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菊糖和菊糖乙酸酯制剂

阅读：834发布：2020-05-26

专利汇可以提供菊糖和菊糖乙酸酯制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开内容提供了包含β-菊糖或菊糖乙酸酯和活性剂的微粒或纳米颗粒的组合物，其中活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒内。活性剂可以是，例如，疫苗接种抗原、抗原肽序列、或免疫球蛋白。可将组合物掺入各种制剂中用于向受试者诸如人或动物施用。本发明还提供了使用组合物和制剂的方法，包括为了治疗、预防、或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病、老化疾病，或其组合的目的刺激受试者中的免疫应答，或增强受试者中的免疫应答的方法。，下面是菊糖和菊糖乙酸酯制剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种组合物，所述组合物包含β-菊糖或菊糖乙酸酯(InAc)和活性剂的微粒或纳米颗粒，其中所述活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒内。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括微粒。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括具有约1μm至约30μm的直径的微粒。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括纳米颗粒。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括具有约10nm至约1000nm的直径的纳米颗粒。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述β-菊糖或InAc具有约4kDa至约16kDa的
分子量。
7.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括一种或更多种免疫调节因子，其中所述一种或更多种免疫调节因子是淋巴因子、细胞因子、胸腺细胞刺激因子、单核细胞或巨噬细胞刺激因子，内毒素、或其组合。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂包括抗原、DNA、RNA、抗原肽或抗原序列、免疫原、或免疫球蛋白。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述生物组分包括肽、蛋白、脂质、DNA或多糖。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包括有效量的第二活性剂。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物体内或原位刺激免疫应答，并且所述免疫应答包括Thl(IgG-2a)型或Th2(IgG-1)型免疫应答、或其组合。
13.一种组合物，所述组合物包含β-菊糖或菊糖乙酸酯(InAc)颗粒和活性剂，其中所述活性剂被包含在单独颗粒中或物理上与β-菊糖或InAc的颗粒缔合，并且其中所述组合物在人或动物中刺激针对活性剂的免疫应答。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含菊糖乙酸酯的疫苗，并且其中对所述菊糖乙酸酯的乙酰化作用的程度为约0.1％至100％。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述β-菊糖是选自由以下组成的组的菊糖衍生物：酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。
16.一种组合物，所述组合物包含β-菊糖或菊糖乙酸酯(InAc)和活性剂的微粒或纳米颗粒，其中所述活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒中，所述组合物用于在传染病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、过敏症、糖尿病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病或老化疾病的治疗中使用。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述β-菊糖是选自由以下组成的组的菊糖衍生物：酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。
18.如权利要求16或17所述的组合物，其中所述组合物在动物中经由TLR诱导免疫原性应答。
19.如权利要求16、17或18所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述组合物包括InAc微粒。
21.一种用于产生抗体的方法，所述方法包含用包含根据权利要求1-20的任一项的组合物的制剂免疫动物或人，并且从所免疫的动物或人收集所述抗体。
22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括刺激免疫细胞，其中所述免疫细胞是巨噬细胞，其中所述抗体是单克隆抗体或来自多克隆血清的抗体，并且其中所述细胞在所述刺激后收集。
23.一种用于产生抗血清的方法，所述方法包含用包含根据权利要求1-20的任一项的组合物的制剂免疫动物或人，并从所免疫的动物或人，或从所免疫的动物或人的产物收集所述抗血清，其中所述组合物递送抗原至构成所述动物或人的免疫细胞作为TLR激动剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗血清包含抗体。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或来自多克隆血清的抗体。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述动物是灵长类动物、狗、猫、奶牛、小羊、猪、阉猪、家禽、马、母马、骡、雄性动物、雌性动物、驹、犊、一岁动物、公牛、牛、绵羊、山羊、美洲鸵、野牛、水牛、羔羊、小山羊、小猪、母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸟、兔、野兔、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、啮齿动物、鱼、水生动物或两栖动物。
27.如权利要求23-36的任一项所述的方法，其中所组合物通过注射、吸入、口服、直肠、阴道、鼻、或局部来施用。
28.权利要求1-18的任一项的微粒或纳米颗粒作为佐剂的用途。
29.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含β-菊糖或菊糖乙酸酯(InAc)的微粒或纳米颗粒的组合物；
b)任选的活性剂；
c)容器；
d)一种或更多种缓冲液，
e)用于将活性剂与所述组合物缔合的说明书；以及
f)标签。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述活性剂选自由以下组成的组：抗原、DNA、RNA、抗原肽、或抗原序列、免疫原、或免疫球蛋白。
31.如权利要求29所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于在动物或人中产生抗血清的说明书。
32.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述β-菊糖是选自由以下组成的组的菊糖衍生物：酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。
33.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述活性剂包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述生物组分包括肽、蛋白、脂质、DNA或多糖。
35.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述组合物包括InAc的微粒。

说明书全文

菊糖和菊糖乙酸酯制剂

[0001] 发明背景发明领域

[0002] 本发明一般涉及疫苗和佐剂，并且更具体地涉及包含β-菊糖和β-菊糖衍生物的疫苗和佐剂，其中所述β-菊糖和β-菊糖衍生物用作递送装置以及佐剂，包括包含其的纳米颗粒和微粒组合物以及使用所述组合物治疗的方法。

[0003] 背景资料

[0004] 接种疫苗的目的是通过产生对施用抗原的强免疫应答，以提供针对感染的长期保护。疫苗通常需要加入称为佐剂的免疫刺激剂，以提高对抗原的特异性免疫应答的效力和寿命。理想的疫苗佐剂应刺激对共注射的抗原的体液(Th2型)和细胞(Th1型)两种免疫应答。需要体液应答以清除细胞外的病原体。细胞应答对消除细胞内的病原体是至关重要的。

[0005] 在美国用于人类使用的唯一被批准的佐剂明矾(铝盐)，仅刺激体液免疫应答。虽然已成功地开发了仅使用明矾作为佐剂引起保护性抗体应答的一些基于重组蛋白的疫苗，包括用于乙型肝炎和人乳头状瘤病毒的那些疫苗，但针对疾病诸如癌症、疟疾、疱疹、流感、结核、HIV和/或AIDS的下一代的重组疫苗，将不仅需要非常强且持久的抗体应答，而且需要有效的细胞介导的免疫应答。

[0006] 因此，对可促进受试者中抗体应答的新组合物存在需要。还对可促进体液和细胞两种免疫应答的新颖疫苗佐剂、抗原递送系统、和组合物存在需要。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明提供了当作为微粒或纳米颗粒递送时刺激免疫系统的可溶性或不溶性的多糖聚合物。当作为微粒或纳米颗粒配制时，菊糖的β-亚型(β-菊糖)及其半合成衍生物菊糖乙酸酯(InAc)可作为新颖疫苗佐剂和抗原递送系统起作用。颗粒可被用于为了预防或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病、或老化疾病的目的刺激受试者中的免疫应答。

[0009] 在实施方案中，公开了包含β-菊糖或菊糖乙酸酯和活性剂的微粒或纳米颗粒的组合物，其中活性剂可被包含在单独微粒或纳米颗粒内。活性剂可包括抗原、抗原肽或其序列、免疫原、免疫球蛋白、或其组合。在相关的方面中，活性剂可以是期望针对其的免疫应答的半抗原或任何剂。

[0010] 在实施方案中，公开了包含β-菊糖或菊糖乙酸酯颗粒和活性剂的组合物，其中活性剂可被包含在单独颗粒内，或在物理上与β-菊糖或菊糖乙酸酯的颗粒缔合，其中当向人或动物施用时，组合物有效地在人或动物中刺激针对活性剂的免疫应答。

[0011] 在一个方面，疫苗组合物包含抗原和有效佐剂量的菊糖乙酸酯，其中对菊糖乙酸酯的乙酰化的程度为约0.1％至100％。

[0012] 在另一个方面，组合物包含β-菊糖或菊糖衍生物和活性剂的微粒或纳米颗粒，活性剂包括抗原、抗原肽序列、或免疫球蛋白，并且组合物包含有效佐剂量的β-菊糖或菊糖衍生物，其中菊糖衍生物包括在颗粒制剂形式中的酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、菊糖或其氧化或还原形式与另外的活性剂的络合、菊糖的阳离子/阴离子/非离子的修饰、或菊糖的磷酸酯，其中将抗原包封在颗粒内，涂覆或缀合至颗粒上或可包括其组合。

[0013] 在实施方案中，公开了为了治疗或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、遗传性疾病、退行性疾病或老化疾病的目的刺激受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。

[0014] 在实施方案中，公开了提供为了治疗或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、遗传性疾病、退行性疾病或老化疾病的目的增强受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。

[0015] 在实施方案中，公开了诱导受试者中免疫原性应答的方法，包括对所述受试者施用有效量的本文描述的组合物。

[0016] 在另一个实施方案中，公开了治疗感染的方法，包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。感染可由细菌、支原体、真菌、病毒、原生动物、或其他微生物、或其组合引起。

[0017] 在实施方案中，公开了治疗动物或人中侵染的方法，包括向患有侵染的动物或人施用有效量的本文描述的组合物。侵染可由微生物、蠕虫、寄生物、或其组合引起。

[0018] 在实施方案中，公开了用于产生抗体或用于刺激免疫细胞的方法，包括用包含本文描述的组合物的制剂免疫动物或人，并从被免疫的动物或人收集抗体或免疫细胞。抗体可以是，例如，单克隆抗体或多克隆抗体或其功能片段(例如，Fab、scFv、抗体缀合物或类似的抗体片段)。

[0019] 在实施方案中，公开了用于生产抗血清的方法，包括用具有本文描述的组合物的制剂免疫动物或人，并从免疫的动物或人、或从免疫的动物或人的产物(诸如动物的卵)收集抗血清。抗血清可包含抗体，其中抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。动物可以是灵长类动物(primate)、狗(dog)、猫(cat)、奶牛(cow)、小羊(lamb)、猪(pig)、阉猪(hog)、家禽(poultry)、马(horse)、母马(mare)、骡(mule)、雄性动物(jack)、雌性动物(jenny)、驹(colt)、犊(calf)、一岁动物(yearling)、公牛(bull)、牛(ox)、绵羊(sheep)、山羊(goat)、美洲鸵(llama)、野牛(bison)、水牛(buffalo)、羔羊(lamb)、小山羊(kid)、小猪(shoat)、母鸡(hen)、小鸡(chicken)、火鸡(turkey)、鸭(duck)、鹅(goose)、鸵鸟(ostrich)、鸟(fowl)、兔(rabbit)、野兔(hare)、豚鼠(guinea pig)、仓鼠(hamster)、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、啮齿动物(rodents)、鱼(ﬁsh)、水生动物(aquatic animal)或两栖动物(amphibian)。

[0020] 组合物可通过注射、吸入、口服、直肠、阴道、鼻、或局部施用。在与颗粒包封或缔合前，活性剂可与生理上可接受的无毒媒介物组合来制备，或在与活性剂包封或缔合后，颗粒可与生理上可接受的无毒媒介物组合。

[0021] 在一个方面，本文描述的微粒或纳米颗粒可被用作佐剂。在一个相关方面，本文描述的组合物的颗粒可以是微粒。微粒可具有约1gm至约30μm、约1.5gm至约25μm、或约2μm至约20μm的直径。颗粒还可以是纳米颗粒。纳米颗粒可具有约10nm至约1000nm、约
10nm至约950nm、约10nm至5约900nm、约50nm至约900nm、约100nm至约800nm、约10nm至约400nm、约400nm至约900nm、或约20nm至约750nm的直径。

[0022] 在另一个方面，β-菊糖或菊糖乙酸酯可具有约4kDa至约25kDa的分子量。

[0023] 在一个方面，组合物还可包括一种或更多种免疫调节因子，诸如淋巴因子、细胞因子、胸腺细胞刺激因子、单核细胞或巨噬细胞刺激因子、内毒素、病原体相关分子模式(PAMS)、模式识别受体的配体(PRR)、或其组合。

[0024] 在另一个方面，活性剂可以是抗原、抗原肽、或抗原序列、或免疫球蛋白。在相关的方面，抗原可以是，例如，DNA或RNA，或包含DNA或RNA的生物组分。在另外的相关方面，活性剂还可包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分(a lysate of a bacterial or a viral pathogen,cancer cell,or other biological component associated with a pathogen or a disease)。例如，生物组分可以是肽、蛋白、脂质、DNA、或单独的多糖。

[0025] 在一个方面，组合物还可包括有效量的与颗粒包封或缔合的或与颗粒一起被包含在制剂中的第二活性剂。

[0026] 在另一个方面，本文描述的组合物的施用可刺激免疫应答。免疫应答可包括Th1(IgG-2a、细胞毒性T细胞)或Th2(IgG-1、IgA)类型的免疫应答、或其组合。在相关的方面，向动物或人的施用可减少由活性剂、或与活性剂相关的疾病或状况引起的症状的至少一个。

