具有作为佐剂的白介素-33的疫苗
阅读：988发布：2020-05-17
专利汇可以提供具有作为佐剂的白介素-33的疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了一种包含 抗原 和IL‑33的 疫苗 。本文还公开一种用于增加受试者的免疫应答的方法。所述方法可包括向有需要的所述受试者施用所述疫苗。，下面是具有作为佐剂的白介素-33的疫苗专利的具体信息内容。
1.一种疫苗，其包含：
a)抗原或编码抗原的核苷酸；和
b)IL-33，其中IL-33由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列以及在SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的疫苗，其中IL-33由如在SEQ ID NO:1中列出的所述核苷酸序列编码。
3.如权利要求1所述的疫苗，其中IL-33由如在SEQ ID NO:3中列出的所述核苷酸序列编码。
4.如权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原由第一核酸编码，并且IL-33由第二核酸编码。
5.如权利要求4所述的疫苗，其还包含具有与权利要求4中所述的抗原相同的编码核酸序列的抗原肽和具有与权利要求4中所述的IL-33相同的编码核酸序列的IL-33肽。
6.如权利要求1所述的疫苗，其中IL-33选自由proIL-33和mtrIL-33组成的组。
7.如权利要求6所述的疫苗，其中IL-33是proIL-33。
8.如权利要求7所述的疫苗，其中proIL-33由如在SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码。
9.如权利要求6所述的疫苗，其中IL-33是mtrIL-33。
10.如权利要求9所述的疫苗，其中mtrIL-33由如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列编码。
11.如权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原选自由以下组成的组：人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、流感抗原、恶性疟原虫抗原、结核分枝杆菌抗原、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCMV)抗原，以及其片段。
12.如权利要求11所述的疫苗，其中所述HPV抗原选自由以下组成的组：HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原，以及其组合。
13.如权利要求11所述的疫苗，其中所述HIV抗原选自由以下组成的组：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag，以及其任何组合。
14.如权利要求11所述的疫苗，其中所述流感抗原选自由以下组成的组：H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA、BHA抗原，以及其任何组合。
15.如权利要求11所述的疫苗，其中所述恶性疟原虫抗原包括环子孢子(CS)抗原。
16.如权利要求11所述的疫苗，其中所述结核分枝杆菌抗原选自由以下组成的组：
Ag85A、Ag85B、EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV、EsxW，以及其任何组合。
17.如权利要求11所述的疫苗，其中所述LCMV抗原选自由以下组成的组：核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)，以及其组合。
18.如权利要求1所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。
19.如权利要求4所述的疫苗，其中所述第二核酸还包含表达载体。
20.权利要求1所述的疫苗在生产用于增加有需要的受试者的免疫应答的药剂中的用途，所述增加包括向所述受试者施用所述疫苗。
21.如权利要求20所述的用途，其中施用所述疫苗包括电穿孔。
22.如权利要求20所述的用途，其中所述受试者的所述免疫应答增加至少约2倍。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述受试者的所述免疫应答增加至少约4倍。
24.如权利要求20所述的用途，其中增加所述受试者的所述免疫应答包括增加所述受试者的细胞免疫应答。
25.权利要求1所述的疫苗在生产用于治疗有需要的受试者的癌症的药剂中的用途，所述治疗包括向所述受试者施用所述疫苗。
26.如权利要求25所述的用途，其还包括减小所述受试者的肿瘤大小。
27.如权利要求25所述的用途，其还包括增加所述受试者的肿瘤消退。
28.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：HPV相关癌症、HBV相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、hTERT相关癌症、FAP抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、肛门癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤、胃癌、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌、以及原发性皮肤T细胞淋巴瘤。
29.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症是所述HPV相关癌症。
30.一种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个核苷酸序列：SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:3、以及其组合。
31.如权利要求30所述的核酸分子，其中所述核酸分子是质粒。
32.如权利要求30所述的核酸分子，其中所述核酸分子是一个或多个质粒。
具有作为佐剂的白介素-33的疫苗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年10月7日提交的美国临时专利申请第61/887,502号和于2013年10月25日提交的美国临时专利申请第61/895,673号的优先权，所述申请均以引用方式特此并入。
技术领域
[0004] 背景
[0005] 疫苗用于刺激个体的免疫应答，以提供针对特定疾病的保护和/或对特定疾病的治疗。一些疫苗包含诱导免疫应答的抗原。一些抗原引起强免疫应答，而其他抗原引起弱免疫应答。通过在疫苗中包含佐剂可以加强对抗原的弱免疫应答。佐剂以很多不同形式出现，例如铝盐、油乳剂、细菌或其他病原体的无菌成分、细胞因子等。
[0006] 细胞因子是由影响其他细胞行为的细胞形成的蛋白质，并且与很多佐剂不同的是它们可以调节特异性免疫应答。一种所述细胞因子是白细胞介素-33(IL-33)。IL-33是在组织损伤或感染时警告免疫系统的内源性信号或警报素(alarmin)。具体地，全长IL-33被释放到细胞外空间中并且活化其受体ST2。ST2的活化引起炎症性和2型免疫应答。
[0007] 还以许多不同方式(例如，注射、口服等)将疫苗施用到许多不同的组织(例如，肌内、鼻内等)中。然而，并非所有的递送方法都是等效的。一些递送方法允许在个体群体内的更大顺从性，而其他递送方法可影响疫苗的免疫原性和/或安全性。因此，在本领域中仍需要开发安全且更有效的增加对抗原的免疫应答的佐剂。
[0008] 概述
[0009] 本发明涉及一种包含抗原和IL-33的疫苗。IL-33可由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列、与如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列。IL-33可由如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列编码。IL-33可由如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码。
[0010] 抗原可由第一核酸编码，并且IL-33可由第二核酸编码。第二核酸还可包含表达载体。疫苗还可包含具有与以上抗原相同的编码核酸序列的抗原肽，和具有与以上IL-33相同的编码核酸序列的IL-33肽。
[0011] IL-33可选自由proIL-33和mtrIL-33组成的组。IL-33可以是proIL-33。proIL-33可由如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码。IL-33可以是mtrIL-33。mtrIL-33可由如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列编码。
[0012] 抗原可选自由以下组成的组：人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、流感抗原、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗原、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCMV)抗原，以及其片段。HPV抗原可选自由以下组成的组：HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原，以及其组合。HIV抗原可选自由以下组成的组：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag，以及其任何组合。流感抗原可选自由以下组成的组：H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原，以及其任何组合。恶性疟原虫抗原可包括环子孢子(CS)抗原。结核分枝杆菌抗原可选自由以下组成的组：Ag85A、Ag85B、EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV、EsxW,以及其任何组合。LCMV抗原可选自由以下组成的组：核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)，以及其组合。
[0013] 所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。
[0014] 本发明还涉及一种用于增加有需要的受试者的免疫应答的方法。所述方法可包括向受试者施用包含抗原和IL-33的疫苗。IL-33可由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列、与如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列具有至少约
95％同一性的核苷酸序列，以及如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列。IL-33可由如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列编码。IL-33可由如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码。
95％同一性的核苷酸序列，以及如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列。IL-33可由如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列编码。IL-33可由如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码。
[0015] 施用疫苗可包括电穿孔。受试者的免疫应答可增加至少约2倍。受试者的免疫应答可增加至少约4倍。增加受试者的免疫应答可包括增加受试者的细胞免疫应答。
[0016] 本发明还涉及一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法可包括向受试者施用包含抗原和IL-33的疫苗。IL-33可由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列、如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列、与如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列。IL-33可由如在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列编码。IL-33可由如在SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码。
[0017] 用于治疗癌症的所述方法还可包括减小受试者的肿瘤大小。用于治疗癌症的所述方法还可包括增加受试者的肿瘤消退。癌症可选自由以下组成的组：HPV相关癌症、HBV相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌(liver cancer)、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、hTERT相关癌症、FAP抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌(gastric cancer)、肛门癌、滑膜肉瘤(synovial carcinoma)、晕丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤(hepatocarcinoma)、胃癌(stomach cancer)、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌，以及原发性皮肤T细胞淋巴瘤。癌症可以是HPV相关癌症。
[0018] 本发明还涉及一种包含选自由以下组成的组的一个或多个核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、与SEQ ID NO：195％或更大同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：395％或更大同一性的核苷酸序列，以及其任何组合。核酸分子可以是质粒。核酸分子可以是一个或多个质粒。
[0020] 图1示出(A)小鼠proIL-33和小鼠mtrIL-33构建体的示意性表示；(B)proIL-33和mtrIL-33的蛋白质印迹检测；(C)分泌的proIL-33和mtrIL-33的ELISA检测；以及(D)proIL-
33和mtrIL-33的细胞定位。
33和mtrIL-33的细胞定位。
[0021] 图2示出(A)DNA疫苗免疫计划表；(B)IFN-γELISpot；以及(C)IL-4ELISpot。
[0022] 图3示出(A)用于流式细胞术分析的门控策略；(B)释放IFN-γ的E6/E7特异性CD4+T细胞；(C)释放TNF-α的E6/E7特异性CD4+T细胞；(D)释放IFN-γ和TNF-α的E6/E7特异性CD4+T细胞；以及(E)单阳性和双阳性CD4+T细胞的亚群。
[0023] 图4示出(A)释放IFN-γ的E6/E7特异性CD8+T细胞；(B)释放TNF-α的E6/E7特异性CD8+T细胞；(C)释放IFN-γ和TNF-α的E6/E7特异性CD8+T细胞；(D)单阳性和双阳性CD8+T细胞的亚群；(E)表达脱粒标记物CD107a的E6/E7特异性CTL；以及(F)单阳性、双阳性和三阳性CD8+T细胞的亚群。
[0024] 图5示出(A)Ly5.1表达的动力学和(B)效应记忆CD8+T细胞的分布。
[0025] 图6示出GP33/Ly5.1特异性CD8+T细胞应答的代表性荧光强度图。
[0026] 图7示出(A)抗HPV16 E7的特异性总IgG抗体；(B)抗HPV16 E7的特异性总IgE抗体；以及(C)在血清中检测到的总IgE抗体。
[0027] 图8示出(A)治疗方案的时间轴的示意性说明；以及(B)肿瘤细胞激发后随时间推移的平均肿瘤大小。
[0028] 图9示出肿瘤细胞激发后小鼠的存活百分比。
[0029] 图10示出人proIL-33和人mtrIL-33构建体的示意性表示。
[0030] 图11示出(A)考查LCMV激发的实验的时间轴的示意性说明；(B)用20x LD50Armstrong LCMV以i.c.形式激发的小鼠的存活百分比；以及(C)用40x LD50Armstrong LCMV以i.c.形式激发的小鼠的存活百分比。
[0031] 图12示出(A)CD8+T细胞响应于DbNP396表位产生IFN-γ的能力，如通过IFN-γ ELISpot测定所测定的；(B)DbNP396特异性CD8+T细胞的总细胞因子(即，IFN-γ、TNF-α和IL-
2)频率，如通过流式细胞术所测量的；(C)释放细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的单阳性、双阳性和三阳性CD8+T细胞的亚群；(D)产生IFN-γ的抗原特异性溶细胞性脱粒T细胞的百分比，其中脱粒T细胞通过脱粒标记物CD107a鉴定并且点图表示每个小鼠组；(E)用DbNP396肽、抗CD3和抗CD28刺激的CD8+T细胞的增殖百分比，如通过cell tracer violet和流式细胞术所测量的；以及(F)在用DbNP396肽刺激时效应记忆CD8+T细胞的增殖百分比，其中点图表示刺激后的CD62L-CD44+CD8+T细胞。
2)频率，如通过流式细胞术所测量的；(C)释放细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的单阳性、双阳性和三阳性CD8+T细胞的亚群；(D)产生IFN-γ的抗原特异性溶细胞性脱粒T细胞的百分比，其中脱粒T细胞通过脱粒标记物CD107a鉴定并且点图表示每个小鼠组；(E)用DbNP396肽、抗CD3和抗CD28刺激的CD8+T细胞的增殖百分比，如通过cell tracer violet和流式细胞术所测量的；以及(F)在用DbNP396肽刺激时效应记忆CD8+T细胞的增殖百分比，其中点图表示刺激后的CD62L-CD44+CD8+T细胞。
[0032] 图13示出(A)DNA疫苗接种后血液中DbGp33(Tet+)特异性CD8T细胞的动力学，其中在第0天初免并且在疫苗接种后第21天(dpv)用单独的GP加强(箭头)；(B)在21dpv时DbGP33CD8+T细胞的频率；(C)如通过IFN-γ ELISpot测定所测量的在21dpv时产生IFN-γ的GP特异性T细胞；(D)在21dpv时GP特异性IFN-γ+CD8+T细胞的频率；(E)在21dpv时GP特异性CD107a+CD8+T细胞的频率；以及(F)在21dpv时GP特异性T-bet+CD8+T细胞的频率。
[0033] 图14示出(A)疫苗免疫计划表的示意性说明；以及(B)DNA疫苗接种后CD8+KLRG1+T细胞群的动力学。
[0034] 图15示出(A)DNA疫苗接种后DbGP33+CD8+CD122+T细胞发育的动力学，其中在第0天初免并且在第21天用单独的GP加强(箭头)，以及指示第21天和第31天外周血中的DbGP33+四聚体特异性CD8+T细胞中的CD122细胞表面表达的代表性等值线图；(B)在21dpv用GP抗原肽库活体外再刺激之后来自收获的小鼠(n＝4)脾脏的CD8+CD122+T细胞的IFN-γ产生；以及b(C)在21dpv用D NP396肽活体外再刺激之后来自收获的小鼠(n＝4)脾脏的CD8T细胞子集
(即，CD8+KLRG1+、CD8+CD122+、CD8+KLRG1-和CD8+CD122-)的IFN-γ产生。
(即，CD8+KLRG1+、CD8+CD122+、CD8+KLRG1-和CD8+CD122-)的IFN-γ产生。
[0035] 图16示出(A)具有抗CD122mAb的DNA疫苗的递送的免疫计划表的示意图；(B)未治疗小鼠和抗CD122治疗小鼠中的表达CD8和CD122的T细胞的评估；以及(C)抗CD122mAb治疗之后脾脏中DbGP33四聚体特异性CD8+T细胞的频率和示出治疗后的DbGP33CD8+T细胞的代表性等值线图。
[0036] 图17示出(A)疫苗接种之后分泌IFN-γ的抗原特异性细胞的检测，如通过IFN-γ ELISpot测定所测量的；(B)多功能性CD4+T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的HIV特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例；以及(C)+多功能性CD8T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的HIV特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例。
[0037] 图18示出(A)疫苗接种之后分泌IFN-γ的抗原特异性细胞的检测，如通过IFN-γ+
ELISpot测定所测量的；(B)多功能性CD4T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的TB特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例；以及(C)多功能性CD8+T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的TB特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例。
ELISpot测定所测量的；(B)多功能性CD4T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的TB特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例；以及(C)多功能性CD8+T细胞的百分比，如通过多参数流式细胞术所测定的，其中条形图示出表现为分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的三阳性、双阳性和单阳性细胞的TB特异性T细胞的百分比，并且饼形图示出每种细胞因子亚群的相对比例。
[0038] 详述
[0039] 本发明涉及一种可以通过使用IL-33作为佐剂用于增加对抗原的免疫应答的疫苗。当用作佐剂时，IL-33意想不到地增加T辅助细胞1(Th1)免疫应答，而不增加T辅助细胞2(Th2)免疫应答。这与IL-33活化先天免疫应答和Th2免疫应答的生物功能截然相反。在一些情况下，IL-33可增加抗病毒细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。IL-33还可增加细胞因子IL-2的水平。因此，IL-33可增加多功能性CD4+T细胞和CD8+T细胞的亚群以促进细胞免疫应答。
