本发明涉及包括抗体和抗原的轭合物，其中所述轭合物具有较低的抗体 效价(valency)，本发明还包括所述轭合物的制备方法。

免疫系统由能够识别特异抗原的淋巴细胞构成。B淋巴细胞通过表面免 疫球蛋白受体识别处于天然构象的抗原，而T淋巴细胞在抗原递呈细胞 (antigen presenting cell)表面识别表现为肽及自身分子的称为主要组织相容性 抗原(MHC)或人体中人白细胞抗原(HLA)的蛋白抗原。抗原递呈细胞存在不 同形式，且可被区分为例如巨噬细胞和树突状细胞的‘经典(classical)’抗原递 呈细胞，和包括B淋巴细胞的‘非经典’抗原递呈细胞。T淋巴细胞还可进一 步划分为能杀灭病毒感染的靶细胞的“细胞毒性T淋巴细胞”，及“辅助性T” 淋巴细胞。辅助性T淋巴细胞具有调节功能并且能够帮助B淋巴细胞产生特 异抗体，或帮助巨噬细胞杀灭细胞内病原体。

抗体可存在多种形式，例如存在主要类型：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE， 各自具有不同的‘效应子(effector)’功能，藉此来确定所述抗体的作用。效应 子功能包括补体结合(导致对炎性反应的刺激作用)，其可由IgM、IgA和IgG 通过形成抗原和抗体的免疫复合物来活化。效应子功能的另一个例子是抗原 对肥大细胞的触发，其通过IgE表面与肥大细胞的的交联来实现，通过高亲 和性受体IgE FcR-ε-I(对IgE的Fc区域的受体)的占据而被限制在该处。对 某些抗体类型还存在亚型(例如人体内的IgG包括四种不同亚型，称为IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4)。所述IgG亚型在丰度和其效应子功能上有显著的区别。

医学历史上最重要的成果之一就是疫苗的发现，其用于预防多种传染性 疾病。同时还在开发用于治疗各种诸如自体免疫和神经变性疾病的非传染性 疾病和各种癌症的疫苗。许多疫苗是通过使注射入个体的病原体失活或减弱 来制备的。被赋予免疫性的个体通过同时产生体液(抗体)和细胞(细胞毒T细 胞，CTL’s)反应来响应。例如某些流行性感冒疫苗是通过用甲醛对病毒进行 化学处理使其失活来制备的，类似地Salk polio疫苗包括用丙内酯 (propionolactone)灭活的全病毒。对许多病原体(特别是细菌)，化学或加热灭 活在产生提供保护性免疫的疫苗免疫原的同时，还引起诸如发热和注射部位 反应的副作用。对于细菌的情况，灭活后的有机体往往毒性过大，因而其副 作用限制了这类天然疫苗免疫原(例如细胞百日咳疫苗)的应用。因此许多现 代疫苗是由病原体的保护性抗原制备的，其通过纯化或分子克隆从引起副作 用的材料中分离得到。这些后者疫苗被称作‘亚单位疫苗(subunit vaccine)。

亚单位疫苗(例如免疫原为纯化的蛋白的疫苗)的开发是近年来大量研究 的焦点。新病原体(例如HIV和B组链球菌)的出现，以及抗生素耐药性的增 长造成了对开发新疫苗及鉴定用于开发亚单位疫苗的其它候选分子的需求。 同样地，基因和蛋白研究中发现的新疫苗抗原使得能够开发新的候选亚单位 疫苗，特别是抗细菌病原体和癌症的亚单位疫苗。然而，虽然亚单位疫苗试 图避免灭活或削弱的病原体疫苗的副作用，但其‘纯净’状态是从通常与整个 有机体疫苗相关联的‘危险信号’中分离得到的，并且亚单位疫苗并不总是具 有充分的致免疫性。近年来，许多候选的亚单位疫苗没有通过临床试验，而 可能获得成功的则可用作增强对纯化抗原的免疫反应的适当佐剂。佐剂指能 通过调节免疫细胞的活性来增强对抗原的特异免疫反应的物质或手段。

