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免疫刺激性核酸

阅读：679发布：2020-10-05

专利汇可以提供免疫刺激性核酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是有关免疫刺激性核酸组合物和利用这些组合物的方法。富含T的核酸含有多T序列和/或含有超过25％的T核苷酸残基。TG核苷酸中含有TG双核苷酸，富含C的核苷酸含有至少一个多C区域和/或超过50％的C核苷酸。这些免疫刺激性核酸与含有CpG基元的核酸以相似的方式起作用。本发明同时包括优选的CpG核酸。，下面是免疫刺激性核酸专利的具体信息内容。

1.一种刺激免疫反应的方法，包括将从含有富含Py的核酸和 TG核酸组成的组中选出的免疫刺激性核酸以能够在非啮齿 实验对象上诱导免疫反应的有效的量给予非啮齿实验对 象。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是富 含T的核酸。
3.根据权利要求2中所述的方法，其中富含T的核酸是包含 5’TTTT3’的多T核酸。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中多T核酸包括 5’X1X2TTTTX3X43’，其中X1，X2，X3和X4是核苷酸。
5.根据权利要求3中所述的方法，其中富含T的核酸包括多 个多T核酸基元。
6.根据权利要求4中所述的方法，其中X1X2是TT。
7.根据权利要求4中所述的方法，其中X3X4是TT。
8.根据权利要求4中所述的方法，其中X1X2是从由TA，TG， TC，AT，AA，AG，AC，CT，CC，CA，GT，GG，GA 和GC组成的组中选出的。
9.根据权利要求4中所述的方法，其中X3X4是从由TA，TG， TC，AT，AA，AG，AC，CT，CC，CA，GT，GG，GA 和GC组成的组中选出的。
10.根据权利要求3中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于25％的T的核苷酸组合物。
11.根据权利要求1中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于35％的T的核苷酸组合物。
12.根据权利要求1中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于40％的T的核苷酸组合物。
13.根据权利要求1中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于50％的T的核苷酸组合物。
14.根据权利要求1中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于60％的T的核苷酸组合物。
15.根据权利要求1中所述的方法，其中富含T的免疫刺激性 核酸含有组成中有大于80％的T的核苷酸组合物。
16.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 至少20个核苷酸。
17.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 至少24个核苷酸。
18.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 一个核苷酸骨架，这个核苷酸骨架包括至少一个骨架修饰。
19.根据权利要求18中所述的方法，其中骨架修饰是硫代磷酸 酯修饰。
20.根据权利要求18中所述的方法，其中核苷酸骨架是嵌合的。
21.根据权利要求18中所述的方法，其中核苷酸骨架是全部被 修饰的。
22.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 有CpG双核苷酸。
23.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 有未甲基化的CpG双核苷酸。
24.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 有甲基化的CpG双核苷酸。
25.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 有多C序列。
26.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 多A序列。
27.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 多G序列。
28.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 组成中有大于25％的C的核苷酸组合物。
29.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸含有 组成中有大于25％的A的核苷酸组合物。
30.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是口 服给予的。
31.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是局 部给予的。
32.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是通 过一个持续释放介质给予的。
33.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是通 过黏膜给予到黏膜表面的的。
34.根据权利要求33中所述的方法，其中免疫反应是黏膜免疫 反应。
35.根据权利要求33中所述的方法，其中免疫反应是系统免疫 反应。
36.根据权利要求33中所述的方法，其中黏膜是从由口黏膜、 鼻黏膜、直肠黏膜、阴道黏膜和眼黏膜组成的组中选出的。
37.根据权利要求1中所述的方法，进一步包括将实验对象接 触抗原，并且其中免疫反应是抗原特定性的免疫反应。
38.根据权利要求37中所述的方法，其中编码抗原的核酸载体 被给予实验对象，并且其中核酸载体与免疫刺激性核酸是 分开的。
39.根据权利要求37中所述的方法，其中抗原是缩氨酸抗原。
40.根据权利要求1中所述的方法，进一步包括从实验对象上 分离免疫细胞；使免疫细胞接触能够活化免疫细胞的有效 量的免疫刺激性核酸；和再次将已经被活化的免疫细胞给 予将实验对象。
41.根据权利要求40中所述的方法，其中免疫细胞是白细胞。
42.根据权利要求41中所述的方法，进一步包括将免疫细胞接 触抗原。
43.根据权利要求40中所述的方法，其中抗原是从由瘤抗原、 滤过性毒菌抗原、细菌抗原和寄生抗原组成的组中选出的。
44.根据权利要求40中所述的方法，其中免疫细胞是枝状细胞。
45.根据权利要求1中所述的方法，其中实验对象患有哮喘或 者有患哮喘的危险，并且方法是治疗或预防实验对象哮喘 的方法。
46.根据权利要求1中所述的方法，其中实验对象患有敏感症 或者有患敏感症的危险，并且方法是治疗或预防实验对象 敏感症的方法。
47.根据权利要求1中所述的方法，其中实验对象患有癌症， 并且方法是治疗癌症的方法。
48.根据权利要求47中所述的方法，其中癌症是从由胆囊癌； 脑癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；CNS癌、结肠癌； 结缔组织癌、子宫内膜癌；眼癌、胃癌；上皮内瘤；喉癌， 淋巴瘤；Hodgkin淋巴瘤，肝癌；肺癌(例如小细胞和非小 细胞)；黑素瘤；成神经细胞瘤；口癌；口腔癌，卵巢癌； 胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；恶性毒瘤；甲状腺癌和肾癌， 以及其它癌和恶性毒瘤。
49.根据权利要求1中所述的方法，其中癌症是从由骨癌；脑 癌和CNS癌、结缔组织癌、食道癌、眼癌、Hodgkin淋巴 瘤、喉癌，口腔癌、皮肤癌和睾丸癌组成的组中选出的。
50.根据权利要求47中所述的方法，进一步包括给予抗癌治疗 物。
51.根据权利要求50中所述的方法，其中抗癌治疗物是抗体。
52.根据权利要求47中所述的方法，其中实验对象是人类。
53.根据权利要求47中所述的方法，其中实验对象是从由狗、 猫和马组成的组中选出的。
54.根据权利要求1中所述的方法，进一步包括给予对表面抗 体有特定性的抗体，并且其中免疫反应导致依赖于抗原的 细胞毒性(ADCC)。
55.根据权利要求1中所述的方法，其中实验对象患有传染病 或者有患传染病的危险，并且其中方法是治疗或预防传染 病的方法。
56.根据权利要求54中所述的方法，其中实验对象是人类。
57.根据权利要求54中所述的方法，进一步包括将抗原给予实 验对象。
58.根据权利要求57中所述的方法，其中抗原是从由细菌抗原、 滤过性毒菌抗原、寄生抗原和真菌抗原组成的组中选出的。
59.根据权利要求56中所述的方法，其中实验对象是从由狗、 猫、马、母牛、猪、绵羊、山羊、小鸡、猴和鱼组成的组 中选出的。
60.根据权利要求59中所述的方法，进一步包括将抗原给予实 验对象。
61.根据权利要求59中所述的方法，其中抗原是由微生物衍生 而来，这些微生物是从由疱疹病毒属、逆转录病毒属、正 粘病毒属、弓形虫属、嗜血杆菌属、弯曲杆菌属、梭菌、 大肠埃希氏菌和葡萄状球菌。
62.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸是TG 核酸。
63.根据权利要求62中所述的方法，其中TG核酸包括 5’N1X1TGX2N23’。
64.根据权利要求62中所述的方法，其中TG核酸包括5’N1X1 X2TGX3X4N23’。
65.根据权利要求63中所述的方法，其中N1是由范围在11-N2 到21-N2之内的许多核苷酸组成的一个核酸序列。
66.根据权利要求63中所述的方法，其中N2是由范围在11-N1 到21-N1之内的许多核苷酸组成的一个核酸序列。
67.根据权利要求64中所述的方法，其中N1是由范围在9-N2 到19-N2之内的许多核苷酸组成的一个核酸序列。
68.根据权利要求64中所述的方法，其中N2是由范围在9-N1 到19-N1之内的许多核苷酸组成的一个核酸序列。
69.根据权利要求63中所述的方法，其中X2是胸腺嘧啶脱氧核 苷。
70.根据权利要求64中所述的方法，其中X3是胸腺嘧啶脱氧核 苷。
71.根据权利要求64中所述的方法，其中X1X2是从由GT、GG、 GA、AA、AT、AG、CT、CA、CG、TA和TT组成的组中 选出的核苷酸。
72.根据权利要求64中所述的方法，其中X3X4是从由TT、CT、 AT、AG、CG、TC、AC、CC、TA、AA和CA组成的组中 选出的核苷酸。
73.根据权利要求63中所述的方法，其中X3X4是从由TT、TC、 TA和TG组成的组中选出的核苷酸。
74.根据权利要求1中所述的方法，其中实验对象有患癌症的 危险，并且方法是预防癌症的方法。
75.根据权利要求50中所述的方法，其中抗癌治疗药物是从由 化疗药物、免疫疗法药物和癌症疫苗。
76.一种在实验对象中预防疾病的方法，包括：在定期基础上， 给予实验对象免疫刺激性核酸以在实验对象中预防疾病， 其中免疫刺激性核酸是从由富含T的核酸和TG核酸组成的 组中选出的。
77.一种诱导天生免疫反应的方法，包括：在定期基础上，给 予实验对象免疫刺激性核酸以能够活化天生免疫反应的有 效量，其中免疫刺激性核酸是从由富含T的核酸和TG核酸 组成的组中选出的。
78.一种组合物包括：包含免疫刺激性核酸的持续释放介质， 其中免疫刺激性核酸是不含未甲基化的CpG基元并且是从 由富含T的核酸和TG核酸组成的组中选出的。
79.根据权利要求78中的所述的组合物，其中免疫刺激性核酸 有磷酸二酯骨架。
80.一种营养补充的组合物包括：含有免疫刺激性核酸的给予 介质是从胶囊、药丸和舌下药片组成的组中选出的，其中 免疫刺激性核酸是不含未甲基化的CpG基元并且是从由富 含T的核酸和TG核酸组成的组中选出的。
81.根据权利要求80中所述的组合物，其中免疫刺激性核酸有 磷酸二酯骨架。
82.一种组合物包括：免疫刺激性核酸和抗原，免疫刺激性核 酸是不含未甲基化的CpG基元并且是从由富含T的核酸和 TG核酸组成的组中选出的。
83.一种组合物包括：免疫刺激性核酸和抗微生物药物，免疫 刺激性核酸是不含未甲基化的CpG基元并且是从由富含T 的核酸和TG核酸组成的组中选出的。
84.根据权利要求83中所述的组合物，其中抗微生物药物是从 抗滤过性毒菌药物、抗真菌药物、抗寄生药物和抗细菌组 成的组中选出的，
85.根据权利要求5中所述的方法，其中免疫刺激性核酸包括 至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个T基 元。
86.根据权利要求5中所述的方法，其中许多多T基元中的至 少有2个多T基元每一个包括至少3个相邻的T核苷酸残 基。
87.根据权利要求5中所述的方法，其中许多多T基元中的至 少有2个多T基元每一个包括至少4个相邻的T核苷酸残 基。
88.根据权利要求5中所述的方法，其中许多多T基元是至少3 个基元，并且其中至少3个基元每一个包括至少3个相邻 的T核苷酸残基。
89.根据权利要求5中所述的方法，其中许多多T基元是至少4 个基元，并且其中至少4个基元每一个包括至少3个相邻 的T核苷酸残基。
90.根据权利要求5中所述的方法，其中许多多T基元中的至 少有1个多T基元每一个包括至少5个、至少6个至少7 个或至少8个相邻的T核苷酸残基。
91.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 两个CpG双核苷酸。
92.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 三个CpG双核苷酸。
93.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸包括 至少两个有至少3个相邻C核苷酸残基的多C序列。
94.根据权利要求1中所述的方法，其中免疫刺激性核酸不含 两个有至少3个相邻A核苷酸残基的多A序列。
95.一种药学组合物，包括有效量的能够能够刺激免疫反应的 权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、32、40、41、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、85、86、87、88、89、90、91、92、93或94中的 分离免疫刺激性核酸和药学上可接受的载体。
96.一种物质组合物，包括权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、32、40、41、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、85、86、87、88、89、90、 91、92、93或94中的有效量的分离免疫刺激性核酸和药学 上可接受的载体。
97.根据权利要求80中所述的方法，其中核酸进一步包括许多 CpG基元，并且其中许多CpG基元中至少3个基元、至少 4个基元并且其中至少4个基元每个包括至少3个相邻T核 苷酸残基。
98.根据权利要求90中所述的方法，其中许多CpG基元和多T 基元是交叉分布的。
99.一种组合物，包括：免疫刺激性核酸和抗癌治疗物，在药 学上可接受的载体里并以能够治疗癌症或能够减少患癌症 危险的有效的量被制备，其中免疫刺激性核酸是是从由富 含T的核酸和TG核酸组成的组中选出的。
100.一种组合物，包括：免疫刺激性核酸和哮喘/敏感药物，在药 学上可接受的载体里并以能够预防或治疗与接触哮喘或敏感 的调节者有关的免疫反应的有效量被制备，其中免疫刺激性 核酸是是从由富含T的核酸和TG核酸组成的组中选出的。
101.一种组合物包括：从由序列号为95-136、序列号为138-152、 序列号为154-222、序列号为224-245、序列号为247-261、 序列号为263-299、序列号为301、序列号为303-409、序 列号为414-420、序列号为424、序列号为426-947、序列 号为959-1022、序列号为1024-1093的核酸组成的组中选 出的免疫刺激性核酸和药学上可接受的载体。
102.一种组合物包括，本质上含有5’M1TCGTCGTTM23’的免疫 刺激性核酸，其中C中至少有一个是未甲基化的，其中M1 是有至少一个核苷酸的核酸，其中M2是含有从0到50个 核苷酸的核酸，并且其中免疫刺激性核酸有至少100个核 苷酸。
103.一种药学组合物包括：包含5’TCGTCGTT3’的免疫刺激性 核酸，其中C中至少有一个是未甲基化的，其中免疫刺激 性核酸有至少100个核苷酸，和持续释放介质。
104.根据权利要求103中所述的药学组合物，其中持续释放介 质是微粒。
105.根据权利要求103中所述的药学组合物，进一步包括抗原。

说明书全文

本发明的背景

细菌的DNA有B细胞和自然的杀伤细胞的免疫刺激效果， 但是脊椎动物的DNA没有这样的免疫刺激效果。(Tokunaga，T.， et al.，1988.Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.，et al.， 1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.，et al.，1991，J. MeImmunol.147：1759-1764；和在Krieg中的综述，1998，In： Applied Oligonucleotide Technology，C.A.Stein and A.M.Krieg， (Eds.)，John Wiley and Sons，Inc.，Newyork，NY,pp431-448)。现 在人们已经认识到：这些细菌DNA的免疫刺激效果是因为未甲 基化的CpG双核苷酸在特定的碱基(CpG基元)中存在的结果， CpG基元在细菌的DNA中是很常见的，但是在脊椎动物的DNA 中都是以甲基化的和未被充分代表的(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10)。 这种细菌DNA的免疫刺激效果可以用合成的低聚脱氧核苷酸 (ODN)来实现。这种低聚脱氧核苷酸中含有这些CpG的主要 基元。这种具有CpG的主要基元的低聚脱氧核苷酸对人类和老 鼠的白细胞有很高的刺激作用，导致B细胞的复制；细胞浆和 免疫球蛋白的分泌；自然杀伤细胞(NK)溶解活性和IFN-γ 的分泌；枝状细胞(DCS)和其它含抗原的细胞产生共刺激分 子以及分泌细胞分裂素，特别是类似Th1的细胞分裂素在促进 类似Th1的T细胞反应的发展中很重要。含有自然的磷酸二酯 骨架的CpG低聚脱氧核苷酸的免疫刺激作用是具有高度的CpG 特殊性的，因为，如果CpG主要基元被甲基化变为GpC，或 被减少，或被改变的话，这种免疫刺激作用就被从根本上破坏 了。(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10)。磷酸二酯CpG的ODN 可以制备到类酯类、矾或其它类型的具有储存性能的介质中， 或者提高细胞吸收以增加免疫刺激效果。(Yamamoto et al，1994 Microfiol.Immunol.38：831-836；Gramzinski et al，1998 Mol.Med. 4：109-118)。

在早期的研究中，人们认为：免疫刺激CpG主要基元是按 照如下的序列：嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶排列的。(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Pisetsky，1996 J.Immunol.156：421- 423；Hacker et al.，1998 EMBOJ.17：6230-6240；Lipford et al，1998 Trends in Microbiol.6：496-500)。但是，现在十分清楚的是：老 鼠的淋巴细胞与磷酸二酯CpG基元相同，而不是上述的“嘌呤 -嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶公式基元”(Yi et al.，1998 J. Immunol.160：5898-5906)，并且人类的B细胞和枝状细胞也是 磷酸二酯CpG的基元。(Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10；Liang，1996J.Clin.Invest.98：1119-1129)。

过去一些研究者考察了ODN中的核苷酸部分在脱离ODN 序列的情况下能否继续有效果。很有趣的是，研究发现：如果 碱基的使用是随机的话，信使(antisense)ODN一般富含GG、 CCC、CC、CAC和CG序列；然而却含有比预期要少的TT或 TCC核苷酸序列(Smetsers et al.，1996 Antisense Nucleic Acid Drug Develop.6：63-67)。这就增加了这种可能性：过分表达的 序列可能包含对于信使寡核苷酸或visa versa是优选的目标元 素。在信使实验中避免使用富含胸腺嘧啶脱氧核苷的ODN的一 个原因是：细胞中的核酸酶使ODN降解释放出自由的胸腺嘧 啶脱氧核苷酸，这种胸腺嘧啶脱氧核苷酸会与3H-腺嘧啶脱氧 核苷酸产生竞争，而3H-腺嘧啶脱氧核苷酸是常用于测定细胞 复制的实验中。(Matson et al.，1992 Antisense Research and Development 2：325-330).

本发明的概述

本发明部分地是有关富含吡啶(Py-rich)和在一些实施方 案中富含胸腺嘧啶脱氧核苷(T)的免疫刺激性核酸不需要CpG主 要基元的存在。本发明还部分地有关一个发现：含有TG双核 苷基元的核酸同样具有免疫刺激性能。本发明部分地建立在不 含CpG主要基元的核酸序列具有免疫刺激性能这个出乎预料的 发现之上的。在分析许多核酸序列的免疫刺激性能的基础上， 我们发现这些序列可能是富含吡啶(Py-rich)例如富含T，或 者它们含有TG主要基元。我们还发现这些序列优先活化非啮 齿动物的免疫细胞。与非啮齿动物的免疫细胞相比，至于啮齿 动物的免疫细胞，Py-rich和TG序列只有很微小的免疫刺激活 性。这样一来，使得在非啮齿动物身上通过使用Py-rich和TG 具有免疫刺激性能的核酸导致免疫反应成为可能。本发明中的 Py-rich和TG具有免疫刺激性能的核酸最好可以包括CpG主要 基元。这些发现在临床开发含有或不含有CpG具有免疫刺激性 能的核酸中具有重要的应用价值。

一方面，本专利讲述了一种药学组合物。这种组合物包含 了能够刺激免疫反应的分离的Py-rich或TG免疫刺激性核酸的 有效剂量和一种药学上可以接受的载体。另一方面，本发明是 一种物质组合物，包括分离的Py-rich和TG免疫刺激性核酸。 在其它实施方案中，免疫刺激性核酸可以是富含T的。在更其 它的实施方案，免疫刺激性核酸可以是富含T而且也含有至少 一个TG基元。

优选的是，Py-rich核酸是一种富含T的核酸。在一些实施 方案中，富含T的免疫刺激性核酸是一种含有5’TTTT3’的多T 核酸。在其它的实施方案中，多T核酸包含5’X1X2TTTTX3X43’， 其中X1、X2、X3和X4是核苷酸。在一些实施方案中，X1X2是 TT和/或X3X4是TT。在其它实施方案中，X1X2从由TA，TG， TC，AT，AA，AG，AC，CT，CC，CA，CG，GT，GG，GA， 和GC组成的组中选出的，和/或X3X4是从由TA，TG，TC，AT， AA，AG，AC，CT，CC，CA，CG，GT，GG，GA，和GC组 成的组中选出的。

富含T的免疫刺激性能的核酸可能只含有一个多T基元或 者含有许多多T核酸基元。在一些实施方案中，富含T的免疫 刺激性核酸包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个， 至少6个，至少7个，至少8个T基元。在其它实施方案中， 富含T的免疫刺激性核酸包含至少2个，至少3个，至少4个， 至少5个，至少6个，至少7个，至少8个CpG基元。在优选 的实施方案中，很多的CpG基元和多T基元是交叉分布的。

在更其它实施方案中，许多多T基元中至少有一个包含至 少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8 个或者9个相邻的T核苷酸残基。在其它实施方案中，许多多 T基元是至少3个基元并且其中至少3个基元每一个基元至少 含有3个相邻的T核苷酸残基，或者许多多T基元是至少4个 基元并且其中至少4个基元每一个至少含有3个相邻的T核苷 酸残基。

在一些实施方案中，富含T的免疫刺激性核酸可以不含多 T基元，然而它的核苷酸组成中可以包括超过25％的T。在其 它的实施方案中，富含T的免疫刺激性核酸含有多T基元并且 也含有T含量超过25％的核苷酸组合物。在优选的实施方案中， 富含T的免疫刺激性核酸的核苷酸组成中有超过35％的T；超 过40％的T；超过50％的T；超过60％的T；超过80％的T； 或超过90％的T核苷酸残基。在重要的实施方案中，核酸中含 有至少50％的T。

多T和TG免疫刺激性核酸可以含有超过7个核苷酸的任意 长度。但是，在一些实施方案中，核酸有8到100个核苷酸残 基的长度。在优选的实施方案中，富含T的免疫刺激性核酸含 有至少20核苷酸；至少24核苷酸；至少27核苷酸；或者至少 30核苷酸。在优选的实施方案中，TG免疫刺激性核酸的长度 在15-25个核苷酸的范围内。富含T和TG免疫刺激性核酸可 以是单条或成对的。

在一个优选的实施方案中，免疫刺激性核酸在它的长度中 间有一个富含T的区域(例如：大致相同数目的核苷酸在5’和 3’末端分布，位于多T区域的两侧。)

在一些实施方案中富含T的核酸选自于以下的小组：SEQ ID 号：59-63，73-75，142，215，226，241，267-269，282， 301，304，330，342，358，370-372，393，433，471，479， 486，491，497，503，556-558，567，694，793-794，797， 833，852，861，867，868，882，886，905，907，908，和910 -913。在其它实施方案中富含T的核酸选自于以下的小组：SEQ ID号：64，98，112，146，185，204，208，214，224，233， 244，246，247，25 8，262，263，265，270-273，300，305， 316，317，343，350，352，354，374，376，392，407，411- 413，429-432，434，435，443，474，475，498-501，518， 687，692，693，804，862，883，884，888，890和891。

在其它实施方案中富含Py的核酸是富含C的核酸。一个富 含C的免疫刺激性核酸是含有至少一个优选的是至少2个多C 区域或含有50％或更多的C核苷酸的核酸。

富含Py和TG的免疫刺激性核酸可以含有一个或多个CpG 基元。这些基元可以甲基化或未甲基化。在其它实施方案中， 富含Py和TG的免疫刺激性核酸中不含一个或多个CpG双核苷 酸。

在其它实施方案中，富含Py和TG的免疫刺激性核酸中也 含有多A，多G，和/或多C基元。在更其它实施方案中，TG 免疫刺激性核酸中不含两个至少含有3个连续C核苷酸残基的 多C序列，或者不含两个至少含有3个连续A核苷酸残基的多 A序列。在其它实施方案中，富含Py或TG免疫刺激性核酸包 含一个核苷酸，这个核苷酸的成分中含有超过25％的C核苷酸 或超过25％的A核苷酸。在更其它的实施方案中，富含或TG 免疫刺激性核酸中不含多C序列、多G序列、或多A序列。

在一些实施方案中，一个多G核酸是从下列序列组中选取 的，它们的序列号为：5，6，73，215，267-269，276，282， 288，297-299，255，259，286，387，444，476，531，557- 559，733，768，795，796，914-925，928-931，和938。在 其它实施方案中，一个多G核酸是从下列序列组中选取的，它 们的序列号为：67，80-82，141，147，148，173，178，183， 185，214，224，264，265，315，329，434，435，475，519， 521-524，526，527，535，554，565，609，628，660，661， 662，725，767，825，856，857，876，892，909，926，927， 932，和937。

依照本发明的其它方面，免疫刺激性核酸可以定义为含有 TG基元的核酸，这里被称作TG免疫刺激性核酸。在一个实施 方案中，TG核酸含有至少一个TG双核苷酸，这种双核苷酸含 有至少两个符合下述的分子式5’N1X1TGX2N23’的序列。在相关 的实施方案中，N1是一个含有许多核苷酸的核酸序列。这些核 苷酸的范围从(11-N2)到(21-N2)变化。N2是一个核酸序列，这个 序列由变化范围从(11-N1)到(21-N1)的许多核苷酸组成的核酸。 在优选的实施方案中，X2是腺嘧啶脱氧核苷。

在其它实施方案中，TG核酸至少含有下列分子式 5’X1X2TGX3X43’。在更其它的实施方案中，TG核酸由下列序列 5‘N1X1X2TGX3X4N23’组成。在相关的实施方案中，N是一个含 有许多核苷酸的核酸序列，这些核苷酸的范围从(9-N2)到(19-N2) 变化。在优选的实施方案中，X3是腺嘧啶脱氧核苷。X1X2是从 由GT、GG、GA、AA、AT、AG、CT、CA、CG、TA和TT组 成的核苷酸组中选出的，并且X3X4是从下列含有TT、CT、AT、 AG、CG、TC、AC、CC、TA、AA和CA组成的核苷酸组中选 出的。在一些优选的实施方案中，X3是腺嘧啶脱氧核苷。在重 要的实施方案中，X3X4是从下列含有TT、TC、TA和TG组成 的核苷酸组中选出的。在其它实施方案中，X1X2是GA或GT， X3X4是TT。在更其它的实施方案中，X1或X2或两者都是嘌呤， 并且X3或X4或两者都是嘧啶；或者X1X2是GpA，并且X3或 X4或两者都是嘧啶。在一个实施方案中，X2是一个T并且X3 是一个嘧啶。

在一个实施方案中，TG核酸的或者TG核酸的整个长度或 部分片段的5’X1X2TGX3X43’这个序列是非回文序列；而在其它 实施方案中它是一个回文序列。

在一些优选的实施方案中，TG核酸同样是富含T的。

在一些实施方案中，富含Py和TG免疫刺激性核酸含有一 个核苷酸骨架，这个核苷酸骨架包含至少一个骨架修饰，例如 一个硫代磷酸酯修饰。核苷酸骨架可以是嵌合，或优选的是核 苷酸骨架被整个地修饰。在一个优选的实施方案中，免疫刺激 性核酸有一个多T基元和一个硫代磷酸酯的骨架。

在本发明的其它方面是关于免疫刺激性核酸的组合物。而 这个组合物是以富含Py或TG核酸或抗原形式存在的，其中核 酸中不含未甲基化的CpG基元。

本发明的其它方面是有关富含Py或TG免疫刺激性核酸和 抗微生物药物，其中富含Py或TG免疫刺激性核酸中不含未甲 基化的CpG基元。优选的是这种抗微生物的药物是从由抗滤过 性毒菌药物、抗寄生药物、抗细菌药物和抗真菌药物组成的药 物组中选取的。

依照本发明的另一方面，提供了一个包括富含Py和/或TG 免疫刺激性核酸的持续释放介质(device)，其中，这种富含Py 和/或TG免疫刺激性核酸中不含未甲基化的CpG基元。

本发明也包括富含Py和/或TG免疫刺激性核酸用以下介质 进行营养补充，这些介质包括：胶囊、药丸和舌含片，其中， 这种富含Py和/或TG免疫刺激性核酸中不含未甲基化的CpG 基元。

当给与富含Py(例如多T、富含T、富含C、或TG寡核苷 酸)和一个CpG寡核苷酸有用的时候，人们还渴望在物理分离 CpG、富含Py或TG寡核苷酸的同时，得到富含Py或TG寡核 苷酸。这种心情可以理解。可替换的是，CpG、富含Py或TG 基元在同一个连续的核酸上一富含Py或TG寡核苷酸的形式存 在。在更深入的实施方案中，全部或者部分的富含Py、TG和CpG 核酸可以在另一个核酸上或同一个核酸分子上共给预。通过共 给予，力图想达到这样一个目的：在一种药中核酸被尽快给予 给另外核酸以得到两寡核苷酸组合的好效果，优选的是这种效 果要好于寡核苷酸单独给予时的效果。

CpG寡核苷酸一般有这样一个分子式：5’X1X2CGX3X43’， 其中，X1、X2、X3和X4是核苷酸并且其中至少CpG中的C是 非甲基化的。优选的是，CpG寡核苷酸是长度在8-100的范围 内的核苷酸；并且它们含有修饰过的骨架。特别的基元在已发 表过的PCT专利、美国专利和在此引用的文献中有详细的描述， 在此它们的全部描述通过引证被并入本文。在一个实施方案中， CpG寡核苷酸中不含多T和TG基元并且不富含T。

在其它实施方案中，CpG寡核苷酸有从下述序列号组中选 取的序列。这个序列组中的序列号有：1，3，4，14-16，18- 24，28，29，33-46，49，50，52-56，58，64-67，69，71， 72，76-87，90，91，93，94，96，98，102-124，126-128， 131-133，136-141，146-150，152-153，155-171，173- 178，180-186，188-198，201，203-214，216-220，223， 224，227-240，242-256，258，260-265，270-273，275， 277-281，286-287。292，295-296，300，302，305-307， 309-312，314-317，320-327，329，335，337-341，343- 352，354，357，361-365，367-369，373-376，378-385， 388-392，394，395，399，401-404，406-426，429-433， 434-437，439，441-443，445，447，448，450，453-456， 460-464，466-469，472-475，477，478，480，483-485， 488，489，492，493，495-502，504-505，507-509，511， 513-529，532-541，543-555，564-566，568-576，578， 580，599，601-605，607-611，613-615，617，619-622， 625-646，648-650，653-664，666-697，699-706，708， 709，711-716，718-732，736，737，739-744，746，747， 749-761，763，766-767，769，772-779，781-783，785- 786，790-792，798-799，804-808，810，815，817，818， 820-832，835-846，849-850，855-859，862，865，872， 874-877，879-881，883-885，888-904，和90-913。

在其它实施方案中，富含Py或T个寡核苷酸中没有CpG 基元。本发明的实施方案还包括药剂组合物和成套的试剂盒 (kits)，这些试剂盒(kits)包括CpG寡核苷酸(不含多T和TG基 元和不富含T)和富含Py和/或TG寡核苷酸从CpG寡核苷酸 中物理分离。药剂制备是以有效的量进行的，并且代表性地包 括配药学上可以接受的载体，关于富含Py和TG寡核苷酸这里 有详尽的描述。成套的试剂盒中至少有一个容器，用来盛放一 种寡核苷酸，这种核苷酸可以是富含Py或者TG寡核苷酸(或 是混合物)。在同一个容器中，或在其它实施方案中使用另外一 个容器，盛放有含有CpG基元的寡核苷酸，这种寡核苷酸可以 不富含Py和/或TG基元。成套试剂盒中也包括将寡核苷酸分配 给受体的试剂盒。成套试剂盒中也可以包括盛有溶剂或稀释剂 的容器。

综上所述，在这里好象充分引用的一样，用物理方法从富 含Py或TG寡核苷酸中分离出的CpG寡核苷酸可以在上述的方 法、组合物和产品中与富含Py或TG寡核苷酸一块使用。

在其它方面，本发明与含有化学骨架并且不要求有CpG基 元存在的免疫刺激寡核苷酸有联系。本发明部分基于以下这个 发现：不含CpG基元的核酸序列具有免疫刺激性能，而且那些 含有化学骨架的核酸序列可以意想不到地提高免疫刺激活性。 因此，本发明一方面涉及一种寡核苷酸的组成，此种寡核苷酸 有下面的分子式5’Y1N1ZN2Y23’，其中Y1和Y2是互相独立的 有1到10个核苷酸组成的核酸，其中Y1至少包含一个修饰过 的内核苷酸联结，并且Y2至少包含一个修饰过的内核苷酸联结， 而且，其中N1和N2是核酸分子，各自独立存在，有0到5个 核苷酸组成。但是，其中N1ZN2中总共至少有6个核苷酸；并 且其中N1ZN2中的核苷酸含有一个磷酸二酯骨架，并且其中Z 是一个免疫刺激性核酸基元但是不含CG。在一个实施方案中Z 是一个从下列的序列组中选取的核酸序列，而这个序列组由 TTTT、TG和一个其中的碱基至少有50％是T的序列。

在一些实施方案中，Y1和/或Y2有3到8个核苷酸组成。在 其它的实施方案中，Y1和/或Y2由至少3个G、至少4个G、 至少7个G、或者全部是G组成。在其它的实施方案中，Y1和/ 或Y2从由TCGTCG、TCGTCGT和TCGTCGTT(序列号为：1145) 组成的序列组中选取的。在更其它的实施方案中，Y1和/或Y2 至少包括1、2、3、4或5个多A、多T、多C序列。

分子式Y1N1ZN2Y2中心的核苷酸(N1ZN2)有磷酸二酯内核 苷酸联结，并且Y1和Y2至少包含一个修饰过的内核苷酸联结。 在一些实施方案中，Y1和/或Y2至少包含两个修饰过的内核苷 酸联结。在其它的实施方案中，Y1和/或Y2包含两个到五个修 饰过的内核苷酸联结。在更其它的实施方案中，Y1包含两个修 饰过的内核苷酸联结，Y2包含五个修饰过的内核苷酸联结；或 者Y1包含五个修饰过的内核苷酸联结，Y2包含两个修饰过的内 核苷酸联结。在一些实施方案中，修饰的内核苷酸联结是硫代 磷酸酯修饰的联结、二硫代磷酸酯修饰的联结、或P-乙氧基修 饰的联结。

分子式Y1N1ZN2Y2的部分可以选择性地形成回文基元。这 样一来，在一些实施方案中，N1ZN2中的核苷酸形成一个回文基 元。在一些实施方案中，回文基元不是一个直接的重复。在更 其它的实施方案中，N1ZN2中的核苷酸不形成一个回文基元。

依照其它实施方案，N1ZN2含有一个核苷酸序列，而这些序 列从下列的序列组中选取的。序列组如下：GATTTTATCGTC(序 列号：1098)；TCGATTTTTCGA(序列号：1099)；TCATTTTTATGT (序列号：1100)；GTTTTTTACGAC(序列号：1101)； TCAATTTTTTGA(序列号：1102)；ACGTTTTTACGT(序列 号：1103)；TCGTTTTTACGA(序列号：1104)； TCGATTTTTACGTCGA(序列号：1105)；AATTTTTTAACGTT (序列号：1106)；TCGTTTTTTAACGA(序列号：1107)； ACGTTTTTTAACGT(序列号：1108)；GATTTTATCGTC(序 列号：1109)；GACGATTTTTCGTC(序列号：1110)； GATTTTAGCTCGTC(序列号：1111)；GATTTTTACGTC(序 列号：1112)；ATTTTATCGT(序列号：1113)；AACGATTTTTCGTT (序列号：1114)；TCACTTTTGTGA(序列号：1115)； TCGTATTTTA(序列号：1116)；ACTTTTGTACCGGT(序列号： 1117)；TCGATTTTTCGACGTCGA(序列号：1118)； ACGATTTTTCGT(序列号：1119)；GATGATCGTC(序列号： 1120)；TCGATGTCGA(序列号：1121)；TCATGTATGA(序 列号：1122)；GTGTTACGAC(序列号：1123)；TCAATGTTGA (序列号：1124)；ACGTGTACGT(序列号：1125)；TCGTGTACGA (序列号：1126)；TCGATGTACGTCGA(序列号：1127)； AATGTTAACGTT(序列号：1128)；TCGTGTTAACGA(序列 号：1129)；ACGTGTTAACGT(序列号：1130)；GATGTATCGTC (序列号：1131)；GACGATGTCGTC(序列号：1132)； GATGAGCTCGTC(序列号：1133)；GATGTACGTC(序列号： 1134)；ATGATCGT(序列号：1135)；AACGATGTCGTT(序 列号：1136)；TCACTGGTGA(序列号：1137)；TCGTATGA(序 列号：1138)；ACTGGTACCGGT(序列号：1139)； TCGATGTCGTCGA(序列号：1140)；和ACGATGTCGT(序 列号：1141)。

组合物可以选择性地包括一种药学载体和/或被调配在传送 介质中。在一些实施方案中，传送介质从由阳离子化的油脂、 细胞渗透蛋白和持续释放介质组合物的介质组中选取的。在一 个优选的实施方案中，持续释放介质是能够生物降解的高分子 物质。在其它的实施方案中，持续释放介质是一种微粒。

本发明涉及的其它方面是有关含有分子式Y1N1ZN2Y2的免 疫刺激寡核苷酸和抗原的组成。

本发明的另一个组合物是含有分子式Y1N1ZN2Y2的免疫刺 激寡核苷酸和一种抗微生物的治疗介质。优选的是这种抗微生 物的治疗介质是从由抗滤过性毒菌的介质、抗寄生的介质、抗 细菌的介质和抗真菌的介质组合物的介质组中选取的。

包含分子式为Y1N1ZN2Y2的免疫刺激寡核苷酸的持续释放 介质的组合物在本发明的其它部分被提供。

本发明也包括分子式为Y1N1ZN2Y2的免疫刺激寡核苷酸用 以下介质进行营养补充，这些介质包括：胶囊、药丸和舌含片。

在其它方面，上述的组合物也包括免疫刺激性核酸。这种 免疫刺激性核酸含有一个非甲基化的CG双核苷酸、一个TG双 核苷酸、或一个富含Py的序列；其中，这种含有一个非甲基化 的CG双核苷酸、一个TG双核苷酸、或一个富含Py的序列的 免疫刺激性核酸有与成分为5’Y1N1ZN2Y23’的寡核苷酸不同的序 列。

在一些实施方案中，这种含有一个非甲基化的CG双核苷 酸、一个TG双核苷酸、或一个富含Py的序列的免疫刺激性核 酸含有完全磷酸二酯化的骨架。在其它的实施方案中，这种含 有一个非甲基化的CG双核苷酸、一个TG双核苷酸、或一个富 含Py的序列的免疫刺激性核酸含有被修饰的骨架，这个骨架可 以选择性地从硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和磷-乙氧基中选择 联结方式以形成内核苷酸。

在一个实施方案中，这种含有一个非甲基化的CG双核苷酸 的免疫刺激性核酸含有如分子式5’X1X2CGX3X43’的组成，其中 X1、X2、X3和X4是核苷酸。在其它实施方案中，免疫刺激性核 酸序列至少包含下述的分子式5’TCNX1X2CGX3X43’，其中N是 由大约0-25个核苷酸组成的核酸序列，其中至少一个核苷酸 拥有修饰过的内核苷酸联结，而且其中核酸内有小于或等于100 个核苷酸。依照一些实施方案，X1、X2是从下列组中选出的核 苷酸：GT，GG，GA，和AA；并且X3X4是从下列组中选出的 核苷酸，TT，CT，或GT。在优选的实施方案中，X1X2是GA 并且X3X4是TT。

在另一个实施方案中，这种含有一个非甲基化的CG双核苷 酸的免疫刺激性核酸序列至少包括下述的诸多序列中的一个： ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(序列号：15)； TCCATGTCGGTCCTGCTGAT(序列号：32)； TCCATGTCGGTZCTGATGCT(序列号：31)； ATCGACTCTCGAGCGTTZTC(序列号：18)； TCCATGTCGGTCCTGATGCT(序列号：28)；GGGGGG(序列 号：12)；TCCATGACGGGTCCTGATGCT(序列号：35)； TCCATGGCGGTCCTGATGCT(序列号：34)； TCCATGACGTTCCTGATGCT(序列号：7)； TCCATGTCGTTCCTGATGCT(序列号：38)； GGGGTCAGTCTTGACGGGG(序列号：41)； TCCATGTCGCTCCTGATGCT(序列号：37)； TCCATGTCGATCCTGATGCT(序列号：36)； TCCATGCCGGTCCTGATGCT(序列号：33)； TCCATAACGTTCCTGATGCT(序列号：3)； TCCATGACGTTCCTGATGCT(序列号：7)； TCCATGACGTCCCTGATGCT(序列号：39)； TCCATCCGTGCCTGATGCT(序列号：48)； TCCATGACGTTCCTGACGTT(序列号：10)； ATGACGTTCCTGACGTT(序列号：70)； TCTCCCAGCGCGCGCCAT(序列号：72)； TCCATGTCGTTCCTGTCGTT(序列号：73)； TCCATAGCGTTCCTAGCGTT(序列号：74)； TCCTGACGTTCCTGACGTT(序列号：76)； TCCTGTCGTTCCTGTCGTT(序列号：77)； TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT(序列号：52)； TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT(序列号：121)； TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT(序列号：208)； TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT(序列号：120)； TCCATGCGTTGCGTTGCGTT(序列号：81)； TCCACGACGTTTTCGACGTT(序列号：82)； TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT(序列号：47)； TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(序列号：46)； TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(序列号：49)； GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT(序列号：56)； TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT(序列号：48)； TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT(序列号：84)； TGTCGTTGTCGTTGTCGTT(序列号：50)；TCGTCGTCGTCGTT (序列号：51)；和TGTCGTTGTCGTT(序列号：85)。在其它 的实施方案中，这种含有一个TG双核苷酸或一个富含Py的序 列的免疫刺激性核酸是如上所述的核酸。

本发明的另一方面是有关包括药剂组合物和成套的试剂 盒，这些试剂盒同时存放有如分子式Y1N1ZN2Y2所示的寡核苷 酸、CpG寡核苷酸(这个CpG寡核苷酸不含多T和TG基元和 不富含Py)，和从有如分子式Y1N1ZN2Y2所示的寡核苷酸中物 理分离出的富含Py和/或TG寡核苷酸。药剂制备是以有效的量 进行的，并且代表性地包括配药学上可以接受的载体，关于富 含Py和TG寡核苷酸这里有详尽的描述。成套的试剂盒中至少 有一个容器，用来盛放一种有如分子式Y1N1ZN2Y2所示的寡核 苷酸。在同一个容器中，或在其它实施方案中使用另外一个容 器，盛放有含有CpG基元的寡核苷酸，这种寡核苷酸可以不富 含Py和/或TG基元和/或富含Py或者TG寡核苷酸(或是混合 物)。成套试剂盒中也可以包括盛有溶剂或稀释剂的容器。

综上所述，在这里好象充分引用的一样，用物理方法从富 含Py或TG寡核苷酸中分离出的具有如分子式Y1N1ZN2Y2所示 基元的寡核苷酸可以在上述的方法、组合物和产品中与富含Py 或TG寡核苷酸一块使用。

本发明的是关于药学组合物，而这个组合物中至少包含两 种此专利中的寡核苷酸。其中至少两种寡核苷酸含有相互不同 的序列和药学上能够接受的载体。

疫苗的表示是依照本发明的其它方面提供。疫苗包括与抗 原组合在一起的本发明中的任意组合物。

依照本发明的其它方面，提供了一种刺激免疫反应的方法。 这种方法包括了将富含Py或TG免疫刺激性核酸以能够引起非 啮齿类客体免疫反应的量注入非啮齿类客体。优选的是，富含Py 或TG免疫刺激性核酸可以以多种形式注入到粘膜，如口服， 局部，或在持续释放的载体中，系统地，肠胃外地，或肌肉式地。 当富含Py或TG免疫刺激性核酸接触到粘膜，免疫刺激性核酸 就会释放出能够使够足够有效的量以导致粘膜免疫反应或系统 的免疫反应。在优选的实施方案中，粘膜是从口，鼻，直肠， 阴道和眼睛的表面选取的。

在一些实施方案中，方法包括使实验对象对抗原暴露，其 中免疫反应是抗原选择的免疫反应。抗原可以被核酸载体解密， 而这种核酸载体可以被传递给实验对象。在一些实施方案中抗 原是从下列抗原组中选取的，如瘤抗原，滤过性病菌抗原，细 菌抗原，寄生病抗原，和缩氨酸抗原。

富含Py或TG免疫刺激性核酸能够引起广谱的免疫反应。 例如，这些免疫刺激性核酸能够用来使Th2免疫反应变为Th1 免疫反应。富含Py或TG免疫刺激性核酸还可以用来激活免疫 细胞，例如，白血球，枝状细胞，和NK细胞。这种激活可以 以通过多种手段多种形式实现，体内，体外，或来自体内等这些 手段包括：将免疫细胞和实验对象隔离，使免疫细胞接触有效 量的富含Py或TG免疫刺激性核酸以激活免疫细胞，将已经激 活的免疫细胞还给实验对象。在一些实施方案中，枝状细胞表 现出有癌症抗原。枝状细胞可以接触癌症抗原，来自体内。

由富含Py或TG免疫刺激性核酸引起的免疫反应可以导致 细胞因子的生成，例如IL-6，IL-12，IL-18TNF，IFN-α，和IFN- γ的生成。

在其它实施方案中，富含Py或TG免疫刺激性核酸对治疗 癌症是有用的。依照这篇治疗的其它方面，富含Py或TG免疫 刺激性核酸对于容易得癌症的实验对象预防癌症也是有用的(例 如，减少癌症发展的危险机率)。癌症是从下列癌症中选出的， 如胆囊癌、乳腺癌、子宫癌、绒毛膜癌、结肠癌、肺癌(例如 小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、 胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、恶性毒瘤、甲状腺癌、肾癌、和 其它癌症和恶性毒瘤。在一些重要的实施方案中，癌症是从下 列癌症中选出的，如骨癌、脑癌和CNS癌、结缔组织癌、食道 癌、眼癌、Hodgkin淋巴瘤、喉癌，口腔癌、皮肤癌和睾丸癌。

可选择性的是，当富含Py或TG免疫刺激性核酸在癌症治 疗的期间提供的话，富含Py或TG免疫刺激性核酸还可以用来 提高癌症细胞对癌症治疗(如抗癌症治疗)的反应。这些抗癌 疗法可以是化学疗法、疫苗疗法(例如体内预种枝状细胞疫苗 或癌抗原疫苗)、或基于抗体的疗法。最后一个疗法也可包括给 细胞表面(比如癌细胞表面)相应的抗原，其中免疫反应导致 抗原依赖细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，抗体可以从下 列组中选取，包括：Ributaxin，Hereceptin，Quadramet，Panorex， IDEC-Y2B8，BEC2，C225，Oncolym，SMART M195，ATRAGEN， Ovarex，Bexxar，LDP-03，ior t6，MDX-210，MDX-22，OV103， 3622W94，anti-VEGF，Zenapax，MDX-220，MDX-447， MELIMMUNE-2，MELIMMUNE-1，CEACIDE，Pretarget， NovoMAb-G2，TNT，Gliomab-H，GNI-250，EMD-72000， LymphoCide，CMA676，Monopharm-C，4B5，ior egfr3，ior c5， BABS，anti-FLK-2，MDX-260，ANA Ab，SMART 1D10Ab， SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。

