本発明は、テルミナリアフェルジナンジアナ(T.フェルジナンジアナ)の天然抽出物/誘導体に関する。

以下、参照を容易にするために、テルミナリアフェルジナンジアナ(Terminalia ferdinandiana)はT.フェルジナンジアナと称され得る。

T.フェルジナンジアナは、オーストラリアの北部地域の亜熱帯の森林地帯、典型的にはノーザンテリトリーおよびウェスタンオーストラリアで広範囲にわたって野生で成長する小さな落葉樹である。

T.フェルジナンジアナには、小さなプラム様の果実が豊富に実をつける。その果実は非常にビタミンC含有量が高いことで知られており、抗酸化物質、葉酸、鉄の供給源である。その果実および果実抽出物は、食品、栄養補助食品および医薬品に使用されている。

T.フェルジナンジアナの果実の最も一般的な用途は、グルメジャム、ソース、ジュース、アイスクリーム、化粧品、香料、医薬品である。

T.フェルジナンジアナの果実抽出物における化粧品ビヒクルの例は、欧州特許第1581513号明細書に提案されている。別の特許文献米国特許第7175862号明細書は、T.フェルジナンジアナ植物の果実からアスコルビン酸(ビタミンC)、抗酸化物質および植物化学物質を含有する粉末を製造する方法を開示している。米国特許第7175862号明細書は、ヒト体内のフリーラジカルを低減するための粉末状のT.フェルジナンジアナ果実の使用について言及している。

T.フェルジナンジアナの果実は抗菌性を持つことでも知られている。北オーストラリアの天然果実として、この果実はオーストラリア先住民によって食品および薬剤として使用されてきた長い歴史がある。この果実は、オーストラリア先住民による長い狩猟移動の間、食品としてよりもその薬効性のために食べられていた。T.フェルジナンジアナの薬効性は十分に理解されていないか、または完全に評価されていない。

T.フェルジナンジアナの果実パルプの抗菌性の評価に関するI.E.CockおよびS.Mohantyの報告による研究は、「Pharmacgnosy Journal 2011[vol 3、issue 20]」に掲載された。その研究は、T.フェルジナンジアナの果実パルプの細菌増殖阻害能力に焦点が当てられており、T.フェルジナンジアナの果実の他の医薬的に重要な生物活性を調べるためにさらなる研究が必要であることが認識された。

チルド調理されたおよび新鮮な海産食品は、特に、貯蔵寿命が比較的短く腐敗につながりやすいと広く認識されている。

腐敗および廃棄される食品を削減するために、養殖および野生で捕獲される海産食品業界において、提示特性および嗜好特性を維持することは、大きな課題である。製品供給元の場所が遠い、および物流/配送チェーンが長いことで、これらの問題は悪化する。「農場での」加工と包装のプロトコルによる保存寿命および貯蔵寿命の延長は、海産食品業界に大きな利益をもたらすであろう。

貯蔵寿命および保存の時間枠、ならびにそれに関連する腐敗の問題は、海産食品業界に限られていない。新鮮な果実および野菜、ならびに赤身や白身の肉製品は、全て保存および貯蔵寿命が限られており、それぞれの業界において腐敗に関連する割合を有する。

包装中での不活性ガスの使用、および流体を吸収するための吸収性パッドの使用などの、冷却、クックチルおよび優れた包装技術の使用によって、製品の保存および貯蔵寿命を延ばすことができる。しかしながら、かかる技術には限界があり、より広範な技術および貯蔵寿命/保存機構は、これらの全ての食品製造産業にとって非常に価値があり、消費者の利益となるであろう。

腐敗による食品の劣化は、大量の廃棄食品、ならびに食品媒介性疾患をもたらす可能性がある。腐敗は、食品の風味、外観、食感または栄養価の劣化をもたらすことがある。食べられはするが消費者の目には不快または魅力的ではない食品は、売れずに廃棄される可能性が高い。傷んだ食品は、病気や食中毒の危険性も増加させる。

食品腐敗の主な原因の1つは、酸化による酸敗である。これは、食品の多価不飽和および一価不飽和成分が酸素と反応して過酸化物を形成し、続いてそれが分解してケトン、アルデヒドおよび他の揮発性化合物を形成するときに起こる。この酸化を制限することで、生鮮食品および加工食品の寿命が大幅に延びるであろう。

生鮮食品および加工食品に抗酸化性の高い果実、ハーブ、スパイスを取り入れて酸敗を遅らせ、貯蔵寿命および安全性を改善することは、酸化による酸敗を減少させ、食品の貯蔵寿命を延ばすことは、現在認められている方法である。しかしながら、高含有量の抗酸化物質の存在下では、微生物による腐敗が依然として継続することがしばしばある。

微生物による腐敗は、特に腐敗しやすい食品では、食品の劣化の主な要因であり、全ての食品廃棄物の推定25%を占めている。この種類の腐敗は、不適切な取り扱い/保存技術の結果としての微生物の取り込み、または、条件が増殖にとって好ましい場合の既存の微生物の繁殖のいずれかによって誘発され得る。

さらには、いくつかの一般的な食品腐敗性微生物も深刻な食中毒を引き起こす可能性がある。これは特に懸念される分野であり、改善された保存方策を開発するために多くの労力が費やされている。微生物の増殖を阻害することを目的とする方法は、初期集団、加工後の残存微生物の再増殖、および汚染物質誘導集団を効果的に制御する必要がある。これは、温度変更(加熱、冷却)、pH(発酵最終産物)、水分活性(脱水)または酸素利用能(缶詰、収縮包装、低酸素包装、高圧)、照射などの多くの方法論、または化学的保存によって達成され得る。

