【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・プルミルスに属する新規微生物およびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術およびその課題】農業経営の広い範囲において、各種の微生物活動が関係しているが、この関係の仕方には、農業にとって利益となる場合と不利益になる場合がある。

【０００３】例えば、真菌類は、通常かびと呼ばれている微生物であり、大きく藻菌類、子のう菌類、担子菌類、不完全菌類に分けられるが、この中には、酵母を始め、有用なものも多い。

【０００４】しかし、例えば、糸状菌等のように土壌中に存在して農作物の病源菌となるものがあるので、その発育を阻止することは農業経営上重要なことである。
また、堆肥は、農作物の肥料として有用なものであるが、このなかに家畜糞等が含まれており、真菌の発育によって悪臭の元となったり、病源性真菌増殖の温床となったりするおそれがあった。 更に、糸状菌等の真菌による農作物の感染病は、伝染性があり、農作物を全滅させることもあるので、これを有効に阻止する手段の開発が望まれている。

【０００５】従来、真菌の発育を阻害する方法としては、種々の抗菌剤や静菌剤を用いる方法が知られているが、これらの方法は、抗菌剤や静菌剤成分が分解するため、一定期間毎に散布する必要性があり、また、他の有用な微生物の活動も阻害したり、耐性菌の発生により効果がなくなるという欠点があり、充分に満足の行くものとはいえなかった。

【０００６】従って、長期間にわたって作用を有し、しかも耐性菌の発生の問題のないような真菌抑制剤の開発が求められていた。

【０００７】一方、生活環境や意識の変化にともない、
悪臭や異臭の防止に対する要求の程度が高まっており、
例えば、従来から生産を続けている畜産農家等に対しても、近隣住民より家畜糞等から発生する悪臭や異臭の防止または削減が要求されるに至っていることも多い。

【０００８】悪臭を防止する消臭方法としては、マスキング法、化学的消臭方法、物理的消臭方法、生物学的消臭方法等が従来より知られているが、悪臭源である家畜糞が継続的且つ大量に発生する畜産においては、化学的消臭方法や物理的消臭方法ではその作用に限界があり、
ましてやマスキング法では全く問題にならない。 そこで、悪臭源である家畜糞を速やかに発酵せしめ、悪臭の発生を防止する生物的消臭法が注目されるが、未だ家畜糞からの悪臭発生を防止するような発酵促進方法が確立されていないのが現状である。 また、旧来の汲取型の便所や家庭から排出される生ゴミについても同様な問題があるが、これらもいまだ解決されていない。

【０００９】従って、簡単な操作で、家畜糞、人糞、生ゴミ等の悪臭源を速やかに発酵させ、悪臭の発生を有効に防止する方法の開発が強く要求されていた。

【００１０】更にまた、畜産農家における大きな関心事の一つは、いかに家畜を健康に飼育し、優れた肉や卵を得るかであるが、実際の飼育においては、家畜が十分に飼料を摂取しなかったり、また、その消化が十分でなかったり、更には病気に罹患したりすることにより満足行くように飼育できないことも多い。 例えば、牛等の反芻動物に発酵しやすい飼料を一度に大量に給餌すると、
一時的にルーメンアシドーシスが発生し、牛の食欲を低下させる。 そして、このような現象は、第一胃（ルーメン）胃液のｐＨの異常、胃壁の損傷、アミン類等の異常な代謝産物の産生、異常な発酵熱等を引き起こし、正常な消化や、吸収を阻害する。 更に、フロラ以外の細菌が異常増殖し、これが血中へ移行して消化管疾患、肝障害、運動器疾患、繁殖障害、熱射病、乳房炎、皮膚炎等の原因となることもある。

【００１１】従って、家畜を健康に飼育し、より多くの畜産生産物を得るためには、家畜の飼料を消化を促進し、家畜を肥育する技術の開発が強く要求されていた。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは土壌中から多くの微生物を単離し、その性質について検索を行なっていたところ、バチルス・プルミルスに属し、アフラトキシン分解性を有する新規な微生物を見出した。 そしてこの微生物は真菌の発生を阻害し、優れた真菌発生抑制効果を示すとともにこの微生物を用いることにより発酵が促進され、リグニンをも有効に分解すること、更に、この微生物を飼料と共に家畜に給餌すると、家畜消化管内での異常発酵等が抑制され、家畜の生育が促進されることを見出し、本発明を完成した。