我们描述了具有增强功效的佐剂。佐剂指能通过调节免疫细胞的活性来 增强对抗原的特异免疫反应的物质或手段。佐剂的例子示例性地包括弗氏佐 剂、胞壁酰二肽、脂质体。公开号为WO 97/38711的国际申请和美国专利第 02/0136722号，除其它外，公开了CD28：抗原和CD40：抗原轭合物，其作为 佐剂导致对所述轭合物的抗原部分的免疫反应增强。

CD28/CD40：抗原轭合物可通过多种方法用多种可能的交联剂来制备。 在Pierce Chemical Company Inc.和Molecular Probes Inc.的目录中描述了多种 交联剂和交联方法。优选的轭合方法使用所谓的异型双功能 (hetero-bifunctional)交联剂，其在分子的每一端具有不同的官能团，因此其 使用可防止直接的抗原-抗原交联或抗体-抗体交联。然而，除了这些交联剂 的上述优点，在许多情况下仍能形成含有超过一个抗体分子和超过一个抗原 分子的轭合物。

例如，如果用sulfo-SMCC和SATA作为交联剂，首先对轭合物的其中 一种组分用sulfo-SMCC进行马来酰亚胺修饰(maleimate)，而另一组分用 SATA来结合巯基。所述马来酰亚胺和巯基修饰都是在伯胺上进行的，而伯 胺在抗体和抗原上均有多个(氨基末端残基(每Ig分子上4个)，及任意赖氨 酸残基)。因此，任意抗原均可能与超过一个抗体分子结合，而任意抗体分 子均有可能与超过一个抗原分子结合。这样，可形成大型共价结合的抗体和 抗原复合物。可用多个不同参数对轭合过程中形成的所述复合物进行表征：

i)轭合物的总大小(分子量)；

ii)抗体对抗原的比例(重量∶重量)；

iii)抗体对抗原的比例(摩尔∶摩尔)；

iv)轭合物中的平均抗体分子数；及

v)轭合物中的平均抗原分子数。

对任一已知分子量的抗原，所有这些参数均可从(iv)和(v)推导出来。然 而，当抗原大小变化时，这些数值之间的关系会发生变化，因此最佳的轭合 物形式会在小型(肽)、中型(蛋白)和大型(多糖)抗原之间变化。

从体外实验得知，通过增加所述相互作用的效价可以增强通过CD40及 CD28进行的信号传输。因此，为了实现最佳的B细胞或T细胞增殖，在加 入所述细胞前，将抗-CD40或抗-CD28粘附在组织培养板的塑料上，或通过 使用粘附在所述塑料上的抗-Fc抗体，或者甚至通过使用诸如本身粘附在所 述组织培养塑料板上的CD32表达L929细胞的Fc受体表达细胞系来进行交 联从而粘附在所述塑料上(Banchereau et al，Science，1991，252，70-72.)。出人 意料地，我们发现，与体外的诱导增殖不同，通过增加多重效价并不能增强 抗体的佐剂作用。实际上，当任何一种抗体处于多价状态时，所述佐剂作用 减弱。

本发明的一个方面提供一种佐剂，其包括CD28和/或CD40抗体及至少 一个抗原的分离的轭合物，其中所述轭合物由低聚复合物构成，其中所述复 合物的抗体效价的平均值不超过每个复合物约5个抗体分子。

“轭合物”的形成是通过任何能导致抗原与抗体的共轭交联或轭合的手 段来实现的。

在本发明优选的实施方案中，所述复合物具有每个复合物平均1-4个抗 体分子。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述复合物具有每个复合物平均 1-3个抗体分子。更优选每个复合物1-2个抗体分子。

本发明的另一方面提供包括本发明的轭合物的疫苗组合物。

在本发明的优选实施方案中，所述组合物还包括载体。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述组合物还包括第二佐剂。

