应用母牛分枝杆菌治疗免疫介导疾病的方法和组合物
阅读：669发布：2020-10-02
专利汇可以提供应用母牛分枝杆菌治疗免疫介导疾病的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种用于 治疗 呼吸系统的免疫介导失调，如分枝杆菌如结核分枝杆菌、贪食分枝杆菌，肉样瘤病、气喘和 肺 癌，该方法包括适用至少一种 脱脂 或脱糖脂的母 牛 分枝杆菌细胞。，下面是应用母牛分枝杆菌治疗免疫介导疾病的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.含有已经酸水解处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌 (Mycobacterium vaccae)细胞的组合物。
2.权利要求1的组合物，其中已经酸水解处理的去脂去糖脂母牛 分枝杆菌细胞含有的半乳糖量小于总碳水化合物的9.7％。
3.权利要求1的组合物，其中已经酸水解处理的去脂去糖脂母牛 分枝杆菌细胞含有的葡糖胺量为总碳水化合物的约8.7％。
4.权利要求1的组合物，其中已经酸水解处理的去脂去糖脂母牛 分枝杆菌细胞与未处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌细胞相比，除去了 阿拉伯半乳聚糖。
5.权利要求1的组合物，还含有一种佐剂。
6.权利要求1的组合物在制备用于治疗患者失调的药物中的用途， 所述失调选自：呼吸系统失调和过敏性失调。
7.权利要求6的用途，其中呼吸系统失调为气喘。
8.权利要求6的方法，其中呼吸系统失调特征为呼吸系统组织嗜 曙红细胞增多。
9.权利要求1的组合物在制备用于减少患者嗜曙红细胞的药物中 的用途。
发明领域
本发明关于免疫介导失调的治疗方法。在特定实施方案中，本发明关 于应用含制于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)成分的组合物，来治疗呼吸系统的免疫介导失调，如肉样瘤 病、气喘和肺癌，来治疗过敏性失调，如特异反应性皮炎和湿疹，来治疗 得益于嗜曙红细胞增多减缓的失调，来治疗和预防传染病，如结核分枝杆 菌或贪食分枝杆菌(Mycobacterium avium)感染，并来治疗[动脉]粥样 硬化、高胆固醇血症和其他可由调节IL-10产生改善的失调。
发明背景
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。它在发展中国家是 一种主要疾病，在发达地区问题也愈益严重，每年约八百万人感染，三百 万人死亡。尽管感染可在相当长时期内无症状，该病常表征为肺慢性炎症， 导致发烧和呼吸系统症状。若不救治，可致显著发病和死亡。
尽管一般可用大量抗生素治疗控制结核病，该治疗尚不足以防止疾病 传播。受感染的个体可在一段时期内无症状但具传染性。此外，尽管服从 疗程很关键，却难以监控病人行为。一些病人不完成疗程，可导致无效治 疗和抗药分枝杆菌的发展。
抑制结核病传播需要有效的疫苗接种和准确的早期诊断。目前，接种 活菌是诱导保护性免疫的最有效方法。最常用的分枝杆菌是卡介苗(BCG) 为牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的无毒株。然而，BCG的安全性 和功效性是有争议的，有些国家，如美国，不向公众接种。结核分枝杆菌 诊断常用皮试，这包括结核菌素PPD(蛋白纯化衍生物)的皮内注射。抗 原特异的T细胞反应导致注射处于注射后48-72小时可测量的硬结，从 而指示分枝杆菌抗原。然而，该测试的灵敏性和特异性却是问题，且接种 BCG的个体能不能区别于受感染的个体。
用于结核病，还有麻风免疫治疗的较不为所知的分枝杆菌是母牛分枝 杆菌，它对人无致病性。然而，与BCG相比，关于母牛分枝杆菌功效的信 息较少，且它未广泛用于公众接种。据信，牛分枝杆菌BCG和母牛分枝杆 菌含可由结核分枝杆菌感染个体的免疫系统所识别的抗原组合物。
若干专利和其他出版物公开了由服用分枝杆菌，包括母牛分枝杆菌或 特定的分枝杆菌片段对各种情况的治疗。美国专利4716038公开了由服用 包括母牛分枝杆菌的分枝杆菌来诊断、接种和治疗包括关节炎病的各类型 自身免疫疾病。美国专利4724144公开了含来自母牛分枝杆菌的抗原物质 的免疫治疗剂来治疗分枝杆菌病，尤其是结核病和麻风，并作为化疗佐剂。 国际专利出版WO 91/01751公开了用来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫 调节物质作为免疫预防剂来延迟或/和防止AIDS发病。国际专利出版WO 94/06466公开了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质用于治疗 HIV感染，伴或不伴AIDS，伴或不伴结核病。
美国专利5599545公开了应用分枝杆菌，特别是整个、失活的母牛分 枝杆菌作为与非内源于母牛分枝杆菌的抗原服用的佐剂。该专利推理佐剂 的利效可以是由于热体克蛋白65(hsp65)。国际专利公开WO 92/08484 披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质用于治疗眼色素层 炎。国际专利公开WO 93/16727披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免 疫调节物质用于治疗与由感染引发的自身免疫反应关联的精神疾病。国际 专利公开WO 95/26742披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物 质用于延迟或预防肿瘤生长或扩散。国际专利出版WO 91/02542公开了灭 活的母牛分枝杆菌用于治疗慢性炎症失调，其中病人显示出IL-6和/或 TNF的异常高水平释放或病人IgG显示出异常高比例的agalactosyl IgG。 该出版物中提及的失调有牛皮癣、类风湿关节炎。分枝杆菌病、Crohn’s 病、原发胆硬变、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、多发性硬 化、Guillain-Barre症、原发糖尿病及移植排斥的某些方面。
母牛分枝杆菌是已知分枝杆菌中惟一热制备物保持疫苗和免疫治疗特 性的。如，牛分枝杆菌BCG疫苗，用于抗结核病接种，采用活件。热杀伤 的牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌当用于疫苗时不具保护性质。已从一些 分枝杆菌中分离出一些具佐剂性质的组合物。这些佐剂的效果基本上是刺 激特定免疫反应机制抗他物种抗原。
已从分枝杆菌中分离出两大类具佐剂性质的组合物。第一类是水溶蜡 D馏分(White等，Immunology 1：54，1958；美国专利4036953)。第二 类是述于美国专利3956481和4036953的胞壁酰二肽基质(约等摩尔量的 N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸)。这些组合物在其组分的以下方面不 同于本发明的去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)：
1.它们是水溶剂，而DD- 母牛分枝杆菌不溶于水溶液。
2.它们含一些分枝杆菌细胞壁单元的小寡聚物，或由各种溶剂提取 自细菌，或由酶消化自细胞壁。对比地，DD- 母牛分枝杆菌含经加工的分 枝杆菌细胞。
3.以蛋白水解酶消化去除其制备物中的全部蛋白。其制备物的惟一 要素是细胞壁肽聚糖结构成分，具体为丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、 N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸。对比地，DD- 母牛分枝杆菌含50％ (质量比)蛋白，包括一些不同的蛋白种类。
肉样瘤病病因未知，表征为影响身体许多器官尤其是肺、淋巴结和肝 的肉芽肿炎症。 肉样肉芽瘤含单核吞噬细胞，上皮样细胞和巨大细胞居中， 及T淋巴细胞。CD4T淋巴细胞与上皮样细胞紧密联结，而CD4和CD8T淋 巴细胞集于周边。肉样瘤病的特征免疫异常包括外周血和支气管肺泡灌洗 高球蛋白血及皮肤对结核菌素和其他类似抗原，如念珠菌属和流行性腮腺 炎，“迟滞型”过敏反应的抑制。外周血淋巴细胞数目减少，外周血CD4∶CD8 比例压至约1-1.5∶1。这些并非意味着一般免疫缺陷，都是“局部于”疾 病活动场所的免疫活性升高的结果。在肺肉样瘤病病人，支气管肺泡灌洗 恢复的细胞总数增加五至十倍，且淋巴细胞比例由正常小于10％-14％ 增至15％-50％。90％多恢复的淋巴细胞是T淋巴细胞，且报道CD4∶CD8 比例由正常对照值1.8∶1增至10.5∶1。 T淋巴细胞主要为Th1类，产生IFN -γ和IL-2细胞因子，而非Th2类。治疗后，肉样肺中Th1淋巴细胞增 长得到矫正。
肉样瘤病在几乎所有病例中都牵涉肺。甚至当病变主要见于其他器官 时，常有亚临床的肺感染。尽管一些肉样瘤病自动消退，约50％病人留 下至少轻度的永久性器官功能异常。严重时，肺纤维化发展并进为肺衰竭 而需植肺。治疗肉样瘤病的主成分是皮质类固醇。初始对皮质类固醇有反 应的病人常复发，并需其他免疫抑制药物治疗，如氨甲蝶呤或环孢菌素。
气喘是常见病，高发于发达地区。气喘表征为气管支气管树对各种刺 激反应性增强，原发生理干扰为可逆性气流受限，可为自发的或药物相关 的，病理hallmark为气道炎症。临床上，气喘可分为外源型和内源型。
外源气喘具可鉴别的沉淀物，可认为是特异反应性的，职业性的和药 物诱发的。特异反应性气喘与产生特异免疫球蛋白E(IgE)的Th2型免疫 反应增强有关，对常见空气过每原和/或特异反应性症状皮试阳性。据症 状的发病时季，可进一步分为季节性和多年性。外源气喘气流梗阻是由于 气道炎症引发的非特异性支气管过反应性。炎症由包括肥大细胞、嗜酸性 粒细胞和淋巴细胞的各种炎症细胞释放的化学物质所介导。这些介导物的 行为导致血管通透，粘液分泌和支气管平滑肌缢缩。在特异反应性气喘， 产生气道炎症的免疫反应是由分泌IL-4、IL-5和IL-10的Th2类T细 胞引起的。已证实特异反应性气喘肺的淋巴细胞激活时产生IL-4和IL -5。IL-4和IL-5都是Th2类的细胞因子，并为气喘中IgE产生和嗜 酸性粒细胞加入所需。职业性气喘可与IgE对蛋白半抗原的发展有关，如 在塑料工人为酸酐，和西部红松诱发气喘的大侧柏酸，或与非IgE相关的 机制，如见于甲苯二异氰酸诱发气喘的。药物诱发气喘可见于服用阿斯匹 林或其他非类固醇抗炎药后；常见于有其他特征如鼻polyposis和鼻窦炎 的特定病人群。报道内源或原因不明的气喘于上呼吸道感染后发展，但在 中年或老年人中可从新发生，在此人群中治疗比外源气喘更难。
理想地，气喘可由回避诱因过敏原来预防，但这并非总是可能的，诱 因过敏原也非总易于鉴别。医疗气喘基于应用皮质类固醇和支气管舒张药 来缓减炎症并回复气路梗阻。对慢性气喘，以皮质类固醇治疗导致不可接 受的不利副反应。
与气喘免疫异常类似的另一失调为过敏性鼻炎。过敏性鼻炎是常见 病，估计影响至少10％人群。过敏性鼻炎可以是对花粉的变态反应引发的 季节性的(花粉气喘)。非季节性或多年鼻炎由对如家居尘螨或动物皮屑 的抗原的变态反应引发。
过敏性鼻炎的异常免疫反应表征为特异于过敏原的IgE抗体的过量生 产。炎症反应发生于鼻粘膜，而非如气喘在更下的气道。如气喘，病变组 织的局部嗜酸性粒细胞是过敏性鼻炎的主要特征。炎症的结果，病人发展 喷嚏，流涕和充血。更严重时，炎症延及眼(结膜炎)，喉和外耳。尽管 不威胁生命，过敏性鼻炎可非常失能，阻碍正常活动，干扰工作能力。目 前治疗用抗组胺剂，鼻疏血剂和，如治气喘的sodium cromoglycate和皮 质类固醇。
特异反应性皮炎，又称特异反应性湿疹，是慢性复发的瘙痒炎症皮肤 病，常发于有各种过敏失调遗传史的家庭，如过敏性鼻炎和气喘。特异反 应性皮炎正逐渐流行，至约15％人群在童年期患过特异反应性皮炎。主要 症状为皮肤干燥和主要位于面、颈、屈肌侧和四肢弯曲处的皮炎(湿疹)， 伴有严重瘙痒。典型发作于一生中的头五年。在许多病人，该皮肤病于童 年期消失，但症状却可持续至成年。进一步，50％的病人发展气喘，约75 ％的病人发展过敏性鼻炎。这是世界范围内最常见的皮炎之一。
过敏原在特异反应性皮炎中作用重要。约80％的病人具对各种食物 和吸入过敏源的IgE抗体，大部分严重特异反应性皮炎病人血清IgE水平 升高，特别是如果他们还患其他特异反应性病。此外，血中嗜酸性粒细胞 循环水平通常升高。在特异反应性皮炎，病变皮肤的真皮渗润巨噬细胞、 T细胞和嗜酸性粒细胞，在慢性病变胞大细胞数目增多。急性病变有显著 多的细胞表达细胞因子IL-4和IL-5和IL-13，意味Th2类T细胞的 优先累积。此外，特异反应性皮炎患者的循环T细胞比正常人产生更多的 IL-4和IL-5。Th2细胞因子在启动过敏反应中起重要作用。IL-4作用 是将抗体生产调至IgE同型，发展Th2细胞和诱导募集嗜酸性粒细胞的内 皮细胞上的粘着分子。IL-5对于嗜酸性粒细胞的发育和分化很重要。
与Th2细胞不同，Th1细胞产生IFNγ和IL-2。慢性特异反应性皮肤 病变中的Th1细胞已经鉴定。因为IL-2对T细胞生长很重要并有致异常 皮层加厚之效应，Th1细胞也可参与特异反应性皮炎的病理。以卵清蛋白 重复上表皮(epicutaneous)致敏可致小鼠特异反应性皮炎似病变。这些 小鼠的引流淋巴结T细胞受体外卵清蛋白刺激时分泌IL-4而不是IFN- γ。
过敏性接触皮炎是常见的皮肤非传染性炎症失调。在接触皮炎，身体 对特殊抗原敏感化时才发展出免疫反应。皮肤随后暴露于抗原和T细胞识 别这些抗原，导致释放各种细胞因子，T细胞增殖和聚集，并终致皮炎(湿 疹)。
过敏性接触皮炎病变中只有一小部分T细胞特异于相关抗原。激活的 T细胞可能移至炎症区而与抗原特异性无关。迟滞型过敏性只能由共享MHC 类II抗原的T细胞(CD4+细胞)转移。对接触过敏原的“反应”可由共 享MHC类I(CD8+细胞)或类II(CD4+细胞)分子的T细胞转移(Sunday 等，J.Immunol.125：1601-1605，1980)。角质形成细胞可产生能助抗原 呈T细胞的白细胞介素-1。表面抗原细胞间粘着分子-1(ICAM-1)表 达可在角质形成细胞和内皮上由细胞因子肿瘤坏死因子(INF)和干扰素 -γ(IFN-γ)诱导。
若能鉴别病因，单独移除即将治愈过敏性接触皮炎。外用皮质类固醇 对炎症有用。已在迟滞型超敏性观察到环孢菌素对体外引发T细胞促炎功 能的抑制效果(Shidani等，Eur.J.Immunol.14：314-318，1984)。还 报道了环孢菌素对小鼠T细胞早期活化的抑制效果(Milon等，Ann.Immunol. (Inst.Pasteur)135d：237-245，1984)。
肺癌是首要的癌症致死因。肺癌发病率持续上升，世界卫生组织估计 至公元2000年每年将有二百万新病例。肺癌广义分为两类：小细胞肺癌 (SCLC)占所有肺癌的20％-25％，和非小细胞肺癌(NSCLC)占其余75 ％。SCLC倾向于早期扩散，90％患者诊断时波及(involvement)胸部呈 纵隔淋巴节。SCLC以化疗或化疗结合放疗治疗。完全反应率变化自10％ 至50％。对无波及(involvement)淋巴节的罕见病人，手术继以化疗可 致超过60％的治愈率。NSCLC预后较悲观，因为多数病人在诊断时病情已 恶化。手术移除肿瘤对极少数病人是可能的，NSCLC的五年存活率仅5％ -10％。
导致肺癌发展的因素复杂多样。环境和遗传因素相互作用，致序列和 增进异常性，而导致不可控的细胞增殖，临近组织入侵和向远处扩散。肺 癌患者显示细胞介导的和体液免疫均受损害。放疗和化疗进一步损伤病人 免疫功能。已尝试以未活化的肿瘤细胞或肿瘤抗原免疫病人来增强机体抗 肿瘤反应。肺癌手术后向胸腔注入卡介苗(BCG)来增强非特异性免疫。 已尝试由向病人提供以来自体内的白介素-2(IL-2)处理的淋巴细胞来 增强抗肿瘤免疫性。这些淋巴因子激活的淋巴细胞获得杀伤肿瘤细胞的能 力。目前肺癌的免疫疗法仍在发展阶段，其肺癌标准治疗功效尚待建立。
动脉粥样硬化是一种动脉壁慢性炎症疾病，表征为脂类、巨噬细胞、 T淋巴细胞、平滑肌细胞和细胞外基质累积。抗炎细胞因子产生于炎症反 应，并据信可调节炎症过程。白介素-10(IL-10)由Th2淋巴细胞和巨 噬细胞分泌，已知具抗炎性。Mallat等近来报道的研究显示IL-10对小 鼠粥样硬化病变的形成和稳定性具保护效果(Circ.Res.85：e17-24， 1999)。这些研究暗示可采用增加IL-10产生的因素来调节动脉粥样硬化 的程度和/或轻重。
显示服用IL-10有利的其他失调包括高胆固醇血症(见美国专利 5945097)；细菌感染，包括革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌感染(见美国 专利5837293和5837232)；和胰岛素依赖性糖尿病(见美国专利5827513)。 此外，美国专利5871725公布了由向病人施用IL-10激活的外周血单核 细胞(PBMC)来治疗癌症的一种方法。
发明概述
简要地，本发明提供组合物和方法来预防和治疗免疫介导失调，包括 呼吸系统失调(如结核分枝杆菌或贪食分枝杆菌等的分枝杆菌感染，肉样 瘤病，气喘，过敏性鼻炎和肺癌)，过敏性失调如特异反应性皮炎和湿疹， 得益于嗜酸性粒细胞减少的疾病，和由调节IL-10产生可改善的失调(如 动脉粥样硬化，高胆固醇血症，癌症，细菌感染和胰岛素依赖性糖尿病)。
首先，提供的组合物包括去脂去糖脂的分枝杆菌细胞。在特定实施方 案中，去脂去糖脂的细胞制备于母牛分枝杆菌，结核分枝杆菌和/或耻垢 分枝杆菌。
其次，本发明提供的组合物包括去脂去糖脂分枝杆菌细胞的衍生物， 它选自下组：经碱水解处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经酸水解处理的 去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经高碘酸处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经 蛋白酶K处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经无水氢氟酸水解处理的去脂 去糖脂分枝杆菌细胞。去脂去糖脂的母牛分枝杆菌衍生物优选地含半乳糖 量小于总碳水化合物的9.7％，更优选地小于总碳水化合物的5％，最优 选地小于总碳水化合物的3.5％。在特定实施方案中，去脂去糖脂母牛分 枝杆菌衍生物葡糖胺含量高于总碳水化合物的3.7％，优选高于总碳水化 合物的5％，更优选地高于总碳水化合物的7.5％。