因此，依照本发明的部分方面，得癌症或有得癌症的危险 的的实验者给予了免疫刺激性核酸和抗癌治疗。在一些实施方 案中，抗癌治疗物是从下列方法中选取的，化学疗法试剂、免 疫疗法试剂和癌症疫苗。化学疗法试剂是从下列中选取的，氨 甲叶酸、长春新碱、阿霉素(adriamycin)、cisplatin、无糖氯乙基 亚硝基脲、5-氟二氧嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素(阿 霉素)、达卡巴嗪(dacarbazine)，红豆杉醇(taxol)、fragyline， Meglamine GLA，valrubicin，carmustaine和poliferposan，MMI270， BAY 12-9566，RAS famesyl转移酶抑制剂，famesyl transferate抑 制剂，MMP，MTA/LY23514，LY264618/Lometexol，Glamolec，CI- 994，TNP-470，Hycamtin/Topotecan，PKC412，Valspodar/PSC833， Novantrone/Mitroxantrone，Metaret/苏拉明(Suramin)，Batimastat， E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC，AG3340，AG3433，Incel/VX-710， VX-853，ZD0101，ISI641，ODN 698，TA 2516/Marmistat， BB2516/Marmistat，CDP 845，D2163，PD183805，DX895lf， Lemonal DP 2202，FK 317，Picibanil/OK-432，AD 32/Valrubicin， Metastron/锶衍生物(strontium derivative)，Temodal/Temozolomide， Evacet/liposomal阿霉素，Yewtaxan/Placlitaxel，Taxol/Paclitaxel， Xeload/Capecitabine，Furtulon/Doxifluridine，Cyclopax/oral paclitaxel，Oral Taxoid，SPU-077/Ciplatin，HMR 1275/Flavopiridol， CP-358(774)/EGFR，CP-609(754)/RAS oncogene抑制剂，BMS- 182751/oral platinum，UFT(Tegafur/Uracil)，Ergamisol/左旋咪唑， Eniluracil/776C85/5FU 增强剂，Campto/左旋咪唑， Camptosar/Irinotecan，Tumodex/Ralitrexed，Leustatin/Cladribine， Paxex/Paclitaxel，Doxil/liposomal阿霉素，Caelyx/liposomal阿霉 素，Fludara/Fludarabine，Pharmarubicin/Epirubicin，DepoCyt， ZD1839，LU 79553/Bis-Naphtaphtalimide，LU 103793/Dolastain， Caetyx/liposomal 阿霉素，Gemzar/Gemcitabine，ZD 0473/Anormed，YM 116，lodine seeds，CDK4和CDK2抑制剂， PARP抑制剂，D4809/Dexifosamide，fes/Mesnex/Ifosamide， Vumon/替尼泊苷，Paraplatin/Carboplatin，Plantinol/cisplatin， Vepeside/Etoposide，ZD 9331，Taxotere/Docetaxel，prodrug of guanine arabinoside，Taxane Analog，nitrosoureas，烷基化试剂例 如melphelan和环磷酰胺(cyclophosphamide)，氨鲁米特 (Aminoglutethimide)，天门冬酰胺酶(Asparaginase)，二甲 磺酸丁酯(Busulfan)，Carboplatin，Chlorombucil，盐酸阿糖孢苷 (Cytarabine HCl)，放线菌素D(Dactinomycin)，盐酸道诺霉 素(Daunorubicin HCl)，雌二醇氮芥(Estramustine)磷酸钠，依 托泊苷(Etoposide)(VP16-213)，氟尿苷(氟尿苷)，氟尿嘧 啶(Fluorouracil)(5-FU)，氟硝丁酰胺(氟他胺)，羟基脲 (Hydroxyurea)(hydroxycarbamide)，异环磷酰胺(异环磷酰胺)， 干扰素(Interferon)Alfa-2a，Alfa-2b，Leuprolide acetate(LHRH- 释放因子类似物(releasing factor analogue))，环己亚硝脲(罗 氮芥)(CCNU)，盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine HCl) (nitrogen mustard)，巯基嘌呤(Mercaptopurine)，巯基磺酸钠(米 托坦)，米托坦(Mitotane)(o.p-DDD)，盐酸二羟蒽二酮(米 托蒽醌HCl)，Octreotide，Plicamycin，盐酸甲苄肼(Procarbazine HCl)，链脲菌素(Streptozocin)，三苯氧胺柠檬酸盐(Tamoxifen citrate)，Thioguanine，噻替派(Thiotepa)，长春碱硫酸盐，安 丫啶(安丫啶)(m-AMSA)，氮胞苷(阿扎胞苷)，Erthropoietin， 六甲三聚氰胺(Hexamethylmelamine)(HMM)，白介素2(白 介素2)，丙脒腙(丙脒腙)(甲基-GAG；甲基乙二醛(methyl glyoxal bis-guanylhydrazone)；MGBG)，Pentostatin (2’deoxycoformycin)，Semustine(甲基-氯乙环己硝脲(CCNU))， 鬼臼噻吩苷(替尼泊苷)(VM-26)和长春碱酰胺(Vindesine) 硫酸盐，但是，并不限于以上提到的药品。

这些免疫治疗的试剂可以从下列药品中选取：Ributaxin， Hereceptin，Quadramet，Panorex，IDEC-Y2B8，BEC2，C225， Oncolym，SMARTM195，ATRAGEN，Ovarex，Bexxar，LDP-03，ior t6，MDX-210，MDX-22，OV103，3622W94，anti-VEGF，Zenapax， MDX-220，MDX-447，MELIMMUNE-2，MELIMMUNE-1， CEACIDE，Pretarget，NovoMAb-G2，TNT，Gliomab-H，GNI-250， EMD-72000，LymphoCide，CMA676，Monopharm-C，4B5，ior egf.r3，iorc5，BABS，anti-FLK-2，MDX-260，ANA Ab，SMART 1D10Ab，SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。但是，并不 限于以上提到的药品。

癌症疫苗可以从下列药品中选取：EGF，抗-idiotypic癌症疫 苗，Gp75抗原，GMK恶性黑素瘤疫苗，MGV gaglioside conjugate 疫苗，Her2/neu，Ovarex，M-Vax，O-Vax，O-Vax，L-Vax，STn-KHL theratope，BLP25(MUC-1)，liposomal idiotypic疫苗，Melacine， 缩氨酸抗原疫苗，毒素/抗原疫苗，MVA-based疫苗，PACIS，BCG vacine，TA-HPV,TA-CIN，DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但 是，并不限于以上提到的药品。

在仍是另一个直接用于预防和治疗癌症的方法的实施方 案，实验对象被给与了α-干扰素。

本发明的其它方面关于预防实验对象的病的方法。这个方 法包括给实验对象提供富含Py或TG免疫刺激性核酸在一般的 基础上达到促进实验对象的免疫系统的反应，最终达到预防疾 病的目的。疾病或用此专利中的疾病预防方法将要预防的条件 的例子包括微生物感染(例如性传播疾病)和由食物引起的过 敏性休克。

在其它方面，本发明关于促使内部免疫反应的方法，此方 法是通过给予实验对象有效量的富含Py或TG免疫刺激性核酸 达到激活内部免疫反应的目的。

依照本发明的其它方面，提供了一种治疗和预防滤过性毒 菌或反滤过性毒菌引起的感染的方法。这种方法包括提供给患 有滤过性毒菌或反滤过性毒菌引起的感染或有危险患有滤过性 毒菌或反滤过性毒菌引起的感染的实验对象能够预防或治疗滤 过性毒菌或反滤过性毒菌引起的感染的本发明中提到过的任何 组合物的有效的药量。在一些实施方案中，病毒是被肝炎病毒、 爱兹病毒、B型肝炎、C型肝炎、疱疹病毒、或视神经乳头水 肿病毒引起的。

依照专利的另外的方面，提供了一种治疗和预防细菌感染 的方法。这种方法包括提供给患有或有危险患有细菌感染的实 验对象能够预防或治疗细菌感染的本发明中提到过的任何组合 物的有效的药量。在一个实施方案中，细菌感染是由于细胞内 的细菌引起的。

依照专利的另外的方面，提供了一种治疗和预防寄生虫感 染的方法。这种方法包括提供给患有或有危险患有寄生虫感染 的实验对象能够预防或治疗寄生虫感染的本发明中提到过的任 何组合物的有效的药量。在一个实施方案中，寄生虫感染是由 于非肠虫寄生引起的。

在一些实施方案中，实验对象是人；在其它的实施方案中， 实验对象是非人类的脊椎动物，这些动物是从狗、猫、马、母 牛、猪、山羊、鱼、猴、小鸡和绵羊中选取的。

专利的另外的方面，提供了一种治疗和预防哮喘的方法。 这种方法包括提供给患有或有危险患有哮喘的实验对象能够预 防或治疗哮喘的本发明中提到过的任何组合物的有效的药量。 在一个实施方案中，哮喘是过敏性哮喘。

专利的另外的方面，提供了一种治疗和预防过敏的方法。 这种方法包括提供给患有或有危险患有过敏的实验对象能够预 防或治疗过敏的本发明中提到过的任何组合物的有效的药量。

依照专利的另外的方面，提供了一种治疗和预防免疫缺乏 症的方法。这种方法包括提供给患有或有危险患有免疫缺乏症 的实验对象能够预防或治疗免疫缺乏症的本发明中提到过的任 何组合物的有效的药量。

专利的另外的方面，是关于导致TH1免疫反应一种方法。 这种方法是提供给实验对象能够预防或治疗过敏的本发明中提 到过的任何组合物的有效的药量，其目的是产生TH1免疫反应。

在一个实施方案中，本发明中的方法包括提供分子式为 5’Y1N1ZN2Y23’的寡核苷酸和含有未甲基饱和的CG双核苷酸、 TG双核苷酸和富含T的序列的免疫刺激性核酸。在一个实施方 案中，由5’Y1N1ZN2Y23’构成的寡核苷酸被单独地有免疫刺激 性核酸提供。在一些实施方案中，分子式为5’Y1N1ZN2Y23’的 寡核苷酸和免疫刺激性核酸是以按一周的频率交替时间表提供 的；在一些实施方案中，分子式为5’Y1N1ZN2Y23’的寡核苷酸 和免疫刺激性核酸是以按两周的频率交替时间表提供的。

本发明在其它方面，提供了一个组合，由免疫刺激性核酸 和抗癌治疗组合，载在药学上可以接受的载体上，和足够治疗 或减少患癌的概率的有效量。在重要的实施方案中，免疫刺激 性核酸是从下列中选取的，富含T的核酸、TG核酸和富含C 的核酸。

本发明还提供了一套试剂盒。此套试剂盒包括盛放免疫刺 激性核酸的容器，还有至少一个容器(例如第二个容器)用来 盛放抗癌治疗试剂，和使用说明书。在一个实施方案中，这套 试剂盒还盛放了α-干扰素，因为α-干扰素要放在另外的容器中 (例如第三个容器)。在重要的实施方案中，整套试剂盒包括含 有免疫刺激性核酸的持续释放介质、至少一个容器存放抗癌治 疗试剂、和关于抗癌治疗的加入的时间表的说明书。免疫刺激 性核酸可以从下列中选取，富含Py的核酸、TG核酸和CpG核 酸，其中CpG核酸与序列号为246的核苷酸的序列相同。

本发明更一步提供了一种治疗和预防哮喘、过敏的方法。 这种方法包括提供免疫刺激性核酸和治疗哮喘/过敏的药物的有 效的量，目的是治疗/预防哮喘、过敏。

免疫刺激性核酸可以从下列中选取，富含T的核酸、TG核 酸和富含C的核酸。

在一些实施方案中，免疫刺激性核酸是富含T的核酸。在 相关的实施方案中，富含T的核酸有从以下选取的核苷酸序列， 它们的序列号为：59-63，73-75，142，215，226，241，267 -269，282，301，304，330，342，358，370-372，393，433， 471，479，486，491，497，503，556-55 8，567，694，793- 794，797，833，852，861，867，868，882，886，905，907， 908，和910-913。在其它的实施方案中，富含T的核酸有从 以下选取的核苷酸序列，它们的序列号为：64，98，112，146， 185，204，214，224，233，244，246，247，258，262，263， 265，270-273，300，305，316，317，343，344，350，352， 354，374，376，392，407，411-413，429-432，434，435， 443，474，475，498-50 1，518，687，692，693，804，862， 883，884，888，890，和891。

在更相关的实施方案中，富含T的核酸不是TG核酸。在其 它的实施方案中，富含T的核酸不是CpG核酸。

在一个实施方案中，免疫刺激性核酸是TG核酸。在更相关 的实施方案中，TG核酸不是富含T的核酸。在另外相关的实施 方案中，TG核酸不是CpG核酸。

在一个实施方案中，免疫刺激性核酸是CpG核酸，其中， CpG核酸含有组合物序列号为：246的核苷酸序列。

在另外的实施方案中，哮喘/过敏药物是从下列中选取的， PDE-4抑制剂、支气管扩展剂/Beta-2.收缩剂、K+通道开启剂、 VLA-4拮抗剂、Neurokin拮抗剂、TXA2合成抑制剂、 xanthanine，Arachidonic acid拮抗剂，5脂肪生成抑制剂、 Thromboxin A2受体拮抗剂，Thromboxin A2拮抗剂，5-lipox活 化蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂，但是并不局限于上述的药品。 在一些重要的实施方案中，哮喘/过敏药物是支气管扩展剂/Beta- 2收缩剂从下列中选取的，salmeterol，舒喘宁、 D2522/formoterol、非诺特罗(fenoterol)，prciprenaline。

在另外的实施方案中，哮喘/过敏药物是从抗组氨酸和前列 腺素诱导剂下列中选取的。在一个实施方案中，抗组氨酸是从 下列中选取的：loratidine，cetiriaine，布克利嗪(buclizine)， ceterizine类似物，fexofenadine，特非那定(terfenadine)， desloratadine，norastemizole，epinastine，ebastine，ebastine， atemizole，levocabastine，azelastine，tranilast，特非那定 (terfenadine)，mizolastine，betatastine，CS 560，和HSR 609。在 另一个实施方案中，前列腺素诱导剂为S-5751。

在其它的实施方案中，哮喘/敏感症的药品是从类固醇和免 疫调节剂中选取的。免疫调节剂是从由下列药品中选取的。它 们是抗炎试剂，白三烯拮抗剂s，IL4muteins，可溶IL-4受体，免 疫抑制剂，抗IL-4抗体，IL-4拮抗剂s，抗IL-5抗体，可溶IL-13 受体-Fc溶解蛋白，抗IL-9抗体，CCR3拮抗剂，CCR5拮抗剂s， VLA-4抑制剂，和IgE的负调节剂，但是不仅仅局限于这些。在 一个实施方案中，IgE的负调节剂是抗IgE。

在其它的实施方案中，类固醇是从下列药中选取的，如： 倍氯米松，fluticasone，tramcinolone，布地奈德(budesonide)和 布地奈德(budesonide)。在更实施方案中，免疫抑制剂是 Tolerizing缩氨酸疫苗。

在一个实施方案中，免疫刺激性核酸是被与哮喘/敏感症的 药品同时给实验对象的。在其它的实施方案中，实验对象是免 疫妥协者。

将免疫刺激性核酸给予实验对象的有关预防和治疗哮喘/敏 感症的方法在本发明的其它方面已经描述。

在其它方面，本发明提供了一整套试剂盒，这套试剂盒包 括一个盛放免疫刺激性核酸的容器，和至少另一个容器(例如 第二个容器)来盛放哮喘/敏感症的药品，和用法说明书。在整 套试剂盒中很有作用的免疫刺激性核酸在此描述一下。在重要 的实施方案中，免疫刺激性核酸是从由富含T的核酸、TG核酸 和富含C的核酸组合物的核酸组中选取的。在其它重要的实施 方案中，整套试剂盒中还包含持续释放介质，这种介质中含有 免疫刺激性核酸和给予哮喘/敏感症的药品时的计时说明书。哮 喘/敏感症的药品可以从前面所述的直接预防和治疗哮喘/敏感症 的方法中提到的哮喘/敏感症的药品中选取。

在其它的方面，专利提供了一个组合物，包括免疫刺激性 核酸和哮喘/敏感症的药品。这个组合物共含在药学上可以接受 的载体上，并且有有效的能够预防或治疗与哮喘/敏感症有关的 病的量。这种核酸从上述的方法和组合物中提到的免疫刺激性 核酸中选取的。在重要的实施方案中，免疫刺激性核酸是从由 富含T的核酸、TG核酸和富含C的核酸中选取的。哮喘/敏感 症的药品可以从上述的方法和组合物中提到的治疗哮喘药品和 治疗敏感症的药品中选取的。

在更深入的方面，本发明提供了有免疫刺激性核酸和药学 上可以接受的载体组成的组合物。这些免疫刺激性核酸从下列 序列组中选取：序列号95-136、序列号138-152、序列号154 -222、序列号224-245、序列号247-261、序列号263-299、 序列号301、序列号303-4109、序列号414-420、序列号424、 序列号426-947、序列号959-1022、序列号1024-1093。优 选的是，这种免疫刺激性核酸在组合物中表现的是有效的量。 在一个实施方案中，免疫刺激性核酸表现出足以导致免疫反应 的有效的量。在其它的实施方案中，免疫刺激性核酸表现出足 以预防或治疗癌症的有效的量。在其它更深入的实施方案中， 免疫刺激性核酸表现出足以预防或治疗哮喘/敏感症的有效的 量。本发明也提供了整套的技术，包括上述的免疫刺激性核酸 组合物中的任何一种组合物，还包括使用说明。

在本发明的其它方面包括了基本基元为 5’M1TCGTCGTTM23’的免疫刺激性核酸的组成，其中，至少一 个C没有甲基化，其中M1是含有至少一个核苷酸的核酸，其 中M2是含有0到25个核苷酸的核酸，其中免疫刺激性核酸至 少含有10个核苷酸。

在更其它方面，专利涉及到一个组成为5’TCGTCGTT3’的 免疫刺激性核酸的药学组合物，其中至少一个C没有甲基化， 其中，免疫刺激性核酸至少含有100个核苷酸、一个磷酸二酯 的骨架和一个持续释放的介质。在一些实施方案中，持续释放 的介质是微粒。在其它实施方案中，上述的组合物包括抗原。

本发明的每一个限度都能够包含本发明的诸多实施方案。 因此，可以预计，本发明的每一个包含任何一个元素或元素组 合的限度都能够被包括在本发明的每一个方面中。

图表的简要描述

图1A是CD19+细胞在放入如X轴所示的寡核苷酸溶液中 时的CD86柱状图表达(如Y轴示)，其中寡核苷酸浓度为0.15 μg/ml。

图1B是CD19+细胞在放入如X轴所示的寡核苷酸溶液中 时的CD86柱状图表达(如Y轴示)，其中寡核苷酸浓度为0.30 μg/ml。

图2是对比ODN2137、ODN2177、ODN2200和ODN2202 的刺激B细胞复制的能力，其中寡核苷酸浓度在0.20μg/ml到 20μg/ml之间变化。

图3是对比ODN2188、ODN2189、ODN2190和ODN2182 的刺激B细胞复制的能力，其中寡核苷酸浓度在0.20μg/ml到 20μg/ml之间变化。

图4的柱状图描述了以药而变的B细胞的活性。被没有CpG ODN.PBMC导致的B细胞的活性在下述的条件下被诱导。这 个条件为：ODNs2006(序列号为246)、2117(序列号为358)、2137 (序列号为886)、5126(序列号为1058)和5162(序列号为1094) 的指示浓度；含有mAb以指示CD19(B细胞指示剂)和CD86 (B细胞活性指示剂，B7-2)。所示的值是由流动血细胞计数 器测定。

图5的柱状图描述了被各式各样的一组典型的原料物质的 非CpG ODNs.PBMC引起的B细胞的刺激反应。B细胞被浓度 为0.4μg/ml、1.0μg/ml或10.0μg/ml的ODNs所刺激的。这些 ODNs为：2006(序列号为246)、2196(序列号为913)、2194 (序列号为911)、5162(序列号为1094)、5163(序列号为1095)、 5168(序列号为1096)和5169(序列号为1097)。在CD19+B 细胞上的活性指示剂CD86(B7-2)的值是由流动血细胞计数 器测定。

图6的柱状图描述了B细胞的被非CpG ODNs1982和2041 所刺激的活性；PBMC是被指示浓度的ODN2006(序列号为 246)、1982(序列号为225)和2041(序列号为282)所诱导； B细胞的活性(活性指示剂CD86的值)被流动血细胞计数器测 定。

图7的柱状图描述了NK细胞的被非CpG ODNs1所刺激的 活性；PBMC是被浓度为6μg/ml的下列ODNs所诱导的；ODNs 包括：ODN2006(序列号为246)、2117(序列号为358)、2137 (序列号为886)、2183(序列号为433)、2194(序列号为911) 和5126(序列号为1058)。含有mAb以指示CD3(T细胞指示 剂)、CD56(NK细胞指示剂)和CD69(早期活性指示剂)。在 CD56+NK细胞上的CD69所示的值是由流动血细胞计数器测 定。

图8的柱状图描述了NK调节的细胞毒素被非-CpG提高。 K-562目标细胞的NK-调节消散在被PBMC诱导过夜后被测 定，其中ODN的浓度为6μg/ml、并且ODN包括2006(序列 号为246)、2194(序列号为911)和5126(序列号为1058)。

图9的柱状图描述了NKT细胞的被非CpG ODN所刺激的 活性。典型的原料物质的PBMC被浓度为6μg/ml的诸多ODN 所诱导24小时。其中ODN包括：2006(序列号为246)、2117 (序列号为358)、2137(序列号为886)、2183(序列号为433)、 2194(序列号为911)和5126(序列号为1058)。NKT含有mAb 以指示CD3(T细胞指示剂)、CD56(NK细胞指示剂)和CD69 (早期活性指示剂)的活性由流动血细胞计数器测定。

图10的柱状图描述了单核细胞被不同的CpG和非CpG ODN所刺激的活性。PBMC被浓度为6μg/ml的诸多ODN所 诱导。其中ODN包括：2006(序列号为246)、2117(序列号 为35 8)、2178(序列号为428)、2183(序列号为433)、2194(序 列号为911)、5126(序列号为1058)和5163(序列号为1095)。 PBMC中含有CD14(单细胞指示剂)和CD80(B7-1，活性 指示剂)。值由流动血细胞计数器测定。

图11的柱状图描述了人类细胞遇到非CpG ODN时TNFα 的释放。在有或无浓度为6μg/ml的指示ODNs和1μg/ml LPS作 为正控制的条件下，PBMC被培育了24小时。TNFα被流动血 细胞计数器测定。

图12的柱状图描述了IL-6的释放，非CpGODNs表现出 TNFα同样的模式。PBMC和指示的ODN(1.0μg/ml)一起培育； IL-6在上层清液中由ELISA测定。

本发明的详细描述

一方面本发明包括发现：富含嘧啶(Py)和优选的是富含 胸腺嘧啶脱氧核苷(T)的核酸以及含有TG双基元的核酸对于 调节免疫刺激效果的特效。前面已经提到：含有CpG的核酸是 治疗药和预防药的组合物。这些组合物可以刺激免疫系统以治 疗癌症、感染疾病、敏感症、哮喘和其它疾病；并且这些组合 物还有帮助保护患者免受癌症化学疗法后的感染。由CpG刺激 引起的细胞和体液的强且平衡的免疫反应反应了人身体本身的 对于外来病菌和癌症细胞的自然保护系统。人们发现：在例如 细菌等有传染力的有机体的DNA中普遍存在CpG序列，然而 在人类的DNA中却相对来讲很罕见。人类的免疫系统明显地进 化地可以识别CpG序列作为细菌感染的前期警告信号，并且立 即对入侵的病原体作出强有力的免疫反应，同时没有引起常见 的与其它免疫刺激药物作用的负反应。依靠这种天生的免疫防 范机制，这些含有CpG的核酸可以用独特和自然的方式进行免 疫治疗。CpG核酸在免疫调节中的效果被及时的专利发明人发 现，并且已经被随后的专利广泛描述，这些专利例如：02/07/95 申请的申请序列号为08/386,063的美国专利(相关的PCT专利 US95/01570)；10/30/96申请的申请序列号为08/738,652；10/30/97 申请的申请序列号为08/960,774(相关的PCT专利US97/19791 和WO98/18810)；11/13/98申请的申请序列号为09/191,170； 02/25/98申请的申请序列号为09/030,701(相关的 PC/US98/03678)；05/20/98申请的申请序列号为09/082,649(相 关的PCT/US98/10408)；06/03/99申请的申请序列号为09/325,193 (相关的PCT/US98/04703)；04/02/99申请的申请序列号为 09/286,098(相关的PCT/US99/07335)；05/06/99申请的申请序 列号为09/306,281(相关的PCT/US99/09863)。这些专利的全部 内容和专利在此通过引证被并入本文。

及时的专利发现对于以上描述的含有CpG的核酸用途和任 何其它的已知的CpG核酸的用途都是可应用的。本发明一方面 包括发现：不论CpG基元是否存在，富含Py以及优选的是富 含T和TG核酸对于CpG寡核苷酸有相似的刺激性质。因而， 本发明对于使用富含Py或TG的核酸来刺激免疫系统的任何方 法都是有用的。依照本发明，惊人地发现：缺乏CpG基元的奇 怪的寡核苷酸居然有免疫刺激性，并且还有与CpG寡核苷酸一 样的许多预防和治疗作用。

富含Py的核酸是富含T或富含C的免疫刺激性核酸。在一 些实施方案中，富含T的核酸是优选的。一个富含T的核酸是 包括至少一个多T和/或含有的核苷酸组成中有多于25％的T核 苷酸残基的核酸。一个含有一个多T序列的核酸至少包括四个 连续的T，如5’TTTT3’所示。优选的是，富含T的核酸包括超 过一个多T序列。在优选的实施方案中，富含T的核酸可以含 有2、3、4个等等多T序列，例如寡核苷酸#2006(序列号为 246)。依照本发明发现：具有最高的免疫刺激性能的富含T的 寡核苷酸之一是全部由T核苷酸残基组成的核酸，例如寡核苷 酸#2183(序列号为433)。依照本发明，其它富含T的核酸在 核苷酸组成中含有大于25％的T核苷酸残基，但是不必要含有 多T序列。在这些富含T的核酸中，T核苷酸残基可以从其它 的核苷酸残基如G、C、A中分离。在一些实施方案中，富含T 的核酸的核苷酸组成中有超过35％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％和99％的T核苷酸残基，并且在每个整数中间也有。 优选的是，富含T的核酸含有至少一个多T序列和核苷酸组成 中有多于25％的T核苷酸残基。

本发明发现：ODN的T成分对于ODN的免疫刺激效果来 讲有巨大的作用；并且在无任何CpG基元的情况下，富含T的 ODN可以激活人类的多种免疫细胞。含有3’多T区域和25’CG 的寡核苷酸的免疫刺激性能很高，例如ODN2181(序列号为 431)。与ODN2181有相似的长度，在5’末端含有两个CG双核 苷酸以及在3’末端含有一个多C区域的ODN2116(序列号为 357)也有免疫刺激活性，但是其强度在标准实验条件比富含T 的寡核苷酸差多了。因此，尽管C和T有差不多一样的基元， 但是它们对于ODN的免疫性能的作用却不同。它们都有能力诱 发免疫反应，但是强度不同。因此，依照本发明，富含T和富 含C的寡核苷酸都有用，但是富含T的寡核苷酸是优选的。更 进一步讲，如果ODN的T成分因与其它碱如G、A或C结合 而减少，那么免疫刺激活性将下降(如ODN#2188(序列号为 905)；2190(序列号为907)；2191(序列号为908)；和2193(序 列号为910))。

富含C的和是含有至少一个或优选的是至少两个多C区域 的核酸分子，或者是有至少50％C核苷酸组成的核酸分子。一 个多C区域至少有四个C残基排成一排。这样一来，多C区域 可以用5’CCCC3’概括了。在一些实施方案中，优选的是多C区 域含有如5’CCCCCC3’的基元。依照本发明，其它富含C的核 酸的核苷酸组成中有大于50％的C核苷酸残基，但是不必要包 括一个多C序列。在这些富含C的核酸中，C核苷酸残基可以 与其它类型的核苷酸残基如G、T和A分离。在一些实施方案 中，富含C的核酸的核苷酸组成中含有大于60％、70％、80％、 90％和99％的C核苷酸残基，并且在每个整数中间也有。优选 的是，富含C的核酸含有至少一个多C序列和在核苷酸组成中 有大于50％的C核苷酸残基，在一些实施方案中也可以是富含 T。

就象例子中所示的那样，几个以前被认为没有免疫刺激性 能的ODN，包括两个ODN序列号分别为225和282，它们以前 被认为没有刺激性能而且主要用作控制ODN(Takahashi，T etal 2000.J.Immunal.164：4458)。但是，上面提到的两个ODN发现 有没有刺激性能。我们实验证明：这些ODN可以刺激B细胞， 尽管使用了比CpG更高的浓度(如图6所示)。至少在一些实 验中，一个含多T的ODN(30mer)导致了B细胞的强的活性， 而这种ODN足以与B细胞活化物即最强的含有CpG的ODN 之一相媲美。这些实验也揭示了令人吃惊的发现：甚至多C的 ODN都可以引起B细胞的刺激活动。

但是，由这些ODN引起的免疫刺激不仅仅局限于B细胞。 不同的实验化验辅助证明：单细胞例如NK细胞和甚至NKT细 胞可以被这样没有CpG的ODN所活化(如图7所示)。和多T 和多C序列相比，由多A序列引起的免疫刺激则不能得到(至 少对于单细胞，如B和NK细胞)。有趣的是，发现：在序列号 为225的序列中引入一个CpG可以提高免疫刺激活性，但是引 入多T序列则不能提高免疫刺激活性。这表明：CpG和富含T 的ODN可能起作用的机理或路径不同。同样有可能的是：多T 基元插入序列号为225的序列的不同位置可能会引起免疫刺激 活性改变。

就相这里用的“TG核酸”或“TG免疫刺激性核酸”是这 样的核酸：它含有至少一个TG双核苷酸(胸腺嘧啶脱氧核苷- 鸟嘌呤双核苷酸序列，例如“TG DNA“或含有5’的胸腺嘧啶脱 氧核苷和3’鸟嘌呤核苷并用磷酸盐键联接)而且可以激活免疫 系统的组成。

在一个实施方案中，本发明提供了由至少下式 5’N1X1TGX2N23’表达的TG核苷酸。其中，X1和X2是核苷 酸；N是任意核苷酸；倘若N1和N2中N的总和在11到21之 间变化，N1和N2是由任意数量的N组成的核酸序列。举个例 子，如果N1为5，那么N2可以是6(导致寡核苷酸整个的长 度为15个核苷酸)。TG可以位于寡核苷酸上任何位置，包括5’ 末端、中心和3’末端。因此，N1可以是零到21之间的任何数， 总之，倘若N2是合适地选取以使N2和N1的和等于11到21 之间的数。同样，N2可以是零到21之间的任何数，总之，倘 若N2是合适地选取以使N2和N1的和等于11到21之间的数。 在一些实施方案中，X1是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷； X2是氧氨嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶脱氧核苷。在优选的实施方 案中，X2是胸腺嘧啶脱氧核苷。在其它的实施方案中，X1是 氧氨嘧啶和/或X2是鸟嘌呤。在其它的实施方案中，就象这里 讨论的一样，倘若核酸足够长，核酸可以包含其它的基元。

在其它的实施方案中，TG核酸可以用至少下式 5’N1X1X2TGX3X4N23’来表示。其中，X1、X2、X3和X4是 核苷酸。在一些实施方案中，X1X2是从下列核苷酸中选取的： GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、TpA和TpT； X3X4是从下列核苷酸中选取的：TpT、CpT、ApT、ApG、TpC、 ApC、CpC、TpA、ApA和CpA；N是任何核苷酸；N1和N2 是油满足N1N2数目的总和在9到19的任意数目的核苷酸组成 的核酸序列。在一些实施方案中，X1X2是GpA或GpT；X3X4 是TpT。在其它实施方案中，X1或X2是或者都是嘌呤并且X1 或X2是或者都是嘧啶；或者X1X2是GpA并且X3或X4是或 者都是嘧啶。在优选的实施方案中，X3X4是从由TpT、TpC和 TpA组成的小组中选取的。免疫刺激性核酸可以是至少有4个 核苷酸的任意大小(例如长度)。在重要的实施方案中，免疫刺 激性核酸的长度可以在6到100之间范围内变化。在更其它的 实施方案中，免疫刺激性核酸的长度可以在8到35之间的范围 内变化。优选的是，TG寡核苷酸的长度在含有15到25个核苷 酸的范围内变化。

免疫刺激性核酸的大小(例如，核酸的长度上的核苷酸残 基的数目)也可以影响核酸的刺激活性。我们惊奇地发现：甚 至对于具有高的免疫刺激活性的核酸来讲，核酸的长度依然可 以影响到可以得到的免疫刺激强度。已经证明：随着富含T的 核酸长度的增加一直到24个核苷酸，增加长度导致免疫刺激活 性的增加。在例子中所举的实验证明：当富含T的核酸的长度 从18增加到27个核苷酸是，核酸的的刺激免疫反应的能力显 著增加(比较ODN#2194、2183、2195和2196数目逐渐从27 减少到到18个核苷酸)。增加核酸的长度一直到30个核苷酸对 核酸的生物性能产生巨大的影响；但是当长度超过30个核苷酸 后，增加长度不会对免疫刺激活性产生更深的影响(例如，比 较ODN2179到2006)。

以上已经表明：TG核酸的长度在15到25个核苷酸的范围 内变化时，会表现出免疫刺激活性的增加。因此，在一方面， 本发明提供了数目在15-27个核苷酸的寡核苷酸(例如寡核苷 酸的长度在含有15、16、17、18、19、20、21、2、23、24、25、 26或27个核苷酸的范围内)，且这种寡核苷酸可以是富含T的 核酸，或是TG核酸、或者既是富含T又是TG核酸。在一个实 施方案中，寡核苷酸不是富含T的核酸也不是TG核酸。在其 它的实施方案中，寡核苷酸中每CG基元。本发明同样提供了 长度在15-27个核苷酸的寡核苷酸、长度自18-25个核苷酸 的寡核苷酸、长度在20-23个核苷酸的寡核苷酸、和长度在23 -25个核苷酸的寡核苷酸。任何一个上述的与长度在15-27的 寡核苷酸有关的实施方案也与这些不同长度的寡核苷酸有关。 本发明进一步包括了任何在次引证的方法中的上述的这些寡核 苷酸。

尽管一些富含T的核酸可以达到最大的免疫刺激，当核酸 的长度是24-30个核苷酸残基，这样的免疫刺激对于一些长度 在15-25的核苷酸的TG核酸也可以达到；但是短些和长些的 免疫刺激性核酸同样也可以依照本发明的提到的方法使用。为 了便于细胞的吸收，免疫刺激性核酸优选的是含有6个核苷酸 残基的长度。因为较大的核酸在细胞内降解，所以如果足够多 的免疫刺激基元存在，任何长度大于6个核苷酸(甚至多个kb 长)的核酸能够依照本发明诱导产生免疫反应。优选的是，免 疫刺激性核酸的长度在8到100个范围内，在一些实施方案中， 富含T的免疫刺激性核酸的长度在24到100个核苷酸的范围 内，含有TG的免疫刺激性核酸的长度在15-25个核苷酸的范 围内。

在一个实施方案中，富含T的核酸可以由至少下式 5’X1X2TTTTX3X43’来表示，其中，X1、X2、X3和X4是核苷 酸。在一个实施方案中，X1X2是TT和/或X3X4是TT。在其 它实施方案中，X1X2是从下列核苷酸中选取的任何一个，TA、 TG、TC、AT、AA、AG、AC、CA、CC、CA、GT、GG、GA 和GC；并且X3X4是从下列核苷酸中选取的任何一个，TA、TG、 TC、AT、AA、AG、AC、CT、CC、CA、GT、GG、GA和GC。

在一些实施方案中，优选的是，免疫刺激性核酸不含多C (CCCC)或多A(AAAA)。在其它的实施方案中，优选的是， 免疫刺激性核酸包括多C、多A、多G(GGGG)或多重GG。 特别是多G或多重GG基元对于一些免疫刺激性核酸来说有巨 大的影响。这些非T序列的影响部分建立在核酸骨架的地位上。 例如，如果核酸有一个核酸磷酸二酯的骨架或一个嵌合骨架， 如果任何效果影响核酸的生物活性，核酸内的这些序列的包含 作用很小。如果骨架完全是硫代磷酸酯(或其它磷酸酯的修饰 形式)或显著地硫代磷酸酯化，那么，这些序列的包含作用对 生物活性或生物活性的动力学都有更多的影响，导致富含T的 免疫刺激性核酸和TG免疫刺激性核酸的潜力下降。

尽管富含C的核酸已经被证明有免疫刺激性能，但是，以 减少核酸中的T核苷酸相对含量的方式将多C序列加入富含T 的核酸中，将对核酸产生负面影响。尽管专利并没有被提议的 机理所束缚，但是人们相信：免疫系统已经为识别有不同核苷 酸性质的核酸发展了机理，可能是由于不同组的结合蛋白质识 别不同的序列，或者是特定的结合蛋白质识别所有的免疫刺激 序列但是以不同的亲和力进行识别。一般来讲，包含不能甲基 化的CpG基元的核酸是免疫刺激性能最好的，紧随其后的是富 含T的核酸、TG核酸和富含C的核酸。但是，这个归纳还有 许多例外。例如，象序列号为886的富含T的这么强的核酸在 一些化验中显示了比一些含有CpG的核酸(例如，只含有一个 CpG基元的硫代磷酸酯CpG核酸)更强的免疫刺激性能。

本发明也发现：将多A作为尾巴添加到免疫刺激性核酸上 可以提供核酸的活性。发现当具有高免疫刺激活性的CpG(序 列号为246)以添加一个多A尾巴(AAAAA)或一个多T尾巴 (TTTTTT)的方式进行修饰后，修饰后的寡核苷酸的免疫刺激 活性增加了。多A尾巴和多T尾巴的增加寡核苷酸免疫刺激性 能的能力是相似的。序列号为246的序列是富含T的寡核苷酸。 多A和多T尾巴添加到不是富含T的核酸上时将对核酸的免疫 刺激能力有更大的影响，这很有可能的。因为多T尾巴添加到 已经是富含T的核酸时，添加多T的免疫刺激能力在某种程度 上被稀释了，尽管没有被完全被稀释。这个发现对多A区域的 应用有重要的应用价值。因此，在一些实施方案中，免疫刺激 性核酸含有多A区域，在其它实施方案中免疫刺激性核酸却没 有多A区域。

这个专利中的一些免疫刺激性核酸包括一个或多个CG基 元。CG基元在免疫刺激性核酸中的存在对核酸的生物活性也有 影响。如果免疫刺激性核酸的总长度在20个核苷酸残基或少于 20个核苷酸残基，那么，CpG基元在决定核酸的没有效果中很 重要。如果免疫刺激性核酸的长度增加到24，那么核酸的免疫 刺激效果变得较少地依靠CpG基元；如果在此描述的其它免疫 刺激性能存在的话，通过CpG的甲基化或通过GC双核苷酸的 倒置(即变为GpC)不能够再破坏免疫刺激效果。

例如，ODN2006(序列号为246)是具有好免疫刺激活性的 富含T的核酸。这个核酸的长度为24个核苷酸残基，并有四个 CpG双核苷酸。虽然ODN2117(序列号为358)的CpG基元是 甲基化的，但是，它也有很高的免疫刺激活性。ODN2006通过 CpG基元中的G和C的换位变为GpC的方式变为ODN2137(序 列号为886)，结果是ODN2137中含有六个TG双核苷酸， ODN2137仍然有免疫刺激活性。诸如核酸ODN2117、2137的 免疫刺激效果由它们的T和TG成分控制的。这三个核酸中的 任何一个都是富含T的，并且ODN2137是更加地富含T。如果 它们的T成分通过加入例如A的其它碱基(ODN2117(序列号 为358))而减少，或如果它们的TG成分通过将TG取代为AG 而减少的话，那么免疫刺激活性将在一定程度上减少。在其它 的例子中，一个长度为24个核苷酸但是所以的位置都是随机的 的核酸只有中等强度的免疫刺激效果(ODN2182(序列号为 432))。同样地，一个长度为24个核苷酸同时其它核苷酸组成 核酸具有不同的免疫刺激效果，这取决于它们的成分(ODN 2188(序列号为905)，2189(序列号为906)，2190(序列号为907)， 2191(序列号为908)，2193(序列号为910)，2183(序列号为433)和 2178(序列号为908))。含有TGT基元的ODN2190比含有TGG 基元的ODN2202有高的免疫刺激活性。因此，在一些实施方案 中，TGT基元是优选的基元。在更其它的实施方案中，TG基元 的数目是很重要的，，因为增加TG基元的数目可以导致免疫刺 激活性的增加。一些优选的TG核酸含有至少三个TG基元。

CpG核酸的例子包括表A所列的序列，但是并不局限于所 列的这些序列。这些序列的序列号分别为：1，3，4，1 4-1 6， 18-24，28，29，33-46，49，50，52-56，58，64-67，69， 71，72，76-87，90，91，93，94，96，98，102-124，126- 128，131-133，136-141，146-150，152-153，155-171， 173-178，180-186，188-198，201，203-214，216-220， 223，224，227-240，242-256，258，260-265，270-273， 275，277-181，286-287，292，295-296，300，302，305- 307，309  312，314-317，320-327，329，335，337-341， 343-352，354，357，361-365，367-369，373-376，378- 385，388-392，394，395，399，401-404，406-426，429- 433，434-437，439，441-443，445，447，448，450，453- 456，460-464，466-469，472-475，477，478，480，483- 485，488，489，492，493，495-502，504-505，507-509， 511，513-529，532-541，543-555，564-566，568-576， 578，580，599，601-605，607-611，613-615，617，619- 622，625-646，648-650，653-664，666-697，699-706， 708，709，711-716，718-732，736，737，739-744，746， 747，749-761，763，766-767，769，772-779，781-783， 785-786，790-792，798-799，804-808，810，815，817， 818，820-832，835-846，849-850，855-859，862，865， 872，874-877，879-881，883-885，888-904和909-913。

在本发明的一些实施方案中，免疫刺激性核酸的包含CpG 双核苷酸；而在其它的实施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG 双核苷酸。CpG双核苷酸可以被甲基化或未甲基化。一个含有 至少一个未甲基化的CpG双核苷酸的核酸是核酸分子，这种核 酸分子含有一个未甲基化的胞核嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸序列(例 如“CpG DNA”或在5’位含有未甲基化的胞核嘧啶、在3’位含 有鸟嘌呤、并且以磷酸酯键相连的DNA)，可以激活免疫系统。 含有至少一个甲基化的CpG双核苷酸的核酸，这种核酸分子含 有一个甲基化的胞核嘧啶-鸟嘌呤双核苷酸序列(例如“CpG DNA”或在5’位含有未甲基化的胞核嘧啶、在3’位含有鸟嘌呤、 并且以磷酸酯键相连的DNA)。

不含CpG核酸的富含T的核酸的例子包括表A所列的序 列，但是不局限于这些。这些例子的序列号分别为：59-63，73 -75，142，215，226，241，267-269，282，301，304，330， 342，358，370-372，393，433，471，479，486，491，497， 503，556-558，567，694，793-794，797，833，852，861， 867，868，882，886，905，907，908，和910-913。含有CpG 核酸的富含T的核酸的例子包括表A所列的序列，但是不局限 于这些。这些例子的序列号分别为：64，98，112，146，185， 204，208，214，224，233，244，247，258，262，263，265， 270-273，300，305，316，317，343，344，350，352，354， 374，376，392，407，411-413，429-432，434，435，443， 474，475，498-501，518，687，692，693，804，862，883， 884，888，890，和891。

免疫刺激性核酸可以是双链的，也可以是单链的。一般来 讲，双链的分子在体内较稳定，但是单链的分子有较高的免疫 活性。因此在本发明的一些方面，优选的是，核酸是单链的； 在其它的方面，核酸则是双链的。

在这里用的富含T的核酸和TG核酸的两个名词，除非特意 作出说明，分别是指具有免疫刺激活性的富含T核酸和具有免 疫刺激活性的TG核酸。本发明中的富含T的核酸序列在上文 中已经广泛描述和在表A中所列的含有至少一个多T基元和/或 作出中含有大于25％或者优选的是35％的T核苷酸残基的核 酸。富含C的核酸是那些含有至少一个更为优选的是至少两个 多C区域的核酸。本发明中的TG核酸在上文中已经广泛描述 和在表A中所列的含有至少一个多TG基元的核酸。

本发明中的核酸可以，但是不是必要的，也包含一个多G 基元。含有多G的核酸也具有免疫刺激性能。许多的文献也描 述了多G核酸的免疫刺激性能。这些文献包括：Pisetsky and Reinch，1993 Mol.Biol.Reports，18：217-221；Krieger and Herz， 1994，Ann.Rev.Biochem.，63：601-637；Macaya et al.，1993，PNAS， 90：3745-3749；Wyatt et al.，1994，PNAS，91：1356-1360；Rando and Hogan，1998，In Applied Antisense Oligonucleotide Technology.Ed. Krieg and Stein，p.335-352；and Kimura et al.，1994，J.Biochem. 116，991-994。

优选的是，多G核酸是含有下式的核酸，5’X1X2GGGX3X43’， 其中X1X2X3和X4是核苷酸。在优选的实施方案中，X3和X4中 至少有一个是G。在其它上述方案中，X3和X4都是G。在更其 它的实施方案中，优选的分子式为5’GGGNGGG3’或 5’GGGNGGGNGGG3’；其中N代表着0-20个核苷酸。在其它 的实施方案中，多G核酸中没有未甲基化的CG双核苷酸，例 如，就象下面所列的核酸，它们的序列号分别为：5，6，73，215， 267-269，276，282，288，297-299，355，259，286，287， 444，476，531，557-559，733，768，795，796，914-925， 928-931，933-936，和938。在其它的实施方案中，多G核 酸包括至少一个未甲基化的CG双核苷酸，例如，就象下面所 列的核酸，它们的序列号分别为：67，80-82，141，147，148， 173，178，183，185，214，224，264，265，315，329，434， 435，475，519，521-524，526，527，535，554，565，609， 628，660，661，662，725，767，825，856，857，876，892， 909，926，927，932，和937。