[0027] 在一个方面，免疫组合物包括，与药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂组合的本文描述的组合物。在相关的方面，可将免疫组合物配制为液体、半固体、胶体或固体剂型。在另外的相关方面，载体可以是液体媒介物或稀释剂可以是固体稀释剂，例如，用于干粉吸入的固体稀释剂。

[0028] 在实施方案中，公开了β-菊糖或β-菊糖衍生物，诸如菊糖乙酸酯的微粒和纳米颗粒制剂，以及其用作免疫刺激剂的用途。在相关的方面，向受试者施用后的前30分钟，制剂可具有小于约30wt.％的包封的或物理上缔合的分子的突释。

[0029] 在实施方案中，在向受试者施用后的前30分钟，制剂可具有小于约20wt.％的突释、小于约15wt.％的突释、或小于约10wt.％的突释。在相关的方面，包封的材料的>约90wt.％的释放是>约20天。

[0030] 在实施方案中，公开了本文描述的组合物用于疾病的医疗、兽医、和人畜共患病的(zoonotic)治疗或预防的用途。在一个方面，药物治疗可以是预防和治疗癌症或其他恶性肿瘤，包括，但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、或结肠癌、以及淋巴瘤和白血病、和骨骼、血液、或淋巴系统的癌症。

[0031] 在实施方案中，公开了如本文描述的组合物用于制造治疗哺乳动物中疾病，例如人的癌症的药剂的用途。在一个方面，公开了如本文描述的组合物用于制造治疗非哺乳动物物种中疾病的药剂的用途。在相关的方面，药剂可包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

[0032] 在实施方案中，公开了试剂盒，包括包含β-菊糖或菊糖乙酸酯的微粒或纳米颗粒的组合物；任选地活性剂；容器；一种或更多种缓冲液，用于活性剂与所述组合物缔合的说明书；以及标签。

[0033] 附图简述

[0034] 以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本公开内容的某些实施方案或各个方面。在一些情况下，本公开内容的实施方案可通过参照附图结合本文提供的详细说明书被最好地理解。

[0035] 说明书和附图可突出显示本公开内容的某些具体实施例、或某些方面。然而，本领域技术人员将理解，该实施例或方面的部分可与本公开内容的其他实施例或方面结合来使用。

[0036] 图1示出由FTIR光谱学对β-菊糖和菊糖乙酸酯的IR光谱的比较。

[0037] 图2示出卵白蛋白从InAc微粒的体外释放曲线。释放研究用在pH 7.4下的1mL的100mM PBS中分散的10mg的微粒以约100rpm震动在37℃下来进行。在不同时间间隔取样，并用等体积的新鲜PBS来代替。卵白蛋白浓度通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定法来测量(n＝3)。

[0038] 图3示出树突状细胞对抗原(ova)的摄取。(A)将DC2.4细胞与在溶液中或在菊糖微粒中的FITC ova温育后的流式细胞术。(B)由荧光显微镜示出如与3A中的相同的结果，DC2.4细胞的细胞核用DAPI来染色。

[0039] 图4示出了(A)InAc通过MyD88或Mal依赖性TLR激活巨噬细胞，且(B)InAc微粒与TLR-4相互作用。*指示使用student t检验，结果在统计上是显著的(P<0.05)。

[0040] 图5示出了免疫的小鼠血清中ova-特异性总IgG、IgG-1和IgG-2a抗体滴度。在第1天和第21天将小鼠(n＝4-5/组)皮内注射单独ova(100μg)、ova与明矾(200μg)、ova与空白的β-菊糖微粒、或在β-菊糖微粒中装载的ova，作为初次剂量和加强剂量。在免疫接种后1周和3周时，收集血清，用于使用间接ELISA分析抗-ova抗体滴度。

[0041] 图6示出卵白蛋白(ova)从β-菊糖微粒的释放曲线。释放研究用在pH7.4下的1mL的100mM PBS(磷酸盐缓冲盐水)中分散的10mg的微粒以约100rpm震动在37℃下来
进行。在不同时间间隔取样，并用等体积的新鲜PBS来代替。FITC-Ova浓度由荧光比色分析来测量(n＝3)。

[0042] 图7示出了免疫的小鼠血清中ova-特异性总IgG、IgG-1和IgG-2a抗体滴度。在10，第1天和第21天将小鼠(n＝4-5只/组)皮内注射单独ova(100μg)、ova与明矾
(200μg)、ova与空白InAc微粒、或在InAc微粒中装载的ova，作为初次免疫和加强免疫。
在初次免疫和加强免疫后1周和3周时，收集血清，用于使用间接ELISA分析IgG滴度。

[0043] 图8示出响应于抗原(Ova)的脾细胞体外增殖。从用单独ova、ova与明矾、或在β-菊糖或InAc微粒中装载的ova免疫的小鼠制备脾细胞，并且在伴刀豆球蛋白
A(ConA,2.5μg/mL)或ova(100μg/mL)或RPMI1640培养基的存在下培养72小时。脾细胞增殖通过MTT测定法来测量并显示为刺激指数(SI)。SI＝抗原(ova)或有丝分裂原(ConA)处理的培养物的吸光度值除以未刺激的培养物(RPMI处理)的吸光度值。ConA是增殖的阳性对照。*指示使用student t检验与ova免疫的组相比，值是统计学显著的(P<0.001)。

[0044] 图9示出Th1(IFN-g和IL-2)和Th2(IL-4和IL-10)细胞因子的测量。从用单独ova、ova与明矾、或装载ova的InAc微粒免疫的小鼠制备脾细胞，并且在Ova(100μg/mL)的存在下培养72小时。72小时后，从不同处理组收集上清液，并且不同细胞因子的浓度使用夹心ELISA来测量。*指示使用student t检验与ova免疫的组相比，值是显著更高的(P<0.001)。

[0045] 图10示出免疫的小鼠中的DTH应答。将Ova(5μg)注射在每个免疫的小鼠的左足垫并且PBS注射在右足垫。足垫肿胀程度在Ova和PBS处理后24小时来测量。数据表示来自每组的3-4只免疫的小鼠的肿胀的平均程度+标准偏差。*指示使用student t检验与ova免疫的组相比，值是统计学显著的(P<0.001)。

[0046] 图11示出菊糖乙酸酯颗粒的大小对免疫的小鼠血清中ova-特异性总IgG滴度的产生的效应。在第1天和第21天将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA(完全弗氏佐剂)或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100、10或1μg)皮下注射，作为初次免疫和加强免疫。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG滴度。CFA被用作阳性对照(最强佐剂)。

[0047] 图12示出菊糖乙酸酯颗粒的大小对免疫的小鼠血清中血清ova-特异性IgG-1滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析IgG-1滴度。

[0048] 图13示出菊糖乙酸酯颗粒的大小对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG-2a滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析IgG-2a滴度。

[0049] 图14示出InAc微粒中装载的抗原的量对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或装载在InAc微粒中的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG、IgG-1和IgG-2a滴度。

[0050] 图15示出InAc纳米颗粒中装载的抗原的量对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或装载在InAc纳米颗粒中的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG、IgG-1和IgG-2a滴度。

[0051] 图16示出补体旁路路径(APC)激活测定的结果。人血清引起兔RBC溶解，其通过在700nm处确定OD值来分析。在与RBC温育以溶解之前，人血清用各种样品来处理。通过将未处理的人血清的RBC溶解视为100％，计算％RBC溶解。酵母聚糖(阳性对照)激活APC，并因此抑制了兔RBC溶解。

[0052] 图17示出了佐剂注射部位处的皮肤组织的H&E染色。(A)示出了在低放大率下来自InAc纳米颗粒注射(左)、InAc微粒注射(中)、和完全弗氏佐剂注射(CFA)(右)的部位的三幅图，且(B)示出了在较高的放大率下InAc微粒(左)和CFA(右)的两幅图。

[0053] 发明详述

[0054] 定义

[0055] 如本文中使用，列举的术语具有以下含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有其如本领域技术人员将理解的普通含义。此类通常含义可通过参考技术词典，诸如由R.J.Lewis的Hawley’s Condensed Chemical Dictionary,第14版,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001来获得。

[0056] 在说明书中提及“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(an embodiment)”等指示描述的实施方案可包括特定方面、特征、结构、部分、或特性，但不是每个实施方案都必定包括该方面、特征、结构、部分或特性。此外，这样的短语可，但不一定，是指在本说明书的其他部分所提到的相同的实施方案。此外，当特定方面、特征、结构、部分或特性在结合实施方案描述时，影响或连接无论是否明确描述的其他实施方案的这样的方面、特征、结构、部分或特性在本领域技术人员的知识范围内。

[0057] 除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种化合物”包括多个此类化合物，使得化合物X包括多个化合物X。还应注意，权利要求书可撰写成排除任何任选的要素。因此，这一声明旨在充当使用与权利要求要素或使用的“否定”限制的列举有关的排他术语，诸如“单独地”、“仅”以及类似的术语的前提基础。

[0058] 术语“和/或”意指项目的任何一个、项目的任何组合、或与该术语相关的全部项目。短语“一个或更多个”由本领域技术人员，特别是当阅读使用其的上下文时容易地理解。例如，一种或更多种任选的成分可被包括在特定制剂中，因此一个或更多个可指一至约四、或一至约五、或作为在特定制剂中被需要的许多组分。

[0059] 术语“约”可指指定的值的±5％、±10％、±20％、或±25％的变化。例如，“约50”百分数可在一些实施方案中进行从45％至55％的变化。对于整数范围，术语“约”可包括比在范围的每个端点处列举的整数更大和/或更小的一个或两个整数。除非本文另外指明，否则术语“约”旨在包括在单独成分、组合物、或实施方案的功能性方面等同的值，例如，邻近列举的范围的重量百分比。

[0060] 如本领域技术人员应当理解，所有数字，包括表示成分的数量、性质，诸如分子量、反应条件等等的那些，都是近似值，并且被理解为在所有情况下任选地被术语“约”修饰。这些值可取决于本领域技术人员利用本文说明书的教导追求获得的期望的特性而发生变化。还应理解，这些数值固有地包含必然地由其各自的测试测量中发现的标准偏差而引起的可变性。

[0061] 如本领域技术人员应理解，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述的方面，本文中列举的所有范围还包括任何及所有可能的子范围和子范围的组合，以及组成范围的单独数值，特别是整数值。列举的范围(例如，重量百分比或碳基团数)包括范围内的每一个具体的值、整数、小数或恒等式(identity)。任何列出的范围可被容易地认为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、或十份成为可能。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可容易地被分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还应理解，所有措辞，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或以上”，以及类似的措辞，包括列举的数字，并且这样的术语是指可随后被分解为如以上讨论的子范围的范围。以相同的方式，本文列举的所有比率还包括落入更宽比率内的所有子比率。因此，对原子团、取代基和范围列举的具体值仅用于说明；其不排除在用于原子团和取代基的限定的范围内的其他限定的值或其他值。

[0062] 本领域技术人员还将容易地认识到，当成员被以共同的方式分组在一起，诸如马库什组(Markush group)时，本发明不仅包括总体上列出的整个组，还单独地包括组的每个成员以及主要组的所有可能的亚组。另外，对于所有的目的，本发明不仅包括了主要组，还包括了缺失一个或更多个组员的主要组。因此，本发明设想，明确排除列举的组的成员中的任何一个或更多个。

[0063] 因此，附带条件可以适用于任何公开的类别或实施方案，由此列举的要素、种类、或实施方案的任何一个或更多个，可被排除在这样的类别或实施方案之外，例如，如用于明确否定性限制。

[0064] 术语“接触”是指触碰、使接触、或使直接或紧密靠近的行为，包括例如，在细胞或分子水平引起生理反应、化学反应或物理变化，例如，在溶液中、在反应混合物中、在体外或体内。

[0065] “有效量”是指有效治疗疾病、紊乱和/或状况，或导致列举的效果的量。例如，有效量可以是有效减少被治疗的状况或症状的进展或严重程度的量。

[0066] 治疗有效量的确定在本领域熟练技术人员的能力范围内。术语“有效量”是指包括本文中描述的化合物、或本文描述的化合物的组合，例如，有效治疗或预防疾病或状况，或治疗宿主中疾病或状况的症状的量。因此，“有效量”通常意指提供期望的效果的量。

