类似物对胸腺再活化的活化，往胸腺 内注射干细胞。在胸腺的微环境及其中合适的细胞生长因子的含量内， 甚至非HSC似乎也可被诱导形成DC。
对性类固醇的抑制或缺失显著地增加了胸腺对造血前体细胞的摄 取。这些细胞被整合到胸腺内并按与受者细胞相同的方式产生DC、NK、 NKT、和T细胞。结果是T细胞、DC和其他细胞的嵌合体。供者细胞 在受者胸腺内的整合意味着这个胸腺所产生的T细胞将被选择，使得它 们能耐受供者细胞。这样的耐受性容许从受者中进一步移植它的细胞、 组织和器官，减少了对免疫抑制药物的需要，因为所移植的材料将被受 者的免疫系统识别为自身的材料。
任选地对干细胞或祖细胞的遗传学修饰
本说明书也包括用于任选地改变个体的免疫系统的方法和基因治疗 的方法。通过将GM细胞施用给受体以及通过阻断性类固醇介导的信号 途径可以实现这一点。发明还包括基因治疗的方法，通过联合再生胸腺 增强BM和/或免疫细胞的功能性，或与胸腺再活化同时或在此之前或没 有胸腺再活化的情况下进行。
遗传学修饰的细胞可以是HSC、上皮干细胞、胚胎或成体干细胞、 或髓系或淋巴祖细胞。在一个具体实施方案中，遗传学修饰的细胞是 CD34+或CD34lo HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在另一个具体实施 方案中，遗传学修饰的细胞是CD34+或CD34lo HSC。遗传学修饰的细胞 被施用给患者并经外周血流迁移到胸腺。在缺少性类固醇时，显著地增 加了胸腺对这些造血前体细胞的摄取。这些细胞被整合到胸腺内并产生 携带有来自被改变的细胞的遗传学修饰的树突状细胞和T细胞。结果是 带有所需的遗传改变的T细胞群循环在受体的外周血中，以及伴随着患 者的胸腺再活化所引起的细胞、组织和器官群的增加。
在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3-4周内(开始LHRH治疗后 的近2-3周)，血流中出现了最初的新的T细胞。但是，T细胞群的完全 发育可能要3-4个(或更多个)月。
本说明书也包括利用遗传学修饰的造血干细胞、淋巴祖细胞、髓系 祖细胞、上皮干细胞或它们的组合(GM细胞)的基因治疗的方法。其他 人所进行的先前的输送这些细胞作为基因治疗的尝试已经是不成功的， 造成修饰细胞的不可计数的水平。本说明书提供了一种新的用于输送这 些细胞的方法，它促进了细胞的摄取并分化为所需的T细胞。将修饰的 细胞注射到患者内。胸腺摄取修饰的干细胞和祖细胞并转化为T细胞、 树突状细胞和其他胸腺内产生的细胞。这些新细胞的每一个细胞都含有 亲代干细胞/祖细胞的遗传学修饰。
在一个实施方案中，发明的方法使用遗传学修饰的HSC、淋巴祖细 胞、髓系祖细胞、上皮干细胞或它们的组合(共同地被称为GM细胞)产 生免疫系统对特殊抗原攻击的抗性。
将一种生成或诱导对一或多种感染性或其他病因的抗性的合适的基 因或多核苷酸(即，定义特定蛋白的核酸序列)遗传工程地加工到干细胞和 /或祖细胞内。通过将特异基因引入到HSC内，细胞分化成例如APC， 它表达作为在MHC I型或II型背景中所表达的肽的蛋白。这种表达将比 正常发生的数目极大地增加了“呈递”所需抗原的APC的数目，据此增 加了合适的T细胞识别特异抗原并应答的机会。
现今在临床中所用的多种抗肿瘤或细胞毒的抗癌药物都造成了中度 到重度的骨髓毒性(例如，长春碱、顺铂、甲氨蝶呤、烷化剂、抗叶酸药 物、长春花生物碱和蒽环类抗生素)。在本发明的另一个实施方案中，可 以将耐药基因引入到HSC内以赋予其对抗癌药物的耐药性。这些基因包 括例如二氢叶酸还原酶。本发明提供对这些化疗药物的细胞毒作用有耐 药性的HSC的用法可以通过减少骨髓抑制的发生率和严重度，容许这些 药物的更多的使用和/或更少的副作用(Podda et al.，(1992)Proc.AM.Acad. Sci.USA 89：9676；Banerjee et al.，(1994)Stem Cells 12：378)。
胸腺可以摄取修饰的干细胞和祖细胞并将其转化为T细胞、DC和其 他胸腺所产生的细胞。这些新细胞的每一个细胞都含有亲代的干细胞/祖 细胞的遗传学修饰，并据此能完全或部分耐受病因所造成的感染或损伤。 在例如阉割的2周内，也增加了骨髓、血液和外周淋巴器官例如脾和淋 巴结内的B细胞的数目。在一个具体实施方案中，患者已经与病因接触 或是处于与病因接触的高度危险中。
患者可以被给予性类固醇类似物以激活他们的胸腺，和/或提高他们 的骨髓功能，这包括增加了摄取并产生HSC的能力。患者可以被注射他 们自己的HSC，或可以被注射来自合适供者的HSC，他们例如已经被 G-CSF治疗3天(每天两次皮下注射)，随后在第4和5天从血液中收集 HSC。HSC可以被基因(例如编码来自病因的蛋白、肽或抗原)转染或转导 以产生所需的蛋白或抗原。在注射到患者体内后，HSC进入骨髓以及一 些HSC最后发育成全身各处的抗原呈递细胞(APC)。抗原被表达于这些 APC的表面的I型MHC和/或II型MHC分子的背景中。通过表达所需 的抗原，APC提高了对T和B淋巴细胞的活化。被移植的HSC也可以 进入胸腺，发育成DC并将相关抗原呈递给发育中的T淋巴细胞。如果 只有小数目的DC(例如＜0.1％胸腺细胞)，DC能将对新T细胞的选择偏倚 向与抗原反应的那些T细胞。如果存在大量的特殊DC，可以用相同的原 理删除可能能与抗原反应的新的T细胞，这可以被用于自身免疫性疾病 的预防或治疗。
在一个实施方案中，患者感染了HIV。在一个特异的具体实施方案 中，用于治疗该患者的方法包括下面更为详细提供的步骤：(1)用高效抗 逆转录病毒疗法(HAART)治疗以降低病毒滴度，在整个过程中持续该治 疗以预防或减少新的T细胞的感染；(2)清除T细胞(免疫抑制)；(3)通过 施与性类固醇类似物例如LHRH类似物阻断性类固醇介导的信号途径； (4)在胸腺开始再活化时施与已经被修饰含有表达将预防HIV感染、预防 HIV复制、灭活HIV病毒或其他能阻止HIV感染T细胞的作用的蛋白的 基因的GM细胞；(5)如果GM细胞不是自体的，在胸腺再活化之前或与 之同时施与供者细胞使得免疫系统将供者细胞识别为自身细胞；和(6)当 胸腺嵌合体被建立以及新的成熟T细胞组已经开始脱离胸腺时，减少并 最终消除了免疫抑制。
在阉割步骤期间或之后，可以将来自供者的造血干细胞或祖细胞、 或上皮干细胞移植到受体患者内。胸腺接受这些细胞为属于受体的细胞 并开始成为胸腺的新的T细胞和DC产物的一部分。所形成的T细胞群 将供者和受体(对于非自体移植的情况)都识别为自身的。在受体中也可以 生成对来自供者的移植物的耐受性。移植物可以是供者的细胞、组织或 器官、或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的方法可以使用胸腺的移植物以提高供 者细胞的植入或对供者的移植物的耐受性。在一些具体实施方案中，胸 腺移植物是当患者是无胸腺时、当患者的胸腺对再生有抗性时、或对快 速再生有抗性时。在某些具体实施方案中，使用了诱导耐受性的胸腺的 异种移植物(见，例如美国No.5,658,564)。在其他的具体实施方案中， 可以使用异基因的胸腺移植物。
如在此所定义的，用语在患者中“产生耐受性”或“诱导耐受性” 和其他的相似用语都指的是完全的以及部分的耐受性诱导(例如，与没有 被本发明的方法所治疗的患者比较，患者可以是更耐受或完全耐受移植 物)。利用本领域已知的方法例如通过MLR反应可以测试耐受性诱导。
因此，在一种方法中，患者在阉割期间或之后接受HSCT。在一种情 况中，患者被注射了他们自身的HSC。在另一种情况中，患者被注射了 来自合适供者的HSC。可以用或不用G-CSF预处理患者或供者(例如，每 天两次皮下注射共三天，随后在第4和5天从血液中收集HSC)。在一种 情况中，在胸腺再活化之前或与之同时，给患者供给造血细胞，这增加 了患者机体的免疫能力。所移植的细胞可以被或不被遗传学修饰。所移 植的细胞可以是HSC、上皮干细胞或造血祖细胞。所移植的细胞可以是 CD34+HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在某些情况中，所移植的细 胞是CD34+或CD34lo HSC。HSC可以被或不被遗传学修饰。
在某些方法中，用基因(例如，编码来自病因的蛋白、肽或抗原的基 因或其他相关的基因)转染或转导HSC以产生相关的蛋白或抗原。在一个 实例中，本发明的方法使用了遗传学修饰的HSC、淋巴祖细胞、髓系祖 细胞、上皮干细胞、或其组合(共同被称作为“GM细胞”)以产生耐受 特殊抗原攻击的免疫系统(见，例如实施例14)。在共拥有的美国No. 09/758,910、10/419,068、和10/399,213中更详细地描述了这个方法。
在缺少性类固醇时，显著地增加了胸腺对HSC的摄取。这些细胞整 合到胸腺内并产生了携带有来自变更细胞的遗传学修饰的DC和T细胞。 结果是具有所需的遗传改变的T细胞群循环在受体的外周血中，以及伴 随有再活化胸腺所引起的细胞、组织和器官群的增加，它们能快速、特 异地应答于抗原。在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3到4周内(开 始LHRH治疗后的近2到3周内)，在血流中可以出现最初的新的T细胞。 T细胞池的完全发育可能要3到4个月。
在被注射到患者内之后，HSC从血液进入骨和骨髓中，然后一些脱 离回到血液内，并最终被转化为全身各处的T细胞、DC和APC。抗原 被表达于这些APC表面的I型MHC和/或II型MHC分子的背景中。对 于GM细胞，通过表达所需的抗原，APC提高了T和B淋巴细胞的活化。 所移植的HSC也可以进入胸腺，发育为DC，并将相关抗原呈递给发育 中的T淋巴细胞。
如果只有小数目的DC(例如＜0.1％胸腺细胞)，DC能将对新T细胞的 选择偏向于与抗原反应的那些T细胞。如果存在大量的特殊DC，可以用 相同的原理删除可能与抗原反应的新的T细胞，这可以被用于自身免疫 性疾病的预防或治疗。在例如阉割的2周内，也增加了骨髓、血液和外 周淋巴器官例如脾和淋巴结内的B细胞的数目。
对于HSC是具有特异性能的GM时，每个新细胞都含有亲代干细胞 /祖细胞的遗传学修饰，并据此完全或部分耐受于病因的感染或损害。
本领域人员熟知用于分离和转导干细胞和祖细胞的方法。例如在 PCT文献WO 95/08105、WO 96/33281、WO96/33282、美国No.5,681,559、 5,199,942、5,559,703、5,399,493、5,061,620中描述了这些类型方法的实 例。
反义多核苷酸
术语“反义”在此被定义为互补于本发明的多核苷酸的多核苷酸序 列。多核苷酸可以是DNA或RNA。可以用任何方法生成反义分子，方 法包括通过将反向定位的相关基因连接到允许互补链合成的病毒启动子 上的合成。一旦被引入到细胞内，这个转录链与细胞所生成的天然序列 结合形成双链体。然后这些双链体阻断了进一步的转录或转译。通过这 种方式，可以生成突变的表型。
催化核酸
术语“催化核酸”在此被定义为特异地识别一种特殊底物并催化底 物的化学修饰的DNA分子或含DNA的分子(在本领域也被叫做“脱氧 核酶”或“DNA酶”)或RNA分子或含RNA的分子(也叫做“核酶”)。 催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生 物。这些碱基的衍生物在领域是熟知的。
催化核酸通常含有用于特异识别靶核酸的反义序列以及裂解酶的活 性的核酸。催化链裂解靶核酸内的特异位点。在本发明中特别有用的核 酶类型是锤头状核酶(Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334：585)， Perrimanet al.，(1992)Gene 113：157)和发夹结构核酶(Shippy et al.， (1999)Mol.Biotechnol，12：117)。
dsRNA
双链RNA(dsRNA)对于特异地抑制特殊蛋白的产生是特别有用的。 虽然不愿被理论所限制，但是一个小组已经提供了一种用于通过其可以 用dsRNA减少蛋白产生的机制的模型(Dougherty and Parks，(1995)，Curr. Opina.Cell Biol.7：399)。最近这个模型已经被修饰并扩展(Waterhouse et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959)。这个技术依赖于存在含有 与相关基因的mRNA基本一致的序列的dsRNA，其中mRNA编码本发 明的第一个方面的多肽。便利地，可以在重组载体或宿主细胞的单个开 发阅读框中生成dsRNA，其中用无关序列侧面连接有义和反义序列，这 使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，具有与无关序列形成的环结 构。对本发明的合适的dsRNA分子的设计及产生都是在本领域人员的能 力范围内，特别是结合于Dougherty和Parks，(1995)，Curr.Opin.Cell Biol 7：399；Waterhouse et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959；和 PCT出版物No.WO 99/32619、WO99/53050、WO99/49029、和 WO01/34815。
抗HIV构建体
本领域人员能发展出用于本发明的合适的抗HIV构建体。事实上， 已经发展出多种抗HIV反义构建体和核酶，并被描述于美国No. 5,811,275、5,741,706、和5,144,019、和PCT出版物No.WO 94/26877和 澳大利亚专利申请No.56394/94中。
基因
在本发明的方法包括GM HSCT中所用的有用的基因和基因片段(多 核苷酸)包括那些编码T细胞对特殊感染性病因感染的抗性的基因。这些 感染性病因包括，但不限定于HIV、T细胞白血病病毒和其他引起淋巴 增殖性疾病的病毒。
对于HIV/AIDS，可以使用多种基因和/或基因片段，包括但不限定 于：nef转录因子；一种编码特异地切割HIV基因的核酶的基因例如tat 和rev(Bauer et al.，(1997)Blood 89：2259)；HIV rev基因的转显性突变形 式，RevM10，它已经显示出抑制HIV复制(Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol. 71：4707)；HIV-1rev反应元件(RRE)的过度表达构建体(Kohn et al.，(1999) Blood 94：368)；编码其的表达能抑制HIV感染细胞或复制的RNA或蛋白 的任何基因；和它们的片段及组合物。
可以使用这些基因或基因片段的可稳定表达的形式。术语“可稳定 表达的”在此被定义为在基因或基因片段被转移到细胞之后，能够至少 在宿主细胞的半永久性基础上以及在分裂和/或分化后的细胞子代中表达 基因或基因片段(“功能片段”)的产物(RNA和/或蛋白)。这要求无论 是否是包含在载体中的基因或基因片段都要具有合适的用于将DNA转 录为RNA的信号序列。另外，当基因或基因片段所编码的蛋白是影响患 者的状态的活性分子时，DNA也编码转译信号。
在绝大多数情况中，基因或基因片段被包含于载体中。本领域一般 人员都知道可以被用于表达所需的RNA或蛋白的表达载体。
表达载体是能指导在此所含的DNA序列的转录及所形成的RNA的 转译的载体。表达载体能在细胞内复制，能被遗传学修饰，它包括质粒、 噬菌体、病毒和微型染色体。同样地，基因或基因片段可以成为细胞的 染色体DNA的整合部分。重组载体和方法学通常是熟知的。
用于表达本发明的蛋白的表达载体可以包括复制起点。适当构建的 表达载体包括用于细胞内的自主复制的复制起点，或能整合到宿主细胞 的染色体中。这些载体也可以包含选择性标记物，有限数目的有用的限 制性酶位点、高拷贝数目和强启动子。启动子是指导RNA聚合酶与DNA 结合并启动RNA合成的DNA序列；强启动子引起了高频率的启动。
在一个实施方式中，DNA载体构建体包括一个启动子、增强子和多 腺苷酸化信号。启动子可以选自由HIV，例如长末端重复(LTR)、猴病 毒40(SV40)、Epstein Bar病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、Rous肉瘤 病毒(RSV)、莫洛尼病毒、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人肌动蛋白、 人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酐、人金属硫蛋白(metalothionein)所 构成的非限制性的组。在另一个实例中，使用了诱导型启动子，使得可 以控制所插入的基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
增强子可以选自包括但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋 白、人肌肉肌酐和病毒增强子例如那些来自CMV、RSV和EBV的增强 子的组。启动子和增强子可以来自相同的或不同的基因。
例如，可以从由LTR多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号、特 别是其中的SV40最小腺苷酸化信号所组成的组中选出多腺苷酸化信号。
本发明的表达载体可以被可操纵地连接到编码本发明所用的RNA 或蛋白的DNA上，即载体能指导所连接的DNA分子的复制以及DNA 分子所编码的RNA或蛋白的表达。因此，对于蛋白，表达载体必须在所 连接的DNA分子的上游具有转录起始信号，保持正确的阅读框以容许 DNA分子在控制序列的控制下的表达和DNA分子所编码的所需蛋白的 产生。表达载体可以包括但不限于，克隆载体、经修饰的克隆载体和特 别设计的质粒或病毒。可以使用诱导型启动子，使得可以控制所插入的 基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
本领域人员能生成在细胞内有功能的DNA构建体。为了测试表达， 利用对与被遗传学修饰的那些细胞相同类型的细胞的组织培养可以在体 外测定遗传构建体的表达水平。
遗传学修饰的方法
可以用标准的重组方法将遗传学修饰引入到正被用于基因治疗的细 胞内。例如，对培养的HSC的逆转录病毒载体的转导是一种本领域已知 的成功方法(Belmont and Jurecic(1997)″Methods for Efficient Retrovirus-Mediated Gene Transfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells，″in Gene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)Humana Press，pp.223-240； Bahnson et al.，(1997)″Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer toCD34+-Enriched Cells，″in Gene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)， Humana Press，pp.249-263)。其他的载体包括但不限于那些腺病毒来源的 或慢病毒来源的、和莫洛尼小鼠白血病病毒来源的载体。
下面的方法对HSC的遗传学修饰也是有用的：颗粒介导的基因转移 例如用基因枪(Yang，N.-S.and P.Ziegelhoffer，(1994)″The Particle Bombardment System for Mammalian Gene Transfer，″In PARTICLE BOMBARDMENT TECHNOLOGY FOR GENE TRANSFER(Yang，N.-S. and Christou，P.，eds.)，Oxford University Press，New York，pp.117-141)、脂 质体介导的基因转移(Nabel et al.，(1992)Hum.Gene Ther.：3：649)， coprecipitation of genetically modified vectors with calcium phosphate (Graham and Van Der Eb，(1973)Virol.52：456)、电穿孔(otter et al.，(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7161)、和微注射(Capecchi，(1980)cell 22：479)，以及其他的能稳定地将可能是在载体内的基因或寡核苷酸转移 到HSC和其他被遗传学修饰的细胞内使得基因被表达至少部分时间的方 法。
发育中的TCR库偏向或偏离特异抗原：过敏和自身免疫性疾病
增强胸腺对造血干细胞的摄取的能力意味着可以操纵树突状细胞的 性能和类型。例如，可以用最终被表达于胸腺(以及体内的其他部位)的树 突状细胞内的特异基因转染干细胞。这些基因可以包括那些编码特异抗 原的基因，针对这些特异抗原的免疫应答可能是有害的，例如在自身免 疫性疾病和过敏中。
本发明的这个部分是立足于一个发现，就是性类固醇抑制对BM功 能性和免疫细胞功能性具有直接作用，以及最终对自身免疫性患者的胸 腺的再活化将有助于克服患者所患的自身免疫性疾病。这一相同的原理 也被应用于患有过敏的患者。当胸腺被再活化时，形成了新的或修饰的 免疫系统，它们不再识别和/或应答于自身抗原。
根据本发明，可以应用如下方案。首先将诊断为自身免疫性疾病(例 如I型糖尿病)的患者免疫抑制以终止疾病进展。可以通过单独地或与抗 T细胞和抗B细胞抗体(例如去除T细胞的抗CD3或抗T细胞伽玛球蛋 白和去除B细胞的抗CD19、CD20或CD21)一起施与免疫抑制剂(例如环 孢菌素或雷帕霉素)实现这一点。在患者被免疫抑制的同时，可以施与性 类固醇类似物(或其他的阉割方法)。然后可以用G-CSF动员其自身的T 细胞。如果他的自身免疫性是由其T细胞与他之前所遇到过的病因的交 叉反应所引起的，那么T细胞的清除将去除自身反应性T细胞，以及新 发育的T细胞将不会继续识别他的细胞(例如他的β胰岛细胞)为外来细 胞。通过这种方式，缓解了其自身免疫性疾病。此外，一旦其自身免疫 性疾病已经被缓解，可以停止性类固醇去除治疗，由此恢复患者的生育 力。
在本发明的另一个非限制性的实例中，用异基因干细胞重建自身免 疫性疾病。在一些具体实施方案中，这些异基因干细胞是脐带血细胞， 它不包含成熟T细胞。
在一些实施方案中，所移植的HSC可以在完全的骨髓清除或骨髓耗 竭之后，因此造成了完全的HSC移植(例如，每次移植每kg体重5×106 细胞)。在一些具体实施方案中，只需要实现较小的骨髓清除，例如在 2-3Gy照射(或300rad)后施与约3-4×105个细胞/kg体重。在一些具体实施 方案中，使用了T细胞清除(TCD)、和/或另一种免疫细胞清除的方法(见， 例如实施例2)。最小到10％嵌合体就可能足以缓解患者的过敏或自身免 疫性疾病的症状。在一些具体实施方案中，供者HSC是来自脐带血(例如， 1.5×107细胞/kg用于受体的植入)。
在其他实施方式中，直到骨髓清除化疗前45天，患者开始接受Lupron 并与BMT同时连续接受Lupron，使得暴露于药物的总长在9个月左右 (等于3次注射，每次注射给药可维持3个月)。在研究期间的不同的间隔 内，可以收集血样分析T细胞的数目(特别是新近胸腺迁出)和功能(具 体的是体外对T细胞刺激的应答)。这个实施方式也通常适用于在此所描 述的其他目的的HSCT(例如癌症放疗和化疗后的HSCT)。
在其他实施方式中，可以在淋巴清除之后移植HSC。在一些实施方 式中，可以选择性清除T细胞和/和B细胞，按需去除细胞(例如那些涉 及自身免疫性和过敏的细胞)。选择可以包括去除活化细胞或涉及自身免 疫或过敏应答的细胞类型。可以根据细胞表面标记物例如CD4、CD8、 B220、thy1、TCR、CD3、CD5、CD7、CD25、CD26、CD23、CD30、 CD38、CD49b、CD69、CD70、CD71、CD95、CD96、抗体特异性或Ig 链、或上调调细胞因子受者例如IL-2R B链和TGFβ选择细胞。一种熟知 的用于耗竭的方法是使用抗淋巴细胞球蛋白。其他选择和分选细胞的方 法是熟知的，包括磁性和荧光细胞分离、离心和更具体的是血浆置换、 白细胞分离术和淋巴细胞分离术。
在一些实施方式中，在没有骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴耗竭、T细 胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除时进行HSCT。
在其他实施方式中，本发明的方法还包括通过例如施予免疫抑制剂 (例如，环孢菌素、强的松、Ozothioprine、FK506、依木兰和甲氨碟呤)将 患者免疫抑制(见美国No.5,876,708)。在一个实施方式中，在无HSCT 时进行免疫抑制。在一个实施方式中，结合HSCT(例如在其之前、与之 同时和之后)进行免疫抑制。在另一个实施方式中，在不存在骨髓清除、 淋巴清除、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭时 进行免疫抑制。仍在另一个实施方式中，结合骨髓清除、淋巴清除、T 细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭进行免疫抑制 (例如在其之前、与之同时和之后进行)。
如上所述，骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清除、免疫抑制、T细胞清 除和/和其他选择性的免疫细胞清除是在本申请书的全文中都被使用的免 疫细胞清除的非限制性的实例类型。通用术语“免疫细胞耗竭”在此被 定义为包括这些方法中的每一种方法，即骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清 除、T细胞清除和/或其他的选择性的免疫细胞清除(例如B细胞和NK 细胞耗竭)。本领域人员容易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可 以用任何一种(或多种)其他的“耗竭”方法取代这些“耗竭”方法中的 任何一种。
在一个实施方式中，耗竭了NK细胞。NK抗体用于耗竭NK细胞群 在本领域是已知的。例如，抗NK抗体的一个来源是抗人胸腺细胞的多 克隆抗血浆。美国No.6,296,846描述了NK和T细胞耗竭的方法以及非 骨髓清除治疗和嵌合淋巴造血细胞群的形成，所有的这些都可被用于本 发明的方法。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括例如在HSCT之前，通过 血流灌注从供者中所获得的器官(例如肝或肾)中吸附受者血液中的天 然抗体。
在另一个实施方式中，本发明还包括减少T辅助细胞的治疗(T cell help-reducing treatment)，例如增加直接和间接(例如通过对第二细胞因子 活性水平的刺激或抑制)促进对移植物的耐受性的细胞因子(例如 IL-10、IL-4和TGFβ)的活性水平，和减低促进对移植物的排斥的细胞因 子的活性(例如，一种抵抗和抑制耐受性的细胞因子(例如，IFNβ、IL-1、 IL-2和IL-12)。在一些实施方式中，施予细胞因子以促进耐受性。细胞 因子可以来源于供者物种和来源于受者物种(见，例如，美国No. 5,624,823，它描述了用于这种用途的编码猪白介素-10的DNA)。辅助诱 导治疗的持续时间可以近似等于和少于受者物种的成熟T细胞在首次被 抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间(在人类这通常是8-12天)。 在其他实施方式中，持续时间是近似等于或少于受者的成熟T细胞在首 次被抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间的2、3、4、5和10倍。 在存在和缺少可以刺激受者的成熟T细胞释放细胞因子的治疗时，例如 缺少强的松(17，21-dihydroxypregna-1，4-diene-3，11，20-trione)时可以施予 短期的辅助减少治疗。可以在引入移植物之前或大致时间时，开始辅助 减少治疗。短期的辅助减少治疗可以是术前和术后的。在一些实施方式 中，供者和受者是I型匹配的。
仍在进一步的具体实施方案中，其中抗原不是一种自身抗原而是一 种外来抗原(例如，花粉和海产品)，可以采用相似的策略。如果过敏是异 常T和B细胞克隆的一些机会性活化所引起的，那么去除T细胞和B细 胞的免疫抑制，以及随后的(和与之同时的)胸腺再活化将去除引起过敏应 答的细胞。因为过敏是异常T和B细胞克隆的机会性活化所引起的，那 么它就不像会再次出现，并且新再生的胸腺也可以生成调节T细胞。虽 然可能仍有自身反应性IgE循环在患者体内，但它们最终会消失，因为 有效地去除了分泌它们的细胞。一旦免疫系统已经被重建，可以停止性 类固醇清除治疗，并恢复患者的生育力。
本发明提供了用于治疗自身免疫性疾病的方法，该方法或者不进行 如在此所述的BMT、或进行BMT或使用GM细胞。本发明的方法还可 以包括器官和细胞移植以修复和取代受损的细胞、组织和器官。例如， 在IDDM中，患者可能需要胰岛细胞移植以取代受损的胰岛细胞。利用 本发明的方法可以实现对自身免疫性疾病的临床症状的预防，其中患者 有临床前症状和家族易感性。
在本发明的进一步的具体实施方案中，如果已知涉及自身免疫性疾 病和过敏的抗原，可以采用对HSC的遗传学修饰。例如，在多发性硬化 中，抗原可以是髓鞘糖蛋白(MOG)、髓鞘少突神经胶质蛋白、髓鞘碱性 蛋白和蛋白脂质蛋白。在恶性贫血中，抗原可以是胃的质子泵。在I型糖 尿病中，抗原可以是前胰岛素(J Clin Invest.(2003)111：1365.，GAD or an islet cell antigen.T cell epitopes of type II collagen have been described with rheumatoid arthritis in(Ohnishi etal.(2003)Int.J.Mol.Med.1：331)。对于桥 本氏甲状腺炎，抗原是甲状腺过氧化物酶，以及对于Graves病，抗原是 甲状腺刺激激素受体(Dawe etal.，(1993)Springer Semin.Immunopathol.14： 285)。系统性红斑狼疮抗原包括DNA、组蛋白、核糖体、snRNP、scRNP 例如H1组蛋白。特别的，Ro(SS-A)和La(SS-B)核糖核蛋白抗原(例如Ro60 和Ro52)与系统性红斑狼疮(SLE)及类风湿关节炎相关。重症肌无力抗原 包括乙酰胆碱受体α链和一些在Atassi eta l.，(2001)Crit.Rev.Immunol. 21：1中所描述的T细胞抗原决定簇。同样的，某些过敏反应是对已知抗 原的应答(例如在猫过敏中，对猫唾液抗原过敏)。在这些情况中，在被施 予给受体之前，可以首先将供者HSC遗传学修饰以表达抗原。根据它们 的CD34的表达可以分离出HSC。可以给患者一起施予这些细胞和增强 BM功能性的性类固醇介导的信号途径的抑制剂例如GnRH类似物。因 此，遗传性修饰的HSC不仅发育成DC并因此耐受新形成的T细胞，它 们还进入BM作为DC并删除新的、自身反应的和过敏的B细胞。因此， 在胸腺和骨髓中都实现了对自身抗原或过敏原的中枢耐受，据此缓解了 患者的自身免疫性疾病或过敏的症状。在一些具体实施方案中，也使用 免疫细胞耗竭和抑制。