又次，本发明提供方法来治疗病人失调，包括呼吸系统失调，这些方 法包括向病人施用本发明的一种组合物。在特定实施方案中，失调选自分 枝杆菌感染，气喘，肉样瘤病，过敏性鼻炎，特异反应性皮炎和肺癌。在 一个实施方案中，这些组合物施用于导向或位于肺内的气道，优选地经鼻 或口吸入，优选地以气雾剂形式施用。或者，这些组合物还可由皮内、经 皮或皮下施用。
又次，本发明提供方法，通过服用本发明的组合物来治疗病人呼吸系 统失调，其中该失调表征为呼吸系统组织中存在嗜酸性粒细胞。这些病的 例子包括气喘和过敏性鼻炎。相关地，本发明提供减少病人嗜酸性粒细胞 的方法，这包括服用此处公开的至少一种组合物。典型地，嗜酸性粒细胞 减少将变化于20％至80％。肺嗜酸性粒细胞减少百分比可于下述治疗前 后由测量气管支气管灌洗液嗜酸性粒细胞数目来确定。
又次，提供了增强IL-10产生的方法，包括服用本发明的一种组合 物。如上讨论，近来显示IL-10在粥样硬化病变形成和稳定性中起保护 作用。还显示IL-10对治疗高胆固醇血症，癌症，细菌感染和胰岛素依 赖性糖尿病有效。发明的组合物于是可用于治疗这些失调。
本发明进而提供激活αβT细胞，γδT细胞或NK细胞的方法，并由此 修复病人内皮，这些方法包括向病人施用本发明的一种组合物。
参考以下详述和附图，本发明的这些和其他方面将很清楚。所有公开 于此的参考文献因而全文引用，如同各自单独引用。
附图简述
图1示高压灭菌母牛分枝杆菌，冻干母牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛 分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂诱导IL-12。
图2比较由不同浓度热灭活(高压灭菌)母牛分枝杆菌，去脂去糖脂 母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂体外刺激 重度联合免疫缺陨(SCID)小 鼠脾细胞产生干扰素-γ。
图3示DD- 母牛分枝杆菌(Q1)和DD- 母牛分枝杆菌衍生物Q2(DD -母牛分枝杆菌-KOH)，Q3(DD- 母牛分枝杆菌-酸)，Q4(DD- 母牛分 枝杆菌-高碘酸盐(periodate))，Q6(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸 盐)，P5(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)和P6(DD- 母牛分枝杆菌-KOH -高碘酸盐)对鼻内接种这些组合物的小鼠中卵清蛋白诱导气道嗜酸性粒 细胞的抑制。对照小鼠接种PBS。
图4示DD-母牛分枝杆菌衍生物刺激THP-1细胞产生IL-10。
图5示结核分枝杆菌感染前，以热灭活 母牛分枝杆菌或去脂去糖脂 母 牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)免疫小鼠的效果。
图6示DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH的重悬浮。
图7DD-母牛分枝杆菌(R1)和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛 分枝杆菌-KOH(R2)，DD- 母牛分枝杆菌-酸(R3)，DD- 母牛分枝杆菌- 高碘酸盐(R4)，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸(R5)和DD- 母牛分枝杆 菌-KOH-高碘酸盐(R6)刺激巨噬细胞产生IL-12。
图8示DD- 母牛分枝杆菌-酸衍生物以剂量依赖方式抑制气道嗜酸 性粒细胞。
图9比较以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内或皮内免疫对肺嗜酸性粒细 胞的抑制效果。
图10示以DD- 母牛分枝杆菌，DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆 菌免疫对气道嗜酸性粒细胞的效果。
图11示以DD- 母牛分枝杆菌刺激人PBMC和非粘附细胞产生TNF-α。
图12A和12B分别示以DD- 母牛分枝杆菌刺激人PBMC和非粘附细胞 产生IL-10和IFN-γ。
图13示DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛分 枝杆菌-酸，Hvac和Evac抑制过敏原诱发的气道嗜酸性粒细胞。
图14示以OVA攻击三天之后，施用DD- 母牛分枝杆菌-酸，DD- 母 牛分枝杆菌-酸对严重过敏原诱发的小鼠气道嗜酸性粒细胞的疗效。
图15示施用DD- 母牛分枝杆菌-酸后立即继以OVA攻击一次或两次， DD- 母牛分枝杆菌-酸对过敏原诱发的气道嗜酸性粒细胞的抑制效果。
图16示在两次OVA攻击之间施用DD.- 母牛分枝杆菌-酸一或二 次，DD- 母牛分枝杆菌-酸抑制过敏原诱发的小鼠气道嗜酸性粒细胞 的效果。
发明详述
如上述，本发明的一般目的是治疗免疫诱导失调的组合物和方法。 在特定实施方案中，这些失调选自呼吸系统失调，过敏性失调，和服 用IL-10和/或刺激IL-10产生对病情有利的失调。呼吸系统失调的 例子有分枝杆菌感染，气喘，肉样瘤病，过敏性鼻炎和肺癌。服用或 增加产生IL-10被认为利好的失调例子有动脉粥样硬化，高胆固醇血 症，癌症，细菌感染和胰岛素依赖性糖尿病。过敏性皮肤病的例子有 特异反应性皮炎和湿疹。
特定的病原如结核分枝杆菌，和特定的癌症，被CD4+T细胞指导的 免疫攻击，称为细胞介导的免疫有效遏制。其他病原如脊髓灰质炎病 毒，还需B细胞产生的抗体遏制。这些不同类的免疫攻击(T细胞或B 细胞)受控于CD4+T细胞的不同亚群，通称为Th1和Th2细胞。
这两类Th细胞已很好地表征于小鼠模型，并由其激活时释放的细 胞因子定义。Th1亚类分泌IL-2，IFN-γ和肿瘤坏死因子。并介导巨 噬细胞活化和迟滞型超敏反应。Th2亚类释放IL-4，IL-5，IL-6和 IL-10，来刺激B细胞活化。Th1和Th2亚类相互抑制，以致IL-4抑 制Th1型反应，IFN-γ抑制Th-2型反应。类似的Th1和Th2亚类已 发现于人，并释放与小鼠模型中观察到的相同的细胞因子。Th-1型免 疫反应扩增是许多失调病情逆转的核心，包括呼吸系统失调如结核病、 肉样瘤病、气喘、过敏鼻炎和肺癌。已显示IL-12上调Th1反应，而 IL-10下调Th2反应。Zuany-Amorim等示IL-10调节淋巴细胞浸润 抗原攻击小鼠的气道，表明IL-10在调节肺过敏性炎症过程中起重要 作用(J.Clin.Invest.95：2644-2651，1995)。Borish等的研究发 现气喘病人比正常人气管支气管液IL-10水平降低(J.Allergy.Clin. Immunol.97：1288-96，1996)。
一方面，提供治疗呼吸和/或肺失调的方法，包括施用去脂去糖脂 的分枝杆菌细胞，优选去脂去糖脂的结核分枝杆菌细胞和/或去脂去糖 脂的耻垢分枝杆菌细胞。相关地，本发明提供方法，由施用含至少一 种去脂去糖脂分枝杆菌细胞衍生物的组合物来免疫治疗病人呼吸和/或 肺失调，包括结核病、肉样瘤病、气喘、过敏性鼻炎和肺癌。在特定 实施方案中，这些方法包括施用至少一种DD- 母牛分枝杆菌衍生物。如 下详述，发明者已用小鼠模型证实了这些组合物治疗气喘的功效。这 些组合物被认为治疗如气喘的疾病有效，是因为它们能抑制气喘诱发 的Th2免疫反应。在一实施方案中，这些组合物直接投放于导向和/或 肺内气道的粘膜表面。然而，这些组合物或者还可由皮内或皮下施用。
用于此的术语“呼吸系统”指肺、鼻通道、气管和支气管通道。
用于此的术语“导向或位于肺的气道”包括鼻通道、口、扁桃体 组织、气管和支气管通道。
此处用的“患者”指任何温血动物，优选人。该患者可害病也可 未患可检测到的疾病。换言之，发明的方法可用于诱导保护性免疫半 预防或治疗疾病。
此处用的术语“失活母牛分枝杆菌”指例1中热灭活的，或经2.5兆 拉德剂量60钴照射致死的母牛分枝杆菌细胞。此处用的术语“修饰母 牛分枝杆菌”包括去脂母牛分枝杆菌细胞，去糖脂母牛分枝杆菌细胞， 去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)细胞及其衍生物。DD - 母牛分枝杆菌可按下述例1制备，DD- 母牛分枝杆菌衍生物制备下 述于例2。去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝 杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)下述于例10。可按公开于此的DD- 母牛分 枝杆菌衍生物的制备过程来制备DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆 菌衍生物，如酸处理、碱处理、过碘酸盐处理、蛋白酶K处理和/或氢 氟酸处理的衍生物。
DD- 母牛分枝杆菌衍生物的半乳糖含量优选地小于总碳水化合物 的9.7％，更优选地小于总碳水化合物的5％，最优选地小于总碳水化 合物的3.5％。在特定实施方案中，DD- 母牛分枝杆菌衍生物含葡糖胺 量优选地大于总碳水化合物的3.7％，更优选地大于总碳水化合物的5 ％，最优选地大于总碳水化合物的7.5％。碱处理的DD- 母牛分枝杆 菌如DD- 母牛分枝杆菌-KOH(也作Kvac)的衍生物比DD- 母牛分枝 杆菌细胞壁连接分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的酯键数目减少，因而贫 化分枝菌酸。以酸如DD- 母牛分枝杆菌-酸(也作Avac)处理制备的 衍生物中连接阿拉伯半乳聚糖侧链和细胞壁肽聚糖的磷酸二酯键数目 减少，因而贫化阿拉伯半乳聚糖。此外，这些衍生物贫化DNA。以高碘 酸盐DD- 母牛分枝杆菌如DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐(也作Ivac) 处理制备的衍生物比DD- 母牛分枝杆菌的顺式二醇蔗糖残基数目减 少，而贫化阿拉伯半乳聚糖。以蛋白酶K处理DD- 母牛分枝杆菌(如 指作Evac的衍生物)制备的衍生物贫化蛋白和肽。以氢氟酸，如以氢 氟酸处理的DD- 母牛分枝杆菌-KOH(作Hvac)，处理制备的衍生物贫 化糖苷键。
通常，本发明的组合物可由注射(如皮内，肌内，静脉内或皮下)， 鼻内(如吸入)，口内或上表皮(皮肤外用)施用。在一实施方案中， 本发明的组合物制式适于投放至导向或肺内气道的粘膜表面。例如， 组合物可悬溶于液体，以气溶剂或类似于目前用于治疗气喘的喷雾器 来向患者投送。
为用于治疗方法，本发明的组合物可另含生理可接受的载体和/或 免疫刺激剂来引发和/或刺激免疫反应，如将多肽掺入佐剂或脂质体。 本技术领域已知的任何适合载体都可用于本发明的药物组合物，载体 类型依施用方式而变。对肠胃外施用，如皮下注射，载体优选地含水、 盐、酒精、脂肪、蜡或缓冲液。对口服、可采用上述载体或固体载体， 如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、果糖、 蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球体(如polylactic galactide)也 可用作本发明药物组合物的载体。适合的生物可降解微球体公开于， 如美国专利号4897268和5075109。
本发明组合物中可采用各种佐剂来增强免疫反应。许多佐剂含设 计用来保护抗原以免被迅速代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免 疫反应的非特异刺激剂，如脂类A，百日咳博德特氏菌，结核分枝杆菌 或如下讨论的母牛分枝杆菌。适合的商业佐剂如Freund’s不完全佐剂 和Freund’s完全佐剂(Difco实验室，底特律，MI)和Merck佐剂65 (Merck and Company公司，Rahway，NJ)。其他合适的佐剂包括明矾， 生物可降解微球体，单磷酸脂A和Quil A。
优选施用频率和有效剂量依个体而变。对DD- 母牛分枝杆菌和DD - 母牛分枝杆菌衍生物，一剂量优选地自约10μg至约1000μg，更优 选地自约10μg至约100μg。施用剂量次数在最多可达12月内自1至 约10次。
措辞“约”用于此申请指剂量中活性成分含量有指定量的多至5％ 偏差。措辞“约”用于嗜酸性粒细胞减少百分数时，有指定百分数的 多至10％偏差。
以下例说明，但不限于这些例子。
例1制备去脂去糖脂母牛分枝杆菌细胞(DD- 母牛分枝杆菌)
此例说明母牛分枝杆菌不同组合物的加工及其免疫调节性质。 热灭活母牛分枝杆菌及母牛分枝杆菌滤过物
母牛分枝杆菌(ATCC Number 15483)37℃培养于无菌培养基90(酵 母提取物2.5g/L，胰胨5g/L，葡萄糖1g/L)。离心收获细胞，转至 含葡萄糖的无菌Middle brook 7H9培养基(Difco实验室，底特律，MI)， 37℃一天。然后离心沉淀细菌，移除培养滤过物。细菌沉淀重悬于磷 酸缓冲盐水至10mg/ml浓度，相当于每毫升1010母牛分枝杆菌。细胞 悬液再于120℃灭菌15分钟。培养滤过物通过0.45μm滤器至无菌瓶 中。
制备去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)及组成分析
为制备去脂母牛分枝杆菌，离心沉淀失活母牛分枝杆菌，水洗沉 淀，再离心收集，并冻干。一份冻干的母牛分枝杆菌被保存并称作冻 干母牛分枝杆菌。当用于实验中时，重悬于PBS至所需浓度。冻干母 牛分枝杆菌以氯仿/甲醇(2∶1)室温处理60分钟来抽提脂类，抽提重 复一次。氯仿/甲醇抽提的去脂残余进一步以50％乙醇回流二小时来移 除糖脂。50％乙醇抽提重复二次。收集的50％乙醇抽提物用作母牛分 枝杆菌糖脂源(见下)。50％乙醇抽提的残余冻干并称重。去脂去糖脂 母牛分枝杆菌的制备量相当于所用母牛分枝杆菌初湿重的11.1％。为 生物测试，去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)以超声重 悬于磷酸缓冲盐水，并高压灭菌。
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌的组成分析见表 1。与热灭活母牛分枝杆菌的不溶部分相比，去脂去糖脂母牛分枝杆菌 的主要变化在于脂肪酸组合物和氨基酸组合物。表1数据显示热灭活 母牛分枝杆菌的不溶部分含10％w/w脂，总氨基酸含量为2750 nmole/mg，或约33％w/w。去脂去糖脂母牛分枝杆菌含1.3％w/w脂 和4250nmole/mg氨基酸，约51％w/w。
表1
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌的组成分析 单糖组合物 蔗糖醛醇(sugar alditol) 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 肌醇 3.2％ 1.7％ 核糖醇* 1.7％ 0.4％ 阿拉伯糖醇(Arabinitol) 22.7％ 27.0％ 甘露醇(Mannitol) 8.3％ 3.3％ 半乳糖醇(Galactitol) 11.5％ 12.6％ 葡糖醇(Glucitol) 52.7％ 55.2％
脂肪酸组合物 脂肪酸 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 C14∶0 3.9％ 10.0％ C16∶0 21.1％ 7.3％ C16∶1 14.0％ 3.3％ C18∶0 4.0％ 1.5％ C18∶1* 1.2％ 2.7％ C18∶1w9 20.6％ 3.1％ C18∶1w7 12.5％ 5.9％ C22∶0 12.1％ 43.0％ C24∶1* 6.5％ 22.9％
热灭活母牛分枝杆菌的不溶部分含10％w/w脂，而去脂去糖脂母 牛分枝杆菌含1.3％w/w脂。
氨基酸组合物 nmoles/mg 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 ASP 231 361 THR 170 266 SER 131 199 GLU 319 505 PRO 216 262 GLY 263 404 ALA 416 621 CYS* 24 26 VAL 172 272 MET* 72 94 ILE 104 171 LEU 209 340 TYR 39 75 PHE 76 132 GlcNH2 5 6 HIS 44 77 LYS 108 167 ARG 147 272
热灭活母牛分枝杆菌不溶部分氨基酸总量为2750nmole/mg，约33 ％w/w。去脂去糖脂母牛分枝杆菌氨基酸总量为4250nmole/mg，约51 ％w/w。
母牛分枝杆菌糖脂
上述收集的50％乙醇抽提物经旋转蒸发干燥，再溶于水，并冻干。 回收糖脂量约所用母牛分枝杆菌初湿重的1.2％。为生物测试，糖脂溶 于磷酸缓冲盐水。
巨噬细胞白细胞介素-12的生产
完整热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌显示具有不 同的细胞因子刺激性质。
Th1免疫反应刺激受巨噬细胞白细胞介素-12(IL-12)生产增强。 不同母牛分枝杆菌制备物刺激IL-12生产的能力示于下。
以DIFCO巯基甘醇酸酯腹膜内注射于一组C57 BL/6J小鼠。三天 后收集腹膜巨噬细胞，并置于含干扰素-γ的细胞培养物三小时。更换 培养基，加入各种浓度的完整热灭活高压灭菌母牛分枝杆菌，冻干母 牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛分枝杆菌(指图1去脂去糖脂母牛分枝 杆菌)。37℃又三天后，测试培养上清中巨噬细胞产生的IL-12。如图 1示，母牛分枝杆菌制备物刺激巨噬细胞产生IL-12。
形成对照地，检测同样母牛分枝杆菌制备物刺激天然杀伤(NK) 细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的能力。制备重度联合免疫缺损(SCID) 小鼠脾细胞。该群体含75％-80％NK细胞。脾细胞37℃孵育于含不 同浓度热灭活母牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛分枝杆菌或母牛分枝杆 菌糖脂的培养物中。图2数据显示，热灭活母牛分枝杆菌和母牛分枝 杆菌糖脂刺激干扰素-γ产生，去脂去糖脂母牛分枝杆菌刺激相对较少 干扰素-γ。图1和2数据合并显示，与完整热灭活母牛分枝杆菌相比， 去脂去糖脂母牛分枝杆菌是IL-12较好的刺激剂，而对干扰素-γ较 差。
例2 母牛分枝杆菌其他衍生物的制备和定性去脂去糖脂母牛分枝杆菌 的碱水解
此过程意在裂解对碱水解不稳定的连接，如连接分枝菌酸与分枝 杆菌细胞壁阿拉伯半乳聚糖的酯键。