[0067] 术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括：(i)预防疾病、病理或医学状况发生(例如，预防)；(ii)抑制疾病、病理或医学状况或阻止其发展；(iii)缓解疾病、病理或医学状况；和/或(iv)减少与疾病、病理或医学状况相关的症状。
因此，术语“治疗”、“治疗”和“治疗”扩展至预防(prophylaxis)并包括预防(prevent)、预防(prevention)、预防(preventing)、降低、停止或逆转被治疗的状况或症状的进展或严重程度。因此，术语“治疗”适当地包括医学、治疗两者和/或预防施用。

[0068] 术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”和“抑制(inhibition)”是指减慢、停止、或逆转疾病、感染、状况或细胞的组的生长或进展。例如，与治疗或接触的不存在下发生的生长或进展相比，抑制可以大于约20％、40％、60％、80％、90％、95％或99％。

[0069] 术语“菊糖”是本领域熟知的，并且是指α-D-吡喃葡糖基-[α-D-呋喃果糖基](n-1)-D-呋喃果糖苷，由线性β-D(2->1)聚呋喃果糖基α-D-葡萄糖的家族组成的多糖类，其中将典型多达约100果糖部分的无支链的链(对于植物衍生的材料n＝约5至约100且对于微生物衍生的材料约5至约100,000)连接至单一末端葡萄糖单元。

[0070]

[0071] 菊糖是植物衍生的多糖并具有相对疏水性的、聚氧乙烯样的主链。这种结构和其非电离化性质允许以非常纯净的状态再结晶和制备。可将菊糖以多达约16kDa的分子量制备为分子多分散的(molecularly polydisperse)。合适的菊糖颗粒(诸如本文描述的β-In和InAc颗粒)可从具有约2kDa至约12kDa、约3kDa至约8kDa、约4kDa至约6kDa、或约5kDa的分子量的原始菊糖(raw inulin)来制备。

[0072] 菊糖充当菊科植物(Compositae)(或菊科(Asteraceae))的贮藏碳水化合物并从大丽花块茎以高分子量来获得。菊糖可商购获自多个供应商，诸如Sigma(St.Louis,MO)。菊糖以几种不同的形式(多晶型)存在，包括α、β、γ、δ、和ε形式(例如，见
WO2011/032229(Petrovsky等人))。这些形式可由其溶解度参数来区分。α菊糖(α-In)和β菊糖(β-In)可分别通过从水和乙醇沉淀来制备。α和β两种异构体37℃下基本上可溶于水。γ菊糖(γ-In)37℃下不溶于水，但在70℃-80℃下以高浓度(>50mg/mL)可溶于水。以β型多晶型形式或以任何水溶性形式的菊糖从未被示出具有佐剂/免疫增强效应。

[0073] 术语“菊糖乙酸酯”(inulin acetate，InAc)是指乙酰化的菊糖。通常至少约90％的菊糖的可用羟基基团被乙酰化，并经常为至少约95％、或至少约98％。在实施方案中，可使用较低程度乙酰化的菊糖，诸如有至少约10％的可利用的羟基基团被乙酰化的菊糖。在实施方案中，至少约25％、至少约50％、或至少约75％的可利用的羟基基团可被乙酰化用于各种菊糖乙酸酯制剂。在实施方案中，当其红外线光谱中的羟基峰消失且乙酰基峰出现时，认为乙酰化的菊糖是菊糖乙酸酯。菊糖乙酸酯即使在高温下不溶于水，但可溶于各种有机溶剂诸如丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、以及类似的有机溶剂。

[0074] 菊糖乙酸酯不启动补体旁路途径(APC)，并且当与抗原共注射时，InAc不起疫苗佐剂的作用。InAc容易分散于盐水中。抗原必须被包封在InAc颗粒内部或物理上与InAc颗粒缔合以用作疫苗佐剂。InAc微粒和纳米颗粒可通过增强抗原的摄取和递送包封的抗原至免疫细胞的相关区室用于活化来用作疫苗佐剂。InAc还是新颖的TLR激动剂，如本文首次显示的。虽然不受理论所束缚，但这表明InAc通过与非乙酰化的菊糖形式不同的机制作为疫苗佐剂起作用。

[0075] 除了菊糖乙酸酯外或代替菊糖乙酸酯，可使用其他菊糖衍生物。菊糖衍生物可以是其中菊糖的羟基基团通过用烷基、芳基或酰基基团的化学取代，或通过由已知方法氧化或还原被修饰的菊糖。参见，例如，由Greg T.Hermanson描述于Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,CA(1996)的技术。

[0076] 菊糖衍生物包括酯键、醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、菊糖的氧化或还原形式及其衍生物、菊糖的阳离子/阴离子/非离子型修饰(阴离子：O-(羧甲基)菊糖；阳离子：Inutec H25P)、以及菊糖或其氧化/还原形式与其他剂的络合(例如，氧化的菊糖与重金属诸如铜、锌、镉、或类似的重金属的络合)。

[0077] “菊糖酯”或“酯化的菊糖”是指，通过与形成酯的基团诸如羧酸缩合或与基团诸如羧酸酐酰化，或类似的对羟基基团酯化的菊糖。菊糖酯的实例包括但不限于：菊糖丙酸酯、菊糖丁酸酯、菊糖磷酸酯，以及类似物。

[0078] “菊糖醚”或“醚化的菊糖”是指，通过用形成醚的基团诸如具有适当离去基团诸如卤化物、酰基卤、或类似基团的基团对羟基基团醚化的菊糖。菊糖醚的实例包括但不限于：甲基化的菊糖(例如，菊糖全甲基醚)、乙基化菊糖、和类似物。

[0079] 菊糖的氧化或还原形式及其衍生物的实例包括菊糖碳酸酯、二醛菊糖和类似物。可使用的其他菊糖衍生物包括氰基乙基菊糖、氨基-3-氧代丙基-菊糖、羧乙基菊糖、羟亚氨基-3-氨基丙基菊糖、菊糖氨基甲酸酯(例如，Inutec SP1)，或其组合。

[0080] 菊糖衍生物可以是其中将货物分子(例如，抗原)包封在颗粒内，或涂覆或缀合至颗粒上的粒状制剂的形式。菊糖的可用羟基基团的修饰可为如上对于菊糖乙酸酯的乙酰化描述的程度。

[0081] “活性剂”或“活性”是指可与β-菊糖或InAcC颗粒包封或物理上缔合的药物、免疫学试剂(例如，抗原)、或其他货物分子。“物理上缔合”是指通过静电相互作用，包括亲水性、疏水性相互作用，或氢键与聚合物或颗粒形成的缔合。“与颗粒物理上缔合”可指用试剂涂覆颗粒，以及将颗粒共价地缀合至试剂。

[0082] 缀合的方法是本领域熟知的并且几种技术描述于Greg T.Hermanson inBioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,CA(1996)中。可将活性剂以总计的颗粒和货物和/或物理上缔合的分子的约1wt.％至约25wt.％、约1wt.％至约10wt.％、或约1wt.％至约5wt.％装载进颗粒。

[0083] “抗原”是指能够在适当条件下，诱导特定免疫应答，并与该应答的产物即，与特定抗体或特定致敏的T淋巴细胞，或两者发生反应的任何物质。术语“抗原”、“免疫原性剂”和“活性剂”在本文档中可互换使用。抗原可以是可溶性物质，诸如毒素和自身或外来蛋白/肽、或颗粒状物质，诸如细菌、病毒、和组织细胞；然而，称为抗原决定簇或表位的蛋白或多糖分子的仅一小部分被淋巴细胞上的特定受体识别。类似地由响应产生的抗体或效应淋巴细胞仅与一个抗原决定簇结合。细菌细胞或大蛋白可具有数百个抗原决定簇，其中的一些在保护性免疫中比其他抗原决定簇更重要。

[0084] 可与本文提供的佐剂一起使用的已知抗原的部分列表如下：同种异体抗原，其在相同物种的一些而非所有个体中出现，例如，组织相容性抗原和以前称为同族抗原的血型抗原；细菌抗原；血型抗原，其存在于红细胞的表面上，并在相同物种的个体之间发生变化，并且被用作为血型分型的基础；荚膜抗原；K、L和V抗原；癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)；瘤胚抗原(oncofetal antigen)；共同抗原(common antigen)，其是存在于两种或更多种不同抗原分子中的抗原决定簇并且是它们之间交叉反应的基础；完全抗原，其是既刺激免疫应答又与该应答的产物，例如抗体发生反应的抗原；缀合抗原(conjugated antigens)；半抗原；交叉反应的抗原是由于抗原决定簇的相似性与响应于不同但相关的抗原产生的抗体组合的抗原，或两种细菌菌株中的相同抗原，使得针对一种菌株产生的抗体将与另一菌株发生反应；狗红细胞抗原(DEA)，其是发现于狗红细胞上并用于区分物种中不同血型的抗原；环境抗原，发现于花粉、真菌、屋尘、食物和动物皮屑中的那些抗原；猫致癌RNA病毒细胞膜抗原(FOCMA)，其是存在于感染了猫白血病病毒的猫的细胞的膜上的肿瘤特异性抗原；鞭毛抗原；H或Hauch抗原，其是在细菌鞭毛中出现的抗原；跳蚤抗原，其包括跳蚤唾液，以及跳蚤的提取物中的某些组分；福斯曼抗原；异嗜性抗原，其是在多个不相关的物种，主要在器官但不在红细胞、或仅在红细胞、或偶尔在器官和红细胞两者中出现的抗原；组特异性(gs)抗原，其为一组特定的生物体，例如，链球菌、致癌RNA病毒所共有；异质抗原；异种抗原；异嗜性抗原；异种抗原，其包括能够刺激与来自其他动物或植物的组织反应的抗体的产生的抗原；隐藏的抗原，其是正常不暴露于循环的淋巴细胞的抗原，例如，在中枢神经组织、睾丸组织和某些胞内组分中，并因此其正常不引起免疫应答；组织相容性抗原；H-Y抗原，其是细胞膜的组织相容性抗原；Ia抗原，其是由位于B淋巴细胞、T淋巴细胞、皮肤、和某些巨噬细胞的主要组织相容性复合体(MHC)的I区支配的组织相容性抗原；同基因抗原，其是由个体、或同一纯系株的成员携带的抗原，能够在相同物种的遗传上不同个体中引起免疫应答，但在携带它的个体中不引起免疫应答；K抗原；细菌荚膜抗原；L抗原，其是大肠杆菌(Escherichia coli)的荚膜抗原；Ly抗原，其是T淋巴细胞的亚群的抗原性细胞表面标志物，分类为Ly 1、2和3；淋巴细胞限定性(LD)抗原；发现于淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞和精子中的II类抗原；M抗原，表现为主要位于细胞壁中并与化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的毒力相关的类型特异性抗原；马立克氏肿瘤特异性抗原(MATSA)，发现于感染了马立克氏病、疱疹病毒的细胞的表面；内格里抗原，其是通过丙酮和甲醇从死的、干燥的及捣碎的结核杆菌中制备的抗原；核抗原，其是与抗核抗体发生反应的细胞核组分；0抗原，其在细菌的细胞壁中出现；瘤胚抗原，其是在胎儿发育过程中表达，但在成人的特化的组织中被抑制，并且还被某些癌症产生的基因产物，包括甲胎蛋白和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)；器官特异性抗原，其是仅出现在特定器官中，并用于将其与其他器官区分开的任何抗原；部分抗原(partial antigen)；花粉抗原，植物的花粉的主要多肽；稀有抗原，其是低频血型的抗原；回忆抗原，其是个体先前已被其致敏化而随后作为攻击剂量施用以诱发过敏性反应的抗原；隔离抗原，其是在胚胎发育过程中被从免疫系统解剖学上隔离，并因而认为不被识别为“自身”且在成年时期此类抗原如果暴露于免疫系统，将引起自身免疫应答的某些抗原；血清学限定性(SD)抗原，其是由使用特定的抗血清可鉴定的主要组织相容性复合物的I类抗原；合成的抗原，基于微生物中发现的或其他抗原的序列，化学合成或通过重组DNA技术、聚合物的合成产生；T-依赖性抗原(大部分抗原的免疫应答需要T辅助(Th)淋巴细胞；由T淋巴细胞产生的淋巴因子决定产生的抗体的特性，其可在免疫应答期间发生改变)；胸腺依赖性抗原，在免疫应答发生之前需要T淋巴细胞参与的抗原；胸腺非依赖性抗原，引起抗体应答而无T淋巴细胞的参与的抗原；致耐受性抗原；肿瘤特异性抗原(TSA)，其是仅发现于肿瘤细胞内的抗原；V抗原，Vi抗原，其是包含在细菌的荚膜中并认为促进其毒性的抗原；异种抗原，其是一个物种的成员共有，而不与其他物种的成员共有的；还称为异质抗原。