在另一个用于耗竭高敏T细胞的实例中，当靶抗原为已知抗原时， 可以用编码需要对其耐受性的特异抗原的基因转染胸腺的上皮干细胞(例 如自体上皮干细胞)。通过用Ab MTS 24和它的人类对应物对胸腺上皮前 体细胞的标记可以将其从胸腺(特别是胚胎的胸腺)中分离出来(见Gill et al.，(2002)Nat.Immunol.3：635)。
因此，发明的基本原理是用T细胞和/或B细胞(如果合适)耗竭、随 后的重建新的耐受性的免疫系统终止正患有的自身免疫性疾病和预防高 度预测病例(例如家族性分布)发展为自身免疫性疾病。首先诊断自身免疫 性疾病，并确定是否存在家族(遗传)易感性。下一步，确定可能通过抗原 模拟和偶然的克隆活化所导致的自身免疫性疾病的患者内是否已经存在 近期的长时间感染。事实上确定疾病的病因可能是不可能的。下一步， 进行T细胞耗竭，以及如果合适，进行B细胞耗竭(和其他免疫细胞耗竭)， 联合化疗、放射治疗和/或抗B细胞试剂(例如，CD19、CD20和CD21) 或特异的Ig亚型的抗体(抗IgE)。通过给患者施予GnRH，提高了骨髓和 免疫细胞的功能性。与之同时注射HSC，HSC已经在体外被编码自身抗 原的基因所转染，HSC进入复壮的胸腺并转化为DC，以给发育中的T 细胞呈递自身抗原，据此诱导耐受性。所转染的HSC也将在骨髓内产生 抗原并将抗原呈递给发育中的B细胞，据此造成它们的删除，这与发生 于胸腺T细胞上的相似。免疫抑制方案(抗T、B治疗)的用法将克服预先 存在的潜在自身反应性T和B细胞的任何不适当的活化。此外，在无明 显的遗传易感性的情况中，GnRH可以联合G-CSF注射以增加血液中的 自体HSC的水平以增强胸腺再活化。
在一些实施方案中，将来自供者(如MHC相配的供者)的造血和淋 巴干细胞和/或祖细胞移植到受体体内以增加胸腺的最终的再生速度。在 另一个具体实施方案中，这些所移植的细胞来自无自身免疫性疾病或过 敏的健康供者，它们取代了患者的异常干细胞和/或祖细胞。
在一个实施方案中，通过清除患者的T细胞群至少部分消除了患者 的自身免疫性疾病。性类固醇介导的信号途径被阻断。在新的T细胞对 外周血的重新分群后，仍不能诱导对自身的耐受性的异常T细胞被从T 细胞群中清除。
在另一个实施方案中，通过相同的淋巴细胞耗竭治疗，并同时通过 对性类固醇介导的信号途径进行阻断而增强胸腺T细胞发育，以容许“干 净的”T细胞群对外周血流重新入住，消除了患者的引起过敏的免疫系统 细胞。在其他情况中，在阻断性类固醇信号途径之后，因为BM和其他 免疫细胞的功能性的增加缓解了过敏和自身免疫性疾病。
预防
本发明还提供了通过联合胸腺再活化，或者先于胸腺再活化或在没 有胸腺的再活化的情况下，增强BM和/或其他免疫细胞的功能性，以预 防感染、增加感染抵抗力、和治疗患者的感染的方法。在这个阶段，患 者的免疫系统被增强、复壮和再活化，据此增加了它对外来抗原例如病 毒和细菌的应答。例如，如用病毒(HSV)攻击所证实的那样，在图13-17 中显示了胸腺再活化对小鼠的免疫系统的作用。先前具有胸腺再活化的 小鼠表现出对HSV感染的抗性，而没有胸腺再活化(衰老的胸腺)的那些 小鼠有着更高水平的HSV感染。已知小鼠的免疫系统是非常类似于人的 免疫系统并被用作为人类疾病的模型。因此，小鼠的结果可以被用于显 示人类的应答。显示了胸腺再活化对人的作用的数据再次验证了这一点。 在实施例23中举例说明了增加免疫细胞的功能性的能力，其中最早到阉 割后3-7天以及在胸腺再活化之前增加了阉割小鼠的TCR的应答性和增 殖。
疫苗应答的提高
本说明书涉及“主动疫苗接种”的领域，其中将抗原施予给患者， 然后其免疫系统通过形成抗抗原的免疫应答应答于抗原。疫苗接种可以 包括预防性和治疗性疫苗。如本领域人员所知道的那样，使用本发明的 方法，实际上可以用任何疫苗接种的方法结合性类固醇抑制，不需过多 的试验。在一些实施方案中，可以先于胸腺再活化或与之同时给予疫苗 接种。按需也可以使用多个剂量(例如强化免疫接种)。
在一个实施方案中，疫苗是死的和或灭活的疫苗(例如经热火其他化 学物)。在另一个实施方案中，疫苗是减毒疫苗(例如脊髓灰质炎和天花疫 苗)。在一个实施方案中，疫苗是亚单位疫苗(例如乙型肝炎病毒疫苗、其 中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是抗原特异性蛋白)。
在另一个实施方案中，疫苗是重组疫苗。一种类型的重组疫苗是其 中病因(例如病毒)已经被删除了特异的引起病毒毒性的基因使得病毒为 无毒的减毒疫苗。另一种类型的重组疫苗采用了感染性的但无病毒毒性 的载体的用法，载体被遗传学修饰为插入了编码靶抗原的基因。重组疫 苗的实例是痘苗病毒疫苗。
仍在另一个具体实施方案中，疫苗是DNA疫苗。基于DNA的疫苗 通常使用细菌质粒在被接种的宿主中表达蛋白免疫原。用重组DNA技术 将编码相关免疫原的cDNA克隆到真核表达载体中。然后在细菌内扩增 疫苗质粒，并将其纯化、直接整合到被接种的宿主体内。可以通过针头 注射盐水中的DNA、或通过将DNA涂层的金珠输送到皮肤内的基因枪 设备接种DNA。本领域人员熟知并容易明白制备和使用这些疫苗的方法。
有一些能影响免疫应答的性能和程度的参数：抗原的水平和类型、 疫苗接种的部位、合适APC的利用度、个体的一般健康状况、以及T和 B细胞池的状态。其中，T细胞是最脆弱的，因为在青春期开始后变得显 著的性类固醇所诱导的明显的胸腺输出的减少和性类固醇对T细胞应答 的普遍抑制。仅仅当潜在的应答T细胞在呈递广泛的特异性组分的原初T 细胞的存在和存在正常的Th1对Th2细胞及Th到Tc细胞的比例上都是 最优化的时，逻辑上才能实施任何的疫苗接种项目。T细胞的类型有助于 支持免疫应答决定是否所生成的抗体是C’依赖性抗体及巨噬细胞非依赖 性的防御将被动员(1型应答)，或是否所生成的抗体是C’非依赖性抗体及 巨噬细胞依赖性的防御将被动员(2型应答)(综述见，Fearon and Locksley(1996)Science 272：50；Seder and Paul(1994)Annu.Rev.Immunol. 12：635)。传统上，1型应答与细胞毒T细胞的产生有关以及2型应答与 抗体的产生有关。因此，所生成的细胞因子的水平和类型也可以被放大 到足以应付所需的应答(例如，一些疾病要求Th1应答，一些要求Th2应 答，例如保护性免疫力)。这包括辅助地给予Th1和Th2型细胞因子(例 如，给予重组细胞因子和编码细胞因子的DNA)以变换患者的免疫应答模 式。免疫刺激性CpG寡核苷酸也已经被用于将对各种疫苗剂型的免疫应 答变换为更多的Th1型应答。
通过在此所述的方法，性类固醇抑制造成了BM和免疫细胞功能性 的增加，在没有胸腺再活化或先于胸腺再活化的情况下或与胸腺再活化 同时，它容许产生对疫苗的免疫应答性。
这个方法可以联合任何其他形式的免疫系统刺激，包括佐剂、附加 分子和细胞因子治疗。例如，有用的细胞因子包括，但不限定于作为普 通免疫生长因子的白介素2(IL-2)和IL-15、将应答偏向到Th2(体液免疫) 的IL-4、和将应答偏向到Th1(细胞介导的炎性应答)的IFNγ、促进Th1 的IL-12和促进Th2细胞的IL-10。附加分子包括但不限定于CTLA4的 抑制剂，它通过促进正常地被CTLA4所抑制的CD28/B7.1，B7.2刺激途径 增强了免疫应答。
重组基因表达载体可以被用于发明的疫苗接种方法。重组载体可以 是质粒或粘粒，它包含编码抗原的发明的多核苷酸，但也可以是病毒和 逆转录病毒。在多核苷酸疫苗中所用的载体可以是“裸的”(即不与转运 载体例如脂质体、胶状颗粒等相关)。为了方便起见，在本说明书中所用 的术语“质粒”将指的是质粒或粘粒，根据哪个是适合用于表达相关肽(其 中编码所需肽的基因的大小决定了两者之间的选择)。常用的质粒可以是 pBR322。
在本发明的疫苗接种方法中可以利用的各种病毒载体包括腺病毒、 疱疹病毒、痘苗病毒和RNA病毒例如逆转录病毒。逆转录病毒载体可以 使用小鼠和鸟逆转录病毒的衍生物。逆转录病毒的实例包括，但不限定 于莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMuS-V)、 小鼠乳房肿瘤病毒(MuMTV)和Rous肉瘤病毒(RSV)。其他可用于发明的 疫苗接种方法中的质粒和病毒载体在疫苗领域是熟知的。
对BM和HSC的作用
本发明提供了用于增加患者的BM的功能包括增加HSC的产生和增 强造血作用的方法。这些方法在多个应用中都是有用的。例如，无论是 用于癌症或其他的目的，化疗和放疗的其中一种困难的副作用就是它们 对患者BM的负性影响。根据化疗的剂量，BM可以被损伤或清除以及血 细胞的产生可以被阻碍。根据本发明，在化疗治疗后施予一个剂量的性 类固醇类似物(例如LHRH类似物)有助于化疗对BM和血细胞的损伤 的恢复。同样的，在给予化疗前数周施予LHRH类似物增加了HSC和其 他的血细胞群，使得减少了化疗的一些有害作用。
例如，BM功能的提高可以应用于患有血液疾病的患者。术语“血液 疾病”在此被定义为直接或间接地累及血液系统的细胞的任何疾病和病， 包括但不限于与造血相关的疾病例如白血病。因此，例如，本发明的方 法可用于在异基因HSCT中用来自受者的新细胞(匹配的和不匹配的)， 或在自体HSCT后用患者自己的细胞取代血液系统的癌细胞。
BM所增加的HSC产生引起了红细胞的增加，反过来它对处理RBC 产生是有用的。通过寻找例如增加的红细胞比容可以容易地确定出这一 点。
在一些实例中，所增加的HSC是CD34+或CD34lo HSC。所动员的 HSC(例如用G-CSF)能有助于“修复”和复壮组织例如心脏组织和肺组 织。HSC具有生成非造血组织的能力。虽然在体外已经进行了很多这方 面的工作，一项在Mayo Clinic Rochester的研究已经显示在BMT之后的 少量心肌细胞是供者来源的。相似的，密西根的Beuamont医院已经用 HSC修复受损的心肌，尽管HSC是否成为肌细胞和血管还不清楚。小鼠 试验也已经显示出HSC变成产胰岛素的β细胞的能力。其他工作已经显 示出HSC能成为骨骼肌(肌细胞)、肝脏(肝细胞)、骨骼、结缔组织、上 皮组织(例如肺、胃肠道和皮肤的上皮组织)、血管、神经元和胰岛β细胞。
在此所述的方法可用于修复对BM的损害和/或有助于取代已经被各 种治疗(例如癌症化疗药物、放射治疗)和疾病(例如HIV、慢性肾功能 衰竭)所损害或破坏的血细胞。
在一些化疗方案中，例如治疗任何血液肿瘤的大剂量化疗，对BM 的清除是必需的作用。在清除发生后可以马上使用发明的方法以刺激BM 并增加HSC和它们的子代血细胞的产生，以缩短患者的恢复时间。在施 予化疗之后，从患者体内清除化疗药物通常需要一天或更多天，给患者 施予在此所述的方法的一个剂量的LHRH类似物。这可以联合施予自体 或异基因BM或造血干细胞或祖细胞、以及其他的因子例如集落刺激因 子(CSF)和干细胞因子(SCF)。
或者，患者可以具有不好的(或“疲劳的”)BM功能并可能不能产 生足够多的或正常数目的HSC及其他的血细胞。多种病变都可以造成这 一点，包括正常的衰老、长时间的感染、化疗后、放疗后、慢性疾病状 态包括癌症、遗传异常和移植诱导的免疫抑制。另外，照射例如全身照 射可以对BM的生产能力有着重大影响。这些病变也可以或被预先治疗 以最小化负面作用(例如化疗和/或放射治疗的负面作用)，或在发生后被 治疗以逆转作用。
对T细胞的作用
通过摄取性类固醇介导的信号途径的阻断剂(例如GnRH激动剂) 可以暂时地抑制雄性和雌性的性类固醇。已知类固醇的缺失造成了胸腺 功能的再活化并增强了原初T细胞的产生。此外，甚至在那些新的T细 胞有机会离开胸腺之前，原有的T细胞对刺激是更为敏感的，造成了更 为有效的免疫应答。所增加的应答性在缺失性类固醇的数天内是明显的 (见，例如实施例23)。这可能是因为没有了性类固醇的抑制作用。这可 能是因为再活化的和被再活化的胸腺所产生的“辅助”和“辅佐”因子， 它们能联合外来刺激共刺激T细胞。也因为免疫系统的许多细胞都具有 GnRH的表面受体，GnRH本身可以给T细胞提供其他的刺激。因为性类 固醇的缺失对外周T细胞的作用是如此的快，可以与给予例如疫苗的同 时给予GnRH作为单次治疗。一个月的剂型是有用的，它具有刺激免疫 应答的好的作用但没有性类固醇的更长时间缺失的副作用。也可以施予 随后的抗原的“强化”注射。
性类固醇抑制剂(例如GnRH类似物)对于强化癌症患者的所有形 式的免疫治疗都是有用的，特别是对逃离化疗和手术的癌细胞的清除， 对预防抵抗机会性感染也是有用的。可以预防性使用这些类似物以提高 设计用于预防例如感染或癌症的疫苗接种计划的免疫应答。
本发明的方法利用了对性类固醇信号途径的抑制。性类固醇抑制了 胸腺、BM和全身的T及B淋巴细胞的功能，这些淋巴细胞聚集在身体 的主要淋巴区域内，包括但不限于血液、淋巴结、粘膜组织(例如呼吸道 的、胃肠道的和生殖道的)。已经惊奇地发现对性类固醇的清除和/或对性 类固醇介导的信号途径的阻断不仅可以被用于再生胸腺(以及因此的T 细胞的数目和“质量”)，还可以被用于或在没有胸腺再活化的情况下、 或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，提高原有的和新产生的T 细胞(和免疫系统的其他细胞)的功能性。
差的免疫应答可以有着快速的和临床重要的结果。这可以意味着对 常见感染(例如流感)的易感性增加、对癌症和肿瘤的易感性增加、和/ 或对疫苗接种的应答性差。
总T细胞池中的原初T细胞的数目和/或比例的增加对多种临床(亚 临床)病变和疾病都有着正面的快速的治疗作用，这些病变和疾病包括但 不限于癌症、免疫缺陷(特别是病毒感染，例如获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)和严重急性呼吸综合症(SARS)和流感)、自身免疫性、移植、 过敏以及提高疫苗接种计划的一般效率。在共拥有的和共同未决美国申 请No.10/418,747、10/419,039、10/418,953、10/418,727、10/419,066、和 10/419,068中都详细地描述了这些申请中的每个申请。
关于本发明的方法在预防病毒感染上的应用，在SARS病毒来临时 观察到了功能差的免疫系统的作用的新近实例。这个病毒尽管与感冒病 毒相关，但却是非常不同的，使得成熟的免疫系统不能识别它。仅仅原 初T细胞能对付先前未知的感染例如SARS。但是，因为只有少量的原初 T细胞以及不能产生合理的附加数量，一般成人都对该疾病高度易感，而 儿童似乎能对付这个疾病。在死亡率图上可以反映出这个人口统计学， 平均死亡年龄为近50岁，没有记录到青春期前的死亡病例。
在一个实例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类 似物)被用于强化T和B淋巴细胞对抗原刺激的应答性。这个刺激可以是 进入人体内的微生物(例如细菌、病毒、真菌、寄生虫等)。
在另一个实例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH 类似物)被用于增强对疫苗抗原的免疫应答。
在一个非限制性的实施例中，对性类固醇信号途径的抑制(例如用 LHRH/GnRH类似物)发生在免疫系统攻击之前。这容许出现性类固醇缺 失的时间。也可以与作用为用于直接增强免疫应答(经细胞表面的信号途 径介导，增加了细胞因子，减少了抑制物等)的刺激物的给药同时或依次 完成对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类似物)。也可以分 次给予对性类固醇信号途径的抑制(例如用LHRH/GnRH类似物)的快速 作用是因为增强了原有的淋巴细胞(和非淋巴细胞)的功能性。随着时间的 性类固醇的减少增加了T细胞、B细胞和APC的产生和功能性，它们累 加地、协同地和互补地持续增强应答。然后可以用新的T细胞、B细胞 和其他免疫细胞例如APC的增加以及原有T细胞、B细胞和APC对刺 激的敏感性的增加产生对原发感染、继发感染、疫苗接种等的更为有效 的免疫应答。
因此，根据本发明的方法，用性类固醇信号途径的阻断剂通过启动 这些免疫细胞的活性或功能性的增加引起了临床正向作用，甚至在这些 药物能引起显著的胸腺再活化之前。
根据本发明，这些药物也可以被用于有助于取代可能已经被各种其 他的治疗和疾病包括但不限定于癌症化疗药物、和/或放射治疗以及疾病 例如慢性肾功能衰竭所损伤和破坏的血细胞。如在此的其他地方所更详 细描述的那样，性类固醇抑制药物联合G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成 素(EPO)、SCF、或其他激素和细胞因子的用法也可以被用于进一步提高 对这些化合物增强血细胞产生的作用。
用语“修饰T细胞群组成”在此被定义为改变由功能性所定义的以 及通过特征性分子的表达所定义的T细胞亚组的性质和/或比例。这些特 征性分子的实例包括但不限定于T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、 CD28、CD44、CD45、CD62L和CD69。
“增加细胞的数目”，例如增加T细胞的数目，在此被定义为一个对 象中的胸腺和/或循环和/或脾和/或BM和/或外周组织例如淋巴结、胃肠 道、泌尿生殖道和呼吸道中的T细胞的数目的绝对增加。这个词也表示T 细胞的相对增加，例如当与B细胞比较时。
“具有受抑的或异常的T细胞群或功能的对象”包括人类免疫缺陷 病毒所感染的个体，特别是患有AIDS、或任何其他的攻击T细胞的病毒 或感染的个体，或患有已经鉴定出缺陷基因的任何T细胞疾病的个体。 此外，这个词包括任何的青春期后个体，特别是具有青春期后胸腺萎缩 所造成的免疫应答性的减低和疾病发病率的增加的老年人。
在对象感染有HIV的情况中，将HSC遗传性修饰使得它们和它们的 子代特别是T细胞、巨噬细胞和DC能耐受HIV病毒的感染和/或破坏是 有用的。遗传学修饰可以包括将一个或多个阻止病毒复制、装配和/或感 染的核酸分子引入到HSC内。这些核酸分子可以是编码抗病毒蛋白的基 因、反义构建体、核酶、dsRNA和催化核酸分子。
在对象具有缺陷T细胞的情况中，HSC可以被遗传性修饰使得缺陷 正常化。对于疾病例如T细胞白血病，修饰可以包括引入核酸构建体或 基因使得HSC正常化并抑制或减少它们成为癌细胞的可能性。
本领域人员明白本发明在治疗具有明确的遗传基础的任何T细胞疾 病中都可能是有用的。
本发明的方法对于治疗AIDS也是有用的，其中治疗包括减少病毒负 荷、增加T细胞数目和功能性、通过对性类固醇信号途径的抑制再活化 胸腺功能。患者可以接受已经被遗传性修饰的HSC，使得所有子代(例如 T细胞和DC)能耐受HIV的进一步感染。这意味着不仅患者被清除了HIV 病毒，而且患者不再易感于常见感染，因为T细胞已经恢复到正常水平， 而能耐受HIV的新的T细胞能去除任何残余病毒所感染的细胞。理论上， 相似的策略可以被应用于对任何T细胞缺陷和任何靶向于T细胞的病毒 感染的HSC的基因治疗。
对B细胞的作用
和其他的免疫系统的细胞一样，B细胞的功能随着年老也被减低了， 这部分是因为T细胞产生的减少和所造成的T细胞辅助的缺乏。但是， 也有着显著的年龄相关的B细胞功能的变化(Hu et al.，(1993)Int，Immunol. 5：1035-1039)。尽管因为牢固调节的内环境稳态机制，B细胞数目在整个 生命中仍是相对恒定的，但是减少了BM的输出、外周B细胞的克隆扩 增，以及免疫应答的减弱(LeMaoult et al.，(1999)J.Immunol. 162：6384-6391)。在老龄中对外来抗原的抗原应答的减低被认为主要是归 结于T细胞辅助的减少(Hu et al.，(1993)Int.Immunol.5：1035-1039， LeMaoult et al.，(I999)J.Immunol.162：6384-6391)。不过，类别转换缺陷 (Weksler et al.，(2000)Vaccine 18：1624-1628)以及高亲和力抗体的选择性 缺失可能有着作用(Nicoletti et al.，(1993)J.Immunol.150：543-549)。
对年老小鼠的阉割造成了IL-7敏感的B细胞祖细胞包括晚期原B细 胞、前B细胞和未成熟B细胞的增加(Ellis et al.，(2001)Int.Immunol.13： 553-558)。这种循环B细胞的增加大部分是因为新近BM迁出 (CD45RloCD24hi)数目的增加，并且这些细胞直到阉割后54天仍处于上升 的水平(Ellis et al.，(2001)Int Immunol.13：553-558)。
因此，可以在没有胸腺再活化或先于胸腺再活化的情况下或与胸腺 再活化同时，用本发明的方法增加B细胞的数目和功能性。这对于增加 对正常患者和有缺陷的免疫系统的患者例如那些接受疾病治疗方案的患 者中的细菌感染的控制(通过预防或治疗)可能是有用的。所增加的B细胞 数目和功能性在术后、和/或烧伤幸存者、和其中患者的免疫系统是受损 的其他情况中可能也是有用的。
对DC的作用
本发明也提供了增加DC功能性和/或DC数目的方法。在性类固醇 清除之后(例如给予LHRH类似物之后)，增加了胸腺和外周的DC，外周 DC可能也有助于T细胞刺激。DC是重要的抗原呈递细胞，所增加的数 目和/或功能在提高对病因例如癌症的应答性上可能是有用的。增强了的 DC功能性在实现对病因例如过敏原或自身抗原(对于自身免疫性疾病)的 耐受性上可能也是有用的。
对血小板的作用
本发明也提供了增加血小板数目和/或功能性的方法。血小板减少症 是常见的并有着多种病因，包括但不限定于贫瘠的BM和脾大。病变通 常造成非常难以治疗的出血性疾病。与血小板减少症相关的最常见的疾 病包括白血病、再生障碍性贫血、肝硬化和戈谢病。常常需要大量的血 液置换，因为用于输血的储存血中的血小板的半衰期很短。
对NK、NKT和Treg细胞的作用
本发明也提供了增加NK和NKT细胞的数目和/或功能性的方法(见 例如实施例17和图43及49)。这在对表现出NK缺陷的疾病例如克隆病、 Chediak-Highashi综合征的治疗上可能是有用的。在结缔组织病包括狼疮 和类风湿关节炎的患者中已经报告了受损的NK细胞功能。NK细胞在防 御癌症和感染性病因上是重要的。可能从发明的方法中受益的其他非限 制性的与NK细胞缺陷(数目的和/或功能的)相关的疾病包括疱疹病毒感 染(例如水痘-带状疱疹病毒(VZV、水痘、带状疱疹)、HSV、CMV和EBV)、 其他病毒感染(例如，麻疹、腮腺炎病毒、流感病毒和HIV，现在认为这 些都是至少部分被NK细胞所控制的)、分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌、 鸟型分枝杆菌，这些明显受NK和巨噬细胞的控制)、其他恶性肿瘤(例如， 实体瘤包括黑素瘤、乳腺癌和直肠癌)、用单倍体相同或不匹配的受者对 急性髓系白血病的BMT。NKT细胞是免疫应答的重要调节物，因为它们 是细胞因子的非常高产量的生产者，且不需要预先的活化。它们不仅在 预防自身免疫性疾病上有着作用，也促进了抗癌作用。Treg(常被定义为 CD4+CD25+)也是免疫应答的主要调节物，主要是通过它们的细胞因子产 物。
巨噬细胞
本发明也提供了用于增加巨噬细胞数目和功能的方法(见，例如实施 例17和图43)，它在帮助去除感染性病因特别是细菌上发挥着主要作用。
实施例
下面的实施例部分提供了发明的方法的具体实施例，但其不能被解 释为将发明限制为实施例的内容。
实施例1：逆转衰老造成的胸腺萎缩
材料和方法
动物：从Monash大学的中心动物服务处得到CBA/CAH和C57B16/J 雄性小鼠，并将其在常规条件中圈养。从Monash大学的中心动物服务处、 Walterand Eliza Hall医学研究研究所(Parkville，Vicotoria)和A.R.C. (Perth，Western Australia)得到C57B16/J Ly5.1，并将其在常规条件中圈 养。年龄从4-6周到26个月大不等，在相关的地方会指示出年龄。
手术阉割：经腹腔注射0.3ml 0.3mg甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NS W，Australia)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar_； Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)的盐水溶液将小鼠麻醉。通过阴 囊切口进行手术阉割：显露睾丸，用缝线将其结扎，然后与外周脂肪组 织一起将其取出。用手术订关闭伤口。假阉割就是在上述步骤后没有取 出睾丸，并被用作为所有研究的对照。
溴代脱氧尿苷(BrdU)掺入：小鼠接受了两次BrdU(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的腹腔内注射，每次剂量为100μl PBS内的100mg/kg 体重的BrdU，隔开4小时(即4小时的间隔)。对照小鼠只接受载体注射。 在第二次注射1个小时后，切开胸腺，或制成细胞悬浮液用于FACS分 析，或即刻将其包埋在Tissue Tek中(O.C.T.compound，Miles Inc.， Indiana)，在液氮中瞬间冷冻并在储存-70℃直到使用。
流式细胞术分析：用CO2窒息处死小鼠，并取出胸腺、脾和肠系膜 淋巴结。经一个200μm筛在冷PBS/1％FCS/0.02％Azide轻轻地洗涤器官， 离心(650g，5分钟，4℃)，并重悬于任一的PBS/FCS/Az中。将脾细胞 在红细胞裂解缓冲液中4℃孵育10分钟，洗涤并重悬于PBS/FCS/Az中。 利用血细胞计数器和溴化乙啶/吖啶橙以及在荧光显微镜(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下的观察重复测定细胞浓度和活力。
对于三色免疫荧光，用抗αβTCR-FITC、抗CD4-PE和抗CD8-APC(都 购自Pharmingen，San Diego，CA)标记细胞，随后是流式细胞术分析。或 用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或用B220-B(Sigma)和CD4-PE及 CD8-APC标记脾和淋巴结悬浮液。用购自Caltag Laboratories，Inc.， Burlingame，CA的抗生物素蛋白链菌素-三色结合体(conjugate)显示出 B220-B。
对于细胞的BrdU检测，用CD4-PE和CD8-APC表面标记细胞，随 后是如前所述的固定和透化作用(Carayon and Bord，(1989)J.Imm.Meth. 147：225)。简单地，将染色细胞在4℃，1％多聚甲醛(PFA)/0.01％ Tween-20中固定过夜。将洗涤后的细胞在500μl DNA酶(100Kunitz units， Roche，USA)，37℃下孵育30分钟以变性DNA。最后，将细胞与抗 BrdU-FITC(Becton-Dickinson)在室温下孵育30分钟，洗涤并重悬细胞 用于FACS分析。
对于TN亚组的BrdU分析，将细胞全体设门在APC的Lin细胞之 外，随后在BrdU检测之前检测CD44-生物素和CD25-PE。所有的抗体都 来自Pharmingen(San Diego，CA)。
对于四色免疫荧光，将胸腺细胞标记CD3、CD4、CD8、B220和 Mac-1，用抗鼠Ig-Cy5(Amersham，U.K.)共同检测，并设门分析阴性细 胞(TN)。它们还被染色CD25-PE(Pharmingen，San Diego，CA)和CD44-B (Pharmingen，San Diego，CA)，随后是如前所述的抗生物素蛋白链菌素-三 色(Caltag，CA)(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14：547)。然 后如上所述的进行BrdU的检测。
在FACSCaliburTM(Becton-Dickinson)上分析标本。根据0度和90 度散射光数值将不同的淋巴细胞设门，并用CellQuestTM软件 (Becton-Dickinson)分析数据。
免疫组织学：用恒冷切片机(Leica)切割出冷冻的胸腺切片，并将 其马上固定于100％丙酮中。
对于两色免疫荧光，用一组单克隆抗体双染切片：在该实验室所产 的MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey et al.，(1990) Immunol.70：66；表1)，以及用多价的兔抗细胞角蛋白抗体(Dako， Carpinteria，CA)测定上皮细胞决定物的共表达。用FITC结合的羊抗鼠 Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示出所结合的mAb，以及用 TRITC结合的山羊抗兔Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示 出抗角蛋白抗体。
对于切片的BrdU检测，或用抗角蛋白抗体和紧接着的抗兔TRITC 或用能用抗鼠Ig-Cy3(Amersham，Uppsala，Sweden)所显示出的特异的 mAb染色切片。然后如前所述进行BrdU检测(Penit et al.，(1996)Proc. Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。简单地，将切片在70％乙醇中固定30分 钟。将半干的切片孵育于4M HCl中，通过在硼酸缓冲液(Sigma)中洗 涤中和，随后是在PBS中洗涤两次。用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson) 检测BrdU。
对于三色免疫荧光，用特异的MTS mAb和抗角蛋白抗体一起标记切 片。然后如上进行BrdU检测。
用Leica荧光和Nikon共聚焦显微镜分析切片。
迁移研究(即对新近胸腺迁出(RTE)的分析)：经腹腔注射0.3ml 0.3mg甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia) 的盐水溶液将小鼠麻醉。
对FITC标记胸腺细胞的技术细节与其他地方所描述的那些计数相 似(Scollay et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547；Berzins et al.， (1998)J.Exp.Med.187：1839)。简单地，暴露出胸腺叶，每叶注射近10μl 350μg/ml FITC(PBS中)。用手术订关闭伤口。加温小鼠直到从麻醉中完 全复苏。在注射后近24个小时，用CO2窒息处死小鼠，并取出淋巴器官 进行分析。
在细胞计数之后，用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色标本，然后用流 式细胞术分析。迁移细胞被识别为表达CD4或CD8的活(live)的设门 的FITC+细胞(以略去自发荧光的细胞和双联体)。加入FITC+CD4和 CD8细胞的百分比以分别给淋巴结和脾提供总的迁移百分比。如Berzins et al.，((1998)J.Exp.Med.187：1839所描述的进行对每日输出率的计算。
使用非成对的学生t检验或非参数的Mann-Whitney U检验所分析的 数据被用于确定对照和至少进行过三次的试验的测试结果之间的统计学 显著性。用下面的表示试验数值与对照熟知有着显著差异：*p≤0.05；**p ≤0.01和***p≤0.001.