【００１３】すなわち、本発明の目的は、バチルス・プルミルスに属し、アフラトキシン分解性を有する微生物を提供することである。 また、本発明の他の目的は、上記微生物を有効成分として含有する真菌発育抑制剤を提供することである。 更に、本発明の別の目的は、上記微生物を有効成分として含有する発酵促進剤を提供することである。 更にまた、本発明の他の別の目的は、上記微生物を有効成分とする家畜肥育剤を提供することである。

【００１４】本発明の微生物は、バチルス・プルミルス（ Bacillus pumilus ）に属し、アフラトキシン分解性を有する微生物であり、これらに該当するいずれの微生物を利用しても良い。

【００１５】これら微生物の有する性質の１例を次に示す。

【００１６】このような微生物の一例としては、本発明者らが見出したバチルス・プルミルスＤＢ９００８を挙げることができ、その微生物学的性質は次の通りである。

【００１７】形 態 ：菌体幅０.６〜０.７μｍの桿菌である。 芽胞を形成し（楕円形、中央部に存在）、菌体の膨脹を認めない。 Ｒ型コロニーを形成し、嫌気性条件下において生育しない。

【００１８】各培地における生育状態： （１）ＤＨＬ寒天培地 生育せず。 （２）マッコンキー寒天培地 発育せず。 （３）マンニット食塩培地 発育せず。 （４）普通寒天培地 発育せず。 （５）ハートインフージョン寒天培地 良好な発育を示す。 コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め、Ｒ型である。 また、コロニーは灰白を呈する。 （６）血液寒天培地（１０％緬羊血液加） 良好な発育を示す。 コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め、Ｒ型である。 また、コロニーは灰白色を呈する。 溶血性は＋である。 （７）ＰＤＡ培地 良好な発育を示す。 コロニーは光沢なく、表面に多数のしわを認め、Ｒ型である。 また、コロニーは灰白色を呈する。

【００１９】 生 理 学 的 性 質： グ ラ ム 反 応： ＋ カ タ ラ ー ゼ： ＋ 培 地 上 所 見： Ｒ型コロニー 嫌 気 性 発 育： − ７％ＮａＣｌ培地発育： ＋ リジン脱水素反応： ＋ アルギニン脱水素反応： ＋ 尿 素 分 解： − 卵 黄 反 応： − 硝 酸 塩 還 元： ＋ Ｖ Ｐ 反 応： ＋

【００２０】 炭水化物分解： ぶ ど う 糖 ＋ アラビノース ＋ キシロース ＋ マンニット ＋ ガラクトース ＋ ラムノース ＋ グリセロール ＋ エスクリン ＋ デンプン分解 − インドール − オキシダーゼ ＋

【００２１】 ゼラチン液化： ＋（全面液化） 塩化ナトリウムの耐性： １０％以下 硫化水素産生： − クエン酸の利用： − ア ミ ラ ー ゼ： − 溶 血 性： ＋ 生育の範囲： ｐＨ ； ４〜９ 温 度 ； ２５〜５０℃

【００２２】本発明者らは、上記の各性質からバチルス・プルミルスＤＢ９００８を新規な菌株と判断し、１９
９１年５月２１日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研寄第１２２６６号（FERM P-12266）
として寄託した。

【００２３】上記の本発明微生物をもちい、真菌発育抑制剤を調製するには、この微生物を植物性有機物質、脱脂米糠、ふすま等の栄養源、特に熟成された植物性有機物質中で増殖させた後、これをそのまま、またはこれを濾過した水懸濁液の状態とすれば良い。 水懸濁液とする場合、１ｍｌ当たりの微生物量は１０ ⁴個以上とすることが好ましい。

【００２４】増殖に用いる植物性有機物質の例としては、人工しめじ栽培に使用した廃用のおがくずを完全に熟成したものが挙げられ、このような植物性有機物質を用いた場合、バチルス・プルミルスは栄養型から増殖型となり、菌数の増加と共にその作用も向上する。