[0085] “补体途径”是指由通常以非活性酶原形式存在的众多血清糖蛋白组成的复杂的酶级联。系统具有三种不同的途径：“经典途径”、“旁路途径”和“卵磷脂途径”。补体系统的经典途径是人的免疫应答的体液分支的主要效应器。经典途径的引发物是结合至抗原的IgG或IgM抗体。抗体结合抗原暴露了抗体上的位点，其是第一补体组分Cl的结合位点。

[0086] “补体旁路途径”或APC不需要抗体用于其活化。而是，多种抗原诸如细菌脂多糖(LPS)和病毒和其他病原体的组分具有激活该途径的能力。虽然不受理论所束缚，认为其进化早于经典补体途径，经典补体途径依赖于相对较近演变的抗体分子。像经典途径一样，旁路途径产生C3和C5转化酶两者，其导致产生C5b，并然后形成膜攻击复合物(MAC)。然而，特定分子参与者和接下来所遵循的路径却不同于经典补体途径的那些。

[0087] 尽管用于每种途径的刺激因子是不同的，每个途径具有类似的末端序列，其产生膜攻击复合物(MAC)，膜攻击复合物(MAC)是穿过各种细胞表面的酶复合物。此外，旁路和经典途径两者具有作为其副产物的一些过敏毒素—促进炎症应答的小肽。

[0088] 参与补体系统的分子通常被提供名称“C”，并然后是数字，例如“C1”。这些数字不指示其在级联中起作用的顺序，而指其被发现的顺序。补体蛋白通常以酶原形式存在，并通过各种分子的连续裂解依次激活。当分解补体蛋白时，形成两个片段，通常称为“a”和“b”。例如，补体分子C5裂解成片段C5a和C5b。

[0089] 卵白蛋白，或“ova”，是水溶性白蛋白并且是鸡蛋清的主要组分。蛋清中总蛋白的约60-65％是卵白蛋白。卵白蛋白可用作贮藏蛋白并且鸡蛋的卵白蛋白可用作在测试受试者中刺激过敏反应的抗原。

[0090] 如本文使用的术语“动物”，是指任何界的生物，包括但不限于动物界的成员，包括通常在以下与植物不同的多细胞生物体和单细胞生物体：1)具有无纤维素壁的细胞，2)缺乏叶绿素和光合能力，3)需要更复杂的食品原料，例如，蛋白质，4)被组织到更大程度的复杂性，以及5)具有自发运动和对刺激的快速运动响应的能力。如本文使用的术语动物，还指任何动物界大分类，或亚界，和其下的主要分类，包括，但不限于：脊椎动物门，包括哺乳类或哺乳动物，包括鸟纲或鸟类、爬行纲、两栖纲、鱼纲或鱼类、Marsipobranchiata(脊椎动物门(Craniota))；和Leptocardia(头索动物门(Acrania))；被囊动物，包括海樽，和Ascidioidea或海鞘；有关节类(Articulata)或有环类(Annulosa)，包括昆虫纲、多足纲(Myriapoda)、软足亚门(Malacapoda)、蛛形纲、海蜘蛛亚门(Pycnogonida)、肢口纲(Merostomata)、甲壳纲(节肢动物门)；和环节动物纲、Gehyrea(Anarthropoda)；蠕虫或蠕形动物(vermes)，包括轮虫纲、毛颚动物门、Nematoidea、棘头虫纲(Acanthocephala)、纽形动物门(Nemertina)、涡虫纲(Turbellaria)、吸虫纲、绦虫纲(Cestoidea)、中生动物(Mesozea)。拟软体动物门(Molluscoidea)，包括腕足类和苔藓动物门；软体动物门，包括头足纲、腹足纲、翼足目(Pteropoda)、掘足纲(Scaphopoda)、瓣鳃类(Lamellibranchiata)或无头亚目(Acephala)；棘皮动物门，包括海参纲(Holothurioidea)、海胆纲、海星纲(Asterioidea)、蛇尾纲(Ophiuroidea)和海百合纲(Crinoidea)；腔肠动物门，包括珊瑚虫纲或水螅体；栉水母类和水螅纲或水母类(Acalephs)；Spongiozoa或多孔动物门，包括海绵；和原生动物，包括纤毛虫纲和根足纲。如本文使用的术语动物，还指以下非限制性实例：人、灵长类动物、狗、猫、奶牛、小羊、猪、阉猪、家禽、马、母马、骡、雄性动物(jack)、雌性动物(jenny)、驹、犊、一岁动物、公牛、牛、绵羊、山羊、美洲鸵、野牛、水牛、羔羊、小山羊、小猪、母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、其他鸟类或家禽、兔、野兔、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、和其他啮齿动物、鱼、和水生物种或两栖动物。如本文使用的术语“动物”还指转基因动物。

[0091] 如本文使用的术语“受试者”是指是医学或科学研究的目标的动物。

[0092] 二辛可宁酸(BCA)蛋白测定法是用于确定溶液中的蛋白的总水平的生化测定(例如，0.5μg/mL至1.5mg/mL)。总蛋白浓度通过样品溶液与蛋白浓度成比例的从绿色至紫色颜色变化来呈现，然后其可使用比色分析技术来测量。

[0093] 自1926年以来，明矾是美国用于人类使用的唯一批准的佐剂，但其仅产生体液免疫应答(Th2型)。此外，明矾佐剂疫苗具有许多缺点，包括在常规冻干和冷冻时效力损失(Maa等人，J.Pharm.Sci.2003；92(2):319-32)。许多目前可用的疫苗的冷储藏，对制药企业和供应商是严重的问题，特别是在发展中国家。

[0094] 本文描述的实施方案提供了能够刺激两组免疫系统包括体液(对于细胞外病原体)和细胞(对于细胞内病原体)的有效的佐剂制剂。此外，本公开内容提供了可在环境温度下物理稳定的并适合于冷冻干燥，因此消除了对冷链存储的需要的疫苗和递送制剂。此外，菊糖乙酸酯是新颖的TLR激动剂并且当配制为颗粒时刺激免疫系统。本文中提供了使用InAc作为疫苗佐剂的许多其他优势的一些。

[0095] 本公开内容以下提供了菊糖的水溶性β-多晶型物(β-In)的纳米颗粒和微粒制剂和其合成的衍生物菊糖乙酸酯(InAc)的制备以及这些制剂作为免疫增强剂的用途的详情。卵白蛋白(ova)可被用作模式抗原。包含ova的β-In或InAc微粒可由双乳液溶剂蒸发方法来制备。体外释放研究显示，大多数掺入的ova(>95％)分别由β-In颗粒和InAc颗粒在16小时和528小时(22天)内释放。

[0096] 小鼠中免疫研究显示，包封在β-In微粒中的ova比未包封(游离)的ova产生更强的抗体应答(仅Th2型)。与使用明矾(FDA批准的唯一佐剂)作为佐剂的组相比，该结果在应答的类型上相似并且在强度上更大。例如，应答的强度可高达明矾作为佐剂的组的应答的强度的约4倍、或约2至约4倍。然而，包含ova的InAc微粒比结合了明矾的ova产生显著更高的抗体应答。

[0097] 例如，在接受包含ova的InAc微粒的小鼠中的总IgG应答比接受明矾结合的ova的小鼠中的大多达约90倍。另外，在接受包含ova的InAc微粒的小鼠中的IgG1应答比接受明矾结合的ova的小鼠中的大多达约75倍。此外，在接受包含ova的InAc微粒的小鼠中的IgG2a应答比接受明矾结合的ova的小鼠中的大多达约1200倍。因此，装载ova的InAc颗粒可比其他结合至ova的佐剂产生显著更高的抗体应答。例如，装载ova的InAc颗粒可比明矾结合的ova产生如以下显著更高的滴度：总IgG：至少约5-100倍更高、至少约10-150倍更高、或至少约10-200倍更高；IgGl：至少约10-100倍更高、至少约15-85倍更高、或至少约20-80倍更高；以及IgG2a：至少约2-1500倍更高、至少约100-1500倍更高、或至少约500-1500倍更高。

[0098] 显著地，InAc微粒产生Th1型和Th2型两种免疫应答，这是现代疫苗递送技术中需要的。公开的实施例由皮内(i.d.)途径进行的事实进一步强调了InAc颗粒在疫苗递送技术，诸如微针，或者使用i.d.途径的其他递送方法中作为佐剂的潜在用途。

[0099] 本公开内容还显示了可通过调节剂量、粒径(纳米与微米)和施用途径进行操作的免疫应答的程度。不同大小的InAc颗粒可通过使用缓冲液、表面活性剂、溶剂和其他赋形剂的选择组合来制备。由于其免疫刺激效应，这些多个制剂具有广泛用途的潜能。本文描述的组合物可被用于提供具有显著高(细胞和体液)的免疫应答特性和改进的安全特性的新颖和成本有效的疫苗佐剂。

[0100] 本文描述的佐剂制剂比明矾作为佐剂提供更强的免疫应答。本发明的佐剂制剂刺激体液介导的免疫(Th2；对于胞外病原体)和细胞介导的免疫(Th1；对于胞内病原体)两者的产生，这是比其他佐剂，包括明矾，显著有益的。此外，在常规冷冻干燥和冷冻时，目前的疫苗可能失去效力。所公开的疫苗和递送制剂可在环境温度下是物理稳定的并适合于冷冻干燥，因此消除了对冷链存储或添加防腐剂的需要。

[0101] 如本文提供的佐剂制剂是生物相容的并可生物降解的。菊糖具有人类安全使用的悠久历史，具有无毒特性的优势。菊糖的代谢产物是可容易地排出的果糖和葡萄糖。已报道了菊糖是无毒的，并已被用作食品添加剂。

[0102] 本文描述的佐剂制剂源自植物。由于其植物来源，可普遍使用这些佐剂制剂，包括InAc。这与不被素食主义者使用或摄入的源自动物的物质形成鲜明对比。此外，因为其源自植物，本文提供的佐剂制剂不携带来自动物的微生物或血液污染的风险。

[0103] 相比于目前可用的选项，本文描述的佐剂制剂提供了增强的稳定性。商业疫苗需要冷藏，其导致高成本以及与冷藏和疫苗运输相关的增加的物流。InAc微粒或纳米颗粒作为佐剂的使用提供了在环境温度下物理稳定的以及冷冻干燥后物理稳定的疫苗制剂。

[0104] 这种增加的稳定性消除了对冷链监控和存储的昂贵和复杂的需要。某些佐剂，如γ-菊糖，因为免疫佐剂效应需要共注射抗原溶液。抗原和佐剂的共注射可使抗原易于聚集或降解。具有使其对光、氧气或湿气不稳定的特性的抗原还可通过包封在InAc微粒或纳米颗粒佐剂中来保护以改进保质期。

[0105] 本文描述的佐剂制剂的生产是成本有效的。InAc可从任何形式的菊糖，包括市售原始菊糖来制备。本文描述的佐剂制剂可比其他复杂的疫苗递送系统以显著更低的成本来制备。通过制备如本文提供的InAc，可避免制备不同形式的菊糖的复杂程序，并且不同亚型之间的多晶型的转化不是问题。显著地，InAc制备的产率接近100％，与制备γ-菊糖的10％-50％的产量相比，其是非常有利的。

[0106] 本文描述的佐剂制剂提供了优良的分散性和动力学，以及均匀的粒径。分散性是疫苗制剂关于其制备、处理和从多剂量小瓶施用的重要特性。通过使用适当的表面活性剂和冷冻保护剂，对InAc微粒或纳米颗粒的可容易再分散性进行了优化。因此，本文提供的InAc制剂可均匀地在水性溶剂或缓冲液中分散。当摇动后，InAc微粒或纳米颗粒可在水性溶液中均匀地分散，并且因此，其可使用标准方法从多剂量小瓶中容易地施用。

[0107] 本文描述的佐剂制剂提供了抗原的延长释放。抗原可从本文描述的InAc制剂释放延长的时间段(包括但不限于1-2个月、2-3个月，或更大)。因为延长了抗原释放的时间段，本发明的制剂可被用作单次注射疫苗，不需施用加强剂量。通过省去对多剂量的疫苗的需要，本文描述的制剂提供了显著降低的成本，并且对于患者和提供者更方便。存在通过消除对大于1次疫苗注射的需要产生的其他优势。例如，当增加了患者的顺应性时，接种疫苗活动可更成功。此外，因为可操作本文描述的制剂的颗粒的尺寸(纳米或微米)，还可选择受试者中期望的递送目的地，这反过来允许在所得到的免疫应答中更高的精度。

