概括地说，本发明描述了改进的克隆哺乳动物的方法、以及将染 色体、细胞核或染色质团插入受体细胞的方法。

哺乳动物的克隆能够产生多个DNA内容等同的哺乳动物。用于产 生这些哺乳动物的供体遗传物质可以通过选择或基因工程方法获得， 从而使克隆的哺乳动物具有所要求的性质，例如对疾病抗性的增强。 但遗憾的是，用供体的体细胞克隆哺乳动物的有效率一般是很低的， 只能导致约1-2％的核移植胚胎发育至足月(Polejaeva等，Nature 407：86-90，2000)。克隆的一个严重问题是后代在妊娠中晚期的丢失 或存活率低。因此，需要有更有效的方法来克隆哺乳动物。这些改进 的方法有可能减少产生多个存活后代所需要的成本和时间。

                      发明概述

本发明的目的是提供改进的克隆哺乳动物的方法。尤其是，这些 方法包括将供体细胞核凝聚成染色质团，使细胞核的成分，例如转录 因子，可以释放出来，该转录因子可促进某些基因的转录，而这些转 录对核移植的胚胎发育成存活的后代来说是不希望有的。在有关的方 法中，透化细胞与改变程序(reprogramming)的培养基(如细胞提取 物)一起温育，使某些因子进入细胞，或从细胞去除，然后使该透化 细胞的原生质膜重新封闭而将所需要的因子包入，并恢复该细胞膜的 完整性。必要时，可重复这些方法中的任何步骤1次或多次，或可连 续进行不同的改变程序的方法，以增加改变程序的程度，导致克隆的 胎儿具有更大的存活能力。本发明还提供产生嵌合胚胎的方法，该嵌 合胚胎中，一些或全部的胎盘组织来自于一种遗传源，而大部分胎儿 组织来自另一种遗传源。这些嵌合胚胎的胎盘异常性较少，从而使其 存活率增加。此外，还建立了一种新的将染色质团或细胞核插入受体 卵母细胞中的方法，该方法包括致融合(fusigenic)化合物的使用。

因此，第一方面，本发明提供一种克隆哺乳动物的方法。该方法 包括(a)将包含少于4套同源染色体(即含有少于2对完全染色单体) 的供体细胞核在使染色质团形成而不引起DNA复制的条件下进行温 育，(b)将染色质团插入去核的卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞， 以及(c)在使核转移卵母细胞或胚胎发育为胎儿的条件下，将该核转 移卵母细胞或由该核转移卵母细胞形成的胚胎转移至宿主哺乳动物的 子宫。在优选的实施方案中，在使细胞核或细胞质的成分，例如转录 因子、阻遏蛋白或染色质重塑蛋白能加入细胞核或所产生的染色质团 中，或从其中除去的条件下，将供体细胞核与改变程序的培养基(如 细胞提取物)一起温育。优选供体细胞核在使染色质团形成的条件下 与一种或多种下述的物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝 分裂提取物、去污剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。在其他优选的 实施方案中，重建的卵母细胞或所产生的胚胎的核纤维蛋白A，核纤维 蛋白C，或NuMA蛋白的表达水平比细胞数相同并来源同一物种的对照 卵母细胞或对照胚胎的相应表达水平高不到5倍。

在相关的方面，本发明提供另一种克隆哺乳动物的方法。该方法 包括使透化细胞与改变程序的培养基(例如细胞提取物)在使某种因 子(例如，细胞核或细胞质的成分，如转录因子)能从透化细胞的细 胞核、染色质团、或染色体中除去、或将某种因子加入该细胞核、细 胞质团、或染色体中的条件下温育，从而形成改变程序的细胞。将该 改变程序的细胞插入去核的卵母细胞，然后将所产生的卵母细胞或由 此卵母细胞形成的胚胎，在使卵母细胞或胚胎能发育成胎儿的条件 下，转移至宿主哺乳动物的子宫中。在优选的实施方案中，该透化细 胞在使染色质团形成的条件下与一种或多种下述物质接触：在抗NuMA 抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐的溶液、或蛋 白激酶溶液。还有一个实施方案中，透化细胞与分裂间期的改变程序 培养基(例如分裂间期的细胞提取物)一起温育。在另外还有一个优 选的实施方案中，透化细胞中的细胞核仍保持膜包围的状态，而且核 中的染色体在与该分裂间期的改变程序培养基温育期间不凝聚。在某 些实施方案中，透化细胞在改变程序培养基中温育不会引起该细胞的 DNA的复制，或者仅引起少于50、40、30、20、10或5％的细胞的DNA 复制。在其他实施方案中，透化细胞在改变程序培养基中的温育至少 引起60、70、80、90、95、或100％的细胞的DNA复制。在各种实施方 案中，通过使完整细胞与去污剂，如毛地黄皂苷、或细菌毒素，如链 球菌溶血素O，一起温育而形成透化细胞。还有另一个优选的实施方案 中，改变程序的细胞在使该细胞的膜重新封闭的条件下进行温育，然 后将其插入卵母细胞。在其他优选的实施方案中，重建的卵母细胞或 所产生的胚胎的核纤维蛋白A、核纤维蛋白B、或NuMA蛋白的表达水 平比细胞数相同并来源同一物种的对照卵母细胞或对照胚胎的相应表 达水平高不到5倍。

本发明还提供包括使用来自两种不同胚胎的细胞克隆哺乳动物的 方法。例如，来源于核转移胚胎(例如，通过将细胞、细胞核、或染 色质团插入去核卵母细胞而形成的胚胎)的细胞可以与来源于体外受 精的、自然产生的、或单性激活的胚胎的细胞结合。优选来源于核转 移胚胎的大部分细胞及其后代掺入所产生的嵌合胚胎的胎儿组织中。 优选至少来源于第二胚胎的一些细胞及其后代进入胎盘组织中，并提 高所产生的嵌合胚胎的存活力。

因此，在一个方面，本发明描述了一种克隆哺乳动物的方法的特 征，该方法包括将细胞、细胞核，或染色质团插入去核的卵母细胞中， 以而形成第一胚胎。一个或多个来源于第一胚胎的细胞与一个或多个 来源于体外受精的、自然产生的，或单性激活的第二胚胎的细胞接触， 形成第三胚胎。将此第三胚胎在使第三胚胎能发育成为胎儿的条件下 转移至宿主哺乳动物的子宫中。在一个实施方案中，至少第一胚胎和 第二胚胎之一是致密(compaction)的胚胎。在另一个实施方案中， 第一胚胎和第二胚胎处于不同细胞时期。第一胚胎和用来产生第二胚 胎的供体细胞可以来自同一个种，或来自不同的属或种。优选胎儿的 滋养外胚层或胎盘组织中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、 90、95或100％的细胞来自第二胚胎，或者在胎儿的内层细胞团或胎 组织中，至少30、40、50、60、70、80、90、95或100％的细胞来自 第一胚胎。在另一个优选的实施方案中，第一胚胎或第三胚胎的核纤 维蛋白A、核纤维蛋白C、或NuMA蛋白的表达水平比细胞数相同并来 源于同一个物种的对照卵母细胞或对照胚胎的相应表达水平高不到5 倍。

在相关的方面，本发明描述了另一种克隆哺乳动物的方法的特 征。该方法包括在使染色质团形成的条件下，使供体细胞核与改变程 序的培养基(例如细胞提取物)接触；并将此染色质团插入去核的卵 母细胞，以而形成第一胚胎。一个或多个来源于第一胚胎的细胞与一 个或多个来源于体外受精的、自然产生的，或单性激活的第二胚胎的 细胞接触，形成第三胚胎。将此第三胚胎在使第三胚胎能发育成为胎 儿的条件下，转移至宿主哺乳动物的子宫中。在优选的实施方案中， 染色质团形成的方法是，使含有少于4套同源染色体的供体细胞核在 使染色质团形成、而又不引起DNA复制的条件下，与改变程序培养基 接触。优选细胞核在使染色质团形成的条件下，与一种或多种下述物 质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和 /或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。在各种实施方案中，第一胚胎和第二 胚胎都是致密的胚胎；  第一胚胎和第二胚胎都是前致密 (precompaction)的胚胎，或者其中之一胚胎是致密的胚胎，而另一 个胚胎是前致密的胚胎。第一胚胎和第二胚胎可以处于不同的细胞时 期，或处于同一细胞时期。第一胚胎和用来产生第二胚胎的供体细胞 可以来自同一个种，或来自不同的属和种。优选胎儿的滋养外胚层或 胎盘组织中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100 ％的细胞来自第二胚胎，或者在胎儿的内层细胞团或胎组织中，至少 30、40、50、60、70、80、90、95或100％的细胞来自第一胚胎。在 另一个优选的实施方案中，第一胚胎或第三胚胎的核纤维蛋白A、核纤 维蛋白C、或NuMA蛋白的表达水平比细胞数相同并来源于同一个物种 的对照卵母细胞或对照胚胎的相应表达水平高不到5倍。

在另一个相关的方面，本发明描述了另外的一种克隆哺乳动物的 方法的特征。该方法包括，在使某种因子从透化细胞的细胞核、染色 质团、或染色体中除去，或使改变程序培养基中的某种因子加入该细 胞核、染色质团，或染色体中的条件下，使透化细胞在改变程序的培 养基(例如，细胞提取物)中温育，从而形成改变程序的细胞。将此 改变程序的细胞插入去核卵母细胞中，即可形成第一胚胎。一个或多 个来源于第一胚胎的细胞与一个或多个来源于体外受精的、自然产生 的、或单性激活的第二胚胎的细胞接触，形成第三胚胎。该第三胚胎 在使第三胚胎能发育成为胎儿的条件下，转移至宿主哺乳动物的子宫 中。在优选的实施方案中，在使细胞核或细胞质的成分，例如转录因 子，加入该细胞核或所产生的染色质团中、或从其中除去的条件下， 使透化细胞与改变程序的培养基(例如细胞提取物)温育。在其他优 选的实施方案中，透化细胞在使染色质团形成的条件下，与一种或多 种下述物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、 去污剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。在另外一个优选的实施方案 中，透化细胞与分裂间期的改变程序培养基(例如分裂间期的细胞提 取物)一起温育。在还有一个优选的实施方案中，透化细胞中的细胞 核仍保持膜包围的状态，而且核中的染色体在与该分裂间期的改变程 序的培养基温育期间不凝聚。在某些实施方案中，透化细胞在改变程 序的培养基中温育不会引起该细胞的DNA的复制，或者仅引起少于 50、40、30、20、10或5％的细胞的DNA复制。在其他实施方案中， 透化细胞在改变程序的培养基中温育至少引起60、70、80、90、95或 100的细胞的DNA复制。在各种实施方案中，通过使完整细胞与去污 剂，例如毛地黄皂苷、或细菌毒素，如链球菌溶血素O，一起温育而形 成透化细胞。还有另一个优选的实施方案中，改变程序的细胞在使该 细胞的膜重新封闭的条件下进行温育，然后再将其插入卵母细胞中。 在不同的实施方案中，第一胚胎和第二胚胎都是致密的胚胎；第一胚 胎和第二胚胎都是前致密的胚胎，或者其中之一个胚胎是致密的胚 胎，而另一个是前致密的胚胎。第一胚胎和第二胚胎可以处于不同的 细胞时期，或处于同一细胞时期。第一胚胎和用来产生第二胚胎的供 体细胞可以来自同一个种，或来自不同的属和种。优选胎儿的滋养外 胚层或胎盘组织中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95 或100％的细胞来自第二胚胎，或者在胎儿的内层细胞团或胎组织中， 至少30、40、50、60、70、80、90、95或100％的细胞来自第一胚胎。 在另一个优选的实施方案中，第一胚胎和第三胚胎的核纤维蛋白A、核 纤维蛋白C，或NuMA蛋白的表达水平比细胞数相同并来源于同一个物 种的卵母细胞或对照胚胎的相应表达水平高不到5倍。

在上述用两个胚胎的细胞克隆哺乳动物的方法的任何一个优选的 实施方案中，在来自每个胚胎的细胞相互接触之前，要将第一胚胎或 第二胚胎的部分或全部透明带除去。在一个实施方案中，将来自第一 和第二胚胎的细胞在溶液内或固体支持物上相互邻近地放置而使其接 触。在另一个实施方案中，采用标准的技术将第一胚胎的细胞注射入 第二胚胎。该细胞可以注入第二胚胎的任何区域，例如透明带和胚胎 本身之间胚胎周边。自然产生的胚胎的例示包括，使用标准方法通过 手术方法或非手术的方法从妊娠的哺乳动物(例如牛)中取出的胚胎。 也可以预期，由来自二个以上胚胎的细胞(例如来自3、4、5、6或更 多个胚胎的细胞)也可以结合而形成嵌合的胚胎来产生克隆的哺乳动 物。

在上述几个方面的任何优选实施方案中，改变程序的培养基(例 如细胞提取物)可以通过增加或耗尽某种因子，例如DNA甲基转移酶、 组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、细胞核纤层蛋白、转录因子、 激活蛋白、阻遏蛋白，来加以改进。在其他优选的实施方案中，在卵 母细胞或嵌合胚胎中NuMA或AKAP95蛋白在细胞核中的表达水平比在 细胞质中至少高2、5、10或20倍。在还有其他的实施方案中，用含 有0.1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I和100mM或300mM的NaCl的溶液，抽提出卵母细胞或嵌合胚胎中至少30，40，50，60，70，80， 90或100％的AKAP95蛋白。优选染色质团在插入去核卵母细胞之前， 先从改变程序的培养基(例如提取物)中纯化。在另一个优选实施方 案中，将染色质团插入去核卵细胞的步骤包括，用致融合化合物在使 染色质团进入卵母细胞的条件下，使染色质团与卵母细胞接触。还有 另外一个实施方案中，胎儿发育成存活的后代。优选至少1、3、5、10、 20、30、40、50、60、70、80或90％的核转移卵母细胞或胚胎发育成 存活的后代。在该方法中，含有染色质团或改变程序细胞的卵母细胞 在使细胞分裂的条件下培养，而且所产生的细胞之一可以再克隆一次 或多次。本方法中所用的供体细胞核、供体染色质团、或供体细胞和 卵母细胞可以来自同一个种，或可以来自不同的种或属。所说的哺乳 动物可以是人或非人的哺乳动物，而所说的卵母细胞可以是受精的或 未受精的。优选供体细胞核、染色质团，或透化细胞是来自G1或G0期 的细胞。此外，优选克隆的胚胎、胎儿、或哺乳动物的基因组DNA与 供体细胞的基因组DNA基本上是相同的。也可以预期、有可能将染色 质团或改变程序的细胞插入胚胎中，来生产含有细胞混合物的嵌合胚 胎、胎儿或哺乳动物，该细胞混合物是以下两种细胞的混合物：DNA 基本上与染色质团或改变程序的细胞的DNA相同的细胞，和DNA基本 上与自然产生的胚胎细胞的DNA相同的细胞。还可以预期，去核卵母 细胞可以用于本发明的方法中。

用于上述本发明任何一个方面的改变程序的培养基中，可以含 有、也可以不含有外源核苷酸。在其他优选的实施方案中，改变程序 培养基中的染色质团、或在透化细胞中形成的染色质团与含有编码目 的基因的核酸的载体接触，在使载体中的核酸与染色质团的基因组中 相应的核酸随机整合、或同源重组的条件下，引起染色质团基因组的 改变。由于缺少完整的质膜和细胞核膜，在透化细胞中或在溶液中的 染色质团比自然产生的细胞更容易修饰。可以用来产生改变程序提取 物的细胞的例子包括，胚胎干细胞和来自脑、血液、骨髓、胰脏、肝 脏、皮肤，或任何其他器官或组织的成体的干细胞。其他可作为改变 程序的细胞提取物的示例包括卵母细胞提取物(例如，牛或海胆卵母 细胞提取物)，和雄性生殖细胞提取物(例如脊椎动物、非脊椎动物、 哺乳动物，例如牛的精原细胞、精母细胞，或精子提取物)。上述供 体或透化细胞可以是非无限增殖化的、或天然、自发或遗传上无限增 殖化的。供体细胞、透化细胞、受体细胞或胞质体的来源可以是任何 年龄的，例如胚胎、胎儿、青年或成年的哺乳动物。较年青来源的细 胞发生自发突变可能性较小，从而在插入卵母细胞后可能有较长的寿 命。