按例1所述制备一克去脂去糖脂母牛分枝杆菌，悬于20mL 0.5％ KOH乙醇溶液。本技术领域已知的其他碱性剂和溶剂可用于置换KOH和 乙醇。混合物于37℃间歇搅拌孵育48小时。离心收集固体残余，乙醇 洗两次，二乙醚洗一次。产物空气干燥过夜。产量为1.01g(101％) KOH处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌，后作DD- 母牛分枝杆菌-KOH(还 作Kvac)。发现该衍生物比公开于此的去脂去糖脂母牛分枝杆菌的其他 衍生物更易溶。
去脂去糖脂母牛分枝杆菌的酸水解
此过程意在裂解酸不稳定的连接，如连接阿拉伯半乳聚糖侧链与 分枝杆菌细胞壁肽聚糖的磷酸二酯键。
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(100mg)在1mL 50 mM H2SO4中洗两次，然后重悬并离心。本技术领域已知的其他酸可用于 置换硫酸。在酸水解步骤，固体残余重悬于1mL 50mM H2SO4，60℃孵 育72小时。离心回收固体残余后，以水洗残余五次来除去酸。冻干固 体残余得58.2mg酸处理的DD- 母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌- 酸，也作Avac)或36.7mg酸处理的DD- 母牛分枝杆菌-KOH(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)。
高碘酸裂解去脂去糖脂母牛分枝杆菌
此过程意在裂解去脂去糖脂母牛分枝杆菌含顺二醇的蔗糖残基， 如肽聚糖主链上阿拉伯半乳聚糖附着位点附近的鼠李糖残基。
DD- 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌-KOH(100mg)悬于1mL 1％高碘酸于3％乙酸溶液，室温孵育1小时，离心回收固体残余。高 碘酸处理重复三次。离心回收固体残余，以5mL 0.1M氢硼化钠室温 孵育一小时。离心回收产物固体残余，并重复氢硼化钠处理。离心后， 以水洗固体残余四次并冻干，得62.8mg DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸 盐(也作Ivac)或61.0mg DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸盐。
重悬DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(各11mg)悬于磷 酸缓冲盐水(5.5mL)。室温以Virtis探针超声器超声样品不同时间 (微小探针，15％输出)。样品涡旋振荡六十秒并静置五分钟以使大颗 粒沉降。600nm测定其余悬液的光吸收。如图6示，DD- 母牛分枝杆 菌-KOH(图6作DDMV-KOH)于一分钟超声后全部重悬，进一步超声 并不增强光吸收。五分钟超声后，如重悬光吸收估计，DD- 母牛分枝 杆菌重悬(图6作DDMV)仍不完全。这些结果表明DD- 母牛分枝杆菌 -KOH比DD- 母牛分枝杆菌相当地更易溶。
去脂去糖脂母牛分枝杆菌的蛋白酶K水解
此过程意在消化蛋白和多肽，同时保留多数其他物质完整。
按例1所述制备一百毫克DD- 母牛分枝杆菌，以超声悬于9mL水 中。加入十二烷硫酸钠(SDS)至终浓度1％w/v，蛋白酶K终浓度为 100μg/mLw/v。反应混合物50℃孵育16小时。离心回收产物，以水 和磷酸缓冲盐水洗，冻干。得59mg(59％)蛋白酶K处理的DD-母 牛分枝杆菌，后作EVac。
氢氟酸水解KOH处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌
此过程意在裂解对无水氢氟酸水解不稳定的连接，如糖苷键，而 保留多数蛋白完整。
按上述制备一克DD- 母牛分枝杆菌-KOH，悬于含苯甲醚为自由基 清除剂的15mL液态氟化氢。混合物于0℃搅拌孵育一小时。蒸馏除去 氟化氢(HF)，以二乙醚洗固体残余来除去苯甲醚。以水抽提产物来得 到水溶和水不溶部分。得250mg(25％)水溶物质，和550mg(55％) 水不溶HF水解的KOH处理DD- 母牛分枝杆菌，后作HVac。
例3 去脂去糖脂母牛分枝杆菌及其衍生物对小鼠气喘的免疫效果
在气喘样过敏原特异肺病小鼠模型中检测DD- 母牛分枝杆菌及其 衍生物抑制过敏性免疫反应发展的能力。该过敏性疾病的严重性反映 为气道中累积巨多嗜酸性粒细胞。
在0至14日经腹膜内给BALB/cByJ小鼠2μg卵清蛋白于2mg明 矾佐剂，然后在第28日经鼻内给100μg卵清蛋白于50μL磷酸缓冲 盐水(PBS)。通过盐水冲洗麻醉鼠气道，收集洗出物(支气管灌洗或 BAL)，并计数嗜酸性粒细胞数目，检测出小鼠在气道累积嗜酸性粒细 胞。
按上述制备DD- 母牛分枝杆菌衍生物。10只小鼠一组，鼻内施用 200μgPBS，DD-母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌衍生物之一(Q1： DD- 母牛分枝杆菌；Q2：DD- 母牛分枝杆菌-KOH；Q3：DD- 母牛分枝 杆菌-酸；Q4：DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐；Q6和P6：DD- 母牛分 枝杆菌-KOH-高碘酸盐；P5：DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)，一周后 继以鼻内施用卵清蛋白。如图3示，与对照小鼠相比，施用卵清蛋白 六天后收集的BAL细胞嗜酸性粒细胞百分数统计上显著降低。而且， 数据显示以DD- 母牛分枝杆菌-酸和DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘 酸盐(Q3，Q6和P6)抑制气道嗜酸性粒细胞高于DD- 母牛分枝杆菌(Q1)。 对照小鼠给鼻内PBS。图3数据示每组小鼠平均值和SEM。
嗜酸性粒细胞是过敏性气喘气道中最显著的血细胞。嗜酸性粒细 胞的分泌产物使过敏性气喘气道粘膜内层(lining)肿胀并发炎。图3 数据表明DD- 母牛分枝杆菌或其衍生物减缓肺嗜酸性粒细胞累积，并 可用于减缓气道，鼻粘膜和上呼吸道中与嗜酸性粒细胞相关的炎症。 因此施用DD- 母牛分枝杆菌或其衍生物可减缓气喘和有类似免疫异常 疾病如过敏性鼻炎、特异反应性皮炎和湿疹的严重性。
此外，采集以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的小 鼠血清样品，并以标准酶联免疫测试(EIA)测定对卵清蛋白的抗体水 平。如表2示，感染BCG的小鼠血清比PBS对照血清，卵清蛋白特异 的IgG1水平较高。对照地，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆 菌免疫的小鼠有相似或较低水平的卵清蛋白特异IgG1。因IgG1抗体是 Th2免疫反应的特征，这些结果与DD- 母牛分枝杆菌对气喘诱发Th2 免疫反应的抑制效果是一致的。
表2
以热灭活母牛分枝杆菌或去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠
的抗原特异IgG1血清低水平 处理组 血清IgG1 平均值 平均标准误 母牛分枝杆菌i.n. 185.00 8.3 母牛分枝杆菌s.c. 113.64 8.0 去脂去糖脂杆菌i.n. 96.00 8.1 去脂去糖脂杆菌s.c. 110.00 4.1 BCG，巴氏消毒 337.00 27.2 BCG，Connaught 248.00 46.1 PBS 177.14 11.4
例4 去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物对THP-1细胞生产IL-10的影 响
已显示IL-10抑制Th1细胞生产细胞因子，并在抑制实验诱发的 皮肤炎症反应中起关键作用(Berg等，J.Exp.Med.182：99-108， 1995)。更近些时候，IL-10已成功用于两例临床实验来治疗牛皮癣患 者(Reich等，J.Invest.Dermatol，111：1235-1236，1998；和 Asadullah等，J.Clin.Invest.101：783-794，1998)。以下评估 在DD- 母牛分枝杆菌衍生物存在时培养的人单核细胞系(THP-1)生 产IL-10的水平。
THP-1细胞(ATCC Number TIB-202)培养于0.5mg/L链霉素， 500U/L青霉素，2mg/L L-谷氨酰胺，5×10-5Mβ-巯基乙醇和5％ 胎牛血清(FBS)补充的RPMI培养基(Gibco BRL Life Technologies)。 测试前一天，细胞以5×105细胞/mL分转培养于新鲜培养基。细胞于 含5％CO2的湿润空气中37℃孵育24小时，然后抽吸并以50mL培 养基离心洗涤。细胞重悬于5mL培养基，以锥虫蓝(Sigma，St Louis MI)染色和血细胞计数器分析测定细胞浓度和活力。DD- 母牛分枝杆 菌衍 生物(按上述制备)于50μL PBS和对照刺激剂以三次重复加入含100μL 培养基的96孔板，并制备相应稀释。脂多糖(LPS)(300μg/mL；Sigma) 和PBS用作对照。每孔加入100μL浓度为2×106细胞/ml的细胞，板 于含5％CO2的湿润空气中37℃孵育24小时。据厂商说明，用人IL -10 ELISA试剂(Phar Mingen，San Diego CA)测定每孔中IL-10 的水平。如图4示，发现DD- 母牛分枝杆菌的酸和高碘酸盐衍生物刺 激显著水平的IL-10生产。PBS对照，DD- 母牛分枝杆菌-KOH，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸盐和DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸衍生物 不刺激THP-1细胞生产IL-10。
例5母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠对结核病的影 响
此例说明以结核分枝杆菌挑战前，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的效果
此距三周分两次向小鼠腹膜内注射下列制备物之一：
a)磷酸缓冲盐水(PBS，对照)；
b)热灭活 母牛分枝杆菌(500μg)；和
c)DD- 母牛分枝杆菌(50μg)。
最后一次腹膜内免疫后三周，以5×105活H37Rv结核分枝杆菌感 染小鼠。又三周后，杀死小鼠，匀浆其脾脏，并测试结核分枝杆菌菌 落形成单位(CFU)作为感染程度的指标。
图5数据中，每点代表一只小鼠。以PBS单独免疫对照小鼠回收 的CFU数作为基线。实验小鼠的所有数据表达为对照小鼠基线下CFU 的对数(或对数保护)。如图5示，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛 分枝杆菌免疫的小鼠分别显示＞1或0.5logs CFU的平均降低。数据证 实以 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的有效性，并表明DD- 母 牛分枝杆菌可发展为抗结核病的疫苗。
例6去脂去糖脂母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物的组 成分析
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的碳水组成分析
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的碳水化合物以标 准技术测定。结果示于表3，其中DDMV代表DD- 母牛分枝杆菌；DDMV -KOH代表DD- 母牛分枝杆菌-KOH；DDMV-A代表DD- 母牛分枝杆菌 -酸；DDMV-I代表DD- 母牛分枝杆菌高碘酸盐；DDMV-KOH-A代表 DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸；DDMV-KOH-I代表DD- 母牛分枝杆菌 -KOH-高碘酸盐。
表3
DD-母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌衍生物的碳水化合物分析 碳水化合物 DDMV DDMV- KOH DDMV-A DDMV-I DDMV- KOH-A DDMV- KOH-I 半乳糖胺 26.6* 29.2 14.9 37.7 0.3 3.9 葡糖胺 3.7 3.6 8.7 35.6 12.2 63.2 半乳糖 9.7 9.2 0.7 3.4 0.0 0.0 葡萄糖 56.9 54.8 71.1 23.0 87.5 27.5 甘露糖 3.2 3.2 4.7 0.4 0.02 5.5 果糖 未测 未测 未测 未测 未测 未测
*所有值为总碳水化合物的百分数
结果证明每种DD- 母牛分枝杆菌衍生物碳水组成含量不同，如从 酸、高碘酸盐或碱处理细胞的不同效果所预期。此外，与DD- 母牛分 枝杆菌衍生物相比，DD- 母牛分枝杆菌的碳水化合物显然不同。如所 期，DD- 母牛分枝杆菌-酸和DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐衍生物中 半乳糖含量低于DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH。这些 值反映了酸和高碘酸盐在制备衍生物中的作用，即从肽聚糖主链裂解 掉阿拉伯半乳聚糖侧链。
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的核酸分析
蛋白酶K处理后，以凝胶电泳分析DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛 分枝杆菌衍生物的核酸含量，显示DD- 母牛分枝杆菌，DD- 母牛分枝 杆菌-高碘酸盐和DD- 母牛分枝杆菌-KOH含少量DNA，而DD- 母牛 分枝杆菌-酸中未检测出核酸。
例7去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物对巨噬细胞生产IL-12的影响
巨噬细胞生产的白细胞介素-12(IL-12)增强刺激Th1免疫反 应。下面证明不同 母牛分枝杆菌制备物刺激IL-12生产的能力。
一组BALB/cByJ小鼠腹膜内注射巯基甘醇酸酯(Difco.实验室， 底特律，MI)。三天后采集腹膜巨噬细胞，并置于含IFN-γ(2U/mL) 的细胞培养物中四小时。以补充有110mg/L丙酮酸，116mg/L精氨酸， 36mg/L L-天冬酰胺，6mg/L叶酸，0.5mg/L链霉素，500U/L青霉 素，2mg/L L-谷氨酸，5×10-5M 2-巯基乙醇和5％胎牛血清(FBS) 的50mL冷DMEM培养基(Gibco Life Techrologies，Gaithersburg MD) 洗涤细胞三次，并调浓度至2×106细胞/mL。加入各种浓度的DD- 母 牛分枝杆菌(图7作R1)和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(图7作R2)，DD - 母牛分枝杆菌-酸(图7作R3)，DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐(图 7作R4)，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸(图7作R5)和DD- 母牛分枝 杆菌-KOH-高碘酸盐(图7作P6)。每孔加入0.1mL浓度为2×106 细胞/mL的IFN-γ处理过的巨噬细胞。37℃又孵育24小时后，收集培 养上清，并测试巨噬细胞产生的IL-12。以DD- 母牛分枝杆菌衍生物 刺激的巨噬细胞生产IL-12水平示于图7。数据表明DD- 母牛分枝杆 菌衍生物刺激巨噬细胞生产IL-12约与DD- 母牛分枝杆菌水平相同， 除DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸诱导较少IL-12产生外。
例8以去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物的不同剂量免疫小鼠的效果
此例说明DD- 母牛分枝杆菌衍生物的不同剂量对肺过敏性免疫反 应发展的免疫效果。这在气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型中得到证 实。这种过敏性疾病的严重性反映于累积在气道的巨大数目嗜酸性粒细 胞。
在0和7天腹膜内注射200μL含10μg卵清蛋白(OVA)和1mg 明矾佐剂的乳剂，使BALB/cBYJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21天， 麻醉小鼠，鼻内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸或PBS。在28 和32天，麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35天，杀死小鼠，用PBS 操作支气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析BAL细胞样品来测定嗜 酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。以嗜酸性粒细胞百分数值乘所得 淋巴细胞总数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞总数用血细胞计数 器测定。
图8示，DD- 母牛分枝杆菌-酸引致气道嗜酸性粒细胞(％嗜酸性粒 细胞)的显著的剂量依赖抑制，增加DD- 母牛分枝杆菌-酸的剂量，则观 察到抑制水平升高。
例9以去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠的途径的效果
此例说明DD- 母牛分枝杆菌衍生物免疫的不同途径抑制气喘样过敏 原特异性肺病小鼠模型中气道嗜酸性粒细胞的效果。
在0和7日，以腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂 的乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠， 鼻内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸或PBS。在28和32日， 麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35日，杀死小鼠，并用PBS作支 气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析BAL细胞样品来测定嗜酸性粒 细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总 数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞数用血细胞计数器测定。