在本发明更进一步优选的实施方案中，所述组合物包括本文所述的 CD40轭合物和CD28轭合物的混合物。

下文对术语“载体”进行了解释。载体是当其与第二分子结合后能增强 后者的免疫反应的致免疫分子。某些抗原本质上不是致免疫的(即其本身不 是致免疫的)，然而当与诸如钥孔(keyhole-limpet)血蓝蛋白或破伤风类毒素的 异物蛋白分子结合时能产生抗体反应。这类抗原含有B-细胞抗原决定簇 (epitope)但没有T细胞抗原决定簇。这类轭合物的蛋白部位(“载体”蛋白)提供 T-细胞抗原决定簇，其刺激辅助性T-细胞进而刺激抗原特异B-细胞分化为 浆细胞并产生抗所述抗原的抗体。辅助性T-细胞还能刺激其它诸如细胞毒性 T-细胞的免疫细胞，而载体能实现类似的产生细胞介导的免疫及抗体的作 用。某些缺乏T-细胞抗原决定簇(诸如具有重复B-细胞抗原决定簇(例如细菌 多糖)的聚合物)的抗原本质上具有有限的致免疫性。这些被称为T-非依赖抗 原。这类抗原得益于与诸如破伤风类毒素的载体结合，在这种条件下其引起 强得多的抗体反应。细菌多糖的载体轭合用于制备多种抗诸如流感嗜血杆菌 (Hib)和C型脑膜炎球菌的抗细菌感染的‘轭合物疫苗’。

在本发明优选的实施方案中，所述抗原为T-细胞依赖抗原。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗原为T-细胞非依赖抗原。

在本发明优选的实施方案中，所述抗原源自致病菌。

优选地，所述抗原源自菌种，所述菌种选自如下细菌：金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；粪肠球 菌(Enterococcus faecalis)；结核分歧杆菌(Mycobacterium tuberculsis)；B组链 球菌(Streptococcus group B)；肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)；幽门螺 旋杆菌(Helicobacter pylori)；淋病双球菌(Neisseria gonorrhea)；A组链球菌 (Streptococcus group A)；伯氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；粗球孢子菌 (Coccidiodes immitis)；荚膜组织胞浆菌(Histoplasma sapsulatum)；脑膜炎双 球菌(Neisseria meningitidis)；弗氏志贺菌(Shigella flexneri)；大肠杆菌 (Escherichia coli)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗原源自病毒性病原体。

优选地，所述抗原源自病毒性病原体，所述病毒性病原体选自：人免疫 缺陷病毒(HIV1&2)；人T细胞白血病病毒(HTLV 1&2)；埃博拉病毒；人 乳头瘤病毒(例如HPV-2，HPV-5，HPV-8，HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33， HPV-52，HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒(rhinovirus)；脊髓灰质 炎病毒；疱疹病毒；腺病毒(adenovirus)；爱泼斯坦-巴尔病毒；流感病毒， 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗原源自寄生性病原体。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗原源自寄生性病原体，所述 寄生性病原体选自锥虫属(Trypanosoma spp.)、Lieshmania属、血吸虫属 (Schistosoma spp.)或原虫属(Plasmodium spp.)。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗原源自真菌病原体。

在本发明优选的实施方案中，所述抗原源自念珠菌属(Candida spp.)的真 菌病原体，优选为白色念珠菌(Candida albicans)。

在本发明优选的实施方案中，所述抗原是肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗 原。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗原是成瘾性药物。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述药物选自可卡因、烟碱或海洛 因。

本发明的再一方面提供使动物对抗原免疫的方法，包括以足够刺激引起 对所述抗原的免疫反应的有效量的本发明轭合物进行给药。

在本发明优选的方法中，所述动物为人。

在本发明另一优选的方法中，所述动物选自小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、 母牛、马、猪、狗、猫或羊。