初期の収穫から製品の加工および包装に至るまでの食品加工を通して、食品はさまざまな非生物的要素(温度、熱、酸素)および生物的要素(酵母、菌類、昆虫、細菌)に曝露される。

肉、魚介類などの海産食品、青果物などの腐敗しやすい食材を一定期間保存する主な方法は、低温での保存(例えば、氷による冷却または冷凍)、調理、乾燥(脱水)によるものである。

これらは多くの食品腐敗性細菌の増殖を抑制する効果的な方法であり得るが、冷却およびクックチル加工は、Shewanella spp.などの好冷性および低温性細菌の増殖を阻害するのに非効率的であり、他の保存方法が必要である。

腐敗しやすい食品の乾燥および/または塩の添加による水分活性の低下、または発酵または酸(例えば、酢酸、クエン酸、乳酸)の直接添加による肉/筋肉のpHの変更は、保存された肉中の細菌増殖の阻害に効果的である。

しかしながら、これらの方法は、食品の味および食感特性にも大きな影響を及ぼしている。さらには、ナトリウムの過剰消費に関連する健康上の懸念により、近年、保存料としての塩の使用が減少している。

腐敗しやすい可食製品の腐敗を遅らせる他の方法は、化学保存料の添加を必要とする。一般的に使用される化学食品保存料としては、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、硝酸塩、亜硝酸塩、二酸化硫黄(SO2)および亜硫酸塩(SO3)が挙げられる。

懸念されるのは、食品に使用される多くの化学保存料の安全性がいまだに決定されておらず、場合によってはこれらの保存料は深刻な健康問題と関連していることである。

化学保存料は、呼吸器系の問題を引き起こし、注意欠陥多動性障害(ADHD)を悪化させ、影響を受けやすい個体にアナフィラキシーショックを引き起こすことがある。消費者の意識の高まりおよび人工保存料に対する否定的な認識により、消費者は化学由来の保存料を含有する食品をますます避けている。加工食品の貯蔵寿命および安全性を高めるために、天然の抗菌代替物の需要が増えている。

したがって、生の製品の初期集団の微生物の増殖を制御すること、ならびに加工後の残存微生物の再増殖、および汚染物質誘導集団を制御することが有益であることが認識されている。

本発明が開発されたのは、上記の制限の少なくとも1つを念頭に置いたものである。

本発明は、腐敗しやすい製品の保存および/または貯蔵寿命を維持するための既知の製品および/または方法の少なくとも1つの欠点を改善する少なくとも1つの代替または追加の製品および/または方法を提供することを目的とする。

上記を念頭に置いて、本発明の態様は、腐敗しやすい動物性および/または植物性製品の保存または貯蔵寿命を維持または延長するための抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ(T.フェルジナンジアナ)の葉に由来する抽出物を含有する組成物を提供する。

好ましくは、腐敗しやすい動物性および/または植物性製品としては、新鮮な、調理済みまたは半調理された、例えば部分調理後冷却した、動物および/または植物製品が挙げられる。

本明細書において、植物製品には、キノコおよびキノコベースの腐敗しやすい食品などの菌類製品が含まれると理解され読まれるべきである。

動物製品および/または植物製品は、ヒト、ペット、飼育動物または家畜のうちの1つ以上による消費のための食品を含んでもよい。

動物製品には、海産食品(例えば、調理済み、チルド調理されたまたは生の甲殻類、エビ、シュリンプ、カニ、ロブスター、魚、筋肉、カキ、タコ、コウイカ、イカ、貝など)などの海洋動物性製品を含んでもよい。

組成物は、T.フェルジナンジアナの葉抽出物に加えて、T.フェルジナンジアナの果実抽出物を含んでもよい。

T.フェルジナンジアナの葉抽出物は、葉のメタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル抽出物、アルコール抽出物、クロロホルム抽出物、またはヘキサン抽出物のうちの1つ以上を含む。

好ましくは、T.フェルジナンジアナの葉抽出物は、少なくとも1つの割合でタンニンを含む。より好ましくは、少なくとも1つのタンニンは、ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうちの1つ以上を含む。

T.フェルジナンジアナの葉抽出物は、好ましくは、ルテオリンなどの少なくとも1つのフラボンまたはフラボノイドを含んでもよい。

本発明のさらなる態様は、食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面上の制御細菌の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、細菌を適用することを含み、テルミナリアフェルジナンジアナ(T.フェルジナンジアナ)の葉抽出物を含有する組成物を、それぞれの食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面に適用することを含む。

好ましくは、組成物を適用する工程は、組成物をそれぞれの表面にスプレーすること、またはそれぞれの表面を組成物を含有する溶液に入れることのうちの1つ以上を含む。

乳酸は、フリーラジカル捕捉剤および/または抗酸化物質として提供され得る。

本発明のさらなる態様は、抗菌剤として提供されるT.フェルジナンジアナの葉抽出物を含むT.フェルジナンジアナの抽出物を提供する。

抽出物または組成物は、1つ以上の抗酸化物質を含んでもよい。1つ以上の抗酸化物質は、エラグ酸を含んでもよい。エラグ酸は、エラグ酸脱水物および/またはトリメチルエラグ酸を含んでもよい。

本発明のさらなる態様は、抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ(T.フェルジナンジアナ)の葉に由来する抽出物を含有する組成物を有する、スプレー溶液、後に希釈するための使用前の濃縮物、すぐに使用できる溶液、溶液中に分散させるための固体製品、または包装または輸送容器に含ませる固体製品を提供する。