如图9示，与对照小鼠相比，观察到以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内免 疫小鼠继以卵清蛋白攻击六天后采集的BAL细胞嗜酸性粒细胞百分数显 著降低。更进一步，数据显示以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内施用对气道嗜 酸性粒细胞的抑制强于皮内免疫。对照小鼠给以鼻内PBS。图9数据示 每组小鼠的平均值和平均标准误差。
例10去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝杆菌 (DD- M.smegmatis)的制备和组成分析
结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的培养滤过物
按例1述母牛分枝杆菌的方法，培养耻垢分枝杆菌(耻垢分枝杆菌 ATCC Number 27199)于加1％葡萄糖的培养基90。37℃孵育5天后， 离心收集细胞，并移除培养滤过物。细菌沉淀重悬于磷酸缓冲盐水至10 mg/mL浓度，相当于每毫升1010耻垢分枝杆菌。细胞悬液120℃灭菌15 分钟。培养滤过物通过0.45μm滤器至无菌瓶中。
结核分枝杆菌H37Rv株(ATCC Number 27294)培养物在GAS培养 基(0.3g细菌酪胨(Difco Laboratories，底特律MI)，0.05g柠檬 酸铵铁，4g K2HPO4，2g柠檬酸，1g L-丙氨酸，1.2g MgCl2·6H2O， 0.6g K2SO4，2g NH4Cl，1.8mL NaOH(10N)，5mL甘油，pH7.0)37 ℃生长五天。细胞收集和进一步处理如上述对耻垢分枝杆菌细胞。
制备去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和去脂去糖脂 耻垢分枝杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)及组成分析。
为制备去糖去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝 杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)，离心沉淀失活结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌， 水洗沉淀并再离心收集，冻干。分别保留一份冻干结核分枝杆菌和耻垢 分枝杆菌，称作冻干结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。当用于实验时，冻 干物质重悬于PBS至理想浓度。
按例1述DD- 母牛分枝杆菌的制备，来制备去脂去糖脂结核分枝杆 菌和耻垢分枝杆菌。为生物测试冻干DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝 杆菌以超声重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)并灭菌。
DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌的组成分析见表4和表5。DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌与DD- 母牛分枝杆菌在单糖组合物上 的主要不同在于某些单糖成分。表4数据示DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻 垢分枝杆菌分别含1.3％和0.0mol％葡萄糖，而DD- 母牛分枝杆菌含28.1 mol％。
DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌的氨基酸组合物见表5。DD- 结核分枝杆菌含6537.9nmoles/mg氨基酸，或约78.5％w/w，DD- 耻垢 分枝杆菌含6007.7nmoles/mg氨基酸，约72.1％w/w蛋白质。与表1DD- 母牛分枝杆菌的氨基酸分析相比，DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌 比DD- 母牛分枝杆菌含更多总％蛋白(55.1％)。
表4
去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌的单糖化合物 单糖 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 重量％ 摩尔％ 重量％ 摩尔％ 肌醇 0.0 0.0 0.0 0.0 甘油 9.5 9.7 15.2 15.5 阿拉伯糖 69.3 71.4 69.3 70.0 木糖 ND* ND 3.9 4.0 甘露糖 3.5 3.0 2.2 1.9 葡萄糖 1.5 1.3 0.0 0.0 半乳糖 12.4 10.7 9.4 8.0
*未做
表5
去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌的氨基酸组成 氨基酸 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 总蛋白 nmoles/mg 总蛋白 ％ 总蛋白 nmoles/mg 总蛋白 ％ 天冬氨酸 592.5 9.1 557.0 9.3 苏氨酸 348.1 5.3 300.5 5.0 丝氨酸 218.6 3.3 252.6 4.2 谷氨酸 815.7 12.5 664.9 11.1 脯氨酸 342.0 5.2 451.9 7.5 甘氨酸 642.9 9.8 564.7 9.4 丙氨酸 927.9 14.2 875.1 14.6 胱氨酸 31.8 0.5 20.9 0.3 缬氨酸 509.7 7.8 434.8 7.2 蛋氨酸 122.6 1.9 113.1 1.9 异亮氨酸 309.9 4.7 243.5 4.1 亮氨酸 542.5 8.3 490.8 8.2 酪氨酸 116.0 1.8 108.3 1.8 苯丙氨酸 198.9 3.0 193.3 3.2 组氨酸 126.1 1.9 117.2 2.0 赖氨酸 272.1 4.2 247.8 4.1 精氨酸 421.0 6.4 371.7 6.2
例11以去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌免疫对小 鼠气喘的影响
按上述于例8，在气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型中检测DD- 结 核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌抑制过敏性免疫反应发展的能力。结果 说明DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌免疫对抑制气道嗜酸性粒细 胞的效果，说明其免疫调节性。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻 内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌，DD- 结核分枝杆菌，DD- 耻垢分 枝杆菌或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35 日，杀死小鼠，并用PBS作支气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析 BAL细胞样品来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜酸性粒细 胞百分数乘所得淋巴细胞总数得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞总数 用血细胞计数器测定。
图10数据表明，以DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌治疗减缓 肺嗜酸性粒细胞累积，这与以DD- 母牛分枝杆菌免疫后的减缓类似；DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌可用于减缓与气道、鼻粘膜和上呼吸 道嗜酸性粒细胞相关的炎症。因此施用DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分 枝杆菌可减缓气喘和类似免疫异常性疾病如过敏性鼻炎的严重性。
例12去脂去糖脂母牛分枝杆菌对人外周血单核细胞产生IL-10，TNF -α和IFN-γ的影响
此例记述DD- 母牛分枝杆菌刺激人外周血单核细胞(PBMC)产生细 胞因子的能力研究。
人血分离为PBMG和非粘着细胞，如下以DD- 母牛分枝杆菌刺激后测 定各部分的细胞因子生产。血以等体积盐水稀释，15-20mL铺层于10mL 水溶性聚蔗糖(Ficoll)(Gibco BRL Life Technologies，Gaithersburg， MD)。1800rpm离心20min后移除淋巴细胞层，以RPMI培养基(Gibco BRL)洗三次，并用锥虫蓝计数。细胞重悬于含5％热失活的自身血清的 RPMI培养基至浓度为2×106/mL。细胞样品分装以制备非粘着细胞。
在含5％CO2的湿润空气中，于补充血清(如上)的RPMI孵育20mL 淋巴细胞一小时来制备非粘着细胞。非粘着细胞转至干净瓶，孵育重复 一次。非粘着细胞移出，计数，并重悬于补充RPMI培养基至浓度为2- 106/mL。制备DD- 母牛分枝杆菌的系列稀释，始于200μg/mL，并加入96 孔板的100μL培养基(补充RPMI)中。PBMC和非粘着细胞加入孔内(100 μL)，板在含5％CO2的湿润空气中37℃孵育48小时。每孔移出150μL 来测定以DD- 母牛分枝杆菌刺激后，不同细胞产生的细胞因子的量。
DD- 母牛分枝杆菌刺激PBMC分泌TNT-α和IL-10(图11和12A， 分别)，但刺激非粘着细胞产生IFN-γ(图12B)。这些数据暗示DD- 母 牛分枝杆菌刺激的PBMC中IFN-γ生产受IL-10自身分泌抑制。
例13热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌活化T细胞
下面检测热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌活化人T 细胞和天然杀伤(NK)细胞的能力。
浓度为5×106细胞/mL的人外周血单核细胞(PBMC)与20μg/mL 热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌培养24小时。对照细胞只与培 养基培养。然后以抗CD 56(NK细胞的一种标记)、αβT细胞或γδT细胞 的单克隆抗体-S抗CD 69单克隆抗体联用，染色培养细胞，其中CD 69 是活化细胞表达的一种分子。细胞再以流式细胞计分析。表达CD 69的 细胞百分数见表6。
表6
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌
活化人T细胞和天然杀伤细胞 αβT细胞 γδT细胞 NK细胞 对照 3.8 6.2 4.8 热灭活母牛分枝杆菌 8.3 10.2 40.3 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 10.1 17.5 49.9
这些结果表明热灭活 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌活化αβ和γδT 细胞及NK细胞。
Holt和Sly的新近研究(Nature Medicine 5：1127-1128，1999) 表明，对气喘，γδT细胞在保持正常气道反应性和下调气道对抗原入侵 的反应性中是重要的，可能通过控制气道内皮细胞对γδT细胞细胞介导 损伤的“修复”反应。由于 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌能活化γδT 细胞，它们可能有效恢复机体存在γδT细胞的病变区如气道、肺、皮肤 和肠的正常内皮。
例14以DD- 母牛分枝杆菌-酸，DD- 母牛分枝杆菌，HVac和EVac免疫 对小鼠气喘的影响
此例说明以DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛分 枝杆菌-酸，Hvac和EVac免疫对肺过敏性免疫反应发展的影响。这在 气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型中得到证实。此过敏性疾病的严重 性反映于累积在气道的巨大数目嗜酸性粒细胞。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μgOVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻 内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌，DD- 母牛分枝杆菌-酸，Hvac， Evac或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻内施用100μg OVA于50μL PBS。在35日，杀死小鼠，并用PBS作支气管肺泡灌洗(BAL)。BAL细 胞以流式细胞计分析来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜 酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋 巴细胞总数由血细胞计数器测定。
如图13示，DD- 母牛分枝杆菌，Hvac和Evac致气道嗜酸性粒细胞 显著抑制(示为％嗜酸性粒细胞)。
例15以OVA攻击后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜酸性粒细胞的 抑制
此例说明DD- 母牛分枝杆菌-酸对肺过敏性免疫反应发展的影响， 如示于气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型。以OVA进攻后三天施用DD- 母牛分枝杆菌-酸来诱发严重的气道嗜曙红细胞增多。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μgOVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠(每组十只)对OVA致敏化。在14和18日， 麻醉小鼠，鼻内进攻100μg OVA于50μL PBS。在21日，再麻醉小鼠， 并鼻内施用200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。在25日，杀死小鼠，并用 PBS作BAL。对照小鼠接受PBS而非DD- 母牛分枝杆菌-酸施用，其余处 理同实验小鼠。BAL细胞以流式细胞计分析来测定嗜酸性粒细胞含量(％ 嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞数由嗜酸性粒细胞百分数乘所得 淋巴细胞总数而得到，淋巴细胞总数由血细胞计数器测定。
如图14示，观察到气道嗜酸性粒细胞的显著抑制(示为％嗜酸性 粒细胞)，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。在PBS和DD- 母牛分枝杆 菌-酸处理的小鼠，气道嗜曙红细胞增多的严重性随两次OVA进攻的时 间间隔延长而降低。更进一步，DD- 母牛分枝杆菌-酸致所用全部三组 小鼠嗜酸性粒细胞百分数的统计显著抑制。这些数据证实诱导气道嗜曙 红细胞增多后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸有治疗利益。
例16以OVA进攻前即刻施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜酸性粒细 胞的影响
此例说明以二次OVA进攻来诱导气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型 严重气道嗜曙红细胞增多之前一天，施用DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使两组BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14日，麻醉小鼠，鼻 内施用DD- 母牛分枝杆菌-酸(200μg)。在15日，麻醉小鼠，鼻内进 攻100μg OVA于50μL PBS。I组小鼠在19日接受第二次鼻内100μg OVA 于50μL PBS进攻。II组小鼠在18日接受第二次200μg DD- 母牛分枝 杆菌-酸，然后在19日接受第二次OVA进攻(100μg OVA于50μL PBS)。 在22日杀死两组小鼠并用PBS作BAL。两组对照小鼠以PBS而非DD- 母 牛分枝杆菌-酸免疫，其余处理同实验组。BAL细胞样品以流式细胞计 来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞由 嗜酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总数而得，淋巴细胞总数由血细胞 计数器测得。
如见于图15，观察到气道嗜曙红细胞增多(示以％嗜酸性粒细胞) 的统计显著抑制(P＝0.0000015)，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。 当仅在第一次入侵前以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小鼠时，嗜酸性粒细 胞百分数减少20％。当在两次入侵前均以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小 鼠时，气道嗜曙红细胞增多的抑制被增强，指示为嗜酸性粒细胞百分数 减少40％。
例17以OVA进攻后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜曙红细胞增多 的抑制