【００２５】本発明の真菌発育抑制剤を土壌に適用する場合には、真菌を病原菌とする農作物の病気の予防であるか、すでに多数存在する病原性真菌の除去であるかによって異なるが、一般には１ｍ ²当たり１０ ⁹個程度となるように散布すれば良い。

【００２６】一方、本発明の真菌発育抑制剤を、堆肥等に適用する場合は、その表面にむらなく散布するか、これらと十分に混合させれば良い。 こうすることにより堆肥等の中で有効成分であるバチルス・プルミルスが増殖し、真菌の生育を抑制することが可能となる。 この場合、真菌発育阻害剤の使用量は、一般に堆肥等からの臭いの消失を目安に決めることができる。

【００２７】また、本発明微生物を用いて発酵促進剤を調製するには、本発明微生物を前記植物性有機物質、脱脂米糠、ふすま等の賦形剤、特に熟成された植物性有機物質に担持させ調製することが好ましい。 この場合、賦形剤１ｇ当たりの微生物量は２×１０ ⁵個以上とすることが好ましい。

【００２８】本発明の発酵促進剤は、悪臭源、例えば、
鶏糞、豚糞、牛糞等の家畜糞、人糞、生ゴミ等の表面にむらなく散布するか、これらと十分に混合させれば良い。 こうすることにより発酵を促進するので悪臭を防止することができる。 この消臭効果は、適用１日目からみられ、１５日間以上持続する。 例えば、悪臭源である家畜糞の発生が一定量であり、排泄された家畜糞が上から堆積しない場合は、数ヶ月に１度表面にむらなく散布することにより消臭効果が期待できる。

【００２９】また、曝気槽中での発酵の促進は、曝気槽中に本発明の発酵促進剤を投入すれば良く、こうすることにより曝気槽中の発酵が促進される。

【００３０】本発明の発酵促進剤の使用量は、悪臭源の種類、量、条件等により異なるので一概に定められず、
実験的に決めることが必要であるが、一般には悪臭源からの臭いの消失を目安に適切な使用量を決めることができる。

【００３１】更に、本発明微生物を用いて家畜肥育剤を調製するには、必須成分として本発明を配合し、家畜の生長に必要な他の成分を任意成分として配合することにより調製される。 このような任意成分の例としては、
脱脂米糠、植物性有機物質、ふすま、貝化石等のカルシウム源、ビール粕、各種ビタミン、栄養剤等が挙げられる。 家畜肥育剤１ｇ中の微生物量は１×１０ ⁵個以上とすることが好ましい。

【００３２】本発明家畜肥育剤の好ましい例としては、
脱脂米糠と貝化石を適度の割合、例えば４：１程度で混合した後、これに１×１０ ⁵個以上のバチルス・プルミルスを加えたものが挙げられる。 このような家畜肥育剤中ではバチルス・プルミルスは栄養型から増殖型となり、有機物質を栄養分として増殖し、菌数の増加と共にその作用も向上する。

【００３３】本発明の家畜肥育剤は、家畜飼料に添加し、これを家畜に給餌すればよいが、場合によっては、
飼料に代えて給餌しても良い。 飼料とともに投与する場合は、一般には飼料に対して０.５〜１０％程度、好ましくは１〜５％程度添加すれば良い。

【００３４】本発明の家畜肥育剤の使用期間は、投与する家畜の種類、生育時期、肥育程度等により異なるので一概に定められず、実験的に決めることが必要である。

【００３５】

【作用】本発明微生物が、真菌発育抑制剤、発酵促進剤、家畜肥育剤等多くの用途に用いられる理由は未だ明らかではないが、環境中に存在し、不利な作用をする微生物、例えば病源性真菌、悪臭を発生する糸状菌、アフラトキシン等発育阻害物質を産生する微生物の発育を抑え、バチルス属微生物の通常の発酵を促進するためと考えられる。

