本発明は、微生物産業に関するものであって、とりわけメタン酸化細菌および従属栄養細菌を含んだ共培養によりタンパク質バイオマスを得るための従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17の菌株に関するものである。微生物タンパク質は、農業における家畜飼料として、また高度な加工のための原料としても利用できる。

ロシアにおける今日の飼料用タンパク質の生産は、全体的に良い状況ではない。ロシア大統領が署名した、食料自給率を80〜90%にするためのドクトリンに従うと、飼料製品の不足は少なくとも年間二百万トンにおよぶ可能性がある。

タンパク質製品の主要な原料は大豆かすである。しかしながら、我が国の自然条件は、十分な量の大豆の栽培には向いていない。したがって、この分野に従事する者は飼料用タンパク質を生産するためのその他の方法を探さなければならない。

飼料バイオマスの生産者のうち、様々な基質において生育することができる様々な分類群の微生物は知られている。

酵母が質量の60%以下のタンパク質しか蓄えない一方で、細菌は質量の79%のタンパク質を蓄えるため、飼料用タンパク質の生産者として細菌を利用することは、酵母を利用することよりも効率がよい。

タンパク質およびバイオマスの生産者として、メタノールをもとにタンパク質を生産する細菌株およびアセトバクター属であるAcetobacter methylicum VSB−924 CMPM V−2942(ロシア国特許第116363号、C12No.15/00、1984年)(特許文献1) 、 Acetobacter methylicum VSB−867 CMPM V−1947(ロシア国特許第925112号、C12No.15/00、1982年)(特許文献2)、 Acetobacter methylovorans VSB−914 CMPM V−2479(ロシア国特許第1070916号、C12No.15/00、1983年)(特許文献3)が利用されている。これらすべての菌株は、絶対乾燥物に対するタンパク質含有率が76%までおよぶという特徴を持つ。

これらの菌株の典型的なファージに対する感度や耐熱性は様々に異なる。Acetobacter methylicum VSB−867にとっての最適な成長温度は28℃〜30℃であり、Acetobacter methylicum VSB−924にとっては30〜36℃、Acetobacter methylovorans VSB−914にとっては36〜40℃である。

しかし、小麦ふすまおよび/または小麦粉を用いた発酵槽内でのpH6.0以下の酸性培養基による非滅菌培養においては、実験が示すとおり、酵母および菌類による汚染が素早く起こり、そして全細胞数の30〜40%以上において生産者の置換反応が起こった。その結果、得られた製品のタンパク質含有レベルに大幅な低下が起こる。

完全な飼料タンパク質製品を得る方法として見込みのあるものの一つに、メタン酸化細菌を利用する方法がある。メタン資化性細菌は、自身に適した条件下において天然ガスのメタンを活発に変換し、素早く増殖して、有用なタンパク質およびビタミンその他の生物活性化合物を豊富に含んだバイオマスを作る。

単細胞タンパク質を得るために天然ガスのメタンを利用することは、液体炭化水素およびその他の基質と比較していくつもの優位性を持つものであり、とりわけ天然ガスの埋蔵量の多さ、可搬性の高さ、基質からさらに精製することなく飼料用タンパク質が得られるといった優位性が挙げられる。

ロシアでは地中ガスの埋蔵量が多く、複数のデータによると世界の埋蔵量の40%にもおよぶ量があるとされることを考慮すると、微生物を利用した単細胞タンパク質の生産を導入することは、ロシアの企業に経済効果をもたらすことができるだけでなく、国内の食糧の安定を確保することにも寄与する。

絶対メタン酸化細菌は基質特異性の高くない酵素メタンモノオキシゲナーゼを含んでおり、メタンだけでなく、天然ガスに含まれるメタンの同族体(たとえばエタン、プロパンおよびブタン)をも酸化することができる。

天然ガスの成分、メタン酸化細菌の種の特性および培養条件によっては、酸化が不完全なメタンおよびメタンの同族体の生産物の中に、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、エタノール、アセトアルデヒド、アセテート、プロピオンアルデヒド、プロピオン酸、オイルアルデヒドが様々な割合で培養基中に存在することがある。これらの生産物が特定の濃度で培養基内に蓄積されると、メタン酸化培養菌およびメタンの酸化に阻害作用を及ぼす。