“核酸”和“寡核苷酸”这两个名称是可以交替地应用以表 示多重核苷酸(也就是如含有糖的分子(例如核糖或脱氧核糖)和 磷酸基和可交换的有机碱相连；这个碱或者是取代的吡啶(例如 胞核嘧啶(C)，胸腺嘧啶脱氧核苷(T)，或尿嘧啶(U)，或者是取代 的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。就象这里用的一样，用于 表示寡核糖核苷酸的名词也可指代寡脱氧核糖核苷酸。这些名 词也包括多核苷(就是多核苷酸减去磷酸)和任何其它包含高 分子的有机碱。核酸分子可以从现存的核酸原料得到(例如， 基因或cDNA)，但是优选的是合成(例如由核酸合成产生)。

核酸和寡核苷酸这两个名词也包括有取代基或修饰成分的 核酸或寡核苷酸，象在碱基和/或糖中的取代或修饰。例如，它 们包括含有糖骨架的核酸，其中糖骨架连在除了3’位上的氢氧 基和5’位上的磷酸基的低分子量的有机基团上。因此，修饰的 核酸可以包括一个2’-O-烃化的核糖基团。另外，修饰的核酸包 括象树胶醛醣取代了核糖的糖。因此，核酸的骨架成分可以是 非均相的，其中包含任何与肽-核酸(含有氨基酸骨架和核酸 碱基)联结在一起的高分子单元的可能组合。在一些实施方案 中，核酸的骨架组成是均相的。核酸也包括取代的嘌呤和嘧啶， 就象C-5丙炔修饰的碱基(Wagner et al.，Nature Biotechnology 14：840-844，1996)。嘌呤和嘧啶包括但是并不局限于腺嘌呤、胞 核嘧啶、鸟嘌呤、胸(腺嘧啶脱氧核)苷、5-甲基胞核嘧啶、2-氨 基嘌呤、2-氨基-6氯代嘌呤、2，6双氨基嘌呤、次黄嘌呤、和 其它自然或非自然存在的核碱基，取代或非取代的芳烃部分。 其它这样的修饰对于本领域的技术人员来讲已经很熟悉了。

在即时的专利中的应用，本发明的核酸可以用任何在本领 域已经很熟悉的过程来合成de novo。例如，b-氰乙基-氨基磷 酸酯方法(Beaucage，S.L.，和Caruthers，M.H.，Tet.Let. 22：1859，1981)；核苷H-磷酸方法(Garegg et al.，Tet.Let. 27：4051-4054，1986；Froehler et al..Nucl.Acid.Res. 14：5399-5407， 1986，；Garegg et al.， 27：4055-4058，1986；Garegg et al.， 29:2619- 2622，1988)。这些化学的过程可以用市场中卖的许多自动的核酸 合成机实现。这些核酸称作合成核酸。可替换的是，富含T和/ 或TG双核苷酸可以在血纤维蛋白溶酶中大量制造(参见 Sambrook，T.，et al.，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”， Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)并且可以 分离成小块或者不分。核酸可以用象应用限制性的酶(限制性 核酸外切酶或限制性核酸内切酶)等已知的技术从已有的核酸 序列(例如：基因或cDNA)得到。这种方式得到的核酸称作 孤立的核酸。孤立的核酸是指被从那些在通常自然情况下地成 分中分离出来的核酸。举个例子，孤立核酸可以是从细胞、核 子、线粒体或染色质中分离出来的。富含Py的核酸和TG核酸 即包括合成的又包括孤立的富含Py的核酸和TG核酸。

为了在体内应用，富含Py和TG核酸可选择性地相对地抗 降解(例如，是稳定的)。一个“稳定的核酸分子”的意思是核 酸分子可以相对地抗体内降解(例如，核酸外切酶或核酸内切 酶)。稳定是长度或二维基元的函数。有成十上百个kbs长的核 酸相对地能抗体内降解。对于较短些的核酸，二维基元可以稳 定和提高核酸的效果。例如，如果核酸的3’位末端有与核酸自 身的上端的自配位，那么，核酸可以折合并形成一种径杆环的 基元，这样一来，核酸变得稳定并且因此表现出更高的活性。

可替换的是，核酸的稳定性可通过磷酸酯骨架的修饰来实 现。优选的是，即时的专利中的稳定的核酸有一个修饰的骨架。 已经证明：核酸骨架的修饰提高了富含Py和TG核酸在体内的 活性。这些稳定的基元是优选的，因为本发明中富含Py和TG 的分子含有至少一部分修饰骨架。含有磷酸二酯链接的富含Py 和TG构造产生最大的活性并且保护核酸免受细胞内的核酸外 切酶或核酸内切酶的降解作用。其它修饰的核酸包括磷酸二酯 修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯的混合修饰的核酸、甲基 磷酸、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙羟基和上述的混 合修饰。关于CpG核酸，这些混合修饰和它们独特对于免疫细 胞的效果都已经在下列的PCT专利中较详细的讨论了。这些专 利有：PCT/US95/01570(WO 96/02555)和PCT/US97/19791(WO 98/18810)；权利要求在U.S.NO.08/386,063和08/960,774，分别 在二月7号，1995和十月30，1997提出申请。在此通过引证这 两篇专利的整个内容被并入本文。本专利认为这些修饰的核酸 可以表现出较高的刺激活性归因于核酸的抵抗力的增强、细胞 的摄取能力的提高、蛋白质的结合能力的提高和/或内部位置的 改变。

本发明的内容可以选择性地是嵌入式的寡核苷酸。这种嵌 入式的寡核苷酸是含有下式5’Y1N1ZN2Y23’的寡核苷酸，其中Y1 和Y2是含有1到10个核苷酸的核酸分子。Y1和Y2每个都包括 至少一个修饰的内核苷酸链接。因为嵌入式的寡核苷酸中至少2 个核苷酸包括骨架修饰，所以这些核酸是一种“稳定免疫刺激 性核酸”的一个例子。

考虑到嵌入式的寡核苷酸，Y1和Y2可以看作是互相独立的。 这就是说，在同一个分子中，Y1和Y2中的任何一个可以含有或 不含有互相不同的下列和互相不同的骨架链接。序列是不同的， 但是，在一些情况下，Y1和Y2含有一个多G序列。多G序列 是指至少连续3个G相邻地排成一排。在其它实施方案中，Y1 和Y2可以是：TCGTCG、TCGTCGT、或TCGTCGTT(序列号 为1145)。Y1和Y2也可以含有一个多C、多T或多A序列。在 一些实施方案中，Y1和/或Y2含有3到8个核苷酸。

只要N1ZN2中总共含有至少6个核苷酸N1和N2是含有0到 5个核苷酸的核酸分子。N1ZN2的核苷酸含有一个磷酸二酯骨 架，并且不含有骨架被修饰的核酸。

Z有一个免疫刺激性核酸的基元，但是它并不含有CG。例 如，Z可以是富含T序列的核酸，如包括一个TTTT基元或一 个碱基中至少有50％是T的序列；Z也可以是TG序列。

式子Y1N1ZN2Y2中心的核苷酸(N1ZN2)有磷酸二酯内核苷 酸链接，Y1和Y2至少含有一个、但是可以含有多于一个、或 甚至全部是修饰的内核苷酸链接。在优选的实施方案中，Y1和/ 或Y2含有至少两个或两个到五个修饰的内核苷酸链接；或者Y1 含有两个修饰的内核苷酸链接并且Y2含有五个修饰的内核苷酸 链接；或者Y1含有五个修饰的内核苷酸链接并且Y2含有两个 修饰的内核苷酸链接。在一些实施方案中，修饰的内核苷酸链 接是硫代磷酸酯修饰的链接、二硫代磷酸酯修饰的链接、或p- 乙氧基修饰的链接。

象硫代磷酸酯修饰的修饰的骨架可以应用自动技术通过氨 基磷酸酯或H-磷酸化学来合成。芳基和烷基磷酸可以通过象 US4,469,863中描述的那样制备；烷基磷酸三酯(其中带电的氧 原子部分是象U.S.5,023,243和EP092,574中描述的那样烷基化 的)可以应用自动固相合成的方法通过商业上可获得的实剂来 合成。制备其它DNA骨架修饰和取代的方法已经描述(Uhlmann， E.And Peyman，A.，Chem.Rev. 90：544，1990；Goodchild，J.， Bioconjugate Chem. 1：165，1990)。

其它稳定的核酸包括：非离子性的DNA类似物，例如烷基 和芳基磷酸(其中带电的氧原子被一个烷基或芳基基团取代)、磷 酸二酯和烷基磷酸三酯、其中带电的氧原子部分被烷基取代。 就象四乙二醇或六乙二醇一样一端或两端都有含有二醇的核 酸，也有充分的核酸酶降解作用的抵抗力。

当富含Py或TG核酸与可以在核酸载体中解密的抗原同时 提供时，优选的是富含Py或TG核酸的骨架是磷酸二酯和硫代 磷酸酯(或其它磷酸修饰)的潜入式混合。在完全硫代磷酸酯 的核酸存在的情况下，细胞可能有吸收质粒载体的问题。因此， 当载体和核酸都给予实验对象时，优选的是核酸有潜入式骨架 或硫代磷酸酯骨架；但是质粒与将质粒直接分散到细胞的介质 有关。这样一来可以避免细胞的摄取。这样的介质在技术上已 知，包含例如脂质体和基因枪。

这里描述的核酸和各种各样的控制核酸在表A中列出。   SEQ ID NO： ODN SEQUENCE   BACKBONE   1 tctcccagcgtgcgccat   s   2 ataatccagcttgaaccaag   s   3 ataatcgacgttcaagcaag   s   4 taccgcgtgcgaccctct   s   5 ggggagggt   s   6 ggggagggg   s   7 ggtgaggtg   s   8 tccatgtzgttcctgatgct   o   9 gctaccttagzgtga   o   10 tccatgazgttcctgatgct   o   11 tccatgacgttcztgatgct   o   12 gctagazgttagtgt   o   13 agctccatggtgctcactg   s   14 ccacgtcgaccctcaggcga   s   15 gcacatcgtcccgcagccga   s   16 gtcactcgtggtacctcga   s   17 gttggatacaggccagactttgttg   o   18 gattcaacttgcgctcatcttaggc   o   19 accatggacgaactgtttcccctc   s   20 accatggacgagctgtttcccctc   s   21 accatggacgacctgtttcccctc   s   22 accatggacgtactgtttcccctc   s   23 accatggacggtctgtttcccctc   s   24 accatggacgttctgtttcccctc   s   25 ccactcacatctgctgctccacaag   o   26 acttctcatagtccctttggtccag   o   27 tccatgagcttcctgagtct   o   28 gaggaaggigiggaigacgt   o   29 gtgaaticgttcicgggict   o   30 aaaaaa   s   31 cccccc   s   32 ctgtca   s   33 tcgtag   s   34 tcgtgg   s   35 cgtcgt   s   36 tccatgtcggtcctgagtct   sos   37 tccatgccggtcctgagtct   sos   38 tccatgacggtcctgagtct   sos   39 tccatgacggtcctgagtct   sos   40 tccatgtcgatcctgagtct   sos   41 tccatgtcgctcctgagtct   sos   42 tccatgtcgttcctgagtct   sos   43 tccatgacgttcctgagtct   sos   44 tccataacgttcctgagtct   sos   45 tccatgacgtccctgagtct   sos   46 tccatcacgtgcctgagtct   sos   47 tccatgctggtcctgagtct   sos   48 tccatgtzggtcctgagtct   sos   49 ccgcttcctccagatgagctcatgggtttctccaccaag   o   50 cttggtggagaaacccatgagctcatctggaggaagcgg   o   51 ccccaaagggatgagaagtt   o   52 agatagcaaatcggctgacg   o   53 ggttcacgtgctcatggctg   o   54 tctcccagcgtgcgccat   s   55 tctcccagcgtgcgccat   s   56 taccgcgtgcgaccctct   s   57 ataatccagcttgaaccaag   s   58 ataatcgacgttcaagcaag   s   59 tccatgattttcctgatttt   o   60 ttgtttttttgtttttttgttttt   s   61 ttttttttgtttttttgttttt   o   62 tgctgcttttgtgcttttgtgctt   s   63 tgctgcttgtgcttttgtgctt   o   64 gcattcatcaggcgggcaagaat   o   65 taccgagcttcgacgagatttca   o   66 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  o   160 tcctgtcgttgaagt   o   161 tcctggcgttgaagt   o   162 tcctgccgttgaagt   o   163 tccttacgttgaagt   o   164 tcctaacgttgaagt   o   165 tcctcacgttgaagt   o   166 tcctgacgatgaagt   o   167 tcctgacgctgaagt   o   168 tcctgacggtgaagt   o   169 tcctgacgtagaagt   o   170 tcctgacgtcgaagt   o   171 tcctgacgtggaagt   o   172 tcctgagcttgaagt   o   173 gggggacgttggggg   o   174 tcctgacgttccttc   o   175 tctcccagcgagcgagcgccat   s   176 tcctgacgtttccctggcggtcccctgtcgct   o   177 tcctgtcgctcctgtcgctcctgtcgct   o   178 tcctggcggggaagt   o   179 tcctgazgttgaagt   o   180 tcztgacgttgaagt   o   181 tcctagcgttgaagt   o   182 tccagacgttgaagt   o   183 tcctgacggggaagt   o   184 tcctggcggtgaagt   o   185 ggctccggggagggaatttttgtctat   o   186 atagacaaaaattccctccccggagcc   o   187 tccatgagcttccttgagtct   rna   188 tcgtcgctgtctccgcttctt   so   189 tcgtcgctgtctccgcttctt   s20   190 tcgagacattgcacaatcatctg   o   191 cagattgtgcaatgtctcga   o   192 tccatgtcgttcctgatgcg   o   193 gcgatgtcgttcctgatgct   o   194 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虽然CpG在老鼠中的效果得到很好的表征，但是在人类系 统中的效果却很有限。在老鼠系统中具有很强的刺激活性的CpG 硫代磷酸寡核苷酸在人类和其它非啮齿动物免疫细胞中表现出 较低活性。在这些例子中，有效的人类CpG基元的发展和它的 效果表征以及在人类基本B-细胞中的作用机理都有描述。含 有这种CpG基元的DNA刺激基本B-细胞使之复制，产生IL-6 并表现出CD86、CD40/CD54和MHC II浓度的升高。它提高了 转录因子NFκB和AP-1的DNA结合能力，同时提高了应力活 化蛋白激酶JNK和p38以及转录因子ATF-2的磷酸化作用。由 CpGDNA活化的产生的B-细胞信号路与由ERK和不同形式的 JNK活化的B细胞接受器活化的信号路不同，但是没有活化p38 和ATF-2。一般来讲，在由CpGDNA初始化的信号传导的数 据与在老鼠上得到的数据是一致的(Hacker H.，et al.1998.Embo J17：6230，Yi A.K.，和Krieg A.M.1998.J Immunol 161：4493)。

优选的非啮齿动物的基元为5’TCGTCGTT3’。在最有效的 8merCpG基元(5’TCGTCGTT3’)中碱基的改变会减少寡核苷 酸的活性。在5’位和3’位上的胸腺嘧啶脱氧核苷比在中间位置 的胸腺嘧啶脱氧核苷更重要。在中间位置的腺嘌呤和鸟嘌呤核 苷带来活性的减少。

值得着重指出的是，我们的研究证明：在磷酸二酯寡核苷 酸(2080)中的人类CpG基元足够产生最大的效果，并且证明增 加的CpG基元(2059)并没有进一步提高活性。含有两个CpG 双核苷酸的具有8merCpG基元(5’TCGTCGTT3’)的寡核苷酸 在研究中表现出最高的活性。在两个CpG双核苷酸侧面的碱基(5’ 位、中间位置、3’位)的替换导致这个序列活性的减小。在8merCpG 基元中的两个CpG双核苷酸对于最佳活性来说都是必须的 (2108，2106)。CpG双核苷酸(2059)中的胞啶甲基化破坏了2080 的活性，但是无联系的胞啶甲基化(2094)不会破坏2080的活 性。在2080序列中加入两个CpG基元变为2059；但是这个加 入并没有进一步提高磷酸二酯寡核苷酸的活性。具有硫代磷酸 骨架的2080序列(即2116)表现出低的活性，这表明CpG基 元的添加对于有效的硫代磷酸寡核苷酸来说是优选的。

本发明发现：免疫刺激性核酸在诸如NK细胞、B细胞和Dcin vitro等人类细胞上有惊人的免疫刺激效果。已经证明：在这里 应用的体外化验体外预测在非啮齿脊椎动物内作为疫苗辅助成 分的有效性(例子12)，这表明免疫刺激性核酸作为预防药物预 防下列疾病是有效的，这些疾病包括：人类疫苗、癌症免疫预 防、哮喘免疫预防、免疫功能的一般性增强、在辐射疗法或化 学疗法后的造血功能的恢复的提高、和其它免疫调节的应用。

因此，在本发明的一些方面，免疫刺激性核酸作为预防免 疫药物对治疗有危险感染有机感染物、已知相应的癌症抗原的 癌症、或过敏原或易患病的体质已知的敏感症或哮喘的实验对 象来说是有效的。对于短期保护以免感染，没有抗原或过敏原 时，免疫刺激性核酸也可以用；在这种情况下，反复使用药物 允许较长期的保护。在这里使用的易患病的实验对象是容易感 染病菌或癌症或过敏原、或的有患癌症的危险实验对象。例如， 易患病的实验对象可能是准备去一个特殊种类的感染性细菌已 被发现的地区的人；或者是通过生活习惯或医疗过程的方式身 体接触含有感染性有机物的液体或直接接触有机物的人，甚至 是生活在感染性有机物或过敏原已知的地区的人们。有感染危 险的人们也包括医生建议用特定的感染性有机原抗体进行免疫 的一般人们。如果抗原是过敏原，因此实验对象对那种特定的 抗原产生了敏感反应；实验对象接触了抗原，例如在花粉季节 里，这样实验对象有接触抗原的危险。有发展为对哮喘过敏危 险的实验对象包括已经被确认为有过敏症或哮喘病但是在用免 疫刺激性核酸治疗的过程中病不活跃的实验对象，同时包括因 为基因或环境因素被认为有患这些疾病危险的实验对象。

有患癌症危险的实验对象是指那些有很高可能患癌症的实 验对象。这些实验对象包括：例如，那些有已经被证明与较高 的患癌症概率相关的基因异常的实验对象；还包括那些接触诸 如烟草、石棉、或其它化学毒物致癌物质的实验对象，或者曾 经因癌症被治疗过但是现在没有癌症的实验对象。当有患癌症 危险的实验对象通过实验对象容易患的癌症的特定抗原和免疫 刺激性核酸的治疗，当癌细胞发展时，实验对象能够杀死它们。 如果瘤在实验对象身上开始时，实验对象针对瘤抗原能够产生 特定的免疫反应。

除了免疫刺激性核酸在预防治疗中的应用之外，本发明也 包括免疫刺激性核酸在治疗有感染、过敏、哮喘或癌症的实验 对象中的应用。

已经受感染的实验对象是指那些接触感染性病菌和在身体 内有急性的或慢性的可检测水平的病菌的实验对象。免疫刺激 性核酸可以与抗原一起应用以装上能够减少或清除病菌的特定 的抗原系统或黏膜免疫反应。在这里用的感染性疾病是指在身 体内由于存在外部的微生物而产生的疾病。发展有效的免疫战 略和治疗以保护病菌入侵的第一站-身体的黏膜是特别重要 的。

有过敏症的实验对象是那些有或者对过敏原有过敏反应的 实验对象。过敏症是指对于一种物质(过敏原)有获得性的高 度敏感性。过敏情况包括但是不仅限于湿疹、过敏性鼻炎或鼻 炎、花粉热、结膜炎、支气管的哮喘、风疹(麻疹)、和食物过敏、 和其它遗传性过敏症的情况。

现在，过敏症一般是通过注入少量的抗原并且之后逐渐增 加抗原的药量来治疗的。人们认为：这个过程导致对抗原的忍 受力以达到预防过敏反应的目的。但是，这些方法要花费几年 的时间才能达到有效，并且有诸如过敏性休克等副作用。本发 明的方法避免了这些问题。

过敏一般是由以对付无害的抗原而产生的IgE抗体造成的。 由免疫刺激性核酸通过系统或黏膜给予方式诱导的细胞因子是 主要地称作Th1类(例如IL-2和IFN-γ)，这些诱导体液的和细 胞的免疫反应。与Th1反应相关的抗体类型一般来讲有较好的 保护作用，因为它们有高的中和能力和调理能力。其它与IL-4、 IL-5和IL-10细胞因子生成相关的主要类型的免疫反应被称作 Th2免疫反应。Th2反应主要包括抗体；这些反应的免于感染的 保护效果差些；一些Th2同形物(例如，IgE)与敏感症有关。 一般意义上，敏感症看起来是由Th2类型免疫反应调节的，但 是Th1反应可以提供最好的免于感染的保护，尽管过量的Th1 反应是与自动免疫症相关。基于免疫刺激性核酸在实验对象身 体内将Th2(与IgE抗体和敏感症生成有关)转移为Th1反应(保 护以免产生过敏反应)的能力，导致免疫刺激性核酸的免疫反 应的一个有效的药剂量可以给予实验对象以达到治疗或预防敏 感症。

这样一来，在过敏性或非过敏性情况例如哮喘治疗中，免 疫刺激性核酸有巨大的治疗作用。Th2细胞因子，特别是IL-4 和IL-5是在哮喘患者的呼吸道中得到提高。这些细胞因子提高 了哮喘引起的反应的重要方面，这些反应包括IgE同位素转换、 嗜曙红细胞化学向性和活性和柱细胞的生长。Th1细胞因子， 特别是IFN-γ和IL-12，能够抑制Th2的复制和Th2细胞因子 的产生。哮喘是指呼吸系统的紊乱，这种紊乱是由引发、呼吸 道变窄和对于吸入的东西的呼吸道增加的反应。哮喘是经常性 的，尽管不是专有地与遗传性过敏症的症状和过敏的症状有关。

有癌症的实验对象是那些已经有可检测出的癌症细胞的实 验对象。癌症可能是恶性的或非恶性的癌症。癌症和瘤包括但 是不局限于胆管癌、脑癌、乳房癌、子宫癌、绒毛膜癌、结肠 癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内瘤、淋巴瘤、肝癌、 肺癌(如：小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔 癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、恶性毒瘤、皮肤癌、 睾丸癌、甲状腺癌、肾癌、和其它癌症和恶性毒瘤。在一个实 施方中，癌症是多毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、皮肤T- 细胞白血病、多重骨髓瘤、小囊淋巴瘤、恶性黑素瘤、鳞状细 胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌、或结肠癌。

本发明中的实验对象是非啮齿实验对象。非啮齿实验对象 的意思是人类或脊椎动物，这些非啮齿实验对象包括但是不局 限于：狗、猫、马、母牛、猪、绵羊、山羊、小鸡、如猴等灵 长类的动物、如鲑鱼等鱼(水产种类)、但是特别不包含老鼠等 啮齿类动物。

这样一来，本发明也可以用来治疗非人类的癌症和瘤。癌 症是人类的同伴动物(如猫和狗)死亡的主要原因之一。癌症 通常对年龄较大的动物是很大的打击，这些动物例如已经成为 家庭的一部分了。大于10岁中51％狗很可能屈服于死。最普通 的治疗选择包括外科、化疗和放射治疗。曾经成功地用过的其 它治疗方法有：激光疗法、冷冻疗法、高温疗法和免疫疗法。 治疗的选择基于癌症的类型和癌症的分散度。除非恶性增长被 限制在身体内的不连续区域，只除去恶性组织而不影响正常细 胞是很难的。

在狗和猫身上诊断出的恶性紊乱包括但不局限于淋巴肉 瘤、骨肉瘤、乳房瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、黑素瘤、腺鳞状细 胞癌、良性肺肿瘤、支气管腺瘤、支气管腺癌、纤维瘤、粘液 软骨瘤、肺部恶性毒瘤、神经瘤、骨瘤、乳突淋瘤、眼癌(有遗 传性)、Ewing恶性毒瘤、Wilm瘤、Burkitt淋巴瘤、微神经胶质 瘤、破骨细胞瘤、口瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、横纹肌瘤。狗身 上的其它的瘤形成包括：生殖小鳞细胞癌、可传播的性瘤、睾 丸瘤、精原细胞瘤、(睾丸细管中的)塞尔托利细胞瘤、血管中柱 鞘瘤、组织细胞瘤、绿色肉瘤(粒细胞恶性毒瘤)、角膜乳突淋瘤、 角膜鳞片细胞癌、血管恶性毒瘤、胸膜间皮瘤、基部细胞瘤、 胃瘤、肾上腺腺癌、口乳突淋瘤、血管内层瘤和囊腺瘤。另外， 在猫身上检测到的恶性瘤包括：小囊淋巴瘤、肠淋巴恶性瘤、 纤维肉瘤和肺部鳞片细胞癌。白鼬是越来越流行的家庭宠物， 已经知道它可能患胰岛瘤、淋巴瘤、恶性毒瘤、神经瘤、胰腺 岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。

影响农业家蓄的瘤形成包括白血病、血管中柱鞘瘤和牛眼 瘤(在牛中形成的)；包皮纤维肉瘤、溃烂鳞片细胞癌、包皮癌、 结缔体素瘤和肥大细胞瘤(在马中形成的)、肝细胞癌(在猪中形 成)；淋巴瘤和肺腺瘤(在绵羊中)；肺部恶性毒瘤、淋巴瘤、 鲁斯氏肉瘤、蜂窝胃内层炎(反刍动物第二胃的一种炎症)、纤维 肉瘤、肾胚细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴白血球组织增生(在 鸟类中)、眼癌(有遗传性)、肝瘤、淋巴肉瘤(成淋巴细胞的淋 巴瘤)、浆细胞增多白血病和鱼鳔恶性毒瘤(在鱼中)、干酪样 淋巴腺炎(CLA)：山羊和绵羊中的长期的、感染性的、传染性 的疾病是由棒状杆菌假结核病，和由南非羊肺炎(jaagsiekte) 引起的绵羊传染性肺瘤。

实验对象要接触抗原。象这里用的一样，这个名词是指实 验对象以主动的方式在体内接触抗原或实验对象被动的接触抗 原。实验对象主动接触抗原的方法在技术上已经人所共知了。 一般来讲，抗原被直接给予实验对象以静脉、肌肉、口服、皮 肤扩散、黏膜、鼻、气管内，或皮下的等方式给予。抗原可以 系统内给予或局部给予。给予抗原和免疫刺激性核酸的方法在 下文中较详细地描述。实验对象被动地接触抗原，如果抗原变 得使体内的免疫细胞易获得。实验对象可能被动地接触抗原， 例如，通过体外病菌进入体内，或瘤细胞的生成来表现在其表 面体外的抗原。

实验对象被动地接触抗原的方式特别依赖于免疫刺激性核 酸给予的时间选择。例如，有患癌症、或感染性疾病、或过敏 性、或哮喘反应危险的实验对象，在经常性的基础上这类实验 对象可以给予免疫刺激性核酸，当这种危险最大时，也就是说， 在过敏的季节或刚接触过致癌物后。另外，在旅行者出发去一 个他们有接触感染病菌危险的地方之前，可以给予他们免疫刺 激性核酸。同样的道理，在士兵或百姓有接触生化武器危险时， 给他们免疫刺激性核酸可以使诱导体系或黏膜在实验对象接触 抗原时对抗原产生免疫反应。

在这里用的抗原是一种能够引起免疫反应的分子。抗原包 括但是不局限于细胞、细胞提取物、蛋白、多缩氨酸、缩氨酸、 多醣、共轭多糖、缩氨酸和多糖的类非缩氨酸形态、和其它分 子、小分子、油脂、醣脂类、碳水化合物、病毒和滤过性毒毒 提取物、和多细胞有机物例如寄生病菌和敏感原。抗原这个名 词广泛地包括任何类型的分子，这类分子被主免疫系统看作体 外的东西。抗原包括但是不局限于癌症抗原、微生物抗原、和 敏感原。

在这里使用的癌症抗原是化合物，如缩氨酸或蛋白；这种 化合物与瘤和癌症细胞表面相关，当它们在MHC细胞内的癌细 胞表面出现时能够引起免疫反应。癌症抗原可以从癌细胞中通 过癌症细胞的粗抽提(如Cohen等所述，1994，Cancer Research， 54：1055)、或可以的部分纯化、或技术再结合、或已知抗原的de novo合成等方法来准备。癌症抗原包括但是不局限于这些抗原， 它们是一个瘤或癌症的免疫基因部分的再组合表达。这些抗原 可以通过分离或再组合制备、或任何已知的技术方法来制备。

这里用的微生物抗原是一种微生物抗原；它包括但是不局 限于病菌、细菌、和真菌。这些抗原包括完整的微生物和自然 的分离物和碎片或它们的衍生物；以及和自然的微生物抗原一 样或类似并且能够引起和这种自然微生物一样的免疫反应的合 成物。如果化合物能够引起对自然微生物抗原产生的(体液或 细胞的)免疫反应，那么它们与自然微生物抗原相似。这些抗 原在技术中得到例行公事地的应用，这些抗原对于本领域的技 术人员是熟知的东西。

在人类中发现的病菌的例子包括但是不局限于：逆转录病 毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(也指HTLV-III，LAV 或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分离的如HIV-LP； 细小核糖核酸病毒科(如骨髓灰质炎病毒，A型肝炎病毒；肠道 病毒、人类的柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；嵌杯样病毒属(如 引起肠胃炎的印迹)；披盖病毒科(如马脑炎病毒，风疹病毒)； 黄色病毒科(Flaviridae)(如登革热(一种热带传染病，骨关节及 肌肉奇痛)病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠形病毒科(如冠状病 毒)；弹状病毒属(如小泡胃炎病毒，狂犬病病毒)；冠形病毒属 (如冠状病毒)；弹状病毒属(如小泡胃炎病毒，狂犬病病毒)； Filoviridae(如埃博拉病毒)；副粘病毒属(如副流感病毒，腮腺炎 病毒，麻疹病毒，呼吸合胞体病毒)；正粘病毒属(如流感病毒)； Bungaviridae(如Hantaan病毒，bunga病毒，静脉病毒和Nairo 病毒)；嵌沙样病毒属(出血热病毒)；呼吸道肠道病毒属(如呼吸 道肠道病毒，环状病毒和轮状病毒(一种致婴儿或新生畜胃肠炎 的病毒))；Birnaviridae；Hepadnaviridae(B型肝炎病毒)；细小病 毒属(parvoviruses)；乳多孔病毒属(乳突淋瘤，polyoma病毒)； 腺病毒属(多数腺病毒)；疱疹病毒属(疱疹单一病毒(HSV)1和 2，水痘带状疹子病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒 属(天花病毒，牛痘病毒，发疹的疾病病毒)；虹色病毒属(阿拉 伯猪热病毒)；和未分类的病毒(海绵状脑病的医学病毒，德耳 塔肝炎的病毒(以前认为是B型肝炎病毒的有缺陷的卫星)；非 A型，非B型肝炎(类型1＝在内传播；类型2＝非肠道传播(如 C型肝炎)；诺沃克因子(肠型流感的致病因子)和相关的病毒， 和astroviruses)。

革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌在脊椎动物中都可作为抗 原。这些革兰氏阳性细菌包括但是并不局限于：巴斯德(氏)菌种 类、葡萄球菌种类、和链球菌种类。革兰氏阴性细菌包括但是 并不局限于：埃希氏杆菌属，假单胞菌种类，和沙门氏菌种类。 感染性细菌的特例包括但是并不局限于：Helicobacter pyloris， Borelia burgdorferi，Legionella pneumophilla，Mycobacteria sps(例 如，M.肺结核，M.Avium，M.Intracellulare，M.Kansaii，M. Gordonae)，葡萄球菌属aureus，奈瑟氏菌属gonorrhoeae，奈瑟氏 菌属meningitidis，李斯特菌属monocytogenes，链球菌 pyogenes(Group A链球菌)，链球菌agalactiae(Group B链球菌)， 链球菌(viridans group)，链球菌facecalis，链球菌bovis，链球菌 (anaerobic sps.)，链球菌pneumoniae，芽胞杆菌属antracis，棒状 杆菌dipheriae，棒状杆菌sp.，丹毒丝菌属rhusiopathiae，梭菌 perfringers，梭菌tetani，Enterobacter aerogenes，克雷白氏杆菌属 pneumoniae，Pasturella multocide，类杆菌(Bacteroides sp.)，梭 菌属nucleatum，链球杆菌念珠棘虫属，密螺旋体pallidium，密 螺旋体pertenue，细螺旋体属，立克次氏体，和放线菌israelli。

真菌类的例子包括：隐球菌，新型细球菌，组织胞浆菌属 capsulatum，球孢子菌属immitis，芽生菌dermatitidis，Chlamydia trachomatis，念珠菌属白体。

其它感染性有机物(即原生生物)包括：疟原虫(Plasmodium) spp.例如疟原虫falciparum，疟原虫malariae，疟原虫ovale， 和疟原虫vivax和弓浆体属gondii。血液寄生和/或组织寄生包 括：疟原虫spp.，巴贝西虫(Babesia)microti，巴贝西虫divergens， 利什曼原虫(Leishmania)tropica，利什曼原虫spp.，利什曼原虫 braziliensis，利什曼原虫donovani，锥虫属gambiense和锥虫属 rhodesiense(非洲睡觉病)，锥虫属cruzi(Chagas’疾病)，和弓浆 虫(Toxoplasma)gondii。

其它医学上相关的微生物已经在文献中详细描述，如参考 C.G.A.Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，这篇文献的整个内容在此通过引证被并入本文。

尽管许多上述的微生物抗原与人类的紊乱有关，但是专利 对于治疗其它非人类脊椎动物也是有用的。非人类脊椎动物也 有能力生成能够用这里所讲的免疫刺激性核酸来预防和治疗的 感染。例如，除了治疗人类的感染性疾病，本发明对于治疗动 物的感染也是有用的。

象这里用的一样，治疗，被治疗，或正在治疗三个名词在 考虑到感染性疾病而用时，名词是指用抗原进行的预防治疗， 这种治疗增加了实验对象(有感染危险的实验对象)对感染的 抵抗力；换个说法，减少实验对象被病原感染的可能性和当实 验对象(已经被感染)已经被感染时治疗是为了同感染做斗争， 如减少或消灭感染或阻止它变得更坏。

在文献(Bennett，K.Compendium of Veterinary Products，3rded. North American Compendiums，Inc.，1995)中，对于治疗非人类脊 椎动物使用的许多牛痘已经描述。象上述的一样，抗原包括感 染性微生物，例如病毒、寄生菌、细菌、真菌和其中的碎片，它 们从自然原料中制得或合成得到。人类和非人类脊椎动物感染 性病毒都包括逆转录酶病毒(一种致肿瘤病毒)、RNA病毒、和 DNA病毒。逆转录酶病毒群包括简单逆转录酶病毒和复杂逆转 录酶病毒。简单逆转录酶病毒包括B类逆转录酶病毒、C类逆 转录酶病毒、和D类逆转录酶病毒子群。B类逆转录酶病毒的 一个例子是老鼠乳房瘤病毒(MMTV)。C类逆转录酶病毒包括 C类A子群(包括Rous恶性毒瘤(RSV))，鸟类白血症病毒 (ALV)，和鸟类成髓细胞变性病毒(AMV)和C类B子群(包 括猫白血症病毒(FeLV)，长臂猿类人猿白血症病毒(GALV)，脾坏 疽病毒(SNV)，网状内皮组织变性病毒(RV)和猿恶性毒瘤病毒 (SSV))。D类逆转录酶病毒包括Mason-Pfizer猴子病毒(MPMV) 和猿坏疽病毒(SNV)，猿逆转录酶病毒类型-1(SRV-1)。 复杂的逆转录酶病毒包括lentiviruses、T细胞白血病和泡沫病毒 等子群。Lentiviruses包括HIV-1，而且包括HIV-2、SIV、绵 羊脱髓鞘性脑白质炎病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、和马感染 性贫血症病毒(EIAV)。T细胞白血病包括HTLV-1、HTLV-II、 猿T细胞白血病(STLV)，和牛T细胞白血病(BLV)。泡沫病毒 包括人类泡沫病毒(HFV)，猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒 (BFV)。

在脊椎动物里是抗体的其它RNA病毒的例子包括以下所列 但是并不局限于：呼吸道肠道病毒属家族成员，这个家族包括 正呼吸道肠道类(哺乳类和鸟类逆转录酶病毒的多血清)，环状 病毒(蓝舌病(羊、马等的病毒性疾病，似口蹄疫，最早出现于南非)， Eugenangee病毒，Kemerovo病毒，阿拉伯马病病毒，和科罗 拉多扁虱热病毒)，轮状病毒(一种致婴儿或新生畜胃肠炎的病 毒)(人类轮状病毒、内布拉斯加州小牛痢疾病毒、猿轮状病毒、 牛或绵羊的轮状病毒、鸟轮状病毒)；小核糖核酸病毒家族，包 括肠道病毒类型(脊髓灰质炎病毒、A型和B型柯萨奇病毒、 肠细胞病的人类孤儿病毒(ECHO)，A型肝炎病毒、猿肠道病毒、 鼠科动物脑脊髓炎病毒(ME)、脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、 猪肠道病毒、心脏病毒类(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒(一 种脑心肌炎病毒)，鼻病毒类(包括至少130个子类型的人类鼻 病毒；其它的鼻病毒)，Apthovirus类(脚和口疾病(FMDV)； Calciviridae家族，包括猪小泡疹病毒、San Miguel海狮病毒、 猫小核糖核酸病毒和诺沃克因子(肠型流感的致病因子)病毒； Togaviridae家族，包括阿尔法病毒类(东部马脑炎病毒、Semlike 森林病毒、Sindbis病毒、Chikungunya病毒、O’Nyong-Nyong 病毒、Ross河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)， Flavirius类(蚊子生成的黄热病，登革热(一种热带传染病，骨关 节及肌肉奇痛)病毒，日本脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒，Murray valley脑炎病毒，西尼罗河病毒，Kunjin病毒，中欧扁虱生成的 病毒、远东扁虱生成的病毒、Kyasanur森林病毒、Louping III 病毒、Powassan病毒、Omsk出血热病毒)，Rubibirus类(风疹 病毒)，Pestivirus类(黏膜疾病病毒，猪霍乱病毒、Border疾 病病毒)；Bunyaviridae家族，包括Bunyvirus类(Bunyamwera 和相关的病毒，加利福尼亚脑炎系列病毒)，Phlebovirus类 (Sandfly热西西里岛病毒、Rift Valley热病毒)，Nairovirus类 (Crimean-Congo出血热病毒，索洛比绵羊疾病病毒)，和 Uukuvirus类(Uukuniemi和相关的病毒)；正粘病毒属家族，包 括流感病毒类型(A型流感病毒，许多人类子类型)；猪流感病 毒，和鸟和马流感病毒；B型流感病毒(许多人类子类型)，和 C型流感病毒(可能孤立的类型)；副粘病毒家族，包括副粘病毒 类(副流感病毒类型1，Sendai病毒，吸血病毒、副流感病毒类 型2到5，Newcastle疾病病毒，流行性腮腺炎病毒)，麻疹病毒 类(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒、大瘟热病毒，牛瘟 病毒)，肺炎病毒类(呼吸合胞体病毒(RSV))，牛的呼吸合胞 体病毒和肺炎病毒)；弹状病毒家族，包括小泡病毒(VSV)， Chandipura病毒，Flanders-Hart公园病毒)，狂犬病病毒(狂犬 病病毒)，鱼棒状病毒，和两种棒状病毒(马尔堡病毒和埃博拉 病毒)；嵌沙样病毒属家族，包括淋巴球增多脉络丛脑膜炎病毒 (LCM)，Tacaribe病毒复合体，和拉沙病毒；冠形病毒属，包 括感染性支气管炎病毒(IBV)，肝炎病毒，人类肠冠病毒，和 猫的感染性腹膜炎(猫冠状病毒)。

例证的在脊椎动物中的抗原的DNA病毒包括但是不仅限 于：发疹的疾病病毒家族，其中包括正痘病毒类(天花主体， 天花副体，猴发疹的疾病牛痘，牛发疹的疾病，水牛发疹的疾 病，兔发疹的疾病，四肢不全之畸形病)，Leporipoxvirus类(粘 液瘤，纤维瘤)，Avipoxvirus类(家禽发疹的疾病，其它鸟类发 疹的疾病病毒)，Capripoxvirus类(绵羊发疹的疾病，山羊发疹 的疾病)，Suipoxvirus类(猪发疹的疾病)，副痘病毒类(传染 性的postular皮炎病毒，假母牛发疹的疾病，牛的丘疹性胃炎 病毒)；虹色病毒属家族(阿拉伯猪热病毒，青蛙病毒2号和3 号，鱼的淋巴球炎病毒)；疱疹病毒家族，包括阿尔法-疱疹病 毒(疱疹简单类型1号和2号，水痘-带状疹子，马流产病毒， 马疱疹病毒2号和3号，假狂犬病病毒，感染性牛角膜结膜炎 病毒，感染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，感染性喉气 管炎病毒)β-疱疹病毒(人类的(形成)巨细胞的病毒和猪和猴 的(形成)巨细胞的病毒)；γ-疱疹病毒(Epstein-Barr病毒 (EBV)，Marek病病毒，疱疹saimiri，疱疹病毒蛛猴属，疱疹 病毒sylvilagus，几内亚猪疱疹病毒，Lucke瘤病毒)；腺病毒 属家族，包括Mastadenovirus类(人类子类属A，B，C，D，E和未分 类的；猿腺病毒(至少有23种血清类型)，感染性的狗肝炎，和 猫腺病毒，猪腺病毒，绵羊腺病毒，青蛙腺病毒，和许多其它 种类，Aviadenovirus类(鸟腺病毒)；和未知的腺病毒；Papoviridae 家族，包括乳突淋瘤病毒(人类乳突淋瘤病毒，牛乳突淋瘤病 毒，Shope兔乳突淋瘤病毒，和许多其它种类的致病的乳突淋瘤 病毒)，Ployomavirus类(Ployomavirus，猿形成空泡的病毒 (SV-40)，兔形成空泡的病毒(RKV)，K型病毒，BK型病毒，JC 型病毒，和其它基本的如Lymphotrophic乳突淋瘤病毒的 polyoma病毒)；细小病毒属家族包括与腺体有关的病毒类型， 细小病毒属类型(猫肠炎病毒，牛细小病毒，狗细小病毒，阿 留申群岛貂病病毒，等等)。最后，DNA病毒可以包括并不包 含在上述的家族中的病毒，例如苦鲁病和Creutzfeldt-Jacob疾病 病毒和慢性感染性神经病病毒(中国病毒)。

以上所列的每一个都是例证，但是并不仅限于这些。

另外，免疫刺激性核酸的用来引起人类的有抗原选择性的 免疫反应的应用，优选的实施方案中的方法特别适合治疗如母 鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、和野鸡等鸟类。鸟类是许多 类型传染病的主要感染目标。

出生后不久，刚出生的鸟暴露于病原性微生物中。尽管这 些鸟最初由从父母那里得到的抗体可以保护小鸟以免受病原的 侵害；但是，这种保护只是暂时的，小鸟自身的未完全发育的 免疫系统必须开始保护小鸟免受病原的侵害。这样一来，当小 鸟是最容易受到伤害的时候，保护它们免受感染常常是很迫切 的。同样迫切的是，保护较大的小鸟免受病原的侵害，特别是 当小鸟被关在封闭的笼子里，这样导致病菌的迅速扩散。这样 一来，当抗原存在时，将本发明中的免疫刺激性核酸和非核酸 性辅助药给予小鸟以提高针对抗原的免疫反应是迫切的。

在小鸡中常见的感染病的一个例子是小鸡感染性贫血症病 毒(CIAV)。在1979年研究Marek病菌疫苗突变时(Yuasa et al.， 1979，Avian Dis.23：366-385)，CIAV在日本第一次被分离。从那 以后，CIAV在主要家禽生成国的商业家禽中都被检测出来(van Bulow et al.，1991，pp.690-699，in Diseases of Poultry，9th edition， Iowa State university Press)。

CIAV传染病导致有贫血、出血和抑制(生物体的)免抑反应 等为特征的临床疾病。已经被CIAV感染的小鸡表现的胸腺的萎 缩和骨髓的萎缩，以及相应的身体的损害也是CIAV传染病的特 征。在胸腺中，偶尔在Fabricius粘液囊中的淋巴球的损耗导致抑 制(生物体的)免抑反应和滤过性毒菌、细菌、或真菌等第二种病 菌感染的机会增加，这些第二种病菌会使疾病复杂化。当抑制(生 物体的)免抑反应感染以下病毒之一或多种可以导致疾病的恶 化，这些病毒包括：Marek病病毒(MDV)，感染性粘液囊病毒、 网状内皮组织变性病毒、腺体病毒、或呼吸道肠道病毒。有报 道说：MDV发病机理可以被CIAV提高(DeBoer et al.，1989，p.28 In Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference， Tempe，Ariz.)。更进一步，有报道说：CIAV可以恶化感染性粘 液囊疾病的症状(Rosenberger et al.，1989，Avian Dis.33：707- 713)。因为CAA鸡对于实验中导致的疾病产生了年龄抵抗力。 当小鸡2周大时，CAA基本上已经完全，但是，较大的鸟仍然 有患感染病的危险(Yuasa，N.Etal.1979 supra；Yuasa，N.Etal.， Arian Diseases 24，202-209，1980)。但是如果小鸡两次感染CAA 和抑制(生物体的)免抑反应(IBDV，MDV等等)，对于疾病的年龄 抵抗力被迟滞(Yuasa，N.et al.，1979 and 1980 supra；Bulow von V. Et al.，J.Veterinary Medicine 33，93-116，1986)。CIAV的加强疾 病传播的特征包括对于环境的阻止作用和一些普通的抗感染药 有高的抵抗力。CIAV传染病对于家禽工业的经济影响在10％- 30％的被感染的鸟因疾病发作而死亡的事实中表现得很清楚。

象其它脊椎动物一样，鸟的接种疫苗可以在任何年龄进行。 通常地，对于一种活的微生物疫苗，接种疫苗最多在12周进行； 对于没有活性或其它类型的疫苗接种疫苗可以在14-18周内进 行。对于体内接种疫苗，接种疫苗可以在胚胎发育的最后四分之 一的时期进行。疫苗可以通过以下在此描述的方式给予，如皮 下，喷雾，口服，眼内，气管内，鼻子，或其它黏膜给予方式。 这样一来，本发明中的免疫刺激性核酸可以通过常规的接种疫 苗时间表给予鸟和其它非人类脊椎动物；如这里描述的在合适 的时期后，抗原可以给予。

牛和家畜也容易受到感染。感染这些动物的疾病能够造成 严重的损失，特别是在牛中的损失。本发明的方法可以用于保 护诸如母牛、马、猪、绵羊和山羊等家畜免受传染病的感染。