[0040] IL-33还可诱导效应记忆T细胞的扩增和分化以促进细胞免疫应答。CD122+CD8+调节T细胞可降低疫苗的有效性，因此IL-33对这些细胞的遏制还可促进由疫苗诱导的细胞免疫应答。
[0041] IL-33可增强对抗原的细胞免疫应答，所述抗原诸如病毒和细菌抗原，例如人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、结核分枝杆菌抗原以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原。因而，IL-33可促进对抗所述病原体的显著保护。
[0042] 本发明的疫苗可预防癌症或肿瘤形成。疫苗还可导致已形成癌症或肿瘤的消退。消退可以是90％或更大的消退。癌症的消退可以是完全的。疫苗还可预防病毒相关癌症(例如，HPV相关癌症)并导致其消退。因此，本文还提供一种用于通过向有需要的受试者施用疫苗来治疗癌症的方法。
[0043] 1.定义
[0044] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域的普通技术人员通常所理解的意义。如有冲突，将以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以其全文以引用的方式并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意图为限制性的。
[0045] 如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语、或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。
[0046] 如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。
[0048] 如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。
[0049] 如本文所用的“核酸”可以是单链的或者双链的或可以含有双链和单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。
[0050] 如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5′(上游)或者3′(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
[0051] 如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然与合成的修饰或组合。
[0052] 如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMV IE启动子。
[0053] 如本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、遏制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。遏制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的疫苗。
[0055] 如关于核酸在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。
[0056] 变体还可定义为通过氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。
[0057] 变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同
[0058] 如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。
[0059] 对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
[0060] 2.疫苗
[0061] 本文提供一种包含抗原和佐剂的疫苗。疫苗可以在受试者中增加抗原呈递和对抗原的总免疫应答。抗原和佐剂的组合比仅包含抗原的疫苗更有效地诱导免疫系统。这种更有效的免疫应答在任何疾病、病原体或病毒(包括以下更详细地描述的癌症)的治疗和/或预防方面提供增加的功效。
[0062] 本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护以免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导对抗细胞内病原体的保护性T细胞应答；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。通过如以下所论述组合抗原和佐剂，疫苗可实现这些特征中的一些或全部。
[0064] a.佐剂
[0065] 疫苗可包含佐剂。佐剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至佐剂的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
[0066] (1)IL-33
[0067] 佐剂可以是白介素-33(IL-33)、其片段、其变体或其组合。IL-33是细胞因子的白介素-1(IL-1)家族成员，所述细胞因子参与组织损伤或感染之后的早期免疫和炎症性应答。IL-1家族成员还协调后来的适应性免疫应答，即T辅助细胞2(Th2)免疫应答。此家族的调节异常已经涉及许多疾病，例如哮喘、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、牙周炎和败血症。具体地，在炎症性疾病哮喘和类风湿性关节炎中IL-33水平是升高的，并且IL-33促进Th2相关疾病诸如哮喘、特应性皮炎和过敏反应的发病。相比之下，IL-33在心血管疾病诸如动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病和心脏重塑中具有保护作用，并且有助于宿主防御寄生虫和细菌感染。
[0068] 全长IL-33被组成型地表达于内皮和上皮细胞的核中，在此处其与异染色质和有丝分裂染色质相关联。全长IL-33的氨基末端包含染色质结合结构域或基序(CBD)和核定位信号(NLS)。具体地，CBD是同源结构域样螺旋-转角-螺旋基序，所述基序充当转录阻遏物。
[0069] 然而，在组织损伤或感染时全长IL-33还作为警报素被释放到细胞外空间中。细胞外IL-33结合细胞表面受体ST2以活化先天免疫系统的细胞(例如，肥大细胞和嗜酸性粒细胞)以发出危险(即损伤或感染)的信号并且诱导炎症性应答。诱导的促炎介质包括肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β和干扰素-γ(IFN-γ)。IL-33还诱导最近发现的先天性免疫细胞，即2型先天性淋巴细胞(ILC2)。ILC2是非B非T细胞并且产生Th2型细胞因子，例如白介素-4、白介素-5和白介素-13(分别为IL-4、IL-5和IL-13)。
[0070] 另外，细胞外IL-33由蛋白酶裂解，其中所得片段结合ST2并且放大初始的“危险”信号。ST2还被表达于许多其他细胞类型(但大部分是造血的)中，例如，CD4+T细胞的不同子集、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、恒定自然杀伤T细胞，并且活化嗜中性粒细胞，从而使得IL-33诱导各种细胞因子和趋化因子的产生以及细胞活化、分化、极化或趋化。ST2是用于Th2型细胞的选择性标记物并且以膜结合形式和可溶性形式存在。ST2的膜结合形式当被IL-33结合时触发核因子(NF)-κB和分裂素活化的蛋白激酶通路(例如，p38、JNK、ERK1和ERK2)以启动细胞信号传导。可溶性ST2也结合IL-33，但是为诱饵分子，从而抑制IL-33。
[0071] 此外，IL-33可以缺少CBD和NLS的成熟形式或截短形式存在。成熟IL-33可充当促炎细胞因子以调节免疫应答。
[0072] IL-33可以增加或加强受试者的对抗原的免疫应答。在以下对抗原进行更详细地论述。在一些情况下，IL-33可以使对抗原的免疫应答增加约75％至约200％。或者，IL-33可以使对抗原的免疫应答增加约90％至约130％。在其他可替代实施方案中，IL-33可以使对抗原的免疫应答增加约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、
102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％，112％、113％、
114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、
126％、127％、128％、129％或130％。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、
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114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、
126％、127％、128％、129％或130％。
[0073] 在其他实施方案中，IL-33可以使对抗原的免疫应答增加或加强至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。
[0074] 当IL-33增加或加强受试者的对抗原的免疫应答时，受试者中的白介素-4(IL-4)水平(分泌)和免疫球蛋白E(IgE)水平没有增加。意想不到的是，作为佐剂的IL-33不增加或加强受试者的对抗原的Th2免疫应答。相反，作为佐剂的IL-33可增加或加强受试者的对抗原的Th1或细胞免疫应答。
[0075] Th1免疫应答涉及T细胞应答的活化。这些T细胞应答可包括CD4+和CD8+T细胞应答以及干扰素-γ、肿瘤坏死因子α和/或白介素(IL-2)的分泌。干扰素-γ和肿瘤坏死因子α具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤特性，并且可以改变多种基因的转录以产生多种生理应答和细胞应答。由干扰素-γ引起的一些作用包括促进自然杀伤细胞(NK细胞)活性、引起正常细胞增加I类MHC分子的表达、增加巨噬细胞中的抗原呈递和溶酶体活性、诱导一氧化氮合酶(iNOS)以及促进有关细胞毒性CD8+T细胞的细胞免疫中的Th1分化，同时遏制体液(抗体)免疫中的Th2分化。
[0076] 细胞毒性CD8+T细胞(细胞毒性T淋巴细胞(CTL))是诱导感染病毒和其他病原体的细胞死亡的T细胞的亚组。在活化后，CTL经历克隆扩增以产生抗原特异性的效应细胞。效应CTL通过指导的胞吐作用(即，脱粒)分子的过程释放，所述分子杀死感染的细胞或靶细胞，例如，穿孔蛋白、粒溶蛋白和颗粒酶。当不再需要时，许多效应CTL死亡，但是一些效应细胞被保留为记忆细胞，以使得当再次遇到抗原时，记忆细胞分化成效应细胞以更快速地发动免疫应答。
[0077] 当IL-33增加或加强Th1或细胞免疫应答时，使干扰素-γ(IFN-γ)水平(分泌)增加。在一些情况下，IL-33可使对抗原的Th1或细胞免疫应答增加约1.5倍至约10.0倍、约1.5倍至约8.0倍、约1.5倍至约6.0倍、约1.5倍至约4.0倍、约2.0倍至约10.0倍、约2.0倍至约
8.0倍、约2.0倍至约6.0倍、约2.0倍至约4.0倍、约2.5倍至约4.0倍、约4.0倍至约10.0倍、约
6.0倍至约10.0倍，或约8.0倍至约10.0倍。IL-33还可使对抗原的Th1或细胞免疫应答增加至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4.0倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约
5.0倍、至少约6.0倍、至少约7.0倍、至少约8.0倍、至少约9.0倍，或者至少约10.0倍。IL-33可使Th1或细胞免疫应答进一步增加约3.5倍或4.0倍。
8.0倍、约2.0倍至约6.0倍、约2.0倍至约4.0倍、约2.5倍至约4.0倍、约4.0倍至约10.0倍、约
6.0倍至约10.0倍，或约8.0倍至约10.0倍。IL-33还可使对抗原的Th1或细胞免疫应答增加至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4.0倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约
5.0倍、至少约6.0倍、至少约7.0倍、至少约8.0倍、至少约9.0倍，或者至少约10.0倍。IL-33可使Th1或细胞免疫应答进一步增加约3.5倍或4.0倍。
[0078] 增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括增加的CD4+T细胞应答。增加的CD4+T细胞应答可包括增加受试者中分泌IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-2，或IFN-γ和TNF-α两者，或IFN-γ、TNF-α和IL-2的一些组合(例如，表达IFN-γ、TNF-α和IL-2的三阳性细胞)的CD4+T细胞的群体或频率。因此，增加的CD4+T细胞应答可包括增加多功能性CD4+T细胞的亚群。
[0079] 增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括增加的CD8+T细胞应答。增加的CD8+T细胞应答可包括增加受试者中分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2，或IFN-γ和TNF-α两者，或IFN-γ、TNF-α和IL-2的一些组合(例如，表达IFN-γ、TNF-α和IL-2的三阳性细胞)的CD8+T细胞的群体或频率。因此，增加的CD8+T细胞应答可包括增加多功能性CD8+T细胞的亚群。
[0080] 增加的CD8+T细胞应答还可包括增加的细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)应答。增加的CTL应答可包括增加受试者中经受脱粒的CD8+T细胞的群体或频率。增加的CTL应答还可包括增加受试者中表达CD107a的CD8+T细胞的群体或频率。增加的CTL应答还可包括增加受试者中共表达CD107a、IFN-γ和TNF-α的CD8+T细胞的群体或频率。
[0081] 增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括受试者中CD8+T细胞的扩增和分化。所述扩增可发生在外周。另外，增加了受试者中的已形成记忆CD8+T细胞的回忆(recall)。因而，IL-33可通过扩增对抗原具有特异性的效应和效应记忆CD8+T细胞群来增加细胞免疫应答。扩增的效应和效应记忆CD8+T细胞群可具有增加的表达KLRG1的细胞的频率。
[0082] 增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括CD122+CD8+调节T细胞的遏制，例如通过防止这些细胞的扩增。CD122+CD8+调节T细胞可遏制由疫苗诱导的免疫应答，从而遏制疫苗的有效性。通过遏制CD122+CD8+调节T细胞，IL-33增加了对抗原的免疫应答，从而增加了疫苗提供的有效性(即保护)。
[0083] 增加或加强的对抗原的免疫应答还可包括针对与抗原相关的疾病的保护。在一些实施方案中，增加或加强的对抗原的免疫应答可包括针对与抗原相关的疾病的完全保护。在其他实施方案中，增加或加强的对抗原的免疫应答可包括针对与抗原相关的疾病至少约
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的存活率。
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100％的存活率。
[0084] (a)proIL-33
[0085] IL-33可以是proIL-33、其片段或其变体。proIL-33是全长或未裂解的IL-33。因此，proIL-33包括染色质结合结构域或基序(CBD)和核定位信号(NLS)两者。proIL-33可定位在核和细胞质两者中。具体地，proIL-33可大量定位在核中。
[0086] 如以上针对IL-33所描述的，proIL-33在增加免疫应答时不增加IgE的水平。与以下所述的mtrIL-33不同，proIL-33可增加受试者中对抗原具有特异性的免疫球蛋白G(IgG)的水平。proIL-33可使对抗原具有特异性的IgG的水平增加约1.5倍至约10.0倍、约2.0倍至约6.0倍，或约2.0倍至约4.0倍。proIL-33还可使对抗原具有特异性的IgG的水平增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。
[0087] 编码proIL-33的核酸可来自任何数量的生物体，例如，小鼠(小家鼠(Mus musculus))和人(智人(Homo sapiens))。可以关于密码子使用和对应RNA转录物对编码
proIL-33的核酸进行优化。可以针对表达对编码proIL-33的核酸进行密码子和RNA优化。在一些实施方案中，编码proIL-33的核酸可包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译的效率。编码proIL-33的核酸可包含多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止的效率。编码proIL-33的核酸还可包括编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可以位于proIL-33的5’。在一些实施方案中，编码proIL-33的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
proIL-33的核酸进行优化。可以针对表达对编码proIL-33的核酸进行密码子和RNA优化。在一些实施方案中，编码proIL-33的核酸可包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译的效率。编码proIL-33的核酸可包含多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止的效率。编码proIL-33的核酸还可包括编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可以位于proIL-33的5’。在一些实施方案中，编码proIL-33的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
[0088] 小鼠proIL-33可以是优化的核酸序列SEQ ID NO：5，其编码SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，小鼠proIL-33可以是在SEQ ID NO：5中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，小鼠proIL-33可以是编码在SEQ ID NO：6中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠proIL-33可以是在如SEQ ID NO：
6中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠proIL-33可以是在如SEQ ID NO：
6中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0089] 人proIL-33可以是优化的核酸序列SEQ ID NO：3，其编码SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，人proIL-33可以是在SEQ ID NO：3中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，人proIL-33可以是编码在如SEQ ID NO：4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人proIL-33可以是在如SEQ ID NO：4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，人proIL-33可以是编码在如SEQ ID NO：4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人proIL-33可以是在如SEQ ID NO：4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0090] 一些实施方案涉及SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
[0091] 可提供具有与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的proIL-33核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
[0092] 可提供SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：6的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
[0093] 可提供具有与SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：6的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：6具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的proIL-33蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的proIL-33蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
[0094] (b)mtrIL-33
[0095] IL-33可以是mtrIL-33、其片段或其变体。mtrIL-33是成熟或截短的IL-33并且缺少CBD和NLS。mtrIL-33定位在细胞溶质中。
[0096] 如以上针对IL-33所描述的，mtrIL-33可增加或加强免疫应答。如以上针对IL-33所描述的，mtrIL-33还可增加或加强受试者的对抗原的细胞免疫应答。