天然ガスにおける安定的な連続培養は、メタン酸化微生物とそのコンパニオンたる従属栄養微生物の共培養によってのみ可能であり、前記従属栄養微生物はメタンの同族体の不完全酸化の生産物を利用し、また微生物細胞の自己分解による生産物を利用することもある。

現在では、たとえ単一基質を使用する場合あっても、培養基に不完全酸化の生産物が蓄積される場合には、純粋培養ではなく共棲培養をする方が適切であると確立されている。共培養の際に主培養菌の生育は目立って活発となり、いくつかの物理化学的指標のストレス作用に対する主培養菌の耐性も目立って上昇する。

デオキシリボヌクレアーゼ酵素の生産者であり、医薬品の主成分にすることのできる(ロシア国特許第2057178号)(特許文献4)Klebsiella pneumoniae GISK No.214菌株は知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、液体培養基または高濃度培養基での菌株の培養、バイオマスの沈殿、超音波破壊、遠心分離により得られる。デオキシリボヌクレアーゼは、上澄み液から抽出される。

制限エンドヌクレアーゼの生産者であるKlebsiella azeanae VKM V−2008D菌株(ロシア国特許第2044055号)(特許文献5)は知られている。この酵素はヌクレオチドの配列5−PuGGNC1CPy−3を認識し、切断する。菌株により生産される制限酵素は、遺伝子工学の研究において利用することができる。

毒性および非毒性微生物の識別において、微生物のカタラーゼ活性を判定するための参考株として利用されるKlebsiella pneumoniae GISK No.215菌株(ロシア国特許第2070923号)(特許文献6)は知られている。

微生物群のヒ素化合物に対する耐性を決定する接合性プラスミドpVK1を含むKlebsiella pneumoniae VKPM V−7001菌株は知られている。前記の菌株を使用することにより、ヒ素を含んだ生体破壊細菌の組合せの菌株(ロシア国特許第2260044号)(特許文献7)が得られる。

飼料用バイオマスの生産者であるMethylococcus capsulatus VCB−874菌株は知られている。菌株は、「全ロシア遺伝学および産業微生物品種改良研究所」の培養コレクションの中に、コレクション番号「CMPM V1743(Авт. свид.誌 ソ連 第770200号)(非特許文献1)」として保管されている。この菌株は炭素源およびエネルギー源としてメタンを利用しており、純粋なメタンであっても天然ガス中の成分としてのメタンであっても利用する。この菌株の欠点は、メタン同族体の共酸化において生成される生産物に対する感度が高いことであり、前記生産物は、大量なことも少量なこともあるが、必ず天然ガスの中に存在するものである。生成される生産物は、生産者の生育を阻害する。

技術的本質および達成される結果が最も近いものが、全ロシア産業微生物集登録番号VKPM V−12549の、微生物タンパク質を得るためのメタン酸化細菌Methylococcus capsulatus GBS−15の菌株(ロシア国特許第2613365号)(特許文献8) である。

ロシア国特許第116363号明細書

ロシア国特許第925112号明細書

ロシア国特許第1070916号明細書

ロシア国特許第2057178号明細書

ロシア国特許第2044055号明細書

ロシア国特許第2070923号明細書

ロシア国特許第2260044号明細書

ロシア国特許第2613365号明細書

Авт. свид.誌 ソ連 第770200号

本発明の目的は、微生物タンパク質生産者の共棲菌として従属栄養細菌が存在する際の天然ガスにおけるメタン酸化細菌の培養について、生産効率を上げ、高い生産性を得ることである。

本発明の技術的結果は、メタン酸化細菌の共棲菌であり、天然ガス中にあるメタン同族体の共酸化による生産物を利用することができ、同様に細菌の溶解過程でできるタンパク質、アミノ酸、多糖類を利用することのできる、新しい菌株を明らかにすることである。

本発明の技術的結果は、登録番号V-8465として「オボレンスク 国家病原性細菌および病原性細胞培養集」に供託された従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17の菌株を、メタン酸化細菌との共培養成分として使用し、微生物タンパク質を得ることで達成される。

供託者が与えられた菌株の符号が1−17である。

Klebsiella pneumonia 1−17菌株は、天然ガスをもとに家畜飼料用飼料バイオマスを工業的に生産するためのメタン酸化細菌の共培養菌の一つとして、また高度な加工のための原料として利用できる。