母牛可以受到牛病毒的感染。牛滤过性毒菌腹泻病毒(BVDV) 是一种正旋RNA包括的小病毒，它和公猪霍乱病毒(HOCV)、 绵羊边界病毒(BDV)一起被划为pestivirus类型。Pestivirus在以 前被划在Togaviridae家族中，但是一些研究建议将它们和 flavivirus和C型肝炎病毒一起重新划分到Flaviviridae中(Francki， et al.，1991)。

作为牛的重要病原的BVDV在细胞分析的基础上可以分在 致细胞病变的(CP)和非致细胞病变的(NCP)的生物型。尽管两种 生物型在牛中都可以找到，但是NCP生物型更加广泛。如果怀 孕的母牛被NCP感染，那么这个母牛能够生出一个持久稳固的 被感染的并且有特别的免疫容忍性的小牛，这个小牛在它的有 生之年里将会传播病毒。这种持久稳固的被感染的牛对于黏膜 疾病的抵抗力很差，因此在这个牛身上两种生物型都能够分离 得到。临床显示包括流产、畸形生长、呼吸困难、黏膜疾病和 慢性腹泻。另外，与能够引起动物死亡的畜牧疾病有关的严重 的血小板减少症已经被描述；与这种疾病有关的族看起来比传 统的BVDV更是恶性的。

马疱疹病毒(EHV)包括一组抗原上可以分清的能够在马 中导致从临床症状不显的到致命的病等多种传染病生物病毒组 成。这些病毒包括在马中普遍存在的马疱疹病毒1号(EHV-1)。 EHV-1与诸如流产、呼吸管道疾病、和中心神经紊乱等病相关 的。小马的上呼吸道的初级感染导致可持续8-10天的发烧。 免疫学上有经验的母马可以通过呼吸道再次感染而没有明显的 疾病，这样一来，流产通常发生在没有警示的情况下。神经学 综合病症是与呼吸疾病或流产相关的，并且这种疾病能够影响 不论公母任何年龄的动物，导致缺乏调和、虚弱和较晚的瘫痪 (Telford，E.A.R.Et al.，Virology 189，304-316，1992)。其它EHV 病毒包括：EHV-2、或马巨细胞病毒、EHV-3、马性交疹病 毒、和以前被分为是EHV-1的子类2的EHV-4。

绵羊和山羊能够被许多包括绵羊脱髓鞘性脑白质炎-maedi 等危险微生物所感染。

象猴、猿和短尾猿等灵长类能够被猿免疫缺陷病毒感染。 没有活性的细胞病毒和没有细胞的整个猿免疫缺陷疫苗据报道 已经应用于保护短尾猿(Stoot et al.(1990)Lancet 36：1538-1541； Desrosiers et al.PNAS USA(1989)86：6353-6357；Murphey-Corb et al.(1989)Science 246：1293-1297；and Carlson et al.(1990)AIDS Res.Human Retro viruses 6：1239-1246)。再结合HIV gp120疫苗 已经报道应用于保护黑猩猩(Berman et al.(1990)Nature 345：622- 625)。

家猫和野猫都容易被许多的微生物感染。例如，猫感染性 腹膜炎是一种可以在下列动物中发生的疾病，如家猫、野猫、 狮子、美洲豹、印度豹和美洲虎。当保护这些动物以免感染在 猫科中的这些疾病或其它类型的病原有机体是很紧迫的时候， 本发明中的方法能够用于种疫苗以保护它们免受感染。

家猫可能感染逆转录酶病毒(一种致肿瘤病毒)，这些逆转录酶 病毒包括但是不仅仅局限于猫白血病病毒(FelV)、猫恶性毒瘤 病毒(FeSV)、内生的Concornavirus(RD-114)、和猫syncytia- forming病毒(FeSFV)。这些里面，FeLV是最著名的病原，它导 致包括lymphoreticular和骨髓瘤、贫血症、免疫调节失衡、与 人类的可获得性免疫缺陷综合病症(AIDS)相似的免疫缺陷综 合病症多种症状。最近，特别的复制缺陷FeLV突变异种，被叫 做FeLV-AIDS，更特别是与抑制(生物体)的免疫反应性能有关。

猫的T-lymphotropic lentivirus(也被称作猫免疫缺陷)的发现 最早在Pedersen et al.的文章中报道，(1987)Science 235：790- 793。FIV的特征已经被报道，见Yamamoto et al.(1988) Leukemia，December Supplement 2：204S-215S；Yamamoto et al. (1988)Am.J.Vet.Res.49：1246-1258；and Ackley et al.(1990)J. Viroal.64：5652-5655。FIV的克隆和序列分析已经有报道： olmsted et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2448-2452 and 86：4355-4360。

猫感染性腹膜炎(FIP)是在家猫和野猫中零星地随机地发 生的。虽然FIP主要是家猫的的疾病，但是这种病已经在狮子、 山狮、美洲豹、印度豹和jaguar。小点的被FIP折磨的野猫包括： 山猫，狞獾，沙猫，和雅典娜猫。虽然各个年龄段的猫都容易患 病，但是，在家猫中，疾病绝大部分发生在年轻的动物上。患 病的峰值的年龄在6到12个月。从5到13年的年龄，患病的 机率在下降，之后在猫的14到15年时患病的机率又上升。

在鳍鱼、甲壳类动物和其它水栖的生命形态中的滤过性毒 菌、细菌、和寄生疾病引起了对于水产业来说严重的问题。由 于在孵卵的池塘或封闭的海产农业区域中的动物的高密度，传 染病菌可能消灭在例如鳍鱼、甲壳类动物和其它水栖的生命形 态的生活场所里的很大一部分存货。疾病的预防对于那些威胁 鱼的疾病来说是比疾病增加时的干预更为紧迫的治疗。鱼类的 接种疫苗是唯一的能够起预防作用的方法，这种方法可以通过 免疫提供长期的保护。基于接种疫苗上的核酸在美国专利 US5,780,448中已经由Davis描述。

鱼类的免疫系统有许多与哺乳类动物的免疫系统相似的特 点，如B细胞、T细胞、淋巴激活素、补足物和免疫球蛋白等 的存在。鱼有淋巴细胞亚类型，这种淋巴细胞亚类型在鱼中所 起的作用在许多方面与哺乳动物中的B和T细胞起的作用相似。 疫苗可以通过沉浸或口服的方式给予。

水产业的种类包括但是不仅限于：鳍鱼、甲壳类动物和其 它水栖动物。鳍鱼包括所有的脊椎鱼，这些脊椎鱼可以是多骨 的或软骨的，例如鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾鱼、seabream、和 seabass。包括鲑鱼(包括彩虹鲑鱼)、大麻哈鱼和Arctic char的鲑 鱼是鳍鱼的一个家族。甲壳类动物的例子包括，但是不仅限于： 蛤、龙虾、小虾螃蟹和牡蛎。其它养殖的水栖动物包括但是不 仅限于：鳗鲡，鱿鱼，章鱼。

滤过性毒菌的水产业病原的多肽包括不仅限于：滤过性毒 菌的出血败血病病毒(VHSV)的醣蛋白(G)或核蛋白质(N)；传 染性造血坏疽病毒(IHNV)的G或N蛋白；传染性胰腺坏疽病毒 (IPNV)的VP！、VP2、VP3、或N基元蛋白；鲤鱼的春季病毒血 症的G蛋白；和与膜有关的蛋白；海峡鲶鱼病毒(CCV)的tegumin 或capsid蛋白或糖蛋白。

感染马的典型的寄生虫是胃蝇属spp；艾美球虫属leuckarti， 贾第虫属sp；T三毛滴虫属eui；梨浆虫属spp.(RBC’s)，泰累氏 梨浆虫属equi；锥虫属spp.；Klossiella equi；Sarcocytis spp.。

感染猪的典型的寄生虫包括：艾美球虫属bebliecki，艾美球 虫属scabra，等孢子球虫属suis，贾第虫属spp.；小袋虫属coli， 内阿米巴属histolytica；弓浆虫属gondii and肉孢子虫属spp.，以 及毛线虫属spiralis.。

奶牛和肉牛的主要寄生虫包括：艾美球虫属spp.， Cryptoporidium sp.，贾第虫属spp.，弓浆虫属gondii；梨浆虫属 bovis(RBC)，梨浆虫属bigemina(RBC)，锥虫属spp.(plasma)，肉孢 子虫属spp.(RBC)；肉孢子虫属parva(lynphocytes)；毛滴虫属 foetus；以及肉孢子虫属spp.

猛禽(肉食鸟)的主要寄生虫包括：毛滴虫属gallinae；球 虫类(艾美球虫属spp.)；疟原虫属relictum，Leucoytozoon danilewskyi(owls)，变形血原虫属spp.，Trypanosoma spp.；组织 滴虫属；Cryptosporidium meleagridis，Cryptosporidium baileyi，贾 第虫属，艾美球虫属；弓浆虫属。

感染绵羊和山羊的典型的寄生虫包括：艾美球虫属spp.， Cryptosporidium sp.，贾第虫属sp.；弓浆虫属gondii；梨浆虫属 spp.(RBC)，锥虫属spp.(plasma)，泰累氏梨浆虫属spp.(RBC)；以 及肉孢子虫属spp。

感染家禽的典型的寄生虫包括：由艾美球虫属acervulina，E. Necatrix，E.Tenella，等孢子球虫属spp.以及艾美球虫属truncata 引起的球虫病；由组织滴虫属meleagridis和组织滴虫属 gallinarum引起的组织滴虫病；由毛滴虫属gallinae引起的毛滴 虫病；和由六鞭虫属meleagridis引起的六鞭虫病。家禽还可能 感染艾美球虫属maxima，艾美球虫属meleagridis，艾美球虫属 adenoeides，艾美球虫属meleagrimitis，Cryptosporidium，艾美球 虫属brunetti，艾美球虫属adenoeides，白细胞虫属spp.，疟原虫 属spp.，变形血原虫属meleagridis，弓浆虫属gondii和肉孢子虫 属。

本发明的方法也可以用于治疗或预防狗、猫、鸟、鱼和雪 貂的寄生感染。感染鸟类的典型的寄生虫包括：毛滴虫属gallinae； 艾美球虫属spp.，等孢子球虫属spp.，贾第虫属；Cryptosporidium； 肉孢子虫属spp.，艾美球虫属spp.，等孢子球虫属spp.，贾第虫 属；Cryptosporidium；肉孢子虫属spp.，弓浆虫属gondii， haemoproteus/Parahaemoproteus，疟原虫属spp.，Leucocytozoon/ Akiba，Atoxoplasma，锥虫属spp。感染鱼类的典型的寄生虫包 括：毛线虫属spiralis；Isopors spp.，肉孢子虫属spp.， Cryptosporidium spp.，Hammondia spp.，贾第虫属 duodenalis(Canis)；小袋虫属coli，内阿米巴虫属histolytica；肝 簇虫属canis；弓浆虫属gondii，锥虫属cruzi；梨浆虫属canis；利 什曼原虫属amastigotes；Neospora caninum。

感染猫类的典型的寄生虫包括：等孢子虫属spp.，弓浆虫属 gondii，Saracocystis spp.，Hammondia hammondi，Besnoitis spp.， 贾第虫属spp.；内阿米巴属histolytica；肝簇虫属canis， Cytauxzoon sp.，Cytauxzoon sp.，Cytauxzoon sp.(红细胞，RE细 胞)。

感染鱼类的典型的寄生虫包括：六鞭虫属spp.，艾美球虫属 spp.；Cryptobia spp.，小孢子虫属spp.，Myxosoma spp.， Chilodonella spp.，Trichodina spp.，Plistophora spp.，Myxosoma Henneguya；Costia spp.，Ichthyophithirius spp.，和Oodinium spp.

感染野生哺乳动物的典型的寄生虫包括：贾第鞭毛虫 spp.(食肉动物，食草动物)，同形孢子spp.(食肉动物)，艾美 球虫属spp.(食肉动物，食草动物)，泰勒尔梨浆虫(食草动物)， 巴贝西虫(食肉动物，食草动物)，锥体虫(食肉动物，食草动 物)，血吸虫(食草动物)，小獐耳细辛(Fasciola hepatica)(食草 动物)，Fascioloides magna(食草动物)，Fasciola gigantica(食草动 物)，毛线虫属spiralis(食肉动物，食草动物)。

在动物园里的寄生感染同样可以带来严重的问题。感染牛 科动物家族(如(一种南非产面部有一斑之)大羚羊、羚羊、白臀 野牛、大羚羊(非洲产，最大的羚羊)、白肢野牛、黑斑羚(产于非 洲中南部)、山羚(产于南非及东非山区的一种小羚羊)、捻(一 种非洲大羚羊)、瞪羚)的典型的寄生虫包括艾美球虫属spp.。 感染pinnipedae家族(海豹、海狮)的典型的寄生虫包括艾美球虫 属phocae。感染骆驼家族(骆驼、美洲驼)的典型的寄生虫包括艾 美球虫属spp.。感染长颈鹿家族(长颈鹿)的典型的寄生虫包括艾 美球虫属spp.。感染象家族(非洲和亚洲的)的典型的寄生虫包 括Fasciola spp.。感染低等类人猿(黑猩猩、猩猩、猿、狒狒、 短尾猿和猴)的典型的寄生虫包括贾第虫属sp.；小袋虫属coli，内 阿米巴虫属histolytica，肉孢子虫属spp.，弓浆虫属gondii； Plasmodim spp.(RBC)，梨浆虫属spp.(RBC)，锥虫属spp.(plasma)， 利什曼原虫属spp.(巨嗜细胞)。

细菌病原中的多肽包括但是不局限于：铁调节的外层膜蛋 白(IROMP)，外层膜蛋白(OMP)，和造成疖病的Aeromonis slmonicida的A蛋白，造成细菌性肾病(BKD)的Renibacterium salmoninarum的p57蛋白，主要表面相关抗原(mas)，表面表 达的细胞毒素(mpr)，表面表达溶红血球素(ish)，耶尔森氏鼠疫 杆菌肠道病的鞭毛虫抗原；细胞外蛋白(ECP)，铁调节的外层膜 蛋白(IROMP)，巴斯德(氏)菌病(出血性败血病)的结构蛋白， Vibrosis anguillarum和V.Ordalii的OMP和鞭毛虫蛋白； Edwardsiellosis ictaluri和E.Tarda的鞭毛虫蛋白，OMP蛋白， aroA，和purA；和鱼虱属的表面抗原；和嗜细胞菌属columnari 的结构和调节蛋白；和发疹伤寒等的病原体的结构和调节蛋白。

寄生病原的多肽包括但是不仅仅限于鱼虱属的表面抗原。

过敏原是指可以在易感人上引起过敏或哮喘反应的物质(或 抗原)。过敏原的列表是庞大的，它可以包括花粉、昆虫毒液、 动物头皮屑灰尘、真菌孢子和药物(如盘尼西林)。自然的、动 物的、植物的过敏原的例子包括但是不仅仅限于以下所列的类 型的特殊蛋白：犬科(canis.familiaris)；表皮螨属 (如，Dermatophagoides farinae)；Felis(Felis domesticu)；豕草属 (ambrosia artemiisfolia)；毒麦(如Lolium perenne或Lolium multflorum)；柳杉(Cryptomeria japonica)；链格孢属(Alternaria alternata)；桤木；桤木(Alnus gultinoasa)；桦属(Betula verrucosa)；白栎皮(Quercus alba)；齐墩果(Olea europa)；蒿 (Artemisia vulgaris)；车前属(如plantago lanceolata)；墙草属(如 Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；小蠊属(如.Blattella germanica)；蜂属(如Apis multiflorum)；柏木(如Cupressus sempervirens，Cupressus arizonica以及Cupressus macrocarpa)； 桧属(如Juniperus sabinoides，Juniperus virginiana，Juniperus communis以及Juniperus ashei)；Thuya(如Thuya orientalis)；扁 柏(如Chamaecyparis obtusa)；大蠊属(如Periplaneta americana)； 冰草(如agropyron repens)；黑麦(如Secale cereale)；小麦属(如 Triticum aestivum)；Dactylis(如Dactylis glomerata)；Festuca(如 Festuca elatior)；熟禾(如Poa pratensis或Poa compressa)；燕 麦(如Avena sativa)；茅香(如Holcus lanatus)；Anthoxanthum(如 Anthoxanthum odoratum)；Arrhenatherum(如Arrhenatherum elatius)；Agrostis(如Agrostis alba)；Phleum(如Phleum pratense)； 五色草(如Phalaris arundinacea)；雀稗属(如paspalum notatum)； 高粱(如Sorghum halepensis)；以及Bromus(如Bromus inermis).

抗原可以是被核酸载体编码的抗原，或者不是被核酸载体 编码的抗原。在前面的例子中，核酸载体被给予实验对象，抗 原在体内表达。在后面的例子中，抗原可以直接给予实验对象。 就象这里用的没有被核酸载体编码的抗原是指非核酸的任何种 类的抗原。例如，在本发明中的一些方面，没有被核酸载体编 码的抗原是多肽。多肽抗原中的主要的氨基酸序列的微小修饰 也可以造成比未修饰的相应的多肽的具有更强抗原活性的多 肽。这样的修饰可能是故意的、或位点定向的突变形成、或偶 然的。只要依然有抗原性能，所有的这些修饰产生的多肽在这 里都被包括在内。多肽可以是，例如，滤过性毒菌的多肽。

就象这里用的被充分纯化的名词是指尽可能没有其它蛋 白、油脂、碳水化合物或其它在自然状态下相关的东西的多肽。 本领域的技术人员能够用标准的蛋白纯化技术来纯化滤过性毒 菌或细菌的多肽。这种充分纯化的多肽在非还原的聚丙烯酰胺 凝胶体上常常产生一个主要的波段。那些部分糖基化的多肽或 那些有几种开始密码子的多肽，在非还原的聚丙烯酰胺凝胶体 上产生几个波段，但是，这些将对那个多肽形成与众不同的特 征。滤过性毒菌或细菌的多肽的纯度可以由末位是氨基的氨基 酸序列分析来确定。未被核酸载体编码的诸如多聚糖、小分子、 拟态的等等其它类型的抗原在上面已经描述，并且都包括在本 专利中。

本发明也应用多肽编码抗原的多肽。可以想象，抗原在核 酸分子中给予实验对象，这种核酸分子为抗原以抗原必须在体 内表达的方式编码。这样的在核酸载体中给予实验对象的抗原 是指被核酸载体编码的抗原。对抗原进行编码的核酸与直接决 定在真核细胞中的抗原核酸的表达的基因表达序列相连。基因 表达序列是任何调节核苷酸序列，例如，促进序列或促进-提 高混合，这种核苷酸序列方便了抗原核酸的有效的复制和移动 到与它链接的基因表达。基因表达序列可以，例如，是哺乳动 物或滤过性毒菌的促进者，就象构成或可诱导的促进者。构成 的哺乳动物的促进者包括：但是不局限于对于下列基因的促进 者：次黄嘌呤的磷酸核糖转移酶(HPTR)，腺苷脱氨(基)酶，丙 酮酸盐(或酯)激酶，b-肌动蛋白促进者和其它构成促进者。在真 核细胞中的表现构造性功能的滤过性毒菌的促进者包括，例如， 从以下病毒来的促进者：巨细胞病毒(CMV)、猿病毒(如，SV40)、 腺病毒、人类没有缺陷病毒(HIV)、鲁斯氏肉瘤病毒、巨细胞病 毒、Moloney白血病病毒的长的末端重复和其它逆转录酶病毒 (一种致肿瘤病毒)、疱疹简单病毒的胸(腺嘧啶脱氧核)苷激 酶促进者。其它构成促进者对于本领域的普通技术人员都知道 的。就象本发明中的基因表达序列一样有用的这些促进者可诱 导的促进者。诱导的促进者在诱导试剂存在的情况下被表达。 例如，金属硫因促进者在一定的金属离子存在下被诱导以促进 复制和转移。其它可诱导促进者对于本领域的普通技术人员都 知道的。

一般来讲，基因表达序列应该必须包括，分别与复制和转 移的初始化有关的5’未复制和5’未转移的序列，就象一个TATA 箱子，帽序列、CAAT序列、和象这样的序列。特别是，这样 的5’非转录序列包括一个启动子区域，这个区域包括转录控制 与抗原相连的核酸的启动子序列。基因表达序列选择性地按要 求包括增强子序列或上游活化序列。

抗原核酸是与基因表达序列相连的。象这里用的一样，抗 原核酸序列和基因表达序列被称作相连的，当它们以共价地联 结。在基因表达序列的影响或控制下，这样共价的方式以放置 抗原编码序列的表达或复制和/或转移。如果在5’基因表达序列 中的一个促进者的诱导导致抗原序列的复制，如果两DNA序列 的自然链接没有(1)导致构成改变的突变，(2)与指导抗原序 列复制的启动子区域的能力相冲突，(3)与将转移到蛋白中的 相应的RNA复制的能力相冲突，的情况下，两个DNA序列被 称作相连的。这样一来，如果基因表达序列有能力影响抗原核 酸序列的复制，并且最终的复制被转移到迫切的蛋白或多肽中， 基因表达序列与抗原核酸序列相连。

本发明中的抗原核酸可以单独给予免疫系统或与载体一块 给。在广泛的意义上，载体是任何能够方便抗原核酸迁移到免 疫系统细胞为了抗原可以表达和出现在免疫细胞的表面的介 质。载体一般将核酸传输到免疫细胞，同时核酸的退化相对于 没有载体时退化的程度要小。载体可包括上述的基因表达序列 以提高抗原核酸在免疫细胞中的表达。一般地讲，本发明中有 用的载体包括但是不局限于：质体、嗜菌粒、病毒、其它从滤 过性毒菌或细菌原料中衍生过来的，而这些原料被抗原核酸序 列的入侵或合并所操纵。滤过性毒菌载体是优选类型的载体， 并且包括但是不局限于下列病毒的核酸序列，这些病毒是：逆 转录酶病毒(一种致肿瘤病毒)，如Moloney鼠科动物白血病病 毒，Harvey murine saroma病毒，鼠科动物乳腺瘤病毒，和鲁斯 氏肉瘤病毒；腺病毒，腺有关的病毒；SV-40类型病毒；Polyoma 病毒；Epstein-Barr病毒；乳突淋瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒； 脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒如逆转录酶病毒(一种致肿瘤病 毒)。可以包括其它没有命名但是在本领域已知的载体。

优选的滤过性毒菌的载体建立在非细胞病性真核病毒，在 这种病毒中非基本的基因被有兴趣的基因所取代。非细胞病性 病毒包括逆转录酶病毒，逆转录酶病毒的生命圈中包括滤过性 毒菌RNA的基因组向DNA的逆转录，随之前病毒的整个进入 寄主的细胞DNA中。逆转录酶病毒已经被人类基因治疗实验认 可。许多有用的是那些缺陷复制逆转录酶病毒(即能够指导所 需蛋白的合成，但是不能制造感染性微粒)。这些经过基因改变 的逆转录酶病毒表达载体对于体内基因的高效传递有一般意义 上的用途。标准的生产具有缺陷复制功能的逆转录酶病毒(包 括包括外生的基因物质进入质体的合并步骤，与质体相连的包 裹细胞的转染，被包裹细胞链生成的再结合逆转录酶病毒的生 产，组织介质中滤过性毒菌的收集，用滤过性毒菌颗粒感染目 标细胞)的协议由Kriegler，M.，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual W.H.Freeman C.O.，New york(1990)and Mury， E.J.Methods in Molecular Biology，vol.7，Humana Press，Inc.， Cliffton，New Jersey(1991).

对于一定的应用优选的病毒是与腺体有关的病毒，它是一 种双螺旋的DNA病毒。这种与腺体有关的病毒能够被启动变成 缺陷复制性，并且能够感染广泛的范围内的各种类型和种类的 细胞。更进一步讲，它有诸如以下的这些优点：热和液体溶解 的稳定性；在不同血统的细胞(包括造血细胞)里的高的传输频 率；缺少超级感染阻止剂这样允许多种传输类型。报道说，与 腺体有关的病毒可以以特定站点的方式整合到人类细胞DNA 中，因此，减小了入侵变异发生和逆转录酶病毒感染的注入基 因表达性质的多样性的机率。补充一点：在没有选择压力下， 在组织中对于超过100名路人野性的与腺体有关的病毒感染的 研究，表明与腺体有关的病毒基因组整合是相对稳定的。与腺 体有关的病毒也以染色体外的方式起作用。

其它的载体包括质体载体。质体载体在本领域已经被广泛 地描述，并且已经被本领域的技术人员所熟知。参看例如： Sambrook et al.，molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.在过去的几 年中，发现质体载体在将基因给予细胞in vivo时有特别的优点， 因为它们在寄主的基因组或整合到寄主的基因中时不能够复 制。但是。含有与寄主细胞相兼容的促进器的这些质体能够从 在质体中表码的基因中表达一个缩氨酸。一些常用的质体包括： pBR322，pUC18，pUC19，pRC/CMV SV40，和pBlueScript。其它 质体对于本领域的普通技术人员都是熟知的。另外，质体可以 通过限制酶和捆绑反应一去掉或加上特定的DNA段的方式设计 和定做。

最近，发现：携带质体的基因能够用细菌的方式给予到免 疫系统。细胞的修饰形式例如沙门氏菌属Salmonella能够与质 体一块转染，并且可以当作给予介质。这种细菌给予型介质可 以通过口服或其它的给予方式给予寄主实验对象。细菌可能通 过内脏的屏障将质体分发到免疫细胞，如B细胞，枝状细胞。 免疫保护的高水平用这种方式已经建立。对于本发明中的利用 抗原、免疫刺激性核酸和/或其它治疗药物的系统分发，这种分 发方式是有用的。

这样一来，免疫刺激性核酸作为疫苗的辅助剂是有用的。 以前已经建立：CpG寡核苷酸是非常好的疫苗的辅助剂。但是， 人们也证明：在老鼠中是超强的疫苗辅助剂的CpG ODN在非啮 齿类动物中却不是优选的疫苗辅助剂。为了确定癌人类和其它 非啮齿类动物中用作疫苗的辅助剂的最佳的免疫刺激性核酸， 体内扫描了许多用于这种目的的核酸。几种体外化验在老鼠中 评价以预测它们在老鼠体内的辅助活性。在这个研究过程中， 用于预测体内效果的体外实验被确定。相当惊讶地发现：B细 胞和NK细胞的活性特别好地与免疫刺激性核酸的对抗原的体 内免疫反应的提高能力有关。

对于体内疫苗辅助活性的B细胞的活性的好的预测值最大 可能与B细胞在一个特定的免疫反应建立中起的中心作用有关 系。B细胞的多克隆复制(由免疫刺激性核酸诱发的)最近了 抗原特定的B细胞或T助细胞匹配的可能性。更深入的讲，在 多克隆的增大的B细胞上的共刺激分子CD86的增强表达活化 了特定的T助细胞。对于免疫刺激性核酸提高了CD40L表达的 活化的T助细胞的活化B细胞能力的一个反应，B细胞也提高 了它们CD40表达。在B细胞上的提高了的ICAM-1合成方便 了细胞与细胞中间的联系。这样一来，多克隆性的B细胞的活 化地位在一个抗体反应的初始阶段起着至关重要的作用。

但是，NK细胞活性对于特定的抗体建立的作用是令人吃惊 的。NK细胞是天生免疫系统的一部分，这样一来，NK细胞成 为抵抗病原的第一道屏障。最有可能的是，在活化基础上由NK 细胞产生的细胞因子模式与特定的免疫反应的初始阶段很有关 系。这样一来，本发明的一个方面涉及到确定辅助剂的方法， 即检测NK细胞的活性。NK细胞的活性化验可以如以下例子中 描述的那样进行或者用其它已知的NK细胞活性化验。但是， 优选的是，应用如PBMC混合细胞群，因为NK细胞活性是非 直接的效果这个可能性。优选的是，化验对于确定在人类和其 它非啮齿类动物中作为辅助剂有用的免疫刺激性核酸是有用 的。

细胞因子引诱也被确认为体内辅助活性的重要的指示剂。 因为人类比老鼠主要的单核细胞的内毒素敏感性高两个数量 级，但是，为了避免在人类系统里用于测定的免疫刺激性核酸 的内毒素污染仍需小心(Hartmann G.，and Krieg A.M.1999.Gene Therapy 6：893)。因为TNF-α、IL-6和IL-12是由人类单核细胞 对于甚至低量的内毒素产生反应而产生的，对于in vivo扫描化 验中的高生产量，它们的值是有限的。另一方面，人类B细胞 和NK细胞只显示由内毒素活化的小的活性，因此它们在测定 免疫刺激性核酸活性中更加有用。

在NK或B细胞中细胞功能的刺激(即细胞溶解酶的活性， 复制能力)需要比在它们表面(CD69，CD86)活化核酸更强的 免疫刺激性核酸。对于两种类型的细胞，细胞表面活化者的用 途表明：与功能性化验相比有更高的非特定可归于硫代磷酸酯 骨架的背景。为了在有相似活性的免疫刺激性核酸中得到优化 的识别力，表面制造者的高敏感性要求低的免疫刺激性核酸浓 度。这样一来，表面制造者的使用使具有弱活性的免疫刺激性 核酸的对比成为可能。，但是，功能性化验对于比较具有高活性 的免疫刺激性核酸比较是优选的。值得一提的是：对于刺激B 细胞和NK细胞，最优的免疫刺激性核酸浓度不同。虽然0.6μ g/mlODN已经是刺激B细胞最大的量，最佳的NK细胞活化需 要6μg/ml的ODN。B细胞活化和NK细胞功能性活性都在新 鲜隔离的PBMC中测量过。以前发现，高度纯化的人类基本B 细胞可以被CpGDNA活化。CpG DNA在NK细胞上的直接效 果的存在比较不明显，在PBMC中由其它细胞类型调节的第二 种机理可能是NK细胞的CpG诱导的功能性活性的原因。本发 明中的核酸可以与抗微生物介质一起给予实验对象。这里使用 的这种抗微生物介质是指自然存在或合成的化合物，它可以杀 死或阻止传染性微生物。根据本发明，这种有用的抗微生物的 介质依赖于实验对象被感染的或易感染的微生物的类型。抗微 生物的介质包括但是不仅仅限于：抗细菌介质、抗滤过性毒菌 介质、抗真菌介质和抗寄生介质。诸如象“抗感染介质”、“抗 细菌介质”、“抗滤过性毒菌介质”、“抗真菌介质”、“抗寄生 介质”、和“寄生杀虫剂”的短语对于本领域的普通技术人员来 说有着确定的意思，这些短语在标准的医学课本中有定义。简 要地讲，抗细菌的介质杀死或阻止细菌，并且包括抗生素和其 它有相似功能的合成或自然的化合物。象微生物一样的由细胞 作为第二代谢物而产生的抗生素有低的分子量。一般讲，抗生 素影响一种或多种细菌功能或结构，这些抗生素对于微生物来 说是特定的并且在寄主细胞中不存在。抗滤过性毒菌介质可以 从自然物质中分离出或合成出；抗滤过性毒菌介质对于杀死或 抑制病毒是有用的。抗真菌介质被用于治疗表面真菌感染和偶 尔和初步的系统真菌感染。抗寄生介质杀死或抑制寄生虫。

抗寄生介质(也指对于人类有用的寄生杀虫剂)的例子包 括但是不仅仅局限于：丙巯咪唑(albendazole)，两性霉素B， bonznidazole，硫氯酚(bithionol)，盐酸氯喹(疟疾的特效药之 一种)，氯喹磷酸盐，氯洁霉素，脱氢吐根碱，乙胺嗪(抗丝虫药)， 二氯散糠基乙酸酯，eflornithine，痢特灵、糖(肾上腺)皮质激素、 halofantrine，碘代对苯二酚，伊维菌素，甲苯咪唑，mefloquine， meglumine锑酸盐，美拉胂醇，metrifonate，灭滴灵，氯硝柳 胺，ntfurtinmox，oxamniquine，巴龙霉素、戊双脒羟乙基磺酸盐， 对二氮己环，吡喹酮，伯氨喹磷酸盐，氯胍，双羟水杨酸噻嘧啶， pyrimethanmine-磺胺药物，pyrimethanmine-sulfadoxina， quinacrime HCl，quine sulfate，奎那定-葡萄糖酸盐，螺旋酶素， stibogluconate钠(钠锑葡萄糖酸盐)，苏拉明(一种抗锥虫及丝虫 药)，四环素，强力酶素，噻苯达唑，磺甲硝咪唑，trimethroprim-磺 胺甲卓唑，以及锥虫胂胺，这些之中，可以单独使用或与其它 混合使用。

在非人类实验对象中使用的寄生杀虫剂包括：对二氮己环， 乙胺嗪(抗丝虫药)，t噻苯达唑，苯硫，丙硫咪唑，磺唑氨酯，奥 苯达唑，苯硫氨酯，，左旋驱虫净(广谱驱肠虫药及免疫增强药)， 噻嘧啶酒石酸盐，双羟水杨酸噻嘧啶，敌敌畏(一种杀虫剂)，伊 维菌素，doramectic，米尔倍霉素肟，iprinomectin，moxidectin，N- 叔丁基氯，甲苯，匀霉素B thiacetarsemide钠，melarsomine，吡 喹酮，epsiprantel，苯并咪唑如苯硫，丙硫咪唑，磺唑氨酯， clorsulon，丙硫咪唑，氨丙磷；癸氧喹酯，拉沙里菌素，莫能菌酸 磺胺二甲氧基嘧啶；磺胺甲嘧啶，磺胺喹恶啉，灭滴灵。

在马中使用的寄生杀虫剂包括：甲苯咪唑，磺唑氨酯，硫苯 胺酯，噻嘧啶，敌敌畏，敌百虫(用作杀虫剂或驱虫剂)，伊维菌素， 对二氮己环；对于S.Westeri：伊维菌素，benzimiddazoles例如噻 苯咪唑，坎苯达唑，奥苯达唑和苯硫。在狗中有用的寄生杀虫 剂包括：米尔倍霉素肟，伊维菌素，双羟水杨酸噻嘧啶  以及伊 维菌素和噻嘧啶的混合使用。在猪中寄生杀虫剂的使用包括以 下的使用：左旋驱虫净(广谱驱肠虫药及免疫增强药)，对二氮己 环，噻嘧啶，噻苯咪唑，敌敌畏和苯硫。在绵羊和山羊中使用的 驱虫剂包括：左旋驱虫净(广谱驱肠虫药及免疫增强药)或伊维 菌素。Caparsolate在治疗猫中的D.Immitis(心虫)显示了一定的 有效性。

抗细菌介质杀死或抑制细菌功能生长。一大类抗细菌的介 质是抗生素。作为能够有效地杀死或抑制很广范围内的细菌的 抗生素被叫做广谱抗生素。其它类型的抗生素主要对于革兰氏 阳性或革兰氏阴性的细菌有效。这种类型的抗生素叫做窄谱抗 生素。只对一个有机物或一种疾病有效但是对其它类型的细菌 无效的抗生素叫做有限谱抗生素。抗生物介质有时是在它们的 活动的初级形式来划分的。一般来讲，抗细菌介质是细胞壁合 成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白合成抑制剂、核酸合成或功能 抑制剂、和竞争抑制剂。

在本发明中有用的抗细菌药品包括但是不仅仅局限于：自 然的盘尼西林、半合成盘尼西林、棒酸、头孢菌素、杆菌肽、 氨卡青霉素、羧苄青霉素、苯甲异唑青霉素、苯咪唑青霉素、 磺唑氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、甲氧苯青霉素、双氯青霉素、 新青霉素III(萘夫西林)、头孢菌素(先锋霉素)、吡啶硫乙酰头孢 菌素、头孢氨苄，头孢羟苄唑、c氯氨苄头孢菌素、先锋霉素V、 cefuroxine，甲氧噻吩头胞菌素，头孢噻肟，头孢磺啶，cefetamet， cefixime，ceftraxone，头孢哌酮，ceftazidine，moxalastam， carbapenems，imipenems，单环内酰胺，euztreonam，万古霉素， 多粘菌素，两性霉素B，制霉菌素(真菌素)，咪唑，克霉唑，双 氯苯咪唑，酮康唑，itraconazole，fluconazole，利福平，乙按9丁 醇，四环素，氯霉素，大环内酯，氨基苷，链霉素，卡那霉素， 托普霉素，氨基羟丁基卡那霉素(抗菌素BBK8)，庆大霉素， 四环素，二甲胺四环素，强力霉素，金霉素，红霉素，roxithromycin， clarithromycin，竹桃霉素，azithromycin，氯霉素，喹诺酮，co- trimoxazole，n氟哌酸，ciprofloxacin，enoxacin，萘啶酮诺， temafloxacin，氨磺酰，磺胺二甲基异恶唑，和三甲氧苄二氨嘧 啶，二乙酰氨苯砜；Acetosulfone钠；Alamecin；阿来西定；阿 姆地诺西林；阿姆地诺西林Pivoxil；Amicycline；Amifloxacin； Amifloxacin Mesylate；丁胺卡那霉素；硫酸丁胺卡那霉素；氨基 水杨酸；氨基水杨酸钠；阿莫西林；双霉素；氨必西林；氨必西 林钠；阿帕西林钠；阿泊拉霉素；天冬菌素；Astromicin Sulfate； 卑霉素；阿伏帕星；Azithromycin；苯咪唑青霉素；苯咪唑青霉素 钠；盐酸氨苄青霉素碳酯；杆菌肽；杆菌肽亚甲基Disalicylate； 杆菌肽锌；班贝霉素；Benzoylpas钙；Berythromycin；Betamicin Sulfate；Biapenem；Biniramycin；盐酸苯柳胺酯；Bispyrithione Magsulfex；Butikacin；硫酸丁酰苷菌素；硫酸卷曲霉素；卡巴多 司；羧苄青霉素二钠(Carbenicillin Disodium)；羧苄青霉素 Indanyl钠；羧苄青霉素苯基钠；羧苄青霉素钾；Carumonam钠； 氨孢克洛；头孢羟氨苄；头孢羟苄唑；头孢羟苄唑Nafate；头孢 羟苄唑钠；Cefaparole；头孢曲嗪；Cefazaflur钠；头孢唑啉；头孢 唑啉钠；Cefbuperazone；Cefidinir；Cefepime；Cefepime；盐酸 Cefepime；Cefetecol；Cefixime；盐酸头孢甲肟；头孢美唑；头孢美 唑钠；头孢尼西一钠；头孢尼西钠；头孢哌酮钠；头孢雷特；头 孢噻肟钠；头孢替坦；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安；头孢西丁； 头孢西丁钠；Cefpimizole钠；Ceefpiramide；Cefpiramide钠； Cefpirome Sulfate；头孢泊肟Proxetil；Cefprozil；Cefroxadine；头 孢磺啶钠；头孢噻甲羧肟；Ceftibuten；头孢唑肟钠；头孢曲松钠； 头孢呋辛；头孢呋辛Axetil；头孢呋辛Pivoxetil；头孢呋辛钠；氰 乙酰头孢菌素钠；头孢氨苄；盐酸头孢氨苄；头孢甘氨酸；头孢 利定；头孢金素钠；Cephpirin钠；头孢拉定；盐酸Cetocycline； Cetophenicol；氯霉素；软脂酸氯霉素；氯霉素泛酸复合物；氯 霉素琥珀酸钠；氯己定Phosphanilate；氯二甲苯酚；酸式硫酸氯 四环素；盐酸氯四环素；西诺沙星；Ciprofloxacin；盐酸 Ciprofloxacin；Cirolemycin；Clarithromycin；盐酸Clinafloxcin；氯 林肯霉素；盐酸氯林肯霉素；软脂酸盐酸氯林肯霉素；磷酸氯 林肯霉素；氯法齐明；氯唑西林苄星青霉素G；氯唑青霉素钠； Cloxyquin；Colistimethate钠；粘菌素；香豆霉素；香豆霉素钠； 环青霉素；环丝氨酸；Dalfopristin；达普宋；Daptomycin；脱甲金 霉素；盐酸脱甲金霉素；Demecycline；Denofungin；二氨藜芦啶； 双氯青霉素；双氯青霉素钠；硫酸双氢链霉素；Dipyrithione； Dirithromycin；强力霉素；强力霉素钙；强力霉素Fosfatex；强 力霉素Hyclate；强力霉素钠；Enoxacin；环烯氨苄青霉素；盐酸 表四环素；红霉素；红霉素Acistrate；红霉素Estolate；乙基琥珀 酸红霉素；红霉素Gluceptate；红霉素Lactobionate；丙酸红霉素； 硬脂酸红霉素；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；Fleroxacin；氟氯西 林；Fludalanine；氟甲喹；磷霉素；磷霉素氨丁三醇；Fumoxicillin； Furazolium氯化物；酒石酸Furazolium；Fusidate钠；梭链孢酸； 硫酸庆大霉素；Gloximonam；短杆菌肽；碘氯苯炔醚；缩酮氨 苄青霉素；缩酮氨苄青霉素钾；双己咪唑；Ibafloxacin；Imipenem； 异康唑；Isepamicin；异烟肼；Josamycin；硫酸卡那霉素；吉他霉 素；Levofuraltadone；Levopropylcillin钾；Lexithromycin；洁霉素； 盐酸洁霉素；Lomefloxacin；盐酸Lomefloxacin；马来酸 Lomefloxacin；Loracarbdf；甲磺灭脓；甲氯环素；磺基水杨酸甲 氯环素；磷酸Megalomicin钾；Mequidox；Meropenem；甲烯土霉 素；盐酸甲烯土霉素；环六亚甲基四胺；Methenamine Hippurte； 杏仁酸环六亚甲基四胺；Methicilin钠；Metioprim；盐酸甲硝哒 唑；磷酸甲硝哒唑；磺唑氨苄青霉素；磺唑氨苄青霉素钠；米诺 环素；盐酸米诺环素；盐酸Mirincamycin；莫能星酸；莫能星酸 钠；乙氧萘(胺)青霉素钠；Nalidixate钠；Nalidixate Acid；那他霉 素；暗霉素；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；十一碳烯酸新霉素； 硫酸乙基烯梭霉素；中性霉素；呋喃咪酮；硝呋地腙；Nifurated； Nifuratrone；Nifurdazil；Nifurimide；硝呋吡醇；Nifurquinazol； Nifurthiazole；Nitrocycline；硝基呋喃妥英；二硝苯甲酰Nitromide； Norfloxacin；新生霉素钠；Ofloxacin；Ormetoprim；苯甲异  唑青 霉素钠；Oximonam；Oximonam钠；Oxolinic Acid；土霉素；土霉 素钙；盐酸土霉素；Paldimycin；Parachlorophenol；Paulomycin； Pefloxacin；Pefloxacin Mesylate；青霉素G双脂；青霉素G苯星 青霉素G；青霉素G钾；青霉素G普鲁卡因；青霉素G钠；青 霉素V；青霉素V苯星青霉素G；青霉素V Hydrabamine；青霉素 V钾；Pentizidone钠；Phenyl Aminosalicylate；哌拉西林钠； Pirbenicillin钠；Piridicillin钠；Pirlimycin Hydrochloride；盐酸匹 氨西林；双羟水杨酸匹氨西林；匹氨西林Probenate；硫酸多粘菌 素B；甲基丝裂霉素；Propikacin；吡嗪酰胺；吡硫嗡锌；乙酸 Quindecamine；Quinupristin；Racephenicol；Ramoplanin； Ranimycin；雷洛霉素；Repromicin；Rifabutin；Rifametane； Rifamexil；利福酰胺；利福平；Rifapentine；Rifaximin； Rolitetracycline；Rolitetracycline Nitrate；罗沙米星；丁酸罗沙米 星；丙酸罗沙米星；磷酸罗沙米星钠；硬脂酸罗沙米星；罗索沙 星；罗沙胂酸；Roxithromycin；山环素；Sanfetrinem钠； Sarmoxicillin；Sarpicillin；Scopafungin；紫苏霉素；硫酸紫苏霉素； Sparfloxacin；盐酸壮观霉素；螺旋霉素；盐酸司他霉素； Steffimycin；硫酸链霉素；链异烟肼；磺胺苯；黄胺苯酰；磺乙酰 胺；Sufacetamide钠；磺胺西汀；磺胺嘧啶；磺胺嘧啶钠；磺胺多 辛；磺胺林；磺胺甲嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺甲噻唑；磺胺甲卓 唑；磺胺间甲氧嘧啶；蝗胺卓唑；磺胺酸锌；磺胺硝苯；水杨酸 偶氮磺胺吡啶；磺胺异噻唑；磺胺噻唑；磺胺吡唑；磺胺异卓唑； 乙酰基磺胺异卓唑；磺胺异卓唑Diolamine；Sulfomyxin； Sulopenem；Sultamicillin；Suncillin钠；盐酸酞氨西林； Teicoplanin；盐酸Temafloxacin；Temocillin；四环素；盐酸四环素； 磷酸四环素复合物；四氧苄嘧啶；甲砜霉素；Thiphencillin Potassium；羟基噻吩青霉素甲苯基钠；羟基噻吩青霉素二钠；羟 基噻吩青霉素一钠；Ticlatone；Tiodonium Chloride；妥布霉素；妥 硫酸布霉素；Tosufloxacin；硫酸甲氧苄啶；Trisulfapyrimidines； 三乙桃霉素；Trospectomycin Sulfate；短杆霉素；万古霉素；盐酸 万古霉素；Virginiamycin；和Zorbamycin。

抗滤过性毒菌的药品是能够通过在细胞中病毒或病毒的复 制的方式达到预防细胞的感染的化合物。抗滤过性毒菌的药品 少于抗细菌药品是因为滤过性毒菌的复制与寄主细胞的DNA复 制密切相关，非特定的抗滤过性毒菌的药品通常是对寄主有害 的。能够被抗滤过性毒菌的药品阻碍或抑制的滤过性毒菌的感 染过程中有几个阶段。这些阶段包括：病毒在寄主细胞上的附 着(免疫球蛋白或结合缩氨酸)；病毒脱壳(如三环癸胺)；滤 过性毒菌的信使RNA的合成或传递(如干扰素)；滤过性毒菌 的RNA或DNA的复制(如核苷类似物)；新病毒蛋白的成熟(如 蛋白酶抑制剂)；和发芽和病毒的释放。

核苷类似物是合成的化合物，这种合成的化合物与核苷相 似，但是有不完全或异常的去氧核醣或核糖基团。一旦在细胞 中核苷类似物，它们就被磷酸化，产生三磷酸盐形式；这种三 磷酸盐形式的核苷类似物与能够结合到滤过性毒菌DNA或RNA 的正常的核苷相竞争。一旦核苷类似物的三磷酸盐形式结合到 正在生长的核酸链中，它导致与滤过性毒菌的聚合酶的无法逆 转的结合，这样一来核酸链就终止了。核苷类似物包括，但是 不仅仅局限于：无糖环鸟苷(用于疱疹简单病毒和水痘-带状疹子 病毒的治疗)，gancyclobir(对治疗形成巨细胞的病毒有用)，碘 苷，  病毒唑(抗病毒药)(对治疗呼吸  syncitial病毒)， dideoxyinosine，dideoxycytidine，和zidovudine(azidothymidine)。