结果
I.年龄对胸腺细胞群的作用
(i)胸腺重量和胸腺细胞数目
随着年龄的增加，小鼠的胸腺重量(图1A)和总的胸腺细胞数目(图 1B)都有着非常显著的下降(p≤0.001)。年轻成体的相对胸腺重量(mg 胸腺/g身体)的平均值为3.34，而18-24个月的小鼠就下降到0.66(脂肪 的沉积限制了精确的计算)。胸腺重量的下降可以归结于总的胸腺数目的 减少：1-2个月大(即年轻成体)的胸腺含有约6.7×107胸腺细胞，到了 24个月时减少到了约4.5×106。通过阉割去除了性类固醇对胸腺的作用， 恢复了胸腺细胞的数目，在阉割后4周时，胸腺在重量(图1A)和细胞 密度(图1B)上都等于年轻成体。有趣的是，在阉割后2周时，显著地 增加了胸腺细胞数目(1.2×108)(p≤0.001)，到了阉割后4周时，胸腺数 目恢复到了正常的年轻小鼠的水平。
在外周没有反映出胸腺所产的T细胞数目的减少，脾细胞数目随着 年龄仍是恒定的(图2A和2B)。外周的内环境稳态机制是显而易见的， 因为脾和淋巴结的B细胞对T细胞的比例不受年龄的影响，以及到达外 周的T细胞数目的随之减少(图2C)。但是，CD4+对CD8+T细胞的比 例随着年龄显著下降，从2个月大时的2∶1到2岁大时的1∶1(图2D)。在 阉割以及到达外周的T细胞数目随之增加之后，没有观察到外周T细胞 数目的变化：脾T细胞数目和脾及淋巴结的B∶T细胞的比例随着阉割都 没有改变(图2A-C)。随着年龄减少的外周的CD4∶CD8比例在阉割后2 周仍是明显减低的，但是到了阉割后4周就完全恢复了(图2D)。
(ii)随着年龄和阉割后的胸腺细胞亚群
为了确定所看到的胸腺细胞数目随着年龄的减少是否是特异的细胞 群的耗竭的结果，用特定的标记物标记胸腺细胞以分析不同的亚群。另 外，这容许对阉割后的胸腺复群的动力学的分析。将主要胸腺细胞亚群 的比例与那些年轻成体(2-4个月)的胸腺的细胞亚群比例进行比较(图 3)，发现该比例随着年龄仍保持一致。另外，通过αβTCR的表达对胸腺 细胞的进一步亚组分型发现这些群的比例随着年龄没有变化。在阉割后2 周和4周时，胸腺细胞亚群仍为相同的比例，虽然阉割后的胸腺细胞数 目增加了100倍，这说明是所有胸腺细胞亚组的同步扩增，而不是不同 进度的扩增。
因此，在年老(2岁)动物的胸腺中所见的细胞数目的减少表明是所 有细胞亚型的平衡减少，并没有所检测的T细胞群的显著变化。胸腺再 活化以同步的方式出现，同时而不是依次再补充所有的T细胞亚群。
II.胸腺细胞的增殖
如图4A-4B所示，在2-4个月时，有15-20％的胸腺细胞正在增殖。 这些细胞中的大部分(约80％)是双阳性的(DP)(即CD4+CD8+)，以及 三阴性(TN)(即CD3-CD4-CD8-)亚组构成了占约6％的第二大群(图 5A)。这些TN细胞是胸腺内的最不成熟的细胞并包括胸腺内前体细胞。 因此，免疫组织学可见绝大多数的分裂在包膜下和皮质中。一些分裂可 见于FACS分析所定位的髓质区域，FACS分析显示了年轻(2个月)的、 分裂的胸腺的单阳性(即CD4+CD8-或CD4-CD8+)细胞的比例(9％ CD4+T细胞和25％CD8+T细胞)(图5B)。
尽管年老小鼠胸腺(2岁大)内的细胞数目被限制地减少了，增殖的 胸腺细胞的总比例仍是恒定的(图4B和5C)，但是CD4-CD8-中的分裂 细胞的比例有着下降，以及也显著地减少了CD4-CD8+T细胞的增殖(数 据没有显示)。免疫组织学显示分裂细胞在1岁时的分布反映了在年轻成 体(2-4个月)中的所见，但是，到了2岁时，增殖主要见于皮质外层以 及在血管外周，在髓质内的分裂很少。
最早到阉割后1周时，有着增殖的CD4-CD8-细胞和CD4-CD8+细胞 的比例的显著增加(数据没有显示)。阉割明显克服了年龄对这些细胞的 增殖的阻断。阉割后有着增殖CD4+CD8-细胞的相应的比例下降(数据没 有显示)。在阉割后2周时，尽管显著地增加了胸腺细胞数目，但是正在 增殖的胸腺细胞的总比例没有变化，在此说明了细胞的同步扩增(图4A、 4B和5C)。免疫组织学显示了阉割后2周时的胸腺细胞扩增的位置和分 裂细胞的程度都接近于2个月大的胸腺的状态。
除了胸腺前体细胞外，DN亚群还包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞， 认为它们在转化为SP细胞的过程中，已经都下调了两种共受体(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14：547)。通过对这些成熟细胞的设门， 分析真正的TN部分(CD3-CD4-CD8-)和它们的表达CD44及CD25的 亚群是有可能的。图5E-H说明了年轻、年老和阉割小鼠中的每个TN亚 组内的增殖程度。这显示了TN1亚组(CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-)的 增殖的显著减低(p＜0.001)，从正常年轻小鼠中的10％到18个月大的约 2％(图5)，在阉割后1周就恢复了。
III.胸腺细胞迁出
在年轻小鼠中，每天都有近1％的T细胞从胸腺内迁出(Scollay et al.， (1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。发现阉割小鼠发生迁出的比例 率等于14个月大的正常年轻小鼠以及甚至2岁大的小鼠，尽管数目上已 经被显著地减少了(p≤0.0001)(图6A和6B)。新近胸腺迁出的CD4∶CD8 比例有所增加，从2个月大的3∶1到26个月大的7∶1(图6C)。在阉割后 1周时，该比例已经正常化(图6C)。到阉割后2周时，迁出到外周的细 胞数目已经显著增加，总的迁出率减少到了0.4％，这反映了胸腺的扩增 (图6B)。
讨论
已经显示衰老的胸腺尽管是严重萎缩的，但随着年龄仍保持着它的 功能能力，发生T细胞增殖、分化和迁出的水平等于年轻成体小鼠。尽 管胸腺功能受神经-内分泌-免疫轴中间的一些复杂的相互作用的调节，但 是阉割后的胸腺再活化的程度说明了性类固醇产生所诱导的萎缩有着最 显著的和长时间的作用。
如前所示，胸腺重量随着年龄被显著的降低了(Hirokawa and Makinodan，(1975)J.Immunol.114：1659，Aspinall，(1997)J.Immunol.158： 3037)，这与胸腺细胞数目的显著减少有关。阉割操作所诱导的应激可以 因为糖皮质激素的作用造成胸腺的进一步的萎缩，这一点可以被在阉割 后2周对性类固醇去除的影响所忽略，它使得胸腺的细胞密度增加到了 阉割前的20-30倍。到了阉割后3周，衰老的胸腺显示出胸腺大小和细胞 数目上的显著增加，优于年轻成体的胸腺，预测是因为性类固醇已经对2 个月大的小鼠本身所施加的作用。
数据确认了先前的发现，注重于胸腺随着年龄持续分化并保持恒定 的亚组比例的能力(Aspinall，(1997)J.Immunol.158：3037)。另外，胸腺 细胞分化已经显示与阉割后同时发生，说明了胸腺细胞亚组的同步扩增。 因为胸腺细胞数目随着年龄的显著减少，分析了胸腺细胞的增殖以确定 它是否是胸腺萎缩的引发因素。
年龄诱导的胸腺萎缩或阉割后对性类固醇去除的影响都没有影响到 胸腺细胞的增殖，约所有胸腺细胞的14％是正在增殖的。但是，这种分 裂的位置随着年龄而所有不同：2个月大小鼠胸腺显示出整个包膜下和皮 质区域内的丰富的分裂(TN和DPT细胞)，以及也有着一些分裂发生在 髓质。因为胸腺上皮结构随着年龄的瓦解，增值的位置是难以区别的， 但表现为比年轻的小鼠更少统一的模式，并移行到皮质外层。在阉割后2 周时，分裂细胞在整个皮质中都能检测到，以及在髓质内是明显的，有 着与2个月大的胸腺相似的分布。
如用CD4和CD8分析所确定的增殖群的表型没有随年龄和阉割后而 改变。但是，对胸腺亚群内的增殖的分析发现TN和CD8+细胞的增殖随 年龄的显著减低。根据标记物CD44和CD25对T细胞亚组内的进一步 分析发现了TN1(CD44+CD25-)群增殖的显著减低，通过TN2 (CD44-CD25+)群的增加弥补了这一点。TN群内的这些异常反映了 Aspinall((1997)J.Immunol.158：3037)的发现。惊奇的是，到阉割后2 周时，TN亚组以正常水平增殖，这说明了该群对性类固醇作用的抑制的 快速反应。另外，在阉割后2周和4周时，增殖的CD8+T细胞的比例要 明显高于对照胸腺，可能说明了它们在外周T细胞池的建立中的作用。
显示随着年龄，恒定比例的胸腺细胞发生了胸腺迁移，这一点与 Scollay et al.，((1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)的先前的数据 矛盾，他们显示胸腺细胞迁移到外周的迁移率的10倍的减少。这些结果 的差异可能是因为对2岁大的胸腺的胸腺内FITC标记的难度或脂肪沉积 对FITC摄取的作用。但是，如Scollay所发现的一样，迁移的T细胞的 绝对数目被显著地减少了，造成了RTEs到外周T细胞池的比例的显著减 低。这将造成外周主要影响T细胞库的改变(Mackall et al.，(1995)N.Eng. J.Med.332：143)。先前的文章(例如，Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med. 332：143)已经显示T细胞库随着年龄偏倚向记忆而不是原初T细胞表 型。但是如果个体遇到了新的抗原，被缩小的T细胞库可能不能应付， 这可能造成年老者中的免疫缺陷。显而易见的是，有着重建免疫功能不 全的个体中的T细胞池的需要。阉割容许胸腺通过显著地增加原初T细 胞的产量而实现外周再生。
如脾和淋巴结的B∶T比例所显示的，外周的T细胞数目仍为恒定水 平，可能是因为外周的内环境稳态。(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med. 332：143；Berzins et al.，(1998)J.Exp.Med.187：1839)。但是，对外周细 胞组成的干扰随着衰老的胸腺是明显的，表现为CD4∶CD8比例的显著下 降，从年轻成体的2∶1到2岁小鼠的1∶1，可能说明了CD4+T细胞对年 龄的更为敏感的性能或胸腺外来源的CD8+T细胞产生的增加。到了阉割 后2周时，这个比例已经被正常化，在此反映了免疫系统对手术阉割的 快速应答。
上述发现已经首次显示了衰老的胸腺能行使功能，其性质等同于青 春期前胸腺。在这个方面，虽然T细胞数目被显著地减少了，但胸腺细 胞分化的能力却没有被阻断。它们的总的增殖和最终迁移到外周的能力 也不受年龄相关的胸腺萎缩的影响。但是，注意到了两个重要的发现。 第一，在对T细胞增殖能力上显示出对T细胞的有害作用，这与Aspinall ((1997)J.Immunol.158：3037)的发现相关。这个缺陷可以归结于胸腺细 胞本身的内在缺陷。仍在此显示的数据以及先前的工作已经显示尽管胸 腺细胞的分化有所减少但仍有发生，以及来自BM的干细胞的迁入不受 年龄的影响(Hirokawa，(1998)，″Immunity and Ageing″in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd；Mackall and Gress，(1997)ImmunoL Rev.160：91)。第二，随 着年龄显著地减少了CD8+T细胞的增殖能力，以及在阉割后、与2个月 的小鼠比较，显著地增加了增殖CD8+T细胞的比例。成熟T细胞的增 殖被认为是迁移前的最后步骤(Suda and Zlotnik，(1991)J.Immunol.146： 3068)，因此CD8+增殖的显著减少可能说明它们的迁移能力的减低。 RTEs中的CD4∶CD8T细胞比例随着年龄的增加的发现支持了这种假说， 这提示了迁移的CD8T细胞的减少。同样的，如果胸腺上皮给CD8T细 胞维持提供了关键因素，无论是淋巴间质分子或细胞因子的影响，通过 增加的性类固醇产生可能阻断了这个因素。通过去除性类固醇的影响， 可以在此最优化地增殖CD8T细胞群。
所观察到的TN1亚组的增殖缺陷提示皮质上皮的缺失影响胸腺细胞 在TCR基因重排的关键阶段上的发育，其中皮质上皮提供了胸腺细胞生 成所必需的因子例如IL-7和SCF(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol. Today 14：547；Aspinall，(1997)J.Immunol.158：3037)。事实上，IL-7-/-和 IL-7-/+小鼠显示出与在年老小鼠中所见的相似的胸腺形态(Wiles et al.， (1992)Eur.J.Immunol.22：1037；Zlotnik and Moore，(1995)Curr.Opin. Immunol.7：206)；von Freeden-Jeffry，(1995)J.Exp.Med.181：1519)。
总而言之，衰老的胸腺仍保持它的功能能力，但是年老小鼠中的胸 腺细胞的发育不处于在正常年轻小鼠中所见的胸腺上皮细胞的严格控制 之下，这是因为胸腺微环境的结构完整性的缺失。因此，这些细胞的增 殖、分化和迁移将不在最优化的调节之下，并可能造成增加了外周的自 身反应性/免疫功能不全的T细胞的释放。TN以及特别是CD8+群内的缺 陷都可能造成在外周T细胞池内的随年龄的变化。阉割对胸腺功能的重 建将提供了一种用于再生外周T细胞池并因此用于重建免疫抑制的、免 疫缺陷的、或免疫失代偿的个体的重要工具。
实施例2：逆转化疗或放疗诱导的胸腺萎缩
材料和方法
材料和方法是如在实施例1中所描述的那样。另外，使用了以下的 方法。
BM重建：受者小鼠(3-4个月大的C57BL6/J)接受了5.5Gy照射两 次，间隔3个小时。在第二次照射剂量后1个小时，给小鼠静脉内注射 5×106供者BM细胞。通过将RPMI-1640培养基流经供者(2个月大的同 系的C57BL6/J Ly5.1+)小鼠的胫骨和股骨，然后收获在培养基中所收集 到的细胞得到BM细胞。
照射：3-4个月大的小鼠接受625Rad的全身照射。
使用环磷酰胺的T细胞耗竭：给年老小鼠(例如2岁大)注射环磷酰 胺(200mg/kg体重，2天内)并将其阉割。
结果
阉割增强了严重T细胞耗竭(TCD)后的再生。对于两种所研究的T 细胞耗竭的模型(使用环磷酰胺的化疗或使用625Rad的亚致死照射)，与 它们的假阉割(SHCx)的对照比较，阉割小鼠都显示出胸腺再活化率的 显著增加(图7A和7B)。到了治疗后1周，阉割小鼠甚至在早期就显示 出胸腺的再生(图7和9-11)。在比较中，未阉割动物显示出DN和DP 胸腺细胞(快速分裂细胞)的严重缺失以及随后的CD4和CD8细胞(耐 放射的)比例的增加。与甚至在治疗后1周就显示出胸腺大小至少增加4 倍的阉割后动物的胸腺细胞数目的差异最好地例证了这一点。在2周时， 未阉割动物显示出相对的胸腺细胞的正常化，伴有DN和DP胸腺细胞的 再生。但是，胸腺细胞的比例仍没有等同于年轻的成体对照的胸腺。事 实上，在2周时，阉割和未阉割小鼠之间的调节率之间的巨大差异是最 大的(到4周时，治疗组之间的胸腺细胞的数目相同)。
在环磷酰胺治疗1周后，SHCx小鼠的胸腺细胞密度要显著地少于对 照(未治疗的、年龄匹配的；p≤0.001)和Cx小鼠(p≤0.05)(图7A)。 在这个时间点上，1周前阉割的小鼠和与治疗同一天阉割的小鼠之间没有 观察到胸腺再活化率上差异，两组都显示出它们的细胞数目至少是SHCx 小鼠的两倍(图7A和7B)。相似的，在环磷酰胺治疗后2周时，两组Cx 小鼠具有比SHCx小鼠显著更高的(5-6倍)胸腺细胞的数目(p≤0.001) (图7A)。在对照小鼠中，在4周时间内逐渐恢复了胸腺细胞数目，但是 阉割明显增强了这一点，甚至在1周内(数据没有显示)。在阉割后1周， 相似地增加了阉割小鼠内的脾和淋巴结的细胞数目(数据没有显示)。
通过在照射前1周(图10)或与照射同一天(图11)的阉割检测了阉 割时机对胸腺恢复的作用。当在1周前进行阉割时，阉割对胸腺恢复具 有更快的作用(图10A与图11的比较)。在2周时，同一天的阉割已经“赶 上了”在治疗前1周阉割的小鼠中的胸腺再活化。在两种情况中，各自 对脾或淋巴结都没有大的作用(图10B和10C、及图11B和11C)。
在照射之后，都在与治疗同一天被假阉割和阉割的小鼠显示出胸腺 细胞密度要显著地少于对照小鼠(p≤0.001)(图7B和11A)和在治疗前1 周被阉割的小鼠(p≤0.01)(图7B)。在治疗后2周时，阉割方案对胸腺细 胞数目的恢复没有区别，两组阉割小鼠都表现出照射后的胸腺细胞比 SHCx小鼠中的显著增强(p≤0.001)(图7B、10A和11A)。因此，阉割 显著地增强了严重T细胞耗竭后的胸腺再活化，可以在先于免疫系统受 损前至少1周进行阉割。
有趣的是，胸腺大小表现出“超过了”对照胸腺的基线。这提示了 胸腺内的快速扩增，这些新形成的胸腺细胞还没有迁移(胸腺细胞需约 3-4迁出并进入外周)。因此，尽管在被释放到外周之前每个亚群内的比 例是相同的，但是建立了胸腺细胞的数目。
在对年轻小鼠(约2-3个月大)环磷酰胺处理之后，尽管减少了Cx 小鼠的脾内的总淋巴细胞数目，但是在整个分析的时相内与对照小鼠都 没有显著的差异(数据没有显示)。但是，ShCx小鼠在治疗后1周和4周 都显示出总脾细胞数目的显著减少(p≤0.05)(图8A)。在淋巴结内，在治 疗后1周，假阉割和阉割小鼠内都观察到了细胞密度的显著减少(p≤0.01) (图8B)，可能反映了应激类固醇的影响。到治疗后2周时，阉割小鼠的 淋巴结细胞密度与对照小鼠相当，但是假阉割小鼠直到治疗后4周也没 有恢复它们的淋巴结细胞数目，其细胞密度要显著地少于(p≤0.05)对 照和治疗后2周的Cx小鼠(图8B)。这些结果表明阉割可以增强总淋巴 细胞数目在环磷酰胺治疗后的恢复的速度。
亚致死照射(625Rad)诱导了严重的淋巴细胞减少，这样在治疗后1 周时，治疗组(Cx和SHCx)部显示出脾和淋巴结的细胞密度要显著地少 于(p≤0.001)对照小鼠(图12A和12B)。到照射后2周时，阉割和假阉 割小鼠的脾细胞数目与对照值相似(图12A)，而淋巴结细胞数目仍显著 地低于对照值(假阉割小鼠p≤0.001；阉割小鼠p≤0.01)(图12B)。在 Cx和ShCx小鼠之间没有观察到显著差异。
图19举例说明了化学阉割的用法与手术阉割在增强T细胞再生上的 比较。注射在这个实施例中所用的化学物地洛瑞林(LHRH-A)4周，并 显示出环磷酰胺治疗后的再生速度与手术阉割的相当。增强作用在胸腺 扩增上是相等的，在脾和淋巴结的恢复上也是相等的。化学阉割的动力 学比手术慢，也就是说，小鼠需要花约3周以上的时间降低它们的性类 固醇水平。但是，化学阉割仍与手术阉割一样有效，可以认为是具有相 同的作用。
讨论
在免疫耗竭的动物模型中探讨了阉割对胸腺的结构和T细胞产生的 影响。具体的，实施例2检查了阉割对亚致死照射和环磷酰胺治疗后的 免疫系统的恢复的作用。这些形式的免疫耗竭作用于抑制DNA合成并因 此靶向于快速分裂的细胞。在胸腺中，这些细胞是非常不成熟的皮质胸 腺细胞，但是所有的亚组都受到了影响(Fredrickson and Basch，(1994) Dev.Comp.Immunol 18：251)。在正常健康的年老动物中，外周T细胞的 定量及定性的差异很少导致病理状态。但是，在T细胞的严重耗竭之后 出现了严重的问题，因为减少了胸腺的T细胞再生的能力。这些结果发 生在HIV/AIDS中，特别是在癌症治疗的化疗及放疗后(Mackall et al.， (1995)N.Eng.J.Med.332：143)。
在亚致死照射和环磷酰胺治疗的小鼠中，阉割明显增强了胸腺再活 化。为了评价主要是糖皮质激素诱导的作用、手术阉割对胸腺再活化的 应激应答，在免疫耗竭的同一天以及7天之前进行阉割。尽管最早到免 疫耗竭后的1周就看到了胸腺细胞密度和组织结构的增加，但是在阉割 后2周观察到了较大的差异。这是是否在免疫耗竭的同一天或1周前进 行阉割的情况。
免疫组织学证实，在所有情况中，阉割后2周的胸腺组织结构表现 为表型正常的，而未阉割小鼠的组织结构被瓦解了。全上皮标记物表明 免疫耗竭引起了皮质上皮的塌陷和对未阉割小鼠的胸腺中的胸腺组织结 构的普遍阻断。髓质标记物支持这个发现。有趣的是，阉割诱导的再生 的其中一种首发特征是MTS 16所鉴定的细胞外基质的明显上调。
流式细胞术分析数据表明了阉割小鼠内的所有胸腺细胞亚组的细胞 数目的显著增加。在每个时间点上，有在免疫耗竭和阉割后的所有CD4、 CD8和αβTCR所定义的亚组的同步增加。这是罕见的但一致的结果，因 为T细胞发育是一个进行性的过程，预计将有着前体细胞(包含在 CD4-CD8-门内)的最初增加以及它可能发生在第一个时间点之前。而且， 因为前体细胞代表着非常小比例的总胸腺细胞，可能没有检测到在它们 的数目上的转换。也分析了阉割对其他细胞包括巨噬细胞和粒细胞的作 用。通常，胸腺内的巨噬细胞和粒细胞数目只有很小的变化。
在免疫耗竭的照射和环磷酰胺的模型中，胸腺细胞数目都在治疗后2 周达到高峰并在4周后减少。几乎在或化疗后的即刻，胸腺重量和细胞 密度戏剧化地减低并在近5天后开始胸腺再活化的第一期。耐照射的胸 腺细胞的再生引起了重建的第一波(第5-14天)，它可生成所有的胸腺亚 组(Penit and Ezine，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：5547)。在第16和 22天之间所观察到的第二个减低是因为耐放射的细胞的受限的增殖能力 伴有BM减少了胸腺前体细胞的产生(也受照射的影响)。第二个再生期 是因为BM起源的前体细胞对胸腺的再补充(Huiskamp et al.，(1983) Radiat.Res.95：370)。
在成体小鼠中，从HSC到成熟T细胞的发育要花近28天(Shortman et.al.，(1990)Sem.immunol.2：3)。因此，一直到治疗后4周才看到外周T 细胞的很小变化。外周受一些胸腺输出的支持，但预计一直到治疗后4 周在外周所发现的T细胞的大部分是增殖的耐环磷酰胺或照射克隆在不 存在被耗竭细胞时的扩增。预计阉割后的外周的一些长期变化包括最重 要的胸腺输出增加所引起的TCR库的多样化。
实施例3：抑制性类固醇后的胸腺再活化使得有缺陷的外周T细胞功能恢 复
材料和方法
材料和方法如实施例1和2中所描述的。另外，使用了下面的方法。
HSV-1免疫接种：手术阉割年老(≥18个月)小鼠。在阉割后6周(胸 腺再活化后)。麻醉后，用20号针头在小鼠后肢上注射无菌PBS中的4×105 噬斑形成单位(pfu)的HSV-1(KOS株)。将感染后的小鼠圈养在独立的 笼子中，并在免疫接种后第5天以人道的方式处死小鼠，同时取出腘(引 流)淋巴结用于分析。
病毒来自Assoc.Prof.Frank Carbone(Melbourne University)。将病毒 储存株生长并滴定于加有5％FCS(Gibco-BRL，Australia)的MEM中的 VERO单层细胞上。
在感染后第5天进行对引流(腘)淋巴结的分析。对于HSV-1研究， 用抗CD25-PE、抗CD8-APC和抗Vβ10-生物素染色腘淋巴结细胞。对于 DC的检测，在用CD45.1-FITC、I-Ab-pE和CD11c-生物素染色之前使用 FcR阻断。用抗生物素蛋白链菌素-PerCP检测所有的生物素化的抗体。 对于HSC的检测，通过用抗CD3、CD4、CD8、Gr-1、B220和Mac-1(所 有的都与FITC结合)共同染色将BM细胞设门于Lin-细胞。通过用 CD11c-APC和Sca-1-PE的染色检测HSC。对于TN胸腺细胞分析，将所 有细胞设门于Lin-群并通过用CD44-生物素、CD25-PE和c-kit-APC的染 色检测。
对淋巴结细胞的细胞毒性检测：将淋巴结细胞在37℃、6.5％CO2中 孵育3天。用加有gB498-505肽(gBp)的非转染细胞株(EL4)确定特异性， 单独EL4细胞作为对照。使用30∶1的起始效应物：靶比。将板在37℃、 6.5％CO2中孵育4个小时，然后在650gmax下离心5分钟。从每个孔中收 集上清液(100μl)并转移到玻璃发酵管中，用于Packard Cobra自动伽玛 计数器的测定。
结果
为了确定胸腺再活化的功能性后果(例如阉割是否能增强免疫应 答)，检测了单纯疱疹病毒(HSV)免疫接种，它容许对疾病进展及CTL 作用的研究。发现阉割小鼠具有定量和定性提高的对病毒的应答性。
在爪垫免疫接种小鼠并在免疫接种后第5天分析腘(引流)淋巴结。 另外，取爪垫并匀浆化以确定在整个试验期间的特殊时间点上的病毒滴 度。检测了区域(腘)淋巴结对HSV-1感染的应答(图13-17)。
观察到了淋巴结细胞密度随年龄的显著减少(图13A、13B和14)。 在免疫接种后第5天(即5天)，阉割小鼠具有比年老小鼠显著更高的淋 巴结细胞密度(数据没有显示)。尽管没有看到活化(CD8+CD25+)细胞 的比例随年龄或阉割后的差异，但是当与年老的对照比较时，淋巴结内 的活化细胞数目随着阉割显著地增加了(数据没有显示)。另外，活化细 胞数目与年轻成体中所发现的相当(数据没有显示)，提示阉割小鼠中的 CTL正被活化到更大的程度，但是因为B细胞活化，年轻成体可能具有 一个增大了的淋巴结。用检测随年龄和阉割后出现的特异裂解的比例的 CTL检测确认了这一点(图16)。与年轻成体(2个月大)小鼠比较，年 老小鼠显示出在效应物：靶为10∶1和3∶1时的靶向细胞裂解的显著减少 (图16)。阉割恢复了小鼠生成HSV感染后的特异性CTL应答的能力(图 16)。
另外，虽然活化细胞的Vβ的总表达随着年龄仍保持恒定(数据没有 显示)，但是年老(18个月)小鼠的一个亚组显示出这种克隆应答的减少 (图14A-C)。到阉割后6周时，浸润的淋巴结细胞的总数目和活化 CD25+CD8+细胞的数目已经增加到了年轻成体水平(数据没有显示)。但 是，更重要的是阉割显著地增强了在年老小鼠中被极大地减低了的对 HSV感染的靶细胞的CTL应答性(图16)并恢复了淋巴结内的CD4∶CD8 比例(图17B)。事实上，与年轻成体和阉割小鼠比较，随着年龄都看到 了引流淋巴结内的CD4+T细胞的减少(图17B)，因此说明了在整个生命 中，对增加胸腺的T细胞的产生的极为重要的需要，为了达到最大的免 疫应答性。
实施例4：对性类固醇的抑制增强了胸腺对新的造血前体细胞的摄取，造 成了宿主和供者淋巴细胞(T、B和DC)的嵌合混合物
材料和方法如实施例1-3中所描述的。另外，使用了下面的方法。
先前的试验已经显示微嵌合体形成在器官移植接受上起到了重要作 用。DC也已经显示在对移植物抗原的耐受性上有着整合作用。因此，研 究了阉割对胸腺嵌合体形成和树突状细胞数目的影响。
为了测定干细胞摄取对胸腺再活化的作用，如实施例2所述的进行 了BM重建。
对于同基因动物的试验，每个治疗组都使用3个月大的小鼠(n＝4)。 所有的对照都是年龄匹配的和未治疗的。
比较了阉割和假阉割重建小鼠与未治疗的年龄匹配的对照的总胸腺 细胞数目，在图18A中概括了这一点。在重建前1天阉割的小鼠中，与 假阉割对照小鼠比较，有着胸腺再活化率的显著增高(p≤0.01)。假阉割 小鼠的胸腺细胞密度要低于同系BMT后2周和4周的未治疗的对照水平 (7.6×107±5.2×106)，而阉割小鼠的胸腺密度在BMT后4周时已经增加到 超过了对照水平(图18A)。在6周时，细胞数目仍低于对照水平。但是， 阉割小鼠的细胞数目比假阉割小鼠高3倍(p≤0.05)(图18A)。
在BMT 4周后，阉割小鼠的BM内也有着显著更多的细胞(p≤0.05) (图18D)。到了2周时，假阉割的BM细胞密度达到了未治疗的对照水平 (1.5×107±1.5×106)，而阉割小鼠的BM细胞密度在同系BMT后2周和4 周都超过了对照水平(图18D)。在照射和重建后2周，阉割和未阉割的 小鼠中的肠系膜淋巴结细胞数目都减少了；但是，到了4周的时间点时， 细胞数目已经达到了对照水平。在阉割和未阉割治疗组之间的淋巴结细 胞数目没有统计学显著差异(图18C)。假阉割和阉割的脾细胞密度在2 周时到达了未治疗的对照水平(1.5×107±1.5×106)，但是假阉割组在4-6周 后出现减少，而阉割小鼠仍有高水平的脾细胞(图18B)。与未阉割的小 鼠比较，阉割小鼠在这些时间点(即重建后4周和6周)都显示出更多的 淋巴细胞(p≤0.05)，尽管在2周时没有看到阉割和未阉割治疗组之间的 总脾细胞的差异(图18B)。
因此，在重建前1天阉割的小鼠中，与假阉割(ShCx)对照小鼠比 较，有着胸腺再活化率的显著增加(p≤0.01)(图18A)。在同系BMT后2 周和4周时，假阉割小鼠的胸腺细胞密度要低于未治疗的对照水平 (7.6×107±5.2×106)，而在BMT后4周时，阉割小鼠的胸腺细胞密度已经 增加超过了对照水平(图18A)。阉割小鼠比未阉割动物有着显著更多的 同系细胞(Ly5.2)。
在未阉割小鼠中，在4周的时间内有着胸腺细胞数目的显著减少， 有着很少或没有再生的证据(数据没有显示)。但是在阉割组中，到2周 时已经存在广泛的胸腺细胞生成，到4周时已经恢复到了对照水平，这 比未阉割小鼠高10倍多。对胸腺的CD45.2(供者来源的抗原)的流式细 胞术分析证实4周时在未阉割组中没有检测到供者来源的细胞，但是实 际上明显地是，在这个时间点上的阉割小鼠的所有胸腺细胞都是供者来 源的(数据没有显示)。假定这种胸腺细胞生成的广泛增强来自供者来源 的造血前体细胞，那么确定T细胞分化是否已经正常进行是重要的。用 流式细胞术分析了CD4、CD8和TCR所定义的亚组。在重建后2周的胸 腺细胞亚组比例上没有相称的差异(数据没有显示)。这种观察在4周时 是不可能的，因为未阉割小鼠仍没有供者来源的细胞的重建。但是，在 这个时间点上，阉割小鼠的胸腺细胞比例表现为正常。
在一组平行试验中，在BMT前1天阉割或假阉割3个月大的、年轻 成体C57/BL6小鼠。对于同系BMT，小鼠接受了800RAD TBI及IV注 射5×106 Ly5.1+BM细胞。2周和4周后处死小鼠，并分析BM、胸腺和 脾的免疫重建。用抗CD45.1抗体确定供者/宿主来源，该抗体只与供者 来源的白细胞反应。
在图19-28中显示了来自这组平行试验的结果。
图20和21显示了阉割动物的BM中的供者来源的HSC的数目和比 例的增加。这说明了提高的植入并提示BMT的更快的恢复。
图22显示了阉割小鼠的BM中的供者来源的B细胞祖细胞和B细 胞的增加。但是，图24和25显示了阉割没有改变阉割后2周和4周时 的外周B细胞的数目或比例。
图26显示阉割增加了胸腺的供者来源的TN、DP、CD4和CD8细 胞的数目。但是，图23显示阉割没有改变供者胸腺细胞的CD4和CD8 细胞的比例。在外周，有着非常少的CD4或CD8细胞，以及在所考虑到 的时间点上，这些细胞没有随阉割而增加。
重要的是，图28显示了到阉割后4周时胸腺的供者DC的数目的增 加。
讨论
实施例4显示了阉割对同基因和同系BM移植的影响。Starzl et al.， (1992)Lancet 339：1579报告了淋巴和非淋巴组织的明显的微嵌合体是异 基因移植的好的预后指标。已经公认为它们对于诱导对移植物的耐受是 必要的(Starzl et al.，(1992)Lancet 339：1579)。供者来源的DC存在于这 些嵌合体中并被认为是在避免移植物排斥上发挥着整合的作用 (Thomson and Lu，(1999)Immunol.Today 20：20)。已知DC是胸腺的阴性 选择步骤中的关键因素，如果供者来源的DC存在与受者胸腺内，就可 以去除移植物反应性T细胞。
为了确定阉割是否能增加嵌合体形成，用同基因的胎肝移植进行了 一项研究。结果显示了阉割小鼠的胸腺的再生被增强了。当用同系的 (Ly5)小鼠重复试验时，再次看到了这些趋势。因为同系标记物的存在， 测定小鼠的嵌合体状态是有可能的。早到胎肝重建后2周时，在胸腺内 就能检测到供者来源的树突状细胞，阉割小鼠的数目是未阉割小鼠的4 倍。在重建后4周时，未阉割小鼠没有表现出供者来源的细胞的重建， 说明阉割事实上可以增加嵌合体形成的可能性。假定阉割不仅能增加致 死性照射和胎肝重建后的胸腺再活化，它还增加了胸腺内供者来源的树 突状细胞的数目，对于干细胞移植，这种方法增加了移植物接受的可能 性。
实施例5：免疫细胞耗竭
为了预防潜在的移植物受者患者中的现有T细胞对移植物的干扰， 患者进行了T细胞耗竭(清除)。这个步骤的一个标准方法如下。患者接 受每日注射15mg/kg Atgam(异种的抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn) 形式的抗T细胞抗体10天，联合应用T细胞活化抑制剂环孢菌素A， 3mg/kg连续输注3-4周，接着是按需服用每日9mg/kg的片剂。这个治疗 不影响患者胸腺内的早期T细胞发育，因为具有这样作用所必需的量的 抗体因为人类胸腺的尺寸和构型而不能被转运到胸腺内。持续治疗近4-6 周以容许性类固醇缺失后的胸腺重建。
也可以联合应用第二信号水平的抑制剂进行对T细胞反应性的预 防，这些抑制剂例如白介素、附加分子(例如阻断例如CD28的抗体)、 增强T细胞清除或其他免疫细胞清除的信号途径分子或细胞粘附分子。 胸腺重建期将与供者HSC的注射结合(与取得相关器官或组织的同时从 血液中得到的，用G-CSF(每天皮下注射2次，共3天)从血液中预先动 员的；或直接从供者BM中所采集的)。增强了的循环HSC的水平将促进 胸腺的摄取(性类固醇的缺失和/或提高的GnRH水平所激活的)。这些供 者HSC将发育成胸腺内DC并引起任何新形成的偶尔将是“供者反应性 的”T细胞的去除。这将建立对供者细胞和组织的中枢耐受并据此预防或 最大程度地最小化宿主的任何排斥。新的T细胞库的发育也将克服T细 胞耗竭方案所引起的免疫缺陷。