此例说明以OVA进攻后三天，以DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛 分枝杆菌-酸两次免疫，对气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型中肺过敏 性免疫反应发展的影响。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使三组BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14日，麻醉全部小鼠， 鼻内进攻100μg OVA于50μL PBS。在18日，再麻醉全部小鼠，鼻内 施用200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。I组小鼠在21日(第一次进攻后 七天)以OVA(100μg于50μL PBS)第二次鼻内进攻。在24日杀死 这些小鼠，并用PBS作BAL。II组小鼠在25日(第一次进攻后11天) 接受第二次OVA进攻，在28日杀死，并用PBS作BAL。III组小鼠在25 日接受200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。这些小鼠在28日(第一次进攻 后14日)接受第二次100μg OVA于50μL PBS入侵，在31日杀死， 并用PBS作BAL。三组对照小鼠接受PBS而非DD- 母牛分枝杆菌-酸， 其余免疫处理同实验组。BAL细胞样品以流式细胞计分析来测定嗜酸性 粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞数由嗜酸性粒细 胞百分数乘所得淋巴细胞总数而得到，淋巴细胞总数以血细胞计数器测 定。
如图16示，观察到气道嗜曙红细胞增多(示以％嗜酸性粒细胞) 的统计显著抑制，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。在PBS和DD- 母 牛分枝杆菌-酸处理的小鼠，气道嗜曙红细胞增多的严重性随两次OVA 进攻时间间隔延长而降低。进一步，DD- 母牛分枝杆菌-酸在所有三种 所用方法中均致嗜酸性粒细胞百分数的统计显著抑制。
第一次进攻后四天，以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小鼠三天后继以 第二次进攻(进攻迟滞＝7日)，气道嗜曙红细胞增多减缓约15％(I组； P＝0.034)。当第二次进攻又迟滞四天时，观察到稍高程度(约25％) 的抑制(II组；P＝0.036)。当第二次进攻前，以DD- 母牛分枝杆菌- 酸两次处理小鼠时，气道嗜曙红细胞增多被抑制56％(III组；P＝ 0.0000027)。这些数据显示，气道嗜曙红细胞增多诱发后，施用DD- 母 牛分枝杆菌-酸有疗效。
尽管本发明已通过说明和实例详述以便理解清晰，可以进行不离开 本发明范围的改变和修饰，本发明仅限于所附权利要求的范围。
尽管一般可用大量抗生素治疗控制结核病，该治疗尚不足以防止疾病 传播。受感染的个体可在一段时期内无症状但具传染性。此外，尽管服从 疗程很关键，却难以监控病人行为。一些病人不完成疗程，可导致无效治 疗和抗药分枝杆菌的发展。
抑制结核病传播需要有效的疫苗接种和准确的早期诊断。目前，接种 活菌是诱导保护性免疫的最有效方法。最常用的分枝杆菌是卡介苗(BCG) 为牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的无毒株。然而，BCG的安全性 和功效性是有争议的，有些国家，如美国，不向公众接种。结核分枝杆菌 诊断常用皮试，这包括结核菌素PPD(蛋白纯化衍生物)的皮内注射。抗 原特异的T细胞反应导致注射处于注射后48-72小时可测量的硬结，从 而指示分枝杆菌抗原。然而，该测试的灵敏性和特异性却是问题，且接种 BCG的个体能不能区别于受感染的个体。
用于结核病，还有麻风免疫治疗的较不为所知的分枝杆菌是母牛分枝 杆菌，它对人无致病性。然而，与BCG相比，关于母牛分枝杆菌功效的信 息较少，且它未广泛用于公众接种。据信，牛分枝杆菌BCG和母牛分枝杆 菌含可由结核分枝杆菌感染个体的免疫系统所识别的抗原组合物。
若干专利和其他出版物公开了由服用分枝杆菌，包括母牛分枝杆菌或 特定的分枝杆菌片段对各种情况的治疗。美国专利4716038公开了由服用 包括母牛分枝杆菌的分枝杆菌来诊断、接种和治疗包括关节炎病的各类型 自身免疫疾病。美国专利4724144公开了含来自母牛分枝杆菌的抗原物质 的免疫治疗剂来治疗分枝杆菌病，尤其是结核病和麻风，并作为化疗佐剂。 国际专利出版WO 91/01751公开了用来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫 调节物质作为免疫预防剂来延迟或/和防止AIDS发病。国际专利出版WO 94/06466公开了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质用于治疗 HIV感染，伴或不伴AIDS，伴或不伴结核病。
美国专利5599545公开了应用分枝杆菌，特别是整个、失活的母牛分 枝杆菌作为与非内源于母牛分枝杆菌的抗原服用的佐剂。该专利推理佐剂 的利效可以是由于热体克蛋白65(hsp65)。国际专利公开WO 92/08484 披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质用于治疗眼色素层 炎。国际专利公开WO 93/16727披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免 疫调节物质用于治疗与由感染引发的自身免疫反应关联的精神疾病。国际 专利公开WO 95/26742披露了来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物 质用于延迟或预防肿瘤生长或扩散。国际专利出版WO 91/02542公开了灭 活的母牛分枝杆菌用于治疗慢性炎症失调，其中病人显示出IL-6和/或 TNF的异常高水平释放或病人IgG显示出异常高比例的agalactosyl IgG。 该出版物中提及的失调有牛皮癣、类风湿关节炎。分枝杆菌病、Crohn’s 病、原发胆硬变、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、多发性硬 化、Guillain-Barre症、原发糖尿病及移植排斥的某些方面。
母牛分枝杆菌是已知分枝杆菌中惟一热制备物保持疫苗和免疫治疗特 性的。如，牛分枝杆菌BCG疫苗，用于抗结核病接种，采用活件。热杀伤 的牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌当用于疫苗时不具保护性质。已从一些 分枝杆菌中分离出一些具佐剂性质的组合物。这些佐剂的效果基本上是刺 激特定免疫反应机制抗他物种抗原。
已从分枝杆菌中分离出两大类具佐剂性质的组合物。第一类是水溶蜡 D馏分(White等，Immunology 1：54，1958；美国专利4036953)。第二 类是述于美国专利3956481和4036953的胞壁酰二肽基质(约等摩尔量的 N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸)。这些组合物在其组分的以下方面不 同于本发明的去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)：
1.它们是水溶剂，而DD- 母牛分枝杆菌不溶于水溶液。
2.它们含一些分枝杆菌细胞壁单元的小寡聚物，或由各种溶剂提取 自细菌，或由酶消化自细胞壁。对比地，DD- 母牛分枝杆菌含经加工的分 枝杆菌细胞。
3.以蛋白水解酶消化去除其制备物中的全部蛋白。其制备物的惟一 要素是细胞壁肽聚糖结构成分，具体为丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、 N-乙酰葡糖胺和N-乙二醇胞壁酸。对比地，DD- 母牛分枝杆菌含50％ (质量比)蛋白，包括一些不同的蛋白种类。
肉样瘤病病因未知，表征为影响身体许多器官尤其是肺、淋巴结和肝 的肉芽肿炎症。 肉样肉芽瘤含单核吞噬细胞，上皮样细胞和巨大细胞居中， 及T淋巴细胞。CD4T淋巴细胞与上皮样细胞紧密联结，而CD4和CD8T淋 巴细胞集于周边。肉样瘤病的特征免疫异常包括外周血和支气管肺泡灌洗 高球蛋白血及皮肤对结核菌素和其他类似抗原，如念珠菌属和流行性腮腺 炎，“迟滞型”过敏反应的抑制。外周血淋巴细胞数目减少，外周血CD4∶CD8 比例压至约1-1.5∶1。这些并非意味着一般免疫缺陷，都是“局部于”疾 病活动场所的免疫活性升高的结果。在肺肉样瘤病病人，支气管肺泡灌洗 恢复的细胞总数增加五至十倍，且淋巴细胞比例由正常小于10％-14％ 增至15％-50％。90％多恢复的淋巴细胞是T淋巴细胞，且报道CD4∶CD8 比例由正常对照值1.8∶1增至10.5∶1。 T淋巴细胞主要为Th1类，产生IFN -γ和IL-2细胞因子，而非Th2类。治疗后，肉样肺中Th1淋巴细胞增 长得到矫正。
肉样瘤病在几乎所有病例中都牵涉肺。甚至当病变主要见于其他器官 时，常有亚临床的肺感染。尽管一些肉样瘤病自动消退，约50％病人留 下至少轻度的永久性器官功能异常。严重时，肺纤维化发展并进为肺衰竭 而需植肺。治疗肉样瘤病的主成分是皮质类固醇。初始对皮质类固醇有反 应的病人常复发，并需其他免疫抑制药物治疗，如氨甲蝶呤或环孢菌素。
气喘是常见病，高发于发达地区。气喘表征为气管支气管树对各种刺 激反应性增强，原发生理干扰为可逆性气流受限，可为自发的或药物相关 的，病理hallmark为气道炎症。临床上，气喘可分为外源型和内源型。
外源气喘具可鉴别的沉淀物，可认为是特异反应性的，职业性的和药 物诱发的。特异反应性气喘与产生特异免疫球蛋白E(IgE)的Th2型免疫 反应增强有关，对常见空气过每原和/或特异反应性症状皮试阳性。据症 状的发病时季，可进一步分为季节性和多年性。外源气喘气流梗阻是由于 气道炎症引发的非特异性支气管过反应性。炎症由包括肥大细胞、嗜酸性 粒细胞和淋巴细胞的各种炎症细胞释放的化学物质所介导。这些介导物的 行为导致血管通透，粘液分泌和支气管平滑肌缢缩。在特异反应性气喘， 产生气道炎症的免疫反应是由分泌IL-4、IL-5和IL-10的Th2类T细 胞引起的。已证实特异反应性气喘肺的淋巴细胞激活时产生IL-4和IL -5。IL-4和IL-5都是Th2类的细胞因子，并为气喘中IgE产生和嗜 酸性粒细胞加入所需。职业性气喘可与IgE对蛋白半抗原的发展有关，如 在塑料工人为酸酐，和西部红松诱发气喘的大侧柏酸，或与非IgE相关的 机制，如见于甲苯二异氰酸诱发气喘的。药物诱发气喘可见于服用阿斯匹 林或其他非类固醇抗炎药后；常见于有其他特征如鼻polyposis和鼻窦炎 的特定病人群。报道内源或原因不明的气喘于上呼吸道感染后发展，但在 中年或老年人中可从新发生，在此人群中治疗比外源气喘更难。
理想地，气喘可由回避诱因过敏原来预防，但这并非总是可能的，诱 因过敏原也非总易于鉴别。医疗气喘基于应用皮质类固醇和支气管舒张药 来缓减炎症并回复气路梗阻。对慢性气喘，以皮质类固醇治疗导致不可接 受的不利副反应。
与气喘免疫异常类似的另一失调为过敏性鼻炎。过敏性鼻炎是常见 病，估计影响至少10％人群。过敏性鼻炎可以是对花粉的变态反应引发的 季节性的(花粉气喘)。非季节性或多年鼻炎由对如家居尘螨或动物皮屑 的抗原的变态反应引发。
过敏性鼻炎的异常免疫反应表征为特异于过敏原的IgE抗体的过量生 产。炎症反应发生于鼻粘膜，而非如气喘在更下的气道。如气喘，病变组 织的局部嗜酸性粒细胞是过敏性鼻炎的主要特征。炎症的结果，病人发展 喷嚏，流涕和充血。更严重时，炎症延及眼(结膜炎)，喉和外耳。尽管 不威胁生命，过敏性鼻炎可非常失能，阻碍正常活动，干扰工作能力。目 前治疗用抗组胺剂，鼻疏血剂和，如治气喘的sodium cromoglycate和皮 质类固醇。
特异反应性皮炎，又称特异反应性湿疹，是慢性复发的瘙痒炎症皮肤 病，常发于有各种过敏失调遗传史的家庭，如过敏性鼻炎和气喘。特异反 应性皮炎正逐渐流行，至约15％人群在童年期患过特异反应性皮炎。主要 症状为皮肤干燥和主要位于面、颈、屈肌侧和四肢弯曲处的皮炎(湿疹)， 伴有严重瘙痒。典型发作于一生中的头五年。在许多病人，该皮肤病于童 年期消失，但症状却可持续至成年。进一步，50％的病人发展气喘，约75 ％的病人发展过敏性鼻炎。这是世界范围内最常见的皮炎之一。
过敏原在特异反应性皮炎中作用重要。约80％的病人具对各种食物 和吸入过敏源的IgE抗体，大部分严重特异反应性皮炎病人血清IgE水平 升高，特别是如果他们还患其他特异反应性病。此外，血中嗜酸性粒细胞 循环水平通常升高。在特异反应性皮炎，病变皮肤的真皮渗润巨噬细胞、 T细胞和嗜酸性粒细胞，在慢性病变胞大细胞数目增多。急性病变有显著 多的细胞表达细胞因子IL-4和IL-5和IL-13，意味Th2类T细胞的 优先累积。此外，特异反应性皮炎患者的循环T细胞比正常人产生更多的 IL-4和IL-5。Th2细胞因子在启动过敏反应中起重要作用。IL-4作用 是将抗体生产调至IgE同型，发展Th2细胞和诱导募集嗜酸性粒细胞的内 皮细胞上的粘着分子。IL-5对于嗜酸性粒细胞的发育和分化很重要。
与Th2细胞不同，Th1细胞产生IFNγ和IL-2。慢性特异反应性皮肤 病变中的Th1细胞已经鉴定。因为IL-2对T细胞生长很重要并有致异常 皮层加厚之效应，Th1细胞也可参与特异反应性皮炎的病理。以卵清蛋白 重复上表皮(epicutaneous)致敏可致小鼠特异反应性皮炎似病变。这些 小鼠的引流淋巴结T细胞受体外卵清蛋白刺激时分泌IL-4而不是IFN- γ。
过敏性接触皮炎是常见的皮肤非传染性炎症失调。在接触皮炎，身体 对特殊抗原敏感化时才发展出免疫反应。皮肤随后暴露于抗原和T细胞识 别这些抗原，导致释放各种细胞因子，T细胞增殖和聚集，并终致皮炎(湿 疹)。
过敏性接触皮炎病变中只有一小部分T细胞特异于相关抗原。激活的 T细胞可能移至炎症区而与抗原特异性无关。迟滞型过敏性只能由共享MHC 类II抗原的T细胞(CD4+细胞)转移。对接触过敏原的“反应”可由共 享MHC类I(CD8+细胞)或类II(CD4+细胞)分子的T细胞转移(Sunday 等，J.Immunol.125：1601-1605，1980)。角质形成细胞可产生能助抗原 呈T细胞的白细胞介素-1。表面抗原细胞间粘着分子-1(ICAM-1)表 达可在角质形成细胞和内皮上由细胞因子肿瘤坏死因子(INF)和干扰素 -γ(IFN-γ)诱导。
若能鉴别病因，单独移除即将治愈过敏性接触皮炎。外用皮质类固醇 对炎症有用。已在迟滞型超敏性观察到环孢菌素对体外引发T细胞促炎功 能的抑制效果(Shidani等，Eur.J.Immunol.14：314-318，1984)。还 报道了环孢菌素对小鼠T细胞早期活化的抑制效果(Milon等，Ann.Immunol. (Inst.Pasteur)135d：237-245，1984)。
肺癌是首要的癌症致死因。肺癌发病率持续上升，世界卫生组织估计 至公元2000年每年将有二百万新病例。肺癌广义分为两类：小细胞肺癌 (SCLC)占所有肺癌的20％-25％，和非小细胞肺癌(NSCLC)占其余75 ％。SCLC倾向于早期扩散，90％患者诊断时波及(involvement)胸部呈 纵隔淋巴节。SCLC以化疗或化疗结合放疗治疗。完全反应率变化自10％ 至50％。对无波及(involvement)淋巴节的罕见病人，手术继以化疗可 致超过60％的治愈率。NSCLC预后较悲观，因为多数病人在诊断时病情已 恶化。手术移除肿瘤对极少数病人是可能的，NSCLC的五年存活率仅5％ -10％。
导致肺癌发展的因素复杂多样。环境和遗传因素相互作用，致序列和 增进异常性，而导致不可控的细胞增殖，临近组织入侵和向远处扩散。肺 癌患者显示细胞介导的和体液免疫均受损害。放疗和化疗进一步损伤病人 免疫功能。已尝试以未活化的肿瘤细胞或肿瘤抗原免疫病人来增强机体抗 肿瘤反应。肺癌手术后向胸腔注入卡介苗(BCG)来增强非特异性免疫。 已尝试由向病人提供以来自体内的白介素-2(IL-2)处理的淋巴细胞来 增强抗肿瘤免疫性。这些淋巴因子激活的淋巴细胞获得杀伤肿瘤细胞的能 力。目前肺癌的免疫疗法仍在发展阶段，其肺癌标准治疗功效尚待建立。
动脉粥样硬化是一种动脉壁慢性炎症疾病，表征为脂类、巨噬细胞、 T淋巴细胞、平滑肌细胞和细胞外基质累积。抗炎细胞因子产生于炎症反 应，并据信可调节炎症过程。白介素-10(IL-10)由Th2淋巴细胞和巨 噬细胞分泌，已知具抗炎性。Mallat等近来报道的研究显示IL-10对小 鼠粥样硬化病变的形成和稳定性具保护效果(Circ.Res.85：e17-24， 1999)。这些研究暗示可采用增加IL-10产生的因素来调节动脉粥样硬化 的程度和/或轻重。
显示服用IL-10有利的其他失调包括高胆固醇血症(见美国专利 5945097)；细菌感染，包括革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌感染(见美国 专利5837293和5837232)；和胰岛素依赖性糖尿病(见美国专利5827513)。 此外，美国专利5871725公布了由向病人施用IL-10激活的外周血单核 细胞(PBMC)来治疗癌症的一种方法。
发明概述
简要地，本发明提供组合物和方法来预防和治疗免疫介导失调，包括 呼吸系统失调(如结核分枝杆菌或贪食分枝杆菌等的分枝杆菌感染，肉样 瘤病，气喘，过敏性鼻炎和肺癌)，过敏性失调如特异反应性皮炎和湿疹， 得益于嗜酸性粒细胞减少的疾病，和由调节IL-10产生可改善的失调(如 动脉粥样硬化，高胆固醇血症，癌症，细菌感染和胰岛素依赖性糖尿病)。
首先，提供的组合物包括去脂去糖脂的分枝杆菌细胞。在特定实施方 案中，去脂去糖脂的细胞制备于母牛分枝杆菌，结核分枝杆菌和/或耻垢 分枝杆菌。
其次，本发明提供的组合物包括去脂去糖脂分枝杆菌细胞的衍生物， 它选自下组：经碱水解处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经酸水解处理的 去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经高碘酸处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经 蛋白酶K处理的去脂去糖脂分枝杆菌细胞；经无水氢氟酸水解处理的去脂 去糖脂分枝杆菌细胞。去脂去糖脂的母牛分枝杆菌衍生物优选地含半乳糖 量小于总碳水化合物的9.7％，更优选地小于总碳水化合物的5％，最优 选地小于总碳水化合物的3.5％。在特定实施方案中，去脂去糖脂母牛分 枝杆菌衍生物葡糖胺含量高于总碳水化合物的3.7％，优选高于总碳水化 合物的5％，更优选地高于总碳水化合物的7.5％。
又次，本发明提供方法来治疗病人失调，包括呼吸系统失调，这些方 法包括向病人施用本发明的一种组合物。在特定实施方案中，失调选自分 枝杆菌感染，气喘，肉样瘤病，过敏性鼻炎，特异反应性皮炎和肺癌。在 一个实施方案中，这些组合物施用于导向或位于肺内的气道，优选地经鼻 或口吸入，优选地以气雾剂形式施用。或者，这些组合物还可由皮内、经 皮或皮下施用。