[0097] 编码mtrIL-33的核酸可来自任何数量的生物体，例如，小鼠(小家鼠)和人(智人)。可以关于密码子使用和对应RNA转录物对编码mtrIL-33的核酸进行优化。还可以针对表达对编码mtrIL-33的核酸进行密码子和RNA优化。在一些实施方案中，编码mtrIL-33的核酸可包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译的效率。编码mtrIL-33的核酸可包含多个终止密码子(例如，TGA TGA)以提高翻译终止的效率。编码mtrIL-33的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可以位于mtrIL-33的5’。在一些实施方案中，编码mtrIL-33的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
[0098] 小鼠mtrIL-33可以是优化的核酸序列SEQ ID NO：7，其编码SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，小鼠mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：7中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，小鼠mtrIL-33可以是编码在SEQ ID NO：8中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：8中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：8中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0099] 人mtrIL-33可以是优化的核酸序列SEQ ID NO：1，其编码SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，人mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：1中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，人mtrIL-33可以是编码在SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，人mtrIL-33可以是编码在SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人mtrIL-33可以是在SEQ ID NO：2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0100] 一些实施方案涉及SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：7的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。
在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
[0101] 可提供具有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：7的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：7具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
[0102] 可提供SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：8的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
[0103] 可提供具有与SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：8的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：8具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的mtrIL-33蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
[0104] b.抗原
[0105] 疫苗还可包含抗原或其片段或变体和如上所述的佐剂。抗原可以是在受试者中诱导免疫应答的任何物质。纯化的抗原通常其自身不是强免疫原性的，并且因此如上所述与佐剂组合。当与佐剂组合时可以加强或增加由抗原诱导的免疫应答。所述免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一些实施方案中，佐剂和抗原的组合可以加强或增加受试者的细胞免疫应答。
[0106] 抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
[0107] 抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的蛋白质、核酸，或其片段、其变体或其组合中。抗原可以与自身免疫疾病、过敏或哮喘相关。在其他实施方案中，抗原可以与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关。优选地，抗原可以与流感或HIV相关。
[0108] 一些抗原可以诱导强免疫应答。其他抗原可以诱导弱免疫应答。当如上所述与佐剂组合时，抗原可以引起更大的免疫应答。
[0109] (1)病毒抗原
[0110] 抗原可以是病毒抗原，或其片段或其变体。病毒抗原可以来自一种病毒，所述病毒来自以下家族之一：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、嵌杯病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。病毒抗原可以来自乳头瘤病毒，例如人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、甲型肝炎病毒、人T-细胞白血病病毒(HTLV-I)、多毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(Hanta
virus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(Ebola fever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(CMV)(例如，人CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunya virus)、拉沙病毒(lassa virus)、沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或致癌病毒。
virus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(Ebola fever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(CMV)(例如，人CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunya virus)、拉沙病毒(lassa virus)、沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或致癌病毒。
[0111] (a)肝炎抗原
[0112] IL-33可以与肝炎病毒抗原(即，肝炎抗原)或其片段或其变体联合或组合。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是编码来自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种抗原的异源核酸分子(如质粒)。肝炎抗原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。
[0113] 肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的共有序列中。共有肝炎抗原可包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽(如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。可以设计免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
[0114] 肝炎抗原可以是来自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。
[0115] 肝炎抗原可以是来自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。
[0116] 肝炎抗原可以是来自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其变体。
[0117] 肝炎抗原可以是来自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。
[0118] 肝炎抗原可以是来自HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。
[0119] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有核心蛋白序列。
[0120] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有核心蛋白序列。
[0121] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有核心蛋白序列。
[0122] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有核心蛋白序列。
[0123] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有核心蛋白序列。
[0124] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有核心蛋白序列。
[0125] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有核心蛋白序列。
[0126] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有核心蛋白序列。
[0127] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有表面蛋白序列。
[0128] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有表面蛋白序列。
[0129] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有表面蛋白序列。
[0130] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有表面蛋白序列。
[0131] 在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有表面蛋白序列。
[0132] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有表面蛋白序列。
[0133] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有表面蛋白序列。
[0134] 在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有表面蛋白序列。
[0135] (b)人乳头瘤病毒(HPV)抗原
[0136] IL-33可以与人乳头瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其变体联合或组合。HPV抗原可以来自引起宫颈癌、直肠癌和/或其他癌症的16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型和58型HPV。HPV抗原可以来自引起生殖器疣并且已知为头颈癌原因的6型和11型HPV。
[0137] HPV抗原可以是来自每种HPV类型的HPV E6或E7域。例如，对于16型HPV(HPV16)，HPV16抗原可以包括HPV16E6抗原、HPV16E7抗原、其片段、其变体或其组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 18E6和/或E7、HPV 31E6和/或E7、HPV 33E6和/或E7、HPV 52E6和/或E7或者HPV 58E6和/或E7、其片段、变体或组合。
[0138] (c)RSV抗原
[0139] IL-33还可以与RSV抗原或其片段或其变体联合或组合。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(本文中还称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间可以是保守的。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23994.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV A2链(GenBank
AAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV F氨基酸序列或其片段或变体。
AAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV F氨基酸序列或其片段或变体。
[0140] RSV F的融合后形式在经过免疫的动物中引起高滴度中和抗体，并且保护动物免于RSV激发。本发明在所要求的疫苗中利用这种免疫应答。根据本发明，RSV F蛋白可以呈融合前形式或融合后形式。
[0141] RSV抗原还可以是人RSV附着糖蛋白(本文中还称为“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSV G蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间有所不同。抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自以下的RSV G蛋白：B亚型RSV分离物H5601、B亚型RSV分离物H1068、B亚型RSV分离物H5598、B亚型RSV分离物H1123或其片段或变体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV G氨基酸序列或其片段或变体。
[0142] 在其他实施方案中，RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23988.1)的RSV NS2蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV核衣壳(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23989.1)的RSV N蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白(“M”)蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23991.1)的RSV M蛋白或其片段或变体。
[0143] 在其他实施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23992.1)的RSV SH蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23995.1)的RSV M2-1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23996.1)的RSV L蛋白或其片段或变体。
[0144] 在另外的实施方案中，RSV抗原可以具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化的氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重组抗原，如由人RSV基因组编码的蛋白质中的任一种。
[0145] 在其他实施方案中，RSV抗原可以是但不限于：来自RSV长链的RSV F蛋白、来自RSV长链的RSV G蛋白、优化的氨基酸RSV G氨基酸序列、RSV长链的人RSV基因组、优化的氨基酸RSV F氨基酸序列、来自RSV长链的RSV NS1蛋白、来自RSV长链的RSV NS2蛋白、来自RSV长链的RSV N蛋白、来自RSV长链的RSV P蛋白、来自RSV长链的RSV M蛋白、来自RSV长链的RSV SH蛋白、来自RSV长链的RSV M2-1蛋白、来自RSV长链的RSV M2-2蛋白、来自RSV长链的RSV L蛋白、来自B亚型RSV分离物H5601的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1068的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H5598的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1123的RSV G蛋白，或其片段或其变体。
[0146] (d)流感抗原
[0147] IL-33可以与流感抗原或其片段或其变体联合或组合。流感抗原是能够在哺乳动物中引起针对一种或多种流感血清型的免疫应答的那些流感抗原。抗原可以包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以是源自多种甲型流感血清型H1株的共有序列、源自多种甲型流感血清型H2株的共有序列、含有源自不同组的多种甲型流感血清型H1株的两个不同的共有序列的部分的杂交序列或源自多种
乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。
乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。
[0148] 流感抗原还可以含有至少一种抗原表位，所述抗原表位可以有效对抗特定流感免疫原，针对所述流感免疫原的免疫应答可以被诱导。抗原可以提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的全部谱系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1或血清型H2的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同组的一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自多种乙型流感病毒株。
[0149] 在一些实施方案中，流感抗原可以是H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含两个不同的共有H1序列的部分的合成杂交共有H1序列，所述两个不同的共有H1序列各自源自来自另一者的不同组的序列。为合成杂交共有H1蛋白的共有HA抗原的实例是包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自来自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。
[0150] 共有血凝素抗原可还包含一种或多种另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原还可在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原可进一步包含免疫原性标签，所述免疫原性标签是可以通过可容易获得的抗体进行检测的独特免疫原性表位。所述免疫原性标签的实例是可以连接在共有血凝素C末端上的9个氨基酸的流感HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原还可在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列并且在其C末端上包含HA标签。
[0151] 共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。
[0152] 共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列组成的那些共有H1蛋白或还包含另外元件(如IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者)的那些共有H1蛋白。
[0153] 共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列组成的那些共有H2蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些共有H2蛋白。
[0154] 杂交共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列组成的那些杂交共有H1蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些杂交共有H1蛋白。
[0155] 杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可以由共有BHA氨基酸序列组成的那些杂交共有乙型流感血凝素蛋白或它可包含IgE前导序列或HA标签，或IgE前导序列和HA标签二者。
[0156] 共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自来自不同株和变体的多种不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可以不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些编码序列。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻译区域中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。N末端前导子可以促进分泌。N末端前导子可以是IgE前导子或IgG前导子。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。
免疫原性标签可以位于蛋白质的C末端上并且编码它的序列是HA编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的C末端处的HA标签。
免疫原性标签可以位于蛋白质的C末端上并且编码它的序列是HA编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的C末端处的HA标签。