本发明也提供了将染色体、染色质团或细胞核插入受体细胞的方 法。这些方法可用于将供体的遗传物质转移到用来克隆哺乳动物的受 体卵母细胞中。这些方法也可以用于一种细胞的遗传物质被另一种细 胞的遗传物质所取代。

根据本发明的这个方面，提供了一种将染色体或染色质团插入受 体细胞的技术，该技术包括用致融合化合物在使染色体或染色质团进 入受体细胞的条件下使染色体或染色质团与细胞接触。在一个优选的 实施方案中，染色体或染色质团与致融合化合物一起温育，然后与受 体细胞接触。该染色体或染色质可以是凝聚的或不凝聚的，而且染色 体和染色质可以来自相同的种，或可以来自不同的种或属。在另一个 优选的实施方案中，受体细胞是受精的或未受精的卵母细胞。优选所 说的受体细胞或染色体是来源于人或非人的哺乳动物。在各种实施方 案中，该受体细胞是成体的、胎儿的或胚胎的细胞。在一个特别优选 的实施方案中，将供体细胞所有的染色体插入受体细胞中。优选该受 体细胞是单倍体(DNA含量为n)、二倍体(2n)、或四倍体(4n)， 以及该受体细胞是亚二倍体(DNA含量少于2n)、单倍体或去核的。 在另一个实施方案中，染色体来源于一种以上的供体细胞，例如二种 单倍体细胞。在还有一个优选的实施方案中，在使染色质团形成、而 又不引起DNA复制的条件下，通过使含有少于4套同源染色体的供体 细胞核与有丝分裂提取物、去污剂和/或盐、或蛋白激酶接触而得到染 色体。优选的致融合化合物包括聚乙二醇(PEG)、和脂，例如 Lipofectin、Lipofectamin、DOTAP{N-[1-(2，3-二油酰氧)丙 基]-N，N，N，-三甲铵基硫酸甲酯；C43H8-3NO8S}、DOSPA{2，3-二油酰 氧-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N，-二甲基-1-丙铵三氟乙酸}， 和DOPE{二油酰磷脂酰乙醇胺}。其他优选的脂包括中性的和单价或多 价的阳离子脂，例如含有季铵基团的脂。另外的优选的脂有胆固醇的 组成成分，例如由胆固醇中的羟基与脂的基团反应而形成的脂。还有， 其他优选的脂含有饱和的或不饱和的脂肪酸，优选这些脂肪酸含有包 括5-10、10-15、15-20，或20-30个在内的碳原子。这些脂可以是用 标准的化学技术合成的、由天然存在的来源获得的、或从市场购买的 (Summers等，Biophys J.71(6)：3199-206，1966)；Nabekura 等，Pharm Res.13(7)：1069-72，1996；Walter等Biophys J.66 (2 pt 1)：366-376，1994；Yang等，Biosci 13(3)：143-157， 1993；Walter和Siegel，Biochemistry.6：32(133271-3281， 1993)。其他优选的致融合化合物是磷脂，例如海胆卵的膜泡部分或 其他来源的磷脂(Collas和Poccia，J.of Cell Science 109，1275： 1283，1996)。最好染色体与膜囊泡部分接触不会使染色体被完整的 膜包成囊状物。

在相关的方面，本发明提供一种将细胞核插入受体细胞的方法， 该方法包括用致融合化合物在使细胞核进入受体细胞的条件下，使细 胞核与细胞接触。致融合化合物或者是脂，或者不是由相同单体组成 的聚合物。优选细胞核与致融合化合物一起温育，然后再与受体细胞 接触。在各种实施方案中，细胞核和受体细胞来源于同一个种，或来 源于不同的种或不同的属。优选该细胞核是单倍体、二倍体或四倍体， 以及受体细胞是亚二倍体、单倍体、或去核的。在一个优选的实施方 案中，细胞核来源于人或非人的哺乳动物。在其他实施方案中，该受 体细胞是成体的、胎儿的，或胚胎的细胞。优选的致融合化合物是脂， 例如Lipofectin、Lipofectamin、DOTAP、DOSPA、DOPE。其 他优选的脂包括中性的脂和单价或多价阳离子的脂，例如含有季铵基 团的脂。另外的优选的脂含有胆固醇的组成成分，或者饱和或不饱和 的脂肪酸，优选该脂肪酸含有包括5-10、10-15、15-20，或20-30个 在内的碳原子。其他优选的致融合化合物是磷脂、例如海胆卵膜囊泡 部分或其他来源的磷脂(Collas和Poccia，同上)。最好核细胞与膜 囊泡部分的接触不会使细胞核被完整膜包成囊状物。

在本发明的各种方面的优选实施方案中，上述细胞核或染色体来 源于成体、胎儿或胚胎的细胞。该细胞核或染色体也可从下述任何一 种优选的供体细胞中获得，或它们可以插入下述任何一种优选的受体 细胞中。优选的细胞的例子包括分化的细胞，例如上皮细胞、神经细 胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、 B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细 胞和肌肉细胞；以及未分化的细胞，例如胚胎细胞(例如干细胞和胚 胎的生殖细胞)。在另一个优选的实施方案中，该细胞来源于雌性的 生殖系统，例如乳腺、卵丘、颗粒层、或输卵管细胞。其他优选的细 胞包括胎儿细胞和胎盘细胞。优选的细胞还包括来源于器官的细胞， 例如膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝脏、肺、卵 巢、胰脏、前列腺、脊髓、脾脏、胃，睾丸、胸腺、甲状腺、气管、 输尿管、尿道，和子宫的细胞。优选的非人哺乳动物包括牛属的成员。 其他优选的哺乳类动物包括母牛、绵羊、大角羊、山羊、野牛、羚羊、 公牛、马、驴、骡、鹿、麋鹿、北美驯鹿、水牛、骆驼、无峰驼、羊 驼、兔、猪、小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠和灵长目动物如猴。还有其他 的优选实施方案中，该细胞核、透化细胞，或染色体来源于转基因细 胞或哺乳动物，或者包含未在供体细胞中或天然存在的细胞中发现的 突变。

优选的转基因供体细胞核和供体细胞能编码使克隆的哺乳动物对 疾病和寄生虫的抗性提高的蛋白。另外，该供体细胞核或供体细胞可 以通过基因工程方法使克隆的哺乳动物产生重组的产物，例如在牛的 尿、血液或乳中产生人的蛋白。例如，通过插入在尿空斑蛋白启动子 调控下的编码人蛋白的多聚核苷酸序列，该人蛋白可以在牛的尿中表 达。可在克隆牛的乳中产生的治疗蛋白的例子包括人单克隆抗体和人 凝血因子，例如因子I-XIII中的任何一种(Voet和Voet， Biochemistry，John Wiley&Sons，New York，1990)。这些异源蛋 白可以在促乳素启动子或其他适合于在牛乳中表达的启动子的调控下 表达。为了在克隆的哺乳动物的乳、血或其他体液中生产人的抗体， 可以采用标准的方法，使抗体重链或轻链的内源基因失活或“敲除”， 这样，供体细胞核就不再编码有功能的抗体；然后将编码人IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM的重链和轻链的基因插入供体细胞核的基因组中。由 上述或其他组织或体液得到的重组蛋白可以用标准的纯化方法进行纯 化(参见，例如Ausubel等，同上)。

还可以预期，用本发明的方法由胚胎、胎儿或成年哺乳动物产生 的细胞、组织或器官可以用作医药应用的材料来源，例如治疗和预防 人类的疾病。例如，由克隆的胚胎可以在体外发育成细胞、组织或器 官，然后转移到哺乳动物中(例如人)；可以从克隆的哺乳动物中取 出并转移到不同物种的另一个哺乳动物中；或可以从克隆的哺乳动物 中取出，并转移到同一个物种的另一个哺乳动物中。例如，可以将克 隆的哺乳动物的神经元组织移植到人神经系统的合适区域，以治疗、 预防或稳定神经病学的疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森氏病、享廷 顿舞蹈病、或ALS；或者治疗、预防或稳定脊髓损伤。特别是，退化的 或受损伤的神经元细胞可以用克隆的哺乳动物相应的细胞来替换。这 种移植方法也可以用于治疗、预防或稳定自身免疫疾病，包括，但不 限于，胰岛素依赖性糖尿病、风湿性关节炎、普通天疱疮、多发性硬 化症、以及重症肌无力。在这些方法中，受到受体的自身免疫系统攻 击的细胞可以被移植细胞所取代。克隆的哺乳动物也可以用作软骨、 骨髓，或其他组织或器官的来源。

为了生产以克隆的哺乳动物为来源的供体移植材料，最好对用来 产生克隆的哺乳动物的供体细胞核或供体细胞进行修饰，使其能编码 异源的MHC I类蛋白，该蛋白的氨基酸序列与接受供体材料的受体哺 乳动物的MHC I类蛋白的序列基本上相同。或者，该供体的细胞核可 以编码异源的MHC I类蛋白，该蛋白的氨基酸序列与另一个与受体哺 乳动物同属或同种的哺乳动物的MHC I类蛋白的序列基本上相同。这 些来源于表达异源MHC蛋白的克隆的哺乳动物的供体细胞、组织或器 官在其供给受体哺乳动物时，诱发不利的免疫应答的可能性较小。其 他优选的供体移植材料可以从如以下所述的克隆的哺乳动物获得，该 哺乳动物采用经修饰后可以表达异源蛋白的供体细胞核或供体细胞产 生，其中所说的异源蛋白抑制受体哺乳动物的补体途径，例如人补体 抑制剂CD59或人补体调节剂衰变加速因子(h-Daf)(参见，例如， Ramirez等，Transplantation 15：989-998，2000；Costa等， Xenotrasplantion 6：6-16，1999)。在还有另外一个实施方案中，供 体细胞核或供体细胞有突变，该突变降低或消除了半乳糖基转移酶的 表达或其活性，例如α-(1，3)半乳糖基转移酶(Tearl等， Transplantation 61：13-19)。该酶以糖类修饰细胞的表面分子，当 表达这种半乳糖的α-(1，3)半乳糖表位的细胞施用给人时，这种修 饰会诱发不利的免疫应答。因此，这种表位的表达水平较低的供体移 植材料被受体哺乳动物排斥的机率也较低。

这里所用的“染色质团”是指无细胞膜包围的一种以上的染色体。 优选该染色质团含有细胞的所有染色体。含有凝聚的染色体的人工诱 导的染色质团可以按本说明书所述，通过将细胞核置于有丝分裂改变 程序培养基(如有丝分裂提取物)中而获得。或者，含有凝聚的或部 分凝聚的染色体的人工形成的染色质团可以按本说明书所述，使细胞 核置于下述物质之一中而产生：含有抗NuMA抗体的有丝分裂提取物、 去污剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液。染色质团可以含有分开的物 理上不触及的染色体，或可以含有两种或两种以上物理上接触的染色 体。

必要时，染色体凝聚的水平可以采用标准方法，通过测定DNA染 色剂DAP I的染色强度来确定。随着染色体的凝聚，染色的强度增加。 因此，该染色体的染色强度可以与分裂间期的解凝的染色体(设定为0 ％凝聚)、和有丝分裂期最大凝聚的染色体(设定为100％凝聚)的染 色强度比较。根据该比较，可确定最大凝聚的百分数。优选凝聚的染 色质团是至少50、60、70、80、90或100％凝聚的。优选解凝或部分 凝聚的染色质团是少于50、40、30、20、或10％凝聚的。

“细胞核”是指含有细胞中大部分或所有DNA的膜包围的细胞器。 该DNA以凝聚的形式装入染色体中。优选将DNA包起来的膜包含一种 或两种脂双层或具有核孔蛋白。

“含有少于4套同源染色体的细胞核”是指DNA含量少于4n的细 胞核，其中的“n”是指特定的属或种的哺乳动物的正常单倍体染色体 组中的染色体数。这种细胞核不含有4个拷贝的每种基因或基因座。 优选该细胞核是二倍体，从而含有二套同源的染色体，但具有少于二 个完整的染色单体对。

“原核”是指由减数分裂或细胞核转移原核产生的单倍体细胞 核。雌性的原核是与雄性原核融合之前的卵母细胞或卵核。雄性原核 是进入卵母细胞或卵后、但与雌性原核融合之前的精子细胞核。核转 移原核是供体细胞、细胞核或染色质团导入卵母细胞后形成的原核(例 如，二倍体原核)。核转移原核含有少于4套的同源染色体。

“供体细胞”是指细胞核或染色质团所来源的细胞、或透化细胞。

“透化作用”是指在质膜上形成孔，或部分去除或完全去除质膜。

“改变程序的培养基”是指某种溶液，该溶液可以除去细胞、细 胞核、染色质团，或染色体中的某种因子，或使溶液中的某种因子加 入细胞、细胞核、染色质团，或染色体中。优选某种因子的加入或除 去可增加或降低mRNA或蛋白在供体细胞、染色质团、或细胞核中，或 在含有改变程序的染色质团或细胞核的细胞中的表达水平。在另一个 实施方案中，相对于供体细胞的表型来说，透化细胞、染色质团，或 细胞核在改变程序的培养基中温育，改变了透化细胞、或含有改变程 序的染色质团的细胞或细胞核的表型。在另外还有一个实施方案中， 透化细胞、染色质团，或细胞核在改变程序的培养基中温育，造成透 化细胞或含有改变程序的染色质团的细胞或细胞核获得或丢失与供体 细胞有关的活性。

改变程序的培养基的示例包括溶液，如缓冲液，该溶液不含有生 物分子，例如蛋白或核酸。这些溶液可以用来除去细胞核、染色质团、 或染色体中的一种或多种因子。其他优选的改变程序培养基是提取 物，例如由细胞核、细胞质或其组合提取的细胞提取物。细胞提取物 的范例包括由卵母细胞(例如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物的卵 母细胞)、雄性生殖细胞(例如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物的 生殖细胞，例如精原细胞、精母细胞、精子细胞或精子)、和干细胞 (例如成体或胚胎的干细胞)。还有其他的改变程序培养基是加入了 一种或多种天然存在的或重组的因子(例如核酸或蛋白，如DNA甲基 转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因 子、激活蛋白、阻遇蛋白、染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细 胞因子，或其他激素)的溶液或提取物，或除去了一种或多种因子的 提取物。还有其他的改变程序的培养基包括去污剂溶液(例如0.01％ -0.1％、0.1％-0.5％、或0.5％-2％的离子或非离子型去污剂，例如 一种或多种下列去污剂：SDS、Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、 脱氧胆酸钠、正丁基葡萄糖苷、Nonidet P 40、IGEPAL、Tween 20、 Tween 40或Tween80)、盐(例如约0.1、0.15、0.25、0.5、0.75、 1、1.5，或2M的NCl或KCl)溶液、多胺(例如约1μM、10μM、100μM、 1mM或10mM精胺、亚精胺、鱼精蛋白，或聚L赖氨酸)、蛋白激酶(例 如依赖细胞周期蛋白蛋白的激酶1、蛋白激酶C、蛋白激酶A、MAP激 酶、依赖于钙/钙调蛋白的激酶、CK1酪蛋白激酶，或CK2酪蛋白激酶)， 和/或磷酸酶抑制剂(如，约10μM、100μM、1mM、10mM、50mM、100mM 的一种或多种下列抑制剂：原钒酸钠、焦磷酸钠、氟化钠、NIPP1、抑 制剂2、PNUTS、SDS22、AKAP149，或ocadaic酸)。在某些实施方案 中，改变程序培养基含有抗-NuMA抗体。必要时，可同时或连续使用多 种改变程序培养基，以改变供体细胞、细胞核或染色质团的程序。