菌株の抽出源:本発明の従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17の細菌株は、メタン酸化細菌Methylococcus capsulatus GBS−15を含む共培養から抽出される。成長の早い混合培養細菌を得るために、ロシア連邦内の天然ガスおよび石油産出地域の地下水から抽出された活発な蓄積培養菌の混合物を使用した。このように混合培養細菌を得た結果、天然ガスにおける工業的なメタン酸化細菌の培養環境において、様々な共培養の成分として使用できる細菌株が得られた。細菌株は、鉱物培養基において発酵の際にメタン酸化細菌の主たる生産者の共培養菌として成長し、生産者にとって最適な物理化学的環境において、天然ガス中に存在するメタン同族体による共酸化の生産物、また主たる生産者の物質代謝による生産物を必要とする。

細菌株は、遺伝子の組み換えがなされていないものである。

細菌株の生物学的危険性(安全性)についての情報:Klebsiella pneumoniae種は、病原性分類第IVグループ(衛生疫学規則 SP 1.3.2322−08「病原性(危険性)分類第III−IVグループの微生物および寄生虫病の病原体を使用する作業の安全性」添付資料第1号「人間に対する伝染病をもたらす病原性微生物、原虫類、寄生虫、生物由来毒の病原性による分類」、2011年6月29日付ロシア連邦国家衛生医師長認定第86号 追加と改訂第2号)リストに載っている。

病原性または毒性に関するその他の情報:Klebsiella pneumonia 1−17細菌株は、非病原性であり、毒素産生性がなく、毒性がなく、無害である。

特徴:供託者が与えられた菌株の符号はKlebsiella pneumonia 1−17である。

同定方法とその結果:質量分析計MALDI Biotyper(スコア値2.561)、VITEK 2(同定確率98%)、遺伝子配列決定16S−rRNA系統解析(99%)、全ゲノム配列決定。

形態学的特徴:大きさ0.5〜0.9×1.0〜1.2μmのグラム陰性桿菌、非運動性、芽胞の形成なし。

培養特性:栄養寒天GRM No.1(国家予算学術施設 国家応用微生物学およびバイオテクノロジー研究センター)の培地において、直径3〜4mmの平らで半透明の粘液状コロニーを形成。

生化学的特質:VITEK 2システム:06.01(bioMerieux)(表1)

実験動物に対する毒性:BALB/c−3.2×10⁸KOE系のマウスに対する毒性 LD50

抗菌薬に対する耐性(感受性)(表2)

遺伝子の特性:プラットフォームであるイルミナ社Miseq上で完全なゲノム配列決定がなされた。取得リード数 2,087,324、分析されたヌクレオチド数 469,180,422、コンティグ数(プログラムSPAdes 3.11.1) 531、得られたコンティグの全長 ヌクレオチドペア5,627,276、カバレッジ平均深度88、GC組成57.01%

コンティグの組み立てにおいて16SrRNA遺伝子が決定され、データベースBLAST Nucleotide collection (nr/nt) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)において分析された。調査対象菌株の16SrRNA遺伝子と参考菌株であるKlebsiella pneumonia subsp. Pneumonia HS11286 (CP003200.1)の16SrRNA遺伝子の相同性は、99%(1526/1527)であった。

Klebsiella pneumonia 1−17菌株の16SrRNA遺伝子領域の配列:

AGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGATGAGGTTATTAACCTTACGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACATTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCT

培養条件:高濃度または液体の栄養培地GRM No.1、GRM培養液、栄養寒天または栄養液、34℃、24時間。炭素源としてメタノールまたはエタノールまたはプロパノールが加えられる鉱物培養基、40℃、36〜48時間。

栄養寒天 成分(調合済み培地1リットル換算):乾燥タンパク質酵素加水分解物 10.5g、発酵培地用乾燥ペプトン 10.5g、濾過ずみ自己消化酵母エキス 2.0g、塩化ナトリウム 5.0g、微生物培養寒天 12.0g。121℃で15分間殺菌する。

栄養液 成分(調合済み培地1リットル換算):乾燥タンパク質酵素加水分解物 9.1g、発酵培地用乾燥ペプトン 9.9g、濾過ずみ自己消化酵母エキス 4.7g、塩化ナトリウム 5.0g、炭酸ナトリウム 0.3g。121℃で15分間殺菌する。