[0157] (e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原
[0158] IL-33可以与HIV抗原或其片段或其变体联合或组合。HIV抗原可以包括经过修饰的免疫原共有序列。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可包括在经过修饰的共有序列中。可以设计新型免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
[0159] 在一些实施方案中，HIV抗原可以是A亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至A亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或A亚型共有包膜蛋白序列。
[0160] 在其他实施方案中，HIV抗原可以是B亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型共有包膜蛋白序列。
[0161] 在其他实施方案中，HIV抗原可以是C亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至C亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或C亚型共有包膜蛋白序列。
[0162] 在另外的实施方案中，HIV抗原可以是D亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至D亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或D亚型共有包膜蛋白序列。
[0163] 在一些实施方案中，HIV抗原可以是B亚型Nef-Rev共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型Nef-Rev蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型Nef-Rev共有蛋白序列。
[0164] 在其他实施方案中，HIV抗原可以是A、B、C和D亚型DNA序列构建体的Gag共有DNA序列、连接至Gag共有A、B、C和D亚型蛋白的共有序列的IgE前导序列，或共有Gag A、B、C和D亚型蛋白序列。
[0165] 在其他实施方案中，HIV抗原可以是MPol DNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合的核酸或氨基酸序列。
[0166] (f)淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原
[0167] IL-33可以与LCMV抗原或其片段或其变体联合或组合。LCMV抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的序列中。LCMV抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽(例如，IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。可以设计免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
[0168] LCMV抗原可以是来自LCMV Armstrong的抗原。LCMV抗原可以是来自LCMV克隆13的抗原。LCMV抗原可以是来自LCMV的核蛋白(NP)、来自LCMV的糖蛋白(GP；例如，GP-1、GP-2和GP-C)、来自LCMV的L蛋白、来自LCMV的Z多肽、其片段、其变体或其组合。
[0169] (2)寄生虫抗原
[0170] 抗原可以是寄生虫抗原或其片段或变体。寄生虫可以是原生动物、蠕虫或外寄生物。蠕虫(即，肠虫(worm))可以是扁形虫(例如，吸虫和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。外寄生物可以是虱子、跳蚤、壁虱和螨虫。
[0171] 寄生虫可以是引起以下疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病(Amoebiasis)、蛔虫病、巴贝西虫病(Babesiosis)、小袋虫病、浣熊蛔虫病、恰加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇属病(Cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病
(Dracunculiasis)、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热(Katayama fever)、利什曼病
(Leishmaniasis)、莱姆病(Lyme disease)、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡症、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病以及鞭虫病。
(Dracunculiasis)、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热(Katayama fever)、利什曼病
(Leishmaniasis)、莱姆病(Lyme disease)、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡症、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病以及鞭虫病。
[0172] 寄生虫可以是棘阿米巴(Acanthamoeba)、异尖线虫、人蛔虫、肤蝇、结肠小袋虫、臭虫、多节绦虫亚纲(绦虫)、恙螨、螺旋蝇蛆、溶组织内阿米巴、肝片吸虫、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、钩虫、利什曼虫(Leishmania)、锯齿舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫(Loa loa)、并殖吸虫属-肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、刚地弓形虫、锥体虫、鞭虫或吴策线虫(Wuchereria bancrofti)。
[0173] (a)疟疾抗原
[0174] IL-33可以与疟疾抗原(即，PF抗原或PF免疫原)或其片段或其变体联合或组合。抗原可以来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(CS)抗原。
[0175] 在一些实施方案中，疟疾抗原可以是编码恶性疟原虫免疫原CS、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1中的一个或多个的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。
[0176] 在其他实施方案中，疟疾抗原可以是从GenBank数据库中的所有全长恶性疟原虫TRAP/SSP2序列(总共28个序列)设计的TRAP(也称为SSP2)的共有序列。共有TRAP免疫原
(即，ConTRAP免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
(即，ConTRAP免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
[0177] 在其他实施方案中，疟疾抗原可以是CelTOS，其也称为Ag2并且是高度保守的疟原虫抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
[0178] 在另外的实施方案中，疟疾抗原可以是Ama1，其为高度保守的疟原虫抗原。疟疾抗原还可以是Ama1(即，ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
[0179] 在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有CS抗原(即，共有CS免疫原)，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
[0180] 在其他实施方案中，疟疾抗原可以是包含本文所述的两种或更多种PF蛋白的组合的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含直接彼此相邻地连接或者间隔子以之间具有间隔子或一个或多个氨基酸连接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原中的两种或更多种。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个PF免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含三个PF免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含四个PF免疫原；并且在一些实施方案中，融合蛋白包含五个PF免疫原。具有两个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS和LSA1、CS和TRAP、CS和CelTOS、CS和Ama1、LSA1和TRAP、LSA1和CelTOS、LSA1和Ama1、TRAP和CelTOS、TRAP和Ama1；或者CelTOS和Ama1。具有三个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；
LSA1、TRAP和Ama1；或者TRAP、CelTOS和Ama1。具有四个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：
CS、LSA1、TRAP以及CelTOS；CS、LSA1、TRAP以及Ama1；CS、LSA1、CelTOS以及Ama1；CS、TRAP、CelTOS以及Ama1；或者LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。具有五个共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。
LSA1、TRAP和Ama1；或者TRAP、CelTOS和Ama1。具有四个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：
CS、LSA1、TRAP以及CelTOS；CS、LSA1、TRAP以及Ama1；CS、LSA1、CelTOS以及Ama1；CS、TRAP、CelTOS以及Ama1；或者LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。具有五个共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。
[0181] 在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至N末端的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的PF免疫原之间的间隔子可以是蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可以是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间，其中间隔子是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点，并且融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽，以使得在裂解时，每个共有PF免疫原的信号肽使共有PF免疫原转移至细胞外。
[0182] (3)细菌抗原
[0183] 抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、拟杆菌门、Caldiserica门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、Elusimicrobia门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门以及疣微菌门。
[0184] 细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自氧细菌或异氧细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
[0185] 细菌可以是炭疽细菌、耐抗生素细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)或者艰难梭菌(Clostridium difficile)。细菌可以是结核分支杆菌。
[0186] (a)结核分支杆菌抗原
[0187] IL-33可以与结核分支杆菌抗原(即，TB抗原或TB免疫原)或其片段或其变体联合或组合。TB抗原可以来自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可以来自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV以及EsxW。
[0188] 在一些实施方案中，TB抗原可以是编码来自Ag85家族和Esx家族的一种或多种结核分支杆菌免疫原的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。共有免疫原可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
[0189] (4)真菌抗原
[0190] 抗原可以是真菌抗原或其片段或变体。真菌可以是曲霉菌属(Aspergillus species)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母(Candida yeast)(例如，白色念珠菌(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、皮肤真菌(dermatophyte)、镰刀菌属(Fusarium species)、英膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉菌亚门
(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、明脐菌属(Exserohilum)或者枝孢菌属(Cladosporium)。
(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、明脐菌属(Exserohilum)或者枝孢菌属(Cladosporium)。
[0191] c.载体
[0192] 疫苗可包含一种或多种载体，所述载体包含编码抗原和佐剂的核酸。一种或多种载体可以能够表达抗原和佐剂。一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列用作增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。
[0193] 载体可具有表达信号(诸如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。
[0194] (1)表达载体
[0195] 载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，这些核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。
[0196] (2)环状载体和线性载体
[0197] 载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
[0198] 载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原或佐剂的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。
[0199] 本文还提供能够经由电穿孔有效地递送至受试者并且表达一种或多种所需的抗原或者一种或多种所需的佐剂的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原或者一种或多种佐剂。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原或佐剂的表达可由启动子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不包含与所需的抗原基因表达或所需的佐剂表达不相关的其他核酸序列。
[0200] LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原或佐剂。质粒可能够表达佐剂IL-33。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或者能够表达编码抗原或编码佐剂的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。
[0201] LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
[0202] (3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
[0203] 载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，所述顺式作用序列元件转录本文所描述的抗原序列或佐剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不损失启动子功能。
[0204] 启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以可操作地连接至编码佐剂和转录物的高效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。
[0205] 启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。
[0206] 载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。
[0207] d.赋形剂和疫苗的其他组分
[0208] 疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、除IL-33之外的佐剂、载体或稀释剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。
[0209] 所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。DNA质粒疫苗还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染剂在所述疫苗中的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
[0210] 药学上可接受的赋形剂可以是除IL-33之外的佐剂。另外的佐剂可以是在替代性质粒中表达的或在疫苗中作为蛋白质与以上质粒组合递送的其他基因。佐剂可选自由以下各项组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-
28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
[0211] 除IL-33之外可以用作佐剂的其他基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
[0212] 疫苗还可包含如1994年4月1日提交的美国序列号021，579中所描述的基因疫苗促进剂，所述专利文献以引用的方式全部并入。
[0213] 可以根据待使用的施用方式来配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定剂可允许制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段，所述稳定剂包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
[0214] 3.疫苗接种的方法
[0215] 本发明还涉及一种增加受试者的免疫应答的方法。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者的疾病，例如，如以下更详细描述的癌症。方法可包括向受试者施用本文所公开的疫苗。与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者具有增加或加强的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答可以增加约75％至约200％。或者，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加约90％至约130％。在其他可替代实施方案中，施用疫苗的受试者的免疫应答可增加约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、
104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％，112％、113％、114％、115％、
116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、
128％、129％或130％。
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、
104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％，112％、113％、114％、115％、
116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、
128％、129％或130％。
[0216] 在其他实施方案中，施用疫苗的受试者的免疫应答可增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。
[0217] 疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0218] a.癌症的治疗和预防