“分裂间期改变程序培养基”是指引起染色质解凝和细胞核被膜 破裂的某种培养基(例如，分裂间期的细胞提取物。)。

“有丝分裂改变程序的培养基”是指某种引起染色质凝聚和细胞 核被膜破裂的培养基(例如，有丝细胞提取物)。

“改变程序的细胞”是指一种暴露于改变程序的培养基的细胞。 优选至少1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、300或 更多种mRNA或蛋白分子在改变程序的细胞中表达，而这些mRNA或蛋 白质分子在供体或透化细胞中是不表达的。在另一优选的实施方案 中，在改变程序的细胞中表达，而不在供体或透化细胞中表达的mRNA 或蛋白分子为1-5、5-10、10-25、25-50、50-75、75-100、100-150、 150-200，或200-300种。优选至少1、5、10、15、20、25、50、75、 100、150、200、300或更多种mRNA或蛋白分子在供体或透化细胞中 表达而不在改变程序的细胞中表达。在还有另一个优选的实施方案 中，在供体或透化细胞中表达，而不在改变程序的细胞中表达的mRNA 或蛋白分子数为1-5、5-10、10-25、25-50、50-75、75-100、100- 150、150-200，或200-300。还有一个实施方案中，这些mRNA或蛋白 分子在供体细胞(即供体或透化的起始细胞)和改变程序的细胞中表 达，但在这些细胞中的表达水平在用标准方法测定时至少相差2、5、 10或20倍(参见，例如，Ausubel等，Current Protocol in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，2000)。

“加入某种因子”是指使某种因子与染色质、染色体，或核被膜 的成分，例如核膜或核基质结合。或者将该因子输入细胞核，使它被 核被膜包围，或被核被膜封入。优选与染色体结合或位于细胞核内的 因子的量至少增加25、50、75、100、200或500％。

“除去某种因子”是指某种因子从染色质、染色体，或核被膜的 成分上，例如核膜或核基质上解离。或者，该因子由细胞核输出，从 而不再由核被膜包围或被核被膜封入。优选与染色体结合或位于细胞 核内的因子的量至少减少25，50，75，100，200或500％。

“因子的富集或耗竭”是指加入或除去的天然存在或重组的因子 的量至少为起始存在于改变程序培养基(例如，细胞提取物)中的该 因子的量的25、40、60、80或100％。或者，也可以加入天然存在或 重组的、而在改变程序培养基中天然不存在的因子。优选的因子包括 蛋白质，例如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、精蛋白、 核纤层蛋白、转录因子、激活蛋白和阻遏蛋白、膜泡和细胞器。在一 个优选的实施方案中，如以下所述，先将该因子纯化，然后加入改变 程序的培养基中，或者，可采用下述的一种纯化方法，以除去改变程 序的培养基中不希望有的因子。

“纯化”是指与和它天然共存的其他成分分离。通常，按重量计， 某种因子在其有50％不含有与其天然组合在一起的蛋白质、抗体，和 天然存在的有机分子时，则可认为该因子基本上是纯的。优选该因子 按重量计至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％是纯的。基本 上纯的因子可以通过以下方法获得：化学合成、从天然来源中分离出 该因子、或在重组宿主细胞中生产该因子，而该天然的宿主细胞是不 产生该因子的。蛋白、囊泡、和细胞器可以由本领域技术人员采用标 准技术进行纯化，例如Ausubel等所述的技术(Current Protocol in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，2000)。优选纯化 后的因子在用聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、光密度、HPLC分析、或 Western分析(Ausubel等，同上)测定时，其纯度至少为起始材料的 2、5、或10倍。优选的纯化方法包括免疫沉淀法、柱层析，例如免疫 亲和层析、磁珠免疫亲和提纯法，和平板结合抗体淘选法。

“再克隆的”是指用在第二轮克隆。具体可将由本发明方法产生 的胚胎、胎儿，或成年动物的细胞，如以上所述，在有丝分裂改变程 序培养基中温育(例如有丝分裂细胞提取物)，以形成用来插入去核 卵母细胞中的染色质。或者，如以上所述，可使该细胞透化、在改变 程序的培养基中温育、并将其插入去核的卵母细胞中。进行两轮或两 轮以上的克隆可能使供体染色质团或供体细胞产生另外的改变程序， 由此经过最后一轮克隆后提高了产生存活的后代的机率。

“存活的后代”是指在子宫外能继续存活的哺乳动物。优选该哺 乳动物在离开其母亲宿主后能活至少1秒、1分、1小时、1天、1周、 1个月、6个月，或一年。该哺乳动物不需要在子宫内环境的血液循环 系统中存活。

“核转移卵母细胞”或“核移植卵母细胞”是指供体细胞、细胞 核或染色质团插入其中或与其融合的卵母细胞。由此卵母细胞形成的 胚胎称为“核转移”或“核移植”胚胎。

“胚胎”或“胚胎的”是指未植入母体宿主的子宫膜内的发育的 细胞团。因此，术语“胚胎”可以是指受精的卵母细胞；含有供体染 色质、细胞核，或改变程序的细胞的卵母细胞；前胚泡期发育的细胞 团；或任何其他在发育期、但在植入母体宿主的子宫膜和形成生殖嵴 之前的发育细胞团。胚胎可以代表细胞发育的多个阶段。例如，一个 细胞的胚胎可以称为受精卵；由分裂的胚胎产生的固态球形的细胞团 可称为桑椹胚；有囊胚腔的胚胎可称为胚泡。“胚胎的细胞”是由胚 胎分离、或包含在胚胎内的细胞。

“来源于胚胎的细胞”是指由胚胎内的细胞分化而产生的细胞。

“嵌合胚胎”是指由来源于两个或两个以上胚胎的细胞形成的胚 胎。所产生的胎儿或后代可以含有仅来自一个原始胚胎的细胞，或来 自一个以上原始胚胎的细胞。需要时，采用标准的FISH分析或加到一 个胚胎上的膜染料的分析，测定掺入胎盘组织和掺入胎儿组织的来自 每种胚胎的细胞的百分数。

“前致密胚胎”是指致密之前的胚胎。前致密胚胎在其卵裂球表 面基本上不表达E-钙粘着蛋白。优选前致密胚胎表达至少比同一个种 的完全致密的胚胎少3、5、10、20、30或40倍的E-钙粘着蛋白，或 不表达E-钙粘着蛋白。

“致密胚胎”是指经受致密或致密后的胚胎。致密胚胎的卵裂球 在其表面表达E-钙粘着蛋白。这种E-钙粘着蛋白的表达可以用抗E- 钙粘着蛋白抗体的标准方法测定。E-钙粘着蛋白增加卵裂球之间的粘 着性。优选的致密胚胎包括完成致密过程的胚胎。其他优选的致密胚 胎表达至少比同一个种的前致密胚胎多3、5、10、20、30或40倍的 E-钙粘着蛋白。

“胎儿”是指已植入母体宿主子宫膜内的发育的细胞团。胎儿可 以有限定的特征，例如生殖嵴，本领域的普通技术人员可以很容易对 此做出鉴定。“胎儿细胞”是任何从胎儿分离出来的或胎儿所含有的 细胞。

“单性生殖”或“单性生殖激活”是指卵母细胞或卵细胞在其细 胞核未与雄性原核融合而形成受精卵的情况下的发育过程。例如，卵 母细胞可以不经受精而诱导分裂。

“透明带”是指许多哺乳动物的包围着卵母细胞或卵的透明的、 有弹性的、非细胞层。

“滋养外胚层”是指在哺乳动物胚胎发育的胚泡期，包围囊胚腔 的最外层细胞。通过进一步的发育，滋养外胚层形成大部分或全部的 胎盘组织。

“内层细胞团”是指被滋养外胚层外包围的细胞。通过进一步的 发育，内层细胞团形成大部分的胎儿组织。

“对一种细胞类型特异的mRNA或蛋白”是指mRNA或蛋白在一种 类型的细胞中的表达水平比在所有其他类型的细胞中的表达水平至少 高10、20、50、75或100倍。优选该mRNA或蛋白只在一种类型的细 胞中表达。

“突变”是指在天然存在的或参照的核酸序列中的改变，例如插 入、缺失、移码突变、沉默突变、无义突变，或错义突变，与天然存 在的序列相比，优选由核酸序列编码的氨基酸序列中至少有一个氨基 酸改变。改变细胞、胚胎、胎儿或哺乳动物的基因组序列的重组DNA 技术的例子包括，将来源于另一生物体(例如人)的DNA序列插入上 述基因组中；去除一个或多个DNA序列；以及在靶DNA序列引入一个 或多个碱基突变(例如，定点或随机突变)。引入这些修饰的方法包 括逆转录病毒的插入、人工染色体技术、基因插入、随机插入组织特 异的启动子、同源重组、基因导向、转座元件，以及任何其他引入外 源DNA的方法。所有这些技术对分子生物学领域的技术人员来说是众 所周知的(参见，例如，Ausubel等，同上)。来源于含有修饰的DNA 的转基因细胞的染色质团、染色体和细胞核，或供体转基因细胞都可 以用于本发明的方法中。

“无限增殖”是指分裂的细胞比与其细胞类型、属、种相同的天 然存在的细胞、或比其来源的供体细胞能够经受至少多25、50、75、 90或95％的细胞分裂。优选无限增殖细胞能够经受的细胞分裂比对照 细胞至少多2、5、10或20倍。无限增殖细胞的例子包括在体内或体 外自然获得突变的细胞，该突变改变其正常的生长调节过程。还有其 他优选的无限增殖细胞包括经过遗传修饰使其表达癌基因，例如ras、 myc、ab1、bcl2或neu的细胞，或已用转化的DNA或RNA病毒感染的 细胞，例如Epstein Barr病毒或SV40病毒(Kumar等 Immunol.Lett.65：153-159，1999；Knight等，Pro.Nat.Acad.Sci. USA 85：3130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Met hods 160：19- 25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 5：98-104，1994；Kataoka等，Differentiation 62：301-211.1997； Chatelut等，Scand.J.Immunol.48：659-666，1998)。也可以将细胞 经过遗传修饰使其表达端粒酶基因(Roques等，Cancer Res. 61：8405-8507，2000)。

“非无限增殖的”是指不是如以上所述的无限增殖的。

“致融合化合物”是指使染色质团或细胞核在处于邻近受体细胞 的位置时增加其插入该细胞的可能性的化合物。例如，致融合化合物 可以增加染色质团或细胞核对细胞的细胞质膜的亲和性。致融合化合 物也可以促进细胞核的核膜与细胞的细胞质膜的接合。

“基本上相同”是指其含有的序列至少60、70、80、90或100％ 与另一序列相同。序列的等同性通常使用指定缺省参数的序列分析软 件进行测定(例如，威斯康星生物技术中心大学，遗传学计算机组的 序列分析软件包，1710 Univers ity Avenne，Madison，WI53705)。 该软件程序通过指定不同的取代、缺失和其他修饰的同源程度，对类 似的序列进行配对。

本发明提供了很多有关哺乳动物的克隆以及基因组物质转移到受 体细胞中的优点。例如，该方法可产生较高百分比的存活的后代，增 加可用于农业或医药应用的哺乳动物数量。与显微注射法相比，这里 描述的将染色体、染色质团或细胞核转移到细胞中的方法称为脂融 合，是将遗传物质导入细胞的一种更温和、更简单的方法，因为它不 需要物理破坏细胞的结构，或不需要用微量移液器吸取细胞核或染色 质团并注入细胞中所必须的技术本领。本发明的方法比涉及病毒或病 毒成分的融合方法更为安全。此外，一般认为，脂融合对受体细胞引 起的生理上的破坏，如果有一些的话，也是最小的，因此比电融合有 利，后者在融合细胞的内部引起信号问题，它可能影响克隆胚胎的细 胞周期的进行或发育。根据以下的详细描述和权利要求，本发明的其 他特征和优点是很明显的。

                       附图简述

本申请文件包含制成彩色的附图(图3，6A-6C，8A，和8B)。

图1A和1B说明牛的植入前胚胎的细胞核被膜和核基质蛋白的免 疫检测。图1A是体外受精的牛胚胎在原核和8-细胞期用同样的抗体检 测的照片。图1A中的箭头指的是原核时期胚胎的雌性原核中的抗NaMA 和抗-AKAP95标记。图1A中的插图是用0.1μg/ml HoecRst33342标 记的DNA(短线，20μm)。图1B是牛的成纤维细胞(上排)和原核时期 胚胎(下排)的免疫印迹分析。分子量标记在图1B的右边以kDa表示。

图2说明核移植胚胎中细胞核被膜、NuMA和AKAP95在染色质超 前凝聚和原核装配期间的动态过程。图2是牛供体成纤维细胞(供体 细胞)、染色质超前凝聚期(融合后3小时)的核移植胚胎、原核期 (融合后19小时)的核移植胚胎、和按本说明书所述激活的单性原核 期胚胎的照片。用抗-核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA和AKAP95 抗体，在注射“hpi”后3小时的染色质超前凝聚期(“PCC”)和 注射后7小时(“NTPN”)监测供体细胞核的解体和新的原核的组装。 MII卵母细胞用10mM SrCl2单性激活后形成的雌性原核也在激活处理 开始5小时后进行分析(“Parh.PN”)。核纤层蛋白A/C被组装在牛 的原核时期核移植胚胎的原核中。DNA用0.1mg/ml Hoechst33342对 染。TRITC是指用TRITC偶联的第二抗体标记(短线，20μm)。

图3表明AKAP95在核移植胚胎的原核中的锚定比在单性胚胎中更 牢固。该图表明了用0.1％Triton X-100和1mg/ml DNAase I，与100 或300mMNaCl在室温下原位提取30分钟，然后用3％低聚甲醛固定 后，未提取的核纤层蛋白B、AKAP95，和DNA标记在单性胚胎、核移 植胚胎，和体细胞供体细胞核的原核中的相对百分数。通过双免疫荧 光对B型核纤层蛋白(红)和AKAP95(绿)进行定位。对每个通道- 红(核纤层蛋白B)、蓝(DNA)，和绿(AKAP95)-的荧光标记强度 进行定量。参考值(100％未提取的)代表B类核纤层蛋白、DNA，和 AKAP95在只用0.1％Triton X-100透化、然后固定的胚胎或细胞中染 色的相对量。每组大约检测30个胚胎。

图4表明核纤层蛋白A/C是根据核移植胚胎中重构的原核从头转 录的。图4是通过成纤维细胞的融合和卵母细胞的激活而产生的牛原 核核移植胚胎的照片，卵母细胞激活方法如下：用5mM离子霉素处理4 分钟、随后用10μg/ml的环己酰亚胺/2.5μg/ml的细胞松弛素处理4 小时(b’，-)、用离子霉素/环己酰亚胺/细胞松弛素D按(b’)同 样处理，然后用10μg/ml环己酰亚胺再培养9小时(b”，CHX)、或 在整个激活处理期间按(b’)同样，再与1mg/ml放线菌素D一起温育 (b)。抗-核纤层蛋白B(兔多克隆)和抗-核纤层蛋白A/C(mAb) 抗体用在相同的制品上。插图是用0.1mg/ml Hoechst 33342标记的 DNA的照片(短线，20μm)。

图5是在有丝分裂细胞质提取物(M-S15)、有丝分裂胞质提取物 (M-S200)、和卵母细胞提取物(MII-S15)中染色体的凝聚和核被 膜破裂的图(n＝300-400个细胞核，检测3-5个重复样品)。

图6A-6C是一组输入的纯化的牛成纤维蛋白细胞核(图6A)和在 有丝分裂胞质溶胶提取物中产生的凝聚染色质(图6B)、以及在卵母 细胞提取物中产生的凝聚染色质(图6C)的免疫荧光分析照片。

图7是一组按常规的核移植(NT)或核注射(NI)方法，以及用 本发明的方法将染色质团注射入卵母细胞(CT)得到的卵母细胞内凝 聚的染色质的免疫荧光分析照片。可检测到的核纤层蛋白B和A/C看 来都是溶解的(短线，10μm)。

图8A和8B是一组由染色质转移、核移植、或核注射产生的原核 的免疫荧光分析照片。在核移植、核注射、或染色质转移后19小时将 胚胎固定并标记。对照单性原核(Part)也进行检测。

图8A表示核纤层蛋白A/C和B的分析结果，图8B表示AKAP95和 NuMA的分析结果。核纤层蛋白A/C(绿色标记)，只在核移植和核注 射的原核中出现。(短线，30μm)。