[0108] 本公开内容提供了β-菊糖和菊糖乙酸酯作为无毒的和生物相容的新颖的疫苗佐剂和递送制剂。菊糖具有人类安全使用的悠久历史，并且其代谢产物(葡萄糖和果糖)可容易地排出。初步观察结果指示小鼠中注射的部位处无与InAc和InAc制剂相关的可见或组织学毒性。如果注射部位处任何局部炎症或刺激出现在人类中，减少掺入的佐剂的量将基本上避免这个问题。为了调整减少的量的β-菊糖或InAc颗粒中需要的抗原剂量，当制备纳米颗粒/微粒时，抗原载量可通过操作制剂和方法参数来增加。

[0109] 可使用几种方法，包括溶剂/非溶剂、单乳液和双乳液制备技术。在测试的相似制剂条件下，发现由双乳液法制备的微粒/纳米颗粒具有高抗原载量、低突释(抗原在前30分钟内从颗粒释放的百分比)，和增加的持续释放的优势组合。然而，通过改变制剂参数，可进一步提高抗原的载量，超出通过任何已知的方法已实现的载量。抗原进入InAc微粒/纳米颗粒的载量还可通过以下来增加：通过增加制剂中抗原：聚合物比(0.4μg/mg颗粒至51μg/mg颗粒，通过增加载量条件从约100μg抗原/约100mg InAc聚合物至约20mg抗原/约100mg InAc聚合物。以优化的制剂因素，可增加这个比例至约75μg/mg的InAc颗粒或约100μg/mg的InAc颗粒。在纳米颗粒/微粒内部的抗原的载量还可通过在装载过程中将甘露糖醇与抗原结合来进一步提高。多达约100μg/mg InAc颗粒的抗原量可在甘露糖醇的存在下来装载。类似地，可添加其他碳水化合物或亲水性物质(例如海藻糖)至制剂中以增强InAcC微粒/纳米颗粒内的抗原的载量。

[0110] 进入β-菊糖的抗原载量效率是显著更高的。可实现多达约500μg的抗原/mg的载量(例如，100μg、200μg、300μg、400μg、或500μg的抗原/mg(β-菊糖)。因此，本文提供的制剂赋予根据需要定制抗原的递送以满足治疗的目标、抗原的特性、和/或受试者的独特需求的能力。

[0111] 提供以下作为本发明的组合物和制剂的一些研究和商业应用的非限制性实例。

[0112] 菊糖和InAc颗粒起疫苗递送系统和疫苗佐剂两者的作用。强效并安全的疫苗佐剂是稀缺的。作为非限制性实例，癌症疫苗和针对细胞外病原体和细胞内病原体(诸如病毒和寄生物)的疫苗，仅是使用本发明的制剂将有益于活化免疫应答的Th1和Th2类型两者的疫苗的实例的数个。本发明中提供的技术提供了在刺激两种免疫应答方面比现有技术(明矾)更优良和更安全的方法。本发明的组合物和制剂可被用作用于多种和很宽范围的疾病和状况的人或动物疫苗佐剂。

[0113] 本文描述的佐剂制剂可与以下组合：其他免疫刺激剂和/或免疫调节剂诸如细胞因子，或其他调节蛋白，包括但不限于淋巴因子和白细胞介素，或免疫系统细胞或其他细胞的产物，以及在调节应答诸如免疫应答中充当细胞间调节因子的免疫系统细胞或其他细胞的那些产物，或非特异性刺激免疫系统的病原体的产物诸如病原体相关的分子模式(PAMS)或用于模式识别受体(PRR)的任何配体。合适的实例包括，但不限于，CpG，或其他TLR激动剂，白细胞介素IL-1至IL-35和其他，干扰素(所有类型，包括1型和2型)，其可与本文描述的佐剂制剂一起使用以进一步调节并增强免疫应答。

[0114] 本文描述的佐剂制剂可与用于受试者中药物或医药递送的其他疗法组合。例如，佐剂制剂可与用于癌症治疗的化学治疗剂(例如，博莱霉素、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、长春新碱等)，药物诸如用于阿尔茨海默治疗的多奈哌齐、加兰他敏、美金刚胺、利凡斯的明、或他克林，或与用于其他治疗方法的光动力疗法和/或膳食补充剂(例如，姜黄素、ω-3 脂肪酸、维生素C以及类似物)组合施用。

[0115] 本文描述的佐剂制剂可被用于疫苗目的并提供多种抗原的递送。本文描述的组合物和制剂可被用于递送抗原，包括但不限于病毒抗原、亚基疫苗、肿瘤抗原、过敏的抗原(allergies as antigens)、核酸疫苗包括但不限于DNA或RNA疫苗、重组蛋白和重组抗原、以及蛋白/碳水化合物/多糖抗原。

[0116] 本文描述的佐剂制剂可与抗原、药物或蛋白，或任何其他治疗化合物或制剂一起被用于治疗和预防各种各样的疾病和状况。本文描述的新颖的组合物和制剂可被用作针对影响人、哺乳动物和其他动物、以及其他生物体的状况的疗法、预防法、或疫苗。

[0117] 本发明的组合物和制剂可与以下组合使用：抗原、其他试剂、药物、蛋白、或作为用于疾病的疗法、预防法、或疫苗的任何其他合适的化合物或制剂，所述疾病包括但不限于疟疾、甲型和乙型流感、其他流感及其变种诸如季节性流感、猪流感、副流感、大流行性流感、抗性大流行性流感(resistant pandemic influenza)、禽流感、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、炭疽、白喉、乙型流感嗜血杆菌(Hib)、AIDS、脑炎、日本脑炎(JE)、莱姆病(Lyme Disease)、疟疾、马尔堡病毒、麻疹、猴痘、腮腺炎、百日咳(Pertussis)(百日咳(Whooping Cough))、风疹(德国麻疹)、脊髓灰质炎(小儿麻痹症)、狂犬病、轮状病毒、天花、破伤风(Tetanus)(破伤风(Lockjaw))、肺结核、伤寒、黄热病、热带病、寄生虫病、利什曼病、构象性紊乱(Conformational Disorder)、肉孢子虫、慢性疲劳综合征、出血热、钩端螺旋体病、肉毒中毒、登革热、Q热病、巴贝斯虫病、军团菌、锥虫病、麻风病、莱姆病、落基山斑疹热。

[0118] 本发明的组合物和制剂可与以下组合使用：抗原、其他试剂、药物、蛋白、或作为用于疾病的疗法、或预防法、或疫苗的任何其他合适的化合物或制剂，所述疾病包括但不限于由以下引起的那些疾病或状况：贾第虫属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、埃希氏菌属物种、肠杆菌科物种、肠球菌属物种、嗜血杆菌属物种、分枝杆菌物种、粘细菌物种、奈瑟氏球菌属物种、疟原虫物种、假单胞菌属物种、沙门氏菌属物种、志贺菌属物种、脑膜炎球菌属物种、钩端螺旋体属物种、念珠菌属物种、Copodella物种、酵母菌物种、真菌物种、隐球菌属物种、巴尔通体物种、立克次氏体物种、疏螺旋体属物种、锥虫病物种、弯曲杆菌属物种、轮状病毒、HIV、AIDS、禽流感病毒、疱疹病毒包括带状疱疹(带状疱疹)和HSV(单纯疱疹病毒)、人乳头瘤病毒(HPV)、亨德拉病毒、人类偏肺病毒(metapneumoviruses)、鼻病毒、博卡病毒(bocaviruses)、冠状病毒、扩散性saffold病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、汉坦病毒、出血热病毒、牛痘病毒、SARS、西尼罗病毒；人畜共患疾病，包括但不限于牛海绵状脑炎(BSE)和尼帕病毒、布鲁氏菌病、狂犬病和寄生虫病，包括但不限于囊虫病/绦虫病和棘球蚴病/包虫病，动物流感，被忽视的人畜共患病，反刍动物疾病、PRRS、猪流行性腹泻、埃立克体病、蓝舌病、慢性消耗性疾病、经典猪霍乱、马传染性子宫炎、马疱疹病毒、马传染性贫血、马焦虫病、马病毒性动脉炎、口蹄疫、约内病、焦虫病、伪狂犬病、绵羊瘙痒病、鲤春病毒血症、水泡性口炎；食源性疾病，由朊病毒引起的疾病、克雅氏病(CJD)和变异型克雅氏病(vJD)、柯萨奇病毒种；蜱传播的疾病、蚊传播的疾病、蝙蝠传播的疾病、啮齿动物传播的疾病、禽传播的疾病、以及耐受抗真菌剂和抗菌药物的疾病。

[0119] 另外，本文描述的佐剂制剂可与以下组合使用：抗原、其他试剂、药物、蛋白、或用于预防或治疗癌症或用于缓解癌症症状和副作用，诸如治疗状况诸如自身免疫性紊乱和疾病、影响记忆的疾病，包括但不限于痴呆和阿尔茨海默氏病，影响运动功能的疾病、克罗恩氏病、胃肠道疾病、和遗传紊乱和遗传疾病的任何其他合适的化合物或制剂。本文描述的制剂和组合物可被用于递送肿瘤相关的抗原用于治疗癌症和或其他恶性肿瘤或缓解与肿瘤相关的症状和副作用。重组DNA抗原可与本发明的制剂和组合物一起成功递送作为有效疫苗制剂。

[0120] 本发明的组合物、制剂和方法可被用于在一个或更多个人或动物中产生一种或更多种免疫应答。组合物和方法可被用于从动物、或从动物产物(例如，卵)、或动物组分(例如，源自动物的血液、淋巴液、组织、细胞和其他组分)生产许多抗体，用于在研究、商品、试验、医药和医疗、疫苗以及其他感兴趣的领域中使用。组合物和方法还可被用于生产，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、和抗血清，以及免疫系统或免疫细胞的任何其他期望的产品。

[0121] 本发明的佐剂制剂允许不同的施用途径：本发明的组合物和制剂可通过多种不同的途径来施用，包括非肠道(例如，皮下(SC)、肌内(IM)、或静脉内(IV))、经皮(TD)、直肠内(IR)、鼻内(IN)、肺、眼内(IO)、胃内(IG)、阴道内(1VG)、气管内(IT)、舌下、含服和/或口服。

[0122] β-菊糖和菊糖乙酸酯微粒和纳米颗粒

[0123] 本文描述的组合物可以在药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中配制为适合于注射的形式，或适合于口服、直肠、阴道、局部、经鼻、经肺、或眼部施用的形式(例如，药物组合物)。组合物可包括一种或更多种活性剂，诸如，例如，疫苗接种抗原(vaccinating antigen)(包括重组抗原)、抗原肽序列、或免疫球蛋白。

[0124] 在实施方案中，公开了为了例如，预防、治疗、或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病或老化疾病的目的刺激受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向受试者施用有效量的本文描述的制剂。

[0125] 在实施方案中，公开了为了例如，预防、治疗、或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、或退行性疾病或老化疾病的目的增强受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向受试者施用有效量的本文描述的制剂。

[0126] 如本文使用的术语“基本上纯化的”应理解为是指基本上不含其他多糖和/或其他外源性生物材料(例如，微生物或植物衍生的材料)的菊糖制剂。本文描述的制剂通常是纯化的或基本上纯化的。这样的制剂将包括不超过约10％(按重量计)，或不超过约5％(按重量计)的外源性生物材料，并且可通过本领域技术人员熟知的任何方法来制备，包括在从菊苣中商业生产菊糖中采用的熟知的热水萃取和纯化方法(Stephen,A.M.等人(编著),Food Polysaccharides and their Applications,第2版,CRC Press,Boca Raton,FL(2006))。

[0127] 组合物可包括各种活性剂，诸如疫苗接种抗原、抗原肽序列、免疫球蛋白、或其组合。可选地，或另外地，活性剂可以是淋巴因子或细胞因子、胸腺细胞刺激因子、巨噬细胞刺激因子、内毒素、多核苷酸分子(例如，编码疫苗接种剂)、CpG、或重组病毒载体、完整微生物(例如，细菌溶解产物)、完整病毒(例如，灭活的或减毒的病毒)、或其组合。本文描述的组合物可与作为活性组分的灭活/减毒的完整病毒一起使用。以上和贯穿本文件提供了可与本文提供的组合物组合的试剂的另外的实例。适合于包括在本文描述的组合物中的有益的疫苗接种抗原包括以下的全部或抗原部分：细菌、病毒、酵母、真菌、原生动物和其他微生物或人类、动物或植物来源的病原体和花粉以及其他过敏原，包括毒液(例如，蜜蜂和黄蜂毒液)、和诱发哮喘的过敏原诸如屋尘螨、猫或狗的皮屑。