本発明の別の態様は、テルミナリアフェルジナンジアナ(T.フェルジナンジアナ)葉に由来する抽出物を含有する抗菌組成物を含んでもよい。

組成物は、組成物を含有する溶液中に食品を浸漬または潅注することにより適用され得る。

組成物または抽出物は乳酸を含んでもよい。乳酸は、フリーラジカル捕捉剤および/または抗酸化物質として提供され得る。

好ましくは、抽出物は、細菌阻害組成物で使用するためのものである。

T.フェルジナンジアナの抽出物または組成物は、少なくとも1つのタンニンおよび/または少なくとも1つのフラボンを含んでもよい。

少なくとも1つのタンニンは、ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうちの1つまたは2つ以上の組み合わせを含んでもよい。

あるいは、またはさらに、抽出物または組成物は、ルテオリンなどの少なくとも1つのフラボンおよびフラボノイドを含んでもよい。

本発明の1つ以上の形態は、以下の製品:スプレー溶液(エアロゾルまたはポンプスプレーなど)、後に希釈するための使用前の濃縮物、すぐに使用できる溶液、溶液中に分散させるための固体製品、加工済みまたは前加工された生の、または調理済みまたは部分的に調理済みの動物または植物製品を有する包装または輸送容器に含ませる固体製品のうちの1つ以上であり得るか、またはそれらに含まれるかまたは組み込まれ得ることが理解される。

本発明の1つ以上の実施形態または実施例を、添付の図面を参照して以下に説明する。

本発明の少なくとも1つの実施形態に関して阻害領域(mm)として測定されたS.putrefaciens環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。

本発明の少なくとも1つの実施形態に関して阻害領域(mm)として測定されたS.baltica環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。

本発明の少なくとも1つの実施形態に関して阻害領域(mm)として測定されたS.frigidimarina環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。

本発明の少なくとも1つの実施形態に関して阻害領域(mm)として測定されたS.loihica環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。

M=メタノール抽出物、W=水抽出物、E=酢酸エチル抽出物、C=クロロホルム抽出物、H=ヘキサン抽出物、Amp=アンピシリン(10g)。結果を、平均阻害領域±SEMとして表す。

T.フェルジナンジアナの果実および葉のメタノール抽出物によるミナミクロダイの魚の切り身における細菌増殖の阻害を示す図である。

図5に示した結果に関して、総生存細菌の増殖を、15日間にわたってlog10 CFUとして計算し、各処理における未処理細菌の増殖の%として報告する。接種後、5日間隔で全ての処理群において細菌増殖を測定した。結果を、各時間間隔において3回にわたって3つの部分の平均阻害領域±SEMとして表す。*は、未処理の対照と有意に異なる結果を示している(p<0.01)。

図6aおよび図6bからなる図である。図6は、24時間曝露後のArtemia franciscanaノープリウスに対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物(2000g/mL)と二クロム酸カリウム(1000g/mL)および海水対照での致死率を示している。M=メタノール抽出物、W=水抽出物、E=酢酸エチル抽出物、C=クロロホルム抽出物、H=ヘキサン抽出物、NC=陰性(海水)対照、PC=二クロム酸カリウム対照(1000g/mL)。結果を、平均死亡率(%)±SEMとして表される。

本発明の少なくとも1つの実施形態に関して(a)陽イオン逆相HPLCモードおよび(b)陰イオン逆相HPLCモードでのT.フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物の2L注入における総化合物クロマトグラム(TCC)の図を示す。

T.フェルジナンジアナの葉を、脱水機で広範囲に脱水した。得られた乾燥した葉材料を−30℃で保存した。

T.フェルジナンジアナの果実パルプを、脱水機で広範囲に脱水した。得られた乾燥した果実パルプを−30℃で保存した。

乾燥した葉および果肉植物材料を、使用前に粗い粉末に粉砕した。質量1gの粉砕した果実および葉の粉末を、メタノール、脱イオン水、酢酸エチル、クロロホルムまたはヘキサンのいずれか50mL中で、または4℃で24時間穏やかに振とうして広範囲で抽出した。抽出物を濾紙で濾過し、室温で風乾した。水抽出物を濃縮器中で回転蒸発により凍結乾燥させた。得られたペレットを10mLの脱イオン水(0.5%ジメチルスルホキシドDMSOを含有する)に溶解し、続いて0.22mの濾紙を通過させ、使用するまで4℃で保存した。

抗酸化能:各サンプルの抗酸化能を、修飾2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル(DPPH)フリーラジカル捕捉法を使用して評価した。アスコルビン酸(ウェルあたり0〜25g)を参照として使用し、515nmで吸光度を測定し、記録した。全試験を各プレート上で対照とともに完了させ、全て3回にわたって実行した。

DPPHフリーラジカル捕捉能力に基づく抗酸化能を、各抽出物について決定し、抽出された元の植物材料のグラムあたりのアスコルビン酸当量として表した。

抗菌スクリーニング:環境Shewanella菌株:Shewanella putrefaciens菌株200、Shewanella baltica菌株OS155、Shewanella frigidimarina菌株NCIMB 400およびShewanella loihica菌株PV−4を使用した。抗菌スクリーニングは、1g/Lのペプトン、1.5g/Lの酵母抽出物、7.5g/LのNaCl、1g/Lの過硫酸アンモニウム、2.4g/LのHEPESバッファ(pH7.5)および16g/Lの細菌用寒天を含有する修飾ペプトン/酵母抽出物(PYE)寒天を使用して達成した。