又次，本发明提供方法，通过服用本发明的组合物来治疗病人呼吸系 统失调，其中该失调表征为呼吸系统组织中存在嗜酸性粒细胞。这些病的 例子包括气喘和过敏性鼻炎。相关地，本发明提供减少病人嗜酸性粒细胞 的方法，这包括服用此处公开的至少一种组合物。典型地，嗜酸性粒细胞 减少将变化于20％至80％。肺嗜酸性粒细胞减少百分比可于下述治疗前 后由测量气管支气管灌洗液嗜酸性粒细胞数目来确定。
又次，提供了增强IL-10产生的方法，包括服用本发明的一种组合 物。如上讨论，近来显示IL-10在粥样硬化病变形成和稳定性中起保护 作用。还显示IL-10对治疗高胆固醇血症，癌症，细菌感染和胰岛素依 赖性糖尿病有效。发明的组合物于是可用于治疗这些失调。
本发明进而提供激活αβT细胞，γδT细胞或NK细胞的方法，并由此 修复病人内皮，这些方法包括向病人施用本发明的一种组合物。
参考以下详述和附图，本发明的这些和其他方面将很清楚。所有公开 于此的参考文献因而全文引用，如同各自单独引用。
附图简述
图1示高压灭菌母牛分枝杆菌，冻干母牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛 分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂诱导IL-12。
图2比较由不同浓度热灭活(高压灭菌)母牛分枝杆菌，去脂去糖脂 母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂体外刺激 重度联合免疫缺陨(SCID)小 鼠脾细胞产生干扰素-γ。
图3示DD- 母牛分枝杆菌(Q1)和DD- 母牛分枝杆菌衍生物Q2(DD -母牛分枝杆菌-KOH)，Q3(DD- 母牛分枝杆菌-酸)，Q4(DD- 母牛分 枝杆菌-高碘酸盐(periodate))，Q6(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸 盐)，P5(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)和P6(DD- 母牛分枝杆菌-KOH -高碘酸盐)对鼻内接种这些组合物的小鼠中卵清蛋白诱导气道嗜酸性粒 细胞的抑制。对照小鼠接种PBS。
图4示DD-母牛分枝杆菌衍生物刺激THP-1细胞产生IL-10。
图5示结核分枝杆菌感染前，以热灭活 母牛分枝杆菌或去脂去糖脂 母 牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)免疫小鼠的效果。
图6示DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH的重悬浮。
图7DD-母牛分枝杆菌(R1)和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛 分枝杆菌-KOH(R2)，DD- 母牛分枝杆菌-酸(R3)，DD- 母牛分枝杆菌- 高碘酸盐(R4)，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸(R5)和DD- 母牛分枝杆 菌-KOH-高碘酸盐(R6)刺激巨噬细胞产生IL-12。
图8示DD- 母牛分枝杆菌-酸衍生物以剂量依赖方式抑制气道嗜酸 性粒细胞。
图9比较以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内或皮内免疫对肺嗜酸性粒细 胞的抑制效果。
图10示以DD- 母牛分枝杆菌，DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆 菌免疫对气道嗜酸性粒细胞的效果。
图11示以DD- 母牛分枝杆菌刺激人PBMC和非粘附细胞产生TNF-α。
图12A和12B分别示以DD- 母牛分枝杆菌刺激人PBMC和非粘附细胞 产生IL-10和IFN-γ。
图13示DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛分 枝杆菌-酸，Hvac和Evac抑制过敏原诱发的气道嗜酸性粒细胞。
图14示以OVA攻击三天之后，施用DD- 母牛分枝杆菌-酸，DD- 母 牛分枝杆菌-酸对严重过敏原诱发的小鼠气道嗜酸性粒细胞的疗效。
图15示施用DD- 母牛分枝杆菌-酸后立即继以OVA攻击一次或两次， DD- 母牛分枝杆菌-酸对过敏原诱发的气道嗜酸性粒细胞的抑制效果。
图16示在两次OVA攻击之间施用DD.- 母牛分枝杆菌-酸一或二 次，DD- 母牛分枝杆菌-酸抑制过敏原诱发的小鼠气道嗜酸性粒细胞 的效果。
发明详述
如上述，本发明的一般目的是治疗免疫诱导失调的组合物和方法。 在特定实施方案中，这些失调选自呼吸系统失调，过敏性失调，和服 用IL-10和/或刺激IL-10产生对病情有利的失调。呼吸系统失调的 例子有分枝杆菌感染，气喘，肉样瘤病，过敏性鼻炎和肺癌。服用或 增加产生IL-10被认为利好的失调例子有动脉粥样硬化，高胆固醇血 症，癌症，细菌感染和胰岛素依赖性糖尿病。过敏性皮肤病的例子有 特异反应性皮炎和湿疹。
特定的病原如结核分枝杆菌，和特定的癌症，被CD4+T细胞指导的 免疫攻击，称为细胞介导的免疫有效遏制。其他病原如脊髓灰质炎病 毒，还需B细胞产生的抗体遏制。这些不同类的免疫攻击(T细胞或B 细胞)受控于CD4+T细胞的不同亚群，通称为Th1和Th2细胞。
这两类Th细胞已很好地表征于小鼠模型，并由其激活时释放的细 胞因子定义。Th1亚类分泌IL-2，IFN-γ和肿瘤坏死因子。并介导巨 噬细胞活化和迟滞型超敏反应。Th2亚类释放IL-4，IL-5，IL-6和 IL-10，来刺激B细胞活化。Th1和Th2亚类相互抑制，以致IL-4抑 制Th1型反应，IFN-γ抑制Th-2型反应。类似的Th1和Th2亚类已 发现于人，并释放与小鼠模型中观察到的相同的细胞因子。Th-1型免 疫反应扩增是许多失调病情逆转的核心，包括呼吸系统失调如结核病、 肉样瘤病、气喘、过敏鼻炎和肺癌。已显示IL-12上调Th1反应，而 IL-10下调Th2反应。Zuany-Amorim等示IL-10调节淋巴细胞浸润 抗原攻击小鼠的气道，表明IL-10在调节肺过敏性炎症过程中起重要 作用(J.Clin.Invest.95：2644-2651，1995)。Borish等的研究发 现气喘病人比正常人气管支气管液IL-10水平降低(J.Allergy.Clin. Immunol.97：1288-96，1996)。
一方面，提供治疗呼吸和/或肺失调的方法，包括施用去脂去糖脂 的分枝杆菌细胞，优选去脂去糖脂的结核分枝杆菌细胞和/或去脂去糖 脂的耻垢分枝杆菌细胞。相关地，本发明提供方法，由施用含至少一 种去脂去糖脂分枝杆菌细胞衍生物的组合物来免疫治疗病人呼吸和/或 肺失调，包括结核病、肉样瘤病、气喘、过敏性鼻炎和肺癌。在特定 实施方案中，这些方法包括施用至少一种DD- 母牛分枝杆菌衍生物。如 下详述，发明者已用小鼠模型证实了这些组合物治疗气喘的功效。这 些组合物被认为治疗如气喘的疾病有效，是因为它们能抑制气喘诱发 的Th2免疫反应。在一实施方案中，这些组合物直接投放于导向和/或 肺内气道的粘膜表面。然而，这些组合物或者还可由皮内或皮下施用。
用于此的术语“呼吸系统”指肺、鼻通道、气管和支气管通道。
用于此的术语“导向或位于肺的气道”包括鼻通道、口、扁桃体 组织、气管和支气管通道。
此处用的“患者”指任何温血动物，优选人。该患者可害病也可 未患可检测到的疾病。换言之，发明的方法可用于诱导保护性免疫半 预防或治疗疾病。
此处用的术语“失活母牛分枝杆菌”指例1中热灭活的，或经2.5兆 拉德剂量60钴照射致死的母牛分枝杆菌细胞。此处用的术语“修饰母 牛分枝杆菌”包括去脂母牛分枝杆菌细胞，去糖脂母牛分枝杆菌细胞， 去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)细胞及其衍生物。DD - 母牛分枝杆菌可按下述例1制备，DD- 母牛分枝杆菌衍生物制备下 述于例2。去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝 杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)下述于例10。可按公开于此的DD- 母牛分 枝杆菌衍生物的制备过程来制备DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆 菌衍生物，如酸处理、碱处理、过碘酸盐处理、蛋白酶K处理和/或氢 氟酸处理的衍生物。
DD- 母牛分枝杆菌衍生物的半乳糖含量优选地小于总碳水化合物 的9.7％，更优选地小于总碳水化合物的5％，最优选地小于总碳水化 合物的3.5％。在特定实施方案中，DD- 母牛分枝杆菌衍生物含葡糖胺 量优选地大于总碳水化合物的3.7％，更优选地大于总碳水化合物的5 ％，最优选地大于总碳水化合物的7.5％。碱处理的DD- 母牛分枝杆 菌如DD- 母牛分枝杆菌-KOH(也作Kvac)的衍生物比DD- 母牛分枝 杆菌细胞壁连接分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的酯键数目减少，因而贫 化分枝菌酸。以酸如DD- 母牛分枝杆菌-酸(也作Avac)处理制备的 衍生物中连接阿拉伯半乳聚糖侧链和细胞壁肽聚糖的磷酸二酯键数目 减少，因而贫化阿拉伯半乳聚糖。此外，这些衍生物贫化DNA。以高碘 酸盐DD- 母牛分枝杆菌如DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐(也作Ivac) 处理制备的衍生物比DD- 母牛分枝杆菌的顺式二醇蔗糖残基数目减 少，而贫化阿拉伯半乳聚糖。以蛋白酶K处理DD- 母牛分枝杆菌(如 指作Evac的衍生物)制备的衍生物贫化蛋白和肽。以氢氟酸，如以氢 氟酸处理的DD- 母牛分枝杆菌-KOH(作Hvac)，处理制备的衍生物贫 化糖苷键。
通常，本发明的组合物可由注射(如皮内，肌内，静脉内或皮下)， 鼻内(如吸入)，口内或上表皮(皮肤外用)施用。在一实施方案中， 本发明的组合物制式适于投放至导向或肺内气道的粘膜表面。例如， 组合物可悬溶于液体，以气溶剂或类似于目前用于治疗气喘的喷雾器 来向患者投送。
为用于治疗方法，本发明的组合物可另含生理可接受的载体和/或 免疫刺激剂来引发和/或刺激免疫反应，如将多肽掺入佐剂或脂质体。 本技术领域已知的任何适合载体都可用于本发明的药物组合物，载体 类型依施用方式而变。对肠胃外施用，如皮下注射，载体优选地含水、 盐、酒精、脂肪、蜡或缓冲液。对口服、可采用上述载体或固体载体， 如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、果糖、 蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球体(如polylactic galactide)也 可用作本发明药物组合物的载体。适合的生物可降解微球体公开于， 如美国专利号4897268和5075109。
本发明组合物中可采用各种佐剂来增强免疫反应。许多佐剂含设 计用来保护抗原以免被迅速代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免 疫反应的非特异刺激剂，如脂类A，百日咳博德特氏菌，结核分枝杆菌 或如下讨论的母牛分枝杆菌。适合的商业佐剂如Freund’s不完全佐剂 和Freund’s完全佐剂(Difco实验室，底特律，MI)和Merck佐剂65 (Merck and Company公司，Rahway，NJ)。其他合适的佐剂包括明矾， 生物可降解微球体，单磷酸脂A和Quil A。
优选施用频率和有效剂量依个体而变。对DD- 母牛分枝杆菌和DD - 母牛分枝杆菌衍生物，一剂量优选地自约10μg至约1000μg，更优 选地自约10μg至约100μg。施用剂量次数在最多可达12月内自1至 约10次。
措辞“约”用于此申请指剂量中活性成分含量有指定量的多至5％ 偏差。措辞“约”用于嗜酸性粒细胞减少百分数时，有指定百分数的 多至10％偏差。
以下例说明，但不限于这些例子。
例1制备去脂去糖脂母牛分枝杆菌细胞(DD- 母牛分枝杆菌)
此例说明母牛分枝杆菌不同组合物的加工及其免疫调节性质。 热灭活母牛分枝杆菌及母牛分枝杆菌滤过物
母牛分枝杆菌(ATCC Number 15483)37℃培养于无菌培养基90(酵 母提取物2.5g/L，胰胨5g/L，葡萄糖1g/L)。离心收获细胞，转至 含葡萄糖的无菌Middle brook 7H9培养基(Difco实验室，底特律，MI)， 37℃一天。然后离心沉淀细菌，移除培养滤过物。细菌沉淀重悬于磷 酸缓冲盐水至10mg/ml浓度，相当于每毫升1010母牛分枝杆菌。细胞 悬液再于120℃灭菌15分钟。培养滤过物通过0.45μm滤器至无菌瓶 中。
制备去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)及组成分析
为制备去脂母牛分枝杆菌，离心沉淀失活母牛分枝杆菌，水洗沉 淀，再离心收集，并冻干。一份冻干的母牛分枝杆菌被保存并称作冻 干母牛分枝杆菌。当用于实验中时，重悬于PBS至所需浓度。冻干母 牛分枝杆菌以氯仿/甲醇(2∶1)室温处理60分钟来抽提脂类，抽提重 复一次。氯仿/甲醇抽提的去脂残余进一步以50％乙醇回流二小时来移 除糖脂。50％乙醇抽提重复二次。收集的50％乙醇抽提物用作母牛分 枝杆菌糖脂源(见下)。50％乙醇抽提的残余冻干并称重。去脂去糖脂 母牛分枝杆菌的制备量相当于所用母牛分枝杆菌初湿重的11.1％。为 生物测试，去脂去糖脂母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌)以超声重 悬于磷酸缓冲盐水，并高压灭菌。
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌的组成分析见表 1。与热灭活母牛分枝杆菌的不溶部分相比，去脂去糖脂母牛分枝杆菌 的主要变化在于脂肪酸组合物和氨基酸组合物。表1数据显示热灭活 母牛分枝杆菌的不溶部分含10％w/w脂，总氨基酸含量为2750 nmole/mg，或约33％w/w。去脂去糖脂母牛分枝杆菌含1.3％w/w脂 和4250nmole/mg氨基酸，约51％w/w。
表1
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌的组成分析 单糖组合物 蔗糖醛醇(sugar alditol) 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 肌醇 3.2％ 1.7％ 核糖醇* 1.7％ 0.4％ 阿拉伯糖醇(Arabinitol) 22.7％ 27.0％ 甘露醇(Mannitol) 8.3％ 3.3％ 半乳糖醇(Galactitol) 11.5％ 12.6％ 葡糖醇(Glucitol) 52.7％ 55.2％
脂肪酸组合物 脂肪酸 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 C14∶0 3.9％ 10.0％ C16∶0 21.1％ 7.3％ C16∶1 14.0％ 3.3％ C18∶0 4.0％ 1.5％ C18∶1* 1.2％ 2.7％ C18∶1w9 20.6％ 3.1％ C18∶1w7 12.5％ 5.9％ C22∶0 12.1％ 43.0％ C24∶1* 6.5％ 22.9％
热灭活母牛分枝杆菌的不溶部分含10％w/w脂，而去脂去糖脂母 牛分枝杆菌含1.3％w/w脂。
氨基酸组合物 nmoles/mg 母牛分枝杆菌 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 ASP 231 361 THR 170 266 SER 131 199 GLU 319 505 PRO 216 262 GLY 263 404 ALA 416 621 CYS* 24 26 VAL 172 272 MET* 72 94 ILE 104 171 LEU 209 340 TYR 39 75 PHE 76 132 GlcNH2 5 6 HIS 44 77 LYS 108 167 ARG 147 272
热灭活母牛分枝杆菌不溶部分氨基酸总量为2750nmole/mg，约33 ％w/w。去脂去糖脂母牛分枝杆菌氨基酸总量为4250nmole/mg，约51 ％w/w。
母牛分枝杆菌糖脂
上述收集的50％乙醇抽提物经旋转蒸发干燥，再溶于水，并冻干。 回收糖脂量约所用母牛分枝杆菌初湿重的1.2％。为生物测试，糖脂溶 于磷酸缓冲盐水。
巨噬细胞白细胞介素-12的生产
完整热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌显示具有不 同的细胞因子刺激性质。
Th1免疫反应刺激受巨噬细胞白细胞介素-12(IL-12)生产增强。 不同母牛分枝杆菌制备物刺激IL-12生产的能力示于下。
以DIFCO巯基甘醇酸酯腹膜内注射于一组C57 BL/6J小鼠。三天 后收集腹膜巨噬细胞，并置于含干扰素-γ的细胞培养物三小时。更换 培养基，加入各种浓度的完整热灭活高压灭菌母牛分枝杆菌，冻干母 牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛分枝杆菌(指图1去脂去糖脂母牛分枝 杆菌)。37℃又三天后，测试培养上清中巨噬细胞产生的IL-12。如图 1示，母牛分枝杆菌制备物刺激巨噬细胞产生IL-12。
形成对照地，检测同样母牛分枝杆菌制备物刺激天然杀伤(NK) 细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的能力。制备重度联合免疫缺损(SCID) 小鼠脾细胞。该群体含75％-80％NK细胞。脾细胞37℃孵育于含不 同浓度热灭活母牛分枝杆菌，去脂去糖脂母牛分枝杆菌或母牛分枝杆 菌糖脂的培养物中。图2数据显示，热灭活母牛分枝杆菌和母牛分枝 杆菌糖脂刺激干扰素-γ产生，去脂去糖脂母牛分枝杆菌刺激相对较少 干扰素-γ。图1和2数据合并显示，与完整热灭活母牛分枝杆菌相比， 去脂去糖脂母牛分枝杆菌是IL-12较好的刺激剂，而对干扰素-γ较 差。
例2 母牛分枝杆菌其他衍生物的制备和定性去脂去糖脂母牛分枝杆菌 的碱水解
此过程意在裂解对碱水解不稳定的连接，如连接分枝菌酸与分枝 杆菌细胞壁阿拉伯半乳聚糖的酯键。
按例1所述制备一克去脂去糖脂母牛分枝杆菌，悬于20mL 0.5％ KOH乙醇溶液。本技术领域已知的其他碱性剂和溶剂可用于置换KOH和 乙醇。混合物于37℃间歇搅拌孵育48小时。离心收集固体残余，乙醇 洗两次，二乙醚洗一次。产物空气干燥过夜。产量为1.01g(101％) KOH处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌，后作DD- 母牛分枝杆菌-KOH(还 作Kvac)。发现该衍生物比公开于此的去脂去糖脂母牛分枝杆菌的其他 衍生物更易溶。
去脂去糖脂母牛分枝杆菌的酸水解
此过程意在裂解酸不稳定的连接，如连接阿拉伯半乳聚糖侧链与 分枝杆菌细胞壁肽聚糖的磷酸二酯键。