[0128] 另外有益的疫苗接种抗原包括上文提供的那些，以及：流感病毒的病毒抗原诸如血凝素蛋白(例如，灭活的流感病毒的季节性毒株、重组HA抗原、和季节性HI、H3B或流行性H5抗原)和流感核蛋白、轮状病毒的外衣壳蛋白的抗原、人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原诸如HIV的gp 120蛋白、呼吸道合胞病毒(RSV)的表面蛋白、人乳头状瘤病毒(HPV)的抗原E7、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(例如，HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)的表面蛋白、灭活日本脑炎病毒、狂犬病病毒的表面蛋白(引起狂犬病)；和来自微生物的抗原，所述微生物包括但不限于志贺氏菌属(Shigella)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(例如，蛋白水解酶和黏附素蛋白)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)(例如，脲酶)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(例如，BCG)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(例如，hsp65)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)(例如白色念珠菌的外膜蛋白)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(例如，1类外蛋白)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(引起炭疽)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)(引起Q热，但其还可诱发对自身免疫糖尿病(即I型糖尿病)的长期保护)和引起疟疾的原生动物(诸如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax))。

[0129] 其他有益的抗原是癌抗原(即，与一种或更多种癌症相关的抗原)诸如：癌胚抗原(CEA)、粘蛋白-1(MUC-1)、上皮细胞瘤抗原(ETA)、p53和ras的异常产物、以及黑色素瘤相关的抗原(MAGE)。其他有益的抗原包括用于通过免疫疗法治疗过敏(例如花粉、屋尘螨、草花粉、花生过敏症，以及类似的过敏)的过敏原。

[0130] 当本文描述的组合物包括疫苗接种的抗原时，组合物还可包括抗原结合载体材料，诸如，例如，一种或更多种金属盐或沉淀物，诸如镁、钙或铝的磷酸盐、硫酸盐、氢氧化物或其水合物(例如，氢氧化铝和/或硫酸铝)和/或一种或更多种蛋白、脂质、有机酸包括硫酸化或磷酸化多糖(例如，肝素、葡聚糖或纤维素衍生物)、有机碱诸如甲壳质(聚N-乙酰基葡糖胺)和其脱乙酰化衍生物、或基本纤维素衍生物(basic cellulose derivative)、和/或其他抗原。抗原结合载体材料可包括此类材料的难溶性颗粒(例如，氢氧化铝(明矾)凝胶或其水合盐络合物的颗粒)。有利地，抗原结合载体材料不趋向于聚集和/或可被处理以避免聚集。在一些实施方案中，抗原结合载体材料可以是氢氧化铝(明矾)凝胶、磷酸铝凝胶或磷酸钙凝胶。

[0131] 当本文描述的组合物包括疫苗接种抗原时，组合物还可包括药学上可接受的媒介物。抗原的此类组合物和制剂应包含至少0.1％的活性剂(例如，(本文描述的β-In或InAc组合物)的抗原。组合物和制剂中的活性的百分比当然可进行改变并可以方便地是给定的单位剂型的重量的约1％至约60％、约1％至约10％、或约2％至约5％。活性化合物在此类治疗有用的组合物中的量使得将获得有效剂量水平。

[0132] 当抗原结合载体材料存在于组合物中时，其可以以本质上与β-In或InAc相关，诸如，例如，与此类材料的共晶体的形式存在。β-In或InAc和抗原结合载体材料诸如金属盐的颗粒形式的共晶体可通过以下来制备，例如：

[0133] (a)通过在水中加热β-In颗粒制备菊糖溶液；

[0134] (b)向溶液中添加一定量的一种或更多种金属盐；

[0135] (c)从所述溶液中重结晶β-In，以提供β-In与金属盐共结晶；以及

[0136] (d)分离β-In和一种或更多种金属盐形成的共晶体。金属盐可以是，例如，镁、铁、钙、铝的磷酸盐、硫酸盐、氢氧化物、或水合物、或类似金属盐。

[0137] β-In与抗原结合载体材料诸如金属盐组合的颗粒的直径可以是约10nm至5um、或约150nm至约30mm。较大的颗粒(例如，大于约2um的直径)可在制剂诸如凝胶中来使用。β-In与抗原结合载体材料组合的颗粒可包括菊糖材料与抗原结合载体材料以约1:20至约200:1的比的相对量(按重量计)。

[0138] 在实施方案中，公开了为了例如，预防、治疗、或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病或老化疾病的目的刺激受试者中免疫应答，或增强、诱发、或减少或预防受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向受试者施用有效量的本文描述的制剂。本文提供的制剂，当与上文提供的抗原或其他化合物组合时，能够在受试者中产生免疫能力，产生对抗原或其他化合物的免疫识别，以及使受试者的免疫系统对抗原或其他化合物敏感化。

[0139] 术语“有效量”通常是指以提供期望的效果的制剂/免疫学组合物的无毒、但足够的量。取决于因素诸如被治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、被治疗的状况的严重程度、被施用的特定制剂/免疫学组合物、和施用的模式等，所需的确切量可从受试者至受试者而改变。因此，指定确切的“有效量”并不总是可能的。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可由本领域技术人员常规地确定。

[0140] 具有约2-5微米的粒径的微粒，和具有约100-400nm的粒径的纳米颗粒，通常可如本文实施例中公开的来制备。然而，如本文描述的InAc微粒的大小范围可以是约1um至约30um、或约1.5um至约25um。如本文描述的InAc纳米颗粒的大小范围可以是约10nm至约
1000nm、15nm至约950nm、或20nm至约900nm。

[0141] 为了诱导或调节免疫应答的目的，本文描述的方法可通过活化或调节人或非人动物受试者中的单核免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞)功能和/或补体途径，创建、刺激、引起、增强、增大、发展、提高、或改进受试者中的免疫应答。诱导或调节免疫应答可，例如用于治疗、抑制、或预防由细菌、支原体、真菌、病毒、原生动物或其他微生物的感染，或由蠕虫或寄生物或任何以上提及的抗原或病原体的侵染，或治疗、抑制、或预防由此类感染引起的免疫病理；治疗或抑制免疫紊乱诸如过敏性疾病或风湿性疾病、自身免疫性疾病、免疫缺陷病、或与免疫系统的功能障碍相关的神经、皮肤、肾、呼吸或胃肠紊乱；或治疗或抑制肿瘤或癌细胞，或预防或清除神经退行性疾病诸如阿尔茨海默氏病中的蛋白聚集。因此，还应当理解，本发明延伸至用于治疗、抑制或预防受试者中癌症的方法，其中方法包括向受试者施用有效量的本文描述的制剂。

[0142] 以下实施例旨在说明上述发明，并不应被解释为缩小其范围。本领域技术人员将容易认识到，实施例显示本发明可以被实践的许多其他方式。应当理解，可进行许多变化和修改而保持在本发明的范围之内。实施例

[0143] 实施例1.菊糖制备.

[0144] 1.1.β-菊糖(β-In)的制备.β-菊糖通过乙醇沉淀法从原始菊糖来制备。将获自大丽花块茎的商购可得原始菊糖(Thermo Fisher Scientiﬁc,USA)悬浮在乙醇中，并允许4℃下静置过夜。第二天，将沉淀的β-菊糖在离心后分离并冻干。然后干燥的β-菊糖被用于下述的进一步研究。

[0145] 1.2.菊糖乙酸酯(InAc)的合成.将两克β-菊糖添加至15mL的二甲基甲酰胺(DMF)中形成溶液并允许搅拌以完全溶解β-菊糖。然后添加25mL乙酸酐并且在氮气下
40℃时进行乙酰化反应24小时。乙酸钠(0.1％，w/v)被用作反应的催化剂。24小时后，将InAc在大过量的冷水中沉淀，并且在过滤后进行收集。将InAc用水再洗涤两次，以除去任何痕量的未反应的β-菊糖，并允许干燥过夜。沉淀的InAc被用于下述的进一步研究。

[0146] 实施例2.装载了抗原的微粒的制备。

[0147] 2.1装载了卵白蛋白(ova)的β-菊糖微粒的制备.β-菊糖微粒通过单(w/o)乳液纳米沉淀技术来制备。将β-菊糖(100mg)和ova(10mg)溶解在10mL的10mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液(水相)中。在微粒制剂中使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的ova代替ova，以评估ova的载量和释放谱。将水相滴加至30mL的含1％w/v的吐温-80作为表面活性剂的轻质矿物油中，伴随连续搅拌(1000rpm)以获得稳定的油包水(w/o)乳液。将乳液搅拌4小时，并且然后将30mL的丙酮逐滴加入以沉淀β-菊糖微粒。将乳液保持搅拌过夜，并且通过在4℃时3000g下离心30min收集β-菊糖微粒。然后将沉淀的装载了ova的β-菊糖微粒用正己烷洗涤两次，保持在-80℃下1小时，并冻干48小时。

[0148] 2.2.装载了卵白蛋白的InAc微粒的制备.装载了Ova的InAc微粒通过双(w/o/w)乳液溶剂蒸发技术来制备。简言之，将200μL的50mg/mL ova溶液与50μL的10mg/mL Pluronic F-68溶液(表面活性剂)混合于作为水相(W1)的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。用5ml的二氯甲烷(DCM)将该水相乳化为含100mg的InAc的油相(O)，导致形成初级(w/o)乳液。然后将该初级乳液滴加至含0.5％w/v聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂的另一水(W2)相(30mL水)中，伴随连续搅拌(800rpm)，导致形成双(w/o/w)乳液。继续搅拌过夜，以完全蒸发有机溶剂。然后通过在4℃时50,000g下离心30分钟收集微粒。丢弃上清液，并且将沉淀的装载了ova的InAc微粒重悬于pH 7.4的100mM柠檬酸盐缓冲液中，在-80℃下保持1小时，并且然后冻干(VirTis,Gardiner,NY)48小时。

[0149] 2.3.装载了卵白蛋白的InAc纳米颗粒的制备.装载了Ova的InAc纳米颗粒通过双(w/o/w)乳液溶剂蒸发技术来制备。简言之，将200μL的50mg/mL ova溶液与50μL的10mg/mL Pluronic F-68溶液(表面活性剂)混合于作为水相的10mM磷酸盐缓冲液
(pH 7.4)中。用5ml的二氯甲烷(DCM)将该水相使用探针在10W下声处理20s(Sonics
Vibracell,Newtown,CT)乳化为含100mg的InAc的油相，导致形成初级(w/o)乳液。然后将该初级乳液用含3.0％w/v聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂的另一水相(30mL水)使用探针在50W下声处理120s进行乳化，导致形成双(w/o/w)乳液。将双乳液放置过夜搅拌(800rpm)以完全蒸发有机溶剂。然后通过在4℃时50,000g下离心30分钟收集装载了Ova的InAc纳米颗粒。丢弃上清液，并且将沉淀的纳米颗粒重悬于pH 7.4的100mM柠檬酸盐缓冲液中，-80℃下保持1小时，并且然后冻干(VirTis,Gardiner,NY)48小时。

[0150] 2.4.粒径和卵白蛋白载量.将颗粒分散于10mM柠檬酸盐缓冲液(pH7.4)中，其预先通过0.22μm孔径过滤器过滤，并适当地稀释用于粒径测量。粒径通过动态光散射法使用大小和ζ电位分析仪(Nicomp 360ZLS,Santa Barbara,CA)来测量。装载了Ova的β-菊糖微粒大小是1.74μm±0.14，且装载了ova的InAc微粒大小是约2lam(表1)。

[0151] 为确定β-菊糖微粒中的ova载量，将已知量的装载了FITC-ova的β-菊糖微粒溶解于1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中。ova含量通过在激发490nm和发射530nm处测量FITC-ova的荧光值来确定。从使用加入了已知浓度的FITC-ova的空白β-菊糖微粒制备的标准曲线计算ova浓度。ova载量报道为每mg的β-菊糖微粒存在的ova的l ug(w/w)。卵白蛋白载量为75.9±2.7μg/mg，具有75.3％±4的包封效率(表1)。

[0152] 为确定InAc微粒或纳米颗粒中的ova载量，将已知量的装载了ova的InAc微粒或纳米颗粒溶解于丙酮中，并且然后沉淀的蛋白用1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液来萃取。萃取液中的卵白蛋白含量，通过二辛可宁酸(BCA)蛋白测定法来测量。从使用溶解于丙酮中并加入了已知浓度的ova的空白InAc微粒或纳米颗粒制备的标准曲线计算ova浓度，ova还在1％SDS溶液中萃取并通过BCA蛋白测定法来分析。通过该方法测量的ova载量报道为每mg的InAc微粒或纳米颗粒存在的卵白蛋白的l ug(w/w)。ova的载量为约
20.0±5.4μg/mg(表1)。

[0153] 表1.装载了Ova的微粒(MP)的物理化学表征.