外周T细胞的耗竭使得移植物排斥的危险最小化，因为它非特异性 地耗竭了所有的T细胞包括那些潜在地与外来供者反应的T细胞。但是， 同时因为T细胞的缺失，这个方法诱导了普遍的免疫缺陷状态，这意味 着患者对感染特别是病毒感染是高度易感的。
实施例6：性类固醇耗竭治疗
患者接受了给予LHRH激动剂形式的性类固醇耗竭治疗。给予了 Leucrin_(储存剂注射液；22.5mg)或Zoladex_(植入物；10.8mg)形式 的LHRH激动剂，每一种都是单次剂量有效3个月。这能有效地将性类 固醇水平减少到足以再活化胸腺的水平。在一些情况中，施与性类固醇 的肾上腺产物的抑制剂也是必要的。也可以在性类固醇耗竭治疗的持续 时间内每天给予一片Cosudex_(5mg/天或50mg/天)。或者，给予患者 GnRH拮抗剂例如皮下注射的西曲瑞克或阿巴瑞克。
在手术阉割后，血液中的性类固醇减少到最低只需要1-3周，而化学 阉割后要花3-4周。在一些情况中，需要将治疗延长到第二个3个月的注 射/植入。作为异基因供者(对于外来组织的移植物)或自体的HSC的血 液HSC的同时增强(通过给宿主注射G-CSF以将这些HSC从BM中动 员到胸腺)可以增加胸腺扩增。
实施例7：其他的给药方法
可以用其他的方法取代LHRH激动剂的3个月储存剂或植入物的给 药方法。在一个实例中，可以用例如Er：YAG激光的激光照射患者的皮肤， 以消融或改变皮肤，以减少角质层的阻抗作用。
在美国No.6,251,100、6,419,642和4,775,361中描述了激光消融或变 更。
在另一个实例中，给药是通过激光产生的压力波的方式。将合适容 器例如塑料柔软垫圈(直径约1英寸及厚度约1/16英寸)内的一个剂量 的LHRH激动剂放置在皮肤的产生压力波的位点上。然后用例如约1mm 厚的黑色聚苯乙烯片的靶材料覆盖该位点。用Q转换的固态红宝石激光 (20ns脉冲持续时间，每个脉冲能产生最大到2焦耳的能量)生成单个脉 冲暂态，该暂态冲击靶材料。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光照射， 使得皮肤仅仅暴露于脉冲暂态，而不暴露于激光照射。可以每天重复操 作，或按所需的经常重复，以保持激动剂的循环的血液水平。
实施例8：供者细胞的施用
在可行的情况下，通过在细胞采集之前给供者注射10μg/kg粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)2-5天(例如，每天注射10μg/kg一次或两次，共2-5 天)增强供者血液中的造血干细胞(HSC)的水平。也可以在采集之前 (7-14天前)给供者注射LHRH激动剂和/或细胞因子例如G-CSF或 GM-CSF，以增强血液中的干细胞的水平或质量。例如通过流式细胞术或 免疫磁珠从供者血液或BM中纯化出CD34+供者细胞。与人CD34特异 性结合的抗体是商品化的(来自例如Research Diagnostics Inc.，Flanders， NJ；Miltenyi-Biotec，Germany)。流式细胞术将供者来源的HSC确定为是 CD34+细胞。也可以通过使用喂养细胞(例如成纤维细胞)、生长因子例 如干细胞因子(SCF)和预防分化为特异细胞类型的LIF的体外培养扩增 这些CD34+HSC。在给予LHRH激动剂后近3-4周(即胸腺刚刚开始再 生的之前或同时)时，给患者注射供者HSC，最优化剂量约为2-4×106细 胞/kg。也可以给受者注射G-CSF以有助于供者HSC的扩增。如果因为 临床病变的严重程度使得这个时间方案不可能时，可以同时施与HSC和 GnRH。近2-3周后给予第二个剂量的HSC可能是必要的，这有助于胸 腺再活化及供者DC的发育(特别是在胸腺内)。一旦HSC已经植入到(即 结合到)和/或迁移到BM和胸腺，作用将是明显的，因为HSC是自我更 新的。
正再活化的或已再活化的胸腺摄取供者HSC并将它们转化为供者型 的T细胞和DC，而将受者的HSC转化为受者型T细胞和DC。通过细 胞死亡诱导去除，或通过经免疫调节细胞诱导耐受性，供者和宿主DC 能耐受能与供者或受者细胞可能反应的任何新的T或NK细胞。
实施例9：移植物HSC的移植
在本发明的一个实施方式中，当受者仍进行持续的T细胞耗竭和/或 其他的免疫细胞耗竭和/或免疫抑制治疗时，一个器官、或一组已经被部 分耗竭供者T细胞的细胞被从供者移植到受者患者内。受者胸腺已经被 GnRH治疗所活化并被外来的HSC所浸润。
在LHRH治疗约3-4周内，首批新的T细胞出现在了受者的血流内。 但是，为了容许产生宿主和供者造血细胞的稳定的嵌合体，可以持续免 疫抑制资料约3-4个月。因为在再活化胸腺内存在着供者和宿主的DC， 去除了新T细胞内的可能的供者反应性和宿主反应性的细胞。已经经宿 主胸腺上皮的阳性选择，T细胞通过识别受者的外周血中的宿主APC所 呈递的肽，保留了对正常感染的应答的能力。供者DC对受者淋巴器官 的结合建立了事实上与单独宿主的免疫系统一致的免疫系统状态，除了 对供者细胞、组织和器官的耐受性以外。因此，存在着正常的免疫调节 机制。这些也可以包括调节T细胞的发育，它利用细胞因子例如IL-4、5、 10、TGF-β、TNFα打开或关闭免疫应答。
实施例10：病毒感染(流感)的免疫接种和预防
流感病毒是片段的RNA病毒，它引起了高度传染性的急性呼吸道感 染。与抗流感的疫苗发展相关的主要问题是，这些病毒通过经所谓的抗 原漂移和抗原转变现象改变血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(N)被膜糖蛋白 上的抗原位点，具有了逃脱免疫监督并保留在宿主群中的能力。对抗流 感病毒的主要相关物是抗经历了抗原漂移和转变的强选择的HA的中和 抗体。但是，在内在蛋白例如核蛋白(NP)之间发生了对不同的流感病毒 株的更为保守的抗原交叉反应(Shu et al.，(1993)J.Virol.67：2723)。先前 已经显示了在用编码NP的多核苷酸的免疫接种后的对流感攻击的CTL 和保护作用(Ulmer et al.(1993)Science 259：1745)。
材料和方法
手术阉割：通过腹腔内注射30-40μl溶于盐水的5ml 100mg/ml盐酸 氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)加上1ml 20mg/ml甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 的混和物麻醉BALB/c小鼠。如在其他地方所描述的进行手术阉割，通 过阴囊切口，显露睾丸，将其用缝线结扎，然后与外周脂肪组织一起取 出睾丸。并手术订关闭伤口。将按上述的但没有取出睾丸的方法所制备 的假阉割小鼠作为对照。
化学阉割：给小鼠肌肉注射10mg/kg作为1个月缓释剂型的Lupron_ (一种GnRH激动剂)。否则就给小鼠注射GnRH拮抗剂(例如西曲瑞克或 阿巴瑞克)。按照产品说明书，用血浆标本的标准放射免疫测定法进行对 性类固醇缺失的确认。到了阉割后3-4周正常地应当达到阉割水平 (＜0.5ng睾酮或雌激素/ml)。
流感A/PR/8/34亚单位疫苗的制备：按照本领域已知的方法制备纯化 的流感A/PR/8/34(H1N1)亚单位疫苗制剂。简单地，用非离子型去污剂 (7.5％N-辛基-β-o-硫代吡喃葡萄糖苷)从流感A/PR/8/34颗粒中提取出血 凝素(HA)和神经氨酸糖苷酶(NA)抗原。离心后，将富含HA/NA的上清 液(55％HA)用作为亚单位疫苗。
流感A/PR/8/34亚单位免疫接种：在手术阉割后近6周或化学阉割后 约8周，用皮下注射的100μl福尔马林灭活的流感A/PR/8/34病毒(约 7000HAU)免疫接种小鼠。
在初次免疫接种后约4周(或更晚)时，可以任选地进行强化免疫接 种。弗氏完全佐剂(CFA)被用于初次免疫接种以及弗氏不完全佐剂被用于 任选的强化免疫接种。
或者，可以将流感A/PR/8/34亚单位疫苗制剂(见上)直接肌肉内注射 到例如四头肌内，剂量为约1μg到约10μg的稀释于40μl 0.9％盐水内的 疫苗制剂。
质粒DNA：对质粒DNA表达载体的制备在本领域是熟知的(见，例 如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)， Wiley and Sons，New York，NY(1994)，and yearly updates including 2002)。 简单地，将完全的流感A/PR/8/34核蛋白(NP)基因或血凝素(HA)编码序列 克隆到表达载体例如pCMV中，它处于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动 子的转录调控之下。
空质粒(例如没有插入物的pCMV)被用作为阴性对照。用标准计数 将质粒培养在大肠杆菌DH5α或HB101细胞中，并根据产品家说明书用 Qiagen_Ultra-Pure_-100柱(Chatsworth，CA)将其纯化。用合适的限制性 内切酶和琼脂糖凝胶电泳验证所有的质粒。用在260nm和280nm所读取 的光密度确定出DNA产品的纯度。将所有的质粒重悬于TE缓冲液中并 在-20℃下储存直到使用。
DNA免疫接种：DNA免疫接种的方法在本领域是熟知的。例如，在 Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)， Wiley and Sons，New York，NY(1994)，and yearly updates including 2002)中 详细描述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)DNA免疫接种的方法。
任选地施用编码细胞因子的DNA，以将免疫应答转换为所需的Th1 或Th2型免疫应答。诱导Th1的遗传学佐剂包括例如IFNγ和IL-12。诱 导Th2的遗传学佐剂包括例如IL-4、IL-5和IL-10。对诱导Th1和Th2 的遗传学佐剂的制备及其在诱导免疫应答中的用法的综述见例如 Robinson，et al.，(2000)Adv.Virus Res.55：1)。
流感A/PR/8/34病毒攻击：为了确定阉割小鼠是否能比它们的假阉割 对照更好地对抗流感病毒的攻击(有和没有免疫接种)，用50μl的10-4倍 稀释于PBS/2％BSA的含有流感A/PR/8/34(H1N1)流感病毒的尿囊液 (50-100LD50；0.25HAU)鼻内接种攻击甲氧氟烷麻醉的小鼠。每日称量 小鼠，并在体重缺失＞20％攻击前体重后将其处死。在这个剂量的病毒攻 击中，100％原初小鼠将在4-6天屈服于流感感染。
任选地用亚致死感染以激活记忆T细胞，但是使用了10-7的病毒稀 释液。也可以任选地用亚致死感染确定出未免疫的、阉割小鼠是否比假 阉割对照具有更好的免疫应答，如下面所列出的ELISA、细胞因子测定 (Th)、CTL测定等等所确定的那样。在用于这些试验之前，可以优化出 致死性和亚致死性感染的病毒滴度。
酶联免疫吸附测定法：在免疫接种之前和之后(或感染之前和之后) 的不同时间段，将每组的小鼠放血，并用标准的定量酶联免疫吸附测定 法(ELISA)测定个体小鼠的血清以检测血清中的抗HA或NP特异性IgG 水平。可以任选地测定IgG1和IgG2a水平，已知它们分别与Th2和Th1 型抗体反应有关。
用于细胞因子产生的脾细胞的制备和刺激：从不同组的小鼠中无菌 收集脾并将其汇集在含有约4ml RPMI-10培养基(RPMI-1640，10％胎牛 血清，50μg/ml庆大霉素)的p60培养皿中。用标准的方法制备脾并裂解 RBC。然后计数细胞并将其重悬于含有80U/ml鼠IL-2(Sigma，St.Louis， MO)的RPMI-10中，使得最终的细胞浓度为2×107细胞/ml。将100微升 细胞分散到96孔组织培养板的各个孔中，使得终浓度为2×106细胞/孔。 通过加入100μl溶解在RPMI-10中的合适的肽或灭活流感病毒实施刺激。 或用Kd-限制性HA533-541肽(IYSTVASSL；SEQ ID NO：1))(Winter，Fields， and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或用Kd-限制性NP147-155肽 (TYQRTRALV；SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252) 刺激CD8+T细胞。用灭活的流感病毒(每孔13,000HAU煮沸的流感病 毒加上每孔13,000HAU福尔马林灭活的流感病毒)加上抗CD28(1μg/ml) 和抗CD49d(1μg/ml)刺激CD4+T细胞(Waldrop et al.，(1998)J.Immunol. 161：5284)。单用培养基进行阴性对照刺激。然后孵育细胞，如下所述的 用ELISA检测细胞外细胞因子或用FACS检测细胞内细胞因子。
CTL的铬释放测定：利用本领域人员熟知的方法测定CTL对流感 HA和NP的应答(见，例如Current Protocols In Immunology，John E. Coligan etal.，(eds)，Unit 3，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的 更新版本包括2002年)。合成肽HA533-541IYSTVASSL(SEQ ID NO：1) (Winter，Fields，and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或NP147-155 TYQRTRALV(SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252)被 用作制靶步骤中的肽。用RPMI-10洗涤每只动物的应答型脾细胞并将其 按6.3×106细胞/ml的终浓度重悬于含有10U/ml鼠IL-2(Sigma，St.Louis， MO)的RPMI-10中。从原初的、同基因的小鼠中制得刺激型脾细胞，并 将其按1×107细胞/ml的浓度悬浮于RPMI-10中。加入终浓度为25μg/ml 的丝裂霉素C。将细胞在37℃/5％CO2中孵育30分钟，然后用RPMI-10 洗涤3次。然后将刺激型细胞重悬于RPMI-10培养基及10U/ml IL-2中， 使其浓度为2.4×106细胞/ml，并加入终浓度为9×10-6M的HA肽或终浓度 为2×10-6M的NP肽，在37℃/5％CO2中孵育2小时。将肽激活的(pulsed) 刺激型细胞(2.4×106)和应答型细胞(6.3×106)在24孔板的2ml体积的SM 培养基(RPMI-10，1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠)中37℃/5％CO2 共孵育5天。用铬释放测定法测定体外刺激的应答细胞(现在叫做效应细 胞)裂解肽激活的小鼠肥大细胞瘤P815细胞(MHC匹配的，H-2d)的能力。 通过取出0.1ml的溶于RPMI-10的P815并加入25μl FBS和0.1mCi溶解 在0.2ml生理盐水中的放射性标记的铬酸钠(MEN，Boston，MA)，用51Cr标记P815细胞。将靶细胞在37℃/5％CO2中孵育2个小时，用RPMI-10 洗涤3次并重悬于含有RPMI-10加上HA(9×10-6M)或NP(1×10-6M)肽的 15ml聚丙烯试管中。将靶细胞在37℃/5％CO2孵育2个小时。将溶于RPMI 中的放射性标记的、肽激活的靶细胞按每孔5×104细胞加入到96孔板的 每个孔中。收集每个免疫接种组中的受刺激的应答细胞(现在叫做效应细 胞)，用RPMI-10洗涤3次，并将其加入到含有靶细胞的终体积为0.2ml/ 孔的96孔板的每个孔中。效应物：靶细胞比例为50∶1、25∶1、12.5∶1和 6.25∶1。将细胞在37℃/5％CO2孵育5个小时，用液态闪烁计数法测定25μg 上清液的细胞裂解。低于给定的效应细胞标本，标记靶细胞的特异性裂 解的百分比为[100x(标本中的Cr释放-标本的自发性释放)/(最大量Cr释 放-标本的自发性释放)]。自发性铬释放是没有加入效应细胞时从靶细胞 所释放出的放射性的量。最大量铬释放是在加入Triton-100到终浓度为 1％之后靶细胞裂解所释放出的放射性的量。自发性释放不应当超过15％。
ELISA对大量培养上清液的IFNγ或IL-5的检测：可以测定大量培养 上清液的IFNγ和IL-5细胞因子水平，已知它们分别与Th1和Th2型应答 相关。将汇集的脾细胞在37℃/5％CO2孵育2天，然后收集并汇集上清 液。所有的ELISA抗体和纯化的细胞因子都购自Pharmingen(San Diego， CA)。将50微升在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 8.2)中被稀释到 5μg/ml(大鼠抗小鼠IFNγ)或3μg/ml(大鼠抗小鼠IL-5)的纯化的抗细胞因子 单克隆抗体分散到96孔板(Corning，Corning，NY)的每个孔中并在4℃孵育 过夜。用PBS-T洗涤、封闭和再洗涤板。将标准物(重组的小鼠细胞因子) 和标本按在RPMI-10中的不同的稀释浓度加入到孔中，并在4℃孵育过 夜以达到最大的敏感性。用PBS-T洗涤板6次。将生物素化的大鼠抗小 鼠细胞因子检测抗体在PBS-T中稀释到终浓度为2μg/ml，往每孔加入 100μl。将板在37℃孵育1个小时，然后用PBS-T洗涤6次。按照产品说 明书将抗生物素蛋白链菌素-AP(Gibco BRL，Grand Island，NY)按1∶2000 稀释，并往每孔加入100μl。将板孵育30分钟，用PBS-T再洗涤6次。 通过加入每孔100μl AP显影溶液(BioRad，Hercules，CA)并再室温下孵育 50分钟，将板显影。通过加入100μl/孔NaOH终止反应并在OD405处读 取数据。用Softmax Pro 2.21版计算机软件(Molecular Devices，Sunnyvale， CA)分析数据。
细胞内细胞因子染色和FACS分析：可以测定脾细胞的细胞内IFNγ 和IL-5细胞因子水平，已知它们分别与Th1和Th2型应答相关。将汇集 的脾细胞在37℃，含有5％CO2的潮湿空气中孵育5-6个小时。按照产品 说明书，按0.14μl/孔加入Golgi转运抑制剂Monensin(Pharmingen，San Diego，CA)，并将细胞再孵育5-6个小时(Waldrop et al.，(1998)J.Immunol. 161：5284)。将细胞彻底重悬并转移到96孔的U型底板中。除非其他说明 的，所有的试剂(GolgiStop试剂盒和抗体)都购自Pharmingen(San Diego， CA)，在冰上用冰冷的试剂进行所有的FACS染色步骤。用FACS缓冲液 (1×PBS，2％BSA，0.1％w/v叠氮化钠)洗涤板2次。用50μl的大鼠抗 小鼠CD8β-APC、-D69-PE和-CD16/CD32(FcγIII/RII；“Fc阻断”)的1∶100 的FACS缓冲液的稀释溶液表面染色细胞。对于四聚体染色(见下)，用 CD8β-TriColor、CD69-PE、CD16/CD32、和HA-或NP-四聚体-APC的 FACS缓冲液相似地染色细胞。将细胞在暗处孵育30分钟，用FACS缓 冲液洗涤3次。通过将细胞彻底地重悬于每孔100μl Cytofix/Cytoperm溶 液中并在暗处孵育20分钟，将细胞透化处理。用Permwash溶液洗涤细 胞3次。通过与每孔50μl的大鼠抗小鼠IFNγ-FITC的1∶100的Permash 溶液的稀释液在暗处孵育30分钟完成细胞内染色。用Permwash溶液洗 涤细胞2次并用FACS缓冲液洗涤1次。将细胞固定于200μl的1％多聚 甲醛溶液中，并转移到按96孔格式排列的微量管中。将管子包裹于箔中 并储存在4℃直到分析(少于2天)。在FACScan流式细胞仪(Becton Dickenson，San Jose，CA)中分析标本。利用以大鼠抗小鼠的CD8-FITC、 -PE、-TriColor、或-APC染色的单染对照细胞进行比较。用FlowJo 2.7 版软件(Tree Star，San Carlos，CA)分析结果。
四聚体：可以用HA和NP四聚体定量HA或NP免疫接种后的HA 和NP特异性的CD8+T细胞应答。基本上按照先前所述的制备四聚体 (Flynn et al.，(1998)Immunity 8：683)。本实施例利用了复合有合成的流感 A/PR/8/34病毒肽HA533-541(IYSTVASSL；SEQ ID NO：1)(Winter，Fields， and Brownlee，(1981)Nature 292：72)或NP147-155(TYQRTRALV；SEQ ID NO：2)(Rotzschke et al.，(1990)Nature 348：252)的H-2Kd I型MHC分子。
要注意，只要做较小的变化，在本实施例中所描述的方法就可适用 于广泛的检测试剂，这一点对于本领域人员是很容易确定的。
实施例11：寄生虫感染(疟疾)的免疫接种和预防
环孢子蛋白(CSP)是这种前红细胞环的免疫力的靶点(Hoffman et al.， (1991)Science 252：520)。在约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)的啮齿动物 模型中，被动转移P.yoelii CSP特异性单克隆抗体(Charoenvit et al.，(1991) J.Immunol.146：1020)，以及过继性转移P.yoelii CSP特异性CD8+T细 胞(Rodrigues et al.，(1991)int.Immunol 3：579，Weiss et al.，(1992)J. Immunol.149：2103)和CD4+T细胞(Renia et al.，(1993)J.Immunol.150： 1471)都是有保护作用的。已经评价了通过诱导抗P.yoelii CSP的免疫应 答所设计的保护小鼠对抗子孢子的多种疫苗。
可以使用可用于本发明的能诱导对疟原虫的保护作用的本领域已知 的任何疟原虫的子孢子蛋白，例如镰状疟原虫、间日疟原虫、三日疟原 虫、和卵形疟原虫CSP；SSP2(TRAP)；Pfs16(Sheba)；LSA-1；LSA-2； LSA-3；MSA-1(PMMSA、PSA、p185、p190)；MSA-2(Gymmnsa、gp56、 38-45kDa抗原)；RESA(Pf155)；EBA-175；AMA-1(Pf83)；SERA(p113、 p126、SERP、Pf140)；RAP-1；RAP-2；RhopH3；PfHRP-II；Pf55；Pf35； GBP(96-R)；ABRA(p101)；Exp-1(CRA、Ag5.1)；醛缩酶；间日疟原虫的 Duffy结合蛋白；网织红细胞结合蛋白；HSP70-1(p75)；Pfg25；Pfg28； Pfg48/45；和Pfg230。
材料和方法
阉割：如上进行手术和/或化学阉割。
寄生虫：如先前所述的使用P.yoelii的17XNL(非致死的)株(美国 No.5,814,617)。
经照射的P.yoelii子孢子的制备：先前已经描述了用于免疫接种的经 照射的P.yoelii子孢子的制备(见，例如Franke et al.，(2000)Infect.Immun. 68：3403)。简单地，用不连续梯度技术从已经受10,000rads(137Ce)照射的 被感染的Anopheles stephen蚊中分离出子孢子(Pacheco et al.，(1979)J. Parisitol.65：414)。
用经照射的P.yoelii子孢子的免疫接种：在手术阉割后近6周或在化 学阉割后约8周，用50,000子孢子经尾部静脉静脉内免疫接种小鼠。在 初次接种后4周和6周，任选地给予20,000到30,000子孢子的强化免疫 接种(见，例如Franke et al.，(2000)Infect Immun.68：3403)。
质粒DNA和DNA免疫接种：编码全长P.yoelii CSP的质粒DNA在 本领域是已知的。例如，可以使用在Sedegah et al.，((1998)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95：7648)中所详细描述的pyCSP载体。
DNA免疫接种的方法在本领域也是熟知的。例如，在Current Protocols In Immunology，Unit 2.14(John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括2002年)中详细地描 述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)的DNA免疫接种的方法。
肽免疫接种：P.yoelii CSP肽制备的方法在本领域是已知的(见，例如 Franke et al.，(2000)Infect Immun.68：3403)。
CTL的铬释放测定法：因为抗P.yoelii的CD8+CTL已经显示为是 过继性转移保护(Weiss et al.，(1992)J.Immunol.149：2103)，并且CD8+T 细胞是经照射的子孢子的免疫接种所诱导的抗P.yoelii的保护作用所需 要的细胞(Weiss et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：573)，因此必 须要确定P.yoelii CSP疫苗接种(例如，经照射的子孢子、CSP肽或CSP DNA免疫接种)是否引发了CSP特异性CTL。
用本领域人员熟知的方法测定了CTL应答(见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括2002年)。使用了在 本说明书的其他地方所描述的用于流感HA和NP的常用方法，除了用合 成的P.yoelli CSP肽(281-296；SYVPSAEQILEFVKQI；SEQ ID NO：3)激 活细胞。
对肝脏发育阶段抑制的测定：先前已经描述了肝脏发育阶段测定及 通过原位胶原酶灌注对小鼠肝脏的小鼠肝细胞的采集(Franke et al.， (1999)Vaccine 17：1201；Franke et al.，(2000)Infect.Immun.68：3403)。将 肝细胞按每室1×105个细胞播种到8室的Lab-Tek塑料载片上，并与 7.5×104个P.yoelli子孢子孵育3个小时。然后洗涤培养物并在37℃/5％CO2 再培养24个小时。如上得到并加入用于CTL的铬释放测定的效应细胞， 将其与受感染的肝细胞培养约24-48个小时。然后洗涤培养物，并在冰冷 的无水甲醇中固定分室载片10分钟。然后在与FITC标记的山羊抗鼠Ig 孵育之前，将分室载片与直接抗P.yoelii的肝脏阶段寄生虫的单克隆抗体 (NYLS1或NYLS3，两者都已经被描述于美国No.5,814,617)孵育。然后 用落射荧光显微镜计数三次重复试验中的肝脏阶段的裂殖体的数目。用 公式[((对照-测试)/对照)×100]计算出抑制百分比。
感染和攻击：对于致死性攻击剂量，必须在试验性攻击之前确定出 P.yoelli子孢子的ID50。但是，最初经尾部静脉给小鼠静脉内注射约50 到100个P.yoelli子孢子的剂量(非致死的，17XNL株)也是可能的。再 静脉内接种42个小时后，处死小鼠并取出肝脏。制备肝细胞的单细胞的 培养基悬浮液，并往多室载片的10孔的每个孔内都放入2×105个肝细胞。 可以将载片干燥并冷冻在-70℃直到分析。为了计数子孢子的数目，将载 片干燥并在与FITC标记的山羊抗鼠Ig孵育之前先与NYLS1孵育，用荧 光显微镜计数每室内的肝脏阶段子孢子的数目。
一旦证实阉割和/或免疫接种减少了受感染的肝细胞的数目，获得血 涂片以确定免疫接种是否保护对抗了血液阶段的感染。如果在攻击后的 5-14天内，没有在血涂片中找到寄生虫就认为小鼠是受保护的。
为了检验单独阉割(无免疫接种)对P.yoelli子孢子原发感染的保护 疗效，如上所述的感染并分析了阉割小鼠。假阉割小鼠被当作对照。
人体研究：在建立了小鼠中的有效性之后，在双盲安慰剂对照现场 试验中，免疫接种了很多人。
实施例12：对细菌感染(TB Ag85)的免疫接种和预防
结核病(TB)是一种结核分枝杆菌病因所引起的肺部的慢性感染性疾 病，是世界范围内的临床最重要的感染之一(见，例如美国No.5,736， 524；综述见Bloom and Murray，(1993)，Science 257，1055)。
结核分枝杆菌是一种感染巨噬细胞的细胞内病原体。对TB的免疫力 包括一些类型的效应细胞。细胞因子例如IFNγ对巨噬细胞的活化是一种 最小化细胞内分枝杆菌增殖的有效方法。
抗TB的保护作用的获得需要CD8+和CD4+T细胞(见，例如Orme et al.，(1993)J.Infect.Dis.167：1481)。已知这些细胞应答于感染分泌Th1型 细胞因子，例如IFNγ，并具有抗原特异性的细胞毒活性。事实上，本领 域已知CTL应答对于抗结核分枝杆菌的保护作用是有用的(见，例如 Flynn et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：12013)。
TB的主要的T细胞抗原是那些分枝杆菌在它们停留于巨噬细胞期间 所分泌的蛋白。这些T细胞抗原包括，但不限定于，抗原85蛋白复合物 (85A、85B、85C)(Wiker and Harboe，(1992)Microbiol.Rev.56：648)和 ESAT-6(Andersen，(1994)Infect.Immunity，62：2536)。在本领域也已经描 述了其他的T细胞抗原(见，例如Young and Garbe，(1991)Res.Microbiol. 142：55；Andersen，(1992)J.Infect.Dis.166：874；Siva and Lowrie，(1994) Immunol.82：244；Romain et al(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5322； and Faith et al.，(1991)Immunol.74：1)。
已经克隆并测序了三种抗原85蛋白(A、B和C)的每种蛋白的基因 (见，例如Borremans et al.，(1989)Infect.Immunity 57：3123)；DeWit et al.， (1994)DNA Seq.4：267)，并且已经显示它们在感染和疫苗接种后能引发 强烈的T细胞应答。
材料和方法
小鼠的阉割：如上进行对BALB/c或C57BL/6小鼠的手术和/或化学 阉割。
蛋白免疫接种：用于结核分枝杆菌(TB)纯化和免疫接种的常用方法 在本领域是已知的(见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14， John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年 的更新版本包括2002年)。用预备的SDS-PAGE可以制备纯化的TB。将 近2mg TB蛋白加样在用大齿梳所形成的标准1.5mm平板凝胶的孔中。 在电泳后可以取出凝胶的边缘并染色以鉴定凝胶中的TB蛋白带。然后从 凝胶中切下含有TB蛋白带的凝胶区域，并将其放置在PBS中，终浓度 为每ml 0.5mg纯化的TB蛋白，并储存在4℃直到使用。然后可以用等体 积的弗氏完全佐剂(CFA)乳化所纯化的TB蛋白用于免疫接种。
在手术阉割后的近6周或化学阉割后的约8周，用2ml CFA乳化2ml 纯化的TB(0.5ml/ml PBS)并储存于4℃。经连接有19号针头的3ml玻璃 注射器缓慢地吸推TB/CFA混和物，一定要避免过度的气泡。一旦乳状 液为均质浓度时，用22号针头替代19号针头，排出所有的气泡。给阉 割和假阉割小鼠肌肉内注射50μl体积的TB/CFA乳状液(也可以经皮内或 皮下途径进行免疫接种)。疫苗制剂也可使用牛型分枝杆菌BCG。
可以在初次免疫接种后4-8(或更晚)任选地实施强化免疫接种。按上 述相同的方式制备TB佐剂乳状液，除了用弗氏不完全佐剂(IFA)取代CFA 用于所有的强化免疫接种。还可以在此后2-4周(或更晚的间隔)进行强化 免疫接种。
质粒DNA：先前已经描述了适用的编码Ag85的DNA序列和载体 (见，例如美国No.5,736,524)。本领域人员能容易地确定出其他适用的 表达载体。
抗原85DNA免疫接种：DNA免疫接种的方法在本领域也是熟知的。 例如，在例如Current Protocols In Immunology，Unit 2.14(John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，及每年的更新版本包括 2002年)中详细地描述了皮内、肌肉内和颗粒介导的(基因枪)的DNA免 疫接种的方法。
任选地施用编码细胞因子的DNA，以将免疫应答转换为所需的Th1 或Th2型免疫应答。诱导Th1发生的佐剂包括例如IFNγ和IL-12。诱导 Th2发生的佐剂包括例如IL-4、IL-5和IL-10。对诱导Th1和Th2发生的 佐剂的制备及其在诱导免疫应答中的用法的综述见例如Robinson，et al.， (2000)Adv.Virus Res.55：1)。
在手术阉割后近6周或在化学阉割后约8周，给小鼠肌肉内注射稀 释于100μl盐水中的200μg DNA。
在初次接种后4周和强化后2周时，任选地施用DNA强化免疫接种。