S.putrefaciensおよびS.loihicaの培養物を30℃で24時間インキュベートした。S.balticaおよびS.frigidimarinaの培養液を15℃で72時間インキュベートした。全ての保存培養物を継代培養し、4℃のPYE培地で維持した。

抗菌活性の評価:T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物の抗菌活性スクリーニングは、改変ディスク拡散アッセイを使用して評価した。簡潔に言うと、100Lの個々のShewanella spp.を、およそ108細胞/mLの菌数が達成されるまで、20mLの新鮮な栄養ブロスで個別に培養した。体積100Lの各細菌懸濁液を栄養寒天プレートに広げ、5mmの滅菌濾紙ディスクを使用して、抗菌活性について抽出物を試験した。ディスクに10LのT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を注入し、乾燥させて接種されたプレートに置いた。プレートをインキュベーション前に4℃で2時間静置した。

S.putrefaciensまたはS.loihicaの培養物を接種したプレートを30℃で24時間インキュベートした。S.balticaまたはS.frigidimarinaの培養液を15℃で72時間インキュベートした。阻害領域の直径は、最も近いミリメートル数で測定した。各アッセイは、少なくとも3回行って完了した。本研究では、平均値(±SEM)が報告されている。アンピシリンディスク(10g)が得られ、抗菌活性を比較するための陽性対照として使用した。10Lの蒸留水を注入した濾紙ディスクを陰性対照として使用した。

最小阻害濃度(MIC)の決定:各抽出物の最小阻害濃度を、2つの方法を使用して決定した。一般的に最も感度の高い細菌増殖阻害アッセイと考えられているため、液体希釈MICアッセイを採用した。

さらには、マイクロプレート液体希釈MICアッセイは、細菌増殖阻害効果を定量化するためにしばしば使用される方法であるため、本方法を使用することで比較が可能になる。固相寒天ディスク拡散アッセイは、固形魚保存システムに関連する環境および条件においてより近い表現をもたらすとみなされたため、このバイオアッセイも本研究で使用した。

マイクロプレート液体希釈MICアッセイ:抽出物のMICを、標準的な方法で評価した。簡潔に言うと、一晩培養した細菌培養物を新鮮な栄養ブロスに滴下し、濁度を視覚的に調整して、マクファーランド番号1標準培養物を生成した。続けて、これを栄養ブロスで50分の1に希釈し、MICアッセイの接種培養物を得た。体積100Lの滅菌ブロスを96ウェルプレートの全ウェルに加えた。次に、試験抽出液または対照抗生物質(100L)を各プレートの一番上の列に加え、各カラムの一番上のウェルから次のウェルに100Lを移すなどによって、ウェルの各カラム内で2倍に連続希釈して調製した。

増殖対照(抽出物なし)および滅菌対照(接種なし)が各プレートに含まれていた。滅菌対照ウェルを除く全ウェルに、体積100Lの細菌培養接種物を加えた。

S.putrefaciensまたはS.loihicaの培養物を接種したプレートを30℃で24時間インキュベートした。S.balticaまたはS.frigidimarinaの培養液を接種したプレートを15℃で72時間インキュベートした。p−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット(INT)が得られ、滅菌脱イオン水に溶解して0.2mg/mLのINT溶液を調製した。

体積40Lのこの溶液を全ウェルに加え、プレートを30℃でさらに6時間インキュベートした。インキュベーション後、発色が阻害される最低用量としてMICを視覚的に決定した。

ディスク拡散MICアッセイ:抽出物の最小阻害濃度(MIC)もディスク拡散アッセイにより評価した。簡潔に言えば、T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を脱イオン水で希釈し、さまざまな濃度範囲にわたって試験した。ディスクに10Lの抽出希釈液を含浸させ、乾燥させ、接種されたプレート上に置いた。上記で概説したように、アッセイを達成し、阻害領域と濃度とのグラフをプロットした。MIC値の決定は、線形回帰を使用して達成した。

T.フェルジナンジアナ抽出物による魚の切り身における細菌増殖の阻害:ミナミクロダイの切り身の接種:新鮮な切り身のミナミクロダイ(Acanthopagrus butcheri Munro)を入手した。魚の切り身は全て4℃で新鮮に保存し、収穫と同じ日の午前10時に購入した。縁部を無菌状態で切除し、各切り身から取り除いた。切り身の残りの部分を無菌状態で切除し、1cm四方の端面を有し、大気中の細菌汚染に曝露された2つの表面(各1cm3)を各々有する魚の切り身の立方体を作成した。立方体を5つのグループに分けた(n=45):

(1)1MのNaCI溶液に浸漬したもの(対照)、(2)2000 g/mLのT.フェルジナンジアナの果実のメタノール抽出物を1MのNaCI溶液に浸漬したもの、(3)500 g/mLのT.フェルジナンジアナの果実のメタノール抽出物を1MのNaCI溶液に浸漬したもの、(4)1MのNaCI溶液に2000 g/mLのT.フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物を浸漬したもの、(5)1MのNaCI溶液に500 g/mLのT.フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物を浸漬したもの。

全試験グループを、それぞれの処理液に6時間浸漬した。続けて、立方体を処理液から出し、無菌状態で排水させた。各グループの3つの部分をただちにサンプリングした(0日目)。各グループにおける残りの部分は、4℃の密閉滅菌容器に別々に保存した。増殖時間経過研究のため、接種後5、10および15日目に、各グループからさらに3つの部分をサンプリングした。