GRM No.1(培養基成分、g/l):魚粉由来膵臓加水分解物 15.0、カゼイン膵臓加水分解物 10.0、酵母エキス 2.0、塩化ナトリウム 3.5、D−グルコース 1.0、寒天 10.0±2。

GRM栄養液(培養基成分、g/l):魚粉由来膵臓加水分解物 8.0、発酵培地用乾燥ペプトン 8.0、塩化ナトリウム 4.0。

鉱物培養基(培養基成分、g/l):(NH₄)₂SO₄ 0.52、MgSO₄ 0.02、K₂SO₄ 0.06、NH₄H₂PO₄ 1.53。微量元素溶液(別途調合)(г/л):ZnSO₄ 0.43、MnSO₄ 0.88、CuSO₄ 0.78、H₃BO₃ 0.4、Na₂MoO₄×2H₂O 0.25、CoSO₄×7H₂O 0.25、FeSO₄×7H₂O 4.97。

調合済みの微量元素溶液1mlを1000mlの鉱物培養基に加える。121℃で15分間殺菌する。pHを6.0〜6.2にする。

基質(炭素源およびエネルギー源)としてメタノール(1.5体積%未満)、エタノール(2体積%未満)、プロパノール(1体積%未満)を使用することができる。培養温度 40℃、好気培養。

保管条件:菌株は栄養寒天上で保管(温度4±2℃)、三か月に一度移植を実施、菌株は凍結乾燥状態でも液体窒素内でも保存が可能。

上述のように、本発明の菌株は、様々な成分の培養基において安定的かつ生産的に成長し、凍結乾燥状態で長期間活性を保つことができ、非病原性かつ毒素産生性、毒性がなく無害であるという特徴を持つ。

Klebsiella pneumonia 1−17菌株は、飼料用バイオマスの工業的生産を目的とした、天然ガスによるメタン酸化細菌の共培養において共棲菌として利用でき、また高度な加工のための原料としても利用できる。

従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17は、生成される生産物(メタノール、エタノール、プロパノール)を炭素源として利用し、それにより主たる生産者にかかる抑制作用を取り除く。この他にも、従属栄養体は細菌の溶解プロセスにおいてできるタンパク質、アミノ酸、および多糖類を利用することができる。

メタン酸化細菌は天然ガスのメタンによって増殖し、共培養の他方の要素は、天然ガス中のメタン同族体の共酸化生産物によって、またメタン資化性菌の細菌活動による生産物によって増殖する。

共培養の過程において、共培養菌の含有レベルは、最初の植え付け量に関係なく、ガス中にあるメタンのガス状同族体の共酸化の結果生み出され利用できる生産物の数により決まる。それは、鉱物培養基においては、メタンを利用しない共培養要素にとっての唯一の炭素源が、これらの生産物となるからである。培養菌がこのような自己調整を行うため、培養の最初の植え付けにおける培養細胞の割合は重大な意味を持たないが、加える非メタン酸化微生物の数は、全体の細胞数の0.1%以上15%以内にすることを推奨する。この範囲を外れた場合、第一にメタン酸化細菌の生育の停滞へとつながり、第二に起こりやすいのが従属栄養細菌の成長の停滞へとつながる。メタンを資化しない細菌を選んで加えた混合培養では、メタン酸化細菌だけの純粋培養に比べてバイオマスの生産量が3〜5倍に増大した。このように、メタン同族体の共酸化の生産物によって生育し、メタンを資化しない従属栄養体を選んでメタン酸化細菌に加えることで、メタンにおけるバイオマス生産量を増大させることができる。たとえメタンを資化しない従属栄養体を高濃度で取り入れても、培養菌の成長において得られる炭素源すなわちメタン同族体の共酸化の生産物の数によりその含有量は制限を受け、通常では全体の細胞数の1〜1.5%を超えないため、メタンを酸化しない従属栄養細菌を加えることはバイオマスの質に影響を与えない。

本発明は、以下の例によって説明することができる。

例1 Klebsiella pneumonia 1−17菌株を培養する液体の鉱物培養基の成分(g/l):(NH₄)₂SO₄ 0.52、MgSO₄ 0.02、K₂SO₄ 0.06、NH₄H₂PO₄ 1.53。