                      详细描述

我们已建立了一种克隆哺乳动物的新方法，该方法包括重塑供体 的遗传物质，然后将其插入受体卵母细胞，重塑是指任何形态学上的 改变，该改变改善了所产生的核移植卵母细胞的发育，使其优于将完 整细胞或完整细胞核转移到受体卵母细胞中所产生的卵母细胞。改变 程序可用下述方法来完成：使供体核细胞在改变程序培养基(例如有 丝分裂提取物、去污剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液)中温育，导 致核被膜的溶解和染色质的可能凝聚。这样的核被膜破裂和染色质凝 聚使连结在染色体上的转录调节蛋白释放出来，否则该蛋白会促进卵 母细胞、胚胎或胎儿发育所不需要的基因的转录。在染色体团转移入 受体卵母细胞之前将其纯化，可以将其他的调节蛋白除去。或者，可 以使特定的由染色体释放出来的调节蛋白免疫耗竭，或从改变程序的 培养基(如细胞的提取物)中除去，以防止它们与染色体重新结合。 核转移后，来自卵母细胞胞质的新蛋白可以在卵母细胞中染色质解凝 和核被膜形成的过程中，结合到染色体上。这些蛋白促进了使卵母细 胞发育成存活的后代的基因转录。

这种由染色质转移的克隆方法产生的胚胎所具有的蛋白表达模式 比用常规克隆方法所产生的胚胎更接近类似于体外受精的胚胎。如实 施例1和4中所说明的，染色质转移胚胎表达的核纤层A/C蛋白比常 规的核转移胚胎少得多。核纤层蛋白A/C是核纤层蛋白的体细胞特异 的成分，该蛋白在分化的细胞中天然表达，但在胚胎中不表达。由于 所报导的核纤层蛋白与转录因子、染色质蛋白、和DNA的相互作用， 有可能核纤层蛋白A/C在常规核转移胚胎中的表达促进了体细胞特异 蛋白的表达，这对胚胎发育来说是不希望有的。由此，本发明的染色 质转移胚胎可以表达比常规核转移胚胎更少的不需要的体细胞特异蛋 白。此外，该染色质转移胚胎的NuMA表达模式比常规的核移植胚胎更 接近类似于体外受精的胚胎，NuMA是与转录调节有关的核基质的主要 成分。该结果也表明，染色质转移胚胎比常规核移植胚胎更有效地改 变了程序。

另一种已建立的克隆方法包括透化细胞在改变程序的培养基(例 如，细胞提取物)中温育，使某些因子加入该细胞内、或从该细胞中 除去，从而使透化细胞改变程序。透化细胞的细胞质膜最好重新封闭， 以包入需要的因子、并恢复该细胞膜的完整性。然后将此改变程序的 细胞转移入受体卵母细胞中，用于克隆哺乳动物的生产。这种克隆方 法已用于生产能存活60天的胎儿。初步的结果表明，用这种方法形成 的胎儿，其40天～60天的存活率(7/10；70％)高于常规的核转移 胎儿(8/16；50％)。

本发明还提供了产生嵌合胚胎的方法，在该胚胎中，大部分胎盘 组织来自一种遗传来源，而大部分胎儿组织来自另一种遗传来源。这 些嵌合胚胎的胎盘异常性较少，从而提高了存活率。在一种这样的方 法中，来源于体外受精的或自然产生的胚胎细胞与来源于用常规核转 移方法、或这里描述的任何新克隆方法所产生的胚胎的细胞相接触， 例如，可将来源于体外受精的胚胎的细胞注射入核转移胚胎的周围(例 如，透明带和胚胎本身之间)。用此方法产生的嵌合胚胎与对照的核 转移胚胎相比，其40天的存活率为67％，而对照为25％。在另一种 方法中，来源于前致密的体外受精或自然产生的胚胎的细胞与来源于 前致密核转移胚胎的细胞，在使来源于每种胚胎的细胞重新组织而产 生单嵌合胚胎的条件下温育(Wells和Powell，克隆2：9-22，2000)。 在上述两种方法中，来源于体外受精或自然产生的胚胎优先掺入胎 盘，而来源于核转移方法的细胞优先掺入胎儿组织。

本发明还描述了将细胞核或染色体插入细胞中的一种新方法的特 征，该方法是指脂融合。这种方法包括用致融合化合物使细胞核或染 色体和受体细胞一起温育，其中的致融合化合物使细胞核或染色体转 移进入细胞的胞质内。这种方法通常可以用于所有细胞类型的细胞核 和染色体，以及用于所有细胞类型的受体细胞。

这些方法在以下进一步描述。值得注意，下述任何一种方法也可 以用细胞提取物以外的改变程序培养基来进行。例如，改变程序培养 基可以通过在溶液中例如缓冲液中加入一种或多种天然存在的或重组 的因子(例如核酸或蛋白，例如DNA甲基转移酶，组蛋白脱乙酰酶、 组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活蛋白、阻遏蛋白、 染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子，或其他激素)而形 成。优选一种或多种因子对卵母细胞或干细胞，例如胚胎干细胞是特 异的。

实施例1：常规的牛细胞核移植胚胎中细胞核缺乏改变程序的证据 牛的植入前胚胎发育期间的核被膜、核基质，和染色质-基质界面成 分的分布

为了测定核被膜(B型和A/C型核纤层蛋白)、核基质(NuMA)、 和染色质-基质界面(AKAP95)成分在植入前胚胎中的分布，通过体外 受精(IVF)产生牛胚胎，并用免疫荧光法进行检测。牛的体外受精按 以前描述的方法进行(Collas等，Mol.Reprod.devel.34：212-223， 1993)。简单地说，将取自1头公牛的冻-融精子在45-90％的PerColl 梯度的顶上铺层，并在70×g下离心30分钟，测定沉淀中精子的浓度， 并将其稀释至在受精时的终浓度为106个精子/ml。卵母细胞成熟后22 小时，将其在TL HEPES中洗涤三次并放入480μl受精培养基中，在 50个卵母细胞中加入20μl浓度为106个精子/ml的精子悬浮液。将胚 胎放入4孔的组织培养板的培养物中，该培养物含有在0.5ml胚胎培 养基中、并覆盖0.3ml胚胎测试矿物油(Sigma)的单层小鼠胎儿成纤 维细胞。每孔放入25-50个胚胎并在38.5℃、含5％CO2的空气下温育。 由原核的发育所测定的受精率为90％以上。

这些体外受精的牛胚胎免疫荧光分析中所用的抗人核纤层蛋白B 抗体从Jean-Claude Courvalin博士，CNRS，Paris，France获得；抗 核纤层蛋白A/C单克隆抗体从Santa-Cruz Biotechnlogy购买，以及 抗NuMA抗体从Transduction实验室获得；抗鼠AKAP95亲和纯化的 兔多克隆抗体从Upstate Biotechmologies获得。将体外受精的牛胚 胎放置在聚L氨赖酸包被的盖玻片上，用3％低聚甲醛固定15分钟， 并用0.1％TrionX-100透化15分钟(Collas等，J.Cell Biol.135： 1715-1725，1996)。蛋白用含2％BSA的PBS/0.01％Tween20(PBST) 溶液封闭15分钟，第一抗体(抗AKAP95、抗核纤层蛋白B、抗LBR、 抗NuMA和抗核纤层蛋白A/C)和第二抗体各温育30分钟，然后以1∶ 100的稀释度在PBST-BSA中稀释后使用。DNA用掺入抗褪色固定培 养基中的0.1μg/ml Hoechst 33342对染。将样品固定在载玻片上， 盖玻片用指甲油密封。在Oympus BX60落射荧光显微镜上进行免疫荧 光观察，并用JVCCCD照相机和AnalySIS软件拍摄照片，用Aldms Photostyler软件处理图象。荧光信号的相对定量用AralySIS定量程 序进行。数据表示为平均相对荧光强度。

牛胚胎的免疫荧光分析表明在核的周围检测到B型核纤层蛋白(图 1A)。但是在原核或8细胞时期未检测到核纤层蛋白A/C。这种在早期 的细胞时期检测不到核纤层蛋白的现象被预期为细胞分化的标志 (GuTlli等，EMBOJ.6：3795-3799，1987)。在所有的检测时期都能 检测到核基质结构蛋白NuMA(图1A)。但是，在牛的原核期胚胎中， NuMA标记限制于雌性的原核(FPN)，即两种原核中最小的原核(图 1A箭头)。最近，在早期小鼠胚胎中鉴定出其特征(Bomar等，2002 提交的原稿)、并用亲和纯化的抗小鼠AKAP95抗体检测到的AKAP95 也是限于雌性原核中(图1A)。但是，在随后的发育期，在所有的卵 裂球的核中，可观察到AKAP95的核内分布(图1A)。

通过牛的原代胎儿成纤维细胞和原核期体外受精胚胎的Western 印迹分析，可以证实免疫荧光标记的特异性(图1B)。进行这种分析 时，先用10％SDS-PAGE在电流为每块凝胶40mA的条件下使蛋白分离。 然后将蛋白在转移缓冲液(25mM Tris-Hcl，pH8.3，192mM甘氨酸，20 ％甲醇，和0.1％SDS)中，电穿孔转移至硝酸纤维素膜上，该转移在 100V下进行1小时。用Tris缓冲的盐溶液(TBS；即，140mM NaCl， 2.7mM KCl和25mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤膜10分钟，用含5％乳的 TBST(含0.05％Tween20的TBS)封闭1小时，然后用下述的第一抗 体温育1.5小时：抗AKAP95(稀释1∶250)、抗核纤层蛋白B(1∶ 1000)、抗LBR(1∶500)、抗NuMA(1∶500)，和抗核纤层蛋白A/C (1∶500)。印迹膜在TBST中洗涤二次，共10分钟，并用辣根过氧 化物酶(HRP)偶联的第二抗体温育1小时，印迹膜在TBS中洗两次共 10分钟，然后用增强的化学发光剂(ECL，Amersham)显色。

所有的蛋白都在其预期的表观分子量Mr处测得：68kDa(B型核 纤层蛋白)、70和60kDa(分别为核纤层蛋白A和C、约180kDa(NuMA)， 以及95kDa(AKAP95)。总之，这些结果表明，植入前牛胚胎表达核 的结构蛋白，该蛋白可以用交叉反应抗体检测。值得注意，在牛植入 前胚胎中核纤层蛋白A/C在免疫学上是不能检测到的。因为核纤层蛋 白A/C在体细胞中表达(图1B)，它们有可能构成核移植胚胎中细胞 核改变程序的分子标记。

核被膜、NuMA、和AKAP95在核移植牛胚胎中的动态学

在牛的常规核移植过程中，对核被膜和核基质结构的动态学进行 检测。用分别对核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95的抗体对这些结 构进行研究。为了测定核重塑期间这些标记的动态学，用按以前所述 的方法分离的作为供体细胞的原代胎儿成纤维细胞产生牛的核移植胚 胎(Kasinathan等，Biol.Repord.64：1487-1493，2001)。简单地说， 用0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS溶液(胰蛋白酶-EDTA)，通 过胰蛋白酶消化收集牛胎儿的细胞。将细胞接种于T75培养烧瓶中 (corning)中，烧瓶中含有添加了10％胎儿牛血清(FBS；Hyclone)、 0.15g/ml谷氨酰胺(Sigma)、0.003％β-巯基乙醇(Gibco)和抗真 菌的抗生素(Gibco)的α-MEM(Gibco)。接种3天后，用胰蛋白酶- EDTA收集细胞，并冷冻在α-MEM/DMSO中。G1细胞按以前所述的方法 分离(Kasinathan等，Biol.Repord.64：1487-1493，2001)。简单地 说，分离前24小时，将5.0×105个细胞在含有10ml MEM/FBS的T75 烧瓶内铺板。第二天，用PBS洗涤该板，更换培养基1-2小时，并将 此板在旋转混合器上以中等速度振摇30-60秒。除去培养基，在500×g 下离心5分钟，然后将沉淀重新悬浮于250μl MEM/FBS中。用微量移 液器挑选由细胞质桥连接的细胞双联体，并用于核转移。

牛的核转移按早些时侯描述的方法(Kasinathan等， Biol.Repord.64：1487-1493，2001)进行。将体外成熟的卵母细胞在 成熟后18-20小时去核，将G1供体细胞转移入卵黄周的空间后，用 2.4KV/cm，的单电流脉冲20微秒使其融合(Electrocell Manipulator 200，Genetronics)。在成熟后28-30小时(即卵母细胞从卵巢收集 并至少与供体细胞融合后2小时，放在成熟培养基上28-30小时后)， 重构的卵母细胞和单性的对照细胞用钙离子载体(5μM)激活4分钟 (Cal Biochem)，随后用10μg环己酰亚胺和2.5μg细胞松弛素 D(Sigma)在ACM培养基(100mM NaCl、3mM KCl、0.27mM CaCl2、2.5mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸盐、1mM L谷氨酰胺、3mg/mlBSA、 1％BME氨基酸，和1％MEM非必须氨基酸)中激活5小时(Liu等， Mol.Reprod.Dev.49：298-307，1998)。激活后，将核移植胚胎或卵母 细胞卵洗涤5次并与小鼠胎儿成纤维细胞在38.5℃、5％CO2的气氛下 共培养。

重建的胚胎用标准的方法激活，融合后3小时，用低聚甲醛固定 染色质超前凝聚(PCC)期的胚胎，并用免疫荧光法，采用核纤层蛋白 A/C、核纤层蛋白B、NuMA和AKAP95(图2，PCC)的抗体进行分析。 此外，用类似的方法对能进展为原核(PN)时期(即融合后15小时的 牛胚胎)的各组核移植胚胎进行分析(图2，核移植-PN)。还对原核 时期的按本说明书所述方法激活的单性卵母细胞进行检测，作为对照 (图2，Parth PN)。

如所预期的那样，供体的体细胞(牛胎儿成纤维细胞，图2)表达 所有的标记，其分布如文献所预期的一样。在染色质超前凝聚期，通 过DNA的Hoechst 33342染色显示出不同的凝聚染色体。在凝聚的染 色体上或其附近，未检测到核纤层蛋白A/C和B(图2，PCC)，推测 这是由于它们在卵细胞质内分散的结果。可以检测到一些标记的 NuMA；推测这些NuMA是与维持染色体凝聚的纺锤体板结合。相反， AKAP95与凝聚的染色体(PCC)结合。此结果可使人联想到标记在人 的有丝分裂细胞上的AKAP95(Collas等，J.Cell Biol.147：1167- 1180，1999；J.Cell Biol.150：1251-1262，2000)。在原核期，对所 有的标记进行检测，核纤层蛋白A/C存在于原核的包膜(图2，核移植 -PN)。此结果与其在对照的单性原核的包膜(图2)和受精的原核的 包膜(图1A)中的不存在相反。对核移植原核和对照原核中的核纤层 蛋白B进行检测。同样，NuMA和AKAP95修饰除核仁外的核的内部。 在核移植原核中的NuMA标记总是比在对照的单性原核的明亮(比较核 移植PN和Parth.PN，图2)。归纳起来，这些观察到的结果表明核移 植胚胎的原核重新装配体细胞核的标记核纤层蛋白A和C，并显示出强 的NuMA染色。

AKAP95在单性胚胎原核和核移植胚胎原核中的不同锚定

A-激酶锚定蛋白AKAP95是在有丝分裂染色体凝聚中涉及的核蛋 白。为了用作影响核移植后的体细胞改变程序的另一种分子标记，对 AKAP95在由胎儿成纤维细胞形成的牛核移植原核时期胚胎中的细胞内 锚定性质进行描述。同时还对AKAP95在单性胚胎的原核和供体体细胞 的核中的锚定进行检测。