【００３６】より詳しくは、真菌発育抑制剤の作用は、
バチルス・プルミルスに属する微生物の有する 真菌との競合発育作用、 真菌に対する溶菌作用、 発育阻止物質の産生等がのいずれかの理由またはそれらが相乗的に作用することが理由と考えられる。

【００３７】また、発酵促進剤の作用は、バチルス・プルミルスに属する微生物の有する 家畜糞等の中で繁殖し、悪臭を発生する糸状菌の発育を阻害し、 これに代わって家畜糞中で増殖し、これを分解するという性質に基づくものと考えられる。

【００３８】そして、上記の作用は、本発明者が同時に見出だしたバチルス・リケニホルミス以外のバチルス属微生物を始めとする他の微生物では全く得られないものである。 なお、アフラトキシン分解性に関しては、本発明のバチルス・プルミルスより上記バチルス・リケニホルミスの方が強い。

【００３９】

【発明の効果】本発明の微生物は、微生物活動が関与している農業の分野で極めて有利に利用することができる。

【００４０】例えば、本発明の微生物を用いた真菌発育抑制剤を用いれば、真菌、特に病源性糸状菌の生育を抑制することができるので、土壌や植物体に適用することにより農作物の病害を予防することが可能となる。 また、この真菌発育抑制剤を堆肥等に適用することにより、堆肥中の病源性糸状菌の生育を阻害し、糸状菌の増殖による悪臭の発生を防ぐことができる。

【００４１】また、本発明の微生物を用いた発酵促進剤を家畜糞等に散布すると、その発酵が極めて促進され、
従来半年から１年かかった発酵が１〜２ヵ月で完了し、
しかもその間、悪臭もほとんど発生しない。 一方、本発明の発酵促進剤を曝気槽に使用すると、汚水処理時間が従来の１／２となり、また、悪臭の発生も減少するほか、処理後のＢＯＤ値、ＳＳ値も従来と比べ大幅に減少する。 他方、家畜飼育（ブロイラー、オガコ豚舎、肥育子牛）の敷き料として使用しているおがくずに本発明の発酵促進剤を加えると、糞処理が簡便化され、悪臭の発生もなく、また、敷き料中で継続的に発酵が行なわれている結果、敷き料は冬でもあたたかく、従来家畜の腹の冷えに起因する下痢、肺炎等の病気に発生が減少する。

【００４２】更に、本発明の微生物を用いた家畜肥育剤を家畜に投与すると、家畜消化管内の状態を正常に保つことができ、消化管よりの栄養の吸収を促進する結果、
家畜の体重を着実に増加させることができ、また、例えば卵の生産を増加させることができるので、畜産において極めて有利なものである。 以上のように、本発明微生物は農業経営の上で極めて有利なものである。

【００４３】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。

【００４４】試 験 例 １ ＰＤＡ寒天の斜面培地を作製し、これに下記の真菌を接種し、２５〜２８℃で７〜１０日間培養する（ほとんどの真菌はこの期間で胞子を形成する）。 形成した胞子を、１×１０ ⁶個／ｍｌとなるよう界面活性剤を添加した生理食塩水あるいはリン酸緩衝液に懸濁させ、胞子浮遊液とする。 この胞子浮遊液を別に作製しておいたＰ
ＤＡ寒天培地平板（９０ｍｍ径シャーレ）に、１枚当たり ０.１ｍｌまき、コンラージ棒でむらなく広げ、培地に十分吸収させる。 この培地の中央部に、１０ ⁶個／
ｍｌに調製したバチルス懸濁液を１スポット（約２５μ
ｌ）接種し、２５〜２８℃で５〜１０日間培養し、阻止円の形成を観察した。 この結果、バチルス・プルミルスＤＢ−９００８はすべての真菌の発育を阻害した。

【００４５】

【００４６】実 施 例 １ 完全に熟成された人工しめじ栽培に使用した廃用のおがくずに、おがくず１ｇ当たり２×１０ ⁵個のバチルス・プルミルスＤＢ−９００８（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２６６）
を加え、真菌発育抑制剤を調製した（本発明品１）。