在本发明进一步优选的方法中，所述免疫反应是产生抗体对所述轭合物 的作用。

在本发明另一优选的方法中，所述免疫反应是产生能识别所述轭合物的 抗原部分的辅助性T-细胞。

优选的给药途径是皮内、皮下、肌内或鼻内途径，然而所述致免疫方法 并不局限于具体的给药方式。

本发明的再一方面提供可通过本发明方法获得的抗体。

在本发明优选的实施方案中，所述抗体是治疗性抗体。

在本发明另一优选的实施方案中，所述抗体是诊断抗体。优选地，所述 诊断抗体带有标签或标记。

在本发明优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或其结合片段。优 选地，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。

嵌合抗体是通过重组方法制备的具有抗体的可变区和人抗体的不变区 或恒定区的抗体。

人源化抗体是通过重组方法制备的结合了抗体的补体决定区(CDRs)及 人抗体的恒定(C)区和来自可变(V)区的框架区的抗体。

嵌合抗体是所有的小鼠或大鼠抗体V-区与人抗体C-区结合的重组抗体。 人源化抗体是将来自啮齿动物抗体V-区的补体决定区与来自人抗体V-区的 框架区融合的重组杂交抗体。也使用人抗体的C-区。所述补体决定区(CDRs) 是抗体重链和轻链的N-末端功能域内的区域，V-区的主要变异都局限在该区 域。这些区域在所述抗体分子的表面形成环。这些环提供了抗体与抗原之间 的结合面。

来自非人动物的抗体激发了对异源抗体的免疫反应，以及将其从循环中 去除的作用。因为在所述重组杂交抗体中啮齿动物(即异源)抗体的量减少， 而人抗体区域不引起免疫反应，因此当注射入人类个体时，嵌合抗体和人源 化抗体均具有削弱的抗原性。这导致较弱的免疫反应以及所述抗体清除的降 低。显然，这是人类疾病治疗中使用治疗性抗体时所需要的。人源化抗体设 计为具有较少的“异源”抗体区域，因此被认为致免疫性小于嵌合抗体。

也能产生单独的可变区域，即所谓的单链抗体可变区片段(scFv’s)。如果 对特异单克隆抗体存在杂交瘤，则本领域所属技术人员很容易通过RT PCR 从所述杂交瘤中提取的mRNA中分离出scFv’s。可选择地，可进行噬菌体呈 现(phage display)筛选来鉴定表达scFv’s的克隆。可选择地，所述片段是“功 能域抗体片段”。功能域抗体是抗体的最小结合部位(约13kDa)。这种技术的 例子在美国专利第6,248,516、6,291,158、6,127,197号和欧洲专利第0368684 号中进行了公开，本文将其整体引入作为参考。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗体是调理素抗体。

吞噬作用是由巨噬细胞和多形(polymorphic)白细胞介导的，并且包括微 生物、受损或死亡细胞、细胞残骸、不溶粒子和活化凝血因子的摄取和消化。 调理素是促进上述异物的吞噬作用的试剂。因而，调理素抗体是能提供相同 功能的抗体。调理素的例子是抗体的Fc部分或补体C3。免疫作用产生的与 抗原结合的免疫复合物形式的抗体可通过在直接微环境中将补体固定在所 述抗原、分子上来发挥调理素作用。

本发明的再一方面提供制备产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系 的方法，包括如下步骤：

i)使用本发明的轭合物、组合物、核酸或载体使免疫活性 哺乳动物产生免疫；

ii)将致免疫后的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤 细胞融合形成杂交瘤细胞；

iii)对步骤(ii)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体进行筛选， 以获得对所述轭合物的抗原的有结合活性的抗体；