用0.1％Triton X-100、1mg/ml DNAse I和100或300mM NaCl在室温下，将胚胎抽提30分钟，对AKAP95在原核胚胎中的细胞内锚 定进行原位测定。如以上所提到的，雄性原核不含有AKAP95。相反， 在牛的核移植胚胎的原核和在供体核中，有相当量的AKAP95和DNA能 耐受DNAse I和300mM的NaCl(图3)。用DNAseI和300mM的NaCl在单性或核移植的原核中未提取到B型核纤层蛋白(图3)，这表示， AKAP95和DNA分布的改变并不是由于核结构的总体变化而引起的。这 些数据表明，如在体细胞核内一样，AKAP95在牛的核移植原核内比在 单性原核内更牢固地锚定在核内结构上。究竟是这种结合对核移植胚 胎内的DNA组织施加了限制因素，还是由基因组的结构改变所引起的 还需进一步确定。因为抗DNAseI的DNA在转录上是沉默的，不完全重 塑的AKAP95在核移植后的锚定有可能减弱发育上重要的基因的表 达。

核移植牛胚胎中核纤层蛋白A/C的转录错误调节

一个引人注意的观察结果是核纤层蛋白A/C重新装配在牛的核移 植胚胎的原核周围，而这种体细胞特异的标记在体外受精的、和单性 的原核中是不存在的。因此，我们进行了以下的研究：核纤层蛋白A/C 的重新装配是否因(i)在染色质超前凝聚时期分解的体细胞核纤层蛋 白重新寻靶(图2)、(ii)核纤层蛋白由母体的核纤层蛋白A/CmRNA 库翻译和装配或(iii)体细胞的核纤层蛋白A(LMNA)基因在核移植 的原核中的从头转录，而引起的。

为了分清这些可能性，用本说明书所描述的“传统”核移植步骤 产生牛的核移植胚胎，核移植后用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX) 激活重建的胚胎；或者核移植后在RNA聚合酶II(P01II)抑制剂放 线菌素D(ActD)存在下进行激活，以抑制从头转录。对于在环己酰亚 胺中培养牛的核移植胚胎，除了卵母细胞在环己酰亚胺(CHX)中温育 14小时之外，其余按以上所述在核转移后对卵母细胞进行激活。在激 活14小时后，将卵母细胞洗涤5次，然后放入含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的ACM培养基中1小时。温育后，用落射荧光 显微镜观察原核的发育。然后用含3％低聚甲醛的PBS溶液固定原核胚 胎、洗涤、固定在载玻片上。对于在放线菌素D中培养牛的核移植卵 母细胞，在核移植后，除了在环己酰亚胺温育步骤中添加5μg/ml放线 菌素D(ActD)之外，按以上所述的方法激活卵母细胞。5小时后，洗 涤卵5次，并且置于含5μg/ml放线菌素D的ACM培养基中。在激活后 14小时，将卵洗涤5次，然后放入含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma) 的ACM培养基中培养1小时。温育后，用落射荧光显微镜观察原核的 发育。原核时期的胚胎用含3％的低聚甲醛的PBS溶液固定、洗涤，并 固定在载玻片上。

围绕着核移植原核的核纤层蛋白B装配不受蛋白或RNA合成抑制 的影响，该结果表明，核纤层蛋白B是由先前分解的体细胞库和/或由 卵母细胞的细胞质中大量的核纤层蛋白B库重新装配的。在核移植原 核中检测到的核纤层蛋白A/C(图2)，在用环己酰亚胺激活后重新形 成的核中不存在。此结果表明，核纤层蛋白A/C的装配需要蛋白从头 合成，还表明通过注射供体核或细胞融合，这些核纤层蛋白不被来自 分解的体细胞库重新导向而进入卵母细胞。此外，当胚胎在放线菌素D 存在下激活时，核纤层蛋白A/C不是重装配的。该结果表明，核纤层 蛋白A/C在核移植原核中的重新装配，是由重建的原核中的LMNA基因 的从头转录而引起的。在核移植原核中可检测到的NuMA没有在环己酰 亚胺激活的核移植胚胎的原核中重新装配，但是放线菌素D处理的核 移植胚胎的原核中，可检测到微弱的NuMA。此发现强有力地提示NuMA 在核移植原核中的重新装配需要至少一部分是由母体NuMA mRNA库产 生的从头翻译。与此相一致的观察结果是，在放线菌素处理的核移植 胚胎中比未处理的核移植胚胎对照的抗NuMA标记弱(比较图4中的b’ 和b)，由该观察结果可以提示NuMA在核移植原核中的部分装配是 由NuMA基因在原核期的从头转录所引起的。

归纳起来说，这些结果表明，在核移植后，LMNA基因不会因核的 重塑而关闭。同样，NuMA基因显然保留其在原核核移植胚胎中的活性。 在染色质超前凝聚期间，正如由染色质的高度凝聚性能所预测的那 样，这些基因的短暂失活有可能发生(图2)。这些结果无疑地说明了 在这里所述的条件下所产生的核移植胚胎中，核的改变程序是不完全 的。正如初期对AKAP95的讨论，我们提出核纤层蛋白A/C在核移植原 核中的保留影响了基因的表达，例如发育上不重要的基因的表达。以 前报道的核纤层蛋白A和C与染色质蛋白和DNA的相互作用，以及这 些核纤层蛋白与转录因子的结合也支持了该假设。

实施例2：改变程序的供体染色质团在克隆哺乳动物中的用途

为了克服实施例1中所证明的常规的核转移胚胎中的不完全改变 程序问题，建立了新的方法，以便更有效地在核转移之前对供体染色 质改变程序。这些方法包括使供体细胞在改变程序培养基(例如，细 胞提取物)中温育，该改变程序培养基可引起核被膜的溶解，以及可 能使染色质凝聚。这些核被膜的破裂和染色质的凝聚使结合在染色体 上的转录调节因子释放出来，不然，这些蛋白会促进卵母细胞、胚胎、 或胎儿发育时所不希望有的基因的转录。此外，改变程序培养基中的 调节蛋白可以结合到染色质团上，并促进发育所需的基因的转录。

用于克隆的供体核的大量制备

从同步或非同步培养的细胞群中可分离出多达数百万个核。该细 胞群可以是自然同步或化学同步的。优选细胞群中至少40、60、80、 90或100％的细胞停滞在G0或G1期。为了达到此要求，例如，细胞 可以在低血清，如5％、2％或0％血清中温育1、2、3或更多天，以 增加在G0期细胞的百分数。为了使细胞同步在G1，可以使细胞生长至 汇合成相连的细胞，然后在0.5-1μg/ml诺考达唑(Sigma Chemicals，St，Louis，MO)中温育17-20小时(参见，例如，Collas 等，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999及其中的参考文献)。用一 只手反复轻打烧瓶，使含有相连的细胞的烧瓶激烈振动，从而使有丝 分裂细胞和G1期双联体分开。G1期双联体是分裂过程结束时的一对伸 长的细胞，该细胞仍通过细桥连接在一起。根据这种特有的双联体结 构，可以将分开的G1期双联体与培养基分离。该G1期双联体在分离后， 可以仍然相连、或可以分成两个分开的细胞。

采用标准的步骤将同步或不同步的细胞收集在磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS)中，洗涤数次后，将细胞从其起始培养基转移至低渗透压的缓 冲液中(10mM HEPES，pH7.5，2mM MgCL2，25mM KCl，1mMDTT，10μM抑蛋 白酶肽、10μM亮抑蛋白酶肽、10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰 蛋白酶抑制剂，以及100μMPMSF)。例如，该细胞可以用50ml的PBS 洗涤并在500×g、4℃下离心10分钟使其沉淀。倾去PBS上清，将沉 淀的细胞重新悬浮于50ml PBS中并和上述一样离心。这次离心后，沉 淀的细胞重新悬浮在20-50倍体积的冰冷低渗缓冲液中，并在500×g、 4℃下离心10分钟，再倾去上清，细胞沉淀中加入约20倍体积的低渗 缓冲液，小心使该细胞在此缓冲液中悬浮，然后在冰上保温至少1小 时，使细胞逐渐膨胀。

为了分离出细胞中的核酸，用标准的方法使细胞裂解。例如，将 2-5ml的细胞悬浮液转移至玻璃匀浆器内，并用牢固固定的杵以10-20 次的起始撞击速度使细胞均化。或者，用电动混合器(例如， Ultraturrax)使细胞悬浮液均化。需要时，可用放大40倍的相差显 微镜监测细胞的裂解。在均化期间，应保留细胞核的完整，而大部分、 或最好全部原来结合的细胞质成分，如小泡、细胞器和蛋白应从细胞 核中释放出来。必要时，可在上述的低渗缓冲液中加入1-20μg/ml的 细胞骨架抑制剂、细胞松弛素B或细胞松弛素D，以促进此过程。按照 需要，使均化连续进行，以裂解细胞并从细胞核释放出细胞质的成分。 对于某些类型的细胞，可能需要100、150或更多次的撞击。然后将裂 解液转移至15ml置于冰上的锥形管内，而膨胀的细胞悬浮液的残留物 重复进行细胞裂解步骤。将制备低渗缓冲液所用的2M蔗糖母液加入细 胞裂解液中(例如，1/8体积的2M母液加入裂解液中)，使蔗糖的终 浓度为250mM。翻转该溶液使其混合，然后在400×g、40℃下在外甩式 转子中离心10-40分钟，使细胞核沉淀。弃去上清，沉淀的细胞核重 悬浮在10-20倍体积的细胞核缓冲液(10mM HEPES，pH7.5，2mM MgCl2，250mM蔗糖、25mM KCl，1mM DTT，10μM抑蛋白酶肽、10μM亮抑 蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂、100μM PMSF)中。如以上所述，使细胞核沉降并重新悬浮于1-2倍体积的细 胞核缓冲液中。新分离得到的细胞核可以如以下所述立即用于体外改 变程序和核转移，或贮藏起来备用。贮藏时，细胞核用细胞核缓冲液 稀释至约为106/ml的浓度。加入甘油(2.4份体积的100％甘油)并 用移液管轻轻抽吸，使其充分混合。然后将此悬浮液分成体积为100～ 500μl的小份，放入冰上的1.5ml管内，立即在甲醇-干冰浴中冷冻， 并在-80℃下贮藏。使用之前，将分成小份的细胞核在冰上或在室温 下融化，加入1份体积冰冷的细胞核缓冲液，然后将此溶液在1000×g 下，在外甩式转子中离心15分钟。沉淀的细胞核重悬于100-150μl细 胞核缓冲液中，并和上述一样进行离心，然后将沉淀的细胞核重悬于 最小体积的细胞核缓冲液中并储存在冰上备用。

用于供体遗传物质改变程序的有丝分裂提取物或培养基的制备

制备有丝分裂提取物时，将体细胞系(例如，成纤维细胞)在 0.5-1μg/ml的诺考达唑中温育17-20小时(例如，Collas等，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999及其中的参考文献)，使其同步，并如以 上所述，通过激烈的振摇，使有丝分裂细胞分开。分开的G1期双联体 可以除去，或可以让其归于有丝分裂细胞中，其中大部分为有丝分裂 细胞(通常至少为80％)，收集分开的细胞，并在500×g和4℃下， 在10ml锥形管内离心10分钟。将数份细胞沉淀集中，重新悬浮于总 体积为50ml冷的PBS中，并在500×g、4℃下离心10分钟。重复该PBS 洗涤步骤，细胞沉淀重新悬浮于约20倍体积冰冷的细胞裂解锾冲液中 (20mM HEPES，pH8.2，5mM MgCl2，10mM EDTA，1mM DTT，10μM抑蛋白酶 肽、10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白 酶抑制剂、100μMPMSF，以及，根据需要可含有20mg/ml的细胞松弛 素B)，然后在800×g、4℃下离心10分钟使细胞沉降，弃去上清，小 心地将细胞重新悬浮于不大于1倍体积的细胞裂解缓冲液中。将该细 胞在冰上温育1小时，使细胞膨胀。用尖端超声发生器通过超声，或 用玻璃研钵和杵通过Dounce均化进行细胞裂解。细胞裂解进行到至少 使90％的细胞和细胞核裂解，这可以用相差显微镜来确定。裂解至少 90％的细胞和细胞核所需的超声时间根据制备提取物所用的细胞类型 而异。

将细胞裂解物放在1.5ml离心管内，用台式离心机在10,000- 15,000×g、4℃下离心15分钟。从离心机中取出离心管，立即放在冰 上。用200μl吸管头小心收集上清液，并将由几管收集的上清液合并 放在冰上。此上清液即为“有丝分裂细胞质”或“MS15”提取物。根 据产生染色质团所用的方法是常规方法还是微量法，可将该细胞提取 物在冰上分成每管为50μl或10μl体积的提取物。将此提取物立即在 液氮内急骤冷冻并储存在-80℃下备用。或者，将此细胞提取物放入冰 上的超速离心管内(如与SW55Ti转子配套的管，Bachman)。需要时， 在管子顶部覆盖矿物油。提取物在200,000×g、4℃下离心3小时， 使MSIS提取物中所含的膜泡沉积。离心结束后，将油弃去，小心收集 上清液，需要时，将其合并，并放入冰上冷的1.5ml管内。此上清液 称为“MS200”或“有丝分裂胞质溶胶”提取物。与上述MS15提取物 一样，将此提取物分成份并冷冻。

需要时，提取物可增加补充的细胞核因子，例如可以由获得改变 程序提取物的细胞类型、或任何其他细胞类型的细胞纯化细胞核，并 按以上所述，用超声波裂解。在含有浓度为0.15-800mM的NaCl或KCl 的细胞核缓冲液中、搅拌下温育10-60分钟，提取细胞核因子。将裂 解物离心，使未提取的成分沉淀，对含有提取的目的因子的上清液进 行透析，以除去NaCl或KCl，然后将透析的细胞核提取物分成小份并 冷冻储存。在加入细胞核进行改变程序之前，将上述细胞核提取物以 不同的浓度加入上述的完整细胞提取物中。

有丝分裂提取物也可以由生殖细胞制备，如卵母细胞或雄性生殖 细胞。例如，可以将自然抑制在中期II时期的卵母细胞收集、洗涤， 并如以上所述进行裂解，产生卵母细胞提取物。为了制备雄精生殖细 胞提取物，从屠宰场得到睾丸，将此器官剁碎并在蔗糖或percoll梯 度上进行差速离心，即分离得到生殖细胞。将生殖细胞与体(Legdig 和Sertoli)细胞分离，通过在PBS中悬浮和沉淀，洗涤该生殖细胞， 然后如以上所述，在冰冷的细胞裂解缓冲液中洗涤一次并用超声波裂 解。将此裂解物在15,000×g、4℃下离心15分钟，使其澄清，上清液 (即生殖细胞提取物)分成小份，并在液氮中迅速冷冻。

作为细胞提取物的替换物，也可以通过将一种或多种天然存在的 或重组的因子(例如，核酸或蛋白，如DNA甲基转移酶，组蛋白脱乙 酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活蛋白、阻遏 蛋白、染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子或其他激素) 加入溶液，例如缓冲液中，制成改变程序培养基。优选一种或多种因 子对卵母细胞或干细胞是特异的。

将核酸置于有丝分裂提取物或培养基中形成凝聚的染色质团

将1份MS15或MS200提取物或培养基在冰上融化，在20μl的提 取物或培养基中，加入ATP产生系统(0.6μl)并通过旋转混合。ATP 产生系统按下述方法制备：将等比例用水制备的100mM ATP母液、1M 磷酸肌酸和2.5mg/ml肌酸激酶母液(100×)混合，放在冰上备用。提 取物中加入ATP产生系统后，终浓度为1mM ATP、10mM磷酸肌酸、和 25μg/ml肌酸激酶。

按每10μl提取物或培养基1μl细胞核的浓度，向提取物或培养基 中加入细胞核悬浮液，用移液管反复抽吸充分混合，然后在30、33、 35、37或39℃的水浴中温育，定时轻轻敲打含有混合物的试管，以防 止染色体在试管底结块。在显微镜下定时监测核被膜的破裂和染色体 的凝聚，例如每隔15分钟一次。当核被膜破裂、染色体开始凝聚时， 开始进行从提取物或培养基中回收染色质团的步骤。