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(100mg)在1mL 50 mM H2SO4中洗两次，然后重悬并离心。本技术领域已知的其他酸可用于 置换硫酸。在酸水解步骤，固体残余重悬于1mL 50mM H2SO4，60℃孵 育72小时。离心回收固体残余后，以水洗残余五次来除去酸。冻干固 体残余得58.2mg酸处理的DD- 母牛分枝杆菌(DD- 母牛分枝杆菌- 酸，也作Avac)或36.7mg酸处理的DD- 母牛分枝杆菌-KOH(DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)。
高碘酸裂解去脂去糖脂母牛分枝杆菌
此过程意在裂解去脂去糖脂母牛分枝杆菌含顺二醇的蔗糖残基， 如肽聚糖主链上阿拉伯半乳聚糖附着位点附近的鼠李糖残基。
DD- 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌-KOH(100mg)悬于1mL 1％高碘酸于3％乙酸溶液，室温孵育1小时，离心回收固体残余。高 碘酸处理重复三次。离心回收固体残余，以5mL 0.1M氢硼化钠室温 孵育一小时。离心回收产物固体残余，并重复氢硼化钠处理。离心后， 以水洗固体残余四次并冻干，得62.8mg DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸 盐(也作Ivac)或61.0mg DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸盐。
重悬DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(各11mg)悬于磷 酸缓冲盐水(5.5mL)。室温以Virtis探针超声器超声样品不同时间 (微小探针，15％输出)。样品涡旋振荡六十秒并静置五分钟以使大颗 粒沉降。600nm测定其余悬液的光吸收。如图6示，DD- 母牛分枝杆 菌-KOH(图6作DDMV-KOH)于一分钟超声后全部重悬，进一步超声 并不增强光吸收。五分钟超声后，如重悬光吸收估计，DD- 母牛分枝 杆菌重悬(图6作DDMV)仍不完全。这些结果表明DD- 母牛分枝杆菌 -KOH比DD- 母牛分枝杆菌相当地更易溶。
去脂去糖脂母牛分枝杆菌的蛋白酶K水解
此过程意在消化蛋白和多肽，同时保留多数其他物质完整。
按例1所述制备一百毫克DD- 母牛分枝杆菌，以超声悬于9mL水 中。加入十二烷硫酸钠(SDS)至终浓度1％w/v，蛋白酶K终浓度为 100μg/mLw/v。反应混合物50℃孵育16小时。离心回收产物，以水 和磷酸缓冲盐水洗，冻干。得59mg(59％)蛋白酶K处理的DD-母 牛分枝杆菌，后作EVac。
氢氟酸水解KOH处理的去脂去糖脂母牛分枝杆菌
此过程意在裂解对无水氢氟酸水解不稳定的连接，如糖苷键，而 保留多数蛋白完整。
按上述制备一克DD- 母牛分枝杆菌-KOH，悬于含苯甲醚为自由基 清除剂的15mL液态氟化氢。混合物于0℃搅拌孵育一小时。蒸馏除去 氟化氢(HF)，以二乙醚洗固体残余来除去苯甲醚。以水抽提产物来得 到水溶和水不溶部分。得250mg(25％)水溶物质，和550mg(55％) 水不溶HF水解的KOH处理DD- 母牛分枝杆菌，后作HVac。
例3 去脂去糖脂母牛分枝杆菌及其衍生物对小鼠气喘的免疫效果
在气喘样过敏原特异肺病小鼠模型中检测DD- 母牛分枝杆菌及其 衍生物抑制过敏性免疫反应发展的能力。该过敏性疾病的严重性反映 为气道中累积巨多嗜酸性粒细胞。
在0至14日经腹膜内给BALB/cByJ小鼠2μg卵清蛋白于2mg明 矾佐剂，然后在第28日经鼻内给100μg卵清蛋白于50μL磷酸缓冲 盐水(PBS)。通过盐水冲洗麻醉鼠气道，收集洗出物(支气管灌洗或 BAL)，并计数嗜酸性粒细胞数目，检测出小鼠在气道累积嗜酸性粒细 胞。
按上述制备DD- 母牛分枝杆菌衍生物。10只小鼠一组，鼻内施用 200μgPBS，DD-母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌衍生物之一(Q1： DD- 母牛分枝杆菌；Q2：DD- 母牛分枝杆菌-KOH；Q3：DD- 母牛分枝 杆菌-酸；Q4：DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐；Q6和P6：DD- 母牛分 枝杆菌-KOH-高碘酸盐；P5：DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸)，一周后 继以鼻内施用卵清蛋白。如图3示，与对照小鼠相比，施用卵清蛋白 六天后收集的BAL细胞嗜酸性粒细胞百分数统计上显著降低。而且， 数据显示以DD- 母牛分枝杆菌-酸和DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘 酸盐(Q3，Q6和P6)抑制气道嗜酸性粒细胞高于DD- 母牛分枝杆菌(Q1)。 对照小鼠给鼻内PBS。图3数据示每组小鼠平均值和SEM。
嗜酸性粒细胞是过敏性气喘气道中最显著的血细胞。嗜酸性粒细 胞的分泌产物使过敏性气喘气道粘膜内层(lining)肿胀并发炎。图3 数据表明DD- 母牛分枝杆菌或其衍生物减缓肺嗜酸性粒细胞累积，并 可用于减缓气道，鼻粘膜和上呼吸道中与嗜酸性粒细胞相关的炎症。 因此施用DD- 母牛分枝杆菌或其衍生物可减缓气喘和有类似免疫异常 疾病如过敏性鼻炎、特异反应性皮炎和湿疹的严重性。
此外，采集以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的小 鼠血清样品，并以标准酶联免疫测试(EIA)测定对卵清蛋白的抗体水 平。如表2示，感染BCG的小鼠血清比PBS对照血清，卵清蛋白特异 的IgG1水平较高。对照地，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆 菌免疫的小鼠有相似或较低水平的卵清蛋白特异IgG1。因IgG1抗体是 Th2免疫反应的特征，这些结果与DD- 母牛分枝杆菌对气喘诱发Th2 免疫反应的抑制效果是一致的。
表2
以热灭活母牛分枝杆菌或去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠
的抗原特异IgG1血清低水平 处理组 血清IgG1 平均值 平均标准误 母牛分枝杆菌i.n. 185.00 8.3 母牛分枝杆菌s.c. 113.64 8.0 去脂去糖脂杆菌i.n. 96.00 8.1 去脂去糖脂杆菌s.c. 110.00 4.1 BCG，巴氏消毒 337.00 27.2 BCG，Connaught 248.00 46.1 PBS 177.14 11.4
例4 去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物对THP-1细胞生产IL-10的影 响
已显示IL-10抑制Th1细胞生产细胞因子，并在抑制实验诱发的 皮肤炎症反应中起关键作用(Berg等，J.Exp.Med.182：99-108， 1995)。更近些时候，IL-10已成功用于两例临床实验来治疗牛皮癣患 者(Reich等，J.Invest.Dermatol，111：1235-1236，1998；和 Asadullah等，J.Clin.Invest.101：783-794，1998)。以下评估 在DD- 母牛分枝杆菌衍生物存在时培养的人单核细胞系(THP-1)生 产IL-10的水平。
THP-1细胞(ATCC Number TIB-202)培养于0.5mg/L链霉素， 500U/L青霉素，2mg/L L-谷氨酰胺，5×10-5Mβ-巯基乙醇和5％ 胎牛血清(FBS)补充的RPMI培养基(Gibco BRL Life Technologies)。 测试前一天，细胞以5×105细胞/mL分转培养于新鲜培养基。细胞于 含5％CO2的湿润空气中37℃孵育24小时，然后抽吸并以50mL培 养基离心洗涤。细胞重悬于5mL培养基，以锥虫蓝(Sigma，St Louis MI)染色和血细胞计数器分析测定细胞浓度和活力。DD- 母牛分枝杆 菌衍 生物(按上述制备)于50μL PBS和对照刺激剂以三次重复加入含100μL 培养基的96孔板，并制备相应稀释。脂多糖(LPS)(300μg/mL；Sigma) 和PBS用作对照。每孔加入100μL浓度为2×106细胞/ml的细胞，板 于含5％CO2的湿润空气中37℃孵育24小时。据厂商说明，用人IL -10 ELISA试剂(Phar Mingen，San Diego CA)测定每孔中IL-10 的水平。如图4示，发现DD- 母牛分枝杆菌的酸和高碘酸盐衍生物刺 激显著水平的IL-10生产。PBS对照，DD- 母牛分枝杆菌-KOH，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-高碘酸盐和DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸衍生物 不刺激THP-1细胞生产IL-10。
例5母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠对结核病的影 响
此例说明以结核分枝杆菌挑战前，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的效果
此距三周分两次向小鼠腹膜内注射下列制备物之一：
a)磷酸缓冲盐水(PBS，对照)；
b)热灭活 母牛分枝杆菌(500μg)；和
c)DD- 母牛分枝杆菌(50μg)。
最后一次腹膜内免疫后三周，以5×105活H37Rv结核分枝杆菌感 染小鼠。又三周后，杀死小鼠，匀浆其脾脏，并测试结核分枝杆菌菌 落形成单位(CFU)作为感染程度的指标。
图5数据中，每点代表一只小鼠。以PBS单独免疫对照小鼠回收 的CFU数作为基线。实验小鼠的所有数据表达为对照小鼠基线下CFU 的对数(或对数保护)。如图5示，以热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛 分枝杆菌免疫的小鼠分别显示＞1或0.5logs CFU的平均降低。数据证 实以 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌免疫的有效性，并表明DD- 母 牛分枝杆菌可发展为抗结核病的疫苗。
例6去脂去糖脂母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物的组 成分析
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的碳水组成分析
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的碳水化合物以标 准技术测定。结果示于表3，其中DDMV代表DD- 母牛分枝杆菌；DDMV -KOH代表DD- 母牛分枝杆菌-KOH；DDMV-A代表DD- 母牛分枝杆菌 -酸；DDMV-I代表DD- 母牛分枝杆菌高碘酸盐；DDMV-KOH-A代表 DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸；DDMV-KOH-I代表DD- 母牛分枝杆菌 -KOH-高碘酸盐。
表3
DD-母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌衍生物的碳水化合物分析 碳水化合物 DDMV DDMV- KOH DDMV-A DDMV-I DDMV- KOH-A DDMV- KOH-I 半乳糖胺 26.6* 29.2 14.9 37.7 0.3 3.9 葡糖胺 3.7 3.6 8.7 35.6 12.2 63.2 半乳糖 9.7 9.2 0.7 3.4 0.0 0.0 葡萄糖 56.9 54.8 71.1 23.0 87.5 27.5 甘露糖 3.2 3.2 4.7 0.4 0.02 5.5 果糖 未测 未测 未测 未测 未测 未测
*所有值为总碳水化合物的百分数
结果证明每种DD- 母牛分枝杆菌衍生物碳水组成含量不同，如从 酸、高碘酸盐或碱处理细胞的不同效果所预期。此外，与DD- 母牛分 枝杆菌衍生物相比，DD- 母牛分枝杆菌的碳水化合物显然不同。如所 期，DD- 母牛分枝杆菌-酸和DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐衍生物中 半乳糖含量低于DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌-KOH。这些 值反映了酸和高碘酸盐在制备衍生物中的作用，即从肽聚糖主链裂解 掉阿拉伯半乳聚糖侧链。
DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物的核酸分析
蛋白酶K处理后，以凝胶电泳分析DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛 分枝杆菌衍生物的核酸含量，显示DD- 母牛分枝杆菌，DD- 母牛分枝 杆菌-高碘酸盐和DD- 母牛分枝杆菌-KOH含少量DNA，而DD- 母牛 分枝杆菌-酸中未检测出核酸。
例7去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物对巨噬细胞生产IL-12的影响
巨噬细胞生产的白细胞介素-12(IL-12)增强刺激Th1免疫反 应。下面证明不同 母牛分枝杆菌制备物刺激IL-12生产的能力。
一组BALB/cByJ小鼠腹膜内注射巯基甘醇酸酯(Difco.实验室， 底特律，MI)。三天后采集腹膜巨噬细胞，并置于含IFN-γ(2U/mL) 的细胞培养物中四小时。以补充有110mg/L丙酮酸，116mg/L精氨酸， 36mg/L L-天冬酰胺，6mg/L叶酸，0.5mg/L链霉素，500U/L青霉 素，2mg/L L-谷氨酸，5×10-5M 2-巯基乙醇和5％胎牛血清(FBS) 的50mL冷DMEM培养基(Gibco Life Techrologies，Gaithersburg MD) 洗涤细胞三次，并调浓度至2×106细胞/mL。加入各种浓度的DD- 母 牛分枝杆菌(图7作R1)和DD- 母牛分枝杆菌-KOH(图7作R2)，DD - 母牛分枝杆菌-酸(图7作R3)，DD- 母牛分枝杆菌-高碘酸盐(图 7作R4)，DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸(图7作R5)和DD- 母牛分枝 杆菌-KOH-高碘酸盐(图7作P6)。每孔加入0.1mL浓度为2×106 细胞/mL的IFN-γ处理过的巨噬细胞。37℃又孵育24小时后，收集培 养上清，并测试巨噬细胞产生的IL-12。以DD- 母牛分枝杆菌衍生物 刺激的巨噬细胞生产IL-12水平示于图7。数据表明DD- 母牛分枝杆 菌衍生物刺激巨噬细胞生产IL-12约与DD- 母牛分枝杆菌水平相同， 除DD- 母牛分枝杆菌-KOH-酸诱导较少IL-12产生外。
例8以去脂去糖脂母牛分枝杆菌衍生物的不同剂量免疫小鼠的效果
此例说明DD- 母牛分枝杆菌衍生物的不同剂量对肺过敏性免疫反 应发展的免疫效果。这在气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型中得到证 实。这种过敏性疾病的严重性反映于累积在气道的巨大数目嗜酸性粒细 胞。
在0和7天腹膜内注射200μL含10μg卵清蛋白(OVA)和1mg 明矾佐剂的乳剂，使BALB/cBYJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21天， 麻醉小鼠，鼻内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸或PBS。在28 和32天，麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35天，杀死小鼠，用PBS 操作支气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析BAL细胞样品来测定嗜 酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。以嗜酸性粒细胞百分数值乘所得 淋巴细胞总数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞总数用血细胞计数 器测定。
图8示，DD- 母牛分枝杆菌-酸引致气道嗜酸性粒细胞(％嗜酸性粒 细胞)的显著的剂量依赖抑制，增加DD- 母牛分枝杆菌-酸的剂量，则观 察到抑制水平升高。
例9以去脂去糖脂母牛分枝杆菌免疫小鼠的途径的效果
此例说明DD- 母牛分枝杆菌衍生物免疫的不同途径抑制气喘样过敏 原特异性肺病小鼠模型中气道嗜酸性粒细胞的效果。
在0和7日，以腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂 的乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠， 鼻内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸或PBS。在28和32日， 麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35日，杀死小鼠，并用PBS作支 气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析BAL细胞样品来测定嗜酸性粒 细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总 数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞数用血细胞计数器测定。
如图9示，与对照小鼠相比，观察到以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内免 疫小鼠继以卵清蛋白攻击六天后采集的BAL细胞嗜酸性粒细胞百分数显 著降低。更进一步，数据显示以DD- 母牛分枝杆菌-酸鼻内施用对气道嗜 酸性粒细胞的抑制强于皮内免疫。对照小鼠给以鼻内PBS。图9数据示 每组小鼠的平均值和平均标准误差。
例10去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝杆菌 (DD- M.smegmatis)的制备和组成分析
结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的培养滤过物
按例1述母牛分枝杆菌的方法，培养耻垢分枝杆菌(耻垢分枝杆菌 ATCC Number 27199)于加1％葡萄糖的培养基90。37℃孵育5天后， 离心收集细胞，并移除培养滤过物。细菌沉淀重悬于磷酸缓冲盐水至10 mg/mL浓度，相当于每毫升1010耻垢分枝杆菌。细胞悬液120℃灭菌15 分钟。培养滤过物通过0.45μm滤器至无菌瓶中。