干扰素是由感染病毒的细胞或免疫细胞分泌的细胞液。干 扰素是通过与感染细胞相邻的细胞上的特定的受体的结合来起 作用的，导致细胞中的改变以达到保护细胞免受病毒感染的目 的。α和β-干扰素作为再结合形式是可得到的，并且已经用 于治疗慢性的B和C型肝炎感染。在对于抗滤过性毒菌治疗有 效的剂量下，干扰素有诸如发烧、不舒服和体重的减少等严重 的负作用。

免疫球蛋白治疗是用于滤过性毒菌感染预防的。免疫球蛋 白对于滤过性毒菌感染的治疗与细菌感染不同，因为不是抗原 -特定性，免疫球蛋白治疗是通过与细胞外的病毒结合，达到 防止它们附着和进入易被滤过性毒菌感染的细胞的目的。当抗 体在寄主中出现的时候，这种治疗寄主对于滤过性毒菌感染是 有用的。一般来讲，有两种类型的免疫球蛋白治疗，常规的免 疫球蛋白治疗和超级免疫球蛋白治疗。常规的免疫球蛋白治疗 用一种抗体产物，这种抗体是由正常的血液捐献者的免疫血清 制备并贮存的。这种储存的产物含有对于大量的人类病毒(如 A型肝炎，parvovirus，肠道病毒(特别是在婴儿中)的低浓度的 抗体。超级免疫球蛋白治疗用由对于特定病毒有高浓度的抗体 的人的免疫血清中制备的抗体。这些抗体用于抵抗特定的病毒。 超级免疫球蛋白的例子包括带状疹子免疫蛋白(对于在儿童和 婴儿中水痘的预防是有用的)，人类狂犬病免疫球蛋白(被疯狗 咬过的人的事后预防是有用的)，B型肝炎免疫球蛋白(在B型 肝炎病毒特别是在接触病毒的人中预防是有用的)，和RSV免 疫球蛋白(在respiratory syncitial病毒感染中是有用的)。

其它类型的免疫球蛋白治疗是主动免疫。这就包括抗体或 抗体片断给予到滤过性毒菌的蛋白质表面。对于B型肝炎的主 动免疫有两种类型的疫苗可以得到：它们包括血清中提取的B 型肝炎抗体和再结合B型肝炎抗体。它们都是由HbsA制备的。 对于有B型肝炎病毒感染的高危险的人群(如健康治疗工作人 员，慢性携带者的性伙伴，和儿童)要给与三倍药量的抗体。

这样一来，在本专利中有用的抗滤过性毒菌的药品包括但 是不仅仅局限于：免疫球蛋白、三环癸胺(抗病毒药)、干扰剂、 核苷类似物、和蛋白酶抑制剂。抗滤过性毒菌的特定的例子包 括但是不仅仅局限于：Acemannan；无糖环鸟苷；无糖环鸟苷钠； Adefovir；Alovudine；Alvircept Sudotox；盐酸三环癸胺；Aranotin； Arildone；Atevirdine Mesylate；Avirdine；Cidofovir；Cipamfylline； 盐酸阿糖孢苷；Delavirdine Mesylate；Desciclovir；Didanosine； Disoxaril；Edoxudine；Enviradene；恩韦肟；Famciclovir；Famotine Hydrochloride；Fiacitabine；Fialuridine；Fosarilate；Foscanet钠； Fosfonet钠；Ganciclovir；Ganciclovir钠；碘苷；乙氧丁酮醛； Lamivudine；Lobucavir；Memotine Hydrochloride；甲红硫脲； Nevirapine；Penciclovir；Pirodavir；三氮唑核苷；盐酸金刚乙胺； Saquinavir Mesylate；Somantadine Hydrochloride；Sorivudine； Statolon；Stavudine；盐酸替洛隆；三氟胸苷；Valacyclovir Hydrochloride；阿糖胸苷；磷酸阿糖胸苷；磷酸阿糖胸苷钠； Viroxime；Zalcitabine；Zidovudine；和Zinviroxime。

抗真菌药品对于治疗和预防感染性真菌是有用的。抗真菌 药品有时是按它们的作用机理来分类的。一些抗真菌药品是通 过抑制葡萄糖合酶来达到作为细胞壁抑制剂的作用的。这些包 括但是不仅仅局限于：basiungin/ECG。其它抗真菌药品通过动 摇膜整体的方法行使作用。这些包括但是不仅仅局限于： immidazoles，例如：克霉唑，sertaconzole，fluconazole，itraconazole， 酮康唑和voriconacole；和FK463，两性酶素B，BAY 38-9502， MK 991，pradimicin，UK292，butenafine，和terbinafine。其它抗 真菌药品通过破坏壳质(例如壳质合酶)，或免疫抑制作用(501 霜)来作用的。在表B中列出一些商业中可获得的药品的例子。

                                  表B 公司 商品名 普通名 指示 作用机理 PHARMACI A&UPJOHN PNU 196443 PNU 196443 抗真菌 N/k Lilly LY303366 Bsiungin/E CB 真菌感染 抗真菌/细胞壁 抑制剂，葡萄糖 合酶抑制剂 Bayer Canesten Clotrimazole 真菌感染 膜整体动摇剂 (destabilizer) Fujisawa FK463 FK463 真菌感染 膜整体动摇剂 Mylan Sertaconzao le Sertaconzol e 真菌感染 膜整体动摇剂 Genezyme Chitinase Chitinase 真菌感染， 系统 壳质破坏 Liposome Abelcet Amphoteric inB， Liposomal 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Seque Amphotec Amphoteric inB， Liposomal 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Bayer BAY38- 9502 BAY38- 9502 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Pfizer Diffucan Fluconazole 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Johnson& Johnson Sporanox Itraconzole 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Sepracor Itraconzole( 2R，4S) Itraconzole( 2R，4S) 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Johnson&Joh nson Nizoral Ketoconazo le 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂 Johnson&Joh nson Monistat Miconazole 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂  Merck  MK991  MK991 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂  Bristol  Myers Sq’b  Pradimicin  Pradimicin 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂  Pfizer  UK-  292,663  UK-  292,663 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂  Pfizer  Voriconazol  e  Voriconazol  e 真菌感染， 系统 膜整体动摇剂  Mylan  501 Cream  501 Cream 发炎性真 菌情况 免疫抑制作用  Mylan  Mentax  Butenafine 指菌 膜整体动摇剂  Schering  Plough  Anti Fungal  Anti Fungal 偶尔感染 膜整体动摇剂  Alza  Mycelex  Troche  Clotrimazol  e 鹅口疮 膜整体稳定剂  Novartis  Lamisil  Terbinafine 系统真菌 感染，甲 真菌病 膜整体动摇剂

这样一来，在本发明中有用的抗真菌药品包括但是不仅仅 局限于：咪唑，FK463，两性霉素B，BAY38-9502，MK991， pradimicin，UK292，butenafine，壳质合酶，501霜，丫苯二酚； Ambruticin；Amorolfine，两性霉素B；Azaconzole；重氮丝氨酸； Basifungin；Bifonazole；盐酸苯柳氨酯；Bispyrithione Magsulfex； Butoconazole Nitrate；十一碳烯酸酸钙；杀念菌素；Carbol- Fuchsin；Cholrdantoin；环吡司；环吡司Olamine；Cilofungin； Cisconazole；克霉唑；Cuprimyxin；Denofungin；Dipyrithione； Doconazole；益康唑；硝酸益康唑；恩康唑；Ethonam Nitrate； Fenticonazole Nitrate；菲律宾菌素；Fluconazole；氟胞嘧啶；真菌 霉素；灰黄霉素；哈霉素；异康唑；Itraconazole；卡拉真菌素；酮 康唑；Lomogungin；利地霉素；Mepartricin；咪康唑；硝酸咪康唑； 莫能星酸；莫能星酸钠；Naftifine Hydrochloride；十一碳烯酸新 霉素；呋喃巯唑酮；Nifurmerone；Nitralamine Hydrochloride；制真 菌素；Octanoic Acid；Orconazole Nitrate；Oxiconazole Nitrate； Oxifungin Hydrochloride；Parconazole Hydrochloride；抑念菌素； 碘化钾；Proclonol；吡硫嗡锌；硝吡咯菌素；Rutamycin； Sanguinarium Chloride；Saperconazole；Scopafungin；Selenium Sulfide；Sinefungin；硝酸硫康唑；Terbinafine；Terconazole；福美 双；Ticlatone；噻康唑；甲苯硫萘酯；苯硫茚酯；托萘酯；甘油三 乙酸酯；Triafungin；十一碳烯酸；Viridofulvin；十一碳烯酸锌和 Zinoconazole Hydrochloride。

免疫刺激性核酸可以与如辅助剂等其它治疗药品组合使用 以提高免疫反应。免疫刺激性核酸和其它治疗药品可以同时或 连续给予。当其它治疗药品是同时给予时，它们可以在同一个 或独立的配方，但是是在同时给予的。当其它治疗药品和免疫 刺激性核酸的给予是分开的，其它治疗药品与免疫刺激性核酸 是一个接一个地给予。给予这些药品的间隔可以是几分钟或更 长的时间。其它治疗药品包括但是不仅仅局限于：辅助剂、细 胞液、抗体、抗原等等。

免疫刺激性核酸作为辅助剂来诱导系统免疫反应是有用 的。因此，任何免疫刺激性核酸可以给予接触抗原的实验对象 以产生更强的对抗原的免疫反应。

除了免疫刺激性核酸，本发明还包括非核酸辅助剂的给予。 非核酸辅助剂是除了免疫刺激性核酸外的这里描述的其它分子 或化合物，这些物质可以刺激体液的和/或细胞的免疫反应。非 核酸辅助剂包括，例如可以产生depo效果的辅助剂、免疫刺激 辅助剂、和可以产生depo效果和刺激免疫系统的辅助剂。

这里用的产生depo效果的辅助剂是可以导致抗原在身体内 的缓慢地扩散，这样一来延长了免疫细胞对抗原的接触时间。 这种辅助剂包括但是不仅仅局限于：矾(例如氢氧化铝、磷酸 铝)；或基于乳剂的配方，包括矿物油、非矿物油、水油乳剂或 油水油乳剂、油水乳剂例如Seppic ISA的Montanide辅助剂(例 如，Montanide ISA 720，AirLiquide，Paris，France)；MF-59(由 Span85he Tween80稳定的三十碳六烯-水乳剂；Chiron公司， Emeryville，CA；和PROVAX(含有稳定溶剂和胶态离子形态的 药品的油水乳剂；DEC，Pharmaceuticals公司，San Diego，CA)。

免疫刺激辅助剂的可以导致免疫系统细胞活化的辅助剂。 例如，它导致免疫细胞产生或分泌细胞液。这类辅助剂包括但 是不仅仅局限于从Q.saponaria的树皮中纯化得到的皂角苷，如 QS21(用HPLC分离醣脂类洗提出的第21个峰；Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worcester，MA)；多双(羧酸苯酚) phosphazene(PCPP高聚物；Virus Research Institute，USA)；脂多 糖的衍生物：如单磷酰基脂质A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamailton，MT)，胞壁酰缩二氨酸(MDP；Ribi)和苏 氨酰-胞壁酰缩二氨酸(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质有关的葡 (萄)糖胺二醣类；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)；和 Leishmania延长因子)一种纯化的Leishmania蛋白；Corporation， Seattle，WA)。

产生depo效果和刺激免疫系统的辅助剂是有上述的功能的 化合物。这类辅助剂包括但是不仅仅局限于：ISCOMS(包含混 合皂角苷和脂质的免疫刺激复合物，这种复合物形成病毒大小 的有可容纳抗原的孔的颗粒；CSL，Melbourne，Australia)；SB- AS2(SmithKline Beecham辅助剂2号系统，这个体系是油水乳 剂，乳剂包含MPL和QS21：SmithKline Beecham Biologicals[SBB]， Rixensart，Belgium)；SB-AS4(SmithKline Beecham辅助剂4号系 统包含矾和MPL；SBB，Belgium)；形成胶态离子的非离子块共 聚物，例如CRL1005(含有侧面与聚乙烯链相连的狂犬病的聚 丙烯线形链；Vaxcel，Inc.，Norcross，GA)；和Syntex辅助剂 Formulation(SAF，含有Tween80和非离子块高聚物的油水乳 剂；Syntex Chemicals，Inc.，Boulder，CO)。

免疫刺激性核酸作为黏膜辅助剂也是有用的。先前已经发 现：系统免疫和黏膜免疫都能够被CpG核酸的黏膜给予所诱导。 在响应CpG核酸的系统免疫不仅包括体液的反应而且包括细胞 调节的反应，这些反应是对于那些当单独给与黏膜时并不能够 引起系统免疫的抗原起的反应。更进一步，CpG核酸和霍乱毒 素(CT，一种引起象Th-2反应的黏膜辅助剂)引起CTL。这是奇 怪的，因为与系统免疫有关，象Th-2的抗体一般是与CTL缺 乏有关的(Schirmbeck et al.1995)。基于这里所列的结果，可以 预测：免疫刺激性核酸将以相似的方式起作用。

另外，免疫刺激性核酸在局部(如肺)和远的(较低的消 化地方)的黏膜地方引起黏膜反应。IgA抗体的显著的量是由免 疫刺激性核酸在远处的黏膜地方引起的。一般来讲，CT被认为 是高效的黏膜辅助剂。就象先前报道(Snider 1995)的，CT引 起主要是引起与IgG1相同类型的抗体，这类抗体是Th2-类型反 应的显示。相反，免疫刺激性核酸有较多的主要与IgG2a抗体 的一起的Th1，特别是在推进后或当两种辅助剂组合时。Th1类 型抗体一般有更好的中和能力，更进一步讲，在肺中Th2反应 是不希望的，因为它与哮喘有关(Kay，1996，Hogg，1997)。因此， 免疫刺激性核酸作为黏膜辅助剂的应用可以有其它黏膜辅助剂 达不到的好处。本发明中的免疫刺激性核酸作为黏膜辅助剂用 于引起系统和黏膜免疫反应同样是有用的。

指非核酸黏膜辅助剂的黏膜辅助剂也可以与免疫刺激性核 酸一起给予的。在这里用的非核酸黏膜辅助剂是一种不同于免 疫刺激性核酸的辅助剂，当它与可以一起被给予黏膜表面时， 这种辅助剂能够在实验对象中引起黏膜免疫反应。黏膜辅助剂 包括但是不仅仅局限于：细菌毒素例如：，霍乱毒素(CT)，CT衍 生物包括但是不仅仅局限于CT B亚单元(CTB)(Wu et al.，1998， Tochikubo et al.，1998)；CTD53(缬氨酸到天冬氨酸)(Fontana et al.，1995)；CTK97(缬氨酸  到赖氨酸)(Fontana et al.，1995)；CTK104(酪氨酸到赖氨酸)(Fontana et al.，1995)； CD53/K63(缬氨酸到天冬氨酸，丝氨酸到赖氨酸)(Fontana et al.，1995)；CTH54(精氨酸到组氨酸)(Fontana et al.，1995)； CTN107(组氨酸到天冬酰胺)(Fontana et al.，1995)；CTE114(丝 氨酸到谷氨酸)(Fontana et al.，1995)；CTE112K(谷氨酸到赖氨 酸)(Yamamoto et al.，1997a)；CTS61F(丝氨酸到苯丙氨酸) (Yamamoto et al.，1997a，1997b)；CTS106(脯氨酸到赖氨酸) (Douce et al.，1997，Fontana et al.，1995)；CTK63(丝氨酸到赖氨 酸)(Douce et al.，1997，Fontana et al.，1995)，Zonula occludens毒 素，zot，Escherichia coli热不稳定性肠毒素，不安定毒素(LT)， LT衍生物包括但是不仅仅局限于：LTB亚单元(LTB)(Verweij et al.，1998)；LT7K(精氨酸到赖氨酸)(Komase et al.，1998，Douce et al.，1995)；LT61F(丝氨酸到苯丙氨酸)(Komase et al.，1998)； LT112K(谷氨酸到赖氨酸)(Komase et al.，1998)；LT118E(甘 氨酸到谷氨酸)(Komase et al.，1998)；LT146E(精氨酸到谷氨 酸)(Komase et al.，1998)；LT1 92G(精氨酸到甘氨酸)(Komase et al.，1998)；LTK63(丝氨酸到赖氨酸)(Marchetti et al.，1998， Douce et al.，1997，1998，Di Tommaso et al.，1996)；和LTR72(丙 氨酸到精氨酸)(Giuliani et al.，1998)，百日咳毒素，PT.(Lycke et al.，1992，Spangler BD，1992，Freytag  and  Clemments，1999， Roberts et al.，1995，Wilson et al.，1995)包括PT-9K/129G(Roberts et al.，1995，Cropley et al.，1995)；毒素衍生物(见下边) (HOlmgren et al.，1993，Verweij et al.，1998，Rappuoli et al.，1995， Freytag and Clements，1999)；脂质A衍生物(如，单磷酰基脂质 A，MPL)(Sasaki et al.，1998，Vancott et al.，1998；Muramyl缩二 氨酸(MDP)衍生物(Fukushima et al.，1996，Ogawa et al.，1989， Michalek et al.，1983，Morisaki et al.，1983)；细菌外层膜蛋白(如， 外表面蛋白A(OspA)Borrelia burgdorferi，outer membrane protine of Neisseria meningitidis中的脂蛋白)(Marinaro et al.，1999，Van de Verg et al.，1996)；油水乳剂(如，MF59)(Barchfield et al.， 1999，Verschoor et al.，1999，O’Hagan，1998)；铝盐(Isaka et al.， 1998，1999)；和皂角苷(如，QS21)Aquila Biopharmaceuticals，Inc.， Worster，MA)(Sasaki et al.，1998，Macneal et al.，1998)，ISCOMS， MF-59(被Span85和Tween80稳定的三十碳六烯水乳剂；Chiron Corporation，Emeryville，CA)；Montanide辅助剂的Seppic ISA系 列(如，Montanide ISA720；AirLiquide，Paris，France)； PROVAX(一种含有稳定溶剂和胶态离子形式试剂的油水乳剂； IDEC Pharmaceuticals Corporation，San Diego，CA)；Syntext辅助 剂formulation(SAF；Syntex Chemicals，Inc.，Boulder，CO)；多- 双羧基苯酚phosphazene(PCPP高聚物；Virus Research Institute， USA)和Leishmania延长因子(Corixa Corporation，Seattle，WA)。

免疫反应也可以被诱导或增强，通过和免疫刺激性核酸一 起的细胞液的共给予或共线性表达(Bueler & Mulligan，1996； Clow et al.，1997；Geissler et al.，1997；Iwasaki et al.，1997；Kim et al.，1997)或B-7共刺激分子(Iwasaki et al.，1997；Tsuji et al.， 1997)。细胞液可以直接与免疫刺激性核酸一起给予或以编码细 胞液的核酸载体的形式给予，为了细胞液可以in vivo的表达。 在一些实施方案中，细胞液是以质体表达载体的形式给予的。 名词细胞液是作为一般性的名字称呼可溶蛋白和缩氨酸，这些 蛋白和缩氨酸在极小的兆分子一的浓度下作为体液调节器的， 并且不管是在正常或病态的情况下，它们调节着个体细胞和组 织的功能性活动。这些蛋白也调节细胞之间的相互作用和调节 细胞外部环境中发生的过程。细胞液的例子包括但是不仅仅局 限于：IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10， IL-12，IL-15，IL-18，粒性白细胞群体刺激因子(G- CSF)，干扰素-γ(γ-IFN)，IFN-α，瘤坏疽因子(TNF)，TGF- β，FLT-3配体，和CD40配体。

在指导T细胞反应中，细胞液扮演着重要角色。通过作用 于包括其它T细胞的其它免疫系统细胞的可溶因子的生成，助 理(CD+)T细胞调配哺乳动物的免疫反应。大多数成熟的CD4 +T助理细胞表达出两种细胞液类型(Th1和Th2)中的一种。 Th1子集促进了延期类型的超敏感性、细胞调节的免疫、和免 疫球蛋白种类转变为IgG2a°Th2子集通过活化B细胞、促进抗 体的产生、和导致类型转变为IgG1和IgE的方式来引起体液反 应。在一些实施方案中，优选的是，细胞液是Th1细胞液。

核酸对于从Th2免疫反应到Th1免疫反应的改道也有作用。 从Th2免疫反应到Th1免疫反应的改道可以通过测定响应核酸 而产生的细胞液的浓度来评价(如，通过引起单核细胞和其它 细胞产生包括IL-2、IFN-γ和GM-CSF等Th1细胞液)。免 疫反应从Th2到Th1反应的改道或再平衡对于治疗或预防哮喘 有特别的效果。例如，对于治疗哮喘有效的剂量是那个剂量， 对于将与哮喘有关的Th2免疫反应改道为Th1类型反应有用的 剂量。Th2细胞液，特别是IL-4和IL-5在哮喘的实验对象的 呼吸道中被提高。这些细胞液促进哮喘诱发反应的重要方面， 包括IgE同类型转变、嗜曙红细胞化学向性和活性和乳细胞的 生长。Th1细胞液，特别是IFN-γ和IL-12，可以抑制Th2 克隆的形成和Th2细胞液的生成。本发明中的免疫刺激性核酸 导致Th1细胞液的增加，Th1细胞液有助于再平衡免疫系统， 阻止或减轻与主要是Th2免疫反应有关的负反应。

核酸对于枝状细胞的存活的提高、区别、活性和成熟也是 有用的。免疫刺激性核酸对于枝状细胞的存活的提高、区别、 活性和成熟有独特的能力。通过免疫磁场细胞分离器分离血液 得到的枝状先驱细胞，在与GM-CSF一起孵化两天过程中，发 展了枝状细胞的形态学上和功能上的特征。没有GM-CSF时， 这些细胞细胞程序性死亡。在促进枝状细胞的存活和区别上免 疫刺激性核酸对GM-CSF而言是超级的(MHCII表达、细胞 大小、粒度)。免疫刺激性核酸也导致枝状细胞的成熟。因为枝 状细胞在先天性的和获得性免疫系统间形成联结，通过表现抗 原和通过它们的可以在它们局部环境中微生物的检测的模式识 别接受体的表达，与免疫刺激性核酸一起活化枝状细胞的能力 支持了这些免疫刺激性核酸基于对体内和来自体内免疫治疗紊 乱如癌症和敏感或感染疾病的策略的应用。免疫刺激性核酸对 于活化和导致枝状细胞的成熟也是有用的。

免疫刺激性核酸也可以提高自然杀死细胞细胞溶解酶的活 性和由抗体决定的细胞毒性(ADCC)。用与对于细胞目标(如 癌细胞)的特定的抗体组合的免疫刺激性核酸，ADCC可以完 成任务。当免疫刺激性核酸与抗体一块给予实验对象时，实验 对象的免疫体系引导去杀死瘤细胞。杂ADCC过程中有用的抗 体包括与身体内的细胞互相作用的抗体。对于细胞的目标特定 的许多这样的抗体在技术中已经描述并且许多在商业上可以得 到了。这些抗体的例子在下边的癌症免疫治疗的列中列出。

免疫刺激性核酸还可以与抗癌治疗一起给予。抗癌治疗包 括癌症药物、放射、和手术过程。象在此用的，“癌症药物”是 指给予实验对象的为了治疗癌症的药物。象在此用的，“治疗癌 症”包括阻止癌症的发展、减轻癌症的症状、和/或抑制已有癌 症的生长。在其它方面，癌症药物给予有患癌症危险的人为了 减少患病的危险性。对于治疗癌症的多种药物在此描述。为了 达到这个特定的目的，癌症药物被分为化学疗法药物、免疫疗 法药物、癌疫苗、激素疗法、和生物反应调节疗法。

象在此用的一样，“癌症药物”是指给予实验对象的为了治 疗癌症的药物。象在此用的，“治疗癌症”包括阻止癌症的发展、 减轻癌症的症状、和/或抑制已有癌症的生长。在其它方面，癌 症药物给予有患癌症危险的人为了减少患病的危险性。对于治 疗癌症的多种药物在此描述。为了达到这个特定的目的，癌症 药物被分为化学疗法药物、免疫疗法药物、癌疫苗、激素疗法、 和生物反应调节疗法。另外，本发明中的方法意味着包括连同 免疫刺激性核酸一起的多于一个癌症药物的使用。举个例子， 在合适的地方，免疫刺激性核酸可以与化学疗法药物和免疫疗 法药物一起被给予。可替换的是，癌症药物可以包括免疫疗法 药物和癌症疫苗，或者化学疗法药物和癌症疫苗，或化学疗法、 免疫疗法药物和癌症疫苗同时给予一个人以达到治疗已患癌症 或有患癌症危险的的人。

癌症药物以多种方式起作用。一些癌症药物通过对瘤细胞 有特定性的目标生理学机理来起作用。例子包括在癌症中变异 的特定基因和它们的基因产物(如，主要为蛋白质)的目标。 这些基因包括但是不仅仅局限于：瘤基因(如Ras，Her2，bcl-2)， 瘤抑制剂基因(如，EGF，p53，Rb)，和细胞循环目标(如，CDK4， p21，调聚物酶)。可替换的是，癌症药物可以瞄准在癌症细胞中 是被改变的信号传送通道和分子机理。通过表达在它们的细胞 表面的抗原决定部位来瞄准癌症细胞在单复制抗体的作用下完 成。在这里，后面这种癌症药物一般来讲是指免疫治疗。

其它癌症药物进攻不是癌细胞的其它细胞。例如，一些药 物使免疫系统做好攻击瘤细胞(即，癌症疫苗)的准备。仍然 是其它药物，叫做血管生成抑制剂，通过攻击固体瘤的血液供 应来起作用。因为大部分恶性癌症能够转移的(即，在初始的 瘤位置并播下末鞘组织，这样形成第二个瘤)，能够阻止这个转 移的药物在癌症的治疗中同样有用。血管生成调节者包括基本 的FGF，VEGF，angiopoietins，angiostation，endostatin，TNF α，TNP-470，糖蛋白G-1，血小板因子4，CAI，和整联蛋白 家族的一定成员。这类药物的一个种类是金属蛋白合酶抑制剂， 它能够抑制被癌症细胞用的以存活基本的瘤位置和转移到其它 组织的酶。

一些癌症细胞是抗原性的，因此它们可以被免疫系统攻击。 在一方面，免疫刺激性核酸和癌症药物(特别是那些被划分为癌 症免疫治疗的那类)混合的使用对于促进特定的免疫反应以抵抗 癌症抗原是有用的。这里用的“癌症抗原”是化合物，如缩氨 酸、这种化合物与瘤或癌症细胞有关的并且能够在MHC分子中 含有抗原的细胞的表面表达时，引发免疫反应。如那些在癌症 疫苗中存在的或那些用于准备癌症免疫疗法的等癌症抗原，可 以从粗的癌症细胞提取液中制得，象Cohen，et al.，1994，Cancer Research，54：1055，中所述；或者用再组合技术将抗原部分纯化； 或者denovo合成已知的抗原。癌症抗原能够以以下形式应用， 如作为特定抗原的产生免疫性的部分，或在一整个细胞的一些 部分，或瘤块能够被当作抗原来使用。这样的抗原可以通过分 离、或在组合制备、或通过本领域里熟知的其它方法。

免疫监督理论就是：免疫系统的主要功能是在瘤形成前就 检测到并消灭瘤细胞。这种理论的基本原理是：癌症细胞与正 常的细胞有抗原性上的差别，因此，引出与那些导致免疫学上 的不相容同种异体移植物排斥反应相类似的免疫反应。研究已 经确认：瘤细胞无论是在质量上还是在数量上都与抗原的表达 不同。例如，“瘤特定性的抗原”是与瘤细胞而不是正常的细胞 特别有关的抗原。瘤特定抗原的例子是在由DNA和RNA病毒 引起的瘤中的滤过性病毒抗原。“与瘤有关的”的抗原在瘤细胞 和正常的细胞中都有，但是在瘤细胞中以不同的质量和不同的 形态而存在的。这些抗原的例子是oncofetal抗原(例如， carcinoembryonic抗原)，区别抗原(例如T和Tn抗原)，和致 癌基因产物(例如，HER/neu)。

能够体内和体外杀死瘤目标和的细胞的不同类型已经确 定：自然的杀死细胞(NK细胞)，溶细胞T淋巴细胞(CTLs)， 由淋巴激活素活化的杀死细胞(LAKs)，和活化的巨噬细胞。NK 细胞能够杀死瘤细胞并且不先对特定的抗原有较早的敏感性， 并且活性不需要类型I抗原的存在，这种抗原是被在目标细胞 上的主要的组织相容性复合物(MHC)编码。NK细胞被认为参与 到初生的瘤和转移生长的控制中。与NK细胞相比，CTLs只有 在它们感受到瘤抗原后并且当目标抗原在表达MHC类型I的瘤 细胞上表达时才能够杀死瘤细胞。CTL被认为在拒绝转移的瘤 和被DNA病毒引起的瘤中是有效的细胞。LAK细胞是与NK 和CTL群落有差别的无效淋巴细胞的一个子集。一旦被激活， 被活化的巨噬细胞能够以不依靠抗原或不受MHC限制的方式下 杀死瘤细胞。被活化的巨噬细胞降低由它们渗透的瘤的生长速 率。In vitro测定证明：其它名义机理如抗体-依赖性，细胞- 调节细胞毒素的反应和由抗体加补充物引起的消散。但是，这 些免疫效果机理被认为in vivo比NK，CTL，LAK，和巨噬细 胞in vivo不重要的(对于review参考Piessens，W.f.，and David，J.， “Tumor Immunology”，In： Scientific American Medicine，Vol.2， Scientific American Books，N.Y.，pp1-13，1996)。

免疫疗法的目的是增加病人的对于已经存在的瘤的免疫反 应。免疫疗法的一种方法包括辅助剂的应用。由如细菌 Calmette-Guerin等微生物得到的辅助剂物质提高了免疫反应和 增加了对动物中瘤的抵抗力。

免疫疗法药物是来源于抗体或特定的附在或识别癌症抗原 的抗体片断的药物。在这里用的癌症抗原是广泛定义为由癌症 细胞表达的抗原。优选的是：抗原在癌症细胞的表面被表达。 更优化的是，抗原是不被正常的细胞表达，或至少不被表达到 象在癌症细胞中一样的量。基于抗体的免疫疗法可以通过附在 癌症细胞表面起作用，这样以来，免疫疗法刺激e内生的免疫 系统去进攻癌症细胞。基于抗体疗法起作用的另一个方法是作 为对癌症细胞有毒的物质的特定的瞄准的分散系统。抗体通常 与如蓖麻毒素(例如，从castor豆)，calicheamicin和maytansinoids 等毒素同时使用，或与如碘-131和钇-90等活化同形物同时使 用，或与化学疗法药物(象这里描述的一样)同时使用，或生 物反应调节药物同时使用。以这种方式，有毒物质能够集中在 癌症的区域，对正常的细胞没有特定毒素被减少。另外，对于 癌症抗原有特定性的抗体的使用，附在脉管系统上的抗体，如 附在内皮细胞上的那些，在本专利中也是有用的。这是因为， 一般情况下，固态瘤依靠新形成的血管而存活的，这样，大多 数瘤能够吸收并刺激新的血管。结果是，许多癌症药物的一个 策略是供给瘤的血管和/或相连的供应这些血管的组织(如基 质)。

与诸如单克隆抗体等免疫疗法药物共同作用的免疫刺激性 核酸的应用能够提高长期的存活性，通过包括ADCC的显著提 高(如上所述)、自然杀伤细胞(NK)的活性和IFNα量的增加 等途径。当与克隆抗体联合使用时，核酸减少了得到生物结果 所需要的抗体的药剂量。

目前正在用的或正在开发的癌症免疫疗法的例子在表C中 列出。

                                     表C                          开发中的或市场中的癌症免疫疗法 市场开发者 商品名(一般名) 指示 IDEC/Genentech， Inc./Hoffm- anLaRoche(在美国第一 个申请治疗癌症的单克 隆抗体的专利 RituxanTM(rituximab， Mabthera)9iDEC-Cab8， 嵌合鼠科/人类抗- CD20 Mab) 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 Genentech/Hoffmann- La Roche Herceptin，抗-Her2 hMAb 乳房/卵巢的 Cytogen Corp. Quadramet(CYT-424) 放射疗法药物 骨转移 Centocor/Glaxo/Ajinom oto Panorex(17-1A)(鼠科 单克隆抗体) 胰腺癌，肺癌， 乳腺癌，卵巢癌 IDEC IDEC-Y2B8(鼠科，抗- CD 20 Mab labeled with Yttrium-90) 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 ImClone Systems BEC2(抗-idiotypic Mab，mimics the GD3抗 原决定部位)(with BCG) 小细胞肺 ImClone Systems C225(chemeric单克隆 抗体对于外皮的生长因 子接受位(EGFr)) 肾细胞 Techniclone International/Alpha Therapeutics Oncolym(与131碘相 连的Lym-单克隆抗体 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 Protein Design Labs SMART M195 Ab，人类 化的 急性myleoid白 血病 Techniclone Corporation/Cambridge Antibody Technology 131ILYM-1(Oncolym TM) 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 Aronex Pharmaceuticals，Inc. ATRAGEN 急性 promyelocytic白 血病 ImClone Systems C225(嵌合抗-EGFr单 克隆抗体)+cisplatin或 放射 头和脖子，非小 细胞肺癌 Altarex，Canada Ovarex(B43，13，抗-个 体遗传型CA125，鼠类 Mab) 卵巢癌 Coulter Pharma(临床结 果是阳性的，但是药与 显著的骨髓毒素有关) Bexxar(抗-CD20Mab 标为131) 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 Aronex Pharmaceuticals，Inc. ATRAGEN Kaposi’s恶性毒 瘤 IDEC  Pharmaceuticals Corp/Genentech RituxanTM(Mab抗 CD20)pan-B Ab在与化 学疗法一起用 B细胞淋巴瘤 LeukoSite/Ilex Oncology LDP-03，huMAb对白细 胞抗原CAMPATH 慢性淋巴细胞白 血病(CLL) Center of Molecular Immunology Ior t6(抗CD6，鼠 Mab)CTCL 癌症 Medarex/Novartis MDX-210(人类化抗- HER-2双效抗体) 乳腺癌，子宫癌 Medarex/Novartis MDX-210(人类化抗- HER-2双效抗体) 前列腺，非小细 胞肺，胰腺，乳 腺癌 Medarex MDX-11(补足物活化接 受者(CAR)单克隆抗体) 急性骨髓性白血 病(AML) Medarex/Novartis MDX-210(人类化抗- HER-2双效抗体) 肾和结肠 Medarex MDX-11(补足物活化接 受者(CAR)单克隆抗体) Ex vivo骨髓清除 在急性骨髓性白 血病(AML) Medarex MDX-22(人类化双功能 抗体，Mab-共轭物)(补 足物cascade活化剂) 急性myleoid白 血病 Cytogen OV103(标记为钇-90的 抗体) 子宫癌 Cytogen OV103(标记为钇-90的 抗体) 前列腺癌 Aronex Pharmaceuticals，Inc. ATRAGEN 非-Hodgkin’s淋 巴瘤 Glaxo Wellcome plc 3622 W94 Mab附在 EGP40(17-1A)在腺癌 上的pancarcinoma抗原 非小细胞肺，前 列腺(辅助剂) Genentech 抗-VEGF，RhuMAb(抑 制血管生成) 肺，乳腺，前列 腺，结肠直肠癌 Protein Design Labs Zenapax(SMART Anti- Tac(IL-2受体)Ab，人 类化) 白血病，淋巴瘤 Protein Design Labs SMART M195 Ab，人源 化的 急性 promyelocytic白 血病 ImClone Systems C225(嵌合anti-EGFr 单克隆抗体)+红豆杉醇 乳腺癌 ImClone Systems (licensed from RPR) C225(嵌合anti-EGFr 单克隆抗体)+阿霉素 前列腺癌 ImClone Systems C225(嵌合anti-EGFr 单克隆抗体)+亚德里亚 霉素 前列腺癌 ImClone Systems BEC2(anti-个体基因型 Mab，模拟物the GD3 抗原决定基) 恶性黑素瘤 Medarex MDX-210(人源化anti- HER-2双效的抗体) 癌 Medarex MDX-220(对于表达 TAG-72的瘤是双效的) 肺，结肠，前列 腺，子宫，外皮， 胰腺，胃 Medarex/Novartis MDX-210(人源化anti- HER-2双效的抗体) 前列腺 Medarex/Merck KgaA MDX-447(人源化anti- EGF接受者的双效的抗 体) EGF接受者癌症 (头和颈部，前 列腺，肺，膀胱， 子宫劲，子宫) Medarex/Novartis MDX-210(人源化anti- HER-2双效的抗体) 与GCSF联合治 疗多种癌症特别 是乳腺癌 IDEC MELIMMUNE-2(鼠单克 隆抗体治疗疫苗) 恶性黑素瘤 IDEC MELIMMUNE-1(鼠单克 隆抗体治疗疫苗) 恶性黑素瘤 Immunomedics，Inc. CEACIDETM(I-131) 结肠直肠的和其 它 NeoRx PretargetTM放射活化抗 体 非-Hodgkin的B 细胞淋巴瘤 Novopharm Biotech， Inc. NovoMAb-G2 (pancarcinoma特定Ab) 癌症 Techniclone Corporation/Cambridge Antibody Technology TNT(嵌合Mab to组 蛋白抗原) 脑 Techniclone Corporation/Cambridge Antibody Technology TNT(嵌合Mab to组 蛋白抗原) 脑 Novopharm Gliomab-H(单细胞克 隆-人类化的Abs) 脑，恶性黑素瘤， 成神经细胞瘤 Genetics Institute/AHP ONI-250Mab 结肠直肠癌 Merck KgaA EMD-72000(嵌合-EGF 拮抗剂) 癌症 Immunomedics LymphoCide(人类化 LL2抗体) 非-hodgkin B细 胞淋巴瘤 Immune/AHP CMA676(单克隆抗体共 轭) 急性骨髓性白血 病 Novopharm Biotech， Inc. Monopham-C 结肠，肺，胰腺 Novopharm Biotech， Inc. 4B5 anti-个体基因型Ab 恶性黑素瘤，小 细胞肺 Center of Molecular Immunology Ior egf/r3(抗EGF-R人 类化Ab) 放射免疫疗法 Center of Molecular Immunology Ior c5(鼠MAb结肠直 肠)对于放射免疫疗法 结肠直肠癌 Creative bioMolecules/ Chiron BABS(生物合成附点) 蛋白质 乳腺癌 ImClone Systems/Chugai FLK-2(新生儿肝激酶-2 的单克隆抗体(FLK-2) 与瘤有关的血管 生成 ImmunoGen，Inc. 人源化Mab/小型药物 配合物 小细胞肺 Medarex，Inc. MDX-260双效，目标 GD-2 恶性黑素瘤，神 经胶质瘤， neurblastoma Procyon Biopharma， Inc. ANA Ab 癌症 Protein Design Labs SMART ID10 Ab B细胞淋巴瘤 Protein Design Labs/Novartis SMART ABL 364Ab 乳腺，肺，结肠 Immunomedics，Inc. ImmuRAIT-CEA 结肠直肠癌

依照本发明能够应用的其它类型的化学疗法药物包括：氨 基苯乙哌啶酮，天(门)冬酰胺酶，白消安/二甲磺酸丁酯(用于治 疗骨髓性白血病)，carboplatin，chlorombucil，盐酸阿糖孢苷，放 线菌素D/更生霉素(一种抗肿瘤的抗生素)，盐酸柔毛霉素(用作 抗肿瘤药)，磷酸雌二醇氮芥钠，依托泊苷(VP16-213)，氟尿苷， 氟尿嘧啶/氟二氧嘧啶(5-FU)，氟他胺，羟基脲(羟基尿素)，异 环磷酰胺，干扰素α-2a，α-2b，Leuprolide acetate(LHRH-释放因 子类似物)，罗氮芥(CCNU)，二氯甲基二乙胺HCl(氮介子气)， 巯(基)嘌呤(尤指6-巯基嘌呤，用以治疗急性白血病)，米托坦，米托 坦(o，p’-DDD)，盐酸米托蒽醌，Octreotide，Plicamycin，甲基苄肼 /甲苄肼HCl，链唑霉素，，三苯氧胺柠檬酸盐，硫鸟嘌呤，三胺 硫磷，长春碱的硫酸盐，安丫啶(m-AMSA)，阿扎胞苷， Erthropoietin，六甲基三聚氰胺(HMM)，白介素2，丙脒腙 (methyl-GAG；methyl glyoxal bis-guanylhydrazone；MGBG). Pentostatin(2’deoxycoformycin)，Semustine(methyl-CCNU)，替尼泊 苷(VM-26)和硫酸长春地辛。

癌症疫苗是用于刺激内在的免疫反应来抵抗癌症细胞的药 物。当今生产的疫苗主要是活化体液免疫系统(也就是：依靠 抗体的免疫反应)。现在正在发展的其它疫苗集中在活化细胞调 节的免疫系统，包括能够杀死瘤细胞的细胞毒素T淋巴细胞。 癌症疫苗一般地给已有抗原的细胞(如巨嗜细胞和枝状细胞) 和、或如T细胞、B细胞、和NK细胞其它免疫细胞带来癌症 抗原的存在的提高。

尽管癌症疫苗可以采用几种形式，象下面所述，它们的目 的是将癌症抗原和/或与癌症有关的抗原给予已有抗原的细胞 (APC)，为了用APC方便这种抗原内部过程和在MHC类型I分 子的邻近的细胞表面上的抗原存在的最高的存在。癌症疫苗的 一种形式是整个细胞疫苗，这种疫苗是癌症细胞的预备状态， 癌症磁暴已经被从实验对象中除去，经过体外处理，然后作为 在实验对象中的整个的细胞被再注入。瘤细胞的溶解产物(尤指 溶菌液)能够被用作癌症疫苗以引起免疫反应。另一种癌症疫苗 的形式为用癌症特定性或与癌症有关的小蛋白以激活T细胞的 缩氨酸疫苗。与癌症有关的蛋白是这样的蛋白，这种蛋白不是 由癌症细胞专有地表达的(就是，其它正常的细胞仍然可以表 达这些抗原)。但是，与癌症有关的抗原的表达一般地一致地与 一种特定类型的癌症调节的。然而其它类型的癌症疫苗是枝状 细胞疫苗，包括体外与癌症抗原接触或与癌症有关的抗原的整 个枝状细胞。枝状细胞的溶解产物或膜部分也可以用作癌症疫 苗。枝状细胞疫苗能够直接活化含有抗原细胞。其它癌症疫苗 包括神经节苷脂、热休克的蛋白疫苗、滤过性毒菌和细菌疫苗、 和核酸疫苗。

与癌症疫苗一起使用的免疫刺激性核酸的应用使抗原特定 性的体液和细胞调节的免疫反应得到提高，除了活化NK细胞 和内部的枝状细胞，并且增加了IFNα的量。这种提高使带简 化抗原的疫苗能够用于得到一样的有益的效果。在一些例子中， 癌症疫苗可以与象上所述的辅助剂一起使用。

象这里用的一样，名词“癌症抗原”和“瘤抗原”在指代由 癌症细胞区别地表达的抗原并且能够因此被开发用于攻击癌症 细胞的抗原的使用上是可替换的，癌症抗原是能够明显刺激瘤 特定性的免疫反应的抗原。这些抗原中的一些是被正常的细胞 编码的，尽管不是必须的被表达。这些抗原被特征性地当作在 正常细胞中通常是沉默的(就是不表达的)那些抗原、只在一 定区别阶段被表达的那些抗原、和那些诸如胚胎和致命的抗原 等临时被表达的抗原。其它癌症抗原被沉默的细胞基因所编码， 这些变异基因如，瘤基因(例如，被活化的ras瘤基因)，抑制 基因(如变异p53)，由内在的删除或染色体变位造成的溶解蛋 白。仍是其它癌症抗原能够被如在RNA和DNA瘤病毒上携带 的基因等滤过性毒菌基因编码。

其它疫苗采用枝状细胞的形式，这些枝状细胞已经体外接 触起着抗原、已经处理了抗原并能够在MHC分子邻近的地方的 它们的细胞表面表达癌症抗原，以得到对于其它免疫系统的细 胞来说的有效的抗原存在。

在本专利的一个方面，与基于枝状细胞的癌症疫苗共同使 用的免疫刺激性核酸被使用。枝状细胞是一种专业的抗原表达 细胞。枝状细胞形成在新生的已获得的免疫系统之间由表达抗 原形成联结，并它们的通过在微生物的环境中识别例如LPS微 生物等的分子模式识别接受器的表达。枝状细胞有效地使内在 化、处理、和表达枝状细胞接触的溶解特定性的抗原。内在化 和表达抗原的过程导致主要的组织相容性复合物(MHC)和共 同刺激分子表达的快速上调节、细胞液的生成、和向被认为与 T细胞活化有关的淋巴腺有机体的迁移。

表D列出多种正在用的或开发中的癌症疫苗。

                            表D                    开发中的或市场中的癌症疫苗 市场开发者  商品名(一般名) 指示 Center of Molecular Immunology  EGF 癌症 Center of Molecular Immunology 神经节苷脂癌 症疫苗 Center of Molecular Immunology  抗-个体遗传性的 癌症疫苗 ImClone System/Memorial Sloan-Kettering Cancer Center  Gp75抗原 恶性黑素瘤 ImClone System/Memorial Sloan-Kettering Cancer Center  抗-个体遗传性的Abs 癌症疫苗 Progenics Phamaceutical，Inc. GMK恶性黑瘤素疫苗 恶性黑瘤素 Progenics Phamaceutical，Inc. MGV神经节苷脂共用疫苗 淋巴瘤、结肠 直肠的、肺的 Corixa Her2/neu 乳腺、子宫 AltaRex Ovarex 子宫 AVAX Technologies Inc. M-Vax，自体同源的整个细胞 恶性黑素瘤 AVAX Technologies Inc. O-Vax，自体同源的整个细胞 子宫 AVAX Technolonlogies Inc. L-Vax，自体同源的整个细胞 白血病-AML Biomira Inc./Chiron Theratope，STn-KLH 乳腺、结肠直 肠的 Biomira Inc. BLP25，MUC-1缩氨酸疫苗 被密封在脂质体给予系统 肺 Biomira Inc. BLP25，MUC-1缩氨酸疫苗 被密封在脂质体给予系统+ 脂质体IL-2 肺 Biomira Inc. 胶囊自体同源的疫苗 淋巴瘤B细胞 恶性的 Ribi Immunochem Melacine，细胞溶菌液 恶性黑瘤素 Corixa 缩氨酸抗原、微球给予系统 和LeIF辅助剂 乳腺 Corixa 缩氨酸抗原、微球给予系统 和LeIF辅助剂 前列腺 Corixa 缩氨酸抗原、微球给予系统 和LeIF辅助剂 子宫 Corixa 缩氨酸抗原、微球给予系统 和LeIF辅助剂 淋巴瘤 Corixa 缩氨酸抗原、微球给予系统 和LeIF辅助剂 肺 Virus Research Institute 毒素/抗原再组合给予系统 所有的癌症 Apollon Inc. Genevax-TCR T细胞淋巴瘤 Bavarian Nordic Research Institute A/S 基于MVA(疫苗病毒)的 疫苗 恶性黑瘤素 BioChem Pharma/BioChem Vaccine  PACIS，BCG疫苗 膀胱 Cantab Pharmaceuticals  TA-HPV 子宫颈 Cantab Pharmaceuticals  TA-CIN 子宫颈 Cantab Pharmaceuticals  DISC-病毒，免疫疗法 癌症 Pasteur Merieux Connaught  ImmuCyst/TheraCys-BCG  免疫疗法(Bacillus Calmette-  Guerin/Connaught)，表面膀  胱癌的内膀胱治疗 膀胱