将细胞核置于有丝分裂提取物或培养基和抗NuMA抗体中形成解凝聚的 染色质团

或者，可以预先加入含有细胞核基质蛋白NuMA抗体的细胞核，再 进行上述的步骤，由此而形成不凝聚或仅有部分凝聚的染色质团 (Steen等，J.Cell Biol.149，531-536，2000)。该步骤中，通过供 体细胞核周围核膜的溶解，可使染色质中的细胞核成分除去；但是， 凝聚步骤被加入的抗NuMA抗体所抑制。防止染色体的凝聚，可以降低 染色体在有丝分裂提取物中温育时染色体破损或丢失的风险。

在该步骤中，使纯化的细胞核(2000个核/μl)在500μl含有 0.75μg/ml溶血卵磷脂的细胞核缓冲液中，室温下透化15分钟。加入 含3％BSA的细胞核缓冲液1ml并在冰上温育5分钟，以抑制过量的溶 血卵磷脂。然后使细胞核沉淀，然后用细胞核缓冲液洗涤1次。将此 细胞核按2000个细胞核/μl的浓度重新悬浮于100μl的含有抗NuMA 抗体(1∶40稀释；Transduction Laboratories)的细胞核缓冲液 中。在冰上缓慢搅拌温育1小时后，使该细胞核在500×g下、通过1M 蔗糖沉淀20分钟。然后将细胞核重新悬浮于细胞核缓冲液中，并按前 面的章节所述将其加入含有ATP产生系统的有丝分裂提取物或培养基 中。根据需要，也可以在提取物或培养基中加入抗NuMA抗体，以进一 步防止染色体的凝聚。

将细胞核置于去污剂和/或盐的溶液中，或置于蛋白激酶溶液中形成解 凝的染色质团

不凝聚的或只是部分凝聚的染色质团也可以通过将细胞核置于去 污剂或蛋白激酶中而形成。去污剂可以用来溶解非结合或松散地结合 在核内染色体上的细胞核成分，从而除去细胞核被膜。在该步骤中， 纯化的细胞核(2,000-10,000个核/μl)在添加了去污剂，例如0.1 ％-0.5％的Triton X-100或NP-40的细胞核缓冲液中温育。为了促 进核被膜的除去，可以在缓冲液中添加盐，例如NaCl，其浓度为大约 0.1、0.15、0.25、0.5、0.75或1M。在冰上缓慢摇动温育30-60分 钟后，将细胞核在外甩式转子中，1000×g下离心10-30分钟，离心时 间根据总体积而定。沉淀的细胞核重悬于0.5～1ml细胞核缓冲液中， 并按上述方法沉淀。重复此洗涤步骤2次，以确保完全除去去污剂和 多余的盐。

或者，该细胞核被膜可以单独用重组或天然存在的蛋白激酶，或 其组合除去。优选蛋白激酶是用标准的步骤提纯的，或者从市场购买 的纯化形式的蛋白激酶。这些激酶可以使核膜、核基质、或染色质的 成分磷酸化，从而除去核被膜(参见，例如Collas和Courvalin，Trends cell Biol.10：5-8,2000)。优选的激酶包括依赖细胞周期蛋白的激 酶I(CDK1)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、MAP激酶、依赖 于钙/钙调蛋白的激酶(Camk II)，以及CK1酪蛋白激酶，或CK2酪蛋 白激酶。在该方法中，约20,000个纯化的细胞核在含有20μl磷酸化 缓冲液的1.5ml离心管中，在室温下温育。优选用于CDK1的磷酸化缓 冲液(Upstate Biotechnology)含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mM MgSO4、80mMβ-甘油磷酸酯、5mM EGTA、100μM ATP、 和1mM DTT。用于PKC的优选的缓冲液含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mM MgSO4、100μM CaCl2、40μg/ml磷脂酰 丝氨酸、20μM二酰基甘油，100μM ATP和1mM DTT。如果同时使用PKC 和CDK1，则采用添加40μg/ml磷脂酰丝氨酸和20μM二酰基甘油的磷酸 化缓冲液。优选用于PKA的磷酸化缓冲液包括200mM NaCl、10mM MgSO4、10mM Tris，pH7.0、1mM EDTA、和100μM ATP。用MAP激酶时， 可采用添加10mM CaCl2、和1mM DTT的PKA磷酸化缓冲液。对于CamK II，可使用添加1mM DTT的PKA缓冲液，或Upstate Biotechnology 生产的Cam激酶测试试剂盒(Venema等，Biol Chem 272：28187-90， 1997)。

加入终量为25-100ng的蛋白激酶使磷化反应开始，该反应在室温 下保温至1小时。在此温育期间，可用显微镜监测核被膜的破裂，例 如间隔15分钟一次。核被膜破裂后，如以上所述，将细胞核洗涤三次， 除去去污剂溶液。

从培养基、提取物、去污剂和/或盐的溶液、或蛋白激酶溶液中回收染 色质团

将含有凝聚的、部分凝聚的，或不凝聚的染色质团置于等体积的 在细胞核缓冲液中制备的1M蔗糖溶液中，该染色质团在1000×g、4℃ 下，在外甩式转头中离心10-30分钟，使其沉淀，离心的时间根据样 品的体积而定，弃去上清，小心地用移液管将沉淀的染色质团吸入 0.1-1.0ml细胞核缓冲液或脂融合缓冲液(150mM NaCl、10μM抑蛋白 酶肽、10μM亮抑蛋白酶肽、10μM胃蛋白酶抑制剂A、10μM大豆胰蛋 白酶抑制剂，以及100mM溶于20mM HEPES，pH约7.0或pH7.5，或溶 于20mM MES，pH约6.2的PMSF)中，使其重新悬浮，并在1,000×g 下离心10-30分钟。弃去上清后，将沉淀的染色质团重新悬浮于细胞 核缓冲液或脂融合缓冲液中，并储存在冰上备用。将每份染色质团转 移至在微量操作皿上20μl的一滴用油覆的盖HEPES缓冲的培养基中， 按以下所述，将1份染色质团插入每个去核的卵母细胞。

微量法制备染色质团

将10-20μl的一滴上述含有ATP产生系统、去污剂和/或盐的溶 液、或蛋白激酶溶液的MS15或MS200提取物或有丝分裂培养基放在培 养皿上。然后加入一滴在培养基中的50μl的分离的G1期细胞双联体或 G0期细胞、隔开的一滴50μl的用HEPES或二碳酸盐缓冲的培养基“裂 解”滴，该培养基含有0.1％Triton X-100或NP-40，用于促进细胞的 裂解、以及一滴50μl的卵母细胞注射培养基。每滴液体用CO2平衡的 矿物油覆盖，培养皿上还加入50μl的培养基“洗涤滴”，用于洗涤裂 解的细胞或细胞核。

用微量移液管将细胞转移至裂解滴，反复温和地抽吸，使细胞膜 在移液管内裂解。细胞裂解后，将裂解物温和地送入洗涤滴，并直接 再吸出细胞核，以除去去污剂。根据需要，在细胞核加入有丝分裂提 取物或培养基之前，可以使其透化并与抗NuMA抗体一起温育。随后将 细胞核送入MS15、MS200液滴或培养基、去污剂和/或盐的溶液、或蛋 白激酶溶液。按上述方法监测细胞核破裂和染色体的凝聚。一旦细胞 核被膜破裂，如果使用不含抗NuMA的有丝分裂提取物，染色体就开始 凝聚，按以下所述，用微量移液管分离出单个完整的染色质团并转移 到去核的受体卵母细胞中。

卵母细胞的去核

优选受体卵母细胞是中期II时期的卵母细胞，在此时期，卵母细 胞可以被激活，或已经被充分激活而能够和对待致育精子那样对待导 入的染色质团。为了使卵母细胞去核，将卵母细胞的部分或最好是全 部DNA去除，或使其失活。破坏或去除受体卵母细胞中的DNA，可以防 止卵母细胞中的遗传物质在克隆的哺乳动物的生长和发育中起作用。 破坏卵母细胞原核的方法之一是用紫外光照射(Guradow，in methods in Cell Biology，Xenopus Laevis：-Practical Uses in cell and Molecular Biology，Kay and Peng，eds.，Academic Press， California，volume 36：pages 299-309，1991)。另一种方法是采用 任何一种标准技术，将该卵母细胞的原核通过外科手术除去(参见， 例如，McGrath和Solter，Science220：1300-1319，1983)。在一种 可行的方法中，将针插入卵母细胞，把细胞核吸入针内的空间，然后 将针从卵母细胞取出而不使细胞质膜破裂(专利号为4,994,384和 5,057,420的美国专利)。

使染色质团插入卵母细胞的脂融合法

采用以下所述的脂融合法或标准的显微注射法或电融合技术，可 以将染色质导入受体卵母细胞中(参见，例如专利号为4,994,384和 5,945,577的美国专利)。下述的脂融合法也可以用于其他的应用场 合，将染色质插入其他受体细胞中。

如以上所述，通过离心从有丝分裂提取物、去污剂和/或盐的溶 液、或蛋白激酶溶液中分离出染色质团，然后用脂融合缓冲液洗涤。 该染色质团可以储存在冰冷的脂融合缓冲液中备用。或者，可将此染 色质团分成小份，在液氮，或甲醇-干冰浴中冷冻，然后在-80℃下 冷冻贮藏。脂融合溶液的制备方法是将一种或多种致融合试剂，分别 按为大约5∶1-1∶10的比例与脂融合缓冲液混合。该致融合试剂包括， 但不限于：聚乙二醇(PEG)和亲脂的化合物，例如：Lipofectin、 Lipofectamin、DOTAP、DOSPA、DOPE和膜泡成分。例如，阳离子 脂质，如DOTAP，可以用脂融合缓冲液按约0.1-30μg/ml的浓度配制 成溶液使用。或者也可以使用含有阳离子脂质和中性脂质，如DOPE 的混合物的脂质体制剂。

将新制备的或冷冻-融化的染色质团与脂融合缓冲液混合，使染色 质团被该化合物包被，在20-30℃下温育大约10-30分钟的时间。将 染色质团包含在脂融合溶液内的微滴置于CO2平衡的矿物油之下，同时 制备含去核的受体卵母细胞的液滴，用微量移液管吸取包被有脂融合 溶液的染色质团，并插入卵母细胞的细胞质与透明带之间的卵黄周的 空间。将此染色质团放在卵母细胞膜的邻近，以保证其与卵母细胞的 接触。使该染色质团-卵母细胞复合体保持在20-30℃的温度下，并 在显微镜下监测其融合。融合一旦发生，即按以下所述对重建的卵母 细胞进行激活。

重建的卵母细胞的激活、培养和移植

为了防止极体的挤出和染色体的丢失，卵母细胞可以在细胞松弛 素B的存在下进行激活，或在激活后立即加入细胞松弛素B(Wakeyama 等，PNAS96：14984-14989，1999；Wakeyama等，Nature Genetics 24：108-109，2000)。重建卵母细胞的激活可以采用电的或非电的方 法。在本领域用于激活细胞的电的技术是众所周知的(参见，例如， 美国专利NO.4,994,384和5,057,420)。非电的细胞激活方法包括本 领域内已知的任何一种增加细胞分裂可能性的方法。非电的激活卵母 细胞的方法包括使卵母细胞在乙醇；三磷酸肌醇；Ca++离子载体和蛋白 激酶抑制剂；蛋白合成抑制剂；佛波醇酯；毒胡萝卜素，或精子的任 何成分存在下温育。其他用于激活的非电的方法包括使卵母细胞经受 冷激或机械应激。或者，在细胞核转移1～3小时后，将卵母细胞在含 有使其激活的Sr2+、和防止细胞分裂及极体挤出的细胞松弛素B存在下 温育约6小时(Wakeyama等，PNAS96：14984-14989，1999；Wakeyama 等，Nature Genetics24：108-109，2000)。根据所克隆的哺乳动物种 类，优选的激活时间长短可以不同。例如，在家养动物，如牛中，卵 母细胞激活周期一般为约16-52小时，或可优选约28-42小时。

激活后，将卵母细胞在培养基内放置适当的一段时间，使产生的 胚胎发育。在两细胞时期或更后的时期，将此胚胎转移至养育的受体 雌性动物中使其发育至足月。对于牛物种，胚胎通常培养至胚泡期(例 如，大约6-8天)，然后转移到母体宿主中。对于其他的克隆动物， 本领域的技术人员熟悉其体外培育的合适时期，或也可通过常规试验 来确定。

将胚胎移植到哺乳动物子宫内的方法在本领域也是众所周知的。 优选胚胎的发育期与宿主哺乳动物的动情周期相关。一旦将胚胎放入 哺乳动物的子宫，该胚胎就可能发育至足月。或者，可以使该胚胎在 子宫内发育至选定的时间，然后用标准的外科方法取出该胚胎(或胎 儿)，测定其健康状况和存活能力。来源于一个物种的胚胎可以放入 另一个物种的动物的子宫环境内。例如，牛的胚胎可以在羊的输卵管 里发育(Stice和Keefer，Biology of Reproduction 48：715- 719，1993)。胚胎和子宫间任何的物种交叉关系都可以用在本发明的 方法中。

细胞核和卵母细胞或其他受体细胞的脂融合

脂融合溶液的制备方法是，如以上所述将一种或多种致融合试剂 分别按大约5∶1～1∶10的比例与脂融合缓冲液混合。按以上所述， 使新制备的或冷冻-融化的核与脂融合溶液混合，使细胞核包被该化 合物，并在20～30℃下温育大约10～30分钟的时间。将染色质包含 在脂融合溶液内的微滴置于CO2平衡的矿物油之下。同时制备含受体细 胞、最好是去核的受体细胞液滴。去核的受体细胞的制备方法是如以 上所述通过显微操作，用物理方法除去染色体或细胞核；或者通过紫 外光照射使其遗传物质受损害。插入卵母细胞时，将包在脂融合试剂 内的细胞核吸入微量移液管内，并插入卵母细胞的细胞质与透明带之 间的卵黄周的空间。插入其他受体细胞时，该有包层的细胞核最好放 在细胞膜的邻近，以保证其与该细胞的接触。使该细胞核-细胞复合 物保持在20-30℃的温度下，并在显微镜下监测其融合。融合一旦发 生，即按以上所述对重建的卵母细胞进行激活。

实施例3：使用改变程序的透化细胞克隆哺乳动物

不需要从细胞中将细胞核或染色质团分离出来也可对细胞进行改 变程序。在该方法中，先使细胞透化，然后在分裂间期、或有丝分裂 改变程序培养基中，在使培养基(例如细胞提取物)和细胞间的各种 因子进行交换的条件下温育。如果使用分裂间期培养基，细胞中的细 胞核仍保持膜包围状态；如果使用有丝分裂培养基，有可能发生细胞 核被膜破裂和染色质凝聚。在这种培养基中温育使细胞核改变程序 后，最好使胞质膜重新封闭好，形成含有来自培养基中所需因子的完 整的改变程序细胞。需要时，如实施例2中所述，培养基中可以增加 补充的细胞核因子，然后使改变程序的细胞与受体卵母细胞融合，并 将由重建的卵母细胞形成的胚胎插入母系的受体哺乳动物，以产生克 隆的哺乳动物。

细胞的透化

可用此步骤改变程序的细胞包括不同步的细胞和同步在G0、G1、S、 G2或M期的细胞，或这些不同期的细胞的合并物。细胞可用任何一种 标准的步骤透化，例如用毛地黄皂苷或链球菌溶血素O。简单地说，用 标准的步骤收集细胞并用PBS洗涤。用毛地黄皂苷进行透化作用时， 将细胞重新悬浮在含有浓度大约为0.001-0.1％的毛地黄皂苷的培养 基中，并在冰上温育10分钟，用链球菌溶血素O透化时，细胞在链球 菌溶血素O溶液中室温下温育(参见，例如，Maghazahi等，FASEB J.11：765-74，1997，及其中的参考文献)约15、30或60分钟。温育 后，在400×g下离心10分钟进行洗涤。通过在PBS中重新悬浮和沉淀 重复洗涤步骤2次。细胞保留在PBS中置于室温下备用。优选如以下 所述，将透化细胞直接加入分裂间期和有丝分裂培养基中进行改变程 序。