[0154]

[0155] 表1中，数据表示平均值±标准偏差(n＝3)。ova载量是指每mg的β-菊糖或菊糖乙酸酯微粒存在的lμg的Ova。

[0156] 制备几种不同尺寸的颗粒。通过改变和优化工艺和配方参数；诸如需要的声能量、声处理的时间、表面活性剂类型、表面活性剂浓度、相体积比、抗原的量，并通过加入其他成分，制备不同尺寸、不同载量和不同突释量(在前30min释放的抗原百分比)的纳米颗粒和微粒。约100nm至1000nm、或约220nm至800nm的纳米颗粒可使用各种修改的条件来制备。颗粒的大小和多分散性，还可通过微粒或纳米颗粒制备的修改的条件来控制。

[0157] InAc微粒在不存在声能量和存在低浓度的表面活性剂下来制备。表面活性剂的浓度可取决于表面活性剂的类型和所需的微粒的尺寸。以0.5％的聚乙烯醇，使用约800r.p.m.搅拌速度，获得的InAc微粒尺寸为约2-3μm。尺寸可通过改变表面活性剂的类型、表面活性剂的浓度、相体积比、溶剂蒸发时间和搅拌速度而变化。

[0158] 约100μm至约200μm的颗粒可容易地随组分的缓慢搅拌(例如，约60r.p.m.)来制备。表面活性剂的使用可有助减少或防止形成的颗粒的聚集。因此，按重量计约0.05％至约3％的表面活性剂可被用于制备制剂。在一些制剂中，一旦形成，颗粒可保留一定量的表面活性剂诸如PVA。冷冻保护剂(例如，甘露醇或海藻糖)可被用于待冻干的颗粒。

[0159] 通过增加表面活性剂的浓度，并通过提供声能量打破颗粒，可生成纳米尺寸级的InAc颗粒(200-600nm)。该范围可取决于提供的声能量的量、声处理的时间、使用的表面活性剂的类型和浓度、相体积比、溶剂蒸发时间和制剂的搅拌速度而变化。在第二乳液过程中，较高声能量(试验了高达50瓦特)持续较长时间(试验了长达5分钟)产生较小颗粒尺寸。在评估的几种表面活性剂中，PVA(3％)的使用导致了260±26nm直径的小颗粒。

[0160] 实施例3.体外释放研究。

[0161] 将装载了FITC-ova的β-菊糖微粒(10mg)分散于1mL的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，并且37℃下以100rpm摇动温育。在预定的时间间隔下取出管并4℃下以20,000g离心10min。取50μL等份的上清液用于测量释放的FITC-ova并用等体积的新鲜的磷酸盐缓冲液代替。上清液中释放的ova浓度通过荧光比色分析法来测量。该体外释放研究指示，多于90％的卵白蛋白在16小时内释放(图6)。

[0162] 将装载了Ova的InAc微粒或纳米颗粒(10mg)分散于1mL的100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并且37℃下以100rpm摇动温育。在预定的时间间隔下取出管并4℃下以
20,000g离心10min。取50μL等份的上清液用于测量释放的ova并用等体积的新鲜的缓冲液代替。上清液中的ova浓度通过BCA测定法来测量。该体外释放研究显示，ova释放持续多于20天(图2)。与β-菊糖的情况下的16小时相比，装载了ova的>90％的释放
耗时多于20天。

[0163] 实施例4.免疫接种研究：装载了Ova的颗粒作为疫苗佐剂和递送系统。

[0164] 已测试了菊糖的不溶性亚型(γ型、δ型和ε型)作为用于疫苗的佐剂。然而，菊糖以其水溶性形式，诸如β多晶型物，从未显示出具有佐剂/免疫增效效应。在以下研究中，评估了装载了ova的β-菊糖或InAc微粒和纳米颗粒的免疫增效能力。以下免疫接种研究使用雄性Balb/C小鼠来进行(n＝4-5只每组，6-8周龄)。

[0165] 4.1.装载了Ova的β-微粒的免疫接种研究.小鼠经皮内(i.d.)途径用以下组进行免疫：i)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的ova(100lug/小鼠)；ii)PBS中的ova(100lug/小鼠)和空白β-菊糖微粒的物理混合物；iii)PBS中的100lug ova与200μg的明矾(氢氧化铝)；以及iv)PBS中的装载了ova的β-菊糖微粒(相当于100μg ova)。

[0166] 使用标准一次性271/2号注射器在小鼠的剃毛背部皮肤的两个不同的部位施用疫苗制剂(每个部位处50μL)。将可见的凸起的皮肤肿胀视为成功i.d.施用的证据。按照免疫接种方案，将小鼠在“第1天”以初次剂量，随后在“第21天”通过加强剂量来接种。在初次剂量和加强剂量后第1周和第3周从眼眶后丛收集血液样品到血清胶管中。将样品以3000g离心30min并将血清储存于-80℃下直至进一步分析。

[0167] 在加强免疫之后，由装载了ova的β-菊糖微粒产生的抗体滴度(总IgG、IgG-1和IgG2a)比明矾佐剂的ova组的显著更高(p<0.05)(图5)。β-菊糖微粒比明矾产生更大的IgG2a免疫应答(图5C)。

[0168] 4.1.1.树突状细胞对抗原(ova)的摄取.将树突状细胞(DC2.4)与溶液中或β-菊糖微粒内装载的FITC-ova在37℃下温育1小时。1小时温育后，将细胞充分洗涤，固定于4％(w/v)多聚甲醛中并使用流式细胞术分析以确定DC2.4细胞对FITC-ova的摄取(图3(A)。荧光显微术显示了类似的结果。DAPI显示了细胞的核染色(图3(B))。该数据的量化表示在表2中。

[0169] 表2.树突状细胞对抗原的摄取的流式细胞检测分析。

[0170]

[0171] 树突状细胞在与溶液中或β-菊糖微粒内的FITC-ova温育后通过流式细胞术来分析。FITC-ova在绿色孔道中的平均荧光强度表示为任意的荧光单位。将细胞进行门控，以除去在空白树突状细胞中观察到的自发荧光。数据表示平均值±标准偏差(n＝3)。*表示与溶液组中的ova相比，方差是显著的(P<0.0001)。

[0172] 4.1.2.对抗原递呈细胞(APC)上的Toll样受体(TLR)的刺激.除了显示Th1和Th2应答之外，还筛选了各种聚合物，以鉴定刺激APC上TLR的候选者。TLR是一组模式识别受体(PRR)，当由病原体通过病原体相关的分子模式(PAMP)激活时，分泌/释放驱动朝向Th1型和Th2型的免疫应答的多种细胞因子。TLR激活(除了TLR3)需要称为MyD88或
Mal的衔接分子以释放细胞因子诸如TNF-α。

[0173] 4.1.2.1.菊糖乙酸酯(InAc)是TLR-4激动剂.将野生型小鼠巨噬细胞和Mal/MyD88-/-细胞(1x 105个细胞/孔)与不同的制剂温育12小时。随后，培养上清液中的TNF-α的浓度由ELISA来测量(见图4(A))。InAc刺激细胞因子TNF-α从My88巨噬细
胞释放，但未能刺激TNF-α从缺乏Mal和My88的巨噬细胞释放。稳定转染了TLR4(1x
5
10 个细胞/孔)受体的HEK细胞，与不同的制剂温育：仅培养基、InAc微粒(250μg/ml)、LPS(1μg/ml)和酵母聚糖(1μg/ml)。刺激16小时后，通过ELISA在一式三份孔中分析细胞上清液中的IL-8分泌(见图4(B))。

[0174] 如从该数据中可见，InAc刺激抗原递呈细胞(APC)释放细胞因子(图4(A))。此外，似乎InAc通过TLR，特别是通过TLR4受体的活化激活APC(图4(B))。InAc微粒导致从正常(表达MyD88衔接蛋白)巨噬细胞显著增强的TNF-α分泌。当将TLR衔接蛋白MyD88从相同细胞除去时，该分泌被废除(图4(A))。这清楚地表明，InAc借助于TLR活化免疫细胞。存在多种TLR受体。发现InAc与TLR-4特异性相互作用。(图4(B))。这是首次显示了，InAc通过与TLR-4相互作用活化先天性免疫系统。水溶性β-菊糖与γ-异构体均不能活化TLR。已知γ菊糖通过补体旁路途径(ACP)活化免疫系统。ACP活化测定测量了兔红细胞(RBC)的溶解对存在于正常人血清中的APC的活化。如本文所示，β-菊糖与InAc的微粒或纳米颗粒均不能活化ACP。然而如本文所示，γ-菊糖和酵母聚糖活化ACP(见图16)。

[0175] 基于这些数据，β菊糖/InAc(微粒或纳米颗粒)可通过与γ-菊糖不同的机制在作为佐剂活化免疫应答的方面起作用。此外，通过使用TLR-4激动剂(InAc)，已鉴定并测试了颗粒(纳米/微米)疫苗递送系统，其中该系统具有刺激动物免疫系统(例如，小鼠)的能力。重要的发现是，用于制造递送系统的聚合物本身是TLR激动剂。递送系统不需要添加其他PAMPS以增强免疫应答。对于免疫系统，基于InAc的颗粒递送系统通过以下方式类似于病原体：它们是颗粒的，由基于多糖的疏水性表面组成，可被用于包封多个抗原，并由提供PAMP 信号转导通过TLR活化APC(先天性免疫系统)。

[0176] 4.2.本研究的结果显示了，装载了ova的β-菊糖微粒在16小时内释放包封的抗原(卵白蛋白)并且比FDA批准的明矾产生显著更高的抗体滴度(总IgG和IgG-1)。

[0177] 在以下的研究中，使用水不溶性β-菊糖衍生物菊糖乙酸酯(InAc)。本研究的目的是通过在InAc微粒中包封抗原，以进一步维持长时间段的抗原的释放，并评估其免疫增效能力和使用InAc作为新颖的TLR4激动剂以刺激体液和细胞免疫应答两者。需要体液应答以清除细胞外病原体，且需要细胞应答以清除细胞内病原体。

[0178] 在InAc的结构中，β-菊糖的羟基基团被乙酰基基团取代。InAc的FTIR光谱中，-1 -1β-菊糖的OH伸缩频带的消失(～3326cm )和羰基频带的出现(C＝0～1743cm )证实
了由β-菊糖合成乙酸酯InAc(图6)。除了羰基频带外，菊糖乙酸酯还由乙酸酯C-0频带-1 -1
(～1224cm )和-CH3频带(～1369cm )的出现表征。小鼠(每组n＝4-5)经皮内(i.d.)
途径用以下组进行注射：i)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的ova(100lug/小鼠)；ii)PBS中的ova(100μg/小鼠)和空白InAc微粒的物理混合物；iii)PBS中的100μg ova与200μg明矾(氢氧化铝)的；以及iv)PBS中的装载了ova的InAc微粒(相当于100μg Ova)，在第1天和第21天作为初次免疫和加强免疫。在初次免疫和加强免疫接种后1周和3周时，收集血清，用于使用间接ELISA分析IgG滴度。使用的免疫接种方案的其余部分与如第4.1节中描述的相同。

[0179] 装载了Ova的InAc微粒比结合了明矾的ova产生显著更高(p<0.001)的抗体应答(总IgG,12-87倍；IgGl,25-60倍；IgG2a,7-1000倍)。图7描述了免疫的小鼠血清中ova-特异性总IgG、IgG-1和IgG-2a抗体滴度。最有趣地，InAc微粒产生现代疫苗中需要的免疫应答的Th1(IgG-2a)型和Th2(IgG-1)型两者。InAc微粒中ova的包封导致增强免疫应答。当将ova与空白InAc微粒或纳米颗粒简单地共同注射时，未观察到针对ova的免疫应答的增强。然而，现有技术γ-菊糖或菊糖的其他不溶于水的形式，当作为佐剂与抗原共注射时，提供增强的免疫应答，但与β-菊糖或菊糖乙酸酯的共注射不提供增强的免疫应答。

[0180] 4.3.装载了Ova的InAc微粒或纳米颗粒的免疫接种研究：作为疫苗佐剂和递送系统的评价.进行本研究以评估使用的InAc颗粒的粒径(微米或纳米)和抗原的剂量(100μg、10μg或1μg)对产生免疫应答的效应。制备具有不同粒径和不同ova载量的制剂。使用析因设计方法进行优化研究，其中改变了以下制剂和工艺参数。

[0181] 1)在InAc微粒或纳米颗粒制备的第一乳化步骤期间使用的抗原(ova)的量.Ova载量(μg/mg)通过增加在颗粒制备期间使用的ova的量(500μg至20mg/100mg的聚合物)从0.5μg/mg增加至50μg/mg。然而，在较高(50μg/mg)的ova载量还增加了突释。