[0219] 与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者可具有增加或加强的免疫应答。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者的疾病。疾病可以是癌症，例如，HPV相关癌症、HBV相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、喉癌、肺癌、肝癌(liver cancer)、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移性癌症、hTERT相关癌症、FAP抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌(gastric cancer)、肛门癌、滑膜肉瘤(synovial carcinoma)、晕丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、成胶质细胞瘤、肝肿瘤(hepatocarcinoma)、胃癌(stomach cancer)、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌、以及原发性皮肤T细胞淋巴瘤。癌症可以是HPV相关癌症。
[0220] 所述方法还可包括减小受试者的已形成肿瘤或病变的大小。可使肿瘤的大小减小约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约90％至约
95％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％，或约80％至约90％。可使肿瘤的大小减小约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约
89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
95％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％，或约80％至约90％。可使肿瘤的大小减小约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约
89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
[0221] 所述方法还可包括与仅施用抗原的受试者相比增加受试者的肿瘤消退。施用疫苗可使肿瘤消退增加约40％至约60％、约45％至约55％，或约50％。施用疫苗还可增加肿瘤消退的速率。施用疫苗可进一步使受试者的肿瘤消退达到约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约80％至约90％，或约85％至约90％。施用疫苗的受试者的肿瘤消退可为约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约100％。施用疫苗的受试者的肿瘤消退还可以是约90％或约100％。
[0222] 所述方法还可包括预防施用疫苗的受试者的癌症或肿瘤生长。所述预防可使得施用疫苗的受试者在将来的癌症中存活下来。换句话讲，疫苗向施用疫苗的受试者提供针对癌症的保护。施用疫苗的受试者可具有约90％至约100％的癌症存活率。施用疫苗的受试者可具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或约100％的癌症存活率。
[0223] b.施用
[0224] 可以根据制药领域中的技术人员所熟知的标准技术来配制疫苗。所述组合物可以由医学领域的技术人员在考虑了如具体受试者的年龄、性别、体重和病状以及施用途径的这类因素之后，按其熟知的剂量和技术进行施用。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
[0225] 可以预防性地或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。足以达到此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于(例如)所施用的疫苗方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。
[0226] 可以通过如文献中所描述的本领域熟知的方法来施用疫苗，所述文献如下：Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15：617-648(1997))；Felgner等(美国专利号5,580,859，
1996年12月3日发布)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日发布)；以及Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日发布)，所有所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用疫苗枪将疫苗的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。
本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取
决于(例如)表达载体的施用途径。
1996年12月3日发布)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日发布)；以及Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日发布)，所有所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用疫苗枪将疫苗的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。
本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取
决于(例如)表达载体的施用途径。
[0227] 可以经由多种途径来递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于疫苗的DNA来说，可以将疫苗递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。还可以将疫苗施用至肌肉，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。
[0228] 还可以配制疫苗，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含疫苗的水性溶液或油性溶液。
[0229] 疫苗可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。
[0230] 疫苗可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(Felgner等，美国专利号5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology，第I卷至第III卷(第二版，1993)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。
[0231] 可以经由电穿孔，(如)通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用疫苗，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,
493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。
493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。
[0232] 微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的疫苗和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。
[0233] MID可在不使用针的情况下将疫苗注射至组织中。MID可将疫苗作为小的流或射流以使得疫苗穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7,171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6,009,347、美国专利号6,
120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
[0234] MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。本文可以使用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783、4,447,223、5,
505,697和4,342,310中所描述的那些，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
505,697和4,342,310中所描述的那些，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
[0235] 可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的疫苗引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致疫苗渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下
层组织和肌肉中的力进行喷射。
层组织和肌肉中的力进行喷射。
[0236] 无针注射器非常适合于将疫苗递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有疫苗的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰
腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
[0237] MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。例如，在标题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开的是针阵列，其中多对针可在治疗性治疗过程中进行脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。
[0238] MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与
0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开
0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开
0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
[0239] MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的两个或更多个针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
[0240] MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
[0241] MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的疫苗)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。
[0242] 此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。
[0243] 应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。
[0244] 可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。
[0245] 装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。
[0246] 用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。
[0247] 感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。还可根据需要记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。
[0248] 装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。
[0249] 如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。活塞驱动部件可例如由伺服电机启动。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的的封闭容器来代替注射管和活塞系统。
[0250] 以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。传统上电穿孔存在很难准确地将电极与之前注射的流体对准的问题，并且因此用户倾向于在较大的面积上注射大于所要求的体积的流体，并且在较高的面积上施加电场，以试图确保所注射的物质与电场之间的重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。
[0251] 本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。
[0252] 4.实施例
[0253] 实施例1
[0254] 用于实施例2-10的材料和方法
[0255] 质粒构建。使用小鼠IL-33的GenBank序列NM_001164724.1合成全长(proIL-33)和成熟IL-33(mtrIL-33)(氨基酸109-266)质粒DNA构建体(小鼠proIL-33构建体和小鼠mtrIL-33构建体的示意性说明参见图1A)。还使用人IL-33的序列合成全长(proIL-33)和成熟(mtrIL-33)(氨基酸112-270)质粒DNA构建体(人proIL-33构建体和人mtrIL-33构建体的示意性说明参见图10)。每种构建体具有插入在基因5’端的高效免疫球蛋白E(IgE)前导序列。通过商业途径合成和优化每种构建体。优化的核酸序列SEQ ID NO：5编码小鼠proIL-33(SEQ ID NO：6)。优化的核酸序列SEQ ID NO：7编码小鼠mtrIL-33(SEQ ID NO：8)。优化的核酸序列SEQ ID NO：1编码人mtrIL-33(SEQ ID NO：2)。优化的核酸序列SEQ ID NO：3编码人proIL-33(SEQ ID NO：4)。在这四个构建体的每一个中，前十八个氨基酸(即残基1-18)是IgE前导序列。还制备了表达HPV 16ConE6E7和GP33构建体的质粒。
[0256] 质粒的转染和表达。通过蛋白质印迹和免疫荧光验证proIL-33和mtrIL-33构建体表达。对人横纹肌肉瘤(RD)细胞系进行培养、转染和收获。简而言之，将RD细胞在6孔板中培养并且使用LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)根据制造商方案用构建体(pVAX作为对照)转染。四十八小时后，使用改进的RIPA细胞裂解缓冲液使细胞裂解并且收集细胞裂解液。使用抗IL33单克隆抗体(R&D Systems)进行蛋白质印迹分析并且使用ECL蛋白质印迹分析系
统(GE Amersham)利用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗大鼠IgG(Cell Signaling)进行可视化。此外，还在转染后48小时收集上清液并且通过小鼠/大鼠IL-33Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)根据制造商方案考查细胞因子分泌。
统(GE Amersham)利用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗大鼠IgG(Cell Signaling)进行可视化。此外，还在转染后48小时收集上清液并且通过小鼠/大鼠IL-33Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)根据制造商方案考查细胞因子分泌。
[0257] 此外，还利用间接免疫荧光测定来验证proIL-33和mtrIL-33的表达。简而言之，将RD细胞涂布于双孔室载玻片(BD Biosciences)上并且使其在具有5％CO2的37摄氏度孵育器中生长过夜至70％汇合度。使用TURBOFECTION 8.0转染试剂(OriGene)根据制造商的说明书用1μg的IL-33构建体和对照质粒pGX0001(1ug/孔)转染细胞。四十八小时后，使用冰冷的甲醇将细胞在载玻片上固定10min。将细胞用抗IL-33小鼠单克隆抗体(R&D Systems，
Minneapolis，MN)染色并且随后与Alexa 555缀合的抗大鼠二级抗体(Cell Signaling)一起孵育。通过荧光显微镜法(Leica DM4000B，Leica Mcirosystems Inc，USA)分析图像并且使用SPOT高级软件程序(SPOT Diagnostic Instruments，Inc)进行定量。
Minneapolis，MN)染色并且随后与Alexa 555缀合的抗大鼠二级抗体(Cell Signaling)一起孵育。通过荧光显微镜法(Leica DM4000B，Leica Mcirosystems Inc，USA)分析图像并且使用SPOT高级软件程序(SPOT Diagnostic Instruments，Inc)进行定量。
[0258] 动物。雌性8周龄C57BL/6(B6)小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME，USA)。携带DbGP33特异性T细胞受体的P14小鼠获自宾夕法尼亚大学(John Wherry博士的实验室)。为了产生“P14嵌合体”小鼠，将1.6x 105初始 T细胞受体转基因T细胞过继转移到初
次实验 的B6小鼠中。
次实验 的B6小鼠中。
[0259] 小鼠的免疫和电穿孔。以三周为间隔，在胫骨前肌中对小鼠免疫三次。疫苗接种后立即使用CELLECTRA自适应恒定电流EP装置(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)在相同部位进行体内电穿孔(EP)。使用5μg pVAX1或者单独的5μg ConE6E7或伴有不同量的proIL-33和mtrIL-33构建体(取决于实验(例如5μg和7μg))对小鼠(n＝4)进行免疫。以5μg施用GP33构建体。
[0260] ELISpot测定。首先，最后一次免疫后8天收获脾脏。将脾脏收获并对其进行处理之后，进行IFN-γ和IL-4ELISpot测定以确定来自免疫小鼠的抗原特异性细胞因子分泌。由GenScript合成表示HPV16的整个共有E6/E7融合蛋白序列的一组肽(重叠8个氨基酸的15个氨基酸残基)。将这组肽汇集成跨越E6和E7抗原的长度的两个库。使用5μg/ml的伴刀豆球蛋白A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作为阳性对照并且使用完全培养基作为阴性对照。使用自动ELISPOT读取器(Cellular Technology，Shaker Heights，OH)对斑点计数。
[0261] 用于流式细胞术的细胞内细胞因子染色。从脾脏和外周血中分离淋巴细胞。使用与LCMV-GP33的主要组织相容性复合体I类肽四聚体。具体地，将脾细胞加入96孔板(1x 105/孔)中并且在37℃/5％CO2下在蛋白质转运抑制剂混合液(布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和莫能菌素(Monensin))(ebioscience)的存在下根据制造商的说明书用汇集的HPV-
16E6/E7汇集肽刺激所述脾细胞，持续5-6小时。使用细胞刺激混合液(加上蛋白质转运抑制剂)(佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(PMA)、离子霉素、布雷菲德菌素A和莫能菌素)
(ebioscience)作为阳性对照并且使用R10培养基作为阴性对照。在用于测量脱粒的培养物中，此时加入抗CD107a(FITC；克隆1D4B；Biolegend)以增强染色。
16E6/E7汇集肽刺激所述脾细胞，持续5-6小时。使用细胞刺激混合液(加上蛋白质转运抑制剂)(佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(PMA)、离子霉素、布雷菲德菌素A和莫能菌素)
(ebioscience)作为阳性对照并且使用R10培养基作为阴性对照。在用于测量脱粒的培养物中，此时加入抗CD107a(FITC；克隆1D4B；Biolegend)以增强染色。
[0262] 然后对所有细胞的表面和细胞内蛋白进行染色。简而言之，在用荧光染料(flourochrome)缀合的抗体对表面进行染色之前，将细胞在FACS缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和1％FCS的PBS)中洗涤。用FACS缓冲液洗涤细胞，使用BD CYTOFIX/CYTOPERM(BD，San Diego，CA，USA)根据制造商方案进行固定和透化，然后进行细胞内染色。
[0263] 以下抗体用于表面染色：LIVE/DEAD可固定紫色死细胞染色试剂盒(Invitrogen)、CD19(V50；克隆1D3；BD Biosciences)、CD4(V500；克隆RM4-5；BD Biosciences)、CD8(PE-TexasRed；克隆53-6.7；Abcam)、CD44(A700；克隆IM7；Biolegend)、KLRG1(FITC；克隆2F1；eBioscience)、以及PD-1(PeCy7；克隆RMP1-30；Biolegend)。使用与LCMV-GP33的主要组织相容性复合体I类肽四聚体。对于细胞内染色，使用以下抗体：IFN-γ(APC；克隆XMG1.2；
Biolegend)、TNF-α(PE；克隆MP6-XT22；ebioscience)，以及CD3(PerCP/Cy5.5；克隆145-
2C11；Biolegend)。
Biolegend)、TNF-α(PE；克隆MP6-XT22；ebioscience)，以及CD3(PerCP/Cy5.5；克隆145-
2C11；Biolegend)。