象这里用的一样，化学疗法药物包括所有其它形式的不落 于免疫疗法或癌症疫苗的分类的癌症药物。这里用的化学疗法 药物不仅包括化学的而且包括生物的药物。这些药物起的作用 是抑制癌症细胞为了存活而依靠的细胞的活性。化学疗法药物 的分类包括烷化/生物碱药物，抗新陈代谢、激素或类激素、和 混杂的抗肿瘤的药。如果不是所有的这些药物，大部分的这些 药物直接对癌症细胞有毒性并且不需要免疫刺激。将化学疗法 和免疫刺激性核酸组合给予提高了化学疗法的最大的可容忍的 剂量。

目前正发展或临床使用的化学疗法药物在表E中列出。

                              表E                         开发中的或市场中的癌症药物 市场开发者 商品名   一般名 指示 Abbott TNP 470/AGM 1470   Fragyline 癌症中抗-脉管基 因 Takeda TNP 470/AGM 1470   Fragyline 癌症中抗-脉管基 因 Scotia Meglamine GLA   Meglamine   GLA 膀胱癌症 Medeva   Valstar   Valrubicin 膀胱癌-顽固的原 位癌 Medeva   Valstar   Valrubicin 膀胱癌-乳突癌 Rhone Poulene   Gliadel Wafer   Carmustaine+   Polifepr Osan 脑瘤 Warner Lambert   Undisclosed   Cancer(b)   Undisclosed   Cancer(b) 癌症 Bristol Myers Squib   RAS Famesyl   Trahsferase抑   制剂   RAS Famesyl   Transferase抑   制剂 癌症 Novartis   MMI 270   MMI 270 癌症 Bayer   BAY 12-9566   BAY 12-9566 癌症 Merck   Famesyl   Transferase抑   制剂   Famesyl   Transferase抑   制剂 癌症(固体瘤胰 腺、结肠、肺、乳 腺) Pfizer   PFE   MMP 癌症，脉管基因 Pfizer   PFE   Tyrosine Kinase 癌症，脉管基因 Lillv   MTA/LY   231514   MTA/LY   231514 癌症固体瘤 Lilly   LY   264618/Lomete   xol   Lometexol 癌症固体瘤 Scotia   Glamolec   LiGLA(锂-γ亚   麻酸盐) 癌症、胰腺、乳腺、 结肠 Warner Lambert   CI-994   CI-994 癌症、固体瘤/白血 病 Schering AG   血管生成抑制   剂   血管生成抑制   剂 癌症/心脏 Takeda   TNP-470   N/k 恶性瘤 Smithkline Beecham   Hycamtin   Topotecan 转移性子宫癌 Novartis   PKC-412   PKC-412 抗多药物癌症 Novartis   Valspodar   PSC-833 骨髓白血病/子宫癌 Immunex   Novantrone   米托蒽醌 与激素有关的疼 痛，顽固的前列腺 癌 Warner Lambert   Metaret    Suramin 前列腺   Genentech   Anti-VEGF  Anti-VEGF 前列腺/乳腺/结肠 直肠/NSCL癌症   British   Biotech   Batimastat  Batimastat(BB9  4) Ptergium   Eisal   E7070  E7070 固体瘤   Biochem   pharma   BCH-4556  BCH-4556 固体瘤   Sankyo   CS-682  CS-682 固体瘤   Agouron   AG2037  AG2037 固体瘤   IDEC Pharma   9-AC  9-AC 固体瘤   Agouron   VEGF/b-FGF   抑制剂s  VEGF/b-FGF  抑制剂s 固体瘤   Agouron   AG3340  AG3340 固体瘤/有印迹的 Degen   Vertex   Incel  VX-710 固体瘤-IV   Vertex   VX-853  VX-853 固体-口头   Zeneca   ZD0101(inj)  ZD0101 固体瘤   Novartis   ISI641  ISI641 固体瘤   Novartis   ODN698  ODN698 固体瘤   Tanube   Seiyaku   TA2516  Marimistat 固体瘤   British   Biotech   Marimastat  Marimastat(BB  2516) 固体瘤   Celtech   CDP845  Aggrecanase  抑制剂 固体瘤/乳腺癌   Chiroscience   D2163  D2163 固体瘤/转移   Warner   Lambert   PD183805  PD183805   Dalichi   DX8951f  DX8951f 抗-癌症   Dalichi   Lemonal DP   2202  Lemonal DP  2202 抗-癌症   Fujisawa   FK317  FK317 抗癌抗生素   Chugal   Picibanil  OK-432 抗恶性瘤   Nycomed   Amersham   AD32/   Valrubicin  Valrubicin 膀胱癌-顽固的药 物癌   Nycomed   Amersham   Metastron  Strontium  Derivative 骨癌(adjunt治疗， 疼痛)   Schering   Plough   Temodal  Temozolomide 脑瘤 Schering Plough Temodal Temozolonide 脑瘤 Liposome Evacet 阿霉素， Liposomal 脑瘤 Nycomed Amersham Yewtaxan Paclitaxel 乳腺癌高级，子宫癌 高级 Bristol Myers Squib Taxol Paclitaxel 乳腺癌高级，子宫癌 高级，NSCLC Roche Xeloda Capecitabine 乳腺癌，结肠直肠 癌 Roche Furtul on Doxifluridine 乳腺癌，结肠直肠 癌，胃癌 Pharmacia & Upjohn Adriamycin 阿霉素 乳腺癌，白血病 Ivax Cyclopax Paclitaxel，Oral 乳腺/子宫癌 Rhone Poulenc Oral Taxoid Oral Taxoid 广泛的癌 AHP Novantrone 米托蒽醌 癌 Sequus SPI-077 Cisplatin， Stealth 癌 Hoechst HMR 1275 Flavopiridol 癌 Pfizer CP-358,774 EGFR 癌 Pfizer CP-609,754 RAS Oncogene 抑制剂 癌 Bristol Myers Squib BMS-182751 Oral Platinum 癌(肺，子宫) Bristol Myers Squib UFT(Tegafur/U racil) UFT(Tegafur/U racil) 口癌 Johnson & Johnson Ergamisol 左旋咪唑 癌症疗法 Glaxo Wellcome Eniluracil/776C 85 SFU Enhancer 癌，顽固固体&结 肠直肠癌 Johnson & Johnson Ergamisol 左旋咪唑 结肠癌 Rhone Poulenc Campto Irinotecan 结肠直肠癌，子宫 颈癌 Pharmacia & Upjohn Camptosar Irinotecan 结肠直肠癌，子宫 颈癌 Zeneca  Tomudex  Ralitrexed 结肠直肠癌，肺癌，  乳腺癌 Johnson & Johnson  Leustain  Cladribine 多毛细胞白血病 Ivax  Paxene  Paclitaxel Kaposi恶性毒瘤 Sequus  Doxil  阿霉素，  Liposomal KS/癌 Sequus  Caelyx  阿霉素，  Liposomal KS/癌 Schering AG  Fludara  Fludarabine 白血病 Pharmacia & Upjohn  Pharmorubicin  Epirubicin 肺/乳腺癌 Chrion  DepoCyt  DepoCyt Neoplastic Meningitis Zeneca  ZD1839  ZD1839 非小细胞肺癌，胰腺 癌 BASF  LU79553  Bis-  Naphtalinide 肿瘤学 BASF  LU103793  Dolastain 肿瘤学 Shering plough  Caetyx  阿霉素-脂质体 子宫/乳腺癌 Lilly  Gemzar  Gemcitabine 胰腺癌，非小细胞 肺癌，乳腺，膀胱和 子宫癌 Zeneca  ZD  0473/Anormed     ZD  0473/Anormed 基于Pt的NSCL， 子宫等等 Yamanouchi  YM116  YM116 前列腺癌 Nycomed Amersham  Seeds/I-125  Rapid St.  Lodine Seeds 前列腺癌 Agouron  Cdk4/cdk2抑  制剂s  Cdk4/cdk2抑  制剂s 固体瘤 Agouron  PARP抑制剂s  PARP抑制剂s 固体瘤 Chiroscience  D4809  Dexifosamide 固体瘤 Bristol Myers Squib  UFT(Tegafur/U  racil)  UFT(Tegafur/U  racil) 固体瘤 Sankyo  Krestin  Krestin 固体瘤 Asta Medica  Ifex/Mesnex  Ifosamide 固体瘤 Bristol Meyers Squib  Vumon  替尼泊苷 固体瘤 Bristol Meyers Squib  Paraplatin     Carboplatin  固体瘤 Bristol Meyers Squib  Plantinol     Cisplatin，     Stealth  固体瘤 Bristol Meyers Squib  Plantinol     Cisplatin  固体瘤 Bristol Meyers Squib  Vepeside     Etoposide  固体瘤 Zeneca  ZD9331     ZD9331  固体瘤，高级的结  肠直肠癌 Chugai  Taxotere     Docetaxel  固体瘤，乳腺癌 Rhone poulenc  Taxotere     Docetaxel  固体瘤，乳腺癌 Glaxo Wellcome  Prodrug of  guanme  arabinside     Prodrug of     arabinside  T细胞白血病/淋巴  瘤&B细胞瘤 Bristol Myers Squib  Taxane Analog     红豆杉烷类似     物  Taxol follow up

在一个实施方案中，在癌症的治疗中，本发明的方法用免 疫刺激性核酸作为IFNα治疗的替代。现在，一些治疗方案要 求IFNα的使用。因为IFNα是随着一些免疫刺激性核酸的给予 产生的，这些核酸能够用于产生内生的IFNα。

本发明也包括用免疫刺激性核酸诱导抗原非特定的天生免 疫活性和对于感染挑战的广谱抵抗力。这里用的名词抗原非特 定的天生免疫活性是指不是B细胞的免疫细胞的活性，举个例 子，包括NK细胞、T细胞或其它可以以抗原独立方式这些细胞 的一些组合的方式起反应的细胞的活性。对于感染挑战的广谱 抵抗力被引起，因为免疫细胞是活化形式并且对于任何入侵的 化合物或微生物做好了起反应的准备。细胞不用特意准备抵抗 特定的抗原。这在生物战争中特别有用，在其它上述的环境中 如旅行也同样特别有用。

特定的免疫刺激性核酸的刺激索引检测出以多种免疫细胞 序列存在。优选的是，考虑到B细胞的增殖，免疫刺激性核酸 的刺激索引至少是5，优选的是至少为10，更加优选的是至少 15，最优选的是至少20，就象在鼠科B细胞中3H尿嘧啶核苷 的组合决定的一样，这个决定是与20μM核酸在37℃下20h测 定的。并且被浓度μCi的13H尿嘧啶核苷所脉冲；4h后成熟和 计数，在PCT公开专利申请PCT/US95/01570(WO96/02555)和 PCT/US97/19791(WO98/18810)有详尽描述。要求权利USNO. 08/386,063和08/960,774，在Feb.7，1995和OCT30，1997分别申 请。对于in vivo中的应用，例如，免疫刺激性核酸能够有效地 诱导免疫反应，如抗体的产生是重要的。

免疫刺激性核酸在非啮齿类脊椎动物中是有效的。依赖于 实验对象的类型和免疫刺激性核酸的序列的不同的免疫刺激性 核酸能够导致最佳的免疫刺激。本发明已经发现：许多脊椎动 物对于同样类型的免疫刺激性核酸有反应，有时，免疫刺激性 核酸是指人类特定的免疫刺激性核酸。但是，啮齿动物对于不 同核酸起反应。在这里反应的是，在人类中导致最佳刺激免疫 刺激性核酸可以不是通常在鼠中导致最佳刺激。但是，在人类 中导致最佳刺激免疫刺激性核酸通常在牛、马、绵羊等等其它 动物中导致最佳刺激。本领域的技术人员用这里描述的路线和/ 或在本领域已知的如用这里提供的帮助能够确认对于一个特定 兴趣的种类有用的最佳核酸。

免疫刺激性核酸可以直接给予实验对象或与核酸给予复合 物一起给予。核酸给予复合物意思是说：与有关的(如离子或 共轭键；或束缚在)核酸分子；目标的意思(例如，导致对目 标细胞高的亲和键的分子(如B细胞表面和/或由目标细胞引起 的细胞吸收的增加。核酸给予复合物的例子包括：与固醇有关 的核酸(如胆固醇)，脂质(如，正离子酯质，virosome或酯质体)， 或目标细胞特定束缚剂(如被目标细胞特定接受器识别的配体)。 优选的复合物可以在体内十分稳定以防止在目标细胞进入前显 著的解开。但是，复合物能够在细胞正常的情况下被劈开目的 是核酸以特定的形式被释放。

为了将抗原或核酸给予到表面的给予机器或给予设备已经描 述。免疫刺激性核酸和/或抗原和/或其它治疗物可以被单独给予 (如在盐水或缓冲液中)或用本领域已知的给予设备。例如，下 列给予设备已经被描述：Cochleates(Gould-Fogerite et al.， 1994，1996)；Emulsomes(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1997)； ISCOMs(Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998， Morein et al.，1999)；酯质体(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；活的细菌携带者(如，沙门 氏菌，Escherichia coli，Bacillus calmatte-guerin，Shigella，乳酸菌) (Hone et al.，1996，Pouwels et al.，1998，Chatfield et al.，1993，Stover et al.，1991，Nugent et al.，1998)；活的滤过性细菌携带者(如，牛 痘，腺病毒，疱疹简单型)(Gallican et al.，1993，1995，Moss et al.， 1996，Nugent et al.，1998，Flexner et al.，1988，Morrow et al.，1999)； 微球体(Gupta et al.，1998，Jones et al.，1996，Maloy et al.，1994， Moore et al.，1995，O’Hagan et al.，1994，Eldrige et al.，1989)；核酸 疫苗(Fynan et al.，1993，Kuklin et al.，1997，Sasaki et al.，1998， Okada et al.，1997，Ishii et al.，1997)；高分子(如羧基甲基纤维素， chitosan)(Hamajima et al.，1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；高分子环 (Wyatt et al.，1998)；Proteosomes(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；氟化钠(Hashi et al.，1998)；基因转移设备(Tacket et al.，1998，Mason et al.，1998，Haq et al.，1995)；Virosomes(Gluck et al.，1992，Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)；象病毒的颗粒 (Jiang et al.，1999，Leibl et al.，1998)。其它给予设备在本领域已知， 其它另外的例子在下面的载体的讨论中给出。

名词免疫刺激性核酸的有效的量是指实现想要的生物效果 所需要的或足够的量。例如，对于引起黏膜免疫的免疫刺激性 核酸的有效的量是导致IgG的发展的需要的那个量，而IgG是 对于接触抗原对抗原的反应。与这里提供的教训一块，通过在 各种各样的活性化合物中选择和比较诸如能力、相对生物获得 性、病人的体重、负反应的严重性和优选的给予模式等因素， 对于治疗特定的病人不造成显著的毒性并且有全效有效的预防 或治疗体能够被计划。对于任何特定应用有效的量能够有差别 是建立在这样的因素上的，如疾病或被治疗的情况，特定的被 给与的免疫刺激性核酸，抗原，病人的个头，或疾病或情况的 严重程度。在本领域里的一名普通的技术人员在没有试验的情 况下能够熟练地决定特定免疫刺激性核酸和/或抗原和/或其它治 疗药物的有效的量。

对于黏膜或局部给予的这里描述的化合物的实验对象剂量 典型地是每次在0.1μg到10mg的范围内，这取决于应用能够 天天、每个星期、每个月地和其它在此期间的时间给予。更典 型的是，黏膜或局部的剂量每次在10μg到5mg的范围内，最 典型的是从大约100μg到1mg，被几天或几个星期隔开的2-4 给予。更典型的是：免疫刺激剂量每次在10μg到5mg的范围 内变化，而且最典型的是：在10μg到5mg的范围内，每天或 每星期给予。对于目的是引起特定抗原免疫反应的注射用药的 给予，这里描述的化合物的试验对象的剂量，这里化合物与抗 原而不是其它这里药物一起被给予，是典型地比对于疫苗辅助 剂或免疫刺激应用的有效黏膜剂量高5到10,000倍，更典型 的是10到1,000倍，最典型的是20到100倍。当免疫刺激性 核酸和其它治疗药物一起被给予或在特定的给予器给予时，对 于目的是引起天生的免疫反应或增加ADCC或引起抗原特定性 的免疫反应的注射性给予的在治疗描述的化合物的每次给予的 剂量在0.1μg到10mg的范围内的变化，这依赖于应用能够能 够天天、每个星期、每个月地和其它在此期间的时间给予。对 于这些目的的更加典型的注射每次用药量在10μg到5mg内变 化，最典型的是从100μg到1mg，被几天或几个星期隔开的2- 4给予。在一些实施方案中，但是，对于这些目的的注射剂量抗 原在比上述的高5到10,000倍的范围内使用。

对于这里描述的任何化合物，治疗的有效的量能够从动物 模型中初步决定。治疗有效的剂量也能够从下列数据得到：如 在人类中已经被测定的(人类临床试验已经开始)人类对于CpG 寡核苷酸的数据，或人类对于已知表现相似的药理学活性的化 合物的数据，例如其它黏膜辅助剂，如LT和其它抗原目的是免 疫，对于黏膜或局部给予。对于注射给予要求较高的剂量。应 用的剂量可以在相对的生物可获得性和给予化合物的能力的基 础上进行调节。在上述的方法基础上调节剂量以获得最大的效 果和与本领域广泛共知的其它方法是本领域普通技术人员的能 力所及的。

本发明的药片是在药理学上可接受的溶液中给予的，这常 规的包含：药理学上可接受的盐的浓度，缓冲药物，防腐剂， 兼容的载体，辅助剂，和可选择的其它治疗成分。

对于在治疗中的应用，免疫刺激性核酸的有效量能够通过 任何将核酸给予如黏膜或系统的目的表面的方式给予实验对 象。将本发明的药理学组合物的给予可以由任何熟练的技术人 员知道的手段完成。给予的优选的路线包括但是不仅仅局限于： 口、注射、肌肉的、鼻内的、intracheal、吸入、眼睛、阴道的、 直肠的。

对于口给予，化合物(即，免疫刺激性核酸，抗原和其它 治疗药物)能够通过活性化合物和本领域熟知的药理学可接受 的载体组合而很容易地制备。这些载体使本发明中的化合物能 够制备成：片、丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶体、糖浆、浆、 悬浮液、和类似的，对于由被治疗的实验对象的口摄取。对于 口用的药理学制备能够作为固体赋形剂得到，在添加了合适的辅 助剂后，可选的是磨碎混合物，和处理颗粒混合物，如果想得 到，以得到药片或糖衣丸内核。合适的赋形剂特别是象糖的填 充物，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨(糖)醇；纤维素制备如， 玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，凝胶，树脂黄芪 胶，甲基纤维素，羟基丙基甲基-纤维素，羧基甲基纤维素钠， 和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果想要，不规整剂可以被加入， 例如交叉相连的聚乙炔吡咯烷酮，琼脂，褐藻酸，或它的盐例如褐 藻酸钠。可选的是，口服药片也可以在盐或缓冲剂中对于中和 内酸条件下制备或在没有任何载体的情况下给与。

糖衣丸内核被提供时有合适的外壳。为了这个目的，浓缩 的糖溶液可以使用，这可以选择性地包括阿拉伯树胶，滑石，，聚 乙炔吡咯烷酮，carbopol凝胶体，聚乙烯乙二醇，和/或二氧化 钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或染料可 以添加到药片或糖衣丸外套中，目的是区分或给不同活性混合 物剂量的组合以特征。

能够口服的药理学制备包括push-fit由凝胶制备的胶囊，同 时软的，密封的由凝胶和可塑剂制备的胶囊，如丙三醇或山梨(糖) 醇。这种push-fit胶囊能够在与填充物混合物中包括活性成分， 例如乳糖，黏结剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石，硬脂酸镁盐和， 可选的是，稳定剂。在软胶囊中，活性混合物可以溶解或悬浮 在合适的液体中，如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙烯乙二醇。 另外，稳定剂可以添加。为了口服形成的微球体也可以应用。 这些微球体有机在本领域被很好地定义。所有的口服的制备必 须在对于这样的给予合适的药剂量。

对于口服，组合物可以采用药片或菱形等传统的方式。

对于通过呼吸给予，依照本发明用的化合物可以以气雾剂 喷雾方便地给予，这些气雾剂喷雾由压力的包装或气雾器而发出 的，同时使用合适的推进剂，如双氯双氟甲烷，三氯氟甲烷， 双氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。在压力气雾剂的 情况下，药物单元可以通过提供一个阀给予以给予可剂量的量。 如在吸入器或吹入器里使用的凝胶的胶囊和盒式凝胶可以制 备，含有化合物和合适的如乳糖或淀粉粉末基础的粉末混合物。

当化合物被希望系统地给予，它可以制备以通过注入注射 给与，例如小而圆的物块注入或连续的输入。为了注射而制备 可以以单元药剂形式存在，例如，在安瓿或多-剂量容器中， 有添加的防腐剂。这种组合物可以采用这样的形式如，悬浮液， 溶液，或在油或水溶性的介质中的乳剂，或可以包含制备剂， 如悬浮剂，稳定和/或分散剂。

对于注射给予的药理学制备包括：以水溶性形式存在的水 溶性的活性化合物。另外，活性化合物的悬浮液可以当作合适 的油注入悬浮液被制备。合适的亲酯性的溶剂或介质包括脂肪 油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如，乙基油酸盐或甘油三 酸酯，或脂质体。水注射悬浮液可以含有增加悬浮的粘性的物 质，例如羧基甲基纤维素，山梨(糖)醇，或山梨(糖)醇。可选的 是，悬浮液也可以包括溶解性的稳定剂或能够增加化合物的溶 解性的药物，目的是允许高浓度试剂的制备。

可替换的是，在用之前，活性化合物可以是与合适的介质 如(无热原质的消毒水)构造一起的粉末状的形式。

化合物也可以在直肠或阴道成分中表达，如栓剂或保持力 灌肠剂，举例，包含传统栓剂基础例如可可黄油或其它脂肪酸 丙酯。

除了以上描述的配方，化合物也可以配制为贮存式制备品。 这样长时间有效的配方可以与合适的聚合物或狂犬病物质(例如 在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或作为少量可溶解 的衍生物，例如作为一种少量可溶解的盐。

药学组合物也可以含有合适的固体或凝胶体相的载体或赋 形剂。这些载体或赋形剂的例子包括但是不仅仅局限于碳酸钙， 磷酸钙，多种糖，淀粉，纤维素衍生物，凝胶，和象聚乙烯乙 二醇样的高聚物。

合适的液体或固体药学上的制备形式是，例如，水的或盐 的溶液，对于吸入、微压缩、encochleated、涂在显微的金颗粒 上，包含在脂质体、成喷雾状、气雾剂、小球对于输入皮肤中， 或干燥到尖锐的物质上以刮入皮肤。药学组合物也包括粒状、 粉末、药片、有涂层的药片、(微)胶囊、栓剂、糖浆、喷雾剂、 悬浮液、霜、液滴或与活性化合物的拖延释放一起的制备、在 制备中赋形剂和添加剂和/或辅助剂象分解质、黏合剂、被覆剂、 膨胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂就象上述的样传统上都用。 药学组合物在多种药物给予体系中的应用是合适的。为了得到 药物给予方法的简要回顾，可参看，Langer，Science 249：1527- 1533，1990，这篇文献在此通过引证被并入本文。

免疫刺激性核酸和可选的其它治疗和/或抗原可以是它们本 身或以药学上接受的盐的形式给予。当在药物中用时，盐必须 是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于 制备这里的药学上可接受的盐。这些盐包括，但是不仅仅局限 于由下列酸制备的盐：盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来 酸、乙酸、水杨酸、p-甲苯硫酸、酒石酸、柠檬酸、甲基硫酸、 蚁酸、丙二酸、琥珀酸、2-萘取代硫酸、和苯硫酸。这些盐同 样可以作为碱金属或碱土金属盐来制备，例如羧基酸的钠、钾、 或钙盐。

合适的缓冲剂包括：乙酸和乙酸盐(1-2％w/v)；柠檬酸和柠 檬酸盐(1-3％w/v)；硼酸和硼酸盐(0.5-2.5％w/v)；和磷酸和磷酸 盐(0。8-2％w/v)。合适的防腐剂包括：苯甲烃铵氯化物(0.003- 0.03％w/v)；氯代丁醇(0.3-0.9％w/v)；parabens(0.01-0.25％w/v)； 和乙基汞硫代水杨酸钠(0.04-0.02％w/v)。

本专利中的药物组合物包含免疫刺激性核酸和可选的抗原 和/或其它可选的包括在药学上接受的载体治疗药物的有效的 量。药学上接受的载体这个名词是指一个或许多可兼容的固体 或液体填充物，稀释液或对于给予人类或其它脊椎动物合适的 胶囊物质。载体这个名词表示有机或无机成分、自然的或合成 的，活性成分与载体结合以方便应用。药学组合物的化合物也 能够与本发明中的化合物混合，以一种对要得到的药学效果没 有显著影响的互相作用的方式互相混合。

此专利中有用的免疫刺激性核酸可以与添加的辅助剂、其 它治疗物、或抗原混合给予。化合物可以包括几种辅助剂，除 了免疫刺激性核酸或几种抗原或其它治疗药物。

多种给予路线可得到。特定的选择方式当然依赖于：选择 的特定的辅助剂或抗原，被治疗的特定的情况，和为了治疗效 果所需的剂量。此专利的方法，一般意义上讲，可以用任何药 学上接受的给予方式来实践，也就是说，任何能够产生有效水 平的免疫反应而且不造成临床上不可接受的副反应的方式。优 选的给予方式上面已经讨论过。

组分可以方便地以单位剂量的方式表现，也可由药学上熟 知的任何方法来制备。所有的方法都包括将化合物负载到有关 的含有一种或多种辅助成分的载体这一步骤。一般来讲，组分 通过将化合物统一地和密切地负载到有关的液体载体中、分的 很小的固体载体上、或两者都有，如果必要的话，使产物成型。 液体剂量单元是小瓶或一次用量的针剂。固体剂量单位是药片、 胶囊和栓剂。为了治疗病人，依赖于化合物的活性、给予的方 式、免疫的目的(也就是预防或治疗)、紊乱的自然和严重性、 病人的年龄和体重等因素，需要不同的剂量。给予药可以在一 次剂量里给予，或者几次少剂量的给予来实现。分开在特定的 星期或月间隔的情况下多次给予药对于培养特定的抗原反应是 通常使用的。

其它给予系统能够包括时间释放、延迟释放、或持续释放 系统。这些系统能够避免化合物的重复给予，方便了病人和医 生。多种类型的释放给予系统是可获得的，并且对于本领域的 普通技术人员来说也是已知的。它们包括高聚物基础系统，例 如聚(丙交酯-醣脂类)、共聚草酸盐、聚己内酯、聚氨基醚、 聚直链醚、聚羟基酪酸、和聚酐。前面所述的聚合物的包含药 物的微胶囊在U.S.5,075,109专利中有描述。给予系统也包括非 高聚物系统：包括甾醇(例如氯化甾醇、氯化甾醇醚)和脂肪 酸或中性脂肪(如单-双和三-脂肪酸丙酯)等脂质；水凝胶 释放系统；sylatic系统；缩氨酸基础上的系统；蜡外壳；用传 统黏合剂和赋形剂制成的压缩药片；部分熔合的植入；等等。 特定的例子包括但是不仅仅局限于：(a)腐蚀系统，其中此专利 中的药物包括在矩阵中，例如在U.S.No.4,452,775，4,675,189，和 5,736,152中有描述(b)扩散系统，其中活性组分以由高聚物控制 的速度进入，高聚物的在U.S.No.3,854,480，5,133,974和5,407,686 中有描述。另外，泵基础上的硬件给予系统可以使用，其中一 些对于植入要适应的。

此专利由以下例子更深入地阐述，不能以为是局限于这些。 所有的在本发明中引用的参考文献(包括著作文献、发布的专 利、公布的专利申请、和正审查的专利申请)中的全部内容都 在此特别地通过引证被并入本文。

实例

材料和方法：

寡核苷酸：天然的磷酸二酯和硫代磷酸酯修饰的ODN是从 Operon Technologies(Alameda，CA)和Hybridon Specially Products(Milfordm MA)购到的。用LAL-化验的方法(LAL-assay BioWhittaker，Walkersville，MD；低检测限为0.1 EU/ml)测定ODN 得到内毒素。对于in vitro化验，ODN在TE-缓冲液(10mM Tris， pH7.0，1mM EDTA)中稀释，保存在-20℃。对于in vivo应用，ODN 在磷酸盐缓冲液(0.1M PBS，pH7.3)中稀释并在4℃下保存。所有 的稀释用的是不含热原质的试剂。

人类PBMC的分类和细胞培养：外围血液单核细胞(PBMC) 用Ficoll-Paque密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(在Hartmann et al.，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10中也有描述)从健康志愿者的外围血液中分离 的。细胞悬挂在RPMI1640培养基中，培养基中补充10％(v/v) 的热-惰性(56℃，1h)FCS(HyClone，Logan，UT)，1.5mM L-谷氨 酸盐，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(都是来自Gibco BRL， Grand Island，NY)(完全的培养基)。细胞(最后的浓度为1× 106cells/ml)是在5％CO2湿度孵化器中，37℃的条件下，在完 全培养基中培养的。ODN和LPS(来自于Salmonella typimurium， Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)或抗-IgM用作刺激剂。为了 测定人类NK细胞溶解酶的活性，PBMC在有24个井的盘中浓 度为5×106/well的条件下培养的。24小时后，培养成熟，象前 面描述的一样(Ballas etal.，1996 J.Immunol.157；1840-1845)，细 胞在抗K562目标细胞标准4小时51Cr释放化验中用作受动器。 对于B细胞繁殖，1μCi的3H胸腺嘧啶脱氧核苷在成熟之前18 小时被加入，3H胸腺嘧啶脱氧核苷的加入量是由在第5天的火 花量决定的。三个井的标准偏差小于5％。

人类PBMC上的流动血细胞计数：在灵长类的动物PBMC 上的表面抗原是用象以前描述的(Hartmann et al.，1998 J. Pharmacol.Exp.Ther.285；920-928)那样玷污上的。 CD3(UCHT1)，CD14(M5E2)，CD19(B43)，CD56(B159)，CD69(FN50) 和CD86(2331[FUN-1])的单克隆抗体是从Pharmingen，San diego， CA.购买的。IgG1，κ(MoPC-21)和IgG2b，κ(Hartmann et al.，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10)用于控制得到非特定性玷 污。NK细胞由CD56在CD3、CD14、和CD19上的表达来确 定的，其中B细胞由CD19来确定的。每个样品的10000个细 胞的流动血细胞计数数据在FACScan(Beckton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)上得到。在用于分析的 FSC/SSC门里的细胞的可育性由propidium碘化物玷污(2μg/ml) 检验的发现高于98％。数据用FlowJo计算机程序(2.5.1版本，Tree Star，Inc.，Stanford，CA)分析。

结果：

例子1：人类B细胞的依赖于CpG的刺激 依赖甲基化和ODN长度

人类PBMC是从正常的捐献者那得到的并在已知ODN系列 的已知浓度和在2×105cells/well的浓度下培养5天。如表F中 所列，人类PBMC复制以上的背景当与多种不同的CpG基元的 ODN以前培养时，但是甚至与不含任何CpG基元的ODN一起 也表现出复制。未甲基化的CpG基元在提供用这些ODN的最 佳免疫刺激中的重要性由这个事实可以看出：在浓度同样为0.6 μg/ml的条件下，ODN1840(序列号为83)诱导56,603个3H-胸 腺嘧啶脱氧核苷结合，但是同样的富含T的CpG基元甲基化(没 有CpG)的ODN，1979(序列号为：222)，诱导了较少的(但是 仍比背景多)活性(只有18,618个)。在高浓度的ODN时复制 的减少可能是人造的细胞在这种实验条件下已经精疲力竭了， 或者反应了高浓度的ODN的一些毒性。有趣的是，较短的含有 CpG基元的ODN，如13-14mers2015和2016，刺激活性较小， 虽然事实上它们的摩尔浓度实际上是较高的，因为ODN是以质 量而不是摩尔量加入的。这也证明：在ODN的免疫效果中，ODN 的长度也可能是一个重要的决定因素。没有CpG但是有少量的 富含T的ODN(大约有30％的T)，1982(序列号为225)，只导致少 量的细胞复制。

                                       表F 寡核苷酸浓度 序列号     0.15μg/ml   0.6μg/ml   2μg/ml 只有cues     648   837   799 1840(序列号为83)     5744   56,603   31,787 2016(序列号为256)     768   4607   20,497 1979(序列号为222)     971   18,618   29,246 1892(序列号为135)     787   10,078   22,850 2010(序列号为250)     849   20,741   8,054 2012(序列号为252)     2586   62,955   52,462 2013(序列号为253)     1043   47,960   47,231 2014(序列号为254)     2700   50,708   46,625 2015(序列号为255)     1059   23,239   36,119

对于人类PBMC的如上述的培养，3H-胸(腺嘧啶脱氧核)苷 结合cpm数列出。

     例子2：含有富含胸(腺嘧啶脱氧核)苷的ODN的

         人类的NK细胞的浓度依赖性的活性。

人类PBMC被培养24小时，在由两个浓度下不同CpG或 CpG ODN组成的小组的存在下，然后，测定它们的杀死NK目 标细胞的能力，象前面描述的一样(Ballas et al.，1996 J.Immunol. 157：1840-1845)。杀死力是作为细胞溶解酶的单位，或L.U.来测 定的。在这个实验中的人类志愿者有3.69L.U.的背景水平，用 正控制，IL-2时，增加到180.36L.U.。一个CpG寡核苷酸，2006 (序列号为246)，在0.6的低浓度下诱导高的NK细胞溶解酶 的功能，但是在6.0的高浓度下诱导低的NK细胞溶解酶的功 能。令人惊奇的是，富含T的ODN，其中2006CpG基元被甲 基化的(ODN为2117(序列号为358))或转化为GpC(ODN2137(序 列号为886))，在较高ODN浓度下仍然保持了强的免疫刺激功 能，就象表G中所列。这些依赖于浓度的免疫刺激效果不是硫 代磷酸酯骨架的一般性质，以为下述的实验证明：富含A的 ODN，没有高于背景水平的刺激活性。在24-碱基长的ODN中 看到一些刺激活性，其中所有碱基位是被A，C，G随机分布的， T在每个碱基位上有25％的概率(ODN2182(序列号为432))。 但是，这种24-碱基的ODN的刺激效果大大增强，如果它都 是多T基元，其中在0.6μg/ml的最低浓度下case刺激也可以 看到(ODN2183(序列号为433))。实际上，序列号为433的ODN 在低浓度下的刺激活性比不包括最佳的序列号为246的人类免 疫刺激ODN其它任何ODN在此低浓度下的刺激活性都高。实 际上，序列号为433的ODN的较高浓度比除了边界更高的强CpG ODN2142(序列号为890)外的任何其它硫代磷酸酯ODN刺激更 多NK活性。如果序列号为246的ODN的G的含量相对于T 含量通过添加更多的G的方式有所增加的话，这样造成T核苷 酸的比例下降，ODN的免疫刺激效果下降(参看ODN2132(序 列号为373))。这样一来，ODN的T含量是ODN免疫刺激效果 的一个重要决定因素。尽管多T ODN在非CpG ODN中是最有 刺激活性的，其它碱基在决定非CpG ODN的免疫刺激效果中同 样是重要的。ODN2131(序列号为372)，其中稍微多于一半的 碱基是T，并且其中没有G碱基，在浓度为6μg/ml的情况下 有免疫刺激活性的，但是比其它富含T的ODN的活性要低些。 如果ODN2131(序列号为372)中的6A被6G代替，这个ODN 的免疫刺激效果可以被增强(参看ODN2130(序列号为371))。

                       表G

用寡核苷酸过夜培养的人类PBL    MR   3605    SR   256    ％SR  7.11 受动器       0.63   1.25   2.50   5.00     10.00   20.00 ALONE        2.65   5.45   10.15  17.65    29.92   39.98                                                     3.69 +IL2(100U/ml 35.95  57.66  86.26  100.39   99.71   93.64                                                     180.36 ) +1585(0.6μ      3.75   6.10   12.14  23.70    36.06   43.98                                                     5.48 g/ml) +1585(6.0μ      15.42  31.09  47.07  73.34    94.29   97.73                                                     35.85 g/ml) +2006(0.6μ      6.71   15.99  26.92  44.75    64.12   68.83                                                     16.96 g/ml) +2006(6.0μ      6.19   8.18   16.13  24.35    39.35   56.07                                                     8.04 g/ml) +2117(0.6μ      4.54   4.73   9.56   18.04    28.57   39.85                                                     3.49 g/ml) +2117(6.0μ      7.03   10.76  16.90  30.59    52.14   59.46                                                     10.96 g/ml) +2137(0.6μ      4.61   5.35   10.04  15.16    23.79   37.86                                                     2.57 g/ml) +2137(6.0μ      7.99   10.37  16.55  32.32    49.78   60.30                                                     11.01 g/ml) +2178(0.6μ      2.88   4.52   11.47  16.05    24.85   34.27                                                     2.37 g/ml) +2178(6.0μ      4.21   5.03   11.16  16.39    28.22   36.45                                                     2.94 g/ml) +2182(0.6μ      2.42   6.57   10.49  19.73    26.55  35.30                                                      2.89 g/ml) +2182(6.0μ  4.11   7.98    14.60    26.56    40.40  51.98  7.59 g/ml) +2183(0.6μ  3.73   8.46    15.52    24.48    37.78  56.77  7.80 g/ml) +2183(6.0μ  8.86   12.89   23.08    41.49    66.26  75.85  16.57 g/ml) +2140(0.6μ  3.78   5.27    12.30    20.79    35.75  45.62  5.40 g/ml) +2140(6.0μ  6.56   13.24   21.26    37.96    60.80  3.05   14.82 g/ml) +2141(0.6μ  2.63   6.34    10.21    17.73    30.93  43.57  4.29 g/ml) +2141(6.0μ  4.98   15.30   25.22    37.88    58.47  69.12  14.83 g/ml) +2142(0.6μ  3.18   3.66    6.99     14.62    19.68  32.52  1.56 g/ml) +2142(6.0μ  7.08   15.80   25.65    41.72    68.09  73.14  17.11 g/ml) +2143(0.6μ  4.12   6.90    10.77    22.96    35.78  42.94  5.19 g/ml) +2143(6.0μ  3.16   8.40    12.38    21.69    34.80  54.21  6.64 g/ml) +2159(6.0μ  5.05   11.76   21.67    41.12    51.68  65.47  13.19 g/ml) +2132(6.0μ  4.23   6.06    10.50    18.74    32.68  44.06  4.61 g/ml) +2179(6.0μ  6.14   9.49    21.06    42.28    60.12  71.87  14.54 g/ml) +2180(6.0μ  2.37   8.57    15.44    29.66    44.35  61.31  9.47 g/ml) +2133(6.0μ  6.53   12.58   23.10    38.03    61.16  68.36  14.62 g/ml) +2134(6.0μ  7.51   12.14   21.14    32.46    54.47  67.12  12.98 g/ml) +2184(6.0μ  5.22   9.19    17.54   30.76    45.35  63.55   10.42 g/ml) +2185(6.0μ  8.11   14.77   26.27   40.31    55.61  70.65   15.60 g/ml) +2116(6.0μ  5.58   10.54   16.77   37.82    59.80  66.33   13.07 g/ml) +2181(6.0μ  4.43   9.85    17.55   27.05    53.16  69.16   11.43 g/ml) +2130(6.0μ  3.81   8.07    17.11   27.17    2.04   53.73   8.27 g/ml) +2131(6.0μ  2.29   6.73    7.30    18.02    32.73  49.06   5.08 g/ml) +2156(0.3μ  2.50   5.26    8.20    15.95    26.64  33.07   2.31 g/ml) +2156(1.0μ  5.91   10.99   17.31   26.97    50.64  63.78   10.84 g/ml) +2157(0.3μ  2.36   4.00    6.65    12.94    24.13  38.86   2.58 g/ml) +2157(1.0μ  3.72   9.55    17.15   34.55    52.27  65.33   11.58 g/ml) +2158(0.3μ  1.25   2.36    6.90    16.39    15.63  29.82   1.17 g/ml) +2158(1.0μ  4.73   7.26    11.07   15.55    30.80  43.71   4.16 g/ml) +2118(0.3μ  1.55   3.38    6.85    13.36    20.15  27.71   1.13 g/ml) +2118(1.0μ  2.65   3.88    9.29    12.19    22.47  28.99   1.34 g/ml)

例子3：由富含T的非CpG ODN引起的B细胞的复制

为了评价富含T的ODN的活化B细胞复制的能力，人类 PBMC被细胞质的染CSFE所着色，在已知ODN的浓度为0.15 或0.3μg/ml的条件下培养5天，然后，由流动血细胞计数分析。 B细胞通过检测对线性制造者CD19有正作用的细胞而确定的。 CpG2006是B细胞复制的强诱导剂，并且这种效果被减弱，象 图1上所示当ODN的浓度为0.3μg/ml如果CpG基元被甲基化 或转化为GpC的话。ODN中的碱基组成在决定免疫刺激效果中 显得很重要。减少ODN中的T的含量显著降低了免疫刺激效果， 由ODN2177(序列号为427)可以例证，其中ODN2137(序列 号为886)中的多T的6位被换成A，结果导致免疫刺激效果 的显著减少。T在免疫刺激效果中的重要性也可由ODN2116(序 列号为357)和2181(序列号为431)的对比看出，它们在ODN 的3位末端不同。其中3位末端为多T的ODN2181比3位末 端为多C的ODN2116有多的刺激活性，尽管这两个ODN的5 位末端都是TCGTCG。

例子4：由TG寡核苷酸诱导的B细胞的复制

TG基元的刺激效果在图2中已示。ODN2137与ODN2006 有相同的碱基组成，但是CG基元全部换成了GC基元，结果是 形成了不含CG的核酸。然而ODN不含6TG双核苷酸。在 ODN2177中，所有的ODN2137的TG双核苷酸都变成了AG。 尽管ODN2177中只含有6个腺嘌呤，在浓度为0.2μg/ml的时 候事实上它没有刺激活性。作为对比，有24个碱基长的ODN， 其中每个位置都由四种碱基中的任何一个随机占据 (ODN2182)，在浓度为0.2μg/ml的时候诱导了B细胞中的12 ％复制。这些结果表明：ODN2137的刺激效果并不简单地是硫 代磷酸酯骨架的作用，而且与TG双核苷酸的存在有关。

为了确定不同数目的TG双核苷酸基元的影响，ODN2200 和ODN2202进行了比较，如图2所示。两个ODN都含有18个 T和6个G，但是在ODN2200中所有的G都是相连的，因此， 只有一个TG双核苷酸，但是在ODN2202中，G作为GG双核 苷酸在ODN中分散的，因此有三个TG。ODN2202比ODN2200 有明显高的刺激活性，与模型中的为了获得最佳的刺激活性至 少在ODN中含有三个TG基元相一致的。如果TG基元象这里 讲的一样优化的话，甚至更高的刺激活性也是可以获得的。

         例子5：TTG对TTG基元的影响

图3表示了为了根据T对G的相对含量来研究TG含量的 实验结果，因为TG含量与ODN的刺激效果有关。图中显示： 所有碱基都随机地是T或者G(ODN2188(序列号为905))的 ODN在浓度为0.2μg/ml的时候没有刺激活性，这与所有碱基 都随机地是A或者G(ODN2189(序列号为906))的ODN相 似。但是，在较高的浓度2μg/ml时，随机分布T/G的ODN2188 明显地有较多的刺激活性。后者的刺激活性仍然比整个随机的 ODN(ODN2182(序列号为432))的产生的刺激活性低。在低 浓度下的最高的刺激活性在其中的一半碱基是T并且另外一半 碱基是T或G的随机分布的ODN(ODN2190(序列号为907)) 中看到。因为每一个其它碱基固定为T，就没有任何TG基元。 在图3中的数据表明：提高ODN中的TG含量可以提高它的没 有活性。

在仍然是其它的实验中，在此没有画出其结果，ODN2190 (序列号为907)表现出与ODN2188(序列号为905)或ODN2189 (序列号为906)相比的刺激NK的活性。

例子6-8

介绍：

以上，我们证明多T相连能够提高B细胞和NK细胞的刺 激。这里和下文中，我们将研究不同的非CpG富含T的和多C 的ODN的效果，为了得到它们刺激人类B细胞、NK细胞和单 核细胞的能力。

物质和方法：

寡核苷酸：硫代磷酸酯修饰的ODN从ARK Scientfic GmbH (Darmstadt，Germany)购得。用的系列有：1982：5’- tccaggacttctctcaggtt-3’(序列号为225)，2006：5’- tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’(序列号为246)，2041：5’- ctggtctttctggtttttttctgg-3’(序列号为282)，2117：5’- tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3’(序列号为358)，2137：5’- tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3’(序列号为886)，2183：5’-ttttttttttttttttttttt-3’ (序列号为433)，2194：5’-ttttttttttttttttttttttttttt-3’(序列号为911)， 2196：5’-tttttttttttttttttt-3’(序列号为913)，5126：5’- ggttcttttggtccttgtct-3’(序列号为1058)，5162：5’- tttttttttttttttttttttttttttttt-3’(序列号为1094)，5163：5’- aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(序列号为1095)，5168：5’- cccccccccccccccccccccccccccccc-3’(序列号为1096)，和5169：5’- cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3’(序列号为1097)。绝大部分 ODN用这里也描述的LAL测定(BioWhittaker，Belguium)(最低 检测限为0.1EU/ml)测定LPS含量。对于所有的测定，ODN都 是在TE缓冲液中稀释并在-20℃下保存。所有的稀释液都是用 没有热原质的试剂传导的。

细胞制备和细胞培养：人类PBMC被从健康的志愿者的外 围血液中分离的，由德国红十字得到(Ratingen Germany)，象 在例子1中描述的那样，但是所有的材料都是从Life Technologies， 德国购得的，和经过内毒素测定的。对于B细胞，NK细胞和 单核细胞活性测定，PBMC在完全的培养基中培养的，在37℃ 下，在加湿器里的96圆底盘的200μl里，浓度为2×106cells/ml。 不同的ODN、LPS(Sigrma)、或IL-2(R&D Systems，USA)被用作 刺激物。在确定的时间点，细胞成熟以用于流体细胞计数器。