【００４７】実 施 例 ２ 実施例１の本発明品１を１０日間、約２０℃で保存した後、その１００ｇを水１０００ｍｌに懸濁させ、十分に撹拌した後、濾過した。 この濾液を液状の真菌抑制剤とした（本発明品２）。 本発明品２の１ｍｌ中には、
バチルス・プルミルスＤＢ−９００８が１×１０ ⁴個含まれていた。

【００４８】実 施 例 ３ 真菌が原因とされるモンパ病で枯れた桃の木の後に、本発明品１ ２ｋｇを散布し、土壌と十分に混合した後、
新たに桃の木の苗を植えた。 この桃の木の苗は、移植７ヵ月を経過したが、十分に根付き、その木の成長の勢いもすばらしかった。 なお、モンパ病にかかって桃の木が枯れると、その土壌中には病源性の糸状菌が多量に存在し、新たに植える苗木をすぐに枯らすため、一般には３年経過しないと新しい苗木を植えることができないとされている。

【００４９】実 施 例 ４ 腐乱病（糸状菌病）の発生の多いりんご農場において、
本発明の真菌発育抑制剤の効果を調べた。 腐乱病に侵されている枝を切り取った後に、全部のりんごの樹木に対し、樹木１本当たり１０リットルの割合で本発明品２
を散布した。 この結果、散布後には腐乱病に感染する樹木はなかった。 また、既に腐乱病に感染していた樹木の樹勢は回復した。

【００５０】実 施 例 ５ 灰色カビ病が発生したビニールハウスで、本発明の真菌発育抑制剤の効果を調べた。 灰色カビの発生が目視によって判断できるキュウリの株を引き抜き、その後に本発明品２をビニールハウス全体に１ｍ ²当たり８００ｍ
ｌとなるように散布した。 この結果、このビニールハウス内では灰色カビ病の発生はなく、収穫量に影響はなかった。 なお、通常はこの病気が発生するとキュウリの収穫量が大きく減少する。

【００５１】実 施 例 ６ 本発明の抗真菌剤について、アフラトキシン産生能を有するアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）
ＮＲＲＬ ２９９９にを用い、これに対する生育抑制および毒素産生抑制効果を次の方法により調べた。

【００５２】抗 真 菌 剤 の 調 製：バチルス・プルミルス ＤＢ ９００８の一白金耳を、１００ｍｌのブレインハートインフュージョンで２４時間振盪培養し、水で１０倍に希釈したものを使用した（抗真菌剤３）。

【００５３】実 験 結 果 ： （１）培養ビン内での試験 ポテトデキストローズアガー培地（ＰＤＡ培地）を試験用培養ビン内に入れ、これを固化させた後、この上にとうもろこし粉１ｇおよび被験微生物１０ ⁶個を加えた。
次いで、この中に抗真菌剤３を１滴（約３０μｌ）滴下した後、約３０℃で培養し、培養開始後４日目および６
日目にアスペルギルス・フラバスおよび他の真菌の生育の有無を調べた。 この結果、抗真菌剤３を滴下した培養ビン中ではアスペルギルス・フラバスを始めとする真菌の生育は認められなかった。 これに対し、抗真菌剤３
を滴下しなかった対照ではアスペルギルス・フラバスの菌糸発育及び分生子形成が認められ、更に他の真菌の発育も認められた。

【００５４】（２）シャーレ内での試験 シャーレ中で固化したＰＤＡ培地の上に、試験飼料０.
５ｇをのせ、被験微生物１０ ⁶個を接種した後、抗真菌剤３をピペットで１滴（約２５μｌ）滴下した。 次いで、これを約３０℃で培養し、培養開始後４日目および６日目にアスペルギルス・フラバスおよび他の真菌生育状況を観察した。 この結果を次に示す。

【００５５】

【００５６】（３）アフラトキシン生成の抑制 前記（１）の培養を、試験開始から１７日間継続した後、この培養物をクロロホルム５０ｍｌで２回抽出し、
２ｍｌに濃縮した後、薄層クロマトグラフィーに付してアフラトキシン生成の有無を調べた。 この結果、対照ではアフラトキシンＢ ₁およびＧ ₁の産生が認められたのに対し、抗真菌剤３を用いたものではその産生が認められなかった。