改变程序培养基的制备

为了制备分裂间期改变程序提取物，用标准方法收集分裂间期的 细胞，并在10ml锥形管中，500×g、4℃下离心10分钟而洗涤，弃去 上清液，细胞沉淀重新悬浮在总体积为50ml冷的PBS中。将细胞在 500×g、4℃下离心10分钟。重复此洗涤步骤，并将细胞沉淀重新悬浮 在大约20倍体积的冰冷分裂间期细胞裂解缓冲液中(20mM HEPES，pH8.2，5mM MgCl2，1mM DTT，10μM抑蛋白酶肽，10μM亮抑蛋白 酶肽，10μM胃蛋白酶A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂，100μM PMSF，以 及需要时加入20μg/ml细胞松弛素B)。然后在800×g、4℃下离心10 分钟，使细胞沉淀。弃去上清，并小心将细胞沉淀重新悬浮在不大于1 体积的分裂间期细胞裂解缓冲液中，该细胞然后在冰上温育1小时使 其膨胀。然后使用尖嘴超声波发生器通过超声波或使用玻璃研钵和杵 通过Dounce匀浆使细胞裂解。细胞的裂解进行到至少90％的细胞和 细胞核裂解为止，裂解的程度可以用相差显微镜来确定。使至少90％ 的细胞和细胞核裂解所需要的超声处理时间根据制备提取物所用的细 胞类型不同而异。

将细胞裂解物置于1.5ml的离心管中，并用台式离心机在 15,000×g、4℃下离心15分钟。从离心机中取出管子并立即置于冰上。 用200μl移液管吸头小心收集上清液，合并几个管的上清液并置于冰 上。这样制成的上清液即为“分裂间期细胞质”或“IS15提取液”。 可将此细胞提取物在冰上分成每管20μl体积的小份，并立即在液氮中 急骤冷冻，然后贮藏在-80℃下备用。或者，将此细胞提取物放入冰 上的超速离心管中(例如，与Bechman的Sw55Ti转头配套的离心管)。 需要时，在管的顶部覆盖矿物油，然后将提取物在200,000×g、4℃下 离心3小时，使包含在提取物中的膜泡沉淀。离心结束后，弃去油， 小心收集上清，需要时将其合并放入冰上的1.5ml冷管中。该上清液 称为“IS200”或“分裂间期胞质溶胶”。和上述的IS15提取物同样， 将此提取物分成小份并冷冻。

需要时，该提取物可以增加补充的细胞核因子。例如可以由产生 改变程序提取物的细胞类型或由其他任何细胞类型的细胞纯化细胞 核，然后如以上所述，用超声处理裂解。裂解物在含有0.15-800mM NaCl或KCl的细胞核缓冲液中、搅动下温育10-60分钟，提取细胞 核因子。离心使裂解物中的未提取成分沉淀，对含有提取的目的因子 的上清液进行透析，以除去NaCl或KCl。然后将透析的细胞核提取物 分成小份冷冻。在加入细胞进行改变程序之前，将此细胞核提取物按 不同的浓度加入上述完整细胞提取物中。

分裂间期提取物也可由生殖细胞制备，例如卵母细胞或雄性生殖 细胞。例如，按以上所述使卵母细胞激活并培养5小时，使其进入分 裂间期。然后，除了裂解缓冲液中无EDTA之外，按实施例2所述处理 中期II卵母细胞提取物的方法，对卵母细胞进行处理。雄性生殖细胞 提取物也可按实施例2中所述方法制备。

作为细胞提取物的替换物，改变程序培养基也可以通过在溶液 中，例如缓冲液中，加入一种或多种天然存在的、或重组的因子(例 如，核酸或蛋白，例如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、 鱼精蛋白、细胞核纤层蛋白、转录因子，激活蛋白、阻遏蛋白、染色 质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子，或其他激素)而形成。 优选一种或多种所说的因子是对卵母细胞或干细胞特异的。

细胞在培养基中的改变程序

将透化细胞按照大约100-10,000个细胞/μl的浓度悬浮于上述的 分裂间期改变程序培养基、或实施例2所述的有丝分裂改变程序培养 基之一中。如以上所述，将ATP产生系统和GTP加入提取物中，反应 在30-37℃温育最多至2小时，以促进因子从提取物进入细胞的转 运，并激活细胞核对因子的摄取、或染色体与因子的结合。该改变程 序的细胞在800×g下离心，然后在PBS中重新悬浮、洗涤、并在400×g 下离心。将细胞重新悬浮于含有20-30％胎牛血清(FCS)、含 2mMCaCl2(取自1M的水溶液储存液)的RPMI 1640的培养基、或含有 2mM CaCl2的α-MEM培养基中，并在37℃下，在常规的细胞培养温箱 中培养1-3小时，使细胞膜重新封闭。然后用常规的温热培养基(10 ％FCS)洗涤细胞，并用标准的培养条件进一步培养。

另一种在盖玻片上而不是在溶液中的对透化细胞改变程序的方法

另一种方法是，细胞可以放在盖玻片上进行透化，以将对细胞的 操作减少到最少、以及可取消细胞的离心步骤，由此而最大限度地提 高了细胞的存活能力。在12孔板中，细胞(例如，成纤维细胞)在16mm 聚L赖氨酸涂敷的盖玻片上在RPMI 1640中生长至50,000-100,000 个细胞/盖玻片。细胞在200ng/ml链球菌溶血素O的无Ca2+Hanks平 衡盐溶液(Gib-coBRL)中，37℃、常压下透化50分钟。需要时，可 根据碘化丙锭的摄取，测定在这些条件下，透化细胞的百分数。将链 球菌溶血素O吸出，用80～100μl的改变程序培养基覆盖盖玻片，然 后使该细胞在37℃、CO2气氛中温育30分钟～1小时。优选改变程序 培养基含有ATP产生系统、以及ATP、CTP、GTP和UTP各1mM。为了 使胞质膜重封，将含2mM CaCl2的α-MEM培养基、含20～30％胎牛血 清的培养基、或含2mMCaCl2的RPMI1640加入孔中，使细胞在37℃下 温育2小时。

不同的链球菌溶血素O处理对透化和重封细胞百分数的影响

为了评定透化和重封细胞的百分数，进行了链球菌溶血素温育的 剂量和时间的滴定(表1)。根据链球菌溶血素O处理结束后所摄取的 0.1μg/ml的DNA染色剂碘化丙锭，对细胞的透化进行评定。同样，在 另一组细胞的重封处理结束后，对细胞的重封进行评定。

表1、链球菌溶血素O(SLD)处理的牛成纤维细胞的透化和重封

         透化                          重封

ng/ml SLO    N      透化％±标准差 N     重封％±标准差

0            563    1+/-2.8        560   89.9+/-4.9

100          404    48.6+/-4.2     810   86.1+/-8.3

200          548    79.2+/-1.4     478   84.9+/-1.5

500          495    88.7+/-1.6     526   87.6+/-0.5

1000         425    84.9+/-0.7     544   86.4+/-1.4

2000         315    96.6+/-2.2     425   10.7+/-1

4000         200    99+/-1.4       200   11.2+/-5.3

用链球菌溶血素O处理并置于有丝分裂提取物中透化的牛成纤维细胞 存活能力的评定

进行TUNEL分析，以评定用0或500ng/ml的链球菌溶血素O透化 并重封、或用链球菌溶血菌O透化，置于有丝分裂提取物中30～60分 钟，并重封的细胞中的凋亡。TUNEL阳性的细胞是进行凋亡细胞(亦即， 细胞死亡)。数据表明，链球菌溶血素O本身不诱导调亡(表2)。根 据TUNEL分析，将链球菌溶血素O处理的细胞置于有丝分裂提取物中 60分钟，而不是30分钟，导至凋亡速度增加10％(表2)。根据这些 数据，供体细胞在提取物中温育30分钟比温育60分钟更可取。细胞 的免疫荧光分析表明，30分钟的温育引起大部分被检测细胞核的包膜 破裂(约90％，n＞100)。

此外，如实施例4中的染色质转移方法所述，纯化的细胞核在提 取物中温育、并在缓冲液N或TL-HEPES和蔗糖中洗涤，不会进行凋亡 (分别为2/34和3/47 TUNEL阳性)。

表2、链球菌溶血素O和链球菌溶血素O加提取物处理的牛成纤维 细胞的TUNEL分析

      ng/ml SLO        N      ％TUNEL阳性±标准差

      0-输入细胞       400    7.7+/-1.7

      0                800    6.5+/-0.17

      500              892    7.3+/-3.41

      0+提取物30′     400    5.5+/-1.12

      500+提取物30′   400    8.2+/-1.1

      0+提取物60′     784    6.5+/-4.0

      500+提取物60′   691    16.9+/-1.9

选择用于这些克隆方法中的透化方法是500ng/ml SLO在38℃下 温育30分钟。选择用于形成包围改变程序细胞的完整膜的重封方法是 在含2mM CaCl2的α-MEM培养基中温育2小时。

重建的卵母细胞的形成、激活、培养和移植

用标准的微量注射法或电融合技术将改变程序的细胞插入卵母细 胞，或与卵母细胞融合(参见，例如，美国专利NO.4,994,384和 5,945,577)。例如，可将细胞置于含有或不合有蔗糖(例如，2.5％ 的蔗糖)的标准细胞培养基中的卵母细胞的邻近，将细胞吸入注射移 液管内。然后用该移液管抽吸数次，使细胞裂解，并从细胞核中取出 细胞质成分，然后将其注射入卵母细胞中。然后对重建的卵母细胞进 行激活、培养，并用实施例2所述的标准方法将其移植到母体受体哺 乳动物中，以产生克隆的哺乳动物。

实施例4：用两种新的克隆步骤：染色质转移(CT)和链球菌溶血 素O转移(SLOT)导致更完全的细胞核改变程序的证据如实施例1中 所说明的，常规的核移植原核期胚胎中，存在不完全的细胞核重塑和 程序改变。该发现可由核纤层蛋白A/C在核移植胚胎原核的核被膜中 的装配、以及过量的NuMA免疫荧光标记来证实。采用实施例2所述的 染色质团转移法和实施例3所述的细胞透化和改变程序法(亦称为 SLOT)可以达到更完全的细胞核改变程序。

在有丝分裂提取物中温育的牛成纤维细胞核的体外细胞核破裂，以及 所产生的染色质团特征的评定

由有丝分裂的牛成纤维细胞制备的提取物始终保持约80％输入的 纯化成纤维细胞核的破裂(图5)。中期II卵母细胞的提取物(亦即， 受精前自然停止在中期II的卵母细胞的提取物)也成功地支持细胞核 的破裂(30分钟内75％的核破裂)。

对输入的分裂间期细胞核(图6A)、由MS 15有丝分裂提取物中 温育的细胞核得到的染色质团(图6B)、和由在卵母细胞提取物中温 育的细胞核所得的染色质团(图6C)，检测其以下标志的表达：核纤 层蛋白B受体(LBR)，即一种内层核膜内在蛋白质(膜标志)；核纤 层蛋白B，即核纤层的普遍存在的成分；核纤层蛋白A/C，即体细胞特 异的核纤层成分，只存在分化细胞中，而不存在于胚胎中；NuMA，即 细胞核基质的主要成分；AKAP95，即细胞核的PKA锚定蛋白；以及DNA。 在约100％被检的染色质单元中，体细胞胞质溶胶MS 15和卵母细胞 MS15提取物诱导核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、LBR和NuMA的溶解 (图6B和6C)。如所预期的一样，AKAP95保持与染色体的结合，和 以前在有丝分裂的人细胞中所观察到的一样(Collas等，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999)。此结果也在实施例1的超前染色质凝 聚期牛核移植胚胎中描述过。无论采用哪种方法，亦即，常规的核移 植、核注入(NI)法，或是染色质转移法，有丝分裂提取物和卵母细 胞提取物在促进细胞核被膜的溶解方面，与完整的卵母细胞有同样的 效率(图7)。

用染色质转移产生的原核胚胎和核移植和核注射胚胎的原核的比较

为了产生染色质转移的胚胎，将体外成熟的卵母细胞在成熟后约 18-20小时去核。取自分裂间期牛胎儿成纤维细胞的细胞核在MS 15 有丝分裂提取物中温育，该提取物按照这里所述的方法由牛胎儿细胞 制备。在核被膜发生破裂之后，但在染色质凝聚结束之前，从提取物 中分离出染色质团。与染色体在分裂间期的凝聚水平(设定为0％凝 聚)和染色体在有丝分裂中的最高凝聚水平(设定为100％凝聚)相比， 在染色质的凝聚50-60％时，分离出染色质团。在此期间，不能区分 在染色质团中的各个染色体，而且该染色质团的边缘是不规则的形 状。将从有丝分裂提取物分离出来的染色质团与去核的卵母细胞一 起，放入含有2.5％蔗糖的TLHEPES微滴内。该缓冲液内加入蔗糖是 为了使随后的注射步骤中对卵母细胞的破坏减到最小。采用Burleigh Piego Drill(Fishers，NY)(在70V振幅下，频率2HZ，75微秒) 的斜面微量注射移液管将染色质团注入卵母细胞中。通常进行多次脉 冲，例如2、3、4或5次脉冲，使针充分地透入卵母细胞而进行注射。 注射后，用连续稀释的TLHEPES蔗糖溶液洗涤卵母细胞，使渗透压冲 击减到最小。成熟后28-30小时(亦即，卵母细胞从子宫中收集后放 在成熟培养基中28-30小时后，该时间至少是注入染色质团2小时 后)，重建的卵母细胞和单性发育对照用钙离子载体(5μM)激活4分 钟(Cal Biochem，San Diego，CA)，并按早些时候所述(Liu等， Mol.Reprod.Dev.49：298-307，1988)用含10μg/ml环己酰亚胺和 2.5μg/ml细胞松驰素D(Sigma)的ACM培养基[100mM NaCl、3mM KCl、 0.27mM CaCl2、25mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸、1mM L谷 氨酰胺、3mg/ml BSA(无脂肪酸)、1％BME氨基酸、和1％MEM非必 须氨基酸(Sigma)]激活5小时。激活后的卵洗涤5次，然后放入4 孔组织培养板的培养物中，该培养物含有小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml 胚胎培养基，并覆盖0.3ml胚胎测试矿物油(Sigma)。每孔放入25～ 50个胚胎，并在38.5℃下，在含有5％CO2的空气氛围中温育。需要 时，可将钙(例如，约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、5mM，或 更多的CaCl2)加入培养基中，培养约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 小时或更长的时间，以促进注射后的卵母细胞的重封。重封的卵母细 胞的存活率有可能提高，其原因是用这里所述的标准方法将其植入受 体哺乳动物时，包围卵母细胞的外层是完整的。

核注射胚胎的形成方法和上述染色质转移胚胎的形成相同，除了 注射入卵母细胞内的是未在提取物中温育过的分裂期间牛胎儿成纤维 细胞核，而不是染色质团。核移植胚胎用实施例1所述的常规方法产 生。

如所预期的那样，核移植、核注射、和染色质转移原核重装配核 纤层蛋白B(图8A，红色标记)和AKAP95(图8B，红色标记)。与上 述报道的核移植胚胎一致，核移植和核注射原核，也重装配体细胞特 异的成分，即核纤层蛋白A/C(图8A，绿色标记)。但是，染色质转 移原核和对照单性原核不重装配核纤层蛋白A/C(图8A)。核移植原 核也含NuMA(绿色标记)，和大多数染色质转移或单性原核O不同(图 8B，绿色标记)。如以上所述，一部分单性核和染色质转移核装配低 水平的NuMA。

核的体外分解后，染色质转移产生形态上类似于对照的单性原核 的原核。相反，核移植和核注射原核具有体细胞特异的成分(核纤层 蛋白A/C和广范围的NuMA标记)。该结果表明了经过传统的核移植或 核注射步骤后，核重塑的不完全。如以上所述，在核移植和核注射原 核中检测到的核纤层蛋白A/C来源于原核期从头转录的核纤层蛋白。 因为核纤层蛋白和可能有的NuMA与转录调节和人类的疾病有关，核纤 层蛋白A/C在常规的核移植原核中持续的存在，也许是功能性改变程 序不正确的表示。我们推论，体外核分解和染色质转移比传统的核移 植或核注射产生更正常的原核。