流体细胞计数器：用于着色抗原表面的Mabs有：CD3、 CD14、CD19、CD56、CD69、CD80和CD86(都是从 Pharminggen/Becton Dickinson，Germany得到的)。对于单核细胞 Fc接受器用人类IgG(Myltenyi，Germany)阻碍就象前面所述的 一样(Bauer，M et al.1999 Immunology 97：699)。特定的亚群落(B 细胞、单核细胞、NK细胞、NKT细胞或T细胞)的至少1000 个细胞流体细胞计数器数据可以在FACSCalibur(Becton Dickinson)上得到。数据用CellQuest程序(Becton Dickinson) 进行分析。

NK调节的细胞毒素：PBMC在有/无6μg/ml ODN或100U/ml IL-2在37℃，5％CO2的条件下过夜培养的。第二天早上，K- 562目标细胞被荧光染CFSE做上标记，就如前面所述的对于人 类B细胞进行的一样(Hartmann，G.，and A.M.Krieg.2000 J. Immunol.164：944)。PBMC以不同的比例(50∶1，25∶1和12.5∶1)被 加入到2×105个目标细胞并在37℃下培养4小时。细胞被收获 并用DNA特定的&-AAD(Pharmingen)孵化目的是检测apoptotic 细胞。结果是被流体细胞计数器检测的。

ELISA：PBMC(3×106cells/ml)在特定浓度的ODN或LPS 下培养24小时(IL-6，IFNγ和TNFα)或8小时(IL-1β)，在37℃ 加湿条件下和在含有48井的盘上培养的。依照制造草案，浮在 表面的物质被收集并且细胞液用OPTeia ELISA Kits(Pharmingen) 检测IL-6，IFNγ和TNFα或者Elipair ELISA测定(Hoelzel， Germany)得到IL-1β。

例子6：由不含CpG基元的ODN诱导的B细胞活性

在上述的例子3中实验中，我们证明：富含T的ODN能够 活化B细胞。这里我们用另外的ODN和不同的细胞和试剂来源 拓展了那些研究。在实验的第一阶段，我们比较了不同的非CpG 富含T的ODN的活性能力与已知的能力很强的CpG ODN2006 (序列号为246)。血液志愿者(n＝2)的PBMC(2×106cells/ml) 在确定浓度的ODN2006(序列号为246)、2117(序列号为358)、 2137(序列号为886)、5126(序列号为1058)、和5162(序列 号为1094)的条件下被孵化。细胞象上述的那样在37℃下孵化 48小时，并且被mAb着色以得到CD19(B细胞制造者)和CD86 (B细胞活性制造者，B7-2)。表达由液体细胞计数器测定。

用不同浓度的ODN，我们示出(图4)：富含T没有CpG 基元的ODN能够诱导人类B细胞的刺激作用。ODN5126(序 列号为1058)只含有一个多T系列但是含有多于50％的T，它 能够导致人类B细胞的高活性。尽管与序列号为246的ODN (如，T/G的含量多于80％)有一些相似性，这个ODN显然缺 乏任何已知的免疫刺激CpG基元。令人惊奇的是，对于所有测 试的富含T的ODN，在浓度为3和10μg/ml的范围内得到最 高的刺激系数。测试的ODN的最高的刺激系数在CpG/富含T 的ODN序列号为246的浓度为0.4μg/ml下得到。有趣的是， 在高浓度下活性下降。

多A、多C和多T系列被合成并测试了生物活性。一个有 代表性的捐献者(n＝3)的PBMC(2×106cells/ml)象上述的一样被 0.4μg/ml、1.0μg/ml或10.0μg/ml等不同浓度的下述ODN刺 激：2006(序列号为246)、2196(序列号为913)(多T，18个 碱基)、2194(序列号为911)(多T，27个碱基)、5162(序列 号为1094)(多T，30个碱基)、5163(序列号为1095)(多A， 30个碱基)、5168(序列号为1096)(多C，30个碱基)和5169 (序列号为1097)(多CG，30个碱基)。活性制造者CD86(B7 -2)在CD19-正的B细胞上的表达由流体细胞计数器测定。

图5表明：至少对于多T的ODN，系列的长度对它的活性 有重要的影响。至少含有18个碱基(序列号为913)的多T系 列比含有27个碱基(序列号为911)或含有30个碱基(序列号 为1094)的ODN的刺激活性低，即有一个明显的刺激序列： 序列号1094＞序列号911＞序列号913。多A(序列号为1095) 或多CG(序列号为1097)的序列，相反，不诱导人类B细胞 的活性。令人惊奇的是，又发现：多C序列(序列号为1096) 至少在高浓度下(10μg/ml)能够活化人类B细胞(图5)。

两个其它富含T的ODN，命名是1982(序列号为225)和 2041(序列号为282)缺少CpG基元被测试在人类B细胞上的 效果。PBMC(n＝2)用确定浓度的ODN2006(序列号为246)，1982 (序列号为225)和2041(序列号为282)孵化，象上述的一样。 B细胞活性(活化制造者CD86的表达)用流体细胞计数器测定。

图6表明：富含T的非CpG的ODN在浓度高于1μg/ml 时有免疫刺激活性。CpG基元加入到1982中提高了免疫刺激活 性。将多T序列加长，并不能够提高这个已经是富含T的ODN 的免疫刺激活性，相反，轻微地减少了活性能力。

例子7：非CpG的ODN的免疫刺激活性在NK活性、

      NK细胞毒素和单核细胞活性中得到反应

不仅单核细胞而且NK细胞测试了它们对于非CpG的ODN 的反应。PBMC(2×106cells/ml)在浓度为6μg/ml的下列ODN (n＝4)存在下孵化：2006(序列号为246)、2117(序列号为358)、 2137(序列号为886)、2183(序列号为433)、2194(序列号为 911)、和5126(序列号为1058)。在37℃下培养24小时后，它 们被收获并被mAb着色以获得CD3(T细胞制造者)、CD56(NK 细胞制造者)、和CD69(早期的活性制造者)，就象上述的一样。 CD69在CD56-正的NK细胞上的表达由流体细胞计数器测定。

图7显示：对于多T ODN可以观察到与图5中描述相似的 效果。象B细胞一样的NK细胞的刺激可以被ODN的长度影响。 ODN2183(序列号为433)(21个碱基)诱导NK细胞的活性， 但是比较长的ODN2194(序列号为911)的强度要低，与由早 期活性制造者CD69的表达的提高测定的一样。ODN5126(序 列号为1058)也表明能够活化人类NK细胞(如7)。

人们相信：CpG ODN的抗瘤活性能够被ODN在体外提高 NK-调节细胞毒素的能力来评估。在5’和3’末端有多G序列 的ODN表明可以导致最高的细胞毒素诱导能力(Ballas，Z.K.，et al.1996 J.Immunol.157；1840)。为了研究非-CpG的富含T的ODN 在NK细胞毒素上的影响，我们分析了ODN 2194(序列号为 911)和5126(序列号为1058)在NK-调节的消散上的影响(图 8)。K-562目标细胞的NK-调节消散在PBMC过夜的孵化后 被测定，PBMC是用浓度为6μg/ml的下列ODN孵化的： ODN2006(序列号为246)、序列号为911(序列号为911)(多 T，27个碱基)和5126(序列号为1058)就象上述的一样。序 列号为1058的ODN与序列号为911的ODN相比表现出少量的 人类NK细胞的消散的增加；序列号为246提高人类NK细胞 的细胞毒素到更高的强度。

前面的报道表明：不仅NK细胞而且NKT细胞都是对于瘤 细胞的细胞毒素的反应的调节者(14)。因此，我们用富含T的 非CpG的ODN研究了人类NKT细胞的潜在的活性。一个具有 代表性的捐献者(n＝2)的PBMC在浓度为6μg/ml的下列ODN 存在下孵化24小时的：ODN 2006(序列号为246)、2117(序 列号为913)、2137(序列号为886)、2183(序列号为433)、2194 (序列号为913)和5126(序列号为1058)，如上述。NKT细 胞的活性是在细胞被mAb着色为得到CD3(T细胞制造者)、 CD56(NK细胞制造者)、和CD69(早期的活性制造者)后由 流体细胞计数器测定的。在CD3和CD56双-正细胞(NKT细 胞)上的CD69的表达被给出。

在图9中，序列号为911和序列号1058发现能够刺激NKT 细胞。与NK细胞相似，序列号911(多T)比序列号1058的 活性高。另外，象上述的对于B细胞和NK细胞，ODN的长度 对免疫刺激能力有一定的影响，较长的ODN在NKT细胞上有 较强的效果。相似的结果对于人类T细胞也有观察到。

在与感染斗争中用的免疫系统的其它类型的细胞是单核细 胞。这些细胞在活性上释放出多种细胞液并且成熟进入专业上 抗原存在的细胞的枝状细胞(DC)(Roitt，I.，J.Brostoff，and D.Male 1998.Immunology.Mosby，London)。图10表明用不同的ODN 培养的PBMC之后的人类单核细胞的活性。PBMC(2×106cells/ml) 在浓度为6μg/ml的下列ODN(n＝3)存在，37℃和过夜的条件 下如上述的过程孵化：ODN2006(序列号为246)、2117(序 列号为913)、2137(序列号为886)、2178(序列号为1096)、2183 (序列号为433)、2194(序列号为913)、5126(序列号为1058) 和5163(序列号为1095)。细胞被收获并且着色以得到CD14(单 核细胞制造者)、CD80(B7-1，活性制造者)。表达由流体细 胞计数器测定的。

象上面对于NK和B细胞表明的一样，不同长度的富含T 的序列(如序列号为433，序列号为911)诱导单核细胞刺激但 是有不同的活性水平：如序列号433＞序列号911。多A(序列 号为1095)和多C(序列号为1096(2178)序列，相反，不能够 导致单核细胞的活化(有CD80在浓度为6μg/ml ODN时的上 调节测定的)。

例子8：由非CpG ODN诱导的细胞液释放

接下来，不同富含T的ODN影响细胞液环境的能力被测定 了。PBMC在有或无6μg/ml的确定的ODN或1μg/ml的LPS 作为正控制(n＝2)时被培养24小时。孵化后，浮在表面的物 质被收集并且TNFα用上述的ELISA检测，结果如图11所示。 PBMC在确定的ODN(1.0μg/ml)情况下被培养，如图11所 描述。IL-6在浮在表面的物质中被ELISA检测，结果如图12 所示。

图11和图12表明：富含T的非CpG和富含T/CpG的ODN 能够诱导预-发炎细胞液TNFα和IL-6的分泌。对于这两种细 胞液，发现ODN5126(序列号为1058)在绝大多数测定中与 ODN2194(序列号为911)有同样的能力。已知：CpG ODN通 过优先诱导Th1细胞液的方式影响Th1/Th2平衡(Krieg，A.M. 1999 Biochemical et Biophysica Acta 93321：1)。为了验证富含T 的ODN是否导致Th1细胞液的转移，在PBMC中的IFNγ产 物被测定。在实验的第一阶段，表明：象对IL-6和TNFα一 样，ODN序列号为1058和序列号为911诱导了与这种Th1细 胞液的相当的量的IFNγ的释放。另外，证明：其它预-发炎 的细胞液，IL-1β在PBMC与这两种ODN的培养中被释放。 尽管这些由富含T的缺乏CpG基元的ODN诱导的细胞液比当 CpG ODN序列号为246的应用时少，由富含T的ODN诱导的 量显著地比控制的要高。

例子9-11

介绍：

对于非啮齿脊椎动物体内的免疫系统活性最佳的CpG基元 在此被描述。含有此基元的磷酸二酯寡核苷酸被发现能够很强 地刺激CD86、CD40、CD54和MHC II表达、IL-6合成和主 要的人类B细胞的复制。这些效果要求寡核苷酸内在化和内部 的成熟。这种CpG基元与NFκBp50/p65异核二聚物和复制因 子复合物活化蛋白-1(AP-1)的持续诱导有关。有CpG DNA 活化的复制因子被增加的压力激酶c-junNH2末端激酶(JNK)和 p38的磷酸化作用，和活化复制因子-2(ATF-2)的增加的磷酸化 作用所推进。与CpG不同，通过B细胞接受器发的信号导致细 胞外的接受激酶(ERK)的活化并导致不同的同型的JNK的磷 酸化。

材料和方法：

寡核苷酸：没有修饰的(磷酸二酯，PE)和修饰的抗核酸酶(硫 代磷酸酯，PS)ODN从Operon Technologies(Alameda，CA)和 Hybridon Specialty Products(Milford，MA)购得。所用的序列在表 H中列出。E.coli DNA和小牛胸腺DNA从Sigma Chemical Co.， Louis，MO购得。基因组DNA样品通过用苯酚-氯仿-异戊基 醇(25/24/1)抽提和乙醇沉淀得到纯化。DNA用氚核x-114(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)反复抽提的方法从内毒素纯化得 到，并用LAL-测定(LAL-assay BioWhittaker，Walkersville，MD； 最低检测限是0.1EU/ml)和以前描述过对于内毒素的高敏感性 测定(最低检测限为0.0014EU/ml)(Hartmann G.，and Krieg A.M. 1999)来测试内毒素。CpG DNA和LPS诱导在人类单核细胞中 独特的活化特征(Gene Therapy 6：893)。DNA样品中的内毒素含 量低于0.0014U/ml。E.coli和小牛胸腺DNA用之前煮沸10min 然后在冰上冷却5分钟被制成单链的。DNA样品用无热原质的 试剂稀释在TE-缓冲液中。

             表H：所用寡核苷酸组1

        名称(序列号)序列5’到3’ 开始序列    PE 2079(320)  T CG A CG TTC CCC CCC CCC CC 中间碱基    PE 2100(341)  TCG GCG TTC CCC CCC CCC CC

        PE 2082(323)  TCG CCG TTC CCC CCC CCC CC 人类CpG基元 PE 2080(321)  TCG TCG TTC CCC CCC CCC CC 5’侧面碱基 PE 2105(346)  GCG TCG TTC CCC CCC CCC CC

        PE 2107(348)  ACG TCG TTC CCC CCC CCC CC

        PE 2104(345)  CCG TCG TTC CCC CCC CCC CC 3’侧面碱基 PE 2098(339)  TCG TCG CTC CCC CCC CCC CC

        PE 2099(340)  TCG TCG GTC CCC CCC CCC CC

        PE 2083(324)  TCG TCG ATC CCC CCC CCC CC 第一CpG删除 PE 2108(349)  CTG T CG TTC CCC CCC CCC CC 第二CpG删除 PE 2106(347)  T CG TCA TTC CCC CCC CCC CC 甲基化      PE 2095(336)  TZG TZG TTC CCC CCC CCC CC

        PE 2094(335)  TCG TCG TTC CCC CCC ZCC CC 2080的非CpG PE 2078(319)    TGC TGC TTC CCC CCC CCC CC 控制

        PE 2101(342)    GGC CTT TTC CCC CCC CCC CC 2080的PS形  PS 2116(357)    T CG T CG TTC CCC CCC CCC CC 式 添加CpG基元 PE 2059(300)    T CG T GG TTT TGT  CGT TTT GT C

                        GTT 最好的PS    PE 2006(246)    T CG T CG TTT TGT  CGT TTT GT C

                        GTT 甲基化的2006PE 2117(358)    TZG TZG TTT TGT ZGT TTT GTZ

                        GTT

1PE，磷酸二酯；PS，硫代磷酸酯；粗体，碱基变换；粗 体Z，甲基化胞啶；下划线，CpG双核苷酸。

细胞制备和细胞培养：人类外围血液单核细胞(PBMC)是从 健康的志愿者的外围血液中用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离 得到的(Histopaque-1077，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)象 (Hartmann G.，et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：291)) 描述的一样。细胞悬挂在RPMI1640培养基中，培养基中补充 10％(v/v)的热-惰性(56℃，1h)FCS(HyClone，Logan，UT)，1.5mM L-谷氨酸盐，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(都是来自Gibco BRL，Grand Island，NY)(完全的培养基)。所有化合物购买时都 做过内毒素-测定。在与ODN孵化之前和之后都用trypan蓝色 排除法(传统的显微镜方法)或propidium碘化物排除法(流 体血细胞计数分析)测定发育能力。在所有的实验中，96％到99 ％的PBMC是可生育的。细胞(最终浓度为1×106cells/ml)在 完全培养基中并在5％CO2加湿的孵化器和37℃的条件下培养 的。不同的核苷酸(参见表1，在图例中确定的浓度)，LPS(来 自沙门氏菌typhimurium，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO) 或抗-IgM用作刺激剂。氯喹(5μg/ml；Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)用于阻碍内部的成熟/酸化。在确定的时间点，细胞 如下描述的被收获。

对于信号传送的研究，人类主要B细胞由应用象制造商描 述的那样的VARIOMACS技术(Miltenyibiotec Inc.，Auburn，CA) 的免疫磁场细胞分类进行分离的。间而言之，从健康的血液志 愿者(Elmer L.DeGowin Blood Center，University of Iowa)的缓 冲套得到的PBMC与CD19的微球抗体存在下孵化并通过正选 择柱子。B细胞的纯洁度高于95％。刺激后，为信号传导研究 的整个细胞的提取物(Western Blot)和核的提取物(EMSA) 制备好。

对于CpG粘合蛋白的研究，Ramos细胞(人类Burkitt淋巴 瘤B细胞线，ATCC CRL-1923或CRL-1596；Intervirology 5：319-334，1975)在完全的培养基中生长。没有处理的细胞收获并 胞液蛋白提取物制备了和用如下述的EMSA和UV-交叉联结 分析了CpG寡核苷酸粘合蛋白是否存在。

流体血细胞计数器：表面抗原的着色如前面述的那样进行 (Hartmann G.Et al.1998 J Pharmacol Exp Ther 285：920)。HLA -DR单克隆的抗体是从Immunotech，Marseille，France买到的。 所有其它抗体从Pharmingen，San Diego，CA购得的如：MABs到 CD19(B43)，CD40(5C3)，CD54(HA58)，CD86(2332(FUN-1))。IgG 1，κ(MOPC-21)和IgG2b，κ被用来控制梯度的着色。细胞内的细胞 液为得到IL-6的着色象文献(Hartmann G.，and Krieg A.M.1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes，Gene Therapy 6：893)  描述的那样进行。简而言之， PBMC(最终的浓度为1×106cells/ml)在brefeldinA(最终的浓 度为1μg/ml，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)存在的情况下 孵化的。孵化之后，细胞被收获并用对CD19 FITC标记的mAB、 PE标记的鼠抗人类IL-6mAB(MQ2-6A3，Pharmingen)和Fix和 Perm Kit(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)着色。每个样品的 10000个细胞的流动血细胞计数数据在FACScan(Beckton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)上得到。不育 细胞用propidium碘化物着色(2μg/ml)从分析中排除。数据 用FlowJo计算机程序(2.5.1版本，Tree Star，Inc.，Stanford，CA)分 析。

复制测定：CFSE(5-(和6-)羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚 胺酯，Molecular probes，USA)是荧光素的衍生的细胞内的荧光 标签，分裂的话，这个标签被在子细胞中均分。在混合细胞悬 挂中，有CFSE的细胞的着色允许复制细胞的量化和免疫显形 (藻红蛋白标记的抗体)。简单地说，PBMC在PBS中洗两次， 在含有最终浓度为5μg/ml的CFSE的PBS中再悬挂，在37℃ 下孵化10分钟。细胞用PBS洗三遍，并在确定的图例中所示的 一样孵化5天。复制CD19-正的B细胞用流体血细胞计数器检 测到的CFSE含量的减少来确定的。

整个细胞、核和胞液提取物的制备：对于Western Blot分 析，整个细胞提取物被准备。主要的B细胞用培养基、浓度为 30μg/ml的磷酸二酯寡核苷酸2080(序列号为321)或2078(序 列号为319)、或抗-IgM(10μg/ml)来处理。细胞收获、用含有 1mMNa3VO4的冰水冷却的PBS洗两次，在消散缓冲液(150mM NaCl，10mM TRIS pH7.4，1％ NP40，1mMNa3VO4，50mM NaF，30 mg/ml leupeptin，50mg/ml aprotinin，5mg/ml antipain，5mg/ml pepstain，50μg/ml苯基甲基磺酸基氟化物(PMSF))中再悬挂， 在冰上孵化15分钟，并且以每分钟14000转的速度旋转10分 钟。浮在表面的物质在-80℃是冻结。为了核提取物的准备，主 要B细胞在低渗的缓冲液(10mM HEPES/KOH(pH7.9)，10mM KCl，0.05％ NP40，1.5mM MgCl2，0.5mM dithiothreitol(DTT)，0.5 mM PMSF，30mg/ml leupeptin，50mg/ml aprotinin，5mg/ml antipain，5mg/ml pepstain)中再悬挂。在冰上孵化15分钟后， 悬挂物以1000xg被离心5分钟。成小球的核子在提取缓冲液 (20mMHEPES(pH7.9)，450mM NaCl，50mM NaF，20％丙三醇，1 mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF，30mg/ml leupeptin，50mg/ml aprotinin，5mg/ml antipain，5mg/ml pepstain) 中再悬挂，并且在冰上孵化1小时。核悬挂在16,000g和4℃ 的条件下被离心10分钟。浮在上面的物质被收集并储存在80℃ 的条件下。用作粘合蛋白研究的胞液提取物从未受刺激的Ramos 细胞中准备的，这种细胞在低渗的缓冲液中溶解，就象对于核 提取物准备一样。离心后，浮在上面的物质作为细胞质部分除 去并保存在-80℃。蛋白浓度用依照制造者的Bradford蛋白测定 方法(Bio-Rad，Hercules，CA)来测定。

西部印迹分析：等浓度的整个细胞蛋白的提取物(25μ g/lane)在SDS样品缓冲液(50mM Tris-Cl，pH6.8；1％β-巯基 乙醇；2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％丙三醇)中煮沸4分钟，之 后在10％的含有0.1％ SDS(SDS-PAGE)多芳基胺凝胶上电 泳。电泳后，蛋白转移到止动剂-P转移膜上(Millipore Corp. Bedford，MA)。印迹被5％非脂肪干奶妨碍了。抗细胞外的接受 器激酶的磷酸化形式、c-jun NH2-末端激酶(JNK)，p38和活化复 制因子-2(ATF-2)的抗体被应用(New England BioLabs， Beverly，MA)。依照制造商推荐的过程，印迹在提高的化学发光 试剂中得到发展(ECL；Amersham International，Aylesbury， U.K.)。

电泳迁移率位移测定(EMSA)：为了测定复制以资活化物 蛋白-1(AP-1)和NFκB的DNA-粘合活性，核提取物(1 μg/lane)被EMSA分析，其中EMSA中用含有AP-1粘合序 列的dsODN5’GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3’(序 列号为838)，和来自c-myc启动子区域5’TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3’(序列号为1142)的NFκ BURE，作为探针。ODN末端被T4-多(聚)核苷酸激酶(New England Biolabs)和(γ-32P)ATP(Amersham，Arlington Heights，IL) 标记。粘结反应实现用以下物质：在DNA-粘结缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)中的1μg核蛋白提取物，40mM MgCl2，20 mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，8％丙三醇和100-400ng的有 20.000-40.000cpm标记的ODN的聚(dI-dC)，整个体积共10μl。 NFκB带(bands)的特定性被竞争性研究所证实，研究中用了 来自于无关的复制因子粘结点的冷寡核苷酸(10-100ng)。对于 超级位移的测定，在放射标记的探针被加入之前，2μg的对于 c-Rel、p50、和p65特定的抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.， Santa Cruz，CA)被加入到反应混合物中30分钟。在室温下孵化 30分钟后，载入缓冲液被加入，探针在tris-硼酸盐-EDTA流动 缓冲液(90mM Tris，90mM硼酸，2mM EDTA，pH8.0)中的6％ 聚丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶被干燥，然后再被放射能照像。

UV-交叉联结(crosslinking)和变性蛋白电泳：就象对于EMSA 描述的一样，核提取物用标记的磷酸二酯寡核苷酸孵化。DNA- 蛋白复合物与UV-光在Stratalinker(Stratagene)交叉联结10分 钟。探针与SDS-样品缓冲液混合在一起，煮沸10分钟并负载 到7.5％的SDS-PAGE上。凝胶在Whatman纸上干燥并被放射 能照像。将位移对制造蛋白的分子量作图得到标准曲线，这个 曲线用于计算交叉联结的蛋白-ODN复合物的近似分子量。寡核 苷酸的分子量被从这个值中减去，给出大小(give the size)。

      例子9：单独使用或与富含T的ODN合用的

               最佳CpG基元的确定

含有鼠科CpG基元GACGTT(序列号为1143)的硫代磷酸酯 寡核苷酸(例如1826(序列号为69))，在鼠科B细胞中是活化的 浓度下使用(Yi A.K.，Chang M.，Peckham D.W.，Krieg A.M.，and Ashman R.F.1998.CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry.J Immunol 160：5898)，已经表明在人类免疫细胞上有很小 的或没有免疫刺激活性。发现在较高的浓度下这种ODN在人类 B细胞上表现出促进效果。

在以前的鼠中B细胞的研究中，发现侧面有两个5’嘌呤和 两个3’嘧啶并且优选的是5’GACGTT 3’(序列号为1143)的CpG 双核苷酸对于磷酸二酯寡核苷酸活化是最佳的(Krieg A.M.，et al.1995 Nature 374：546，Yi A.K.，Chang M.，et al..1998 J Immunol 160：5898)。

为了确定对于刺激人类和非啮齿类脊椎动物的免疫反应的 最佳基元，我们设计了一系列的ODN并测定了它们的活性。首 先，我们设计了一个20mer磷酸二酯寡核苷酸，这个磷酸二酯 寡核苷酸在5’末端有TC双核苷酸，之后有最佳的鼠科CpG基 元5’GACGTT3’(序列号为1143)，之后又有一个多C尾巴(2079： 5’TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC3’(序列号为320))。如果在 对于E.Coli DNA最佳条件(在0小时、4小时和18小时重复加 入；每个时间点30μg/ml)同样的条件下加入到人类主要B细胞 中，两天后，这个寡核苷酸在人类主要B细胞上刺激了高的CD86 表达。为了确定CpG基元的基元与功能的关系，我们将邻近CpG 双核苷酸的碱基替换了，但是在序列中保持这两个CpG双核苷 酸。将位于两个CpG双核苷酸之间的腺嘌呤换为胸腺嘧啶脱氧 核苷(2080(序列号为321))导致稍微高些的活性。在这个位置换 为鸟嘌呤核苷(2100(序列号为341))或胞啶(2082(序列号为323)) 与2079(序列号为320)相比没有大的变化。相反，将第二个CpG 双核苷酸的3’位胸腺嘧啶脱氧核苷换为嘌呤鸟嘌呤核苷 (2099(序列号为340))或腺嘌呤(2083(序列号为324))导致寡核苷 酸活性的大幅度下降，但是嘧啶胞啶只导致小的下降。与第一 个CpG双核苷酸相邻的胸腺嘧啶脱氧核苷也很重要。将此胸腺 嘧啶脱氧核苷替换为任何其它碱基(2105(序列号为346))，鸟嘌 呤核苷；2107(序列号为348)，腺嘌呤；2104(序列号为345)，胞啶) 导致寡核苷酸活性的显著下降。第一个CpG双核苷酸的除去 (2108(序列号为349))或第二个CpG双核苷酸的除去(2106(序列 号为347))也部分减少了活性。

添加多的5’GTCGTT3’(序列号为1144)CpG基元到含有8mer 双重CpG基元的磷酸二酯寡核苷酸(5’TCGTCGTT3’(序列号为 1145)，2080(序列号为321))上并没有进一步提高CD86在B细胞 (2059(序列号为300))上的表达。与2080(序列号为321)有相同序 列但是有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸在上面的背景中不表现出 活性(2116(序列号为357))。这很令人惊讶，因为硫代磷酸酯骨 架曾经被报道过能够使寡核苷酸极其稳定并很大程度地提高 CpG诱导的刺激活性(Krieg A.M.，Yi，A.K.，Matson S.， Waldschmidt T.J.，Bishop G.A.，Teasdale R.，Koretzky G.A.，and Klinman D.M.1995.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B- cell activation.Nature 374：546)。因此，我们对含有 5’GTCGTT3’(序列号为1144)和5’TCGTCGTT3’(序列号为1145) 基元的硫代磷酸酯寡核苷酸的基元与功能进行了更深入的分析 研究，研究表明：添加的CpG基元(2006(序列号为246))趋向于 提高硫代磷酸酯寡核苷酸的活性。

用免疫磁性细胞分类方法从外围血液中分离得到的纯化B 细胞被CpG DNA活化到与PBMC中未纯化的B细胞一样的程 度。这样一来，B细胞的活化是主要反应而不是由其它细胞分 泌的细胞液导致的第二效果。

除了共-刺激负载CD86外，B细胞的功能性阶段被其它表 面制造者所特征化。例如，被活化的助细胞刺激B细胞通过CD40 绑(ligation)，细胞内的附着分子-1(ICAM-1，CD54)作为媒介粘 结到其它免疫细胞上，和主要的组织相容性复合物II(MHC II) 负责抗原的表达。我们发现：CD40、CD54、和MHC II的B细 胞表达被CpG寡核苷酸2080(序列号为321)上调节 (upregulated)。非CpG控制的寡核苷酸2078(序列号为319)与 介质单独相比表现不出活性。

当PBMC在2080(序列号为321)存在的情况下孵化5天(在 0小时、4小时、18小时、和每个连续的早晨添加)，有趣的是： 淋巴细胞的亚群落在细胞大小(size)(FSC)内增加了并变得更多 的粒状(SSC)。为了检验这种亚群落是否表现了B细胞的复制， 我们在0天将刚分离的PBMC上着色(stain)CFSE(5-(和-6-)羧基 荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯)并且用2080(序列号为321)孵化它 们5天，如上述。CFSE是与细胞蛋白不可逆地粘合在一起的 荧光分子。每次细胞的分裂将减少CFSE色度到50％。低的CFSE 着色的细胞(复制细胞)发现主要是CD19-正B细胞。寡核苷酸 2080(序列号为321)在5天内诱导60到70％的CD19正B细胞 产生复制。控制寡核苷酸2078(序列号为319)诱导少于5％的B 细胞产生复制。复制B细胞(CFSE低)表现出较大的细胞(FSC) 和较高的粒状。

复制的B细胞表达出比没有复制的细胞(没有给出)更高 的CD86量。与这个发现一致，上述的为了诱导CD86表达的实 验的寡核苷酸组导致了几乎同样的B细胞复制的模式。3’位胸 腺嘧啶脱氧核苷被替换比替换中间位置的胸腺嘧啶脱氧核苷更 能减少活性。

例子10：B细胞活化需要内部成熟/酸化

以前表明：氯喹，是一种内部酸化的抑制剂，阻止有鼠科 抗原存在的细胞和B细胞的CpG调节的刺激作用，但是不影响 LPS调节的效果(Hacker H.，et al 1998 Embo J17：6230，Yi A.K.et al 1998 J Immunol 160：4755，Macfarlane D.E.，and Manzel L.1998 J Immunol 160：1122)。我们发现：添加5μg/ml氯喹完全阻止了 在由主要B细胞上的CD86表达的CpG DNA-调节的诱导(MFI CD86：2006(序列号为246)，4.7 vs 1.4；E.Coli DNA，3.4 vs.1.4； 只有培养基，0.9；n＝4)。更进一步，氯喹完全抑制了由硫代磷酸 酯寡核苷酸2006(序列号为246)诱的B细胞复制，由CFSE复制 测定和用标准方法的测定。这些基元表明：象与鼠科细胞一样， 由CpG DNA引起的人类B细胞的活化也需要内部DNA的吸收 和后来内部的酸化。

    例子11：用最佳的人类ODN的人类B细胞刺激上的

          亚-细胞事件(sub-cellular events)的分析

因为得到最大B细胞活化所需要的CpG基元，在鼠 (GACGTT)(序列号为1143)和人类(TCGTCGTT)(序列号为1145) 之间有显著的差别。我们感兴趣的是：基本的细胞内部的发信 号事件(basic intracellular signaling events)是否可比较。NKκ B粘合活性的快速诱导以前在鼠科B细胞和巨噬细胞里被发现 (Stacey K.J.，et al 1996 J Immunol 157：2116，Yi A.K et al 1998 J Immunol 160：4755)。为了研究人类NKκB对于CpG DNA的反 应，人类主要B细胞用免疫磁性细胞分类方法从外围血液中分 离得到并用CpG寡核苷酸2080(序列号为321)、非CpG控制的 寡核苷酸2078(序列号为319)或培养基孵化。在确定的时间点， 细胞被收获，核提取物被制备。在CpG寡核苷酸存在下，NKκ B粘合活性在1小时内被增加并且能够保持18小时(实验中最晚 的时间点)。非CpG控制的寡核苷酸2078(序列号为319)与只有 培养基孵化的细胞相比没有提高NKκB活性。NKκB带(band) 被冷竞争所确定，并被超级位移测定测定出含有p50和p65亚 单元。

活化蛋白-1(Ap-1)复制因子在瞬间早期基因和细胞液表达的 调节中起作用(Karin M.1995.The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases.J Biol Chem 270：16483)。在鼠 科B细胞中，AP-1粘合活性被诱导以响应CpG DNA(Yi A.K.，and Krieg A.M.1998.Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA.J Immunol 161：4493)。 为了确定这个复制因子在人类中是否也会被CpG DNA诱导，我 们测定了在人类主要B细胞中AP-1 DNA的粘合活性。细胞用 CpG寡核苷酸2080(序列号为321)或控制寡核苷酸2078(序 列号为319)孵化。核提取物被制备，AP-1粘合活性用EMSA 分析。AP-1粘合活性在1小时内被提高，并且增加到18小时 (实验中最晚的时间点)，表现出了持续的反应。

因为AP-1活性可以被许多刺激物诱导(Angel P.，and Karin M.1991.The role of Jun，Fos and the AP-1 complex in cell- proliferation and transformation.Biochim Biophy Acta 1072：129)， 我们对AP-1的上游的信号传导路径感兴趣。AP-1复制因子复 合物整合不同分裂素活化的蛋白激酶(MAPK)路径(Karin M. 1995.The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases.J Biol Chem 270：16483)。Western印迹是用来源于CpG 寡核苷酸2080(序列号为321)、控制寡核苷酸2078(序列号为 319)、或只用培养基孵化的主要B细胞的整个细胞提取物完成 的。JNK，p38，ATF-2和ERK的磷酸化形式的特定的抗体被使用。 JNK磷酸化的强诱导性在接触CpG-DNA后30分钟到60分钟 内被发现，但是，非CpG寡核苷酸在上述的背景中不表现出活 性。蛋白激酶p38，另一种由应激活化(stress activated)的蛋白激 酶(SAPK)，也在60分钟内响应CpG DNA而被磷酸化。ATF-2，同 时是p38和JNK的培养基(Gupta S.，CampbellD.，Derijard B.，and Davis R.J.1995.Transcription factor ATF-2 regulation by the JNK signal transduction pathway.Science 267：389)和Ap-1复合物中的 组成，30分钟后表现出弱磷酸化，60分钟后有所增加。CpG DNA 不能诱导ERK的真实的磷酸化。相反，抗-IgM，刺激B细胞接 受器，能够诱发ERK的磷酸化。抗-IgM比CpG DNA更能活化 不同的等同形式的JNK。

           例子12：体内辅助剂活性的测定

用于确定作为人类和其它非啮齿动物的辅助剂体内有用的 ODN的体内扫描测定被发展。因为我们发现：在鼠中不同CpG ODN的活性不仅量上而且是质上是不同的，我们第一次在鼠细 胞上扫描了一组CpG和非-CpG控制的ODN，并发现了与肝炎 B表面抗原(HBsAg)的体内辅助剂活性可靠且强相关的体外测 定。然后在相应的人类测定中我们系统地检验了一组多于250 个的ODN以确定带有体外免疫刺激活性的序列。接着，我们检 验了在这些人类测定中有最高活性的ODN是否也能够在黑猩猩 和猴中活化B细胞复制，最后，检验它们在黑猩猩和猕猴体内 作为HbsAg的辅助剂时是否也是有活性的。这些研究表明：分 离的CpG基元的序列、数目和间隔都对CpG硫代磷酸酯ODN 的免疫刺激活性有贡献。在5’末端有TC双核苷酸并有被TT双 核苷酸分开的3个6mer CpG基元(5’GTCGTT3’)的ODN一致性 地对于人类、黑猩猩、恒河猴的白血球有最高的活性。黑猩猩 或猴用这种CpG ODN辅助剂接种以预防B型肝炎的话，它们 发展了不那些单纯用疫苗接种的高15倍的抗-HBs抗体滴定 量。

材料与方法：

寡脱氧核苷酸：硫代磷酸酯修饰的ODN是从Operon Technologies(Alameda，CA)和Hybridon Specialty Products(Milford， MA)购得的。ODN用LAL-测定(LAL-assay BioWhittaker， Walkersville，MD；最低检测限是0.1EU/ml)内毒素。对于in vitro 测定，ODN在TE-缓冲液(10mM Tris，pH7.0，1mM EDTA)中 稀释并保存在-20℃。对于in vivo应用，ODN在磷酸盐缓冲的 盐溶液(0.1M PBS，pH7.3)中稀释并保存在4℃。所有的稀释都 是用不含热原质的试剂进行稀释的。

鼠的脾细胞培养：脾从6-12周大的母老鼠BALB/c(The Jackson Laboratory)身上摘下的，2×106个脾细胞用0.2μM的 ODN培养4小时(TNFα)或24小时(IL-6，IFN-γ，IL-12)，细胞 液象前面叙述的一样用ELISA检测(Yi，A.K.，Klinman D.M.， Martin T.L.，Matson S.，and Krieg A.M.1996.Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA.Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway.J Immunol 157：5394)。为了评价CpG诱导的B细胞的复制，脾细 胞被抗-Thy-1，2和补充物(complement)去除了T细胞并且在 Lympholyte M(Cedarlane Laboratories，Hornby，ON，Canada)上离 心，用确定的ODN培养44小时，然后，象前面所述的一样用 1μCi的3H胸腺嘧啶脱氧核苷脉冲4小时(Krieg A.M.，Yi A.K.， Matson S.，Waldschmidt T.J.，Bishop G.A.，Teasdale R.，Koretzky G.A.，and Klinmann D.M.1995.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.Nature 374：546)。为了测定NK细 胞的细胞溶解酶的活性，鼠脾细胞被前面详述的用包有磁珠子 的抗-鼠Ig除去B细胞(Ballas Z.K.，and Rasmussen W.1993. Lymphokine-activated killer cells.VII.IL-4 induces an NK 1.1 +CD8α+β-TCR-αβB220+lymphokine-activated killer subset.J Immunol 150：17)。在有24个井的盘子上，浓度为5×106/well 下细胞被培养，并且在18小时收获以在抗YAC-1目标细胞的 标准4小时51Cr-释放测定中用作受动细胞。一个单元(LU)被定 义为影响30％特定消散需要的细胞数。

鼠的抗HbsAg免疫性和体液反应的评价：一组6-8周大的 母BALB/c鼠(n＝5或10，Charles River，Moutreal，QC)象前面描述 的(Davis H.L.，et al 1998 J Immunol 160：870)免疫以抵抗HbsAg。 简单地说，每个鼠接受了一个IM注入50μl PBS，这个PBS含 有1μg再结合HbsAg(Medix Biotech，Foester City，CA)，和10μ g的CpG ODN或非-CpG ODN作为单独的辅助剂或与矾 (Alhydrogel“85”，Superfos Biosector，Vedback，Denmark；25mg Al3+/mgHBsAg)混合辅助剂。控制鼠在无辅助剂或与钒一起用 HbsAg免疫。血浆在免疫后以不同的倍数从鼠中更新，对于 HbsAg特定的Abs(抗-Hbs)象前面所述的一样被末点(end-point) 稀释ELISA测定定量化(以三倍(in triplicate))(Davis H.L et al 1998 J Immunol 160：870)。末点滴定量被定义为：可以导致吸收 值(OD450)比去掉0.05值的非免疫血浆的吸收值高两倍的最 高的血浆稀释。

灵长类的动物PBMC的分离和细胞培养：外围血液单核细 胞(PBMC)是从健康的志愿者、黑猩猩或恒河猴或猕猴的外围血 液中用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离得到的(Histopaque-1077， Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)象(Hartmann G.，et al 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：291))描述的一样。细胞悬挂 在RPMI1640培养基中，培养基中补充10％(v/v)的热-惰性(56℃， 1h)FCS(HyClone，Logan，UT)，1.5mM L-谷氨酸盐，100U/ml青 霉素和100μg/ml链霉素(都是来自Gibco BRL，Grand Island， NY)(完全的培养基)。细胞(最终浓度为1×106cells/ml)在完 全培养基中并在5％CO2加湿的孵化器和37℃的条件下培养的。 ODN和LPS(来自沙门氏菌typhimurium，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)或抗-IgM用作刺激剂。为了测定人类NK细胞溶 解酶的活性，PBMC在有24个井的盘子上，浓度为5×106/well 下细胞被培养。培养在24小时后收获，细胞在抗K562目标细 胞的标准4小时51Cr-释放测定中用作受动细胞，就象前面叙述 的一样(Ballas，Z.K.，Rasmussen W.L.，and Krieg A.M.1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA.J.Immunol.157；1840； Ballas Z.K.，and Rasmussen W.1993.Lymphokine-activated killer cells.VII.IL-4 induces an NK 1.1+CD8α+β-TCR-αβB220+ lymphokine-activated killer subset.J Immunol 150：17)。对于B细 胞的复制，1μCi的3H胸腺嘧啶脱氧核苷在收获前18个小时时 被加入，并且加入的3H胸腺嘧啶脱氧核苷量由在第5天的闪烁 计数来决定的。三个井的标准偏差小于5％。

在灵长类的动物PBMC上的流体血细胞计数器：在灵长类 的动物PBMC上的表面抗原被象前面所述的一样着色(Hartmann G et al 1998 J Pharmacol Exp Ther 285：920)。CD3(UCHT1)、 CD14(M5E2)、CD19(B43)、 CD56(B159)、CD69(FN50)和 CD86(2331(FUN-1))的单克隆的抗体都是从Pharmingen，Sna Diego，CA购得的。IgG1，κ(MOPC-21)和IgG2b，κ(Hartmann G et al 1999 PNAS 96：9305)用作对非特定性着色的控制。NK细胞用 CD56在CD3、CD14和CD19负细胞上的表达来确定的，但是 B细胞由CD19的表达来确定。来自于每个样品的10000个细胞 的流体血细胞计算器的数据在FACScan上得到(Beckton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)。用于分析的 FSC/SSC门内的细胞的发育能力被propidium碘化物着色(2μ g/ml)来检测，发现发育能力高于98％。数据用FlowJo计算机 程序(2.5.1版本，Tree Star，Inc.，Stanford，CA)分析。

抗-HbsAg的黑猩猩和猕猴的免疫能力和体液反应的评价： 十四个弥猴(2.0-3.5千克)用小儿科剂量的含有10μg吸附在 矾(25mgAl3+/mgHBsAg)上的HbsAg的Engerix-B(SmithKline Beecham Biologicals，Rixensart，BE)免疫。这被单独给予(n＝5)或 与CpG ODN 1968(n＝5,500μg)或CpG ODN 2006(序列号为 246)(n＝4,150μg)混合给予。四个黑猩猩(10-20千克)用两个接受 控制疫苗(只有Engerix-B)和两个接受实验疫苗(Engerix-B加上 1mg CpG ODN 2006)以同样的形式免疫。所有的疫苗在前面的 右大腿上给予IM，整个体积为1ml。猴子在灵长类动物研究中 心(Bogor，Indonesia)的动物设施中生活，黑猩猩被关在 Bioqual(Rockville，MD)。动物白天被动物医护专家监护。一般 疾病或在注射部位的局部负反应没有发现任何症状。在免疫之 前或免疫之后的多个时间里，血浆通过IV小孔被不断更新并以 冻结状保存(-20℃)到测定抗体为止。抗-HBs抗体用商业上的 ELISA工具(Monolisa Anti-HBs；Sanofi-Pasteur，Montreal，QC)检 测，滴定量用基于与定义标准的WHO作的比较的mIU/ml来表 达(Monolisa Anti-HBs Standards；Sanofi-Pasteur)。

结果：

有in vitro免疫活性不同立体图的CpG ODN的确定：我们 的研究表明：在CpG基元中的CpG双核苷酸的5’和3’位上的 精确碱基可以对合成的ODN的免疫活性有影响，但是还不清 楚：不同的CpG基元会不会表现出不同的免疫效果。为了评价 这个可能性，我们测定了一组CpG ODN得到它们诱导NK细胞 溶解酶的活性、B细胞复制、和刺激在鼠脾中的TNF-α、IL-6、 IFN-γ和IL-12等的合成等的能力。没有CpG基元的ODN(ODN 1982(序列号为225)，ODN 1983(序列号为226))的免疫刺激活性 与CPG ODN相比是负的或弱的。有非最佳CpG基元的ODN (ODN 1628(序列号为7667)，ODN 1758(序列号为1))比以下 含有侧面为两个5’位嘌呤和两个3’嘧啶的CpG基元的ODN (ODN 1760(序列号为3)，ODN 1826(序列号为69)，ODN 1841(序 列号为84))活性低。含有两个最佳鼠科CpG基元(5’GACGTT3’) (序列号为1143)的ODN 1826对于5/6的测定末点(endpoints)有 最高的活性。除了ODN 1628，所有的ODN表现出一般上相似 模式的活性(NK细胞调节的消散，B细胞复制，IL-12，IL-6，TNFa， IFN-γ)。值得一提的是，ODN 1628，因为含有两个富含G的 区域而在这个小组中显得独特，表现出对IFN-γ合成优选诱导， 但是相对地对其它活性的刺激较低。

与体内辅助剂活性相关的体外测定的确定：因为辅助剂的 活性是一个体内末点，我们对确定能够预测CpG ODN体内的辅 助剂活性的体外测定有兴趣。用于体外末点的同一个ODN被测 定了它们的辅助剂免疫鼠抗HbsAg的活性。只用ODN和ODN 与矾混合用都被测定了，因为以前的研究表明CpG ODN和矾有 很强的协同作用(PCT公开专利申请WO98/40100)。