[0264] 使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)收集所有数据并且使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)和SPICE 5.2版(可购自美国国立卫生研究院(National
Institutes of Health)(NIH)，具体地，国家过敏和传染性疾病研究所(National
Institutes of Allergy and Infectious Disease)(NIAID))进行分析。使用FlowJo软件进行Boolean门控以考查来自接种动物的T细胞的多功能性。通过在LIVE/DEAD可固定的紫色死细胞染色试剂盒(invtirogen)上相对于前向散射(FSC-A)进行门控来移除死细胞。
Institutes of Health)(NIH)，具体地，国家过敏和传染性疾病研究所(National
Institutes of Allergy and Infectious Disease)(NIAID))进行分析。使用FlowJo软件进行Boolean门控以考查来自接种动物的T细胞的多功能性。通过在LIVE/DEAD可固定的紫色死细胞染色试剂盒(invtirogen)上相对于前向散射(FSC-A)进行门控来移除死细胞。
[0265] Ag特异性抗体测定。通过免疫和对照小鼠的ELISA(酶联免疫吸附测定)进行对病毒基因E6和E7具有特异性的IgG抗体的测量。用1μg/ml的每种蛋白质(ProteinX Lab)涂布板并且在4摄氏度下孵育过夜。洗涤之后，将板在室温下用在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的
10％胎牛血清(FBS)封闭1小时。然后再次洗涤板并且加入在1％FBS+PBS+0.05％Tween-20中的1∶25稀释度的血清并且在室温下孵育1小时。再次洗涤之后，向每个孔中加入1∶5000稀释度的山羊抗小鼠IgG HRP(Santa Cruz)并且在室温下孵育1小时。最终洗涤之后，使用底物3，3′，5，5-′四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)使反应显色并且使用100μL的2N硫酸/孔终止反应。在Glomax多检测系统(Glomax Multi-Detection System)(Promega)上在450nm下读取板。所有血清样品进行两次重复测试。
10％胎牛血清(FBS)封闭1小时。然后再次洗涤板并且加入在1％FBS+PBS+0.05％Tween-20中的1∶25稀释度的血清并且在室温下孵育1小时。再次洗涤之后，向每个孔中加入1∶5000稀释度的山羊抗小鼠IgG HRP(Santa Cruz)并且在室温下孵育1小时。最终洗涤之后，使用底物3，3′，5，5-′四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)使反应显色并且使用100μL的2N硫酸/孔终止反应。在Glomax多检测系统(Glomax Multi-Detection System)(Promega)上在450nm下读取板。所有血清样品进行两次重复测试。
[0266] 还使用二级大鼠抗小鼠IgE HRP抗体(Southern Biotech)使用类似的ELISA方案测定抗原特异性IgE的量。使用GenWay的小鼠IgE试剂盒测定总IgE。按照制造商方案使用了
1∶50的血清稀释液。所有血清样品进行两次重复测试。
1∶50的血清稀释液。所有血清样品进行两次重复测试。
[0267] 肿瘤细胞系。TC-1细胞系组成型地表达E6和E7并且具有高度致肿瘤性。在皮下(s.c.)肿瘤植入之前，培养、制备TC-1细胞并将其与基质胶(BD Bioscience)混合。
[0268] 体内肿瘤治疗(消退)研究。将雌性B6小鼠分成各自10只小鼠的四组，并且将5x 104TC-1细胞s.c.植入到每个野生型雌性B6小鼠的侧腹中。在第4天(肿瘤植入之后并且当肿瘤达到3mm时)，分别用pVAX、ConE6E7、ConE6E7proIL-33和ConE6E7mtrIL-33通过电穿孔对每组小鼠进行肌内免疫(i.m./EP；以上所述的)，并且在第11天和第18天加强。通过肿瘤的测量每周两次监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤直径达到20mm时，将动物处死。
[0269] 统计分析。运用学生t检验来比较细胞免疫应答和肿瘤直径的定量数据。在此研究中，p＜0.05认为是统计学上显著的。
[0270] 实施例2
[0271] IL-33同种型的构建和表达
[0272] 为了考查IL-33是否可用作DNA疫苗接种中的佐剂，设计并产生了proIL-33和mtrIL-33构建体，如图1A中所示和以上所描述。每种构建体均处于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下并且含有IgE前导序列。
[0273] 为了测定proIL-33和mtrIL-33形式的表达，用每种构建体单独转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞。用表达载体pVAX转染的RD细胞充当阴性对照。转染之后48小时(h)收获细胞裂解液。使用抗IL-33单克隆抗体(mAb)通过蛋白质免疫印迹在相应的细胞裂解液中检测proIL-33和mtrIL-33的表达。在对应于阴性pVAX对照的泳道中没有检测到IL-33蛋白(图1B)。在对应于mrtIL-33的泳道中，观察到预期的条带大小(约20千道尔顿(kDA))。在对应于proIL-33的泳道中，观察到较大的条带(约30kDA)和较小的条带(约20kDA)并且所述条带分别对应于proIL-33和mtrIL-33的预期大小。因此，这些数据表明从构建体中表达了proIL-33和
mtrIL-33。
mtrIL-33。
[0274] 为了考查proIL-33和mtrIL-33形式的分泌，在RD细胞转染后48h获得细胞上清液。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分泌到细胞外环境中的蛋白质的检测。如图1C中所示，来自mtrIL-33和proIL-33转染的RD细胞的上清液分别含有浓度为大约20,000pg/ml和
600pg/ml的mtrIL-33和proIL-33。来自用表达载体pVAX转染的RD细胞的细胞上清液充当阴性对照并且从这些相同的细胞中没有分泌IL-33。图1C中所示的数据为两个重复测定的平均值和平均值标准误(SEM)。
600pg/ml的mtrIL-33和proIL-33。来自用表达载体pVAX转染的RD细胞的细胞上清液充当阴性对照并且从这些相同的细胞中没有分泌IL-33。图1C中所示的数据为两个重复测定的平均值和平均值标准误(SEM)。
[0275] 使用免疫荧光染色进一步验证proIL-33和mtrIL-33的表达。一级抗体是抗IL-33小鼠mAb并且二级抗体是Alexa 555-缀合的抗大鼠抗体。使用DAPI对核染色。在用proIL-33构建体瞬时转染的RD细胞中，观察到proIL-33的高核表达和一些细胞质表达，表明proIL-
33主要定位在核中(图1D，底部的图)。在用mtrIL-33构建体瞬时转染的RD细胞中，仅观察到mtrIL-33的高细胞质表达，这表明mtrIL-33定位在细胞质中(图1D，中间的图)。用表达载体pVAX瞬时转染的RD细胞充当阴性对照并且在这些相同的细胞中没有检测到IL-33(图1D，上部的图)。这些染色数据反映出proIL-33与mtrIL-33之间的一个结构差异，即核定位信号存在于proIL-33中，而不存在于mtrIL-33中。
33主要定位在核中(图1D，底部的图)。在用mtrIL-33构建体瞬时转染的RD细胞中，仅观察到mtrIL-33的高细胞质表达，这表明mtrIL-33定位在细胞质中(图1D，中间的图)。用表达载体pVAX瞬时转染的RD细胞充当阴性对照并且在这些相同的细胞中没有检测到IL-33(图1D，上部的图)。这些染色数据反映出proIL-33与mtrIL-33之间的一个结构差异，即核定位信号存在于proIL-33中，而不存在于mtrIL-33中。
[0276] 实施例3
[0277] IL-33增强对DNA疫苗的细胞免疫应答
[0278] 如上所述，IL-33诱导并支持Th2免疫应答。Th2免疫应答包括细胞因子白介素-4(IL-4)的诱导。因此，进一步考查以上所述的proIL-33和mtrIL-33构建体以确定IL-33是否能增加对抗原(例如，基于共有区的融合HPV 16E6/E7(ConE6E7)抗原)的Th2免疫应答的诱导。还通过考查IFN-γ分泌来研究对ConE6E7的Th1免疫应答。具体地，将编码ConE6E7抗原的质粒(ConE6E7构建体)单独地或与proIL-33或mtrIL-33构建体组合地施用至小鼠。施用构建体之后进行电穿孔。
[0279] 图2A示出DNA疫苗免疫计划表。将5μg剂量的ConE6E7构建体单独地或与不同剂量(即5μg和7μg)的mtrIL-33或proIL-33构建体组合地肌内(i.m.)施用至C57BL/6(B6)小鼠(每组n＝4)。通过i.m.方式向第四组小鼠施用5μg剂量的pVAX。肌内施用构建体之后进行电穿孔。在第0周、第3周和第6周进行免疫。最后一次免疫后一周(即第7周)，将小鼠处死以收集脾脏。从脾脏中分离淋巴细胞并且使用定量ELISpot测定分析每组小鼠的免疫应答。
[0280] 使用ELISpot测定来确定响应于E6和E7肽库的刺激(以上实施例1中所述的)的抗原特异性IFN-γ或IL-4分泌细胞的数目。如图2B中所示，IL-33驱动Th1极化的免疫应答。通过HPV 16E6和E7特异性IFN-γ斑点形成单位(SFU)/百万个脾细胞的频率来显示Th1免疫应答的诱导。当与仅接种ConE6E7构建体的小鼠(约500SFU/百万个脾细胞)相比时，与编码
proIL-33或mtrIL-33的质粒共免疫在所有剂量(即5μg和7μg)下均诱导更高数目的E6和E7特异性IFN-γ分泌T细胞。7μg剂量的mtrIL-33或proIL-33分别使IFN-γELISpot强度增加总共4倍或3.5倍。
proIL-33或mtrIL-33的质粒共免疫在所有剂量(即5μg和7μg)下均诱导更高数目的E6和E7特异性IFN-γ分泌T细胞。7μg剂量的mtrIL-33或proIL-33分别使IFN-γELISpot强度增加总共4倍或3.5倍。
[0281] 如图2C中所示，proIL-33和mtrIL-33均不驱动IL-4的强分泌。通过HPV 16E6和E7特异性IL-4斑点形成单位(SFU)/百万个脾细胞的频率来显示Th2免疫应答的诱导。
[0282] 如以上所指出的，认为IL-33诱导并支持Th2免疫应答。相反，proIL-33和mtrIL-33作为佐剂均偏向Th1而不是Th2细胞因子相关的免疫应答。因此，这些数据是出人意料且让人吃惊的，因为对于DNA疫苗，IL-33(proIL-33和mtrIL-33形式)增加Th1的诱导(细胞免疫应答，如IFN-γ所证明的那样)，但是不增加Th2的诱导(体液免疫应答，如IL-4所证明的那样)。这些数据表明proIL-33和mtrIL-33均为诱导细胞免疫应答的有效佐剂。
[0283] 实施例4
[0284] IL-33增强HPV抗原特异性CD4+T细胞免疫
[0285] 如以上所展示，proIL-33和mtrIL-33均放大了由疫苗接种诱导的抗原(Ag)特异性IFN-γ免疫应答。通过表征由免疫应答产生的效应T细胞的表型和细胞因子分布来进一步考查此免疫应答。具体地，因为多功能的CD4+和CD8+T细胞免疫有利于HPV16感染细胞的消除，所以通过IFN-γ和TNF-α分泌来考查CD4+和CD8+(以下在实施例5中讨论)T细胞免疫。
[0286] 通过肌内(i.m.)注射伴有或不伴有7μg的mtrIL-33或proIL-335构建体的5μg剂量的ConE6E7构建体，然后进行电穿孔来免疫B6小鼠。通过i.m.方式向第四组小鼠施用5μg剂量的pVAX。肌内施用构建体之后进行电穿孔。在第0周、第3周和第6周进行免疫。最后一次免疫后一周(即第7周)，将小鼠处死以收集脾脏。因此，以3周为间隔进行免疫，并且最后一次免疫后一周收集脾细胞。用汇集的E6和E7肽刺激脾细胞以确定疫苗诱导的Ag特异性T细胞群响应于刺激而分泌IFN-γ和TNF-α的能力。刺激之后，在用针对IFN-γ和TNF-α的抗体细胞内染色之后使用流式细胞术分析脾细胞。用于分析对于IFN-γ和TNF-α细胞因子为阳性的CD4+T细胞的频率的门控策略在图3A中示出。
[0287] 图3B-3E示出来自对于IFN-γ、TNF-α或IFN-γ和TNF-α两者为阳性的CD4+T细胞的分析的数据。数据表示四只小鼠/组的平均值±SEM。**P＜0.01，*P＜0.05，与ConE6E7相比(学生t检验)。与阴性对照pVAX和单独的ConE6E7疫苗接种相比，ConE6E7与mtrIL-33或proIL-33的共施用引发更高频率的产生总IFN-γ(mtrIL-33：0.21％；proIL-33：0.25％)、总TNF-α(mtrIL-33：0.25％；proIL-33：0.39％)和双IFN-γ/TNF-α(mtrIL-33：0.12％；
+
proIL-33：0.15％)的HPV特异性CD4 T细胞(图3B-3D)。观察到仅产生IFN-γ和仅产生TNF-γ的Ag特异性CD4+T细胞的频率具有类似趋势(图3E)。在图3E中，柱状图示出了释放细胞因子IFN-γ和/或TNF-α的单阳性和双阳性CD4+T细胞的多功能亚群。单阳性CD4+T细胞是释放IFN-γ或TNF-α的那些细胞，而双阳性CD4+T细胞是释放IFN-γ和TNF-α两者的那些细胞。图
3E中的饼形图示出了对于Ag特异性刺激每种细胞因子亚群的相对比例。
+
proIL-33：0.15％)的HPV特异性CD4 T细胞(图3B-3D)。观察到仅产生IFN-γ和仅产生TNF-γ的Ag特异性CD4+T细胞的频率具有类似趋势(图3E)。在图3E中，柱状图示出了释放细胞因子IFN-γ和/或TNF-α的单阳性和双阳性CD4+T细胞的多功能亚群。单阳性CD4+T细胞是释放IFN-γ或TNF-α的那些细胞，而双阳性CD4+T细胞是释放IFN-γ和TNF-α两者的那些细胞。图
3E中的饼形图示出了对于Ag特异性刺激每种细胞因子亚群的相对比例。
[0288] 以上数据说明，当proIL-33或mtrIL-33为疫苗中的佐剂时，产生IFN-γ、TNF-α和双IFN-γ/TNF-α的CD4+T细胞的频率显著增加。分泌抗病毒细胞因子诸如IFN-γ和TNF-α的效应T细胞的高频率指示proIL-33和mtrIL-33增强疫苗效力的佐剂作用。这些数据进一步指示proIL-33和mtrIL-33充当有效佐剂(即通过诱导CD4+T细胞免疫以及IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌)的能力。
[0289] 实施例5
[0290] IL-33增强HPV抗原特异性CD8+T细胞免疫
[0291] 与CD4+T细胞免疫类似，多功能的CD8+T细胞免疫也有利于HPV16感染细胞的消除。因此，还针对CD8+T细胞考查了响应于疫苗接种的IFN-γ和TNF-α分泌。
[0292] 具体地，通过肌内(i.m.)注射伴有或不伴有7μg的mtrIL-33或proIL-335构建体的5μg剂量的ConE6E7构建体，然后进行电穿孔来免疫B6小鼠。通过i.m.方式向第四组小鼠施用5μg剂量的pVAX。肌内施用构建体之后进行电穿孔。在第0周、第3周和第6周进行免疫。最后一次免疫后一周(即第7周)，将小鼠处死以收集脾脏。因此，以3周为间隔进行免疫，并且最后一次免疫后一周收集脾细胞。用汇集的E6和E7肽刺激脾细胞以确定疫苗诱导的Ag特异性T细胞群响应于刺激而分泌IFN-γ和TNF-α的能力。刺激之后，在用针对IFN-γ和TNF-α的抗体细胞内染色之后使用流式细胞术分析脾细胞。用于分析对于IFN-γ和TNF-α细胞因子+
为阳性的CD8T细胞的频率的门控策略在图3A中示出。
为阳性的CD8T细胞的频率的门控策略在图3A中示出。
[0293] 图4A-D示出来自对于IFN-γ、TNF-α，或IFN-γ和TNF-α两者为阳性的CD8+T细胞的分析的数据。数据表示四只小鼠/组的平均值±SEM。*P＜0.05，与ConE6E7构建体相比(学生t检验)。与阴性对照pVAX和单独的ConE6E7疫苗接种相比，ConE6E7与mtrIL-33或proIL-33的共施用激发实质更高频率的产生总IFN-γ(mtrIL-33：3.68％；proIL-33：3.50％)、总TNF-α(mtrIL-33：3.11％；proIL-33：3.13％)和双IFN-γ/TNF-α(mtrIL-33：2.83％；proIL-33：2.75％)的HPV特异性CD8+T细胞(图4A-4C)。
[0294] 观察到仅分泌IFN-γ和仅分泌TNF-α的Ag特异性CD8+T细胞的频率具有相同趋势(图4D)。在图4D中，柱状图示出了释放细胞因子IFN-γ和/或TNF-α的单阳性和双阳性CD8+T细胞的多功能亚群。单阳性CD8+T细胞是释放IFN-γ或TNF-α的那些细胞，双阳性CD8+T细胞是释放IFN-γ和TNF-α两者的那些细胞。图4D中的饼形图示出对于Ag特异性刺激每种细胞因子亚群的相对比例。图4D中的点图表示四只小鼠并且示出用汇集的E6/E7肽刺激之后的双阳性CD8+T细胞。响应于E6E7刺激的效应CD8+T细胞亚群的比例顺序为对两种细胞因子即IFN-γ+/TNF-α+为双阳性的细胞最大，其次是仅分泌IFN-γ的细胞，其继而大于仅分泌TNFα+的细胞(图4D)。
[0295] 以上数据说明，当proIL-33或mtrIL-33为疫苗中的佐剂时，产生IFN-γ、TNF-α和双IFN-γ/TNF-α的CD8+T细胞的频率显著增加。与proIL-33和mtrIL-33的共施用产生类似量的产生IFN-γ、TNF-α和双IFN-γ/TNF-α的Ag特异性CD4+和CD8+T细胞，其中细胞因子产生+主要由CD8T细胞介导。分泌抗病毒细胞因子诸如IFN-γ和TNF-α的效应T细胞的高频率指示了IL-33增强疫苗效力的佐剂作用。这些数据进一步指示proIL-33和mtrIL-33充当有效佐剂(即通过诱导CD8+T细胞免疫以及IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌)的能力。
[0296] 实施例6
[0297] IL-33诱导细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)
[0298] 细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)还通过经受脱粒来提供保护性免疫。CD107a是脱粒的标记物。考查当IL-33为疫苗中的佐剂时是否诱导CD8+T细胞经受脱粒，以便更好地理解疫苗的细胞毒性潜力。
[0299] 通过肌内(i.m.)注射伴有或不伴有7μg的mtrIL-33或proIL-335构建体的5μg剂量的ConE6E7构建体，然后进行电穿孔来免疫B6小鼠。通过i.m.方式向第四组小鼠施用5μg剂量的pVAX。肌内施用构建体之后进行电穿孔。在第0周、第3周和第6周进行免疫。最后一次免疫后一周(即第7周)，将小鼠处死以收集脾脏。因此，以3周为间隔进行免疫，并且最后一次免疫后一周收集脾细胞。用汇集的E6和E7肽刺激脾细胞以确定疫苗诱导的Ag特异性T细胞群响应于刺激而分泌IFN-γ和TNF-α的能力。还考查了疫苗诱导的Ag特异性T细胞群响应于刺激而表达CD107a的能力。刺激之后，在用针对IFN-γ、TNF-α和CD107a的抗体细胞内染色之后使用流式细胞术分析脾细胞。用于分析对于IFN-γ、TNF-α和CD107a为阳性的CD8+T细胞的频率的门控策略在图3A中示出。
[0300] 图4E和4F分别示出如通过脱粒标记物CD107a测量的T细胞的抗原特异性溶细胞性脱粒和溶细胞性表型的细胞因子分布。数据表示四只小鼠/组的平均值±SEM。*P＜0.05，与ConE6E7构建体相比(学生t检验)。
[0301] 与仅接受ConE6E7构建体的小鼠相比，从接种作为佐剂的proIL-33或mtrIL-33的+
小鼠中分离的CD8 T细胞显示出更高频率的脱粒标记物CD107a(mtrIL-33：4.4％；proIL-
33：4.9％)(图4E)。很大比例的HPV特异性效应细胞是多功能性的，表达脱粒标记物CD107a并同时表达各种组合的IFN-γ和TNF-α(图4F)。包含proIL-33或mtrIL-33作为佐剂的疫苗引发实质更高频率的共表达CD107a/IFN-γ/TNF-α的效应CD8+T细胞(mtrIL-33：2.5％；
proIL-33：2.5％)。这些结果指示了proIL-33和mtrIL-33诱导功能性效应细胞毒性CTL的佐剂潜力，所述CTL具有指示细胞清除HPV16感染细胞的能力的表型。这些数据进一步指示
proIL-33和mtrIL-33充当有效佐剂(即通过诱导CD8+T细胞免疫以及IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌)的能力。
小鼠中分离的CD8 T细胞显示出更高频率的脱粒标记物CD107a(mtrIL-33：4.4％；proIL-
33：4.9％)(图4E)。很大比例的HPV特异性效应细胞是多功能性的，表达脱粒标记物CD107a并同时表达各种组合的IFN-γ和TNF-α(图4F)。包含proIL-33或mtrIL-33作为佐剂的疫苗引发实质更高频率的共表达CD107a/IFN-γ/TNF-α的效应CD8+T细胞(mtrIL-33：2.5％；
proIL-33：2.5％)。这些结果指示了proIL-33和mtrIL-33诱导功能性效应细胞毒性CTL的佐剂潜力，所述CTL具有指示细胞清除HPV16感染细胞的能力的表型。这些数据进一步指示
proIL-33和mtrIL-33充当有效佐剂(即通过诱导CD8+T细胞免疫以及IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌)的能力。
[0302] 总之，来自实施例4-6的数据说明HPV ConE6E7构建体与作为佐剂的mtrIL-33或proIL-33构建体的共免疫产生更强的HPV特异性细胞免疫。因此，包含proIL-33和mtrIL-33作为佐剂的疫苗显示出治疗潜力。
[0303] 实施例7
[0304] proIL-33诱导CD8+T细胞的扩增
[0305] 进一步考查了由在疫苗中包含proIL-33作为佐剂诱导的CD8+T细胞应答来确定+ b
proIL-33是否能诱导CD8T细胞的扩增。可使用P14(DGP33特异性T细胞受体(TCR))小鼠模
型追踪T细胞子集的群体，从而允许监测CD8+T细胞响应于疫苗接种的扩增。如下文所详述，对GP33/Ly5.1+特异性CD8+T细胞响应于用包含或不包含proIL-33作为佐剂的疫苗进行的
免疫而进行的扩增进行监测。
proIL-33是否能诱导CD8T细胞的扩增。可使用P14(DGP33特异性T细胞受体(TCR))小鼠模
型追踪T细胞子集的群体，从而允许监测CD8+T细胞响应于疫苗接种的扩增。如下文所详述，对GP33/Ly5.1+特异性CD8+T细胞响应于用包含或不包含proIL-33作为佐剂的疫苗进行的
免疫而进行的扩增进行监测。