ミナミクロダイの切り身中のコロニー形成単位(cfu)の決定:ミナミクロダイの切り身の細菌増殖時間に対するT.フェルジナンジアナの果実および葉のメタノール抽出物の影響を調べるために、処理後0、5、10、および15日において、各処理につき3回ずつ個別の部分をサンプリングした。オーバーヘッド浸漬ブレンダーを使用して各部分を個別に均質化し、ワットマンNo.54濾紙で4℃で濾過した。均質化後、10−3〜10−7の範囲にわたって、1MのNaCl溶液において各均質液から連続希釈で10倍の希釈液を調製した。生菌数を数えるために、体積100Lの各懸濁液を個々の栄養寒天プレートに広げた。プレートを30℃で24時間インキュベートし、直接コロニーを計数して細菌負荷(サンプルのコロニー/mL)を数え、各時点での未処理の対照コロニー数(グループ1)の±SEM(%)として表した。

Artemia franciscanaノープリウス毒性スクリーニング:修飾Artemia franciscanaノープリウス致死率アッセイを使用して、毒性を評価した。簡潔に言うと、約53(平均52.7、n=125、SD11.8)A.franciscanaノープリウスを含有する400Lの海水を48ウェルプレートのウェルに加え、ただちにバイオアッセイに使用した。体積400Lの参照毒素または希釈した植物抽出物をウェルに移し、人工光(1000ルクス)の下で25±1℃でインキュベートした。各プレートにおいて、400Lの海水陰性対照を3回繰り返して実施した。一定間隔でウェルを評価し、死亡数を計数した。10秒以内に付属器官の動きが観察されなかった場合、ノープリウスは死亡したとみなした。24時間後、全ノープリウスを犠死させて計数し、ウェルあたりの総死亡率(%)を決定した。プロビット分析を使用して、各処理において95%信頼限界でのLC50を計算した。

HPLC−MS/MS分析:Zorbax Eclipse plus C18カラム(2.1×100mm、粒径1.8m)を設置したAgilent 1290 HPLCシステムにサンプルを2L注入して、クロマトグラフィー分離を行った。移動相は、(A)超純水および(B)流速0.7mL/分の95:5アセトニトリル/水からなるものであった。両方の移動相を、陽性モードでの質量分析において0.1%(v/v)の氷酢酸、陰性モードでの分析において5mM酢酸アンモニウムで修飾した。研究に用いたクロマトグラフィー条件は、5%Bの均一濃度で最初の5分間分析を行い、5%から100%までの(B)の勾配を5分から30分まで適用し、その後100%で3分間均一濃度で行った。

質量分析は、陽性モードと陰性モードの両方でエレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極飛行時間型分光計で実行した。データは、定性分析ソフトウェアパッケージを使用して分析した。

ソフトウェアパッケージのFind by Molecular Featureアルゴリズムを使用して、各溶媒抽出システムを使用したブランクを分析し、10,000カウントを超える豊富な分子の化合物リストを作製した。次に、これを除外リストとして使用して、抽出物の分析から背景汚染化合物を除去した。次に、各抽出物をFind by Molecular Feature機能を使用して、同じパラメータを使用して分析し、抽出物中の化合物の推定リストを作製した。次に、化合物リストを3つの正確な質量データベースに対してスクリーニングした;本研究のために特別に作製された治療上重要な既知の植物化合物のデータベース(800化合物);Metlinメタボロミクスデータベース(24,768化合物);およびAgilent Technologiesによる法医毒性学データべース(7,509化合物)。同定されていない化合物の実験式は、ソフトウェアパッケージのFind Formula関数を使用して決定した。

統計分析:データは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SEMとして表される。一元配置分散分析を使用して、対照群と統計的に有意とみなされるP値<0.01を有する処理群との間の統計的有意性を計算した。

結果:液体抽出物収率および定性的な植物化学スクリーニング:さまざまな溶媒によるT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物(1g)により、18mg〜483mg(果実抽出物)および58mg〜471mg(葉抽出物)の範囲の乾燥した植物抽出物を得た(表1)。

水およびメタノール抽出物は、低〜中程度の収率をもたらしたクロロホルム、酢酸エチル、およびヘキサンの抽出物に比べて抽出された材料の収率が著しく向上した。乾燥した抽出物を10mLの脱イオン水(1%DMSO含有)に再懸濁し、表1に示す濃度にした。

表1では、+++は大きな応答を示し、++は中程度の応答を示し、+は小さな応答を示し、−はアッセイで応答がないことを示す。

FM=T.フェルジナンジアナ果実のメタノール抽出物;FW=T.フェルジナンジアナ果実の水抽出物;FE=T.フェルジナンジアナ果実の酢酸エチル抽出物;FC=T.フェルジナンジアナ果実のクロロホルム抽出物;FH T.フェルジナンジアナ果実のヘキサン抽出物。

LM=T.フェルジナンジアナ葉のメタノール抽出物;LW=T.フェルジナンジアナ葉の水抽出物;LE=T.フェルジナンジアナ葉の酢酸エチル抽出物;LC=T.フェルジナンジアナ葉のクロロホルム抽出物;LH T.フェルジナンジアナ葉のヘキサン抽出物。