用不含辅助剂的HbsAg免疫的BALB/c鼠在4周时得到很 低的抗-HBs的量，而且添加控制ODN也对此没有影响。相反， CpG ODN的添加将抗-HBs提高了5到40倍(fold)，依赖于应用 的序列。当矾添加时，抗-HBs的量大约是单独用HbsAg时高6 倍。特别是，控制ODN没有效果，不同的CpG ODN提高了这 个量2到36倍(fold)。单独用不同的ODN得到的结果与用同样 的ODN加矾得到的结果强相关(r＝0.96)。当使用线性回归时， 发现在确定的体外测定和抗-HBs的体内增长之间有非常高的 相关度。在所有测定的体外末点中，NK细胞溶解酶的活性的 诱导显示出与体内辅助剂活性(没有矾，r＝0.98；有矾时， r＝0.95；p＜0.0001)最好的相关性。关于辅助剂活性的好的相关 性对于B细胞刺激(r＝0.84和0.7)可以得到；TNF-α(r＝0.9和 0.88)、IL-12(r＝0.88和0.86)、和IL-6(r＝0.85和0.91)的分泌也得 到。那个不能够很好地与体内测定相关的体外测定是IFN-γ分 泌(r＝0.57和0.68)。这些数据证明：对于NK细胞溶解酶的活性、 B细胞活性和TNF-α、IL-12、和IL-6的产生的体外测定提供 了可以预测所给ODN体内的辅助剂活性的有价值的体外的信 息。

用于活化人类NK细胞的硫代磷酸酯ODN组的扫描：在前 面的研究中，我们发现：用人类PBMC的发炎细胞液的合成是 被极低量的内毒素(诱导TNF-α分泌到可检测时，只用6pg/ml 内毒素，比鼠免疫细胞更敏感2个logs)。相反，虽然使用高浓 度的内毒素，但是用内毒素的人类B细胞的活化和人类NK细 胞细胞溶解酶的活性的诱导仍然很低。基于这些结果，我们选 择了NK细胞的活化(细胞溶解酶的活性和CD69表达)和B细胞 的活化(复制和CD86表达)作为最高特定性和复制测定，这种测 定有低的inter-subject可变性；我们用这些测定来in vitro扫描 库中的ODN。

第一次，我们研究了含有CpG基元的不同组合和排列的硫 代磷酸酯ODN在NK细胞调节的目标细胞的消散上的效果。为 了表达的清楚和容易，只列出了有选择的代表性的CpG和控制 ODN的数据。人类PBMC用不同的硫代磷酸酯ODN(6μg/ml) 孵化24小时，并测定了它们细胞溶解51Cr标记的K562细胞的 能力。有两个6-mer CpG基元的ODN(或者是5’GACGTT3’(序 列号为1143)或5’GTCGTT3’(序列号为1144)与5’末端有一个TpC 的ODN的组合(ODN 18405’TCCATGTCGTTCCTGTCGTT3’(序 列号为83)，ODN 18515’TCCTGACGTTCCTGACGTT3’(序列号 为94)或与至少三个在5’末端没有TpC的6-mer基元(ODN 2013(序列号为253))的组合表现出中间活性。当5’TpC直接在 一个6-mer人类CpG基元之前(5’TCGTCGTT(序列号为1145)) 并且跟随着两个6-mer基元(ODN 2005(序列号为245)，ODN 2006(序列号为246)和ODN 2007(序列号为247))，高活性被发 现。当6-mer CpG基元被TpT互相分开和从5’8-mer CpG基元 分开(ODN 2006(序列号为246))时，得到最好的结果。

活化制造者CD69的表达在NK细胞表面随着刺激被很快地 上调节(upregulated)。为了确定从NK细胞消散测定的结果， PBMC用ODN(2μg/ml)孵化18小时。CD69表达在CD56正NK 细胞(CD3、CD14和CD19负)上检测。尽管CD69表达的诱导 与NK细胞功能性活性的刺激相比是较低地被序列抑制，控制 ODN(ODN 1982，ODN 2116，ODN 2117，ODN2010)表现出与背景 水平相似的低活性。有被5’TTTT3’分开的两个人类CpG基元的 ODN(ODN 1965(序列号为208))或有四个没有分开的人类CpG 基元的ODN(ODN 2013(序列号为253))在诱导CD69表达中 比刺激NK细胞细胞溶解酶的活性中有相对高的活性。最佳的 NK细胞功能性活性，同时CD69表达，用下列ODN可以得到： 在序列中，在人类CpG基元之前含有一个TpC双核苷酸，和在 人类基元后含有一个TpC双核苷酸(ODN 2006(序列号为246)， ODN 2007(序列号为247))。

硫代磷酸酯ODN对于刺激人类B细胞的活性：在初步的实 验中，我们发现B细胞复制的百分率(CFSE测定，参见方法部 分)与共刺激的CD86在B细胞上的表面表达相关，象用流体血 细胞计数器测定的一样。这样一来，我们用CD86在B细胞上 的表达以扫描一组ODN得到它们的免疫刺激活性。PBMC用0.6 μg/ml的ODN孵化。CD86的表达(意思是荧光强度，MFI)在CD19 正B细胞上被检测。一个多C的ODN(ODN 2017(序列号为257)) 或没有CpG双核苷酸的ODN(ODN 1982(序列号为225))不能在 这些实验条件下刺激人类B细胞。有一个TpC在一个最佳人类 CpG基元之前(5’TCGTCGTT3’(序列号为1145))的一个硫代磷酸 酯ODN(ODN 2116(序列号为256))没有活化功能。在序列中 的这些CpG基元中的两个表现出没有(ODN 1960(序列号为203)， ODN 2016(序列号为256))或中等(ODN 1965(序列号为208))活 性，活性依赖于序列前后关系。如果ODN含有三个或四个这个 基元的复制(ODN 2012(序列号为252)，ODN 2013(序列号为253)， ODN 2014(序列号为254))，在B细胞上中等活性可以检测到。 在ODN的5’末端有人类8-mer CpG基元和两个6-mer CpG基元 的组合(ODN 2005(序列号为245)，ODN 2006(序列号为246)， ODN 2007(序列号为247)，ODN 2102(序列号为343)，ODN 2103 (序列号为344))导致ODN刺激B细胞的能力有相当可观的增 加。单个基元之间的空间是关键的。被TpT分开的CpG基元是 优选的(ODN 2006(序列号为246))与没有分开的CpG基元(ODN 2005(序列号为))；也将ODN 1965(序列号为208))和ODN 1960 (序列号为203)比较是一样的。当与在5’末端的人类8-mer CpG 基元组合时(ODN 2006 vs.ODN 2102(序列号为343)和ODN 2103(序列号为344，人类的6-mer CpG基元(5’GTCGTT3’)比最 佳的鼠6-mer CpG基元(5’GACGTT3’(序列号为246))更好。一 个(TCG)polyODN没有活性或只有弱活性，含有侧面为鸟嘌呤的 CpG双核苷酸或其它CpG双核苷酸的ODN(ODN 2010(序列号 为250))也是一样的。放在一起，对于NK细胞和B细胞的发现 与测定的ODN的发现是一致的，ODN 2006(序列号为246)在人 类免疫细胞上有最高的免疫刺激活性。

CpG硫代磷酸酯ODN在不同灵长类动物中的能力的比较分 析：对于活化鼠和人类免疫细胞，不同的CpG基元是最佳的。 进一步讲，在活性硫代磷酸酯ODN中的CpG基元的数目和位 置在鼠和人类中是不同的。我们有兴趣去知道：CpG硫代磷酸 酯ODN在不同种类的灵长类动物中是否表现出相似活性。我们 比较了一组CpG ODN得到它们在人类、黑猩猩和恒河猴或猕猴 中诱导B细胞的能力。ODN刺激人类B细胞复制的能力(表J) 与它们诱导CD86在B细胞上的表达的能力很好地相关。在人 类B细胞和NK细胞中表现出最高的活性的ODN 2006(序列号 为246)，在刺激黑猩猩和恒河猴B细胞复制中也是活性最高的(表 J)。ODN 1968(序列号为211)和ODN 2006(序列号为246)给出 猕猴B细胞体外最高的活性(SI分别是25和29，在6μg ODN/ml)。惊奇的是，表现出与在人类细胞中最佳的ODN 2006(序 列号为246)相似的高活性的ODN 2007(序列号为247)不能刺激 恒河猴或黑猩猩B细胞复制，ODN 1968(序列号为211)表现出 低活性。最初被确定为在鼠中有高活性的CpG ODN(ODN 1760(序列号为3)，ODN 1826(序列号为69)在猴中只表现出极小 的活性(表J)。

      表J：在灵长类动物中PBMC对于硫代磷酸酯

                CpG ODN的复制反应

                       人类          黑猩猩         恒河猴

  无添加               0.5+-0.1     0.5+-0.1       0.5+-0.0 ODN 1760(序列号为3)        23+-7        0.3+-0.1       0.5+-0.3 ODN 1826(序列号为69)       0.8+-0.1     0.4+-0.1       0.6+-0.1 ODN 1968(序列号为211)      35+-9        20.0+-3.8      1.9+-0.7 ODN 1982(序列号为225)      9.7+-1.1     2.5+-1.1       0.7+-0.1 ODN 2006(序列号为246)      58+-8        27.4+-8.9      6.3+-3.3 ODN 2007(序列号为247)      47+-11       0.5+-0.1       0.4+-0.2

PBMC从外围的血制备的，并如同指示的那样用ODN(0.6 μg/ml)孵化5天。在最后18小时内，复制被3H/胸腺嘧啶脱氧 核苷(cpm/1000)吸收测定。由CFSE测定给出：多于95％的复制 细胞是B细胞。四个人类渊源者(probands)、六个黑猩猩和两个 恒河猴被实验。

在黑猩猩和弥猴中的CpG ODN的体内辅助剂活性：为了评 价在灵长类的动物细胞上有强的体外刺激效果的CpG ODN是否 有可体内检测的辅助剂活性，弥猴和黑猩猩用Engerix B免疫， 其中Engerix B含有吸附在矾上的HbsAg，单独或分别与 ODN1968(500μg)或ODN 2006(序列号为246)(1mg)混合使用。 与没有得到CpG ODN的控制比较，抗-HBs的量在开始灌注后 4周和推进后2周在猴中分别是高66-和16-倍，在黑猩猩中分 别是高15-和3-倍(表K)。这样一来，一个清楚的CpG ODN的 辅助剂效果被看到，并且在一个免疫过后这是特别惊人的。

表K在用CpG ODN免疫抵抗HbsAg的灵长类的动物中抗-

           HBs反应抗-HBs(mIU/ml) 灵长类动物种类 n  CpG ODN           4周post- 2周post-boost

                                 prime 弥猴            5  无                15 +44  4880 +13113

            5  ODN 1968(500μ          995  +  76449 +42094

               g)(序列号为211)   1309 黑猩猩          2  无                6，11    3712，4706

            2  ODN 2006(1mg)(序  125，135 9640，16800

               列号为246)

动物通过IM注入Engerix B免疫，其中Engerix B含有吸附 在矾上的HbsAg，单独或添加CpG ODN。弥猴在灌注后10周 时被推进，黑猩猩是在灌注后4周被推进。抗-HBs被ELISA测 定测量；猴的值是GMT +SEM(n＝5)，但是在每个小组中对于两 个黑猩猩单独的值是给出的。

                        序列表

                   序列表

<110>衣阿华大学研究基金会

科勒制药GMBH公司

<120>免疫刺激性核酸

<130>C1039/7035WO(HCL/MAT)

<150>US 60/156,113

<151>1999-09-25

<150>US 60/156,135

<151>1999-09-27

<150>US 60/227,436

<151>2000-08-23

<160>1145

<170>FastSEQ的Windows 3.0版

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1 tctcccagcg tgcgccat

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2 ataatccagc ttgaaccaag                                         20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3 ataatcgacg ttcaagcaag                                         20

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4 taccgcgtgc gaccctct                                           18

<210>5

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5 ggggagggt                                                     9

<210>6

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6 ggggagggg                                                 9

<210>7

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7 ggtgaggtg                                                 9

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>m5c

<400>8 tccatgtngt tcctgatgct                                     20

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(11)...(11)

<223>m5c

<400>9 gctaccttag ngtga                                          15

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>m5c

<400>10 tccatgangt tcctgatgct                                         20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(13)...(13)

<223>m5c

<400>11 tccatgacgt tcntgatgct                                         20

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(7)...(7)

<223>m5c

<400>12 gctagangtt agtgt                                              15

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13 agctccatgg tgctcactg                                         19

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14 ccacgtcgac cctcaggcga                                        20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15 gcacatcgtc ccgcagccga                                        20

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16 gtcactcgtg gtacctcga                                         19

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17 gttggataca ggccagactt tgttg                             25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18 gattcaactt gcgctcatct taggc                             25

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19 accatggacg aactgtttcc cctc                              24

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20 accatggacg agctgtttcc cctc                              24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21 accatggacg acctgtttcc cctc                              24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22 accatggacg tactgtttcc cctc                                 24

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23 accatggacg gtctgtttcc cctc                                 24

<210>                                                  24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24 accatggacg ttctgtttcc cctc                                 24

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25 ccactcacat ctgctgctcc acaag                                25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26 acttctcata gtccctttgg tccag                                25

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27 tccatgagct tcctgagtct                                      20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(9)...(9)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(11)...(11)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(15)...(15)

<223>I

<400>28 gaggaaggng nggangacgt                                      20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(7)…(7)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(13)...(13)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(18)...(18)

<223>I

<400>29 gtgaatncgt tcncgggnct                                      20

<210>30

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30 aaaaaa                                                     6

<210>31

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31 cccccc                                                     6

<210>32

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32 ctgtca                                                         6

<210>33

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33 tcgtag                                                         6

<210>34

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34 tcgtgg                                                         6

<210>35

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35 cgtcgt                                                         6

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36 tccatgtcgg tcctgagtct                                       20

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37 tccatgccgg tcctgagtct                                       20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38 tccatgacgg tcctgagtct                                       20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39 tccatgacgg tcctgagtct                                       20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40 tccatgtcga tcctgagtct                                       20

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41 tccatgtcgc tcctgagtct                                       20

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42 tccatgtcgt tcctgagtct                                       20

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43 tccatgacgt  tcctgagtct                                      20

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44 tccataacgt tcctgagtct                                       20

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45 tccatgacgt ccctgagtct                                       20

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>46 tccatcacgt gcctgagtct                                       20

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>47 tccatgctgg tcctgagtct                                       20

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>m5c

<400>48 tccatgtngg tcctgagtct                                       20

<210>49

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49 ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaag                  39

<210>50

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50 cttggtggag aaacccatga gctcatctgg aggaagcgg                  39

<210>51

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51 ccccaaaggg atgagaagtt                                       20

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>52 agatagcaaa tcggctgacg                                       20

<210>53

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>53 ggttcacgtg ctcatggctg                                       20

<210>54

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>54 tctcccagcg tgcgccat                                         18

<210>55

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>55 tctcccagcg tgcgccat                                         18

<210>56

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>56 taccgcgtgc gaccctct                                         18

<210>57

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>57 ataatccagc ttaaccaag                                        20

<210>58

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>58 ataatcgacg ttcaagcaag                                       20

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>59 tccatgatt tcctgatttt                                        20

<210>60

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>60 ttgttttttt gtttttttgt tttt                                  24

<210>61

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>61 ttttttttgt ttttttgttt tt                                    22

<210>62

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>62 tgctgctttt gtcttttgt gctt                                   24

<210>63

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>63 tgctgcttgt gcttttgtgctt                                     22

<210>64

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>64 gcattcatca ggcgggcaag aat                                   23

<210>65

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>65 taccgagctt cgacgagatt tca                                   23

<210>66

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>66 gcatgacgtt gagct                                            15

<210>67  

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>67 cacgttgagg ggcat                                            15

<210>68

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>68 ctgctgagac tggag                                            15

<210>69

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>69 tccatgacgt tcctgacgtt                                       20

<210>70

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>70 gcatgagctt gagctga                                          17

<210>71

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>71 tcagcgtgcg cc                                               12

<210>72

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>72 atgacgttcc tgacgtt                                          17

<210>73

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>73 ttttggggtt ttggggtttt                                       20

<210>74

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>74 tctaggcttt ttaggcttcc                                       20

<210>75

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>75 tgcatttttt aggccaccat                                       20

<210>76

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>76 tctcccagcg tgcgtgcgcc at                                    22

<210>77

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>77 tctcccagcg ggcgcat                                          17

<210>78

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>78 tctcccagcg agcgccat                                         18

<210>79

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>79 tctcccagcg cgcgccat                                         18

<210>80

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>80 ggggtgacgt tcagggggg                                        19

<210>81

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>81 ggggtccagc gtgcgccatg gggg                                  24

<210>82

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>82 ggggtgtcgt tcagggggg                                        19

<210>83

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>83 tccatgtcgt tcctgtcgtt                                       20

<210>84

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>84 tccatagcgt tcctagcgtt                                       20

<210>85

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>85 tcgtcgctgt ctccgcttct t                                     21

<210>86

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>86 gcatgacgtt gagct                                            15

<210>87

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>87 tctcccagcg tgcgccatat                                       20

<210>88

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(17)...(17)

<223>m5c

<400>88 tccatgangt tcctgangtt                                       20

<210>89

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(7)...(7)

<223>m5c

<400>89 gcatgangtt gagct                                            15

<210>90

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>90 tccagcgtgc gccata                                           16

<210>91

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>91 tctcccagcg tgcgccat                                         18

<210>92

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>92 tccatgagct tcctgagtct                                       20

<210>93

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>93 gcatgtcgtt  gagct                                           15

<210>94

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>94 tcctgacgtt cctgacgtt                                        19

<210>95

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>95 gcatgatgtt gagct                                            15

<210>96

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>96 gcatttcgag gagct                                            15

<210>97

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>97 gcatgtagct gagct                                            15

<210>98

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>98 tccaggacgt tcctagttct                                       20

<210>99

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>99 tccaggagct tcctagttct                                       20

<210>100

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>100 tccaggatgt tcctagttct                                       20

<210>101

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>101 tccagtctag gcctagttct                                       20

<210>102

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>102 tccagttcga gcctagttct                                       20

<210>103

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>103 gcatggcgtt gagct                                            15

<210>104

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>104 gcatagcgtt gagct                                            15

<210>105

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>105 gcattgcgtt gagct                                            15

<210>106

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>106 gcttgcgttg cgttt                                            15

<210>107

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>107 tctcccagcg ttgcgccatat                                      21

<210>108

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>108 tctcccagcg tgcgttatat                                       20

<210>109

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>109 tctccctgcg tgcgccatat                                       20

<210>110

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>110 tctgcgtgcg tgcgccatat                                       20

<210>111

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>111 tctcctagcg tgcgccatat                                       20

<210>112

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>112 tctcccagcg tgcgcctttt                                       20

<210>113

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<222>(5)...(5)

<223>nisaorgorcort/u

<221>misc_difference

<222>(6)...(6)

<223>disaorgort/u；notc

<221>misc_difference

<222>(9)...(10)

<223>hisaorcort/u；not g

<400>113 gctandcghh agc                                              13

<210>114

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>114 tcctgacgtt ccc                                              13

<210>115

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>115 ggaagacgtt aga                                              13

<210>116

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>116 tcctgacgtt aga                                              13

<210>117

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>117 tcagaccagc tggtcgggtg ttcctga                               27

<210>118

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>118 tcaggaacac ccgaccagct ggtctga                               27

<210>119

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>119 gctagtcgat agc                                              13

<210>120

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>120 gctagtcgct agc                                              13

<210>121

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>121 gcttgacgtc tagc                                             14

<210>122

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>122 gcttgacgtt tagc                                             14

<210>123

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>123 gcttgacgtc aagc                                             14

<210>124

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>124 gctagacgtt tagc                                             14

<210>125

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>125 tccatgacat tcctgatgct                                       20

<210>126

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>126 gctagacgtc tagc                                             14

<210>127

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>127 ggctatgtcg ttcctagcc                                        19

<210>128

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>128 ggctatgtcg atcctagcc                                        19

<210>129

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>129 ctcatgggtt tctccaccaa g                                     21

<210>130

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>130 cttggtggag aaacccatga g                                     21

<210>131

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>131 tccatgacgt tcctagttct                                       20

<210>132

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>132 ccgcttcctc cagatgagct catg                                  24

<210>133

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>133 catgagctca tctggaggaa gcgg                                  24

<210>134

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>134 ccagatgagc tcatgggttt ctcc                                  24

<210>135

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>135 ggagaaaccc atgagctcat ctgg                                  24

<210>136

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>136 agcatcagga acgacatgga                                       20

<210>137

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>137 tccatgacgt tcctgacgtt                                       20

<210>138

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>138 gcgcgcgcgc  gcgcgcgcg                                       19

<210>139

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>139 ccggccggcc ggccggccgg                                       20

<210>140

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>140 ttccaatcag ccccacccgc tctggcccca ccctcaccct cca             43

<210>141

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>141 tggagggtga gggtggggcc agagcgggtg gggctgattg gaa             43

<210>142

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>142 tcaaatgtgg gattttccca tgagtct                               27

<210>143

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>143 agactcatgg gaaaatccca catttga                               27

<210>144

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>144 tgccaagtgc tgagtcacta ataaaga                               27

<210>145

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>145 tctttattag tgactcagca cttggca                               27

<210>146

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

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<220>

<221>修饰碱基

<222>(7)...(7)

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<220>

<221>修饰碱基  

<222>(3)...(3)

<223>m5c

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

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<221>修饰碱基

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<223>m5c

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(3)...(3)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>I

<221>修饰碱基

<222>(14)...(14)

<223>I

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<212>DNA

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<220>

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<223>m5c

<221>修饰碱基

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<221>修饰碱基

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<222>(1)...(3)

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<221>修饰碱基

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<221>修饰碱基

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<223>I

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<222>(1)...(3)

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<210>352

<211>24

<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<222>(22)...(24)

<223>Biotin moiety attached at 3’end of sequence.

<400>352 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                                 24

<210>353

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>353 tccagttcct tcctcagtct                                                      20

<210>354

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(2)...(2)

<223>m5c

<400>354 tngtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                                 24

<210>355

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>356

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>357

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<212>DNA

<213>人工序列

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<210>358

<211>24

<212>DNA <213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(2)...(2)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(5)...(5)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(13)...(13)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(21)...(21)

<223>m5c

<400>358 tngtngtttt gtngttttgt ngtt                                                 24

<210>359

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<213>人工序列

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<211>14

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<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>363

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>363 tcgtcgtcgt cgtt                                                            14

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<212>DNA

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<211>20

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<212>DNA

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>369 aatagtcgcc atcccccccc                                                      20

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<211>24

<212>DNA

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<400>370 tgctgctttt gtgcttttgt gctt                                                 24

<210>371

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>371 ctgtgctttc tgtgtttttc tgtg                                                 24

<210>372

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>372 ctaatctttc taattttttt ctaa                                                 24

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<211>26

<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>381 ttctgtgtct gttgctggtt ccgctttatc tgagaac                                   37

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<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>393 accatggatt acctttttcc cctt                                                 24

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>396 ctctccaagc tcacttacag                                                      20

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>400

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>405

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>24

<212>DNA

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<220>

<221>misc_difference

<222>(3)...(3)

<223>n is a or c or g or t/u

<221>misc_difference

<222>(8)...(8)

<223>n is a or c or g or t/u

<221>misc_difference

<222>(11)...(11)

<223>n is a or c or g or t/u

<221>misc_difference

<222>(16)...(16)

<223>n is a or c or g or t/u

<221>misc_difference

<222>(19)...(19)

<223>n is a or c or g or t/u

<221>misc_difference

<222>(24)...(24)

<223>n is a or c or g or t/u

<400>414 tcntcgtntt ntcgtnttnt cgtn                                                 24

<210>415

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<210>425

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>425 tccatgacgt tcctgatcc                                                       19

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>435 tcgtcgtttt gtcgttttgg gggg                                                 24

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>437 tcgtcgctgt ctccg                                                           15

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>17

<212>DNA

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<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>450 gctagacgtt agcgtga                                                         17

<210>451

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>451 gcttggaggg cctgtaagtg                                                      20

<210>452

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<212>DNA

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<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>456

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>457

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>458

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>DNA

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<211>22

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>24

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<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<211>27

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<212>DNA

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<211>29

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(5)...(5)

<223>m5c

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<211>18

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

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<211>17

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

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<213>人工序列

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<220>

<221>修饰碱基

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<220>

<221>修饰碱基

<222>(14)...(14)

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>17

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<400>748 gagcaagctg gaccttccat                                             20

<210>749

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<210>753

<211>15

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>755 tccatggcgg tcctgatgct                                             20

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<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>757

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>758 tccatgacgt tcctgatgct                                             20

<210>759

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>759 tccatgtcgt tcctgatgct                                             20

<210>760

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(13)...(13)

<223>m5c

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<211>15

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<213>人工序列

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<210>762

<211>20

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<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

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<210>763

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(12)...(12)

<223>m5c

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<210>764

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(3)...(3)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(10)...(10)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(14)...(14)

<223>m5c

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<210>765

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>766

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>767

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>768

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>768 ggggtcaagt ctgagggggg                                             20

<210>769

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>775 tccatgccgg tcctgatgct                                             20

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<211>20

<212>DNA

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<210>777

<211>20

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<211>21

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<213>人工序列

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<211>21

<212>DNA

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<220>

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<222>(8)...(10)

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<220>

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<222>(8)...(10)

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<220>

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<222>(8)...(10)

<223>Biotin moiety attached at 3’end of sequence.

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<220>

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<222>(8)...(10)

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<220>

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<222>(8)...(10)

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<213>人工序列

<400>793 gtttttatat aatttggg                                               18

<210>794

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>794 tttttgtttg tcgttttgtc  gtt                                        23

<210>795

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>795 ttgggggggg tt                                                     12

<210>796

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>796 ggggttgggg gtt                                                    13

<210>797

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>798

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<221>修饰碱基

<222>(6)...(6)

<223>m5c

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<211>20

<212>DNA

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<210>800

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<221>修饰碱基

<222>(8)...(8)

<223>m5c

<400>800 gagcaagntg gaccttccat                                             20

<210>801

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<221>修饰碱基

<222>(6)...(6)

<223>m5c

<400>801 gagaangctc cagcactgat                                             20

<210>802

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(5)...(5)

<223>m5c

<221>misc_feature

<222>(8)...(10)

<223>Biotin moiety attached at 3’end of sequence.

<400>802 tcaangttga                                                        10

<210>803

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(2)...(2)

<223>m5c

<221>misc_feature

<222>(8)...(10)

<223>Biotin moiety attached at 3’end of sequence.

<400>803 gnaatattgc                                                        10

<210>804

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>804 tgctgctttt gtcgttttgt gctt                                        24

<210>805

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>805 ctgcgttagc aatttaactg tg                                          22

<210>806

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>806 tccatgacgt tcctgatgct                                             20

<210>807

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>807 tgcatgccgt gcatccgtac acagctct                                    28

<210>808

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>808 tgcatgccgt acacagctct                                             20

<210>809

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>809 tgcatcagct ct                                                     12

<210>810

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>810 tgcgctct                                                          8

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>813 cccccccc                                                          8

<210>814

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>814 tgcatcagct ct                                                     12

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>815 tgcatgccgt acacagctct                                             20

<210>816

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>816 gagcaagctg gaccttccat                                             20

<210>817

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>817 tcaacgttaa cgttaacgtt aacgttaacg tt                               32

<210>818

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>818 gagaacgctc gaccttcgat                                             20

<210>819

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>819 gtccccattt cccagaggag gaaat                                       25

<210>820

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>820 ctagcggctg acgtcatcaa gctag                                       25

<210>821

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>821 ctagcttgat gacgtcagcc gctag                                       25

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<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>822 cggctgacgt catcaa                                                 16

<210>823

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>823 ctgacgtg                                                          8

<210>824

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>824 ctgacgtcat                                                        10

<210>825

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>825 attcgatcgg ggcggggcga g                                           21

<210>826

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 826 ctcgccccgc cccgatcgaa t                                           21

<210>827

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>827 gactgacgtc agcgt                                                  15

<210>828

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>828 ctagcggctg acgtcataaa gctagc                                      26

<210>829

<211>26

<212> DNA

<213>人工序列

<400>829 ctagctttat gacgtcagcc gctagc                                      26

<210>830

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>830 ctagcggctg agctcataaa gctagc                                      26

<210>831

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>831 ctagtggctg acgtcatcaa gctag                                       25

<210>832

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>832 tccaccacgt ggtctatgct                                             20

<210>833

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>833 gggaatgaaa gattttatta taag                                        24

<210>834

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>834 tctaaaaacc atctattctt aaccct                                      26

<210>835

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>835 agctcaacgt catgc                                                  15

<210>836

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>836 ttaacggtgg tagcggtatt ggtc                                        24

<210>837

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>837 ttaagaccaa taccgctacc accg                                        24

<210>838

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>838 gatctagtga tgagtcagcc ggatc                                       25

<210>839

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>839 gatccggctg actcatcact agatc                                       25

<210>840

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>840 tccaagacgt tcctgatgct                                             20

<210>841

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>841 tccatgacgt ccctgatgct                                             20

<210>842

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>842 tccaccacgt ggctgatgct                                             20

<210>843

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>843 ccacgtggac ctctagc                                                17

<210>844

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>844 tcagaccacg tggtcgggtg ttcctga                                     27

<210>845

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>845 tcaggaacac ccgaccacgt ggtctga                                     27

<210>846

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>846 catttccacg atttccca                                               18

<210>847

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>847 ttcctctctg caagagact                                              19

<210>848

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>848 tgtatctctc tgaaggact                                              19

<210>849

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>849 ataaagcgaa actagcagca gtttc                                       25

<210>850

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>850 gaaactgctg ctagtttcgc tttat                                       25

<210>851

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>851 tgcccaaaga ggaaaatttg tttcatacag                                  30

<210>852

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>852 ctgtatgaaa caaattttcc tctttgggca                                  30

<210>853

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>853 ttagggttag ggttagggtt                                             20

<210>854

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>854 tccatgagct tcctgatgct                                             20

<210>855

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>855 aaaacatgac gttcaaaaaa                                             20

<210>856

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>856 aaaacatgac gttcgggggg                                             20

<210>857

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>857 ggggcatgag cttcgggggg                                             20

<210>858

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>858 ctaggctgac gtcatcaagc tagt                                        24

<210>859

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>859 tctgacgtca tctgacgttg gctgacgtct                                  30

<210>860

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>860 ggaattagta atagatatag aagtt                                      25

<210>861

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>861 tttacctttt ataaacataa ctaaaacaaa                                  30

<210>862

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>862 gcgttttttt ttgcg                                                  15

<210>863

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>863 atatctaatc aaaacattaa caaa                                        24

<210>864

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>864 tctatcccag gtggttcctg ttag                                        24

<210>865

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<400>865 tccatgacgt tcctgatgct                                             20

<210>866

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(3)

<223>Biotin moiety attached at 5’end of sequence.

<400>866 tccatgagct tcctgatgct                                             20

<210>867

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)...(13)

<223>FITC moiety attached at 3’end of sequence.

<221>misc feature

<222>(0)...(0)

<223>Has phosphodi ester backbone.

<400>867 tttttttttt ttt                                                    13

<210>868

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<222>(11)...(13)

<223>Biotin moiety attached at 3’end of sequence.

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>Has phosphorothioate and phosphodiester chimeric

backbone with phosphodiester on 3’end.

<400>868 tttttttttt ttt                                                    13

<210>869

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>869 ctagcttgat gagctcagcc gctag                                       25

<210>870

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>870 ttcagttgtc ttgctgctta gctaa                                       25

<210>871

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>871 tccatgagct tcctgagtct                                             20

<210>872

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>872 ctagcggctg acgtcatcaa tctag                                       25

<210>873

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>873 tgctagctgt gcctgtacct                                             20

<210>874

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>874 atgctaaagg acgtcacatt gca                                         23

<210>875

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>875 tgcaatgtga cgtcctttag cat                                         23

<210>876

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>876 gtaggggact ttccgagctc gagatcctat g                                31

<210>877

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>877 cataggatct cgagctcgga aagtccccta c                                31

<210>878

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>878 ctgtcaggaa ctgcaggtaa gg                                          22

<210>879

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>879 cataacatag gaatatttac tcctcgc                                     27

<210>880

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>880 ctccagctcc aagaaaggac g                                           21

<210>881

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>881 gaagtttctg gtaagtcttc g                                           21

<210>882

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>882 tgctgctttt gtgcttttgt gctt                                        24

<210>883

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>883 tcgtcgtttt gtggttttgt ggtt                                        24

<210>884

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>884 tcgtcgtttg tcgttttgtc gtt                                         23

<210>885

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>885 tcctgacgtt cggcgcgcgc cc                                          22

<210>886

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>886 tgctgctttt gtgcttttgt gctt                                        24

<210>887

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>887 tccatgagct tcctgagctt                                             20

<210>888

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>888 tcgtcgtttc gtcgttttga cgtt                                        24

<210>889

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>889 tcgtcgtttg cgtgcgtttc gtcgtt                                      26

<210>890

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>890 tcgcgtgcgt tttgtcgttt tgacgtt                                     27

<210>891

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>891 ttcgtcgttt tgtcgttttg tcgtt                                       25

<210>892

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>892 tcctgacggg gaagt                                                  15

<210>893

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>893 tcctggcgtg gaagt                                                  15

<210>894

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>894 tcctggcggt gaagt                                                  15

<210>895

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>895 tcctggcgtt gaagt                                                  15

<210>896

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>896 tcctgacgtg gaagt                                                  15

<210>897

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>897 gcgacgttcg gcgcgcgccc                                             20

<210>898

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>899

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>900 gcggcggtcg gcgcgcgccc                                             20

<210>901

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>902

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>22

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<211>21

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<211>15

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<211>15

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<211>20

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<211>20

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<211>20

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<211>20

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<211>20

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>925

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>927

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>928

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>928 atggactctg gaggggtctc                                             20

<210>929

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>929 atggaggctc catggggctc                                             20

<210>930

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>930 atggactctg gggggttctc                                             20

<210>931

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>932

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>933

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>20

<212>DNA

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<210>935

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>936

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>937

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>938

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>938 gctagaggga gtgt                                                   14

<210>939

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>939 tttttttttt tttttttt                                               18

<210>940

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<222>(2)...(2)

<223>m is a or c

<221>misc_difference

<222>(18)...(18)

<223>m is a or c

<400>940 gmggtcaacg ttgagggmgg g                                           21

<210>941

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>942

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>943

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>944

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>945

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>945 ttggtttttt tggttttttt ttgg                                        24

<210>946

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>946 tttccctttt ccccttttcc cctc                                        24

<210>947

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<222>(21)...(21)

<223>s is g or c

<400>947 ggggtcatcg atgagggggg s                                           21

<210>948

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>948 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>949

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>949 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>950

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>950 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>951

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>951 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>952

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>952 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>953

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>953 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>954

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>954 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>955

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>955 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>956

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>956 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>957

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>957 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>958

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>958 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>959

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>959 gggggacgat cgtcggggg                                              19

<210>960

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>960 gggggtcgta cgacgggggg                                             20

<210>961

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>961 tttttttttt tttttttttt tttt                                        24

<210>962

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>962 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                        24

<210>963

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>963 cccccccccc cccccccccc cccc                                        24

<210> 964

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>964 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                        24

<210>965

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>965 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                        24

<210>966

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>966 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                        24

<210>967

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>967 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                        24

<210>968

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>968 ggggtcaacg ttgagggggg                                             20

<210>969

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>969 ggggtcaacg ttgagggggg                                             20

<210>970

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>970 ggggtcaagc ttgagggggg                                             20

<210>971

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>971 tgctgcttcc cccccccccc                                             20

<210>972

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>972 ggggacgtcg acgtgggggg                                             20

<210>973

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>973 ggggtcgtcg acgagggggg                                             20

<210>974

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>974 ggggtcgacg tacgtcgagg gggg                                        24

<210>975

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>975 ggggaccggt accggtgggg gg                                          22

<210>976

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>976 gggtcgacgt cgagggggg                                              19

<210>977

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>977 ggggtcgacg tcgaggggg                                              19

<210>978

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>978 ggggaacgtt aacgttgggg gg                                          22

<210>979

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>979 ggggtcaccg gtgagggggg                                             20

<210>980

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>980 ggggtcgttc gaacgagggg gg                                          22

<210>981

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>981 ggggacgttc gaacgtgggg gg                                          22

<210>982

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>982 tcaactttga                                                        10

<210>983

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>983 tcaagcttga                                                        10

<210>984

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>984 tcacgatcgt ga                                                     12

<210>985

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>985 tcagcatgct ga                                                     12

<210>986

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>986 gggggagcat gctggggggg                                             20

<210>987

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>987 gggggggggg gggggggggg                                             20

<210>988

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>988 gggggacgat atcgtcgggg gg                                          22

<210>989

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>989 gggggacgac gtcgtcgggg gg                                          22

<210>990

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>990 gggggacgag ctcgtcgggg gg                                          22

<210>991

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>991 gggggacgta cgtcgggggg                                             20

<210>992

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>992 tcaacgtt                                                          8

<210>993

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>993 tccataccgg tcctgatgct                                             20

<210>994

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>994 tccataccgg tcctaccggt                                             20

<210>995

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>995 gggggacgat cgttgggggg                                             20

<210>996

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>996 ggggaacgat cgtcgggggg                                             20

<210>997

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>997 ggggggacga tcgtcggggg g                                           21

<210>998

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>998 gggggacgat cgtcgggggg g                                           21

<210>999

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>999 aaagacgtta aa                                                     12

<210>1000

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1000 aaagagctta aa                                                     12

<210>1001

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(6)...(6)

<223>m5c

<400>1001 aaagangtta aa                                                     12

<210>1002

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1002 aaattcggaa aa                                                     12

<210>1003

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1003 gggggtcatc gatgaggggg g                                           21

<210>1004

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1004 gggggtcaac gttgaggggg g                                           21

<210>1005

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1005 atgtagctta ataacaaagc                                             20

<210>1006

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1006 ggatcccttg agttacttct                                             20

<210>1007

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1007 ccattccact tctgattacc                                             20

<210>1008

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1008 tatgtattat catgtagata                                             20

<210>1009

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1009 agcctacgta ttcaccctcc                                             20

<210>1010

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1010 ttcctgcaac tactattgta                                             20

<210>1011

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1011 atagaaggcc ctacaccagt                                             20

<210>1012

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1012 ttacaccggt ctatggaggt                                             20

<210>1013

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1013 ctaaccagat caagtctagg                                             20

<210>1014

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1014 cctagacttg atctggttag                                             20

<210>1015

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1015 tataagcctc gtccgacatg                                             20

<210>1016

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1016 catgtcggac gaggcttata                                             20

<210>1017

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1017 tggtggtggg gagtaagctc                                             20

<210>1018

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1018 gagctactcc cccaccacca                                             20

<210>1019

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1019 gccttcgatc ttcgttggga                                             20

<210>1020

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1020 tggacttctc tttgccgtct                                             20

<210>1021

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1021 atgctgtagc ccagcgataa                                             20

<210>1022

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1022 accgaatcag cggaaagtga                                             20

<210>1023

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1023 tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

<210>1024

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1024 ggagaaaccc atgagctcat ctgg                                        24

<210>1025

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1025 accacagacc agcaggcaga                                             20

<210>1026

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1026 gagcgtgaac tgcgcgaaga                                             20

<210>1027

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1027 tcggtaccct tgcagcggtt                                             20

<210>1028

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1028 ctggagccct agccaaggat                                             20

<210>1029

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1029 gcgactccat caccagcgat                                             20

<210>1030

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1030 cctgaagtaa gaaccagatg t                                           21

<210>1031

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1031 ctgtgttatc tgacatacac c                                           21

<210>1032

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1032 aattagcctt aggtgattgg g                                           21

<210>1033

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1033 acatctggtt cttacttcag g                                           21

<210>1034

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1034 ataagtcata ttttgggaac tac                                         23

<210>1035

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1035 cccaatcacc taaggctaat t                                           21

<210>1036

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1036 ggggtcgtcg acgagggggg                                             20

<210>1037

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1037 ggggtcgttc gaacgagggg gg                                          22

<210>1038

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1038 ggggacgttc gaacgtgggg gg                                          22

<210>1039

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(9)...(9)

<223>n is 5-methylcytosine.

<400>1039 tcctggcgng gaagt                                                  15

<210>1040

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1040 ggggaacgac gtcgttgggg gg                                          22

<210>1041

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1041 ggggaacgta cgtcgggggg                                             20

<210>1042

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1042 ggggaacgta cgtacgttgg gggg                                        24

<210>1043

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1043 ggggtcaccg gtgagggggg                                             20

<210>1044

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1044 ggggtcgacg tacgtcgagg gggg                                        24

<210>1045

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1045 ggggaccggt accggtgggg gg                                          22

<210>1046

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1046 gggtcgacgt cgagggggg                                              19

<210>1047

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1047 ggggtcgacg tcgagggg                                               18

<210>1048

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1048 ggggaacgtt aacgttgggg gg                                          22

<210>1049

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1049 ggggacgtcg acgtggggg                                              19

<210>1050

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1050 gcactcttcg aagctacagc cggcagcctc tgat                             34

<210>1051

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1051 cggctcttcc atgaggtctt tgctaatctt gg                               32

<210>1052

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1052 cggctcttcc atgaaagtct ttggacgatg tgagc                            35

<210>1053

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1053 tcctgcaggt taagt                                                  15

<210>1054

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1054 gggggtcgtt cgttgggggg                                             20

<210>1055

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1055 gggggatgat tgttgggggg                                             20

<210>1056

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>修饰碱基

<222>(7)...(7)

<223>m5c

<221>修饰碱基

<222>(11)...(11)

<223>m5c

<400>1056 gggggangat ngttgggggg                                             20

<210>1057

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1057 gggggagcta gcttgggggg                                             20

<210>1058

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1058 ggttcttttg gtccttgtct                                             20

<210>1059

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1059 ggttcttttg gtcctcgtct                                             20

<210>1060

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1060 ggttcttttg gtccttatct                                             20

<210>1061

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1061 ggttcttggt ttccttgtct                                             20

<210>1062

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1062 tggtcttttg gtccttgtct                                             20

<210>1063

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1063 ggttcaaatg gtccttgtct                                             20

<210>1064

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1064 gggtcttttg ggccttgtct                                             20

<210>1065

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1065 tccaggactt ctctcaggtt tttt                                        24

<210>1066

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1066 tccaaaactt ctctcaaatt                                             20

<210>1067

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1067 tactactttt atacttttat actt                                        24

<210>1068

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1068 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg                                        24

<210>1069

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1069 ttgttgttgt tgtttgttgt tgttg                                       25

<210>1070

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1070 ggctccgggg agggaatttt tgtctat                                     27

<210>1071

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1071 gggacgatcg tcggggggg                                              19

<210>1072

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1072 gggtcgtcga cgaggggggg                                             20

<210>1073

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1073 ggtcgtcgac gaggggggg                                              19

<210>1074

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1074 gggtcgtcgt cgtggggggg                                             20

<210>1075

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1075 ggggacgatc gtcggggggg                                             20

<210>1076

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1076 ggggacgtcg tcgtgggggg                                             20

<210>1077

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1077 ggggtcgacg tcgacgtcga ggggggg                                     27

<210>1078

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1078 ggggaaccgc ggttgggggg g                                           21

<210>1079

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1079 ggggacgacg tcgtgggggg g                                           21

<210>1080

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1080 tcgtcgtcgt cgtcgtgggg ggg                                         23

<210>1081

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1081 tcctgccggg gaagt                                                  15

<210>1082

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1082 tcctgcaggg gaagt                                                  15

<210>1083

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1083 tcctgaaggg gaagt                                                  15

<210>1084

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1084 tcctggcggg caagt                                                  15

<210>1085

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1085 tcctggcggg taagt                                                  15

<210>1086

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1086 tcctggcggg aaagt                                                  15

<210>1087

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1087 tccgggcggg gaagt                                                  15

<210>1088

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1088 tcggggcggg gaagt                                                  15

<210>1089

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1089 tcccggcggg gaagt                                                  15

<210>1090

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1090 gggggacgtt ggggg                                                  15

<210>1091

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1091 ggggtttttt ttttgggggg                                             20

<210>1092

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1092 ggggcccccc ccccgggggg                                             20

<210>1093

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1093 ggggttgttg ttgttggggg g                                           21

<210>1094

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1094 tttttttttt tttttttttt tttttttttt                                  30

<210>1095

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1095 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                  30

<210>1096

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1096 cccccccccc cccccccccc cccccccccc                                  30

<210>1097

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1097 cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg                                  30

<210>1098

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1098 gattttatcg tc                                                     12

<210>1099

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1099 tcgatttttc ga                                                     12

<210>1100

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1100 tcatttttat ga                                                     12

<210>1101

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1101 gttttttacg ac                                                     12

<210>1102

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1102 tcaatttttt ga                                                     12

<210>1103

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1103 acgtttttac gt                                                     12

<210>1104

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1104 tcgtttttac ga                                                     12

<210>1105

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1105 tcgattttta cgtcga                                                 16

<210>1106

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1106 aattttttaa cgtt                                                   14

<210>1107

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1107 tcgtttttta acga                                                   14

<210>1108

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1108 acgtttttta acgt                                                   14

<210>1109

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1109 gatttttatc gtc                                                    13

<210>1110

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1110 gacgattttt cgtc                                                   14

<210>1111

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1111 gattttagct cgtc                                                   14

<210>1112

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1112 gatttttacg tc                                                     12

<210>1113

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1113 attttatcgt                                                        10

<210>1114

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1114 aacgattttt cgtt                                                   14

<210>1115

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1115 tcacttttgt ga                                                     12

<210>1116

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1116 tcgtatttta                                                        10

<210>1117

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1117 acttttgtac cggt                                                   14

<210>1118

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1118 tcgatttttc gacgtcga                                               18

<210>1119

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1119 acgatttttc gt                                                     12

<210>1120

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1120 gatgatcgtc                                                        10

<210>1121

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1121 tcgatgtcga                                                        10

<210>1122

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1122 tcatgtatga                                                        10

<210>1123

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1123 gtgttacgac                                                        10

<210>1124

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1124 tcaatgttga                                                        10

<210>1125

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1125 acgtgtacgt                                                        10

<210>1126

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1126 tcgtgtacga                                                        10

<210>1127

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1127 tcgatgtacg tcga                                                   14

<210>1128

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1128 aatgttaacg tt                                                     12

<210>1129

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1129 tcgtgttaac ga                                                     12

<210>1130

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1130 acgtgttaac gt                                                     12

<210>1131

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1131 gatgtatcgt c                                                      11

<210>1132

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1132 gacgatgtcg tc                                                     12

<210>1133

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1133 gatgagctcg tc                                                     12

<210>1134

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1134 gatgtacgtc                                                        10

<210>1135

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1135 atgatcgt                                                          8

<210>1136

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1136 aacgatgtcg tt                                                     12

<210>1137

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1137 tcactggtga                                                        10

<210>1138

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1138 tcgtatga                                                          8

<210>1139

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1139 actggtaccg gt                                                     12

<210>1140

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1140 tcgatgtcga cgtcga                                                 16

<210>1141

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1141 acgatgtcgt                                                        10

<210>1142

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1142 tgcaggaagt ccgggttttc cccaaccccc c                                31

<210>1143

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1143 gacgtt                                                            6

<210>1144

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1144 gtcgtt                                                            6

<210>1145

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1145 tcgtcgtt                                                          8

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