[0306] 具体地，将约150,000个Ly5.1+初始P14TCR转基因CD8+T细胞转移到初次实验的野生型受体中以制备“P14嵌合体小鼠”。随后在第0天(初免)和第41天(加强)用单独的GP33P14或GP33与proIL-33构建体的组合接种P14嵌合体小鼠两次。在伴有或不伴有proIL-
33佐剂的初免和加强DNA疫苗接种过程中，监测血液中Ag特异性CD8+T细胞应答的频率(图
5A和图6)。具体地，图5A示出外周血单核细胞(PBMC)中的P14特异性CD8+T细胞上的Ly5.1表达的动力学。对于图5A，误差条表示四只小鼠/组的平均值±SEM，同时与单独的GP33相
比，***P＜0.001、**P＜0.01，并且*P＜0.05(学生t检验)。图6示出在第一次疫苗接种后第
14天、第21天和第31天以及第48天(第二次疫苗接种后第7天)接种小鼠血液中的GP33/
Ly5.1特异性CD8+T细胞的代表性荧光强度图。图6中的数字指示Ag特异性CD8+T细胞在总CD8+T细胞群内的百分比。
33佐剂的初免和加强DNA疫苗接种过程中，监测血液中Ag特异性CD8+T细胞应答的频率(图
5A和图6)。具体地，图5A示出外周血单核细胞(PBMC)中的P14特异性CD8+T细胞上的Ly5.1表达的动力学。对于图5A，误差条表示四只小鼠/组的平均值±SEM，同时与单独的GP33相
比，***P＜0.001、**P＜0.01，并且*P＜0.05(学生t检验)。图6示出在第一次疫苗接种后第
14天、第21天和第31天以及第48天(第二次疫苗接种后第7天)接种小鼠血液中的GP33/
Ly5.1特异性CD8+T细胞的代表性荧光强度图。图6中的数字指示Ag特异性CD8+T细胞在总CD8+T细胞群内的百分比。
[0307] 图5A和图6中的数据表明，与仅施用GP33构建体的小鼠相比，施用GP33和proIL-33构建体的小鼠的血液中具有显著增加的频率的P14CD8+Ly5.1+T细胞。与GP33免疫组相比，接种GP33和proIL-33构建体的小鼠中的Ly5.1+CD8+T细胞的这种显著增加的频率(约5倍)在约14dpv(疫苗接种后的天数)时达到峰值。具体地，在仅接种GP33的组在约21dpv时达到其峰值的7天之前，接种GP33和proIL-33的组的频率增加达到峰值。这些数据表明，在疫苗中包含proIL-33作为佐剂显著扩大了Ag特异性CD8+T细胞应答的强度。
[0308] 此外，同源加强后7天(初始疫苗接种后48天)，与接受仅有GP33的疫苗的小鼠相+ +
比，proIL-33免疫佐剂显著增加Ag特异性CD8T细胞的频率(图5A)。加强后Ag特异性CD8T细胞的频率的这种增加指示了已形成的记忆CD8+T细胞库的回忆。这些数据进一步表明，在疫苗中包含proIL-33作为佐剂不仅显著扩大初次疫苗接种后Ag特异性CD8+T细胞应答的强
度，而且显著增加了加强疫苗接种后的Ag特异性CD8+T细胞应答。因此，这些数据进一步说+
明了proIL-33通过以扩大效应和效应记忆Ag特异性CD8T细胞应答的方式显著增强Ag特异
性CD8+T细胞应答而用作疫苗中的佐剂的能力。
比，proIL-33免疫佐剂显著增加Ag特异性CD8T细胞的频率(图5A)。加强后Ag特异性CD8T细胞的频率的这种增加指示了已形成的记忆CD8+T细胞库的回忆。这些数据进一步表明，在疫苗中包含proIL-33作为佐剂不仅显著扩大初次疫苗接种后Ag特异性CD8+T细胞应答的强
度，而且显著增加了加强疫苗接种后的Ag特异性CD8+T细胞应答。因此，这些数据进一步说+
明了proIL-33通过以扩大效应和效应记忆Ag特异性CD8T细胞应答的方式显著增强Ag特异
性CD8+T细胞应答而用作疫苗中的佐剂的能力。
[0309] 实施例8
[0310] ProIL-33引发CD62L-KLRG1+效应记忆T细胞
[0311] 效应CD8+T细胞(例如，CD62L-KLRG1+效应记忆T细胞)提供保护性免疫和病原体控制，并且以上数据表明，作为佐剂，proIL-33响应于初次和加强疫苗接种而增加Ag特异性CD8+T细胞的频率。为了进一步确定包含proIL-33作为佐剂的疫苗的功效，关于CD62L-KLRG1+效应记忆T细胞应答考查了P14小鼠模型。
[0312] 具体地，可使用P14(DbGP33特异性T细胞受体(TCR))小鼠模型追踪T细胞子集的群体。将约150,000个Ly5.1+初始P14TCR转基因CD8+T细胞转移到初次实验的野生型受体中以制备“P14嵌合体小鼠”。随后在第0天(初免)和第41天(加强)用单独的GP33P14或GP33与proIL-33构建体的组合接种P14嵌合体小鼠两次。
[0313] 图5B示出在第一次疫苗接种后第14天、第21天、第31天以及第48天(第二次疫苗接种后第7天)来自免疫小鼠的效应记忆CD8+T细胞的分布。误差条表示四只小鼠/组的平均值±SEM，同时与单独的GP33相比，*P＜0.05(学生t检验)。
[0314] 具体地，从14dpv开始考查疫苗诱导的P14特异性CD8+T细胞群内的效应CD8+T细胞的表型。考查了以下细胞表面表达标记物：Ly5.1、CD62L和KLRG1(图5B)。如图5B中所示，与仅接种GP33的组相比，proIL-33佐剂组中CD62L-KLRG1+效应记忆细胞的百分比显著较高。+
虽然观察到Ag特异性CD8T细胞的频率在14dpv开始逐渐收缩(图5A)，但是两个接种组中的效应群体连续3周保持相同(图5B)。总之，这些数据表明由CD8+T细胞造成的KLRG1的高表达与重复的抗原刺激相关联。这些数据还指示了proIL-33增强正在进行的Ag持续暴露的能
力。
虽然观察到Ag特异性CD8T细胞的频率在14dpv开始逐渐收缩(图5A)，但是两个接种组中的效应群体连续3周保持相同(图5B)。总之，这些数据表明由CD8+T细胞造成的KLRG1的高表达与重复的抗原刺激相关联。这些数据还指示了proIL-33增强正在进行的Ag持续暴露的能
力。
[0315] 另外，在发生在初始免疫后48天的同源DNA加强之后，在两个组(即，单独GP33以及GP33和proIL-33)中，次级记忆细胞显示出KLRG1+T细胞群的大大扩增。与单独GP33的组相比，具有proIL-33佐剂的组中效应记忆应答保持显著较高(图5B)。总之，如此处在实施例7和8中所描述的图5A、图5B和图6的数据表明，proIL-33增加了Ag特异性CD8+T细胞的形成并且增强了效应记忆库的克隆扩增。这些数据进一步表明proIL-33为有效的佐剂。
[0316] 实施例9
[0317] proIL-33诱导IgG体液应答
[0318] 如实施例3中所述，proIL-33和mtrIL-33不诱导IL-4的分泌，所述分泌是Th2或体液免疫应答的一部分。因此，进一步考查了对包含proIL-33或mtrIL-33的疫苗的体液应答。
[0319] 用单独的ConE6E7构建体、ConE6E7构建体和mtrIL-33构建体，以及ConE6E7构建体和proIL-33构建体对相应组的小鼠(n＝4)进行免疫。作为阴性对照，用pVAX接种一组小鼠(n＝4)。具体地，疫苗接种包括构建体的肌内注射，然后进行电穿孔。在第0周、第3周和第6周进行免疫。最后一次免疫后一周，从每组小鼠收集血液。然后进行ELISA以测量对HPV E6和E7具有特异性的IgG和IgE抗体的水平。
[0320] 如图7A中所示，与其他免疫组相比，只有与proIL-33共免疫显著诱导了E7特异性总IgG。***P＜0.001，与单独的ConE6E7构建体相比(学生t检验)。E6特异性抗体没有被诱导或没有被检测到(数据未示出)。
[0321] 此外，IL-33与涉及IgE抗体的变应性应答相关。因此，通过ELISA测量血清中的E7特异性IgE和总IgE应答。如图7B和图7C中所示，与对照接种组相比，mtrIL-33和proIL-33不增强IgE的水平。IgE类别转换是由IL-4驱动的，因此，此增强的缺乏与图2C所示的和实施例3中所述的IL-4的低诱导一致。另外，DNA疫苗接种部位的仔细评价没有显示出可检测的变应性皮肤反应。这些结果表明，DNA疫苗接种环境中的IL-33佐剂作用不诱导Th2相关的应答。
[0322] 概括地说，抗原和proIL-33的组合增加了Ag特异性IgG体液应答，这表明了proIL-33作为有效佐剂增强Ag特异性细胞介导的免疫应答和体液免疫应答的作用。
[0323] 实施例10
[0324] IL-33诱导抗肿瘤免疫和已形成肿瘤的消退
[0325] 鉴于proIL-33和mtrIL-33均为引发明显的HPV Ag特异性的偏向Th1和CD8的T细胞免疫应答的有效佐剂的以上数据，使用体内肿瘤治疗研究来确定IL-33佐剂的治疗功效。具体地，体内肿瘤治疗研究考查了包含proIL-33或mtrIL-33作为佐剂的疫苗清除已形成的
HPV相关肿瘤或病变并且提供保护以免形成新的HPV相关肿瘤或病变的能力。
HPV相关肿瘤或病变并且提供保护以免形成新的HPV相关肿瘤或病变的能力。
[0326] 为了考查已形成肿瘤或病变的清除，将表达HPV16E6/E7的TC-1肿瘤(5x104)细胞植入初次实验的B6受体小鼠中。在TC-1细胞植入后四天，测量肿瘤(肿瘤已经达到3mm的平均大小)并且用pVAX(5μg)、单独的ConE6E7(5μg)，或与7μg的mtrIL-33或proIL-33共施用的ConE6E7(5μg)免疫多组小鼠(n＝10)，接着以一周为间隔进行两次加强，如图8A所概述。
pVAX免疫小鼠充当阴性对照。然后用电子卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤，并且数据表示为各个小鼠随时间推移的所述值的平均值。当肿瘤直径达到大约2.0cm时，将小鼠处死。
pVAX免疫小鼠充当阴性对照。然后用电子卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤，并且数据表示为各个小鼠随时间推移的所述值的平均值。当肿瘤直径达到大约2.0cm时，将小鼠处死。
[0327] 图8B示出随时间推移的平均肿瘤大小，以毫米(mm)计。仅示出存活小鼠的每个时间点的肿瘤测量。在初始肿瘤植入后第7天、第14天、第21天、第28天和第35天对多组小鼠进行成对比较，并且p值示于下表1中。在初始肿瘤植入后42天，在具有mtrIL-33佐剂的组中10只小鼠中的9只不含肿瘤，而ConE6E7-proIL-33接种小鼠(即，10只小鼠中的10只)诱导了已形成TC-1肿瘤的完全消退(图8B)。
[0328] 表1：图8B的p值
[0329]比较 p值
第7天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.05
第7天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.01
第7天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第7天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.05
第7天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第14天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.001
第14天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.001
第14天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第14天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第14天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.01
第21天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.001
第21天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.001
第21天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第21天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第21天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第28天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第28天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第35天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第35天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第7天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.05
第7天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.01
第7天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第7天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.05
第7天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第14天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.001
第14天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.001
第14天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第14天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第14天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.01
第21天：pVax相对于pConE6E7 p≤0.001
第21天：pVax相对于ConE6E7mtrIL-33 p≤0.001
第21天：pVax相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.001
第21天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第21天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第28天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第28天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
第35天：pConE6E7相对于ConE6E7mtrIL-33 p＝NS
第35天：pConE6E7相对于ConE6E7proIL-33 p≤0.05
[0330] NS是不显著。
[0331] 同时，pConE6E7接种组中仅六只小鼠在42天后不含肿瘤，并且到第21天对照组中的所有小鼠死亡。明显地，在第一次免疫后10天内，以mtrIL-33或proIL-33共免疫的ConE6E7接种动物开始显示出已形成肿瘤的消退，并且在第一次免疫后17天大多数不含肿瘤(图8B)。相反，仅用ConE6E7治疗的小鼠表现出较缓慢的肿瘤消退，并且到初始疫苗接种后17天时10只小鼠中仅有4只不含肿瘤。直到第42天，除了mtrIL-33佐剂组中的一只小鼠之外，IL-33组保持不含肿瘤。此外，proIL-33佐剂组到疫苗接种后17天时表现出完全的肿瘤消退，这与以上以及图5A和图6中所述的由proIL-33介导的CD8+T细胞扩增的峰值(疫苗接种后14天)相关联。这些数据表明，由佐剂mtrIL-33和proIL-33诱导的CD8+T细胞免疫有利于肿瘤消退。
[0332] 为了考查针对新肿瘤或病变的保护或预防，以三周为间隔用pVAX、单独的ConE6E7构建体、ConE6E7构建体和proIL-33构建体，以及ConE6E7构建体和mtrIL-33构建体对相应组的B6小鼠(10只小鼠/组)免疫三次。用pVAX进行的免疫充当阴性对照。mtrIL-33和proIL-33构建体的剂量是7μg。最后一次免疫后一周用5x104TC-1细胞激发小鼠以评估疫苗的抗肿瘤或预防功效。如图9所示，在植入时，疫苗防止了肿瘤生长，但是用pVAX免疫的小鼠(阴性对照)在植入后40天内死亡。与ConE6E7类似，proIL-33和mtrIL-33均保持并引发抗肿瘤记忆应答。
[0333] 这些数据表明，ConE6E7防止E6/E7肿瘤生长，但是不像mtrIL-33或proIL-33为疫苗中的佐剂时那样有效地导致肿瘤消退。作为疫苗中的佐剂，mtrIL-33和proIL-33防止肿瘤生长并且分别导致已形成肿瘤的90％消退和完全消退。虽然仅proIL-33诱导体液免疫(即，如上所述的IgG水平增加)，但是mtrIL-33和proIL-33均诱导(增加)CD4+T细胞免疫、CD8+T细胞免疫，以及溶细胞性效应CD8+T细胞经受脱粒。因此，这些数据一起表明，因为mtrIL-33和proIL-33均提供显著的肿瘤消退水平，所以抗肿瘤保护是由通过在疫苗中包含proIL-33和mtrIL-33作为佐剂而诱导的T细胞免疫提供的。概括地说，由proIL-33和mtrIL-
33佐剂诱导的HPV特异性T细胞免疫通过延迟和快速诱导已形成TC-1肿瘤的完全消退来提
供实质性的保护性抗肿瘤免疫。
33佐剂诱导的HPV特异性T细胞免疫通过延迟和快速诱导已形成TC-1肿瘤的完全消退来提
供实质性的保护性抗肿瘤免疫。
[0334] 实施例11
[0335] 用于实施例12-15的材料和方法
[0336] 构建体。编码成熟IL-33(mtrIL-33)的DNA构建体以上描述于实施例1中。DNA构建体还包括HIV(ConC)、LCMV-GP构建体和TB Ag85B构建体。所有构建体均具有插入在基因5’端的高效免疫球蛋白E(IgE)前导序列。合成并优化构建体。
[0337] 动物。雌性C57BL/6(H-2b)8周龄小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。
[0338] 动物免疫和抗CD122治疗。在胫骨前肌中肌内(i.m.)免疫小鼠一次。疫苗接种后立即使用CELLECTRA自适应恒定电流EP装置(Inovio Pharmaceuticals)在相同部位递送体内电穿孔(EP)。
[0339] 用10μg pVAX1或伴有或不伴有11μg mtrIL-33构建体的10μg pLCMV-NP免疫小鼠。初始免疫后三周，将小鼠处死并且收获脾细胞以测量免疫应答。
[0340] 以10μg施用LCMV-GP(GP)构建体。通过s.c.注射20μg的抗CD122单克隆抗体(mAb)(AbD Serotec)实现CD122+细胞的消耗。
[0341] 对于HIV和TB免疫，以两周为间隔用伴有或不伴有11μgmtrIL-33的10μg的各构建体(ConC、Ag85B)免疫小鼠三次。免疫后一周，将小鼠处死并且收获脾细胞以监测免疫应答。
[0342] 所有研究均重复至少两次。
[0343] LCMV病毒激发。对于致死激发研究，在初始疫苗接种后21天，用在30μl病毒稀释液(具有20％FBS和1X Anti-Anti(Invitrogen，Carlsbad，CA)的PB S)中的20xLD50或40xLD50的LCMV Armstrong以i.c方式激发免疫小鼠。将所有LCMV激发小鼠饲养于BSL-2设施中并且每天观察持续21天。
[0344] ELISPOT测定。对于接种DNA的小鼠，将所有脾脏进行处理，并且进行IFN-γ ELISpot测定以确定抗原特异性细胞因子分泌。将脾脏收集于RPMI 1640培养基(补充有
10％FBS、1X抗生素-抗霉菌素和1Xβ-ME)中并且使用Stomacher机(Seward Laboratory
Systems，Bohemia，NY)通过脾脏的机械破坏分离脾细胞。将所得的捣碎脾脏使用40μm细胞过滤器过滤，用ACK裂解缓冲液处理5分钟以裂解RBC，在PBS中洗涤，然后重悬于RPMI培养基中，以用于ELISpot或流式细胞术测定。
10％FBS、1X抗生素-抗霉菌素和1Xβ-ME)中并且使用Stomacher机(Seward Laboratory
Systems，Bohemia，NY)通过脾脏的机械破坏分离脾细胞。将所得的捣碎脾脏使用40μm细胞过滤器过滤，用ACK裂解缓冲液处理5分钟以裂解RBC，在PBS中洗涤，然后重悬于RPMI培养基中，以用于ELISpot或流式细胞术测定。
[0345] 通过用来自H-2b背景的免疫显性LCMV表位(DbNP396-404(NP396))或(DbGP33-41(GP33))(Invitrogen)刺激脾细胞来评估LCMV特异性T细胞应答的测量。通过使用汇集肽
(重叠9个氨基酸的15聚体；最终2.5μg/ml)测量HIV特异性T细胞应答。通过使用跨越整个TB Ag85B抗原的汇集肽(重叠8个氨基酸的11聚体；最终2.5μg/ml)测量Ag85B特异性T细胞应答。所有肽由GenScript合成。使用伴刀豆球蛋白A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作为阳性对照并且使用完全培养基作为阴性对照。使用自动ELISPOT读取器(Cellular Technology，Shaker Heights，OH)对斑点计数。
(重叠9个氨基酸的15聚体；最终2.5μg/ml)测量HIV特异性T细胞应答。通过使用跨越整个TB Ag85B抗原的汇集肽(重叠8个氨基酸的11聚体；最终2.5μg/ml)测量Ag85B特异性T细胞应答。所有肽由GenScript合成。使用伴刀豆球蛋白A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作为阳性对照并且使用完全培养基作为阴性对照。使用自动ELISPOT读取器(Cellular Technology，Shaker Heights，OH)对斑点计数。
[0346] 流式细胞术。将淋巴细胞从外周血中分离出来并对其进行处理。将细胞用CD8、CD44、CD62L、KLRG1、CD122以及与LCMV-GP33的MHC I类肽四聚体(KAVYNFATC(SEQ ID NO：
9))(Beckman Coulter)染色。用LCMV表位DbNP396-404或DbGP33-41肽、HIV汇集肽和Ag85B汇集肽(取决于研究)活体外刺激5小时(h)后进行细胞内细胞因子染色。
9))(Beckman Coulter)染色。用LCMV表位DbNP396-404或DbGP33-41肽、HIV汇集肽和Ag85B汇集肽(取决于研究)活体外刺激5小时(h)后进行细胞内细胞因子染色。