酶联免疫吸附测定法：在免疫接种之前和之后(或感染之前和之后) 的不同时间段，将每组的小鼠放血，并用标准的定量酶联免疫吸附测定 法(ELISA)测定个体小鼠的血清以检测血清中的抗Ag85的特异性IgG水 平。可以任选地测定IgG1和IgG2水平，已知它们分别与Th2和Th1型 抗体反应有关。
在初次接种之前和之后以及强化后的不同时间点收集血清，并分析 血清中的抗Ag85特异性抗体的存在。在本说明书的其他地方描述了基本 的ELISA方法，除了使用纯化的Ag85蛋白。
细胞因子测定：分析了来自被接种小鼠的脾细胞应答于Ag85再刺激 的细胞因子的分泌，如例如在Huygen et al.，(1992)Effect.Immunity 60： 2880，和美国No.5,736,524中所描述的。简单地，将脾细胞与牛型分枝 杆菌BCG纯化的Ag85A的培养滤液蛋白或C57BL/6T细胞抗原决定簇 肽(氨基酸241-260)一起孵育。
在初次接种后4周和强化后2周(或更晚)，测定细胞因子，用标准生 物测定法测定IL-2、IFNγ和IL-6，利用本领域熟知的方法用ELISA测定 IL-4和IL-10。见，例如Current Protocols In Immunology，Unit 6(John E. Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版 本包括2002年)。
分枝杆菌感染和攻击：为了检验疫苗接种的疗效，用静脉内注射活 的牛型分枝杆菌BCG(0.5mg)攻击小鼠。在攻击后的不同的时间点，分析 BCG在小鼠脾和肺内的增殖。阳性对照是接受了攻击剂量的原初小鼠 (按需为阉割和/或假阉割小鼠)。
为了检验性类固醇清除对预防原发感染的疗效，如上述攻击试验所 描述的相似地注射活的牛型分枝杆菌BCG。假阉割小鼠被当作对照。
预计受攻击的、疫苗接种的小鼠的脾和肺内以及阉割的、原发感染 小鼠的肺内的集落形成单位(CPU)的数目都要显著地低于阴性对照动物， 这说明了在活的牛型分枝杆菌攻击模型中的保护作用。
实施例13：癌症的免疫接种和预防
为了确定性类固醇清除在预防癌症和/引发癌症抗原疫苗接种后的保 护性免疫应答上是否是有效的，进行了以下研究。
材料和方法
阉割：如上进行对C57BL/6小鼠的手术和/或化学阉割。
CEA免疫接种：在手术阉割后近6周或化学阉割后约8周，用编码 人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry et al.，(1995)Cancer Gene Ther.2：33)的腺病毒载体例如是在美国No.6,348,450中所描述的 AdCMV-hcea接种小鼠。或者利用在本说明书的其他地方所描述的各种 DNA疫苗接种的方法将编码人CEA基因的质粒DNA注射到小鼠内(例 如，肌肉内注射到四头肌内)。
肿瘤攻击：为了测定性类固醇清除对CEA免疫的小鼠的抗肿瘤活性 的疗效，小鼠接受了肿瘤攻击。在免疫接种后的不同时间点上，将表达 人CEA基因(MC38-CEA-2)的同基因肿瘤细胞(Conry et al.，(1995)Cancer Gene Ther.2：33)接种到小鼠内。每隔一天观察小鼠的可触及的肿瘤结节 的发育。当肿瘤结节直径超过1cm时，处死小鼠。接种和处死之间的时 间为生存时间。
为了检验性类固醇清除预防肿瘤的疗效，用表达人CEA基因的肿瘤 细胞接种到阉割的、未疫苗接种的小鼠内，如上所列的。假阉割小鼠当 作对照。
实施例14：遗传学修饰HSC的移植(基因治疗)
I.SCID-hu小鼠模型
材料和方法
小鼠：基本上如先前所述的通过将人胎肝和胸腺片段手术移植到 CB-17scid/scid小鼠内制备SCID-hu小鼠中(见例如，Namikawa et al.，(1990) J.Exp.Med.172：1055和Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。构建 SCID-hu Thy/Liv小鼠的方法也可见于例如Current Protocols In Immunology，Unit 6，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York， NY(1994)，和每年更新版本包括2002年。
小鼠的手术阉割：通过腹腔内注射30-40μl溶于盐水的5ml 100mg/ml 盐酸氯胺酮(Ketalar_；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)加上1ml 20mg/ml甲苯噻嗪(Rompun_；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia) 的混和物麻醉SCID-hu小鼠。如在其他地方所描述的进行手术阉割，通 过阴囊切口，显露睾丸，将其用缝线结扎，然后与外周脂肪组织一起取 出睾丸。并手术订关闭伤口。将按上述的但没有取出睾丸的方法所制备 的假阉割小鼠作为对照。
化学阉割：如上进行化学阉割。
人CD34+HSC的分离：用本领域人员所熟知的技术收集并处理人脐 血(CB)HSC(见，例如DiGusto et al.，(1997)Blood，87：1261(1997)， Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。每个CB标本的一部分都进行了 MA2.1表面分子的HLA表型分型。利用Bonyhadi et al.((1997)J.Virol.71： 4707)所描述的方法用免疫磁珠富集CD34+细胞。简单地，将CB细胞与 抗CD34抗体(QBEND-10，Immunotech)孵育，然后洗涤并以2×107/ml的终 浓度重悬。然后按照产品说明书用山羊抗小鼠IgG1磁珠(Dynal)富集 CD34+细胞。然后将CD34+细胞与50μl糖蛋白酶(O-唾液糖蛋白内肽酶) 孵育，该酶造成CD34+细胞从免疫磁珠上的释放。用磁铁去除磁珠，然 后细胞被用于利用所结合的抗CD34-PE抗体的流式细胞术，以确定细胞 群中所存在的CD34+细胞的总水平。或者，细胞被用抗CD34抗体磁性 标记并储存于autoMACSTM中。autoMACSTM可被用于在进一步的流式细 胞术分选之前进行对细胞的磁性预分选。例如，可以往FITC或PE染色 的细胞内加入抗FITC或抗PE的MACS_MicroBeads。然后autoMACSTM 根据细胞的磁性标记分选细胞。可以选择阳性或阴性部分用于流式细胞 术的分选。
任选地，可以用IL-3、IL-6以及或用SCF或LIF(每种10ng/ml)体外 扩增HSC。
RevM10载体和遗传学修饰的(GM)HSC的制备：RevM10在本领域 是已知的，并且在对用于HIV感染患者的T细胞存活的GM HSC的研究 中已经广泛地描述了本载体(见，例如，Woffendin et al.，(1996)Proc.Natl. Acad.Sci.USA，93：2889；for review，see Amado et al.，(1999)Front.Biosci. 4：d468)。已知HIV Rev蛋白能影响HIV感染细胞内的病毒潜伏期，并对 HIV复制是至关重要的。RevM10是Rev的衍生物，因为与细胞因子相 互作用的Rev的富含亮氨酸区域内的突变。RevM10具有78位点上的门 冬氨酸对亮氨酸的取代以及79位点上的亮氨酸对谷氨酸的取代。这些突 变的结果是RevM10能与野生型HIV Rev有效地竞争与Rev反应元件 (RRE)的结合。
可以使用本领域已知的并被描述的任何一种RevM10基因转移载体。 例如，逆转录病毒的RevM10载体，pLJ-RevM10被用于转化HSC。 pLJ-RevM10载体已经显示出在转运到HIV感染的个体后能增强T细胞 植入(Ranga et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1201)。构建的其他 方法和适用于制备GM HSC的逆转录病毒载体在本领域是熟知的(见，例 如，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。
在另一个实例中，pRSV/TAR RevM10质粒被用于利用颗粒介导的基 因转移将非病毒载体转运到所分离的靶向HSC内，基本上同Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11581所描述的。也可以使用含 有Rous肉瘤病毒(RSV)启动子以及来自HIV的-18到+72的tat激活反应 元件(TAR)被用于表达RevM10的开放阅读框的pRSV/TAR RevM10质粒 (Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11581；Liu et al.， (1997)Gene Ther.1：32)。先前已经显示该质粒对人PBL的体外转染提供 了对HIV感染的抗性(Woffendin et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 91：11581)。
一种标记基因例如Lyt-2α(小鼠CD8α)基因也可以被结合到RevM10 载体内，以方便在随后步骤中的对GM HSC的纯化和分析的FACS分析 (见，例如，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。
构建了含有甲硫氨酸(Met)起始密码子(ATG)的缺失以及包括一系列 在框架内插入到RevM10基因的BgIII位点内的终止密码子的连接物的 ΔRev10，并被用作为阴性对照(见，例如Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71： 4707)。
GM HSC被注射到小鼠内：在胸腺和肝植入后约4个月分析了 SCID-hu小鼠。为了清除细胞群，被确定为与人供者HSC HLA不匹配的 (MA2.1)的小鼠接受了近400rads的全身照射(TBI)。TBI之后，如先前所 述的用RevM10GM HSC(见上)重建小鼠(DiGusto et al，(1997)Blood， 87：1261，Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)。给对照小鼠注射未修饰 的HSC或已经用ΔRevM10基因或无关基因修饰的HSC。
流式细胞术对GM HSC的分析：在GM HSC重建后近8到12周， 取出Thy/Liv移植物，得到胸腺细胞并用本领域人员容易知道的流式细胞 术和FACS分析的方法分析其的HLA表型(MA2.1)以及CD4+、CD8+、 和Lyt2(“标记物”，CD8α的小鼠同系物)表面表达的分布(见，例如 Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707；也见Current Protocols In Immunology，Unit 6，John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York， NY(1994)，和每年更新版本包括2002年)。利用标准PCR方法用特异于 RevM10基因的引物测定了胸腺细胞的转基因DNA。
对GM HSC对HIV感染抗性的分析：在GM HSC重建后近8到12 周，取出Thy/Liv移植物并从GM HSC重建的SCID-hu小鼠中得到胸腺 细胞。如先前所述的(Bonyhadi et al.，(1997)J.Virol.71：4707)，用HIV-1 的JR-CSF分子分离物体外刺激并感染胸腺细胞。简单地，含有10％FCS、 50μg/ml链霉素、50U/G青霉素G、1×MEM维生素溶液、1×转移胰岛素 的亚硒酸钠培养基补充物(Sigma)、40U人rIL-2/ml、和2μg/ml植物凝血 素(PHA)(Sigma)的RPMI培养基中，在有着经照射的异基因喂养细胞(106 外周血单个核细胞/ml和105JY细胞/ml)时，体外刺激胸腺细胞。约每10 天如先前在Vandekerckhove et al.，(1992)J.Exp.Med.1：1033中所述的用 喂养细胞和PHA再刺激细胞。在刺激后近5天时，根据HLA表型(MA2.1) 和Lyt2(“标记物”，CD8α的小鼠同系物)分选细胞。所分选的细胞被再 刺激并可以被扩增到增加细胞组成到超过约90％纯度。然后分选出 CD4+/Lyt2+细胞，将一部分近5×104个所分选的细胞放入到96孔U底组 织培养板的多个孔内。往每个孔中加入约200TCD50的EW、HIV-1初级 分离物，或1000TCD50的JR-CSF、HIV-1分子分离物。先前已经描述了 病毒储存液制备的方法(Bonyhadi et al.，(1993)Nature，363：728)。从第3 天到12天每天更换培养基。隔天收集上清液部分并储存在-80℃直到使 用。然后按照产品说明书(Coulter)用p24ELISA分析组织培养上清液。
II.HIV感染个体的治疗
材料和方法
人CD34+HSC的分离：因为绝大多数HIV感染患者有着非常低滴 度的HSC，因此用供者供给细胞是可能的。在实践中，通过在收集细胞 之前给供者注射10μg/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天，增强了供 者血液中的HSC水平。
在这个实施例中，用本领域人员熟知的技术收集并处理人脐血 (CB)HSC(见，例如DiGusto et al.，(1997)Blood，87：1261；Bonyhadi et al.， (1997)J.Virol.71：4707)。每个CB标本的一部分被用于进行HLA表型分 型，例如用流式细胞术或免疫磁珠从供者血液(或BM)中纯化出CD34+ 供者细胞，基本上如上述的。用流式细胞术所鉴定的供者来源的HSC是 CD34+细胞。
任选地，可以用IL-3、IL-6以及或用SCF或LIF(每种10ng/ml)离体 扩增HSC。
RevM10载体和遗传学修饰的(GM)HSC的制备：可以使用在本领域 已知的并被描述的任一RevM10基因转移载体，包括那些在上面的小鼠 研究中所描述的载体。利用GM逆转录载体的基因转导或利用颗粒介导 的输送的基因转染的方法在本领域也是熟知的，并在本说明书的其他地 方有所描述。
如上所述，可以构建逆转录病毒载体含有HIV-1rev基因的反式显性 突变形式Rem10，该突变形式已经显示能抑制HIV复制(Bonyhadi et al.， (1997)J.Virol.71：4707)。通过用来自载体转染的亲嗜性(ecotropic)生产细 胞的过滤上清液的感染生成了含有双向载体的上清液。
在加有IL-3、IL-6和SCF或LIF(每种10ng/ml)的LCTM培养基中， 任选地预刺激所收集的CD34+细胞，以诱导细胞进入细胞周期。
在这个实施例中，利用颗粒介导的(“基因枪”转移)用线性RevM10 质粒对富含CD34+的HSC进行转染，基本上如在Woffendin et al.，(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：2889中所述的。但是，如果进行逆转录病 毒转导，就反复地往细胞内加入含有载体的上清液2-3天，以容许载体转 导到细胞内。
对HIV感染患者的HAART治疗：在T细胞耗竭和性类固醇清除之 前开始HAART治疗，在整个过程中都保持治疗以减少病毒滴度。
T细胞耗竭：如在实施例5中所给的，进行T细胞耗竭以尽可能地 去除许多HIV感染细胞。
性类固醇清除治疗：如在实施例6中所述，给予HIV感染患者性类 固醇清除治疗。
将GM HSC注射到患者体内：在注射之前，将GM HSC在包括IL-2 (Chiron，300IU/ml)的X-Vivo15培养基中培养扩增近10天。在给予LHRH 激动剂后近1-3周，在胸腺刚刚开始再活化之前或同时，给患者注射遗传 学修饰的HSC，任选的剂量为约2-4×106个细胞/kg。也可以任选地给受 者注射G-CSF，有助于GM HSC的扩增。
在给患者输注之前即刻，用Dulbecco PBS洗涤GM HSC 4次。将细 胞重悬于100ml含有1.25％人白蛋白和4500U/ml IL-2的盐水中，并在30 分钟内输注到患者体内。
在给HIV感染患者性类固醇清除和注射GM HSC之后，所有新的T 细胞(以及DC、巨噬细胞等)都耐受于该病毒随后的感染。给进行胸腺再 活化的患者注射异基因HSC意味着HSC将进入胸腺。正再活化或已再 活化的胸腺摄取遗传学修饰的SHC并将其转化为供者型T细胞和DC， 而将受者的HSC转化为受者型T细胞和DC。通过细胞死亡诱导删除， 或通过免疫调节细胞诱导耐受性，供者DC将耐受任何的可能与受者反 应的T细胞。
当建立了胸腺嵌合体时，新的成熟T细胞群已经开始离开胸腺，出 现了免疫抑制的减轻以及最终的消失。
输注后治疗：在输注之后，利用对从患者中得到的PBL标本的限制 性稀释PCR定期测定GM HSC在HIV感染患者中的保留时间和半衰期， 基本上如在Woffendin et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：2889中 描述的。比较了被感染患者与接受ARevM10载体的阴性对照患者中的 GM HSC相对水平。
也利用本领域熟知的方法进行各种标准的血液学的(例如CD34+T 细胞计数)、免疫学的(例如中和抗体滴度)和病毒学的(例如病毒滴度)研 究。
免疫抑制的终止：如在实施例16中所给出的终止免疫抑制。
实施例15：可供选择的方案
在缩短供者细胞、组织或器官的移植所需的时间方面，修改了实施 例1-14中所用的时间线。同时开始T细胞清除或其他免疫细胞耗竭及性 类固醇清除。T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续约10天，而性类固醇 清除持续3个月左右。在一个实施方式中，在开始联合治疗后10-12天左 右，当胸腺开始再活化时，进行HSC移植。
在一个甚至更短的时间表中，同时开始两种类型的耗竭和HSC移植。 在这种情况中，T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续了3-12个月，例如 3-4个月。
实施例16：免疫抑制的终止
当建立了胸腺嵌合体以及新的成熟T细胞群开始离开胸腺时，从患 者中取血，并在标准的混和淋巴细胞反应中体外检查T细胞的对供者细 胞的应答性的缺失(见，例如，Current Protocols InImmunology.John E. Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版 本包括2002年)。如果没有应答，逐步减少免疫抑制治疗以容许对感染的 防御作用。如果没有排斥的征象，如血液中所存在的活化T细胞的存在 所部分提示的那样，最终完全停止免疫抑制治疗。因为HSC具有很强的 自我更新的能力，所形成的造血嵌合体理论上将在患者的终生都是稳定 的(也就是正常的、未耐受的和未植入的人)。
实施例17：使用LHRH激动剂再活化人胸腺
材料和方法
为了显示人胸腺可以被本发明的方法所再活化，这些方法被用于已 经用化疗治疗前列腺癌的患者。
患者：选择了16例I-III期前列腺癌患者(用他们的前列腺特异性抗 原(PSA)积分所评价)。所有的对象都是年龄在60和77岁之间的男性， 这些患者在按需接受前列腺癌的局部放疗之前，都经受了标准的联合的 雄激素阻断治疗，治疗依据每月注射GnRH激动剂，每月3.6mg醋酸戈 舍瑞林(Zoladex_)或7.5mg亮丙瑞林(Lupron_)治疗共4-6个月。
FACS分析：将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl全血中，并 在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其重悬于 1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、 CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE (都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
统计学分析：通过比较治疗前和治疗后结果，每个患者都作为内对 照，并用配对学生t检验或Wilcoxon标记的秩和检验分析结果。
结果
在性类固醇清除治疗之前和4个月后评价前列腺癌患者。在图19-23 中概述了结果。数据共同地证实了许多患者内的T细胞状态的定量和定 性的提高。
I.LHRH治疗对淋巴细胞和其中T细胞亚组的总数的作用
分析了进行前列腺癌的LHRH激动剂治疗的患者(都＞60岁)的外周 血淋巴细胞的表型组成(图40)。在治疗前和在开始LHRH激动剂治疗后 4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总淋巴细胞数目 都在对照值的低限。
在治疗之后，9例患者中的6例显示出总淋巴细胞计数的显著增加 (在一些病例中观察到了总细胞数目的翻倍)。与此相关的是9例患者中的 6例有总T细胞数目的增加。在CD4+亚组内，这种增加在9例患者的8 例中甚至是更为明显的，证实了CD4+T细胞水平的增加。在9例患者的 4例患者中看到了CD8+亚组内的较不突出的趋势，表现为水平的增加， 虽然通常增加的程度要小于CD4+T细胞。
II.LHRH治疗对T细胞亚组的比例的作用：
对在LHRH激动剂治疗之前和之后的患者血液的分析证实在T细胞、 CD4+或CD8+T细胞的总体比例上没有显著变化以及CD4+∶CD8+比例在 治疗后有着不同的变化(图41)。这说明治疗对T细胞亚组的内环境稳态 的保持上有着很小的作用，尽管治疗后显著地增加了总T细胞数目。所 有数值都与对照值相当。
III.LHRH治疗对B细胞和髓细胞的比例的作用
对进行LHRH激动剂治疗的患者的外周血内的B细胞和髓细胞 (NK、NKT和巨噬细胞)的比例的分析证实在亚组内有着不同程度的变 化(图42)。NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，而9 例患者中的4例出现了B细胞比例的下降。
IV.LHRH激动剂治疗对B细胞和髓细胞总数的作用
对治疗后的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目的分析清楚地显示 治疗后增加了NK(9例患者中的5例)、NKT(9例患者中的4例)和巨噬 细胞(9例患者中的3例)的细胞数目的水平(图43)。B细胞数目没有显 示出突出的趋势，其中9例患者中的2例显示出水平的增加，9例患者中 的4例显示出没有变化，以及9例患者中的3例显示出水平的减少。
V.LHRH治疗对原初细胞相对于记忆细胞的水平的作用
LHRH激动剂治疗后所看到的主要变化是在外周血的T细胞群内。 特别是，有着原初(CD45RA+)CD4+细胞的比例的增加，以及在CD4+T 细胞亚组内，9例患者中的6例出现了原初(CD45RA+)对记忆 (CD45RO+)的比例的增加(数据没有显示)。
VI.结论
因此可以推论：对动物例如具有萎缩胸腺的人的LHRH激动剂治疗 能诱导胸腺的再生。已经显示了已经接受性类固醇清除治疗的这些前列 腺癌患者的血T淋巴细胞状态的普遍提高。似乎这些细胞是来源于胸腺， 因为已经描述了没有主流的(TCRαβ+CD8αβ链)T细胞的其他来源。胃 肠道T细胞主要是TCRγδ或CD8αα链。
实施例18：人的外周免疫细胞池在造血干细胞移植后的再生
I. 异基因和自体HSCT
这个实施例涉及用HSCT患者所进行的临床试验。为了评价恢复人 的胸腺和骨髓功能的临床可能性，已经分析了常规进行基于LHRH激动 剂(化学阉割)的性类固醇清除治疗的前列腺癌患者(＞60岁)。在治疗开 始时和在此时所有患者的血清睾酮浓度都处于阉割水平的治疗后4个月， 检查患者。
材料和方法：
患者：82例患者都因为恶性疾病或骨髓衰竭进行了大剂量化疗 (HDT)和PBSCT(异基因对照患者22例，异基因LHRH-A治疗患者20 例；自体对照20例；自体LHRH-A治疗患者20例)。在自体或异基因干 细胞移植前3周，给予测试患者3.6mg(有效4周)Zoladex(LHRH-A)， 然后每月注射共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周、和此后的每 个月直到12个月分析所有患者。从Alferd人体研究伦理委员会得到伦理 许可(试验编号01/006)。
对全外周血的FACS分析：将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl 全血中，并在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其 重悬于1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、 CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE (都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
Ki67分析：为了检测增殖细胞，用CD27-FITC、CD45RO-CyChrome、 and CD4-或CD8-APC(Pharmingen，San Diego，CA)表面染色标本。在红 细胞裂解后，将标本在500μl 1X FACS透化溶液(Becton-Dickinson，USA； 从RO水的10X溶液中制得1X溶液)中暗处，RT下孵育20分钟，将洗 涤过的标本(2ml FACS缓冲液，5分钟，600gmax，RT)与抗Ki-67-PE或 抗Ki67-FITC(或合适的同型对照)在室温下暗处一起孵育30分钟。然后 洗涤标本并将其重悬于1％PFA中用于分析。
PBMC的制备：通过聚蔗糖-泛影葡胺分离和随后的离心制备出纯化 的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分析，取出血浆层，在分析性 类固醇水平之前将其储存在-20℃。没有被用于T淋巴细胞刺激检测的细 胞被重悬于冷冻培养基中，并在TREC分析之前将其储存在液氮中。
T淋巴细胞刺激检测：对于促有丝分裂原刺激，按每孔100μl RPMI-FCS内的1×105个细胞的浓度将纯化的淋巴细胞平铺在96孔圆底 板中。将细胞与剂量从1-10μg/ml的PHA在37℃，5％CO2下一起孵育。 对于TCR特异性刺激，将细胞在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗 CD28(10μg/ml)涂层的板中孵育48个小时。在空斑形成后(48-72个小 时)，往每孔内加入1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。 收集板到过滤包(mats)中，并在β计数器(Packard-Coulter，USA)上用液 态闪烁法测定3H-胸腺嘧啶核苷的掺入情况。
TREC分析：
细胞分选：将冷冻的标本快速融化并用抗CD4-FITC和抗CD8-APC 在冰中染色30分钟，将其洗涤(2ml FACS缓冲液)以及用3％福尔马林 PBS溶液固定(搅拌下)。再孵育标本30分钟，洗涤并将其重悬在500μl用 于分选的FACS缓冲液中。在MoFlo_细胞分选仪(Cytomation Inc.)中分 选出CD4+和CD8+细胞群。
DNA分离：分选细胞并将其重悬于蛋白酶K(PK)消化缓冲液中 (2×105个细胞/20μl 0.8mg/mL溶液)。将标本在56℃下孵育1个小时，随 后在95℃下孵育10分钟以灭活蛋白酶。
利用分子信标的实时PCR：如先前所述的(Zhang et al.，(1999)J.Exp. Med.190：725)进行用于分析所选细胞内的TREC含量的实时PCR。引 物为：有义引物，5′-GGATGGAAAACACAGTGTGACATGG-3′(SEQ ID NO：4)，反义引物，5′-CTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCC-3′(SEQ ID NO：5)。进行1个循环的变性(95℃10分钟)，随后是45个循环的扩增 (94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒)。为了标准化输入DNA中的细胞等 价物，用分开的实时PCR检测定量CCR5编码序列，它不含有假基因。
统计学分析：用Instat II软件进行统计学分析。对于前列腺癌HSCT 研究，进行Mann-Whitney U检验。对于人体研究，通过比较治疗前和治 疗后的结果，每个患者都作为内对照，并用配对的学生t检验或wilcoxon signed秩合检验分析结果。
结果：
图49描述了在HSCT后的不同时间点(2-8周)对对照患者的自然杀 伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在两个对照的异基 因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反地，在HSCT前3周 接受LHRH-A治疗的异基因患者从移植后第14天到5个月都显示出了显 著更高的NKT细胞(Vα24+Vβ11+)数目(图49C，数据表示为6-20例患 者的平均值±1SEM，*p≤0.05)。根据它们的Vα24+Vβ11+表型分析NKT 细胞。
图50描述了在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35天)对 对照患者的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期 恢复，这主要见于移植后早期的CD8+群内，这说明了胸腺外途径的再生。 从移植后1个月开始，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的B 细胞重建。如图51B所示，自体移植患者中的B细胞重建比异基因患者 中的发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月，两组内 的向对照值(阴影部分)的恢复仍不明显。
图52描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的 CD4+重建。当B细胞数目在移植后6个月恢复到对照值时(见图48A-B)， 自体的(图52B)和异基因的(图52A)受者中的CD4+T细胞数目仍是 严重减低的，甚至在移植后12个月时。
图53描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的 CD8+细胞再生。如图53A-B所示，相应地在异基因和自体受者中，CD8+ T细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53C所示，CD8+T细 胞主要是胸腺外来源的，如TCRγδ+T CD8+T细胞、CD8ααT细胞和 CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样。
图54描述了利用标记物Ki-67对HSCT之前(图54A)和28天后(图 54B)的对照患者的不同的CD4+和CD8+T细胞群的增殖的FACS分析。 利用标记物CD45RO和CD27，根据原初、记忆和活化表型分析细胞。 大多数的增殖发生在CD8+T细胞亚组，这还说明这些细胞是胸腺外来源 的以及主要的增殖都发生在外周T细胞亚组内。
图55描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者及 LHRH-A治疗患者的原初CD4+T细胞再生。图55描述了对原初CD4+T 细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析，并显示这些细胞在整 个研究过程中的严重缺失。如图55B-C所示，自体移植患者中的原初 CD4+T细胞到HSCT后12个月时开始再生(图55C)，但异基因患者中 的仍显著地低于对照值(图55B)。这些结果说明胸腺因为患者的年龄而 不能在移植后恢复足够多的原初T细胞的数目。相反地，在异基因前3 周接受LHRH-A的患者中，到移植后9&12个月时都显示出比对照显著 更高数目的原初CD4+T细胞(与对照(未LHRH-A治疗的)比较，移植 后9&12个月的p≤0.05)(图55D)。这说明胸腺依赖性T细胞途径的再生 随着性类固醇清除治疗而增强。
图56描述了在HSCT后不同时间点(1-12个月)的对照患者的 TREC水平。对仅见于新近胸腺迁出细胞(RTE)的TREC水平的分析着 重于异基因(图52A)和自体(图52B)患者的胸腺在移植后恢复水平的 无能。这再次被归结于患者的年龄，以及因为胸腺萎缩所造成的胸腺功 能的缺失，已经认为这对这些患者的发病率和死亡率都有着相当的影响。 相反地，当在异基因移植前接受LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干 细胞移植的患者都表现出CD4+TREC+细胞/ml血的显著增加(与对照 (未LHRH-A治疗的)比较，移植后9个月的p≤0.01)。接受LHRH-A治 疗的异基因患者在移植后9个月时显示出比对照显著更高数目的CD4+ TREC+细胞/ml血。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月也显示 出显著更高的水平(图56D)。这说明胸腺再活化随性类固醇清除治疗的 增强。数据表示为5-18例患者的平均值±1SEM，*p≤0.01。