培養基を121℃で15分間殺菌する。

微生物溶液(培養基とは別に調合し、殺菌する)(g/l):ZnSO₄ 0.43、 MnSO₄ 0.88、CuSO₄ 0.78、H₃BO₃ 0.4、Na₂MoO₄×2H₂O 0.25、CoSO₄×7H₂O 0.25、FeSO₄×7H₂O 4.97。調合済みの微生物溶液1mlを1000mlの鉱物培養基に加える。pHを6.0〜6.2にする。基質(炭素源およびエネルギー源)として、メタノール1.0%を使用する。

菌株の培養は期間を定めた方法で、耐熱ガラス製のフラスコ内で、充填率0.3〜0.4の際に1リットルの容量で、恒温振とう培養機内で行われる。培養は34℃およびpH6.0において48時間行われる。培養終了時の乾燥物濃度は、1リットル当たりの絶対乾燥物8.2gとなる。得られた培養菌は、容量10リットル(実働容量7リットル)の自動発酵システムまたは容量40リットル(実働容量28リットル)の排出型発酵槽において、その後の細菌培養のための種菌として使用される。

例2 例1と同様に菌株の培養が行われるが、炭素源およびエネルギー源としてエタノール1.6%が使用される。物理化学的条件および培養時間は同じであり、乾燥物濃度は、1リットル当たりの絶対乾燥物3.0gとなる。

例3 例1と同様に菌株の培養が行われるが、炭素源およびエネルギー源としてプロパノール0.5%が使用される。物理化学的条件および培養時間は同じであり、乾燥物濃度は、1リットル当たりの絶対乾燥物3.0gとなる。

例4 メタン酸化細菌Methylococcus capsulatus GBS−15および従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17で構成される共培養を、容量10リットル(実働容量7リットル)の自動発酵システムの中で、下記の構成の鉱物培養基において行う。(単位g/l)H₃PO₄(80%) 17.2、 K₂SO₄ 5.0、MgSO₄×7H₂O 4.0、FeSO₄×7H₂O 0.21、CuSO₄ 0.78、MnSO₄×4H₂O 0.38、ZnSO₄×7H₂O 0.06、H₃BO₃ 0.25、Na₂MoO₄×2H₂O 0.009、CoSO₄×7H₂O 0.0095

窒素源および滴定剤としてアンモニア水が供給される。培養プロセスは40〜45℃、pH5.4〜5.8において、メタンおよび酸素を含む混合気体を常時供給しながら進められる。バイオマス濃度が、1リットル当たりの絶対乾燥物9gに達したところで、培養基の希釈率D=0.25 h⁻¹の連続培養プロセスに移行する。バイオマス濃度が、1リットル当たりの絶対乾燥物18.5gである際に、Methylococcus capsulatus GBS−15の支配率は93%となった。

例5 メタン酸化細菌Methylococcus capsulatus GBS−15および従属栄養細菌Klebsiella pneumonia 1−17で構成される共培養を、容量40リットル(実働容量28リットル)の排出型発酵槽の中で、下記の構成の鉱物培養基において行う。(単位g/l)H₃PO₂(80%) 17.2、 K₂SO₄ 5.0、MgSO₄×7H₂O 4.0、FeSO₂×7H₂O 0.21、CuSO₄ 0.78、MnSO₄×4H₂O 0.38、ZnSO₄×7H₂O 0.06、H₃BO₃ 0.25、Na₂MoO₄×2H₂O 0.009、CoSO₄×7H₂O 0.0095

窒素源および滴定剤としてアンモニア水が供給される。培養プロセスは41〜45℃、pH5.4〜5.7において、メタンおよび酸素を含む混合気体を常時供給しながら進められる。バイオマス濃度が、1リットル当たりの絶対乾燥物9〜10gに達したところで、少しずつ0.8MPaまで気圧を上昇させる。気圧の上昇に伴って、微生物の栄養源である気体の供給を少しずつ増加させる。その際の培養プロセスの指標はD=0.30 h⁻¹、バイオマス濃度は1リットル当たりの絶対乾燥物37g、メタン酸化細菌Methylococcus capsulatusGBS −15の支配率は93%であった。