结核分枝杆菌H37Rv株(ATCC Number 27294)培养物在GAS培养 基(0.3g细菌酪胨(Difco Laboratories，底特律MI)，0.05g柠檬 酸铵铁，4g K2HPO4，2g柠檬酸，1g L-丙氨酸，1.2g MgCl2·6H2O， 0.6g K2SO4，2g NH4Cl，1.8mL NaOH(10N)，5mL甘油，pH7.0)37 ℃生长五天。细胞收集和进一步处理如上述对耻垢分枝杆菌细胞。
制备去脂去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和去脂去糖脂 耻垢分枝杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)及组成分析。
为制备去糖去糖脂结核分枝杆菌(DD- 结核分枝杆菌)和耻垢分枝 杆菌(DD- 耻垢分枝杆菌)，离心沉淀失活结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌， 水洗沉淀并再离心收集，冻干。分别保留一份冻干结核分枝杆菌和耻垢 分枝杆菌，称作冻干结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。当用于实验时，冻 干物质重悬于PBS至理想浓度。
按例1述DD- 母牛分枝杆菌的制备，来制备去脂去糖脂结核分枝杆 菌和耻垢分枝杆菌。为生物测试冻干DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝 杆菌以超声重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)并灭菌。
DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌的组成分析见表4和表5。DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌与DD- 母牛分枝杆菌在单糖组合物上 的主要不同在于某些单糖成分。表4数据示DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻 垢分枝杆菌分别含1.3％和0.0mol％葡萄糖，而DD- 母牛分枝杆菌含28.1 mol％。
DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌的氨基酸组合物见表5。DD- 结核分枝杆菌含6537.9nmoles/mg氨基酸，或约78.5％w/w，DD- 耻垢 分枝杆菌含6007.7nmoles/mg氨基酸，约72.1％w/w蛋白质。与表1DD- 母牛分枝杆菌的氨基酸分析相比，DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌 比DD- 母牛分枝杆菌含更多总％蛋白(55.1％)。
表4
去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌的单糖化合物 单糖 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 重量％ 摩尔％ 重量％ 摩尔％ 肌醇 0.0 0.0 0.0 0.0 甘油 9.5 9.7 15.2 15.5 阿拉伯糖 69.3 71.4 69.3 70.0 木糖 ND* ND 3.9 4.0 甘露糖 3.5 3.0 2.2 1.9 葡萄糖 1.5 1.3 0.0 0.0 半乳糖 12.4 10.7 9.4 8.0
*未做
表5
去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌的氨基酸组成 氨基酸 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 总蛋白 nmoles/mg 总蛋白 ％ 总蛋白 nmoles/mg 总蛋白 ％ 天冬氨酸 592.5 9.1 557.0 9.3 苏氨酸 348.1 5.3 300.5 5.0 丝氨酸 218.6 3.3 252.6 4.2 谷氨酸 815.7 12.5 664.9 11.1 脯氨酸 342.0 5.2 451.9 7.5 甘氨酸 642.9 9.8 564.7 9.4 丙氨酸 927.9 14.2 875.1 14.6 胱氨酸 31.8 0.5 20.9 0.3 缬氨酸 509.7 7.8 434.8 7.2 蛋氨酸 122.6 1.9 113.1 1.9 异亮氨酸 309.9 4.7 243.5 4.1 亮氨酸 542.5 8.3 490.8 8.2 酪氨酸 116.0 1.8 108.3 1.8 苯丙氨酸 198.9 3.0 193.3 3.2 组氨酸 126.1 1.9 117.2 2.0 赖氨酸 272.1 4.2 247.8 4.1 精氨酸 421.0 6.4 371.7 6.2
例11以去脂去糖脂结核分枝杆菌和去脂去糖脂耻垢分枝杆菌免疫对小 鼠气喘的影响
按上述于例8，在气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型中检测DD- 结 核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌抑制过敏性免疫反应发展的能力。结果 说明DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌免疫对抑制气道嗜酸性粒细 胞的效果，说明其免疫调节性。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻 内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌，DD- 结核分枝杆菌，DD- 耻垢分 枝杆菌或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻内施以100μg OVA。在35 日，杀死小鼠，并用PBS作支气管肺泡灌洗(BAL)。以流式细胞计分析 BAL细胞样品来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜酸性粒细 胞百分数乘所得淋巴细胞总数得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋巴细胞总数 用血细胞计数器测定。
图10数据表明，以DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌治疗减缓 肺嗜酸性粒细胞累积，这与以DD- 母牛分枝杆菌免疫后的减缓类似；DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分枝杆菌可用于减缓与气道、鼻粘膜和上呼吸 道嗜酸性粒细胞相关的炎症。因此施用DD- 结核分枝杆菌和DD- 耻垢分 枝杆菌可减缓气喘和类似免疫异常性疾病如过敏性鼻炎的严重性。
例12去脂去糖脂母牛分枝杆菌对人外周血单核细胞产生IL-10，TNF -α和IFN-γ的影响
此例记述DD- 母牛分枝杆菌刺激人外周血单核细胞(PBMC)产生细 胞因子的能力研究。
人血分离为PBMG和非粘着细胞，如下以DD- 母牛分枝杆菌刺激后测 定各部分的细胞因子生产。血以等体积盐水稀释，15-20mL铺层于10mL 水溶性聚蔗糖(Ficoll)(Gibco BRL Life Technologies，Gaithersburg， MD)。1800rpm离心20min后移除淋巴细胞层，以RPMI培养基(Gibco BRL)洗三次，并用锥虫蓝计数。细胞重悬于含5％热失活的自身血清的 RPMI培养基至浓度为2×106/mL。细胞样品分装以制备非粘着细胞。
在含5％CO2的湿润空气中，于补充血清(如上)的RPMI孵育20mL 淋巴细胞一小时来制备非粘着细胞。非粘着细胞转至干净瓶，孵育重复 一次。非粘着细胞移出，计数，并重悬于补充RPMI培养基至浓度为2- 106/mL。制备DD- 母牛分枝杆菌的系列稀释，始于200μg/mL，并加入96 孔板的100μL培养基(补充RPMI)中。PBMC和非粘着细胞加入孔内(100 μL)，板在含5％CO2的湿润空气中37℃孵育48小时。每孔移出150μL 来测定以DD- 母牛分枝杆菌刺激后，不同细胞产生的细胞因子的量。
DD- 母牛分枝杆菌刺激PBMC分泌TNT-α和IL-10(图11和12A， 分别)，但刺激非粘着细胞产生IFN-γ(图12B)。这些数据暗示DD- 母 牛分枝杆菌刺激的PBMC中IFN-γ生产受IL-10自身分泌抑制。
例13热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌活化T细胞
下面检测热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌活化人T 细胞和天然杀伤(NK)细胞的能力。
浓度为5×106细胞/mL的人外周血单核细胞(PBMC)与20μg/mL 热灭活 母牛分枝杆菌或DD- 母牛分枝杆菌培养24小时。对照细胞只与培 养基培养。然后以抗CD 56(NK细胞的一种标记)、αβT细胞或γδT细胞 的单克隆抗体-S抗CD 69单克隆抗体联用，染色培养细胞，其中CD 69 是活化细胞表达的一种分子。细胞再以流式细胞计分析。表达CD 69的 细胞百分数见表6。
表6
热灭活母牛分枝杆菌和去脂去糖脂母牛分枝杆菌
活化人T细胞和天然杀伤细胞 αβT细胞 γδT细胞 NK细胞 对照 3.8 6.2 4.8 热灭活母牛分枝杆菌 8.3 10.2 40.3 去脂去糖脂母牛分枝杆菌 10.1 17.5 49.9
这些结果表明热灭活 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌活化αβ和γδT 细胞及NK细胞。
Holt和Sly的新近研究(Nature Medicine 5：1127-1128，1999) 表明，对气喘，γδT细胞在保持正常气道反应性和下调气道对抗原入侵 的反应性中是重要的，可能通过控制气道内皮细胞对γδT细胞细胞介导 损伤的“修复”反应。由于 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌能活化γδT 细胞，它们可能有效恢复机体存在γδT细胞的病变区如气道、肺、皮肤 和肠的正常内皮。
例14以DD- 母牛分枝杆菌-酸，DD- 母牛分枝杆菌，HVac和EVac免疫 对小鼠气喘的影响
此例说明以DD- 母牛分枝杆菌和DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛分 枝杆菌-酸，Hvac和EVac免疫对肺过敏性免疫反应发展的影响。这在 气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型中得到证实。此过敏性疾病的严重 性反映于累积在气道的巨大数目嗜酸性粒细胞。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μgOVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14和21日，麻醉小鼠，鼻 内或皮内接种200μg DD- 母牛分枝杆菌，DD- 母牛分枝杆菌-酸，Hvac， Evac或PBS。在28和32日，麻醉小鼠，鼻内施用100μg OVA于50μL PBS。在35日，杀死小鼠，并用PBS作支气管肺泡灌洗(BAL)。BAL细 胞以流式细胞计分析来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。嗜 酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总数即得总BAL嗜酸性粒细胞数，淋 巴细胞总数由血细胞计数器测定。
如图13示，DD- 母牛分枝杆菌，Hvac和Evac致气道嗜酸性粒细胞 显著抑制(示为％嗜酸性粒细胞)。
例15以OVA攻击后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜酸性粒细胞的 抑制
此例说明DD- 母牛分枝杆菌-酸对肺过敏性免疫反应发展的影响， 如示于气喘样过敏原特异性肺病的小鼠模型。以OVA进攻后三天施用DD- 母牛分枝杆菌-酸来诱发严重的气道嗜曙红细胞增多。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μgOVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使BALB/cByJ雌小鼠(每组十只)对OVA致敏化。在14和18日， 麻醉小鼠，鼻内进攻100μg OVA于50μL PBS。在21日，再麻醉小鼠， 并鼻内施用200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。在25日，杀死小鼠，并用 PBS作BAL。对照小鼠接受PBS而非DD- 母牛分枝杆菌-酸施用，其余处 理同实验小鼠。BAL细胞以流式细胞计分析来测定嗜酸性粒细胞含量(％ 嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞数由嗜酸性粒细胞百分数乘所得 淋巴细胞总数而得到，淋巴细胞总数由血细胞计数器测定。
如图14示，观察到气道嗜酸性粒细胞的显著抑制(示为％嗜酸性 粒细胞)，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。在PBS和DD- 母牛分枝杆 菌-酸处理的小鼠，气道嗜曙红细胞增多的严重性随两次OVA进攻的时 间间隔延长而降低。更进一步，DD- 母牛分枝杆菌-酸致所用全部三组 小鼠嗜酸性粒细胞百分数的统计显著抑制。这些数据证实诱导气道嗜曙 红细胞增多后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸有治疗利益。
例16以OVA进攻前即刻施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜酸性粒细 胞的影响
此例说明以二次OVA进攻来诱导气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型 严重气道嗜曙红细胞增多之前一天，施用DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使两组BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14日，麻醉小鼠，鼻 内施用DD- 母牛分枝杆菌-酸(200μg)。在15日，麻醉小鼠，鼻内进 攻100μg OVA于50μL PBS。I组小鼠在19日接受第二次鼻内100μg OVA 于50μL PBS进攻。II组小鼠在18日接受第二次200μg DD- 母牛分枝 杆菌-酸，然后在19日接受第二次OVA进攻(100μg OVA于50μL PBS)。 在22日杀死两组小鼠并用PBS作BAL。两组对照小鼠以PBS而非DD- 母 牛分枝杆菌-酸免疫，其余处理同实验组。BAL细胞样品以流式细胞计 来测定嗜酸性粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞由 嗜酸性粒细胞百分数乘所得淋巴细胞总数而得，淋巴细胞总数由血细胞 计数器测得。
如见于图15，观察到气道嗜曙红细胞增多(示以％嗜酸性粒细胞) 的统计显著抑制(P＝0.0000015)，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。 当仅在第一次入侵前以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小鼠时，嗜酸性粒细 胞百分数减少20％。当在两次入侵前均以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小 鼠时，气道嗜曙红细胞增多的抑制被增强，指示为嗜酸性粒细胞百分数 减少40％。
例17以OVA进攻后施用DD- 母牛分枝杆菌-酸对气道嗜曙红细胞增多 的抑制
此例说明以OVA进攻后三天，以DD- 母牛分枝杆菌衍生物DD- 母牛 分枝杆菌-酸两次免疫，对气喘样过敏原特异性肺病小鼠模型中肺过敏 性免疫反应发展的影响。
在0和7日，腹膜内注射200μL含10μg OVA和1mg明矾佐剂的 乳剂使三组BALB/cByJ雌小鼠对OVA致敏化。在14日，麻醉全部小鼠， 鼻内进攻100μg OVA于50μL PBS。在18日，再麻醉全部小鼠，鼻内 施用200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。I组小鼠在21日(第一次进攻后 七天)以OVA(100μg于50μL PBS)第二次鼻内进攻。在24日杀死 这些小鼠，并用PBS作BAL。II组小鼠在25日(第一次进攻后11天) 接受第二次OVA进攻，在28日杀死，并用PBS作BAL。III组小鼠在25 日接受200μg DD- 母牛分枝杆菌-酸。这些小鼠在28日(第一次进攻 后14日)接受第二次100μg OVA于50μL PBS入侵，在31日杀死， 并用PBS作BAL。三组对照小鼠接受PBS而非DD- 母牛分枝杆菌-酸， 其余免疫处理同实验组。BAL细胞样品以流式细胞计分析来测定嗜酸性 粒细胞含量(％嗜酸性粒细胞)。总BAL嗜酸性粒细胞数由嗜酸性粒细 胞百分数乘所得淋巴细胞总数而得到，淋巴细胞总数以血细胞计数器测 定。
如图16示，观察到气道嗜曙红细胞增多(示以％嗜酸性粒细胞) 的统计显著抑制，说明DD- 母牛分枝杆菌-酸的疗效。在PBS和DD- 母 牛分枝杆菌-酸处理的小鼠，气道嗜曙红细胞增多的严重性随两次OVA 进攻时间间隔延长而降低。进一步，DD- 母牛分枝杆菌-酸在所有三种 所用方法中均致嗜酸性粒细胞百分数的统计显著抑制。
第一次进攻后四天，以DD- 母牛分枝杆菌-酸处理小鼠三天后继以 第二次进攻(进攻迟滞＝7日)，气道嗜曙红细胞增多减缓约15％(I组； P＝0.034)。当第二次进攻又迟滞四天时，观察到稍高程度(约25％) 的抑制(II组；P＝0.036)。当第二次进攻前，以DD- 母牛分枝杆菌- 酸两次处理小鼠时，气道嗜曙红细胞增多被抑制56％(III组；P＝ 0.0000027)。这些数据显示，气道嗜曙红细胞增多诱发后，施用DD- 母 牛分枝杆菌-酸有疗效。
尽管本发明已通过说明和实例详述以便理解清晰，可以进行不离开 本发明范围的改变和修饰，本发明仅限于所附权利要求的范围。
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