用改变程序的染色质团或透化细胞作为供体来源的克隆效率

如实施例3中所述，建立了一种表示为“SLOT”的新的克隆步骤， 该步骤包括链球菌溶血素O(SLO)诱导的原代胎牛成纤维细胞的透化； 将透化的细胞置于改变程序培养基(例如有丝分裂提取物)中处理30 分钟；用含2mM钙的培养物重封该成纤维细胞；以及用标准的细胞融 合方法将染色质转移到卵母细胞中。

为了实施此克隆方法，将一小瓶链球菌溶血素O(Sigma S-5265； 2500单位，以贮藏粉的形式在4℃下贮藏)溶于400μlH2O中，并充分 混合。将全部内含物转移到15ml的锥形管内，然后加入3.6mlH2O，并 旋转混合。浓度为母液浓度0.062U/μl、分成10μl的小份在20℃ 下冷冻。在室温下，将细胞(约100,000)悬浮在100μl HBSS(Gibco BRL，目录号14170-120)中。将这些细胞汇合，这样约80-85％的细 胞是在G1期，大多数其他细胞是在S期。加入链球菌溶血素储存液 (5μl)(即，终浓度为500ng/ml或0.3U/μl)，然后将此混合物在 水浴中38℃下温育25分钟。在温育期间将试管轻轻敲打2-3次，以 保证细胞保持在悬浮状态。加入室温的PBS(200μl)，然后用移液管 温和地抽吸，使其充分混合。用台式离心机，在5,000rpm、室温下， 将细胞离心5分钟，弃去全部上清液。在此阶段，细胞沉淀很小，可 能看不清楚。加入含有ATP产生系统的有丝分裂提取物(40μl，“MS 15”)，并充分混合。该提取物在细胞离心的期间制备，即融化一小 瓶40μl的提取物，加入1.2μl ATP产生系统，充分混合并在室温下温 育。这种有丝分裂提取物与以上章节所述的用于产生染色质团的提取 物相同。混合物在水浴中38℃下温育30分钟，并不时的温和地敲打 试管。加入室温的重封培养基(RM，500μl)(添加了2mM CaCl2的完 全α-MEM[Bio-Whittaker]培养基，其中的CaCl2取自1M储存液)。使 管子开着口在CO2温箱中培养2小时，并不时地敲打管子，以保证细胞 保持在悬浮的状态。然后用台式离心机将细胞在5,000rpm、室温下离 心5分钟。将细胞沉淀重新悬浮在100μl室温的TLHEPES(Bio- Whittaker，目录号04-616F)中，另加入900μl TLHEPES。核转移用 标准步骤进行。按前面章节所述的染色质转移一样，使卵母细胞激活 并转移到受体哺乳动物中。

本发明采用SLOT法和染色质转移法所形成的胚胎的发育归纳在表 3中。SLOT的胚泡时期的发育比常规核转移的胚胎稍差。SLOT和核转 移在胚泡期的发育的差别，可能是由于核转移所使用的细胞周期中的 G1时期细胞的百分率大于SLOT所使用的G1时期细胞的百分率而产生 的影响。染色质转移胚胎的存活率较低，对于侵入性的步骤，这是预 期到的。

比较了核转移和SLOT胚胎在妊娠期40天的妊娠率(表3)。SLOT 胚胎妊娠40天～60天的存活率高于用常规方法产生的核转移胚胎。

表3染色质转移(CT)、核移植、和SLOT产生的牛胚胎克隆的发 育。

        转移数  存活数    原核       卵裂数     胚泡数     40天

                          时期数     (％)                  妊娠数

                (％)      (％)                  (％)       (％)

CT      1503    736(49)   355(23.5)  81(5.3)    3          0

SLOT    1884    1802(97)  未测       575(30.5)  156(8.3)   24/65(37)

核移植  1821    1682(92)  未测       764(41.9)  235(12.9)  39/103(36)

        40-60天

        存活数/总数

        (％)

CT      ND

SLOT    7/10(70)

核移植  8/16(50)

如以上所示，通过将重建的卵母细胞在钙中温育数小时，使卵母 细胞重封，然后插入受体哺乳动物中，从而可能增加染色质转移胚胎 的存活率。通过缩短从培养物中取出细胞至使其与卵母细胞融合之间 的时间，也可以增加SLOT胚胎的存活率。例如，可以缩短在链球菌溶 血素O中的温育时间、在改变程序培养基中的温育时间、和/或在重封 培养基中的温育时间。特别是在重封培养基中温育可以减少至大约1 小时或更短。这种缩短时间的重封处理可以如以上所述，在2mM存在 下进行，或在高浓度的钙(例如，约2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、 或6.0mM的钙)存在下进行，以增加重封的速度。通过减少细胞与卵 母细胞融合之前的处理时间，该细胞进入S期并开始DNA的复制的可 能性就较少，这降低重建的卵母细胞的存活率。

实施例5：产生嵌合的哺乳动物的方法

一般认为，很多用传统方法克隆哺乳动物所发生的自然流产是因 胎盘的异常而引起的，而不是因胎儿的问题所引起。因此，建立了产 生嵌合胚胎的方法，该嵌合胚胎的胎盘组织主要来自一种来源(例如， 体外受精的、自然产生的，或单性激活的胚胎)，而胎儿组织主要来 自另一种来源(例如，核转移胚胎)。嵌合胚胎的胎盘组织主要来源 于体外受精的、自然产生的、或单性激活的胚胎的细胞时，有可能更 类似于自然产生的胎盘组织，并导致存活的后代的产量增加。优选该 后代的大部分细胞来自核转移胚胎的细胞，从而具有基本上与产生核 转移胚胎的供体细胞相同的基因组。

在一种这样的方法中，来源于体外受精胚胎的细胞注射入致密胎 胎的周围(例如，在透明带和胚胎本身之间)，该致密胚胎是用传统 的核转移方法或这里所描述的任何一种新的克隆方法产生的。在另一 种方法中，使来源于前致密的、体外受精胚胎的细胞与来源于用本发 明的克隆方法产生的胚胎的细胞(例如，用改变程序的染色质团或透 化细胞作为供体来源)共同温育，温育的条件是可使来自每种胚胎的 细胞重组而产生单个嵌合胚胎(Wells和Powell，Cloning 2：9- 22，2000)。在上述两种方法中，来源于体外受精胚胎的细胞优先掺入 胎盘，而来源于核转移方法的细胞优先掺入胎儿组织。这些方法在下 面进一步描述。

G1 成纤维细胞的分离

采用以前描述的“甩出”法(Kasinathan等，Nature iotech.19：1176-1178，2001)，分离出G1成纤维细胞作为供体细胞， 用以产生核转移胚胎。简单地说，分离前24小时，将5.0×105个细胞 铺于100mm的含有10ml的α-MEM加FCS的组织培养板上。第2天，用 PBS洗涤培养板，并更换培养基，1～2小时后进行分离。然后使该板 在Vorter-Genie 2(Fisher Scientifie，Houston，TX，中等速度) 上振摇30-60秒。除去培养基，在500×g下旋转5分钟，细胞沉淀重 悬浮于250μl的MEM加FCS中。此细胞悬浮液含有新分裂的由细胞质 桥相连的细胞双联体、一些单个细胞、和中期或后期细胞。由细胞质 桥相连的细胞双联体用作核转移的供体细胞。

核移植、激活和胚胎培养

采用分离的G1成纤维细胞的核转移步骤基本上按以前所述的方法 (Cibelli等，Nature biotech.16(7)：642-646，1998；Kasinathan 等，Biol.Reprod.64(5)：1487-1473，2000)进行。体外成熟的卵母 细胞在成熟后约18-20小时去核，在紫外灯下，用双苯亚胺(Hoechst 33342，Sigma)标记确认染色体的去除。这些细胞质-供体细胞对采用 2.4KV/cm，20微秒的单电流脉冲(Etectrocell manipulate200，Genetronics，San Diego，CA)进行融合。成熟后30 小时，按以前所描述的方法(Liu等，Mol.Reprod.Dev.49：298- 307，1998；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.38：380-385)，用钙离子 载体(5μM)对重构的卵母细胞和对照激活4分钟(Cal biochem，San Diego，CA)，然后用含10μg环己酰亚胺和2.5μg细胞松弛素D (Sigma)的ACM培养基(100mM NaCl、3mM KCl、0.27mM CaCl2、25mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸、1mML谷氨酰胺，3mg/ml BSA(无 脂肪酸)，1％BME氨基酸，和1％MEM非必须氨基酸；全部购自Sigma) 激活6小时。激活后，用HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM- HEPES，114mM NaCl，3.2mM KCl，2mM CaCl2，10mM乳酸钠，0.1mM丙 酮酸钠，2mM NaHCO3，10mM HEPES，和1％BME氨基酸；Sigma)将卵 洗涤5次，然后放入4孔组织培养板上的培养物中，培养物含有覆盖 0.2ml胚胎测试矿物油的小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基。 每孔放入25～50个胚胎，并在38.5℃下在含5％CO2的空气中温育。 在第4天，在培养基中加入10％FCS。在第7和第8天，记录发育成胚 泡时期。

牛的体外受精

按照早期所描述的方法(Collas等，Mol.Reprod.Dev.34：224- 231，1993)进行体外受精，以产生体外受精的牛胚胎。用精子TL储存 液制备45％和90％的等渗Percoll梯度，(Parrish等 Theriogenology 24：537-549，1985)。将来自一头公牛的冷冻-融化 的牛精子在上述梯度上铺层，并在700×g(尖端半径为6.37英寸， 2000rpm)下离心30分钟。测定沉淀中的精子浓度，用精子TL(精子 TL储存液，1mM丙酮酸，6mg/mlBSA，和1％PS)将精子稀释至受精的 终深度为106个精子/ml。在卵母细胞成熟后22小时，用TL HEPES洗 涤三次，然后放在Nukc孔内的480μl受精TL(Bavister 等，Biol.Reprod.28：235-247，1983)中，孔内含有6mg/ml BSA，0.2mM 丙酮酸，20μM青霉氨、10μM次牛磺酸，1mM肾上腺素(Leibfried等， J.Reprod.Fertil.66：87-93，1982)，以及0.004μg/ml肝素。50个 卵母细胞中加入20微升的精子，使终浓度为106个精子/ml。培养条件 与上述核转移的条件相同。根据原核的发育，受精率为90％以上。

嵌合的核转移胚胎

8细胞时期(6-12个卵裂球)的体外受精胚胎在大约受精后96小 时、致密之前收集。用蛋白酶(3mg/ml，用TL-HEPES配制)除去透明 带。用解剖显微镜仔细监测该透明带的溶解。当透明带开始出现溶解 时(约2分钟)，将胚胎取出，用TL-HEPES洗涤，并转移到含有HanK’S 平衡盐溶液的30mm培养皿中，在37.5℃下温育30分钟。将这些前致 密胚胎产生的卵裂球转移到100mm培养皿中矿物油覆盖下的TL-HEPES 微滴中(50μl)。挑选4天的8-16细胞时期的核转移胚胎并转移到含 有卵裂球的同一微滴中。这些核转移胚胎包括前致密胚胎(例如，8细 胞时期的胚胎)和致密胚胎(例如，16时期的胚胎)。然后采用标准 的显微镜操作技术，用斜面的微量移液管(35μm直径)将4-6个卵裂 球转移到核转移胚胎中。卵裂球转移后，和所述的核转移胚胎一样， 进行胚胎的培养。

在第7和第8天，对发育至胚泡的嵌合胚胎进行评定，并分析该 胚泡中膜染料DiI的存在。该染料是在体外受精胚胎细胞注射入核转 移胚胎之前加入该细胞中的。该细胞在第4天标记，在第7天观察。 该染料在原始被染细胞的后代中维持很少的几次细胞分裂，在经过很 少几次细胞分裂后，可以对嵌合胚胎进行分析。根据此分析，体外受 精的胚胎的细胞已掺入嵌合胚胎中。如果需要，可以采用标准的方法， 使用对体外受精胚胎或核转移胚胎的核酸特异的探针，进行荧光原位 杂交(FISH)(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，pp.14.7.1- 14.7.12，1995)。在嵌合胚胎处于体外培养、或胎儿、或由此胚胎产 生的后代时期，这种FISH分析可以用来测定来自各种胚胎的细胞在嵌 合胚胎的分布(例如，测定掺入内层细胞团的细胞百分数，以及掺入 滋养外胚层的细胞百分数)。或者，可将某种报告基因，例如绿色荧 光蛋白加入来自其中一种胚胎的细胞中，并用来监测细胞在嵌合胚胎 的胎盘和各种胎儿组织中的掺入。

胚胎转移

第7和第8天，将来源于核转移胚胎和嵌合的核转移胚胎的1级 和2级核转移胚泡转移到6天和7天的同步的受体小母牛中。采用单 次注射Lutalyse(Parmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)使受体同步， 随后探测其动情期。用超声法在胚胎转移后30和60天，检测受体是 否妊娠，此后每30天通过直肠扪诊，直至240天。表4是嵌合胚胎和 由转基因牛成纤维细胞和卵母细胞融合所产生的对照胚胎在40天的妊 娠结果的比较。这些结果表明较大数量的嵌合胚胎存活至40天。

表4、胚胎转移和妊娠 植入 对照核转移 嵌合的核转移 受体数  40天妊娠  受体数  40天妊娠 第1次 2  1  2  1 第2次 6  1  4  3 合计 8  2(25％)  6  4(67％)

产生嵌合胚胎的另一种方法

标准的方法可以用来改进上述产生嵌合基因的方法。例如，自然 产生的胚胎可以通过手术从哺乳动物(例如，牛)分离出来，或卵母 细胞可以用标准技术单性激活并代替体外受精的胚胎而使用。如果需 要，可将较少量体外受精的、自然产生的、或单性激活的胚胎(例如， 1、2、3、4或5个细胞)注入核转移胚胎内，以减少掺入胎儿组织的 注入细胞及其后代的百分数。或者，可以注入较多的细胞(例如6、7、 8、9、10、11或更多个细胞)以增加掺入胎盘组织的注入细胞及其后 代的百分数。此外，也可以使用来自胚胎其他细胞时期的细胞。例如 在4、8、16、32、64、128、256、512或更晚的细胞时期的体外受精 的、自然产生的、或单性激活的胚胎的细胞可以注射入在4、8、16、 32、64、128、256、512，或更晚的细胞时间的核转移胚胎中。该注射 的细胞和核转移胚胎可以在相同的细胞时期或在不同的细胞时期。在 一个实施方案中，体外受精的、自然产生的、或单性激活的胚胎相对 于核转移胚胎，其染色体倍数性有所增加(例如DNA含量为4n)，这 样，使注射的细胞更倾向掺入滋养外胚层(即，主要形成胎盘组织的 胚胎的最外层细胞)。如果需要，所有，或部分透明带可以仍然包围 着注射的细胞，而不是在注射之前将其去除。

在其他可选择的方法中，来源于体外受精、自然产生、或单性前 致密胚胎或致密胚胎的细胞与前致密核转移胚胎的细胞，在使来自每 种胚胎的细胞重组而产生单胚胎的条件下(Wells和Powell，Cloning 2：9-22，2000)一起温育。预期来源于体外受精的、自然产生的、或单 性的胚胎的细胞主要对滋养外胚层的形成起作用，从而最终对胎盘的 组织起作用，而预期来源于核转移胚胎的细胞主要对内层细胞团的形 成起作用，从而最终对胎儿组织起作用。来源于上述二种胚胎的细胞 可以在相同的细胞时期或在不同的细胞时期，而且，相同或不同数量 的来自每种胚胎的细胞可以结合而形成聚集的胚胎。

其他实施方案

由前面所述，显然，对这里所描述的本发明可以进行改变和改进， 使其适应于不同的用途和场合。这种实施方案也在以下提出的权利要 求的范围内。

本说明书中提及的所有出版物特在此引入作为参考，在某种程度 上相当于将每篇独立的出版物或专利中请专门并单独地表明被引入作 为参考。

                      发明背景