抗酸化能をDPPH還元によって決定し、抽出された植物材料(果実または葉)のグラム(g)あたりのアスコルビン酸当量(ミリグラム(mg))として表した。

抗xodidantの含有量:植物抽出物の抗酸化能(表1)は、抽出された乾燥植物材料(メタノール果実抽出物)のグラムあたり0.4mg(ヘキサン葉抽出物)〜最高660mgのアスコルビン酸当量までの範囲であった。一般的に、水およびメタノール抽出物は、対応するクロロホルム、ヘキサンおよび酢酸エチル抽出物よりも高い抗酸化能を有していた。

Shewanella spp.の増殖阻害:T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のShewanella spp.を阻害する能力を決定するために、ディスク拡散アッセイを使用して10Lの各抽出物をスクリーニングした。S.putrefaciensの増殖は、T.フェルジナンジアナ果実のメタノール、水および酢酸エチル抽出物および葉の全ての抽出物によって阻害された(図1)。

クロロホルムおよびヘキサン果実抽出物のみが、S.putrefaciensの増殖阻害活性を欠いていた。

メタノールおよび水葉抽出物は、S.putrefaciensの特に強力な阻害剤であり、それぞれ実質的に11mmを超える阻害領域を有していた。これは、8.3±0.6mmの阻害領域を有するアンピシリン対照(10g)と比較してより優れたものであった。S.putrefaciensは微生物による魚の腐敗の主な原因物質であるため(中温条件と低温条件の両方で)、これらは特に注目に値する結果である。

メタノール、水および酢酸エチル果実抽出物、ならびにクロロホルムおよびヘキサン葉抽出物もS.putrefaciensの増殖を阻害したが、それらは一般的に、対応するメタノール抽出物よりも効力が低かった。

高極性抽出物と比較して低極性抽出物の有効性が低いことは、最も強力なおよび/または最も豊富な増殖阻害化合物が極性であることを示している。

海産食品は一般に、低温条件で保存されるため、他の低温性および好冷性のShewanella spp.は、低温において重要性が増加している。

S.balticaの増殖の制御、および程度は低いがS.frigidimarinaの増殖の制御は、海産食品(例えば、魚)を低温で長期間保存し、S.putrefaciensの寄与が減少する場合により重要になる。

S.balticaの増殖は、T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物にも影響を受けやすかった(図2)。

S.putrefaciensの増殖阻害について指摘された傾向と一致して、S.balticaは、水抽出物および極性の低い抽出物よりもメタノール抽出物に対してより影響を受けやすいようであった。

さらには、葉抽出物は、対応するT.フェルジナンジアナ果実抽出物よりも実質的により強力な増殖阻害剤であった。

S.putrefaciensの増殖阻害について上記で報告したように、メタノールおよび水葉抽出物は、S.baltica増殖に対する特に強力な阻害剤であり、阻害領域はそれぞれ14.6±0.3mmおよび12.7±0.6mmであった。

この細菌の増殖はアンピシリンの影響を受けないため、S.balticaの増殖の阻害は特に注目に値し、抗生物質耐性株であることを示している。

メタノール果実抽出物は、S.baltica増殖の優れた阻害剤でもあった(阻害領域=9.8±0.4mm)。阻害活性を欠いた果実のクロロホルムおよびヘキサン抽出物を除いて、他の全ての抽出物は、S.baltica増殖の中程度の阻害剤であった(阻害領域により決定)。

S.frigidimarinaの増殖は、いくつかのT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物によっても阻害された(図3)。

S.balticaおよびS.frigidimarinaの増殖の阻害について明らかなように、メタノール抽出物は一般的に、他の対応する溶媒抽出物よりも強力なS.frigidimarina増殖阻害剤であった。

メタノール葉抽出物は特に強力で、18.6±0.6mmの阻害領域を有していた。

特に、他の低温性細菌種(S.baltica)に関しては、S.frigidimarinaの増殖も、アンピシリン曝露に耐性があった。

水の葉抽出物も強力な増殖阻害剤であった(阻害領域=9.8±0.4mm)。

果実のメタノール抽出物、水抽出物、および酢酸エチル抽出物、ならびに葉の酢酸エチル抽出物も、より小さな阻害領域を有し、中程度の阻害活性を示すものではあるが、S.frigidimarinaの増殖を阻害した。

全てのクロロホルムおよびヘキサン抽出物は、S.frigidimarinaの増殖阻害活性を完全に欠いていた。

S.loihicaおよびS.putrefaciensは、同様の遺伝子型と表現型の特徴を共有し、同様の最適な増殖条件を有している。

したがって、T.フェルジナンジアナの果実および葉のS.loihicaを阻害する能力も試験した(図4)。他のShewanella spp.とは対照的に、S.loihicaはアンピシリン対照(19.6±1.3mmの阻害領域)に対して特に影響を受けやすかった。T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のほとんどに対して、実質的により小さな阻害領域が記録されたが、いくつかは強力なS.loihica増殖阻害を示した。実際、S.loihicaのメタノール果実および葉抽出物への曝露によって、10mmを超える阻害領域が生成された。他のShewanella spp.の増殖阻害について明らかなように、メタノールによるT.フェルジナンジアナ果実抽出物は最も強力な増殖阻害剤であり(阻害直径により評価)、15.3±1.2mmの阻害領域が測定された。

他方、メタノール果実抽出物については、10.8±0.8mmの阻害領域が測定された。果実の水、酢酸エチルおよびクロロホルム抽出物、ならびに葉のヘキサン抽出物もS.loihicaの増殖を阻害したが、実質的により小さな阻害領域が測定された。

最小阻害濃度(MIC)の定量化:Shewanella spp.に対する各抽出物のMIC値(表2)を決定することにより、抗菌活性の相対レベルをさらに評価し、ディスク拡散スクリーニングアッセイでは影響を受けやすいことが示された。