[0182] 2)通过在InAc微粒和纳米颗粒的制备中增加第二水相体积至45mL，将突释限制在约20％。

[0183] 3)为了降低InAc颗粒的尺寸，使用声能量。将工艺参数，包括声处理的时间和能量，进行了优化，以提供具有期望的载量(例如，对于InAc颗粒的10μg/mg至约100μg/mg和对于β-菊糖颗粒的约10μg/mg至约500μg/mg)和限制的突释(在施用后前30分钟内小于约30％、或小于约20％)的纳米尺寸范围(约100-600nm)的颗粒。

[0184] 通过优化这三个参数，可成功制备具有各种尺寸(约100nm-1000nm的纳米颗粒；以及约lμm-30μm的微粒)和载量的期望的制剂。

[0185] 为了研究粒径对刺激免疫应答的效应，用装载了ova的InAc微粒(近似尺寸：2μm)或纳米颗粒(近似尺寸：250nm)以不同剂量的ova免疫的小鼠。小鼠经皮下(s.c.)途径用以下组来免疫：i)PBS中的ova(100μg、10μg或1μg/小鼠)；ii)ova(100μg、10μg或1μg/小鼠)与100μm的CFA乳液；以及iii)PBS中的装载了ova的InAc微粒或纳米
颗粒(相当于100μg、10μg或1μg的ova)。免疫接种方案的其余部分与如第4.1节中描述的相同。

[0186] 图11示出菊糖乙酸酯颗粒的尺寸对免疫的小鼠血清中ova-特异性总IgG滴度的产生的效应。在第1天和第21天将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射，作为初次免疫和加强免疫。
在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG滴度。CFA被用作阳性对照(最强佐剂)。

[0187] 图12示出菊糖乙酸酯颗粒的尺寸对免疫的小鼠血清中血清ova-特异性IgG-1滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析IgG-1滴度。

[0188] 图13示出菊糖乙酸酯颗粒的尺寸对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG-2a滴度的产生的效应。在第1天和第21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc微粒或纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析IgG-2a滴度。

[0189] 在100和10lug剂量的ova下的InAc微粒比纳米颗粒产生更高的抗体滴度，且该抗体滴度甚至比阳性对照CFA佐剂化的组更高。然而，1μg剂量的抗原下的纳米颗粒比微粒产生更高的抗体滴度(图11、12和13)。该数据指示，在10μg和100μg剂量的抗原下InAc微粒比CFA在产生免疫应答方面更有效。

[0190] 为了研究抗原的剂量的效应，小鼠用在InAc微粒或纳米颗粒中装载的100μg、10μg或1μg卵白蛋白来免疫。图14示出InAc微粒中装载的抗原的量对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG滴度的产生的效应。在1天和21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用
单独或连同CFA或在InAc微粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG、IgG-1和IgG-2a滴度。

[0191] 图15示出InAc纳米颗粒中装载的抗原的量对免疫的小鼠血清中的ova-特异性IgG滴度的产生的效应。在1天和21天时，将小鼠(n＝4-5只/组)用单独或连同CFA或在InAc纳米颗粒中装载的ova(100μg、10μg或1μg)皮下注射。在初次免疫和加强免疫后1周和3周时收集血清用于使用间接ELISA分析总IgG、IgG-1和IgG-2a滴度。

[0192] 装载了Ova的InAc微粒显示免疫应答取决于ova的剂量：在100μg的抗原下具有最高抗体滴度，随后是10μg和1μg剂量(图14)。与10μg和μg的抗原相比，在100μg的抗原下装载了Ova的InAc纳米颗粒还产生更强的抗体滴度，但未发现在10μg和1μg的抗原剂量下抗体滴度中存在显著差异(图15)。

[0193] 4.4.使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗ova的抗体.通过间接ELISA测定法对来自免疫的小鼠的血清测试针对ova产生的抗体(总IgG、IgG1和IgG2a)的存在。简言之，将96孔ELISA板用ova(1μg/孔)在pH 9.6碳酸盐缓冲液中包被，并在4℃下温育过夜。板用洗涤液(50mM Tris、0.14M NaC1、0.05％吐温20，pH 8)洗涤，并且然后用200μl的封闭溶液(50mM Tris、0.14M NaCl、1％BSA，pH 8)在室温下(-23℃)封闭30min。将板用洗涤缓冲液洗涤后，将板中的孔与不同稀释度的试验血清(100μL)在室温下温育1小时。将板洗涤，并且随后与100μL缀合了过氧化物酶的山羊抗小鼠抗体在室温下温育1小时。温育后，将板洗涤并与100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液在室温下温育5分钟用于显色。使用2M H2SO4停止反应，并且在450nm处测量光密度(OD)。将结果表示为血清免疫球蛋白G(IgG)滴度，其被定义为OD比平均OD加上PBS对照的两个标准偏差更大的最终血清稀释度的倒数。

[0194] 4.5.脾细胞增殖试验.如果将疫苗赋予持久保护，则记忆应答的诱发是必不可少的。为了评估记忆应答的产生，加强免疫后三周，从小鼠的脾制备脾细胞。

[0195] 加强免疫后第21天时，处死小鼠并取出脾。在完全RPMI培养基(补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和50μM 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基)中制备脾细胞的单细胞悬液。将细胞悬液在25℃下以700g离心5min。弃去上清液后，使用100mM NH4C1溶解RBC。将脾细胞悬浮于完全RPMI培养基中，并且细胞通过台盼蓝6
排除法使用Cellometer(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)来计数。将脾细胞(10 个细胞/孔)接种到96孔板中，并与200μL的仅完全RPMI1640培养基、包含卵白蛋白(100μg/mL)或刀豆蛋白A(2.5μg/mL)的完全RPMI 1640培养基温育。温育72小时后，除去上清液，并保存用于细胞因子分析。将细胞与50μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)溶液(0.5mg/mL)温育4小时。在结束时，将板与150μL的二甲基亚砜(DMSO)在37℃下温育10分钟。然后使用UV-Vis分光光度计在540nm处读取平板。
刺激指数(SI)通过将用伴刀豆球蛋白A或ova处理的细胞的吸光度值除以RPMI处理的细胞的吸光度值来计算。

[0196] 该数据指示，在装载了ova的InAc微粒处理的小鼠中产生了显著更高的数目的在随后暴露期间识别ova的记忆性T细胞(图8)。有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)作为阳性对照，并且其在所有组中非特异地增强了刺激指数(S.I.)。

[0197] 4.6.细胞因子分析：Thl(IFN-g和IL-2)和Th2(IL-4和IL-10)细胞因子的测量.为了评估装载了ova的InAc微粒是否优先诱导体液(Th2)或细胞介导的免疫应答
(Th1)，在用ova再刺激后，检查了脾细胞培养物上清液中分泌的Th1细胞因子(IL-2和IFNγ)和Th2细胞因子(IL-4和IL-10)的存在。

[0198] 从用单独ova、ova与明矾、或装载ova的InAc微粒免疫的小鼠制备脾细胞，并且在Ova(100μ/mL)的存在下培养72小时。72小时后，从不同处理组收集上清液，并且不同细胞因子的浓度使用夹心ELISA来测量。见图9。使用student t检验与ova免疫的组相比，星号(*)指示值是显著更高的(P<0.001)。

[0199] 支持抗体应答数据(IgG-1和IgG-2a两者的高水平)的是，在用装载了ova的InAc微粒免疫的小鼠的脾细胞上清液中观察到细胞因子的两种类型(Th1和Th2)的高水平(图9)。

[0200] 4.7.迟发型超敏反应(DTH)应答.

[0201] 通过在每个免疫的小鼠的左足垫中注射5μg的ova并在右足垫中注射等体积的PBS测量DTH应答。处理24小时后，足垫肿胀的程度通过从左足垫的厚度减去右足垫的厚度来测量。图10中的数据表示来自每组的3-4只免疫的小鼠的肿胀的平均程度+标准偏差。使用student t检验与ova免疫的组相比，星号(*)指示值是统计学显著的(P<0.001)。

[0202] DTH应答的分析还证实免疫应答的Th1型的产生。用装载了ova的InAc微粒免疫的小鼠比ova免疫的小鼠产生显著更高(p<0.001)的DTH应答(图10)。这些结果还支持由装载了ova的InAc微粒诱导的Thl型免疫应答。

[0203] 4.8.补体旁路途径(APC)活化测定.已显示了菊糖的不溶性多晶型物(γ-菊糖)通过活化APC作为疫苗佐剂(Silva等人,Immunol.Cell Biol.(2004)82,611-616)。然而，从未显示β-菊糖作为疫苗佐剂/免疫增效剂。如下描述，评估了β-菊糖颗粒、InAc微粒和InAc纳米颗粒活化APC的潜力。

[0204] 人血清引起兔RBC的溶解，并因此，人血清和兔红细胞(RBC)被用于APC活化测定。兔RBC使用APC缓冲液(明胶佛罗那缓冲液(Gelatin Veronal Buffer)(GVB缓冲液)+5mM乙二醇四乙酸(EGTA))来洗涤。对于APC活化测定，100μL包含1mg/mL的菊糖、β-菊糖、γ-菊糖、酵母聚糖(APC活化的阳性对照)、InAc微粒和InAc纳米颗粒的人血清
8
用400μL的GVB缓冲液来稀释，在37℃下温育30min并离心。将上清与500μL的RBC(1x10个细胞/mL)在37℃下温育45min，并且然后在700nm处观察O.D.值。通过将未处理的人血清的RBC溶解视为100％，计算％RBC溶解。数据报告为溶解RBC的10％。与RBC温育后，在GVB缓冲液中稀释的人血清导致RBC的100％溶解。酵母聚糖活化APC，并因此抑制了兔RBC的溶解。

[0205] ACP活化的测定测量兔红细胞(RBC)的溶解对存在于正常人血清中的补体旁路途径的活化。图16中显示的数据指示，β-菊糖、InAc微粒和InAc纳米颗粒不活化APC，不像γ-菊糖和酵母聚糖。因此，β-菊糖、InAc微粒和InAc纳米颗粒通过与γ-菊糖不同的机制起作用。

[0206] 实施例5.安全性

[0207] 用各种佐剂系统(InAc纳米颗粒、InAc微粒和完全弗氏佐剂(CFA)))免疫后，小鼠组织由苏木精和伊红(H&E)染色来分析。施用疫苗后21天，对注射的部位显影图像。InAc微粒(2-4微米直径)的皮下注射在注射的部位处形成与明矾或CFA类似的局部积存(depot)，并且持续释放抗原>20天。然而，InAc纳米颗粒(平均直径200-300nm)从注射的部位被清除，并可能靶向淋巴系统。在这两种情况下，未观察到炎症、组织损伤或脓肿形成(图17(A))。

[0208] 强的佐剂活性通常伴随着毒性。例如，FDA批准的疫苗佐剂明矾在注射部位还引起疼痛、炎症、淋巴结病、坏死、和肉芽肿。疫苗制剂的安全性如通过确定小鼠皮肤中注射部位处的总体结构损伤来分析。

[0209] 在CFA处理和InAc微粒之间可见明显的差异。与CFA处理相比，装载了Ova的InAc微粒处理的部位在注射部位处具有非常高数字的免疫浸润细胞和几乎没有组织损伤。如预期的，CFA注射导致注射部位处严重的组织坏死(由黑箭头所示)。相比之下，InAc微粒没有引起注射部位处的任何大的毒性。发现，与CFA处理相比，InAc微粒在注射部位处的免疫浸润细胞(白色箭头示出)的数目更大。再次，这些数据清楚地表明，InAc微粒不仅是有效的疫苗佐剂，而且显示出良好的安全性谱。

[0210] 实施例6.药物剂型

[0211] 以下制剂说明代表性药物剂型，其可被用于治疗性或预防性施用本文描述的β-菊糖或InAc组合物、本文具体地公开的β-菊糖或InAc组合物、或β-菊糖或InAc组合物与本文描述的其他组分组合(下文称为‘组合物X’)：

[0212]

[0213]

[0214]

[0215]

[0216]

[0217]

[0218]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222]

[0223]

[0224] 这些制剂可通过药学领域中熟知的常规方案来制备。应理解，以上药物组合物可根据熟知的制药技术而变化，以适应不同数量和类型的活性成分‘组合物X’。气雾剂(ⅵ)可与标准的计量剂量的气雾剂分配器结合使用。另外，特定成分和比例是为了说明的目的。根据感兴趣的剂型的需要的性质，成分可交换为适合的等同物并且可改变比例。

[0225] 虽然以上参考公开的实施方案和实施例描述了具体实施方案，但此类实施方案仅是说明性的并非对本发明范围的限制。本领域普通技术人员可做出变化和修改而不偏离本发明，本发明以其更宽广的方面如以下权利要求书中所限定的。

[0226] 所有出版物、专利和专利文件通过引用并入本文，如同通过引用单独并入。

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