LHRH-A给药显著地增加了外周血的NK但不是B细胞的数目。总 体而言，没有观察到B细胞数目随LHRH-A治疗的显著变化(图47)。但 是，观察到了NK细胞数目随治疗的显著增加(p≤0.01)(图47)。因此， 性类固醇的去除造成了T细胞和NK细胞数目的显著增加。
与对用LHRH-激动剂所治疗的患者的先前研究一致(Garzetti et al.， (1996)Obstet.GynecoL 88：234-40；Oliver et al.，(1995)Urol.Int，54： 226-229；Umesaki et al.，(1999)Gynecol.Obstet.Invest.48：66-8)，观察到了 总淋巴细胞、T细胞(主要是CD4+)和NK细胞的显著增加(图45和47)。 对T细胞群的更为详细的分析发现了原初CD4+T细胞以及原初和记忆 CD8+T细胞数目在LHRH-A治疗后的显著增加(图44)。
为了确定原初T细胞的增加是否是通过外周扩增(见例如用IL-7给 药的实例(Soares et al.，J.Immunol.(1998)161：5909-5917))或是作为胸 腺再活化的直接结果，进行了对细胞增殖(Ki-67抗原+)以及TREC水平 的分析(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79：631-40)。在CD4+(图48A) 和CD8+T细胞(图48B)的原初、活化或记忆细胞群中，都没有看到增 殖水平随激动剂治疗的任何变化(仍为2-4％的低水平)。这说明治疗没有 直接诱导T细胞的增殖，以及外周的过度增殖不会影响TREC的水平。 这没有除外在更早时间点的外周扩增的可能性。但是，预计这将仅仅造 成活化/记忆细胞水平的增加。在对10例患者的TREC水平的分析之后， 发现了胸腺功能和T细胞数目的增加的直接证据(图46B)。在CD4+和 CD8+T细胞群内，10例患者中的5例到LHRH-A治疗4个月时显示出 绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超过最初显示值的＞25％)。这也被 反映于比例的增加(每1×105个细胞)。与此相关的10例患者中的6例都 显示出总TREC水平的总体增加。仅仅1例患者显示出总TREC(减少约 10％)的减少。因为能在胸腺内发生作为正常T细胞发育的一部分或输出 后的有丝分裂(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79：631-40)稀释了 TREC(Zhang et al.，(1999)J.Exp.Med.190：725-732)，绝对TREC水平将 表示对T细胞输出的非常的低估值。因此，激动剂治疗后的外周的总 TREC+细胞的显著增加与胸腺依赖性T细胞途径的再生(Douek et al.， (1998)Nature 396：690-695(1998)；Douek et al.，(2001)J.Immunol.167： 6663-8；Hochberg et al.，(2001)Blood 98：1116-21)完全一致。总的，这些 数据证实了性类固醇抑制提高了成人的胸腺输出的能力并提供了恢复在 多种临床病变中的严重T细胞耗竭后的原初T细胞数目的基础。
实施例19：性类固醇清除增强了小鼠的造血干细胞移植后的免疫重建
进行这个试验是为了检验异基因HSCT受者的性类固醇抑制能提高 它们的移植后免疫重建的假说。因此，这些试验旨在建立性类固醇清除 是否影响异基因HSCT后的造血恢复。在HSCT后14天时，阉割小鼠比 假阉割对照显著地增加了胸腺细胞数目。到28天时，这些细胞仍在增多， 此时阉割小鼠的脾细胞密度也有增加。在胸腺中，T细胞前体和DC在 HSCT和阉割后都有着显著增加。在HSCT和阉割后，也显著地增加了 BM前体细胞和发育中的B细胞。这些中心增加转变为异基因HSCT后 的供者来源的外周T和B细胞的显著增加。每一种免疫增强策略都带来 了加重发生移植物抗宿主病(GVHD)的危险。在异基因组中，在诱导 GVHD的同时阉割小鼠。当比较阉割和假阉割小鼠时，GVHD发生率或 严重度都没有显著差异。此外，在缺乏性类固醇时，GVT活性没有消失。 先前已经显示在IL-7治疗后增强了异基因HSCT受者的淋巴细胞恢复。 IL-7治疗和阉割的联合表现出对HSCT后的胸腺具有累加作用。这些结 果说明阉割及所造成的性类固醇的清除增强了异基因HSCT后的造血恢 复，且没有加重GVHD并保留了GVT。
材料和方法
试剂：抗小鼠CD16/CD32FcR封闭剂(2.4G2)和所有下面的荧光团 标记的抗小鼠抗原的抗体都来自Pharmingen(San Diego，CA)：Ly-9.1 (30C7)、CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8.2(53-5.8)、T细胞受体β (TCR-β；H57-597)、CD45R/B220(RA3-6B2)、CD43(S7)、IgM-FITC (R6-60.2)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(Gr-1)(RB6-8C5)、c-kit(2B8)、Sca-1 (D7)、CD11c(HL3)I-Ak(11-5.2)、同型对照物：鼠IgG2a-k(R35-95)、鼠 IgG2a-1(B39-4)、鼠IgG2b-(A95-1)、鼠IgGl-k(R3-34)、仑鼠IgG-group l-k (A19-3)、仑鼠IgG-group 2-1(Ha4/8)、和2.4G2及Fcr(FcR封闭剂)。抗生 物素蛋白链球菌-FITC、PercP-藻红蛋白(PE)也来自Pharmingen(San Diego，CA)。重组人IL-7由Michel Morre博士(Cytheris，Vanves，France) 提供。
为了确认人重组IL-7能刺激小鼠细胞，用IL-7依赖性小鼠前B细胞 株2E8进行了胸腺嘧啶核苷掺入增殖检测，并发现在研究中所用的人IL-7 对小鼠细胞具有与小鼠IL-7相等的增殖作用。组织培养基由加有10％热 灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺 的RPMI 1640(以及用于培养32Dp210细胞和增殖检测的50mM 2-巯基乙 醇)构成。
小鼠和HSCT：雄性C57BL/6J(B6，H-2b)、C3FeB6Fl/J([B63C3H]F1； H-2b/k)、B10.BR(H-2k)、B6D2F1/J(H-2b/d)、CBA/J(H-2k)、Balb/c(H2-d)、 IL7-/-和KGF-/-小鼠都来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)，并当它们 为8到12周大之间时将其用于试验中。使用4个月到7个月中间大的 KGF-/-和IL7-/-小鼠。HSCT方案得到了Memorial Sloan-Kettering癌症中 心研究所的动物照顾和使用委员会的许可。从股骨和胫骨中无菌取出BM 细胞。通过与抗Thy-1.2抗体在4℃孵育30分钟，紧接着与低TOX-M兔 补体(Cedarlane Laboratories，Hornby，ON，Canada)在37℃孵育1个小时， 取出了供者BM的T细胞。通过在尼龙绒毛柱上的纯化及随后用氯化氨 红细胞裂解缓冲液去除红细胞，得到了脾T细胞(用于GVHD分析)。将 细胞(有或没有脾T细胞和白血病细胞的5×106个BM细胞)重悬于 Dulbecco改良基本培养基(Life Technologies，Grand Island，NY)中，并在 第0天将其通过尾部静脉输注(0.25mL总体积)移植到致死性照射的受 者中。在移植前的第0天，受者接受了1300cGy全身照射(137Cs源)，分 次给予，每次剂量之间间隔3小时(以减少胃肠道毒性)。将小鼠圈养在 无菌的微隔离笼中，并接受正常的食物和高压灭菌的次氯酸化的饮用水 (pH 3.0)。
手术阉割：将小鼠麻醉并切出小的阴囊切口以显露睾丸，将睾丸结 扎并与外周的脂肪组织一起取出。用手术订关闭伤口。假阉割除了取出 睾丸外要求相同的手术操作。在BM移植前1天进行阉割，用于免疫重 建和GVHD研究。
IL-7的给药：或从第0到13天或从第21到27天腹腔内给予10μg/ 天IL-7，用于免疫重建研究。在相同的时间点给对照小鼠注射PBS。
流式细胞术分析：在FACS缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS)/2％小牛血 清蛋白(BSA)/0.1％叠氮化合物)中洗涤BM细胞、脾细胞或胸腺细胞， 并将1-3×106个细胞与CD16/CD32FcR封闭剂在4℃下一起孵育30分钟。 然后将细胞与第一抗体在4℃下孵育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤两 次。根据需要，将细胞与结合的抗生物素蛋白链菌素在4℃下再孵育30 分钟。将所染色的细胞重悬在FACS缓冲液中并在FACSCaliburTM流式细 胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuestTM软件进行分析。
增殖检测：将脾细胞(4×105个细胞/孔)在96孔内与作为刺激物的 经照射的(2000cGy)BALB/C脾细胞(2×105个细胞/孔)孵育5天，并用 αCD3(145-2c11)和αCD28(37.51)(终浓度为2.5mg/mL)刺激脾细胞 (4×105个细胞/孔)4天。在最后18个小时期间，用1mCi/孔[3H]胸腺嘧啶 核苷激动(pulse)培养物，并用Harvester 96(Packard)收集DNA。将刺 激指数(SI)计算为刺激细胞(cpm)对未刺激细胞(cpm)的比值。
51Cr释放测定法：在37℃和5％CO2下，用100mCi51Cr标记2×106 个细胞/mL的靶细胞2个小时。在洗涤三次后，将所标记的靶细胞按 2.5×103个细胞/孔平铺在U底板(Costar，Cambridge，MA)中。将终体积 为200mL的与经照射的BALB/C脾细胞(1∶2比例)培养2天的脾细胞按 不同的效应物：靶细胞比例加入到4到6个孔中，并在37℃和5％CO2下 孵育4到6个小时。最后，从每个孔中取出35mL上清液，并在伽马计 数仪上计数以确定出试验释放。从只接受靶细胞和培养基的孔中得到自 发释放，从接受5％Triton X-100的孔中得到总释放。用下面的公式计算 出细胞毒性百分比：毒性百分比＝100×[(试验释放-自发释放)/(总释放-自 发释放)]。
用细胞内IFN-γ染色对异基因反应性T细胞克隆的检测：简单地，将 细胞与布雷菲德菌A(10mg/mL)孵育12到15个小时(对于用T细胞耗 竭的[TCD]、经照射的刺激型细胞的异基因刺激)，收集并洗涤细胞，然 后用第一(表面)荧光团(FITC、PerCP、和APC)结合的抗体染色、固 定、并用Cytofix/Cytoperm试剂盒(Pharmingen)透化细胞，以及最后用 αIFNγ-PE染色。通过给所设定的群设门进行FACS分析。使用如下面所 提及的流式细胞仪和软件。
迟发型过敏发应检测：在异基因BMT后42天时，经尾部静脉注射 200μl 0.01％羊红细胞(Colorado Serum，Denver，CO)的PBS溶液致敏假 阉割和阉割小鼠。在第46天时，用50μl 20％羊RBC悬液攻击致敏动物 的右后爪垫，同时左后爪垫接受了相同体积的50μl PBS溶液作为对照。 用标识厚度的计量器(Mitutoyo，Kanagawa，Japan)测定24小时和48小 时后的爪垫肿胀。通过试验右侧的爪垫测定值减去PBS注射的左侧爪垫 的测量值测定出反应的强度。
对GVHD的判定：用首先由Cooke et al.((1996)Blood 88：3230-9)所 描述的临床GVHD积分系统判定GVHD的严重度。简单地，每周给编码 笼内的耳部标记的动物个体化地计分5个临床参数(体重减轻、姿态、活 力、皮毛和皮肤)，分值从0到2分。通过累加整个5个条件的积分(0-10) 得出临床GVHD指标。每日监测生存率。积分大于等于5分的动物被认 为是濒死的，并被以人道的方式处死。
对GVT-P815(H-2d)肥大细胞瘤诱导作用的评价以及对肥大细胞瘤 死亡对GVHD造成的死亡的评价：B6D2F1/J受者在异基因HSCT(5×106 个T细胞耗竭的(TCD)BM细胞和5×105个C57/BL6来源的T细胞)的 第0天静脉内接受了1×103个P815(H-2d)细胞。每日检测生存率，如先 前所述的用尸解确定HSCT后的死亡原因。简单地，死于白血病的特征 是肝脾肿大以及显微镜检查在肝和脾内发现有肥大细胞瘤细胞，而死于 GVHD被定义为缺少肝脾肿大及肝和脾内的白血病细胞，以及在死亡时 存在有临床GVHD积分系统所评价的GVHD的临床症状。
半定量RT-PCR：用Superscript II逆转录酶(Life Technologies， Rockville，USA)逆转录全BM的总细胞RNA。用PCR Master Mix (Promega，Madison，USA)PCR扩增cDNA 35个循环(94℃30秒；56℃30 秒；72℃60秒)。HPRT：5′CACAggACTAgAACACCTgC3′和 gCTggTgAAAAggACCTCT3′；TGFβ1：5′CTACTgCTTCAgCTCCACAg3′ 和5′TgCACTTgCAggAgCgCAC3′；KGF：5′gCCTTgTCACgACCTgTTTC 3′和5′AgTTCACACTCgTAgCCgTTTg 3′。
对IL7-/-胸腺的酶消化：IL7-/-小鼠包含有很大比例的CD45-胸腺间 质细胞，每个胸腺都在0.125％(w/v)胶原酶/分散酶(Roche Applied Sciences，Indianapolis，USA)和0.1％(w/v)DNA酶中接受酶消化，从胸腺 中释放出绝大多数的间质和造血细胞，以容许精确地计算胸腺的细胞密 度。用抗CD45抗体鉴别CD45-间质细胞。
统计学：所有的数据都被表示为平均值±SEM。用Mantel-Cox对数 秩合检验分析生存数据，用非参数的、非配对的Mann-Whitney U检验进 行所有其他的统计学分析。小于0.05的P值被认为是统计学显著的。
结果
I.阉割增加了异基因HSCT后的BM、胸腺和脾的细胞密度。在异 基因HSCT前1天阉割胸腺CBA小鼠。小鼠接受了1300cGy全身照射， 和随后的5×106个B10.BR TCD BM细胞。在早到HSCT后14天时(图 29A-B)，与假阉割的对照比较(分比为9.5×106±3.0×105和 25×106±2.6×106)，阉割小鼠的BM(16×106±1.4×106)和胸腺内 (55.4×106±1.8×106)有着显著更多的细胞。在HSCT后28天时，这些数 目在阉割小鼠中仍有显著的提高(BM：22×106±4.0×106对 14×106±2.2×106；胸腺：72×106±5.9×106对45×106±2.9×106)。在第28天时， 阉割小鼠中的脾细胞密度也显著地增高超过了假阉割的脾细胞数目 (253×106±28.4×106对126×106±13.9×106)(图29C)。到28天时，阉割小鼠 开始接近移植前的细胞密度。到了HSCT后42天时，阉割小鼠和假阉割 小鼠之间的胸腺及脾细胞密度不再有显著的差异。因为假阉割受者都是 年轻小鼠，它们具有活跃的移植后淋巴细胞生成，但是与阉割受者比较， 显著地延长达到生成初级和二级淋巴组织的正常细胞密度所需的时间。
II.在HSCT后28天的阉割小鼠的BM中有着显著更多的供者来源 的HSC。一些研究已经显示性类固醇抑制了早期造血前体细胞的增殖和/ 或分化(Thurmond et al.，(2000)Endocrmol.141：2309-2318；Medina et al.， (2001)Nat.Immunol.2：718；Kouro et al.，(2001)Blood 97：2708)。因此，已 经探讨了阉割对异基因移植组中的HSC数目的影响。供者来源的HSC 数目在异基因HSCT后14天的假阉割和阉割小鼠中都是非常低的(分别 为2.98×102±1.25×102和2.66×102±8.8×101)(图30A)。但是，到第28天时， 与假阉割对照比较(1.1×103±4.1×102)，阉割小鼠有着显著更多的 Ly9.1+Lin-Sca-1+c-kit+供者来源的HSC(4.8×103±1.1×103)(图30A)。
III.先于异基因HSCT的阉割增强了供者来源的B细胞的恢复。在 对B细胞恢复的分析中，区分开B细胞发育的三个阶段：原B细胞 (CD45R+CD43+IgM-)、前B细胞(CD45R+CD43-IgM-)和未成熟B细胞 (CD45R+CD43-IgM+)。在异基因HSCT后14天时，与假阉割对照 (2.08×106±5.0×104)比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的前B细胞 (5.5×106±1.7×106)(图30B)。在28天时，在阉割小鼠的BM内也有显著更 多的前B细胞(sham-cx：3.1×106±3.7×105c.f.cx：6.6×106±6.6×105)和未成熟 B细胞(sham-cx：1.3×106±2.6×105c.f.cx：3.0×106±3.4×105)(图30B)。在 HSCT后28天时，BM B细胞和它们的祖细胞的增加转化为阉割小鼠的 脾的未成熟B细胞数目的显著增加(sham-cx：64.9×106±6.4×105 c.f.cx：112.0×106±10.0×105)(图30C)。这些结果与先前的结果吻合，说明阉 割增强了BM的B细胞产生及输出。
IV.阉割增强了异基因HSCT后的T细胞重建。根据CD3、CD4和 CD8的表达，将胸腺细胞和外周细胞分成发育阶段：三阴性(TN) (CD3-CD4-CD8-)、双阳性(DP)(CD4+CD8+)、单阳性CD4(SP CD4) CD3+CD4+CD8-和单阳性CD8(SP CD8)CD3+CD4-CD8+(图31A-D)。早 到异基因HSCT后14天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内有着显著更 多的TN、DP、SP CD4和SP CD8胸腺细胞。在HSCT后28天时，阉割 组内的DP和CD4SP细胞数目仍有显著地提高。到第42天时，假阉割 和阉割小鼠内的所有的胸腺细胞亚群都相同。宿主和供者来源的DC都 被认为在避免移植物排斥上发挥着完全的作用(Morelli et al.，(2001) Semin.Immunol.13：323-335)。在异基因HSCT后14天时，在阉割小鼠 的胸腺内有着显著更多的宿主来源的CD11chiDC。在异基因HSCT后28 天时，阉割小鼠的胸腺内的宿主和供者来源的DC都有着显著地增加(图 31E-F)。在第28天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内的胸腺细胞数目 的增加转化为了阉割小鼠的脾内的供者来源的成熟CD4+和CD8+T细胞 数目的显著增加(图31G)。
V.就每个细胞而言，假阉割和阉割小鼠的T细胞之间没有显著差异。 为了确定异基因HSCT后的阉割小鼠的外周T细胞的功能潜能，进行了 一系列的体外检测。图32A展示了异基因HSCT后6周的阉割小鼠和假 阉割对照的供者来源的T细胞的数目。以两种方式测定了脾T细胞的增 殖能力：αCD3/αCD8交联(图32B)和3rd部分MLR(用经照射的BALB/C 脾细胞作为刺激物)(图32C)。当在这两个组中比较假阉割和阉割小鼠时， 在外周T细胞的增殖能力上都没有显著差异。异基因HSCT后6周，将 脾细胞与经照射的BALB/C脾细胞(3rd部分)培养5天。在异基因刺激5 天后，培养中的绝大多数细胞都是CD8+T细胞。这些细胞的半数被用于 CTL(51Cr)检测以确定出假阉割和阉割小鼠的脾细胞的细胞毒性。测试 了在不同的效应物：靶细胞比值的脾细胞杀伤带有51Cr的A20(BALB/C B 细胞淋巴瘤肿瘤细胞株)细胞的能力(图32D)。在细胞毒性方面，假阉 割和阉割小鼠之间没有显著差异。用3rd部分(BALB/C)或同基因的 (B10.BR)经照射的脾细胞和布雷菲德菌素A重新刺激培养了5天的其他 一半的细胞以确定出IFNγ的产量。图32E显示了供者来源的CD8+T细 胞在BALB/C原初刺激和BALB/C或B 10.BR二次刺激(对照)后的IFNγ 的产量。图32F图解地展示了这一点。当比较假阉割和阉割小鼠时，产 IFNγ的供者来源的CD8+细胞的比例没有显著差异。
为了体内评价免疫功能，使用了DTH检测，其中在阉割和异基因 BMT后42天时，用sRBC致敏小鼠。在第46天，攻击小鼠并在24和 48小时后，测定爪垫肿胀。当与异基因HSCT同时被阉割的小鼠与假阉 割对照比较时，显著地增强了攻击后48小时的DTH应答(图32G)。
这些功能性检测证实，就每个细胞而言，阉割受者的T细胞与假阉 割受者的T细胞相当，并能应答于新的抗原，具有完整的增殖、细胞毒 性和细胞因子的产生。但是，甚至在移植后6周，阉割受者中的显著更 快的T细胞重建转变为了DTH应答的增强。
VI.先于异基因HSCT的阉割没有加重GVHD并保留了GVT活性。 GVHD和GVT都是主要由异基因移植物所转入的异基因反应性供者来源 的T细胞所介导的。任何用于增强免疫重建的治疗都有可能加重GVHD 或相反地减弱GVT活性。为了建立阉割对供者来源的异基因反应性T细 胞没有刺激作用，通过往异基因移植物内加入异基因供者T细胞诱导 GVHD。当比较阉割和假阉割小鼠时，因为GVHD所造成的发病率或死 亡率都没有显著差异(图33A)。为了评价阉割对GVT活性的作用，在移 植的同时将肥大细胞瘤细胞株P815(H-2d)注射到B6D2F1/J受者中。尸 解在试验期间死亡的动物，并确定出死亡的原因(肿瘤对GVHD)。肥大 细胞瘤所造成的死亡率在阉割后仍未改变(9只小鼠中的6只)，当与假 阉割对照比较时(8只小鼠中的5只)。这说明阉割没有消除HSCT后的 GVT应答(图33B)。
VII.异基因HSCT后的IL-7和阉割具有累加作用。先前已经显示 IL-7治疗能增加没有其他治疗的动物的T和B细胞的数目，以及也能增 强环磷酰胺、照射、同基因和异基因HSCT治疗后的淋巴系的复原 (Alpdogan et al.，(2001)Blood 98：2256；Bolotin et al.，(1996)Blood 88： 1887；Faltynek etal.，(1992)J.Immunol.149：1276；Morrissey et al.，(1991)J. Immunol.146：1547)。已知IL-7通过增加胸腺活性和外周扩增增加了T 细胞数目。
因此，决定在异基因HSCT的受者中联合阉割施与IL-7。治疗后14 天时，在阉割小鼠和那些接受联合治疗(阉割和IL-7给药)的小鼠的胸 腺中有着显著更多的细胞。在这早期时间点上，在PBS治疗的、假阉割 对照和IL-7治疗的、假阉割小鼠中都没有看到差异。在阉割组和接受联 合治疗的小鼠之间也没有看到显著差异，说明在异基因HSCT、IL-7治疗 和阉割后14天时，这仅仅是阉割所造成的作用(图34A)。在异基因HSCT 后28天的这个较晚的时间点上，单独阉割组和单用IL-7组的胸腺的细胞 密度都显著地高于对照组。当在异基因HSCT后28天分析时，IL-7治疗 和阉割的联合治疗对胸腺细胞密度具有累加作用(图34B)。
VIII.对IL-7、TGFβ1和KGF的半定量RT-PCR发现异基因HSCT 和阉割后的KGF的增加和TGFβ1的减少。对全骨髓细胞的RT-PCR发现 晚到异基因HSCT后6周时在假阉割和阉割小鼠中都没有可检测到的 IL-7转录的水平。当使用来自对照的、未移植的小鼠的模板时，检测到 了IL-7(数据没有显示)。已知TGFβ1和KGF是造血的关键介导物。在阉 割和异基因BMT后2周时，使用HPRT equibrated模板显示TGFβ1的减 少和KGF的增加(图34C)。
IX.在KGF-/-小鼠而不是在IL-7-/-小鼠中看到了阉割后所发生的变 化。为了进一步地研究隐藏在阉割后所增强了的免疫重建后面的可能机 制，阉割了KGF-/-和IL-7-/-小鼠，2周后分析了胸腺、脾和BM(TGFβ1-/- 小鼠在青春期前死亡，Shull et aL(1992)Nature 359：693)。当比较假阉割 和阉割的KGF-/-小鼠时，显著地增加了胸腺的细胞密度。尽管在这个早 期时间点上没有看到BM和脾的总细胞密度上的差异，如先前在野生型 小鼠中所看到的一样，在BM的B细胞组内看到了变化(Ellis et al.(2001) Int.Immunol.13：553；数据没有显示)。因为IL-/-小鼠的胸腺内的细胞的 大部分都是CD45-间质细胞的事实，当使用这些小鼠时，用酶消化得到 了细胞悬浮液。通过进行酶消化，更多的细胞被释放到悬浮液中，这造 成了这个试验中所看到的比先前文献中的稍微更高的胸腺细胞密度(von Freeden-Jeffry et al.(1995)J.Exp.Med.181：1519)。当比较阉割小鼠和假 阉割对照时，在IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、脾(图34H)或BM(图34I)中 都没有看到差异。这些发现说明IL-7在阉割和异基因HSCT后所看到的 增强了的免疫重建中的重要作用。
讨论
异基因HSCT的受者经历了一段长时间的免疫缺陷期，这与致命性 的感染相关。随着受者年龄的增加，这种感染的危险增加，因为完全的 免疫学重建所需的时间更长。HSCT后的免疫缺陷期可以超过1年，最近 长期的研究证实更老的HSCT患者比他们的供者减少了TREC+CD4+T 细胞(Storek et al.，(2001)Blood 98：3505；Lewin etal.，(2002)Blood 100： 2235)。这说明胸腺的损伤和随后的T细胞产量的下降可能比所想象的更 长。绝大部分的HSCT后的感染与外周CD4+T细胞的缺乏相关(Storek et al.，(1997)Am.J.Hematol.54：131)。因此，阉割后所发生的外周T细胞数 目的增加可能减少这些感染的发病率，导致移植患者的总生存率的增加。
多个小组都已经把它们的研究的重点集中在HSCT后的造血重建上， 绝大多数有希望的结果都来自造血生长因子和细胞因子的应用。例如， G-CSF被用于动员供者干细胞(Dreger et al.，(1993)Blood 81：1404)。 Noach等显示用SCF和IL-1II或SCF和Flt-3配体的预处理造成了供者细 胞植入的增强((2002)Blood 100：312)。KGF表现出增强了同基因和异基 因组的植入和重建并改善了GVHD(Panoskaltsis-Mortari et al.，(2000) Blood 96：4350；Kriianovski，et al.，(1999)Blood 94：825)。IL-7增强了同基 因HSCT后的免疫重建(Bolotin et al.，(1996)Blood 88：1887)，并能增强 异基因HSCT后的免疫重建和保持GVT活性而不加重GVHD(Alpdogan et al.，(2001)Blood 98：2256)。
一些研究已经显示手术或化学阉割所造成的雄性小鼠的性类固醇清 除增加了BM和脾B细胞的数目(Ellise et al.，(2001)Int.Immunol.13：553； Erben et al.，(2001)Hor7n.Metab.Res.(2001)33：491；Wilson et al.，(1995) Blood 85：1535；Masuzawa et al.，(1994)J.Clin.Invest.94：1090)。外周B细 胞数目的增加主要是因为B220loCD24hi新近BM迁出的增加(Ellis et al.， (2001)Int.Immunol.13：553)。Olsen等已经证实雄激素增强了BM内间质 细胞的TGFβ的产量，这反过来抑制了B细胞发育(J.Clin.Invest.(2001) 108：697)。另外，对TGFβ的体外中和逆转了二氢睾酮对B细胞的抑制。 TGFβ也已经显示出下调了间质的IL-7产生并随后抑制了B细胞前体的增 殖(Tang et al.，(1997)J.Immunol.159：117)。因此，在这个情况中，对阉 割/雄激素清除的作用的一个可能的解释是它在异基因HSCT后抑制了 TGFβ的产生，反过来增强了B细胞发育，解释了阉割小鼠比假阉割对照 增加了BM和脾的B细胞数目。
TGFβ也调节了造血干细胞的增殖。Batard等已经证实生理浓度的 TGFβ抑制了HSC的体外增殖和分化((2000)J.Cell.Sci.113：383-90)。此 外，对HSC的TGFβ信号途径的阻断(经突变的II型受体的暂时表达)增 强了这些细胞的存活和增殖(Fan et al.，(2002)J.Immunol.168：755-62)。 因此，异基因HSCT和阉割后28天所看到的HSC数目的增加可能是因 为BM间质细胞的TGFβ产量的减少是可能的。
雌激素和雄激素都能影响HSC的分化和增殖(Thurmond et al.， Endocrinol.，(2000)141：2309-18；Medina et al.，(2001)Nat.Immunol. 2：718-24；Kouro et al.，(2001)Blood 97：2708-15)。雌激素直接地抑制了 HSC和一些淋巴祖细胞亚组的增殖和分化(Medina et al.，(2001)Nat. Immunol.2：718；Kouro et al.(2001)Blood 97：2708)。HSC表达功能性的雌 激素受体(ER)以及雌激素给药减少了Lin-c-kit+Sca-1+HSC的数目 (Thurmond et al.，(2000)Endocrinol.141：2309；Kouro et al.，Blood(2001) 97：2708)。Thurmond等所进行的研究说明当BM(Endocrinol.(2000)141： 2309)的造血细胞中存在有ERoc时，阻断了c-kit+Sca-1+前体细胞和更 成熟的亚组(c-kit+Sca-1-和c-kit-Sca-1-)之间的转化。ER也存在与BM 间质细胞中(Girasole et al.，(1992)J.Clin.Invest.89：883；Smithson et al.， (1995)J.Immunol.155：3409)，说明雌激素也可能对间质细胞产生生长因 子有着作用，这反过来影响了HSC增殖和/或分化。尽管绝大多数证据说 明雌激素经BM间质对HSC的间接作用，BM的淋巴系中存在有功能性 雌激素受体并没有排除直接作用。
Olsen等已经显示功能性雄激素受体存在于胸腺上皮上而不是胸腺 细胞上，该受体对于年龄相关的胸腺退化以及随后的经性类固醇清除的 再生都是关键的(Olsen et al.，(2001)Endocrinol.142：1278)。
尽管胸腺退化和/或再生的分子机制仍不清楚，但这里有着一些可能 的侯选机制。胸腺IL-7水平随着年龄而减低(Aspinall，et al.，(2000) Vaccine 18：1629；Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37：455；Ortman et al.， (2002)Int.Immunol.14：813)。仍不清楚是否这是因为产IL-7的细胞数目 的减少或已有细胞产细胞因子的能力减低。但是，对老年小鼠的IL-7治 疗可以逆转年龄相关的胸腺凋亡的增加并增强造血作用(Andrew et al.， (2001)J.Immunol.166：1524)。小鼠胸腺的干细胞因子(SCF)和M-CSF mRNA表达也随着年龄而减少(Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37： 455)。在细胞内的信号途径水平，减少了对DN胸腺发育关键的转录因子 E2A，也减少了存在于胸腺上皮细胞上，并涉及该细胞的增殖和发育的转 录因子Foxnl(whn)(Ortman et al.，(2002)Unit.Immunol.14：813)。 Sempowski等已经监测了老年人的mRNA稳态水平，并显示出白血病抑 制因子(LIF)、制瘤素M、IL-6和SCF mRNA的显著增加(J.Immunol. (2000)164：2180)。
上述研究说明了对阉割的应答是多因素的。阉割IL-/-小鼠的试验说 明IL-7产生的增加是阉割作用的重要组成部分。但是，当用大剂量IL-7 和阉割治疗小鼠时，观察到了对胸腺细胞密度的累加作用，这说明阉割 提供了比单独增加IL-7水平更多的胸腺生成的作用。