【００５７】実 施 例 ７ 完全に熟成された人工しめじ栽培に使用した廃用のおがくずに、おがくず１ｇ当たり２×１０ ⁵個のバチルス・プルミルスＤＢ−９００８を加え、発酵促進剤を調製した（本発明品４）。

【００５８】実 施 例 ８ 鶏糞 １００ｇの表面に、実施例７で得られた本発明品４、３ｇをむらなく散布した。 この結果、従来発酵には６ヶ月〜１年かかるとされている家畜糞が３０〜４５
日で完全に発酵した。 また、本発明品を散布しなかった場合と比べ、悪臭の発生は極めて少なかった。 豚糞や牛糞を用いた場合も同様な効果が認められた。

【００５９】実 施 例 ９ 養豚農場（６０００頭規模）の曝気槽のうち５トンのものに本発明品４を１５０ｋｇ投入した。 投入１日後には試験曝気槽の異臭がかなり軽減された。 また、従来使用した菌では認められなかった泡が発生し、発酵が行なわれていることが確認された。

【００６０】実 施 例 １０ ４００リットルの汲取式内便所の内容物をすべてバキュームカーで吸い出した後、１ｋｇの本発明品４をむらなく散布した。 散布直後より１ヵ月間観察したが、その間、悪臭の発生は認められなかった。

【００６１】実 施 例 １１ 買い物用ビニール袋に１週間を経た家庭生ゴミ（非常な悪臭）をいれ、これに本発明品４を片手で４掴み投入する。 投入３日後で悪臭は甘酸っぱい臭気に変わり、投入１週間後には生野菜は完全に溶けていた。

【００６２】実 施 例 １２ １５リットルの家庭用生ゴミ容器（２０％の入量）に本発明品４を１００ｇ投入した。 投入８時間後には異臭は消失し、６０％入量となっても臭いはなかった。

【００６３】実 施 例 １３ 養豚農家（１５００頭規模）の１４豚房中、２豚房の敷き料として１トンのおがくずに３％の本発明品４を加えたものを用い、これを２０ｃｍの厚さに敷いた。 この豚房では翌日から悪臭が消え、しかも敷き料が乾燥せず、適度な水分を保持するため埃がたたなかった。 また、おがくずが発酵し、適度な温度を保つため、冷えからくる豚の下痢が発生しなかった。 試験３週目から豚糞の色が変わり、排泄したばかりの豚糞でも臭わなかった（試験豚房中の豚が、敷き料中の本発明品４を食べたためと思われる）。 これに対し、敷き料としておがくずのみを用いた対照区では悪臭が発生し、埃がたっていた。 なお、豚出荷後の試験豚房の敷き料は悪臭の発生がなく、堆積することにより速やかに発酵し、発酵終了後は再度敷き料として使用できた。

【００６４】実 施 例 １４ 脱脂米糠８０％、貝化石２０％の混合物に、１ｇ当たり１×１０ ⁵個のバチルス・プルミルス ＤＢ−９００８（
ＦＥＲＭ Ｐ−１２２６６）、を加え、家畜肥育剤を調製した（本発明品５）。

【００６５】実 施 例 １５ 飼料に対し３％となるように、本発明品５を添加し、１
ヶ月にわたって乳牛に給餌した。 この結果、いずれの家畜肥育剤を添加した場合も、これを添加しなかった場合に比べ、乳牛の乳量は３％程度増加した。 更に、繁殖障害等の問題も起きず、その予防にも効果が認められた。

【００６６】実 施 例 １６ ブロイラー鶏（コブ種）１区１０羽を用い、鶏に対する本発明家畜肥育剤の効果を調べた。 まず、本発明品 ５
を飼料に３％添加した試験区と、飼料のみの試験区（対照区）を設定し、３週間飼育し、その平均体重を測定した。 この結果、飼育後の体重は、本発明の家畜肥育剤を投与した試験区の鶏の平均体重は、対照区の鶏のものより２３０ｇ重かった。 また、剖検した結果では、試験区の鶏では全例について腸管の異常を認めなかったのに対し、対照区では１０羽全例について、十二指腸および空腸に点状出血、充出血を認めた。

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