iv)对所述杂交瘤细胞进行培养来增殖和/或分泌所述单克 隆抗体；及

v)从所述培养上清中回收所述单克隆抗体。

优选地，所述免疫活性哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或者仓鼠。

本发明的再一方面提供可通过本发明方法得到的杂交瘤细胞系。

本发明的再一方面提供交联抗体及至少一个抗原的方法，其特征在于提 供了选择具有低抗体效价的轭合物的反应条件，其中所述抗体能够结合 CD28或CD40受体多肽。

本发明的再一方面提供了制备本发明轭合物的方法，包括对共轭反应混 合物进行分离。

在本发明优选的方法中，所述分离包括如下步骤：

i)提供由异源交联的抗体：抗原轭合复合物构成的反应混合物；

ii)将所述反应混合物分成含有规定大小的轭合物的部分；并且任 意地

iii)分离具有所需抗体效价的轭合物。

在本发明优选的方法中，所述部分含有抗体效价约为每个复合物平均5 抗体分子的轭合复合物。

在本发明进一步优选的方法中，所述部分含有抗体效价每个复合物1-4 抗体的复合物。

在本发明更进一步优选的实施方案中，所述部分含有抗体效价每个复合 物1-3抗体的复合物。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述部分含有两个抗体分子的复合 物。优选地，所述轭合物是与至少一个抗原连接的单个抗体。

在本发明优选的方法中，所述方法选自：尺寸排阻色谱法；亲和层析法； 示差沉淀方法。

以下将参照如下附图以示例方式提供了本发明的实施方案：

图l显示了抗-CD40抗体效价对一级抗-大鼠免疫反应的作用；及

图2显示了增加抗体效价对使用抗-CD40抗体的免疫反应的作用。

材料和方法

轭合物的抗体效价可通过多种途径改变，实际上存在本领域所属技术人 员公知的多种可行的途径来实现轭合过程。其示例性地包括以下实施例。

改变抗原的衍生度(degree of derivatisation)

使抗原与抗体交联的一种方法是对所述抗原使用例如sulfo-SMCC进行 马来酰亚胺修饰，然后将所述马来酰亚胺修饰的抗原与硫醇化的抗体(可使 用SATA或SPDP对抗体进行硫醇化)反应。

通过改变反应中sulfo-SMCC(硫基-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲 基)环己烷-1-碳酸酯)与抗原的相对浓度可以改变所述抗原的马来酰亚胺化 的程度。

另一种制备轭合物的方法使得能够对待测定抗原的衍生度进行精确的 测量。可使用交联剂SPDP(琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸盐)对所述 抗原进行硫醇化。SPDP在pH7-9条件下与含氨基的抗原反应，产生混合的 二硫化物。然后，通过用二硫苏糖醇进行还原，释放出2-吡啶硫酮发色团而 巯基基团仍保留在所述蛋白上。从释放的发色团的数量(通过吸光率测定)能 够计算出所述抗原上衍生作用的平均比例。显然，如果该比例为例如3个巯 基/抗原分子，则与sulfo-SMCC马来酰亚胺修饰的抗体形成的后续轭合物不 可能具有超过3的抗体效价。因此，控制衍生度进而控制每抗原分子的硫醇 残基的平均数量可限制轭合物的抗体效价。

另一种控制效价的方法是改变抗原上的反应基团的数目。因此，可使用 例如SPDP或SATA(除其它交联剂外)来向抗原上添加巯基基团。这些交联 剂均与伯胺反应，因此可与氨基末端残基或蛋白上其它位置的赖氨酸残基进 行反应。可以通过定点突变(site-directed mutagenesis)来从重组抗原上去除某 些赖氨酸残基。显然，可以通过改变合成过程来从肽中去除赖氨酸残基。当 然，如果所述抗原序列被改变，则需要重点确认该过程没有去除重要的抗原 决定簇。