スクリーニングアッセイで見られたのと同様の傾向、すなわち、T.フェルジナンジアナの葉抽出物は、対応する果物抽出物よりも全てのShewanella spp.増殖において実質的に優れた阻害剤であることが認められた。

さらには、メタノール抽出物は一般的に最も強力な増殖阻害剤であった。メタノール葉抽出物は、特に強力なS.putrefaciens増殖阻害剤であり、ディスク拡散(DD)および液体希釈(LD)のMIC値はそれぞれ93および73 g/mLであった。これは、メタノール果実抽出物(DD MIC 1160 g/mL;LD MIC 980 g/mL)よりも実質的に強力である。T.フェルジナンジアナメタノール葉抽出物は、S.baltica(DD MIC 104 g/mL;LD MIC 85 g/mL)、S.fhdidimarina(DD MIC 466 g/mL;LD MIC 391 g/mL)およびS.loihica増殖(DD MIC 95 g/mL;LD MIC 55 g/mL)の強力な阻害剤でもあった。水および酢酸エチルのT.フェルジナンジアナ葉抽出物も、多くの場合、対応する葉抽出物よりも1桁高いMIC値ではあるが、全てのShewanella spp.増殖に対して低いMIC値を有していた。さらに、メタノール抽出物が最も強力であった葉抽出物とは対照的に、酢酸エチル抽出物は一般的に、果実抽出物の中で最も強力であった。

ミナミクロダイの切り身における細菌増殖の阻害:低温性および好冷性のShewanella spp.は、冷蔵魚の腐敗の主な原因として一般的に認められているが、他の細菌種も腐敗の原因となるであろう。

さらには、本発明者らの研究で使用されているMICアッセイ法は、抽出物がin vitroでShewanella spp.の増殖を阻害する能力に関する重要な情報を提供するが、市販の冷蔵魚の細菌による腐敗を必ずしも正確に描写しているわけではない。したがって、T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を、冷蔵条件下で魚の切り身の細菌の増殖を阻害する能力について試験した。

メタノール抽出物は、一般的に最も効果的な増殖阻害剤であったため(表2)、魚の切り身の腐敗評価ではこれらの抽出物のみを試験した。本研究では、細菌種を区別せず、その代わりにコロニー形成単位(cfu)として総生菌数を測定した。さらに、冷蔵は、新鮮な魚の最も一般的な保存方法であるため、本研究で使用した魚の切り身も評価期間中4℃で保存した。結果は、冷蔵のみでの改善の程度を決定するために、対照の魚の切り身(処理なし、4℃で保持)のcfu(%)として表す。

メタノールによるT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物による全ての処理は、処理直後の切り身の生菌数を減少させるのに効果的であり、抽出物が0.5mg/mLで殺菌性であることを示している。実際、処理された全グループのcfuは、対照の切り身と比較して約95%阻害された。

0.5mg/mLのメタノール果実抽出物を除き、全ての抽出物は、試験開始時と同様に10日間の冷蔵後もほぼ有効であり、各々が対照の切り身と比較して、依然として約95%細菌の増殖を阻害していた。0.5mg/mLのメタノール果実抽出物は、10日間の増殖後には効果的ではなかったが、対照の切り身と比較して、依然として約35%細菌の増殖を阻害していた。

15日間の冷蔵後、果実抽出物(両方の濃度)および0.5mg/mLの葉抽出物の処理は、試験の初期よりも効果が低く、細菌の増殖は対照の切り身のレベルの50〜85%まで増加した。

これらの値は、細菌の増殖の著しい減少を表しており、抽出物の全てが少なくとも15日間腐敗を著しく減少させることを示している。

注目すべきことに、2mg/mLのメタノール葉抽出物の処理は、15日目の細菌増殖の阻害に依然として非常に効果的であった。実際、この処理における試験の15日目では細菌の増殖が約90%減少していた。つまりは、2mg/mLのメタノールT.フェルジナンジアナ葉抽出物で処理すると、15日間で細菌による腐敗が大幅に減少し、冷蔵魚の貯蔵寿命が延びる可能性を示している。

図5は、メタノールによるT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物によるミナミクロダイの魚の切り身における細菌増殖の阻害における図を示している。

図5において、総生存細菌の増殖を、15日間にわたってlog₁₀ CFUとして計算し、各処理における未処理細菌の増殖の%として報告している。

接種後、5日間隔で全ての処理群において細菌増殖を測定した。結果は、各時間間隔において3回にわたって3つの部分の平均阻害領域±SEMとして表される。*は、未処理の対照と有意に異なる結果を示している(p<0.01)。

図6に示すように、毒性の定量化を行った。全ての抽出物は、Artemiaノープリウスアッセイで2000g/mLで最初にスクリーニングした。 さらに、バイオアッセイでは、参照毒素として重クロム酸カリウム(PC)も試験した。

参照毒素は、死亡の発生が急速であり、曝露の最初の3時間以内にノープリウス死を促進し、5時間以内に100%の死亡率が明らかになった(未発表の結果)。全てのメタノールおよび水抽出物も、24時間の曝露後に100%の死亡率を誘導した。同様に、酢酸エチル葉抽出物も24時間の曝露で100%の死亡率を誘発した。他の全ての抽出物は50%未満の死亡率を誘発したため、非毒性であるとみなされた。