DC是胸腺内的阴性选择的关键媒介物(Jenkinson et al.，(1985) Transplantat.39：331；Matzinger et al.，(1989)Nature 338：74-60)，以及在暂 时设定中，已经被涉及于通过移植后呈递胸腺的异基因抗原和去除供者 特异性T细胞诱导移植物接受性。Tomita已经证实MHC I型错配的受者 的胸腺的供者来源的细胞介导了供者反应性细胞的去除(Tomita et al.， (1994)J.Immunol.153：1087-1098)。他们也显示静脉内注射的胸腺来源的 DC被转运到了宿主胸腺内。此外，已经显示胸腺内注射宿主细胞加上异 基因的抗原、供者细胞、或供者可溶性肽都增加了移植物接受性 (GalTovillo et al.，(1999)Transplantation68：1827；Ali et al.，(2000) Transplantation 69：221；Garrovillo et al.，(2001)Am.J.Transplant.1：129； Oluwole et al.，(1993)Transplantation 56：1523-1527)。这些结果显示阉割显 著地增加了异基因HSCT后的胸腺的宿主和供者来源的DC的数目。也 就是说，性类固醇清除增强了胸腺DC的分化和/或增殖。因此，与造血 干细胞和实体器官移植联合应用的阉割增加了移植物接受性。
结论
当前的研究已经发现阻断性类固醇对骨髓清除和HSCT后的免疫重 建具有显著的正向作用。HSC、和B和T祖细胞被明显地增强。这提供 了一个用于增加植入的效率的重要平台和依赖于完整的造血系统的移植 后策略，例如抗肿瘤或微生物抗原的疫苗接种或靶向于供者HSCT的基 因治疗。胸腺内DC的增加对诱导和保持对异基因抗原的耐受性是重要 的。另外，在阉割受者中没有加重GVHD和消除GVT活性。这些结果 证实暂时的性类固醇清除(例如用LHRH类似物)作为增强免疫重建的 预防性治疗是有用的。
实施例20：性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的TCR特异性刺激
为了评价再生的T细胞的功能特性，分析了患者对TCR特异性刺激 的应答性。
材料和方法
患者：在干细胞移植前3周给予测试患者Zoladex(LHRH-A)，然后 每月注射1次共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周和每个月直到 12个月分析了所有的患者。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许可 (试验编号01/006)。
PBMC的制备：将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分 析，并如上制备。
T淋巴细胞刺激检测：除非有其他的说明，从移植后1-12个月起利 用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺激的分析。对于TCR特 异性刺激，在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)涂 层的板上孵育细胞48个小时。在形成空斑后(48-72个小时)，往每个孔 内加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收 集到过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定 出3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后的对TCR特异性刺激的 应答性。LHRH-A治疗的患者比对照患者在所有的时间点都表现出增强 了的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)，除了在第6个月和9 个月，因为此时所分析的患者数目少；(图57A-B)。在用LHRH-A所治 疗的异基因移植患者中，在移植后4和5个月时观察到了比对照患者显 著增加了的对抗CD3/CD28刺激的应答性。虽然对照患者在移植后6和9 个月显示出增强了的应答，而LHRH-A治疗的患者在移植后12个月显示 出更强的应答性。在移植后6和9个月，对照患者具有与治疗前数值相 似的应答性。但是，在所有的其他时间点上，他们都是明显更低的。相 反地，LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都具有与治疗前相同的应 答性，除了移植后6个月。LHRH-A治疗的患者在移植后1、3和4个月 显示出比对照患者增强了的应答性(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)。 这提示了外周T细胞的直接作用的结果，因为直到移植后1-2个月，新 的CD4+T细胞仍是不明显的(图57A-B)。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后的对TCR特异性刺激的应 答性。用自体移植的受者也观察到了在异基因移植受者中所看到的相似 的应答(图57C)。那些用LHRH-A治疗的患者证实了在移植后4和9个 月都具有增强了的对TCR刺激的增殖应答。LHRH-A治疗的患者在所有 时间点都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所 评价的)，除了移植后5个月。在移植后12个月，在对照和LHRH-A治 疗患者中都观察到恢复到了治疗前数值。
III.LHRH-A给药增强了慢性癌症患者治疗后的TCR特异性刺激的 应答性。
在本研究中入选了患有慢性血液恶性肿瘤且为免疫抑制的患者，其 免疫状态被如下确定：有资料证实的与CD4＜0.4×109/L相关的严重感染； 或淋巴增殖性疾病(例如，CLL、骨髓瘤、淋巴瘤)并接受常规的预防性 静脉内免疫球蛋白(有资料证实的低伽马球蛋白血症)；或先前4年内有 氟达拉滨、deoxycorfomycin和2-CdA的治疗；或先前2年内有异基因干 细胞移植或自体干细胞移植。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许 可(试验编号01/006)。如下给予患者LHRH-A，展示一直到LHRH-A给 药后6周的结果。
d-1(或之前)：签署知情同意，以及进行治疗前调查；
d0：施与Zoladex(男性10.8mg，女性3.6mg)；
d+28：女性-施与Zoladex 3.6mg
d+56：女性-施与Zoladex 3.6mg
d+84：女性和男性-施与Zoladex 3.6mg
从给药后第7天起，用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺 激的分析。与治疗前水平比较，LHRH-A治疗的患者显示出“循环”方 式的增殖应答的增强(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)(图63)。也就 是说，在注射的当天就观察到了T细胞增殖的增加，以及该增殖在下次 注射之前表现为轻度减少。这也说明LHRH-A对已有的外周T细胞的直 接影响的可能性。这反映了用每月储存剂注射液的激动剂的给药。这些 结果提示了对外周T细胞的直接影响。但是，在治疗后12个月所看到的 增强了的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因为所有患者从4个月 起就停止了激动剂的给药。
结论
因为早到移植后第35天就观察到了增加的对TCR特异性刺激的应 答性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅在这个阶段 才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T 细胞的影响，所以可以得出的结论是所增加的T细胞功能是因为已有T 细胞的提高而不是来源于再生胸腺的T细胞。
实施例21：性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的促有丝分裂刺激
为了评价再生T细胞的功能特性，分析了患者的对促有丝分裂刺激 的应答性。
材料和方法
患者：患者为如上所入选于No.01/006临床试验方案的那些患者。 在干细胞移植之前，给予患者LHRH-A(3周之前)。没有接受激动剂的患 者被用作为对照患者。
PBMC的制备：将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分 析，并如上制备。
促有丝分裂剂刺激检测：从移植后1-12个月起，用美洲商陆有丝分 裂原(PWM)和破伤风毒素(TT)进行对促有丝分裂应答性的分析。对 于促有丝分裂剂刺激，将PBMC以100μl RPMI-FCS内1×105个细胞/孔 的密度平铺在96孔圆底板中。将细胞与TT(2LFAU/ml)或PWM(10μg/ml) 在37℃，5％CO2下孵育。在空斑形成之后(48-72小时)，往每个孔内加 入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收集到 过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定出 3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应 答性。对促有丝分裂应答性的分析显示进行LHRH-A治疗的异基因患者 在移植后所有的时间点上都比对照具有增强了的对PWM的应答性(图 58A)。也就是说，先于干细胞移植用LHRH治疗的患者在所有的时间点 上都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性。
在分析对TT的应答性之后，相似的结果是显而易见的(图58B)。 LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都比对照患者具有增强了的应答 性，除了在移植后12个月。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应答 性。先于干细胞移植用LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上 都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性(3个月时的P≤ 0.001)(图59A)。到了移植后12个月时，LHRH-A所治疗的患者已经将 应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当减低的。
与上述的异基因患者相似(图58B)，当在治疗前给予LHRH-1时， 自体移植患者也显示出增强了的对TT的应答。先于干细胞移植用 LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上都显示出比对照患者增 强了的对TT刺激的应答性(图59B)。到了移植后12个月时，LHRH-A 所治疗的患者已经将应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当 减低的。
结论
因为早到移植后第35天就观察到了增加的对促有丝分裂刺激的应答 性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅仅在这个阶段 才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T 细胞的影响。
实施例22：性类固醇清除增强了造血干细胞移植患者中的植入的速度
材料和方法：
上面描述了用于这些试验的材料和方法。附加的材料和方法如下：
分析了异基因和自体患者(对照或LHRH-A治疗的)的HSCT后的 总WBC和总粒细胞或中性粒细胞数目。在HSCT前3周，用LHRH-A 治疗患者。没有接受激动剂的患者作为对照患者。确定出每μl血的总白 细胞(WBC)计数、粒细胞(G)或中性粒细胞计数，一直到移植后35 天。或用Cell-Dyn 1200自动化细胞计数仪(Abbott)或血细胞计数器重 复两次分析全外周血标本。这容许计算出移植后的全白细胞、淋巴细胞 和粒细胞数目。从移植后第14到35天起进行对植入的分析。
结果
I.先于移植进行LHRH-A治疗的自体干细胞移植患者增强了植入的 速度。在移植后第14、28和35天，确定出每μl血的总白细胞(WBC)计 数和粒细胞(G)计数。如图60A-D所示，接受LHRH-A治疗的自体患 者在移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图60B)(P≤ 0.05)，其中在这个时间点上，与对照的45％比较，87％显示出粒细胞植 入(≥500细胞/μl血)(P≤0.05)。接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后 第10-12天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图60C，数据被 表示为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，尽管没有显著差 异，LHRH-A治疗的自体患者在整个时间点都比对照组具有更高的淋巴 细胞计数(图60D)。这说明LHRH-A治疗显著地增加了干细胞移植后的 淋巴细胞水平。
II.先于移植进行LHRH-A治疗的异基因干细胞移植患者增强了植 入的速度。如图61A、C和D所示，接受LHRH-A治疗的异基因患者在 移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图61A)(P≤0.05)， 其中在这个时间点上，与对照的44％比较，64％显示出粒细胞植入(≥500 细胞/μl血)。另外，接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第9、12和 19天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图61C，数据被表示 为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，对进行外周血干细胞 移植的患者的分析证实当在异基因移植之前用LHRH-A治疗时，有着淋 巴细胞计数的显著增加(移植后第10、12、13和17-21天时的P≤0.05)(图 61D)。
结论
在异基因和自体移植的模型中，都观察到了LHRH-A治疗患者在移 植后第14天的WBC和粒细胞数目要显著地高于对照(图60和61)。这 种增强了的植入的速度对于有着预示感染率增加的粒细胞缺乏(≤200中 性粒细胞/ml血)的患者的总死亡率是重要的。因此，WBC和粒细胞数 目的早期恢复表明了LHRH-A治疗患者的更好的生存率。对性类固醇的 抑制增强了完全胸腺再活化或完全胸腺再活化所造成的新T细胞释放之 前的植入和重建。
实施例23：性类固醇清除在1周内增加了T细胞增殖应答。
进行这些研究以确定小鼠的性类固醇清除是否早到阉割后3到7天 就能增强增殖应答。
材料和方法
阉割8周大的小鼠，并分析手术3天(图62A、C和E)和7天(图 62B、D和F)后的抗CD3/抗CD28所刺激的T细胞增殖应答。用不同浓 度的抗CD3刺激以及用恒定浓度10μg/ml的抗CD28共刺激外周(颈部、 腋窝、肱骨和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和 D)、和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用氚化胸腺嘧啶激活细胞 18个小时，并将增殖测定为3H-T掺入。对照小鼠为假阉割，n＝4，*P≤0.05 (非参数的、非配对的、Mann-Whitney统计检验)。
结果
性类固醇清除的小鼠显示在阉割后第3天(图62A、C、和E)和7 天(图62B、D和F)就增强了CD28/CD3刺激的T细胞的增殖。在阉割 后第3天(10μg/ml抗CD3)和7天(2.5μg/ml和1.25μg/ml抗CD3)从 外周LN所分离到的T细胞显示出增殖应答的显著增加。
另外，在阉割后第3天从肠系膜淋巴结(图62C和D)和脾(图62E 和F)所分离到的T细胞也显示出抗CD3刺激的增殖的显著增加超过了 假阉割小鼠。
结论
早到阉割后第3-7天(先于新T细胞从胸腺迁出)，就有着T细胞对 抗CD3和CD28交联刺激的应答性的增加。这些数据提示在胸腺再活化 之前，性类固醇清除对外周血T细胞池的功能性具有直接作用。
为了确定LHRH-A对人类患者的外周T细胞的直接作用的程度，进 行了研究。将对照患者的T细胞与各种剂量的LHRH-A一起孵育，并在 不同的时间点(D3、D7和D14)分析相比较于对照标本(只用培养基)的 增殖水平。这容许确定出是否LHRH-A通过引起已有T细胞的活化而直 接作用于这些细胞，如在小鼠模型中所观察到的那样。
实施例24：性类固醇清除增强了同系HSCT后的造血作用
结果：
I.阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT前1 天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad) 的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同时间点(2-6周)分析BM、脾和胸 腺(图35)。如图35B所示，在阉割和HSCT后2周，当与假阉割对照比 较时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地，如图35C所示， 在移植后2、4和6周，阉割小鼠比假阉割对照有着显著增加的胸腺细胞 数目。如图35C所示，在外周，阉割受者在移植后4和6周的脾细胞数 目也显著地高于对照。
II.阉割增强了同系HSCT后的HSC在BM内的植入。在同系HSCT 前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射 (800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM的 lin-c-kit+sca-1+HSC(图36)。在BMT移植和阉割后2周，在阉割小鼠的 BM内比假阉割对照有着显著更多的供者来源的HSC。
III.阉割增强了同系HSCT(2.5×106)后的HSC在BM内的植入。在 同系HSCT前1天阉割小鼠。将2.5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到 经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分 析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37A-B)。图37A描述了BM内的普通 淋巴祖细胞的百分比。图37B描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。 BMT移植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了 供者来源的HSC的比例。
IV.阉割增强了同系HSCT(5×106)后的HSC在BM内的植入。在同 系HSCT前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照 射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM 的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37C-D)。图80A描述了BM内的普通淋巴祖 细胞的百分比。图37D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。BMT移 植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了供者来 源的HSC的比例。
V.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的DC在胸腺内的植入的速 度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6 小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析胸腺细胞。供者来源的DC 被定义为CD45.1+CD11c+MHC I型+CD11b+或-。在BMT后2周时，与 假阉割对照比较，显著地增加了阉割小鼠的胸腺内的供者来源的CD11b+ 和CD11b-DC(图38)。
VI.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的B细胞在脾内的植入的 速度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的 C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析脾细胞。在同系BMT 后2周时，与假阉割对照比较，在阉割小鼠的脾内有着显著更多的B220+ B细胞(图39)。
实施例25：用G-CSF和/或GM-CSF对癌症患者的治疗减少了化疗后中 性粒细胞缺乏症的发病率
这个实施例举例说明了G-CSF和/或GM-CSF用于增加中性粒细胞水 平和减少接受化疗的患者的感染发病率的用法。
材料和方法
在100例小细胞肺癌患者中进行了一项双盲的、安慰剂对照研究。
G-CSF给药：根据产品说明书，从化疗后第4-17天皮下施与 4-8μg/kg/d剂量的Neupogen_(Amgen，Thousand Oaks，CA)。
GM-CSF给药：在第一个研究中，根据产品说明书，患者在每个化 疗周期的第2天接受了单一SC剂量的6mg Neulasta_(Amgen，Thousand Oaks，CA)或从每个周期的第2天开始接受皮下的5μg/kg/d Filgrastim_ (Amgen，Thousand Oaks，CA)。在第二个研究中，将对象随机分组接受为 在第2天接受单次皮下注射100μg/kg Neulasta_或从每个化疗周期的第2 天开始接受5μg/kg/d Filgrastim_。
患者：所有患者都已经被诊断为小细胞肺癌并给予了标准周期的环 磷酰胺、阿霉素和依托泊苷的治疗。GM-CSF患者被诊断为转移性乳腺 癌。
结果
以这种方式的G-CSF(Neupogen_)的治疗造成了如发热性中性粒细 胞缺乏症、感染率、患者入院和抗生素使用所确定的感染发病率的临床 及统计学地显著减少。多个该公司(www.neupogen.com)所报道的III期临 床试验报告G-CSF的应用造成了中性粒细胞的可测定的增加，据此支持 G-CSF治疗在接受免疫抑制性化疗的癌症患者中的临床应用。
在利用GM-CSF(Neulasta_)的随机双盲主动控制研究中看到了相 似的结果，该研究在转移性乳腺癌的治疗中采用了每21天给予60mg/m2 阿霉素和175mg/m2紫杉醇，共4个周期的方案(www.neulasta.com)。
选择中性粒细胞缺乏症的持续时间作为主要终点(明显得到了FDA 许可)。没有接受Neulasta_的患者有着100％的严重中性粒细胞缺乏症的 发病率，平均持续时间为5-7天，以及30-40％发热性中性粒细胞缺乏症 的发病率。
在两个研究中，都在第2天给患者施用Neulasta_(c.f.Neupogen_， 其中在第4天施与药物)。
两个研究(对于Neulasta_，一个研究是固定剂量的，另一个是重量调 整的剂量)都证实每种药物在严重中性粒细胞缺乏症的平均天数的主要终 点上没有差异。在两种情况中，平均天数都接近于1.7天(c.f.未治疗的5-7 天)。两个研究中的发热性中性粒细胞缺乏症的发病率相当，都接近于 10-20％。
实施例26：用性类固醇清除治疗和G-CSF(和/或GM-CSF)对癌症患者的 治疗减少了化疗后的中性粒细胞缺乏症的发病率和感染率
在一个随机的双盲研究中，80例小细胞肺癌患者被随机分组到接受 G-CSF(Neupogen_)或接受G-CSF和Lupron_的1-4组中；在化疗周期的 前4天每天和此后的每三天监测所有组内的所有患者。利用本领域熟知 的技术监测所有患者的CBC、中性粒细胞计数、红细胞压积和T细胞分 类分型。另外，每天两次监测搜有患者的体温和其他的副作用。
组#1：仅用G-CSF
第一组包括一组在环磷酰胺(1g/m2/天)、阿霉素(50mg/m2/天)和依托 泊苷(120mg/m2/天x3)的标准化疗后第4-17天接受G-CSF的患者(n＝20)。 根据相关包装说明书内的给药和剂量说明，静脉内(I.V.)施与所有药物。 所有患者都接受21天周期的这个治疗方案。在这个组中，根据Neupogen_ 的包装说明书(任选范围为0-10μg/kg/d)所设定的剂量说明书皮下给予 5μg/kg/d剂量的G-CSF。根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给 予随后的化疗周期。根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向 10,000/mm3，治疗临床医师也能任选地减少所用的剂量，在ANC达到 10,000/mm3时停用G-CSF。
组#2：G-CSF加上化疗前21天的“大剂量”Lupron_
第二组包括一组在化疗前21天给予“大剂量”Lupron_(3个月恒定 释放产品，剂量22.5mg，S.C.)以及也根据前述方案从环磷酰胺(1g/m2/ 天)、阿霉素(50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天 给予G-CSF(5μg/kg/d)(任选范围为0-10μg/kg/d)的患者(n＝20)。所有患者 都接受21天周期的这个治疗方案。根据ANC最低值的持续时间和严重 度任选地给予随后的化疗周期。根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加 朝向10,000/mm3，治疗临床医师也能任选地减少所用的剂量，在ANC达 到10,000/mm3时停用G-CSF。根据相应包装说明书内的给药和剂量说明 施与所有药物。
组#3：G-CSF加上化疗前21天的“小剂量”Lupron_
第三组包括一组在化疗前21天给予“小剂量”Lupron_(3个月恒定 释放产品，剂量11.25mg，S.C.)以及从环磷酰胺(1g/m2/天)、阿霉素 (50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天给予 G-CSF(5μg/kg/d)的患者(n＝20)。所有患者都接受21天周期的这个治疗方 案。根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给予随后的化疗周期。 根据常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向10,000/mm3，治疗临床医师 也能任选地减少所用的剂量，在ANC达到10,000/mm3时停用G-CSF。 根据这些药物的包装说明书施与化疗药物、G-CSF和Lupron_。
组#4：G-CSF加上化疗前14天的“大剂量”Lupron_
第四组包括一组在开始化疗前14天给予“大剂量”Lupron_(3个月 恒定释放产品，剂量22.5mg，S.C.)的患者(n＝20)，从环磷酰胺(1g/m2/天)、 阿霉素(50mg/m2/天)和依托泊苷(120mg/m2/天x3)的化疗后第4-17天给予 这些患者G-CSF(5μg/kg/d)。所有患者都接受21天周期的这个治疗方案。 根据ANC最低值的持续时间和严重度任选地给予随后的化疗周期。根据 常规的肿瘤学技术，如果ANC增加朝向10,000/mm3，治疗临床医师也能 任选地减少所用的剂量，在ANC达到10,000/mm3时停用G-CSF。根据 这些药物的包装说明书施与化疗药物、G-CSF和Lupron_。
结果
预期当与G-CSF治疗组(组1)比较时，G-CSF和“大剂量”Lupron_ 的治疗(组2)将造成如感染率、抗生素使用、WBC计数、严重中性粒细 胞缺乏(ANC＜500/mm3)和发热性中性粒细胞缺乏症所证实的感染发病 率的临床和统计学显著的减少。也预期G-CSF和“小剂量”Lupron_的 治疗(组3)将产生与来自更大剂量Lupron_治疗(组2)的患者的结果没有 显著差异的结果。最后，预期在化疗前第14天给予3个月恒定释放的、 22.5mg S.C.剂量的Lupron_将产生与组2的那些患者的结果没有显著差 异的数据。但是，预期有多个数据点说明在治疗周期的更早阶段施与 Lupron_对于一些患者可能是有益的。
实施例27：用性类固醇清除治疗对骨髓移植患者的治疗减少了WBC计 数、严重中性粒细胞缺乏症、发热性中性粒细胞缺乏症和感染的发生率
在一项随机非盲研究中，20例患者在接受BMT之前给予了GnRH 类似物的治疗。也进行BMT但没有接受GnRH类似物的这个患者组是对 照组(n＝19)。
根据认可的医学技术，所有患者都接受了来自匹配供者的异基因移 植物(Lincz et al.，(2001)Leuk.and Lymph.40：373)。
治疗组中的所有患者都接受了4个每月剂量的GnRH类似物 (Lupron_7.5mg，S.C.)。最初在BMT前21天施与Lupron_。
在移植之前，用标准的清除药物和技术清除所有患者的BM(Segeren et al.，(1999).Br.J.Haem.105：127-130)。
在第-21、-2、0、1、2、3、7、10、14和21天抽取每个患者的血样。 然后利用在本说明书的其他地方所详细描述的方法以及本领域人员所熟 知的方法评价血样的WBC、中性粒细胞、T细胞(经FACS分析，如上 面所详细描述的那样)、粒细胞水平和红细胞比容。
另外，监测所有患者的感染率(包括病毒感染)、抗生素的使用、发 热性中性粒细胞缺乏症、和严重中性粒细胞缺乏症(ANC＜500/mm3)的平 均天数。如上面所列的进行这些分析，从移植日期开始起的1个月、3个 月、6个月和9个月随诊患者。
结果
预期一直到移植后的第21天，当与无GnRH激动剂治疗组比较时， GnRH激动剂(Lupron_)的治疗将造成WBC计数、严重中性粒细胞缺乏 症(ANC＜500/mm3)的平均天数和发热性中性粒细胞缺乏症的临床及统计 学显著的减少。
也预期由于患者的数量少，一直到1个月，两组间的病毒和其他感 染率的发病率将没有统计学显著差异。但是，预期在移植后3、6和9个 月，两组间的这些感染率将是有统计学差异的，其中GnRH激动剂治疗 的患者将治疗得更好(即，更容易处理和恢复更快)。
实施例28：用性类固醇清除治疗对癌症患者的治疗增加了造血作用和中 性粒细胞计数
在一个随机非盲研究中，转移性前列腺癌的男性患者(n＝30)在他们正 常的治疗过程中接受了GnRH激动剂(Lupron_，注射(7.5mg s.c.每月一 次))。所有患者也都接受了抗雄激素药物。也可以给予Cosudex_(5mg/ 天或50mg/天口服)1个月。
所有患者在开始治疗前进行全血分析(FBA)。FB包括对淋巴细胞、 白细胞、红细胞比容和红细胞含量的标准的病理分析。另外，进行了对 免疫学参数的分析包括T细胞刺激、细胞因子产生、免疫细胞亚组和 TREC分析。
另外，在第-2、0、1、2、3、7、10、14、21和28天、以及此后的 每个月共6个月抽取每个患者的血样。然后利用在本说明书的其他地方 所详细描述的方法以及本领域人员所熟知的方法评价血样的WBC、中性 粒细胞、T细胞(经FACS分析，如上面所详细描述的那样)、粒细胞水平 和红细胞比容。
预期在GnRH激动剂治疗的最初14天内，当与基线水平(第-2和0 天)比较时，大多数患者(近70％)都将有着造血作用和中性粒细胞计数的 增加。
实施例29：性类固醇清除疗法对患者的治疗增加了流感疫苗接种的疗效
在一个随机非盲研究中，转移性前列腺癌的男性患者(n＝45)在他们正 常的治疗过程中接受了GnRH激动剂(Lupron Depot_，注射(7.5mg s.c. 每月一次))。所有患者也都接受了抗雄激素药物。也可以给予Cosudex_ (5mg/天或50mg/天口服)1个月。
所有患者在开始治疗前进行全血分析(FBA)。
接受GnRH激动剂和Cosudex_的患者被如下随机分组到每组15例 患者的三个组中的其中一组：
组#1：
第1组包括15例根据产品说明书在第0天接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#2：
第2组包括15例根据产品说明书在第21天接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#3：
第3组包括15例根据产品说明书在第8周接受流感疫苗接种(例如， Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)的患者。
组#4：对照：
第4组是对照组，包括15例没有前列腺疾病并没有接受药物的相似 年龄的男性的附加组。对照组根据产品说明书在第0天接受流感疫苗接 种(例如，Fluarix_(GlaxoSmithKline，Australia)，0.5ml，i.m)。
在整个研究中(在第-2、0、1、2、3、5、7、14、21、28天、以及此 后的每个月共6个月)，利用在本说明书的其他地方所详细描述的方法以 及本领域人员所熟知的方法评价血样的WBC、中性粒细胞、T细胞(经 FACS分析，如上面所详细描述的那样)、粒细胞水平和红细胞比容。在 每个时间点，也利用鼻咽部拭子和FLU OIA(Thermo BioStar)监测患者是 否存在流感(A和B型)病毒。