衍生的蛋白反应中的抗原：抗体比例的改变

可改变反应混合物中的衍生后抗原和抗体的相对比例，其对形成的轭合 物的类型产生影响，其还依赖于所述两种组分的衍生度和相对尺寸。

不同尺寸的轭合物的纯化

可通过尺寸分离对所形成的轭合物进行纯化。例如通过凝胶过滤可将糖 蛋白D和200kDa-400kDa的抗体轭合物与更大的轭合物分离。这类轭合物 的每轭合物含有不超过两个抗体分子(每个约150kDa)。

纯化较低分子量的轭合物的可选方法是将聚乙二醇(PEG)连续加入所述 轭合物混合物中。沉淀较大的轭合物需要相对较低的PEG浓度，因而增加 浓度能沉淀尺寸逐渐减小的轭合物。PEG的替代物可以是诸如硫酸铵的盐。 同样，增加硫酸铵的浓度可导致尺寸逐渐减小的蛋白/轭合物的沉淀。随后， 可从通过透析重新溶解的沉淀中除去PEG或硫酸盐。

选择低效价而非小尺寸的轭合物的另一方法是通过在负载Fc-γ-受体-IIb 细胞外功能域的SepharoseCL4B上进行亲和层析来减少高效价的轭合物。只 有高效价的轭合物会粘附在所述柱上，或者可替代地，在0.15MP NaCl pH7.4 10mM Na Po4缓冲液的无梯度条件下，所述物质种类可依效价的次序洗脱， 即低效价先洗脱(在所述柱的“空隙容积(void volume)”中未吸附或吸附较弱) 或其后迅速洗脱。

通过对比已知标准的凝胶过滤或在某些条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳可评估纯化的轭合物的尺寸。然后还必须测定所述轭合物的活性，最重要 的是表明抗原决定簇完整性的与CD40或CD28结合的抗体的保留及抗原的 抗原性的保留。一种检验这两种活性的方法是使用CD40或CD28表达细胞 的流式细胞术(Flow cytometric)染色。将轭合物加入PBS中的细胞中，并在 冰上孵育30分钟。然后对细胞进行清洗，然后加入抗所述抗原的抗体(单克 隆或多克隆)在冰上保持30分钟。然后使用荧光标记的第二抗体对所述抗体 进行检测。只有与抗体结合(到CD40或CD28)且抗原的抗原决定簇完整的轭 合物才显示出阳性染色，并且方便进行致免疫性评估。

噬菌体PEG沉淀/纯化

已知15％的PEG可从血清中沉淀自由的IgG。因此，对复合物适用更低 的浓度，例如用于沉淀免疫复合物，或诸如以下的噬菌体病毒体(viron)的更 大的分子。

1.向SS-34 Oakridge管中加入30ml噬菌体储藏菌种(stock)；

2.加入7.5ml 20％PEG-8000/2.5M NaCl；

3.在冰上孵育30分钟或更长时间；

4.在11K下旋(spin down)噬菌体20分钟；

5.再旋转2-3x以除去所有的PEG溶液(使用微细管尖端帮助去除所有 的溶液)；

6.将噬菌体在STE(500-1000μl)中重悬；

7.转移至eppendorf并在14K旋转10分钟；

8.将上清转移至新的eppendorf并标记；

9.对噬菌体进行滴定。

STE：100ml中加入1ml 1M Tris(pH8)，0.2ml 0.5M EDTA(pH8)，2 ml 5M NaCl，高压灭菌。

PEG：100ml中加入20gm PEG-8000和14.6gm NaCl，过滤杀菌。

实施例1

与对照大鼠IgG2a相比，大鼠(IgG2a)抗-小鼠CD40在小鼠中诱导了及 大增强的抗大鼠IgG2a的免疫反应。为了评估抗-CD40效价对所述佐剂效果 的作用，制备不同CD40抗体效价的免疫原如下。

a.将单独的抗-CD40抗体或同种型(isotype)对照抗体作为免疫 原，效价为一个CD40抗体/“轭合物”(单体的(Monomeric))。

b.将抗-CD40或同种型对照抗体与抗-大鼠Ig抗体交联，得到的 效价为两个CD40抗体/轭合物(二体的(dimeric))。

c.将抗-CD40或同种型对照抗体与生物素基化的(biotinylated)抗- 大鼠Ig和抗生物素蛋白交联，得到多聚体轭合物(多体的(multimeric))。