死亡の開始における毒素濃度の影響をさらに定量化するために、抽出物を人工海水で連続希釈して、Artemiaノープリウスバイオアッセイの濃度範囲で試験した。A.franciscanaに対するT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物の24時間LC50値を表2に示す。試験した全ての濃度で50%未満の死亡率が見られたため、任意のクロロホルムまたはヘキサン抽出物、および果実の酢酸エチル抽出物についてLC50は報告していない。他の全ての抽出物について、実質的に1000g/mLを超えるLC50値が測定された。Artemiaノープリウスに対して1000g/mLを超えるLC50値を有する抽出物は、本アッセイでは非毒性であると定義されているため、T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物は全て非毒性であるとみなされた。

全てのメタノールおよび水抽出物も、24時間の曝露後に100%の死亡率を誘導した。同様に、酢酸エチル抽出物も24時間の曝露で100%の死亡率を誘発した。他の全ての抽出物は50%未満の死亡率を誘発したため、非毒性であるとみなされた。

図7は、(a)陽イオン、および(b)陰イオンRP−HPLCモードでのメタノールによるT.フェルジナンジアナの葉抽出物の2Lインジェクションにおける総化合物クロマトグラム(TCC)の図を示している。理解を容易にするために、推定上同定された注目すべき化合物をクロマトグラムに示している。

以下の表2は、S.putre faciens、S.baltica、S.fhgidimahnaおよびS.loihicaの増殖(g/mL)に対するディスク拡散および液体希釈MICの結果、およびT.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のArtemiaノープリウスバイオアッセイLC50値(g/mL)を示している。

メタノール葉抽出物は、最大の抗菌効果を示した(MICによる判定、表2)。

最適化されたHPLC−MS/MSパラメータが開発され、メタノール葉抽出物の特定の化合物クラスを検索し、個々の成分を特定するために使用した。

陽イオンおよび陰イオンのクロマトグラムで得られた総化合物クロマトグラム(TCC)をそれぞれ図6(図6aおよび6b)に示す。

陰イオンクロマトグラムは、本モードでの参照イオンのイオン化により、陽イオンクロマトグラムよりもバックグラウンドの吸収レベルが著しく高くなり、目的のピークの信号がマスクされる可能性がある。

陽イオンクロマトグラム(図6a)では、特に極性化合物の溶出に対応するクロマトグラムの初期および中期に多数のピークが存在することが明らかになった。ほぼ全てのメタノール抽出化合物が15分で溶出した(約40%のアセトニトリルに対応)。5%アセトニトリルで最初の1分間にいくつかの主要なピークが溶出した。同様に、陰イオンのメタノールT.フェルジナンジアナ葉抽出物TCCで検出されたピークの大部分は、15分までに溶出していた。最大30分の溶出時間(100%アセトニトリル)においてもいくつかの顕著なピークが明らかになり、この抽出物には低極性化合物も存在することが示された。

本研究で使用されたメタボロミクスフィンガープリント手法は、2つの特定の植物化学クラスを対象としている。タンニン含有量が高いことがTerminalia spp.の特徴であり、T.フェルジナンジアナにおいてタンニン含有量が高いことが報告されている(Cock、2015年)。

さらに、最近の研究では、T.フェルジナンジアナ葉において、多くのタンニン成分が特徴づけられており、それらはいくつかの病原菌の増殖の阻害と関連付けられた(Courtneyら、2014年)。Metlinメタボロミクス、法医毒性学(Agilent)および植物化学(本実験室で開発)データベースとの比較により、メタノールによるT.フェルジナンジアナ葉抽出物で総計10個のタンニンを推定上同定した。

ケブル酸(+イオン化モードで2.2%の総ピーク面積)、ケブラジン酸(−イオン化モードで1.7%の総ピーク面積)、コリラゲン(−イオン化モードで7.2%の総ピーク面積)、エラグ酸(−イオン化モードで1.0%の総ピーク面積)およびトリメチルエラグ酸エステル(+イオン化モードで1.7%の総ピーク面積)、エキシフォン(+イオン化モードで1.9%の総ピーク面積)およびプニカリン(−イオン化モードで2.4%の総ピーク面積)は、特に高い相対存在量で存在した(相対ピーク面積(%)で評価)。他の全てのタンニンは、より低い相対的存在量で存在していた。

T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を、いくつかの方法で腐敗しやすい食品の貯蔵寿命に良い影響を与える可能性があるため、腐敗性細菌の増殖を阻止する能力についてスクリーニングするために選択した。

肉製品などの生鮮食品、例えば海産食品、魚、肉などの腐敗の大部分は、酸化的腐敗の結果である。

腐敗しやすい食品を高含量で抗酸化物質を含有する製剤(例えば、いくつかの植物抽出物)で処理すると、脂質の酸化が減少するため、酸化による酸敗が阻害される。

T.フェルジナンジアナの果実および葉抽出物は、個別または組み合わせて、Shewanella spp.増殖の強力な阻害剤であるため、天然の魚/海産食品の保存料としての可能性を有している。

T.フェルジナンジアナの葉抽出物は、全ての低温性および中温性のShewanella spp.に対して特に効果的であったため、魚および冷蔵魚の両方の保存の可能性を有している。

全ての試験されたT.フェルジナンジアナの葉抽出物は、Artemia fransiscana(塩水エビ)バイオアッセイにおいて非毒性であることがわかった。

さらには、全てのT.フェルジナンジアナ抽出物はArtemiaノープリウスに対して非毒性であったため、天然の魚の保存剤として安全に使用できる。

欧州特許第1581513号明細書

米国特許第7175862号明細書