在第-2天以及流感免疫接种后的所有时间点，还利用本领域人员熟 知的技术监测每组内的患者是否存在抗流感H1N1株的凝血抑制抗体。
结果：
当与组4内的对照患者有1例拭子流感病毒阳性比较时，预期在组 1-3的任一组内都没有一例患者报告有任何的流感的感染性式件。
也预期所有组内的患者将有着比GnRH激动剂治疗前更高的血凝抑 制抗体滴度。预期组2和3内的患者比那些组1和4内的患者产生了更 高的抗体滴度。但是，预期所有患者从12周开始将有相似的抗体滴度。
另外，预期保护率(对流感H1N1株大于40％的患者具有血凝抑制物) 在组2中是最高的，以及在组4中是最低的。
实施例30：LHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮
材料和方法
利用125I-睾酮放射免疫测定法(RIA)进行对患者血清中的性类固醇 水平的检测。在检测之前，将所有试剂、标本和对照都放在室温。对照 管或有单独缓冲液-非特异结合(NSB)管或有0ng/ml标准睾酮(B0)。将 单独缓冲液、标准液(0-10ng/ml睾酮)或测试标本加入到每个管中，随 后加入性结合球蛋白抑制剂(SBGI)以限制放射性标记的睾酮的非特异 性结合。往每个管中加入125I-睾酮，随后加入抗睾酮抗体(除了NSB管 外)。然后将管在37℃下孵育2个小时。之后，往所有管中加入第二抗体， 涡旋并再孵育60分钟。将管离心(1000gmax)15分钟，去除上清液，在 Packard Cobra自动贝塔计数仪上计数沉淀物。平均三次cpm结果并用结 合睾酮百分比(B/B0)的公式构建出标准曲线：
％B/B0＝(标本-NSB)/B0-NSB
标本＝特定测试标本的平均cpm
NSB＝非特异性结合管的平均cpm
B0＝0ng/ml标准液的平均cpm(总结合管)
从标准曲线中确定出每个测试标本的睾酮水平。
结果
给前列腺癌患者施与LHRH-A造成了阉割水平的血清睾酮。为了确 定LHRH-A治疗的有效性，在治疗前和LHRH-A治疗4个月时，分析了 所有患者的血清睾酮水平。利用125I-睾酮的放射免疫测定法(RIA)进行 分析。在激素治疗之前，血清睾酮的浓度是在1-3ng/ml睾酮(平均值 ＝2.3ng/ml)的范围之内(图46A)。在治疗4个月时，患者基本上没有可 测定到的血清睾酮，提示对性类固醇释放的成功清除。
LHRH-A给药没有影响外周血内的淋巴细胞亚组的百分比。在用 LHRH-A治疗4个月后，与治疗前数值比较，没有观察到任何淋巴细胞 亚组的比例的任何变化。这些数值都在正常范围内(数据没有显示)。用 FACS分析了外周血淋巴细胞的T、B和髓系来源的(NK和巨噬细胞)的 比例和细胞数目。在LHRH-A给药后没有观察到任何细胞亚组的比例的 任何变化。此外，所有淋巴细胞亚组的比例都在整个年龄组的正常范围 内(图84C)(Hannet et al.，1992；Xu et al.，1993)。
实施例31：在用醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)对性类固醇的暂时清除后进 行自体或异基因干细朐移植患者的胸腺再活化
在这个实施例中，在自体或异基因外周血干细胞移植(PBSCT)之前 给予醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)。主要终点是如体外检测所测定的胸腺再 活化。患者在移植后随诊6个月。20例患者(10例异基因移植和10例自 体移植)将进入研究。这个实施例探讨了在LHRH水平抑制性类固醇产 生的作用，利用LHRH的激动剂脱敏垂体并因此阻止了LH和FSH的释 放。反过来，这造成了性腺的雄激素和雌激素产生的阻断，这就去除了 对胸腺功能的抑制作用。在这个试验中所检测的组是进行大剂量化放疗 (HDT)和PBSCT的患者。
醋酸戈舍瑞林(Zoladex_)是一种LHRH的有效的、合成的十肽类 似物。当急性给药时，醋酸戈舍瑞林将从垂体中释放出LH。但是，在慢 性给药后，醋酸戈舍瑞林是一种促性激素激素产生的有效的抑制剂，造 成了性腺抑制以及最终造成了性器官退化。在动物和人类中，在对垂体 的最初刺激、LH分泌和血清睾酮的短暂提高之后，慢性给药造成了对促 性腺激素分泌的抑制。结果是发生在最初治疗的近3周之内的对垂体LH 的持续抑制以及男性中的血清睾酮水平减少到了如在手术阉割男性中正 常所看到的范围。然后保持这种抑制与持续治疗一样长的时间。
患者是男性或女性，年龄大于等于18岁，因恶性疾病或BM衰竭进 行了大剂量治疗(HDT)和PBSCT。10.8mg Zoladex_的植入物剂型(男 性用)被分散在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形棒 内，在皮下注射后持续释放超过12周。3.6mg植入物(女性用)被分散 在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形杆内并在皮下注 射后持续释放超过28天。植入物是商品化的，置于用专用目的设计的带 有14-16号针头的给样器内。
血液中的性类固醇减少到最小值可能要花费数周。因此，在PBSC 输注(第0天)前21天，给患者注射LHRH激动剂Zoladex_(植入物)形 式的性类固醇清除治疗。对于男性，在第-21天给予单一剂量的10.8mg 戈舍瑞林(有效3个月)以及在第63天再次注射3.6mg(有效28天)。对 于女性，在第-21天、第7、35和63天施与3.6mg(有效28天)。这对于 减少性类固醇水平到足以再活化胸腺的水平应当是有效的(预计在 PBSCT后4个月)。因此，在这个实施例中，仅仅给予4-6个月的治疗。 本领域人员容易确定出可被接受的其他剂量。
在第0天输注PBPC。再活化的胸腺摄取所输注的前体细胞并将它们 转化为新的T淋巴细胞和上皮胸腺细胞。最大的性类固醇“清除”是在 PBSCT输注的时候，因此所输注的PBSC能有助于胸腺重建。预计在 PBSCT后3-4周内，最初的新的T细胞将出现在血流中，但是治疗应当 在PBSCT后维持3个月以容许免疫系统的完全正常化。
通过流式细胞术、体外T细胞应答和TREC的产生对T细胞的评价 确定出胸腺功能。
在开始研究之前，进行了常规的HDT前的调查，记录基础的FBE、 电解质和LFT。其他治疗前分析包括血清HCG(女性)、胸腺CT、骨密度 研究、蛋白电泳和免疫电泳、激素研究：TFT、FSH、LH、雌激素、孕 激素、睾酮。另外，进行了各种基线的T细胞检测。从50ml血液中纯化 出白细胞，并如下检测：
(a)流式细胞术
原初T细胞对记忆T细胞
CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PerCP、CD4-或CD8-APC
CD27-FITC、CD45RO-PerCP、CD4/CD8-APC、Ki-67-PE
CD62L、CD45RO-PerCP、CD103、CD4/CD8-APC
T细胞亚组
CD4-FTTC、CD8-APC、αβTCR-PE、γδTCR-B/S-PerCP
CD25-PE、CD69-CyChrome、CD4-FITC、CD8-APC
CD28-CyChrome、αβTCR-PE、CD4-FITC、CD8-APC
B细胞/髓系细胞
CD19-FITC、CD3-PerCP、CD56-PE、CD34-APC
CD11b-CyChrome、CD11c-PE、CD4-FITC、CD8-FITC
细胞因子
IL-4-PE、IFNγ-APC、CD4-FITC、CD8
其他标记物
CD11a、CD95、HLA-DR、CD2、CD5
所有患者都作为内对照，因为在治疗前和后都检查他们。染色特异 性对照将包括FITC/PE/APC等的同型物对照，并在染色前阻断FcR。
(b) T细胞功能
将体外检查血淋巴细胞的对CD3交联的应答的能力。
(c) TREC分析
分离并探查原初T细胞的T细胞受体删除环的存在，它是因为上述 的TCR基因重排所形成的。它们的存在是胸腺输出的非常强的提示(因 为这是主流的T细胞产生的唯一来源)。因为细胞分裂与TCR基因的重 排后的胸腺发育相关，TREC水平可能低估了胸腺的迁出(实际水平的约 10％)。
实施例32：对恶性贫血的治疗
一个成年女性患者(例如，35岁)患有恶性贫血，一种自身免疫性疾 病。在G-CSF治疗(每天两次，共3天，每次10μg/kg)3天后，她的CD34+ 造血干细胞(HSC)收集自她的血液。用CD34可以从血液中纯化出她的 HSC。为了收集CD34+细胞，收集供者(即将给受者提供他/她的器官或皮 肤的人)的外周血，根据标准方法从外周血中分离出CD34+细胞。一个非 限制性的方法是将外周血与特异地结合于人CD34的抗体(例如，购自 Abcam Ltd.，Cambridge，UK的小鼠单克隆抗人CD34+抗体)孵育，用可 检测的标记的抗小鼠抗体(例如FITC标记的山羊抗小鼠抗体)二次染色 细胞，并经荧光活化细胞分选术(FACS)分离出FITC标记的CD34+细胞。 因为循环的外周血中只有少数的CD34+细胞，可能需要对供者进行对此 的采集和细胞分选。CD34+可以被冷冻保存，直到收集到足够多的使用 的量。
因为恶性贫血的抗原，用任何方式转染患者的所采集的HSC以表达 该抗原(称为，胃质子泵)。通过利用各种技术包括但不限定于电穿孔、病 毒载体、基于激光的压力波技术、脂质输注(见，例如在Bonyhadi等1997 中所描述的方法)可以转染HSC。在一个实例中，用H/K-ATP酶质子泵的 C1链转染她的HSC，将II型MHC启动子用于表达。
为了终止进展中的自身免疫性疾病，患者将进行T细胞耗竭和/或其 他免疫细胞耗竭。她也将进行胸腺再活化以取代这些T细胞，并因此克 服免疫缺陷状态。为了达到这一点，她将接受4次每月一次的Lupron (7.5mg)的注射以耗竭性类固醇(到3周时)，据此容许她的胸腺的再活化。 这也将容许摄取HSC并建立对相关自身抗原的中枢耐受。虽然还不清楚 自身免疫性疾病为什么会发生，但是对微生物的交叉反应是一种可能性； 因此耗竭所有的T细胞将去除这些交叉反应的细胞。如果疾病是这些交 叉反应所启动的，那么可能没有必要用名义上的自身抗原转染HSC。简 单地耗竭T细胞，紧接着通过阻断性类固醇信号途径的胸腺再活化可能 是足够的。用于去除T细胞的一种标准的方法如下。患者接受了每日注 射15mg/kg Atgam(异种抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn)形式的抗T 细胞抗体共10天，以及联合一种T细胞活化的抑制剂环孢菌素A，3mg/kg 连续输注3-4周，随后是按需的每日9mg/kg的片剂。这个治疗不影响患 者胸腺内的早期T细胞发育，因为人胸腺的大小和构型而不能输送具有 这样的作用所必需的抗体的量。保持这个治疗近4-6周以容许性类固醇的 缺失及随后的胸腺重建。对T细胞反应性的阻止也可以联合于第二信号 水平例如白介素、辅助分子(阻断剂，例如CD28)、信号途径分子或细胞 粘附分子的抑制剂，以增强T细胞清除或其他免疫细胞耗竭。
实施例33：对I型糖尿病患者的治疗
I型糖尿病患者接受了与实施例32中所述的相似的方法。用广谱的 耗竭方法去除T细胞(见上)，4个月的Lupron治疗促进了胸腺复壮以及 通过注射预先采集的经使用II型MHC启动子的前胰岛素基因所转染的 自体HSC增强了患者的免疫系统恢复。HSC将进入胸腺，分化成DC(和 所有的胸腺细胞)，并将前胰岛素呈递给发育中的T细胞。凋亡将杀死所 有的那些可能与前胰岛素反应的T细胞，只留下攻击外来的感染性病原 体的T细胞库。
对于与感染的交叉反应或只是“坏运气”所引起的自身免疫性疾病， 使用自体HSC足以帮助强化胸腺再活化。如果存在有对疾病的遗传易感 性(家族成员经常患自身免疫性疾病)，最好用异基因的高度纯化的HSC 进行胸腺恢复，以预防经由过路T细胞(passenger T cell)的移植物抗宿 主反应。脐带血也是一种好的HSC来源，通常没有或只有非常少量的异 基因反应性T细胞。尽管脐血没有高水平的CD34+HSC，它们对于建立 微嵌合体是足够的-甚至10％血细胞最终就能足以建立足够多的胸腺内树 突状细胞对自体抗原的耐受性。
实施例34：对患有过敏的患者的治疗
对于过敏，可以采用与实施例32和33相似的原理。如上耗竭过敏 患者的T细胞。在通过产IgE或IgG的B细胞(浆细胞)所加重的严重病 例中，利用化疗的骨髓清除可能是必要的。或者，可以使用全身照射(例 如6Gy)。通过应用3-4个月的GnRH和静脉内注射HSC(按需为异基因的 或自体的HSC)将复壮整个免疫系统。对于具有过敏的遗传学易感性的情 况，可以使用异基因的，否则就使用所动员的自体HSC。
实施例35：阉割对NOD和NZB小鼠的作用
非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)是I型糖尿病的一种非常具有特征性 的模型。大量研究已经确认该疾病的病理是因为对胰腺的异常的T细胞 浸润和对产胰岛素的胰岛细胞自身免疫性破坏。这些动物中的胸腺的结 构是异常的，这里有着髓质上皮细胞(mAb MTS 10所鉴定的)的异位表 达、大量B细胞滤泡和缺少上皮细胞的富含胸腺细胞区域的存在。
为了检查性类固醇对这些小鼠的影响，将20只3周大的雌性NOD 小鼠手术切除卵巢，以及20只进行假手术。选择这个阶段是因为它早于 疾病的发生。从10周大开始监测血糖。到了21周大时，超过60％的假 阉割小鼠已经发展为糖尿病，但＜20％的阉割组小鼠患有糖尿病。在手术 阉割后，也有着胸腺缺陷的正常化，包括界限明确的皮质和髓质、B细 胞滤泡的缺失和CD25+调节细胞的增加。调节T细胞的增加是非常重要 的，因为它们能改变迁出胸腺细胞的致病性细胞因子的量。因此，阉割 对NOD小鼠的糖尿病的发生和进展都具有显著的影响。
检查了16只卵巢切除的和16只假手术的NOD小鼠的糖尿病及胰岛 炎的发生(提高了的血糖水平；BGL)21周。在尸解中，也检查了胸腺结 构异常的出现。如图45所示，其中60％的假手术的NOD小鼠患有糖尿 病，少于20％的阉割组小鼠患有糖尿病。这清楚地显示了延缓或甚至预 防了糖尿病。
如图64所示，阉割NOD小鼠有着总的胸腺细胞数目的显著增加， 但在总脾细胞上没有差异。在糖尿病的阉割小鼠中，有着总的胸腺细胞 数目的显著减少，它们可能使得这些小鼠易患该疾病并提示在阉割之前 已经出现了糖尿病触发物。
这里有着所有的胸腺细胞亚型的显著增加(图66A)，但是它们的比例 没有变化(数据没有显示)。有趣的是，与假阉割小鼠(图66C)比较，B细 胞和脾的总T或B细胞都没有变化(图66B)。
与阉割后总胸腺细胞增加所平行的是，CD25+调节细胞的明显增加 (数据没有显示)。在脾内没有这样的变化。
也检查了阉割对NZB小鼠的作用，它是一种系统性红斑狼疮(SLE) 的模型。NZB小鼠具有明显的胸腺异常，它出现在疾病发生之前并与疾 病紧密相关。这些缺陷包括不明确的皮质-髓质界限、和异常的B细胞簇 (见Takeoka et al.，(1999)Clin.Immunol.90：388)。
在4-7周大时将小鼠阉割或假阉割，并在4周后检查。
有着总胸腺细胞(图67A)和脾细胞(图67B)的明显增加。也有着胸腺 调节细胞(CD25+和NKT细胞)的明显增加。来自这些小鼠的细胞因子 可能影响效应T细胞并调控它们可能的致病性。通过免疫化学法，阉割 小鼠具有正常的胸腺结构以及B细胞滤泡的缺失(数据没有显示)。
实施例36：阉割对肿瘤特异性抗原的免疫接种的作用
人乳头状瘤病毒(HPV)感染引起生殖道疱疹，这可能导致一些妇女的 宫颈癌。事实上，超过90％的所有宫颈癌中都含有HPV DNA。乳头状瘤 病毒是感染皮肤和粘膜表面的双链DNA病毒。至今已经鉴定出了80多 种类型的HPV。HPV16是其中一种与宫颈癌相关的主要类型。
E7是与HPV16诱导的宫颈癌相关的主要的致癌蛋白。其他小组已 经显示具有活化ras的E7开放阅读框的表达足以将培养物中的初级上皮 细胞转化为恶性表型(Lin et al.(1996)Cancer Res.56：21)。因此，E7是 一种用于宫颈癌和癌前病变的免疫治疗和/或疫苗接种的吸引人的肿瘤特 异性抗原。事实上，其他小组已经显示用50μg/ml最佳剂量的E7-GST融 合蛋白以及Qiul A作为佐剂所免疫的小鼠被保护性地对抗了用HPV16 E7所转染的肿瘤细胞株的继发攻击(Fernando et al.，(1999)Clin.Exp. Immunol.115：397)。
进行这个试验以确定对小鼠的阉割是否能增强亚最佳剂量的HPV E7的疫苗接种(作为预防性疫苗)和/或免疫治疗(作为治疗性疫苗)的疗效。
材料和方法
成体(＞9个月)C57BL/6小鼠接受了皮下注射来源于经HPV-16E6和 E7及c-Ha-ras癌基因共转化的C57BL/6小鼠的初级上皮细胞的E7阳性 的同系E7+TC1肿瘤细胞。5天后，如上述的手术阉割小鼠，经阴囊切 口，显露睾丸，用缝线将其结扎，然后与外周脂肪组织一起去除。然后 用手术订关闭伤口。按上面的方法但不取出睾丸制备假阉割小鼠，并将 其作为阴性对照。在肿瘤攻击后7天，给阉割或假阉割小鼠注射亚最佳 剂量(5μg/ml)的E7GST融合蛋白。阳性对照接受了最佳剂量50μg/ml的 E7GST融合蛋白。25天后，分析小鼠的肿瘤(肉眼观察和肿瘤重量)以及 T细胞应答性(如上所述，利用标准的ELIspot法分析INFγ产量和利用 HPV16E7刺激的靶细胞经51Cr释放检测分析CTL裂解活性)。
结果
如图68所示，与假阉割的亚最佳剂量对照中所出现的47％(9/19)相 比较，仅仅22％(4/18)接受了亚最佳剂量E7GST的阉割小鼠具有肿瘤。 值得注意的是，受保护的接受亚最佳剂量E7GST疫苗的阉割小鼠的比例 (78％)与受保护的阳性对照的比例相当，阳性对照接受了高出10倍剂量 (最佳)的疫苗(3/4，75％)。所有的没有接受疫苗的阉割小鼠都有肿瘤。
如图69所示，与其他所有组相比较，接受亚最佳剂量E7GST的阉 割小鼠在皮内具有显著更高的细胞数目(图69A)(P≥0.01)。但是，与所测 试的其他所有组相比较，阉割的亚最佳E7GST组的脾内的活化 (CD25+)CD4+(图69B)和CD8+(图50C)T细胞的总数目保持了相同的数 目。
如图70A所示，接受亚最佳剂量GST-E7的阉割小鼠的脾细胞的非 特异的IFNγ产量与接受高出10倍剂量(最佳)的疫苗的阳性对照小组相 当。接受亚最佳剂量疫苗的假阉割小鼠具有中等水平的IFNγ产量，其中 阴性对照动物具有很少到没有脾细胞的非特异的IFNγ产物。这个数据与 在肿瘤发病率中所看到的平行(见图68)，说明脾细胞的IFNγ产量与这些 动物的肿瘤发病率直接平行。这是不奇怪的，假定Th1细胞所介导的应 答是主要作用于肿瘤保护。
如图70B所示，E7特异性产生的水平遵循着上述所讨论的关于非特 异性IFNγ产生的相同的趋势。虽然接受亚最佳GST-E7剂量的阉割小鼠 的E7特异性IFNγ产生的水平要稍低于接受高出10倍(最佳)剂量的疫苗 的阳性对照小鼠的水平，但是它仍高出在接受亚最佳剂量的假阉割小鼠 中所观察到的水平。再一次，阴性对照动物只有很少到没有E7特异性脾 细胞产生的IFNγ。
最后，分析了小鼠对HPV16E7所感染的靶细胞的E7特异性CTL杀 伤作用。如图71A所示，当与接受高出10倍(最佳)剂量的疫苗的阳性对 照小鼠比较时，接受亚最佳E7GST剂量的阉割小鼠具有相当水平的E7 特异性CTL。接受亚最佳剂量疫苗的假阉割小鼠具有中等水平的E7特异 性CTL应答，其中阴性对照只有很少到没有E7特异性CTL。这个数据 与在肿瘤发病率(见图49)和IFNγ产量(见图70)中所看到的数据平行。图 71B显示E7特异性CTL活性与肿瘤重量反向平行。也就是说，具有最 高水平的CTL活性的小鼠没有肿瘤，而有肿瘤的少数小鼠显示出具有较 弱的E7特异性CTL裂解活性。
结论
这些试验显示阉割能有效地增加患者的疫苗疗效。当与接受亚最佳 剂量疫苗的阉割小鼠比较时，在接受高出10倍(最佳)剂量的HPV16-E7 疫苗的未阉割小鼠中实现了相等的IFNγ产量、CTL活性和对肿瘤攻击的 保护。
可以进行相似的试验以确定阉割加上E7疫苗接种在免疫治疗的疫 苗接种方面的疗效。在这种情况中，将如上述的阉割小鼠。在阉割后6 周时给小鼠注射TCl细胞，并在1周后用GSTE7疫苗免疫小鼠。然后分 析小鼠的肿瘤(肉眼观察和肿瘤重量)以及T细胞应答性(如上所述，利用 标准的ELIspot法分析INFγ产量和利用加有HPV16E7的靶细胞经51Cr释放检测分析CTL裂解活性)。预期接受这个治疗性疫苗接种方案的小鼠 将具有比假阉割对照更少的肿瘤肿瘤。另外，预期阉割小鼠将比假阉割 的副本具有更小剂量的疫苗。
实施例37：其他的病毒疫苗接种策略
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他的 阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高各种本领域认可 的病毒疫苗的疗效。除了上面所提供的实施例外，非限制性的病毒疫苗 的实施例如下：
I.乙型肝炎病毒疫苗
病毒疫苗和重组DNA疫苗的一个实例是Glaxo Smith Kline(Engerix B_)、和Merck Sharpe和Dohme(HBVaxII_)分别开发的乙型肝炎病毒疫 苗。Engerix B_疫苗制剂是每1ml 20μg的剂量，按产品说明书给药。 HBVaxII_疫苗制剂是1ml 10μg/ml的剂量，按产品说明书给药。也可以 得到这些和其他疫苗的各种儿科剂型。这些疫苗可以或不可以含有防腐 剂例如硫柳汞(Australian Immunization Handbook，8th edition)。疫苗剂量 通常是在经肌肉内注射施与0.5ml到1ml的范围内。疫苗接种的一般疗程 可以不同，但通常包括单一的、初次免疫接种，之后是至少一次间隔近1 个月以上的强化免疫接种。
II.甲型肝炎病毒疫苗
灭活病毒疫苗的实例是那些Aventis Pasteur(Avaxim_)、Glaxo Smith Kline(Havrix 14400和Havrix Junior_)和其他所开发的用于治疗甲型肝 炎的疫苗。对于Avaxim_，每0.5ml剂量含有160ELISA单位的甲型肝 炎(GBM株)病毒抗原。对于Havrix 1440_，每0.5ml剂量含有1440ELISA 单位的甲型肝炎病毒(HM 175株)。这些单价疫苗的疫苗剂量是在经IM 注射的0.5ml到1ml的范围内。疫苗接种的一般疗程可以不同，但通常包 括在6个月间隔内的三次疫苗接种。
III.甲型肝炎和乙型肝炎多价疫苗
或者，可以使用多价疫苗，它含有超过一种的病毒抗原。例如，Glaxo Smith Kline的Twinrix_含有720ELISA单位的甲型肝炎病毒抗原和20μg 重组DNA乙型肝炎B表面抗原蛋白，在0、3和6个月时经肌肉注射给 药。另一种多价疫苗是Aventis Pasteur的Vivaxim_。每1ml剂量含有160 ELISA单位的灭活甲型肝炎病毒抗原和25μg纯化的伤寒荚膜多糖，经双 腔注射器提供，肌肉施与2个或3个剂量的该多价疫苗。
IV.巨细胞病毒疫苗
Vical公司已经开发出了一种抗CMV的免疫治疗性的基于DNA的疫 苗。按产品说明书中所提供的，按1或5mg三次剂量施与疫苗。DNA质 粒编码CMV磷蛋白65(pp65)和糖蛋白B(gB)，以及与Poloxamer一起制 成疫苗。
V.EBV疫苗
Medlmmune、GlaxoSmithKline、和Henogen已经共同开发了一种抗 EBV的可溶性重组亚基疫苗。已经用活的重组疫苗载体表达EBV gp220/350，并已经显示赋予了灵长类和EBV阴性婴儿的保护作用。另外， 已经在澳大利亚进行了对EBNA-3A肽的临床试验(对于这种病毒疫苗和 其他疫苗的综述，见例如THEJORDAN REPORT 2000：ACCELERATED DEVELOPMENT OF VACCINES，published by the Division of Microbiology and Infectious Diseases，National Institute of Allergy and Infectious Diseases，National Institutes of Health(可在 http://www.niaid.nih.gov/publications/pdf/Jordan.pdf-last visited Apr.2004获 得))。
实施例38：其他的癌症疫苗策略
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他的 阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高各种本领域认可 的癌症疫苗的疗效。除了上面所提供的实施例外，非限制性的癌症疫苗 的实施例如下：
I.黑素瘤疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，可以用本发明的方法提高黑素瘤疫苗的 疗效。这样的黑素瘤疫苗的一个实例是AVAX公司(Philadelphia，PA)所开 发出的自体黑素瘤细胞疫苗。切除转移癌，保持在4℃，并在切除的48h 内运送到实验室。通过胶原酶和DNA酶的酶性分离提取肿瘤细胞，分装 并在可控速的冷冻箱中冷冻，和含有人白蛋白及10％二甲基亚砜的培养 基一起储存在液氮中直到需要时。在治疗患者的当天，融化一部分细胞， 洗涤并经2500cGy照射。然后洗涤肿瘤细胞，并与二硝基氟苯孵育30分 钟，然后用盐水洗涤(Miller et al.(1976)J.Immunol 117：1519)。在洗涤之 后，计数细胞并重悬在0.2ml含有人白蛋白的Hanks溶液中，并保持于4℃ 直到给药。
疫苗剂量是在0.5-25.0×106个细胞的范围内。正在注射之前，可以往 疫苗中加入0.1ml BCG(Tice，Organon Teknika，Durham，N.C.)。可以逐步 减弱BCG剂量，以产生包括无溃疡的炎性丘疹的局灶反应。将混和物皮 内注射到一个或多个部位，例如上臂。在不同的时间段内(例如每月一次 共12个月，或每周一次共6-12周)进行多个剂量疫苗接种，以及可以包 括施与低剂量(300mg/m2)的环磷酰胺，当在与免疫接种相关的合适时间给 予时，环磷酰胺能似非而是地增加细胞介导的免疫力。
II.肺癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高肺癌疫苗的 疗效。这样的肺癌疫苗的一个实例是Corixa公司的非小细胞肺癌的DNA 疫苗。疫苗是一种与重组腺病毒佐剂一起施与的重组DNA疫苗。 ABiojector_设备(Bioject，Tualatin，OR)被用于疫苗给药，它是一种可重复 使用的压缩CO2筒供能的无针头注射器。
本发明的方法可以使用的其他非限制性的肺癌疫苗包括用于非小细 胞肺癌的L523S(Wang et al.(2003)Br.J.Cancer 88：887)和用于小细胞肺 癌的BEC-2、GM2、Globo H、fucosyl GM1、和聚硅酸(Krug(2004)Sem. Oncol.31：112)。
III.前列腺癌
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高前列腺癌疫 苗的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是Provenge_ (Dendreon Corp.)，它是一种用于雄激素非依赖性前列腺癌的疫苗。这种 疫苗造成了对前列腺癌的与抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)相关的T细胞免 疫应答的形成。经白细胞分离术从患者中得到DC前体细胞，并用细胞 分离设备将其与其他白细胞分开。然后将这些细胞与重组的PAP融合的 输送盒共培养约36个小时，以容许DC成熟。然后成熟的DC被用于疫 苗。在两周的间隔内，30分钟静脉内输注转运Provenge疫苗。用于本发 明的其他侯选的前列腺癌疫苗在本领域是已知的(见，例如Shaffer and Scher(2003)Lancet Ocol.4：407)。
IV.结直肠癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高结直肠癌疫 苗的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是TrovaxTM(Oxford BioMedica)。该疫苗是一种经肌肉内注射通过修饰的痘苗病毒Ankara (MVA)所运送的实体瘤相关抗原5T4。在0、4和8周与化疗同时给予疫 苗。用于结直肠癌患者的其他细胞毒性T淋巴细胞前体导向的肽疫苗在 本领域是已知的(见，例如Sato et al.(2004)Br.J.Cancer 90：1334)。
V.卵巢癌疫苗
通过在施用性类固醇信号途径的抑制剂例如GnRH类似物(或其他 的阉割方法)之前、之后或同时，也可以用本发明的方法提高卵巢癌疫苗 的疗效。这样的一种疫苗的一个非限制性的实例是用于治疗转移性卵巢 癌的M-FP(CancerVac Pty.Ltd.)。它是一种自体发生的细胞疫苗，其中皮 下注射DC。将重组的MUC1融合到甘露聚糖中以促进患者的纯化树突 状前体细胞对抗原的摄取。然后给患者皮下注射呈递MUC1肽的活化 DC。
实施例39：阉割对胸腺切除小鼠的BM和脾的作用
进行这些预试验是为了确定阉割作用在胸腺切除的患者(小鼠)中 是否是明显的。结果说明对性类固醇信号途径的阻断对免疫系统(例如 BM和胸腺内的免疫细胞)具有直接或间接的作用，无论是否存在再活化 的胸腺。
材料和方法
利用本领域已知的常规方法将小鼠阉割和胸腺切除。小鼠被分到下 面的组中：未治疗(即天然的、“未治疗的”)、假阉割(“sham-cx”)、 和阉割(“cx”)，以及这三组的每一组都被胸腺切除(“tx”)或假胸腺 切除(“shtx”)，总共有6个被分析的组。在骨髓清除和BMT(见上面的 方法)后2周和4周时，分析6组中的每一组。
结果
I.胸腺切除没有影响性类固醇抑制对BM的作用
如图72A所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有数目增加的BM 普通淋巴祖细胞(CLP)，该数目与ShTx/Cx小鼠的相当。
如图72B所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有总数目增加的 BM B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有数目增加的BM B细 胞。
如图72C所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也具有总数目增加的 BM未成熟B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或 ShamCx/ShTx对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有数目增 加的BM未成熟B细胞。
因此，图72A-C的结果支持这样的结论，就是阉割对增加BM细胞 的数目和功能性包括增加植入的作用不需要再活化的胸腺，取而代之的 是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
II.胸腺切除不影响性类固醇抑制对脾的作用
如图72D所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出具有脾的细 胞总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。当与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照小鼠比较时，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠也具有增加了总数目的脾 细胞。
如图72E所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出脾的B细胞 总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx 对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠也具有数目增加的脾的B细胞。
因此，图72D-E的结果支持这样的结论，就是阉割对增加脾的免疫 细胞的数目和功能性包括增强重建的作用不需要再活化的胸腺，取而代 之的是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
在此一同并入参考在上面说明书中所提及的所有文献。只要不脱离 发明的范围和精神，对所述的本发明的方法和系统的各种修饰和变异对 于本领域人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选的实施方式描述了 发明，但应当明白所要求的发明不应当被过度地限制于这些特殊的实施 方式。事实上，对生物学或相关领域的人员显而易见的是对所述的实施 发明的方式的各种修饰都在下面的权利要求书的范围内。
本领域人员利用常规试验将认识到、或能确定出多种与在此所特异 描述的特异的实施方式相等价的实施方案。这些等价方案包含在下面的 权利要求书的范围内。
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