为了确保每只小鼠都用等量的抗原混合物致免疫，向所述免疫原中加入 对照蛋白，从而使所述免疫原包括下列成分：

a)10ug CD40或同种型对照mAb，10μg小鼠IgG和5μg抗生素蛋白

b)10μg CD40或同种型对照mAb，10μg小鼠抗大鼠IgG和5μg抗生 素蛋白

c)10μg CD40或同种型对照mAb，10μg生物素基化的小鼠抗大鼠IgG 和5μg抗生素蛋白。

对5BALB/c雌性小鼠组进行腹膜内致免疫，10天后采血，并如前所述 通过ELISA分析血清的抗-大鼠IgG2a反应(Barr et al.Immunology 109 87-91，2003)。简而言之，在4℃将96孔ELISA板用10μg/ml PBS中的大 鼠IgG2a(GL117)包被过夜。第二天用1％PBS中的鱼胶将所述板封闭，并 用PBS/0.05％Tween清洗。制备系列的血清稀释液，在室温下孵育1小时并 清洗后，将多重吸附的(multiadsorbed)的轭合物(辣根过氧化物酶标记的山羊 抗-小鼠免疫球蛋白)(Sigma)加入孔中，并将所述板继续孵育1小时。然后再 次清洗所述板，并用基质(OPD，Sigma)孵育15分钟，并在490nm处读取。 滴定度表示为最高血清稀释度的倒数，在所述最高血清稀释度处测试血清表 现出比正常小鼠血清更高的OD值。结果如图1所示。

实施例2

轭合物效价的提高会降低所述抗体反应。用SPDP(Molecular probes，使 用Molecular probes提供的方案)对钥孔血蓝蛋白(Sigma)进行修饰，并通过二 硫苏糖醇还原来对巯基基团进行脱保护，随后进行透析。用sulfo-SMCC (Molecular probes，使用Molecular probes提供的方案)对抗-CD40或同种型对 照抗体进行马来酰亚胺修饰，并将所述修饰后的蛋白混合形成如下的轭合 物：

A)100％抗-CD40抗体(5mg抗体-1mg KLH)

B)10％抗-CD40，90％同种型对照抗体(5mg抗体-1mg KLH)

C)1％抗-CD40，99％同种型对照抗体(5mg抗体-1mg KLH)。

该方案涉及用来制备相同尺寸和抗原含量，但具有不同CD40抗体效价 的轭合物。

对3BALB/c雌性小鼠组进行腹膜内致免疫，10天后采血，并如前所述 通过ELISA分析血清的抗-KLH反应(Barr et al.Immunology 109 87-91， 2003)。简而言之，在4℃将96孔ELISA板用10μg/ml PBS中的KLH包被 过夜。第二天用1％PBS中的鱼胶将所述板封闭，并用PBS/0.05％Tween清 洗。制备系列的血清稀释液，在室温下孵育1小时并清洗后，将多重吸附的 (multiadsorbed)的轭合物(辣根过氧化物酶标记的山羊抗-小鼠免疫球蛋白) (Sigma)加入孔中，并将所述板继续孵育1小时。然后再次清洗所述板，并用 基质(OPD，Sigma)孵育15分钟，并在490nm处读取。滴定度表示为最高血 清稀释度的倒数，在所述最高血清稀释度处测试血清表现出比正常小鼠血清 更高的OD值。

结果如图2所示。用所述1％ CD40轭合物致免疫的小鼠表现出最强的 抗KLH抗体反应。因为据估计SPDP修饰作用可产生200个反应位点/KLH 分子，因此C组中所用的轭合物的估计最大CD40抗体效价为2分子抗 -CD40/KLH分子。