[0347] 以下抗体用于表面染色：LIVE/DEAD可固定紫色死细胞染色试剂盒(Invtirogen)、CD4(FITC；克隆RM4-5；ebioscience)、CD8(APC-Cy7；克隆53-6.7；BD Biosciences)、CD44(A700；克隆IM7；Biolegend)。对于细胞内染色，使用以下抗体：IFN-γ(APC；克隆XMG1.2；Biolegend)、TNF-α(PE；克隆MP6-XT22；ebioscience)、CD3(PerCP/Cy5.5；克隆145-2C 11；
Biolegend)、IL-2(PeCy7；克隆JES6-SH4；ebioscience)。
Biolegend)、IL-2(PeCy7；克隆JES6-SH4；ebioscience)。
[0348] 使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)收集所有数据并且使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)和SPICE 5.2版(可购自美国国立卫生研究院(NIH)，具体地，国家过敏和传染性疾病研究所(NIAID))进行分析。使用FlowJo软件进行Boolean门控以检查来自接种疫苗的动物的T细胞的多功能性。
[0349] T细胞增殖测定。将从初始免疫后21天的免疫B6小鼠中分离的脾细胞用Cell Tracer violet Violet(Molecular Probes)标记并且用10μM肽脉冲处理5天。使用流式细胞术测定CD8T细胞增殖以评估Cell Trace Violet稀释液。
[0350] 统计分析。通过匹配、双尾、非配对t检验完成组分析并且通过对数秩Mantel-Cox检验分析存活曲线。对于非均匀分布的样品，进行非参数Mann-Whitney检验(图12E和图12F)。所有值均为平均值±SEM并且通过GraphPad Prism(La Jolla，CA)进行统计分析。
[0351] 实施例12
[0352] IL-33引发对抗致死LCMV激发的保护
[0353] 如上所述，当在疫苗中施用时，IL-33诱导抗病毒和抗肿瘤CD8+T细胞应答，因此，IL-33在所述疫苗中充当佐剂。为了进一步研究由IL-33(当存在于疫苗中时)提供的保护，使用了LCMV感染模型(本文也称为“i.c.LCMV激发模型”)。LCMV感染模型是一种用于疫苗引+发的保护背景下的病毒特异性CD8 T细胞应答的模型。LCMV NP结构蛋白是保护性LCMV免疫的组分和靶标，因为其不是中和抗体的靶标。
[0354] 具体地，用10μg空载体对照质粒(pVAX)或者伴有或不伴有11μg成熟IL-33(mtrIL-33)构建体的10μg pLCMV-NP(NP)构建体通过电穿孔(EP)肌内(i.m.)接种三组C57BL/6小鼠(B6)(n＝10/组)一次。使用空载体pVAX作为阴性对照。
[0355] 接种后21天(dpv)用致死20xLD50剂量或致死40xLD50的LCMV Armstrong以i.c.方式激发所有动物(图11A)。激发后21天监测动物存活率。以独立实验的形式进行至少两次实验并且图11中所示的数据是代表性结果。
[0356] 用NP外加mtrIL-33接种的动物显示出完全保护，而单独NP组仅实现60％保护(图11B)。在图11B中，*＜0.05。相反，所有对照pVAX接种的动物死于感染。因此，这些数据说明，用使用mtrIL-33作为佐剂的疫苗免疫的小鼠对LCMV激发表现出100％存活率。
[0357] 完成另外的研究以确定已接受mtrIL-33佐剂的接种小鼠是否将提供对抗甚至更高致死剂量的LCMV激发的保护。因此，单次疫苗接种后21天，用40xLD50剂量的LCMV
Armstrong激发小鼠(图11C)。接受一次NP外加mtrIL-33的免疫的动物产生显著的80％的保护，而单独NP组在对抗所述高致死剂量的LCMV方面仅赋予10％的保护(图11C)。在图11C
中，**＜0.01。
Armstrong激发小鼠(图11C)。接受一次NP外加mtrIL-33的免疫的动物产生显著的80％的保护，而单独NP组在对抗所述高致死剂量的LCMV方面仅赋予10％的保护(图11C)。在图11C
中，**＜0.01。
[0358] 概括地说，以上数据说明，当包含在疫苗中时，IL-33引发对抗致死LCMV激发的保护。
[0359] 实施例13
[0360] IL-33增加LCMV特异性CD8+T细胞应答
[0361] 为了确定以上所述的对抗LCMV激发的保护是否由CD8+T细胞的诱导介导，通过ELISPOT测定考查了免疫小鼠中的抗原特异性T细胞应答。具体地，用伴有或不伴有11μg mtrIL-33的10μg核蛋白(NP)以i.m.方式对多组C57BL/6小鼠(n＝4-5)免疫一次，然后进行电穿孔。仅接受10μg pVAX的小鼠充当阴性对照。接种后21天收获脾细胞以评估细胞免疫应答。具体地，使用H-2b背景中的免疫显性表位：DbNP396-40(NP396)，测量疫苗接种后21天(dpv)响应于肽再刺激的NP特异性免疫应答的强度。这些实验的结果在图12中示出，如下文所详述。在图12中，数据示出为两个重复至少两至三次的独立实验的平均值的标准误(SEM)。在图12中，与NP相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01；并且***，P＜0.001。
[0362] 与仅接种NP的小鼠相比，与mtrIL-33编码质粒共免疫引发大于2.5倍的更强的NP特异性T细胞应答(图12A)。IFN-γ ELISPOT计数在IL-33接种小鼠中为约2,500斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞，相对于单独NP组的约980SFC/106个脾细胞。
[0363] 还评估了疫苗诱导的CD8+T细胞响应于NP396肽再刺激的表型和功能性分布。接种后二十一天，在疫苗组之间观察到产生效应细胞因子的CD8+T细胞的频率的显著差异(图12B和图12C)。与mtrIL-33的共施用的NP疫苗引发更高百分比的产生所有三种细胞因子
(即，干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-2(IL-2))的抗原(Ag)特异性+ +
CD8 T细胞(图12B)，并且大量的这些CD8T细胞是多功能性的(图12C)。与单独NP接种组相比，NP+mtrIL-33接种组在21dpv时在脾脏中引发实质更高频率的产生仅IFN-γ(NP，1.3％；
NP+mtrIL-33，2.3％)、双IFN-γ+TNF-α+(NP，0.76％；NP+mtrIL-33，1.63％)或三阳性IFN-γ+TNF-α+IL-2+(NP，0.20％；NP+mtrIL-33，0.43％)的NP特异性CD8+T细胞(图12C)。总而言+
之，由IL-33诱导的增强的Ag特异性CD8T细胞应答指示了IL-33提供对抗LCMV激发的实质
性保护的能力。
(即，干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-2(IL-2))的抗原(Ag)特异性+ +
CD8 T细胞(图12B)，并且大量的这些CD8T细胞是多功能性的(图12C)。与单独NP接种组相比，NP+mtrIL-33接种组在21dpv时在脾脏中引发实质更高频率的产生仅IFN-γ(NP，1.3％；
NP+mtrIL-33，2.3％)、双IFN-γ+TNF-α+(NP，0.76％；NP+mtrIL-33，1.63％)或三阳性IFN-γ+TNF-α+IL-2+(NP，0.20％；NP+mtrIL-33，0.43％)的NP特异性CD8+T细胞(图12C)。总而言+
之，由IL-33诱导的增强的Ag特异性CD8T细胞应答指示了IL-33提供对抗LCMV激发的实质
性保护的能力。
[0364] 在所述研究中还考查了疫苗诱导的CD8+T细胞的细胞毒性潜力。与仅接种NP的小鼠(IFN-γ+CD107a+：1.2％)相比，从接种mtrIL-33的小鼠中分离的CD8+T细胞显示出显著更+ +
高频率的抗原特异性(IFN-γCD107a：1.2％)脱粒(图12D)。
高频率的抗原特异性(IFN-γCD107a：1.2％)脱粒(图12D)。
[0365] 另外，通过在从21dpv的小鼠中分离并且用NP396肽再刺激体外再激发的脾细胞中监测Cell Trace Violet稀释液来评估CD8+T细胞的增殖能力。图12E显示，mtrIL-33接种小鼠经受显著更高的CD8+T细胞的Ag特异性增殖，比NP对照组大约2倍。在佐剂接种组中还存在效应记忆CD8+T细胞(CD44+CD62L-)的富集(图12F)。总的来说，mtrIL-33的包含引发较强水平的NP特异性T细胞免疫并且增强了增强的CD8+T细胞免疫应答。
[0366] 为了进一步考查疫苗接种过程中Ag特异性CD8+T细胞的诱导，对mtrIL-33扩增Ag特异性效应记忆CD8+T细胞群的能力进行研究。在所述研究中，采用DbGP33-41MHC I类四聚体追踪在初免后发育的Ag特异性CD8+T细胞。具体地，用伴有或不伴有mtrIL-33的10μgLCMV糖蛋白LCMV-GP(GP)DNA疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝4-8)一次。在疫苗接种过程中监测抗原特异性CD8T细胞群。具体地，在伴有或不伴有mtrIL-33的疫苗接种过程中监测外周血中
DbGP33特异性CD8+T细胞的频率(图14A)。在第21天，收获脾脏(n＝4)并且用GP33肽活体外监测抗原特异性应答。这些实验的结果在图13中示出，如下文所详述。在图13中，数据示出为两个重复至少两次的独立实验的SEM。在图13中，*，P＜0.05，**，P＜0.01。
DbGP33特异性CD8+T细胞的频率(图14A)。在第21天，收获脾脏(n＝4)并且用GP33肽活体外监测抗原特异性应答。这些实验的结果在图13中示出，如下文所详述。在图13中，数据示出为两个重复至少两次的独立实验的SEM。在图13中，*，P＜0.05，**，P＜0.01。
[0367] 在疫苗中包含mtrIL-33导致外周血中DbGP33四聚体特异性CD8+T细胞数目的扩增(图13A)。在图13A中，在活的CD9+CD44+T细胞上对细胞进行门控。在外周血淋巴细胞(PBL)中，与无佐剂组相比，GP33特异性CD8+T细胞的频率在18和21dpv时高2倍(图13A)。在疫苗中+
包含mtrIL-33还增加了21dpv时脾脏中的GP33特异性CD8 T细胞的数目(图13B)以及分泌
IFN-γ、经受脱粒和表达转录因子T-bet的Ag特异性CD8+T细胞的数目(图13C、图13D、图13E和图13F)。
包含mtrIL-33还增加了21dpv时脾脏中的GP33特异性CD8 T细胞的数目(图13B)以及分泌
IFN-γ、经受脱粒和表达转录因子T-bet的Ag特异性CD8+T细胞的数目(图13C、图13D、图13E和图13F)。
[0368] 另外，用单独的GP构建体对所有小鼠进行加强(初始免疫后21天)，以对Ag特异性+回忆应答进行定量。与对照组相比，mtrIL-33接种组显著增加Ag特异性CD8T细胞。与NP接种组相比，在mtrIL-33免疫组中，从加强疫苗接种后3天(第24天)开始，GP33四聚体特异性T细胞高约3倍(图13A)。在DNA加强后10天(第31天)仍观察到GP33特异性CD8+T细胞的扩增的所述显著差异。与图12一致，这些数据进一步证实了IL-33诱导Ag特异性CD8+T细胞的快速扩增和增殖的能力。因此，IL-33显著增加了对抗两种单独的病毒蛋白即NP和GP的LCMV特异性CD8+T细胞免疫。
[0369] 概括地说，以上数据说明，当mtrIL-33为疫苗中的佐剂时CD8+T细胞应答的频率显著增加。所述增加的CD8+T细胞应答是抗原特异性的并且导致细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生增加。另外，当mtrIL-33为疫苗中的佐剂时，观察到增大频率的多功能性CD8+T细胞(即，IFN-γ+TNF-α+和IFN-γ+TNF-α+IL-2+)。当mtrIL-33为疫苗中的佐剂时所述增加的CD8+T细胞应答还包括显著更高频率的抗原特异性脱粒。以上数据还说明，当mtrIL-33为疫苗中的佐剂时抗原特异性CD8+T细胞(包括效应记忆CD8+T细胞)的扩增增加。总之，这些数据还表明了mtrIL-33用作有效佐剂(即通过诱导CD8+T细胞免疫)的能力。
[0370] 实施例14
[0371] IL-33驱动效应记忆CD8+KLRG1T细胞子集分化并且防止CD8+CD122+调节T细胞扩增[0372] 对抗侵入病原体的保护性免疫可由记忆CD8+T细胞介导。效应-表型记忆T细胞(Teff)可介导血液携带病原体的清除。CD44和KLRG1是Teff细胞分化的表达标记物，并且因此被表达在活化和记忆CD8+T细胞而不是初始CD8+T细胞上。如上所述，在疫苗中包含IL-33诱+
导了抗原特异性CD8T细胞的扩增和增殖。如以下详述的，进行研究以考查在疫苗接种过程中IL-33促进诱导的Ag特异性CD8+T细胞子集的记忆分化的能力(图14和图15)。具体地，首先考查标记物CD44和KLRG1以确定在疫苗中包含IL-33是否诱导Teff细胞的分化(图14A)。
导了抗原特异性CD8T细胞的扩增和增殖。如以下详述的，进行研究以考查在疫苗接种过程中IL-33促进诱导的Ag特异性CD8+T细胞子集的记忆分化的能力(图14和图15)。具体地，首先考查标记物CD44和KLRG1以确定在疫苗中包含IL-33是否诱导Teff细胞的分化(图14A)。
[0373] 用伴有或不伴有11μg mtrIL-33构建体的10μg GP质粒免疫C57BL/6小鼠(n＝4-8)一次并且在初始疫苗接种后21天时仅用GP加强。如图14A中所指出的那样监测血液中抗原特异性应答。在图14中，实验重复两次。在图14中，*，P＜0.05；**，P＜0.01；并且***，P＜0.001。
[0374] 与仅接种GP的组相比，mtrIL-33的施用导致PBL中的CD8+KLRG1+Teff细胞的百分比明显扩大(图14B)。在图14B中，在DbGp33+CD8+CD44+KLRG1+上对群体进行门控。初始免疫后21天还评估了DNA-GP加强之后的DbGP33四聚体特异性CD8+KLRG1+T细胞的回忆应答。在加强之后在两个组中观察到GP33特异性记忆CD8+KLRG1+T细胞的明显扩增；然而，mtrIL-33佐剂组中的CD8+KLRG1+T细胞的比例保持显著更高(图14B)。
[0375] 考查了mtrIL-33改变CD8+CD122+T细胞子集群体分化的能力，因为此群体可具有调节功能并且遏制疫苗诱导的免疫应答。因而，所述CD8+T细胞遏制物群体的扩增可能是疫苗接种策略的缺陷。
[0376] 在PBL中，在疫苗接种过程中，疫苗诱导的DbGP33+CD8+CD122+特异性T细胞子集的动力学揭示出显著的差异(图15A)。与GP+mtrIL-33治疗组相比，在疫苗接种过程中，仅接种b + +GP的小鼠诱导更高的DGP33四聚体特异性CD8 CD122T细胞应答。每组具有4-8只小鼠。与
mtrIL-33治疗组相比，从14dpv开始，GP组中GP33特异性CD8+CD122+T细胞的频率高约3倍(图
15A)。在疫苗中包含mtrIL-33在疫苗接种过程内保持相对恒定的低水平的四聚体特异性
CD8+CD122+T细胞子集。因而，在疫苗中包含mtrIL-33遏制了CD122+CD8+调节T细胞的扩增，这进而增加了由疫苗诱导的免疫应答。
mtrIL-33治疗组相比，从14dpv开始，GP组中GP33特异性CD8+CD122+T细胞的频率高约3倍(图
15A)。在疫苗中包含mtrIL-33在疫苗接种过程内保持相对恒定的低水平的四聚体特异性
CD8+CD122+T细胞子集。因而，在疫苗中包含mtrIL-33遏制了CD122+CD8+调节T细胞的扩增，这进而增加了由疫苗诱导的免疫应答。
[0377] 在图15中，示出的数据是三个重复两次的独立实验的结果。在图15中，*，P＜0.05；**，P＜0.01；并且***，P＜0.001。
[0378] 当在21dpv时考查脾脏中所述GP特异性CD8+CD122+T细胞子集的功能性时，在GP33肽再刺激时，Ag特异性CD8+CD122+T细胞不能产生IFN-γ(图15B)。类似地，与NP特异性CD8+KLRG1+T细胞子集或其他未表征的Ag特异性CD8+T细胞相比，NP特异性CD8+CD122+T细胞分泌非常少的IFN-γ(图15C)。因而，NP特异性CD8+KLRG1+T细胞而不是CD8+CD122+调节T细胞诱导IFN-γ。因此，在疫苗中包含mtrIL-33显著地改变CD8+CD122+调节群。因此，CD8+CD122+调节群的调节是mtrIL-33增加疫苗诱导的CD8+T细胞应答的一种机制
[0379] 为了进一步考查所述调节，进行研究以确定CD8+CD122+调节T细胞的消耗是否将类似于mtrIL-33的施用而增强GP接种组中的Ag特异性应答。具体地，仅用编码GP抗原的DNA接种两组C57BL/6小鼠(n＝4/组)。在单次疫苗接种后第3天、第6天、第9天和第12天时，将抗CD122单克隆抗体(mAb)(20μg)腹膜内(i.p.)注射到一组小鼠中(图16A)。使用抗CD122mAb消耗CD122。另一组小鼠不接受抗CD122mAb，因此充当对照。在14dpv时处死小鼠并且收获脾脏以评估CD8和CD122的表达。这些实验的结果在图16中示出并且在下文更详细地描述。在图16中，数据示出为两次实验中的一个代表性实验的结果。
[0380] CD122消耗导致用抗CD122mAb治疗的小鼠中CD8+CD122+T细胞的消除(图16B)。在疫苗接种后2周，相比于对照组中的Ag特异性CD8+T细胞，CD122消耗的小鼠表现出脾脏中的b + +DGP33特异性CD8 T细胞数目的明显增加(图16C)。因而，通过体内施用抗CD122mAb消耗CD8+CD122+调节T细胞导致疫苗诱导的免疫应答增加，类似于如图13所示的mtrIL-33佐剂的共施用。
[0381] 概括地说，这些数据表明了mtrIL-33防止所述调节T细胞即CD8+CD122+T细胞子集的分化或扩增的能力。所述减少是mtrIL-33有利于抗病毒免疫的另一机制。
[0382] 实施例12、13和14说明，mtrIL-33构建体的共施用不仅增加了IFN-γ斑点形成NP396特异性CD8+T细胞的强度，而且还改善其多功能性，即增加了CD8+T细胞的溶细胞性表型和其效应记忆分化。如通过针对特异性CD8T细胞表位DbNP396-40的IFN-γELISpot所测量的，与仅NP免疫相比，mtrIL-33的包含诱导大2.5倍的应答。此外，这些实施例显示，mtrIL-33增强分泌IFN-γ+TNF-α+IL2+、IFN-γ+TNF-α+和IFN-γ+的多功能性CD8+T细胞群并且引发更大的Ag特异性CD8+溶细胞性脱粒(图12)。所述数据与实施例1-10的研究一致，即当与DNA疫苗共施用时，IL-33(proIL-33和mtrIL-33形式)增加了Ag特异性细胞介导的免疫应答。
[0383] 此外，与实施例1-10的研究一致，实施例12-14的研究说明，类似于proIL-33，mtrIL-33响应于疫苗接种而诱导血液中的GP33+CD8+T细胞应答的显著放大。因而，IL-33调节了CD8+T细胞的扩增。
[0384] 实施例12-14的这些研究还说明，与仅接种GP的组相比，加强之后的次级回忆应答+ +引起四聚体特异性CD8KLRG1 T细胞的快速扩增(图13A)。在加强后8天Ag特异性效应记忆
CD8+T细胞的所述差异和快速回忆应答与如图11所示的IL-33提供佐剂作用并介导抗病毒
保护的能力一致。总体来说，所述结果说明，作为佐剂的IL-33的包含通过诱导引发直接效应功能的效应记忆T细胞而促进了抗病毒免疫。
CD8+T细胞的所述差异和快速回忆应答与如图11所示的IL-33提供佐剂作用并介导抗病毒
保护的能力一致。总体来说，所述结果说明，作为佐剂的IL-33的包含通过诱导引发直接效应功能的效应记忆T细胞而促进了抗病毒免疫。
[0385] 另外，所述实施例说明，CD8+CD122+调节T细胞的消耗增加了四聚体特异性CD8+T细胞应答(图16C)，这表明IL-33接种小鼠中Ag特异性CD8+T细胞扩增和功能的增加与对CD8+CD122+调节T细胞的扩增的阻止有关。
[0386] 实施例15
[0387] IL-33增强HIV和TB特异性T细胞介导的应答
[0388] 为了确定mtrIL-33佐剂是否增强需要THl和CD8+T细胞应答的针对其他病原体的疫苗效力，对与HIV或TB DNA抗原共递送的mtrIL-33的Ag特异性T细胞介导的应答进行评估(图17和图18)。以两周为间隔用单独给出的或与11μg mtrIL-33组合给出的10μg HIV
Consensus clade C(ConC)或TB抗原85B(Ag85B)肌内(i.m.)接种C57BL/6小鼠(n＝4-5)三
次，然后进行EP。最后一次免疫后一周，将小鼠处死并且对脾脏进行处理。使用源自所述脾脏的细胞测量抗原特异性免疫应答。
Consensus clade C(ConC)或TB抗原85B(Ag85B)肌内(i.m.)接种C57BL/6小鼠(n＝4-5)三
次，然后进行EP。最后一次免疫后一周，将小鼠处死并且对脾脏进行处理。使用源自所述脾脏的细胞测量抗原特异性免疫应答。
[0389] 与LCMV模型(图12A、图12B和图12C)中的发现一致，当分别与无佐剂组(ConC，约2,300SFC；Ag85B，约333SFC)相比时，在疫苗中包含mtrIL-33提高HIV和TB特异性IFN-γ分泌T细胞的数目(ConC，约3,800SFC；Ag85B，约1,062SFC)(图17A和图18A)。
[0390] 在图17中，实验进行至少两次，获得类似结果。另外，在图17中，与ConC组相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01；并且***，P＜0.001。在图18中，实验进行至少两次，获得类似结果。另外，在图18中，与Ag85B组相比，*，P＜0.05；并且**，P＜0.01。
[0391] 此外，免疫后针对HIV和TB抗原考查了CD4+和CD8+T细胞群的产生细胞因子的表型(分别为图17B和图17C，以及图18B和图18C)。在小鼠中，HIV和TB疫苗接种后的Ag特异性TH1应答由脾脏中的高频率的多功能性三阳性(IFN-γ+TNF-α+IL-2+)、双阳性(IFN-γ+TNF-α+)以及IFN-γ单阳性CD4+T细胞构成(分别为图17B和图18B)。关于CD8+T细胞，观察到伴有mtrIL-33的HIV和TB疫苗接种之后的应答诱导了显著更高频率的多功能性双阳性(IFN-γ+TNF-α+)以及TNF-α和IFN-γ单阳性CD8+T细胞(分别为图17C和图18C)。这些数据与来自以上实施例的数据一起表明，IL-33是靶向不同病原体的疫苗中的有效佐剂。
[0392] 概括地说，实施例12-15说明，在疫苗接种期间IL-33的共施用增强了针对不同抗原的抗原(Ag)特异性T细胞的强度和功能，所述抗原例如LCMV NP以及HIV和TB抗原。通过表现出细胞毒性表型的TH1-型多功能性T细胞的更高频率来表征所述应答。这些T细胞在体内Ag特异性再刺激时能够强烈扩增并且提供对抗高剂量致死LCMV激发的保护。这些T细胞还能够强烈地产生抗原特异性IFN-γ。
[0393] 此外，IL-33通过扩增KLRG1+效应记忆T细胞并防止CD122+调节CD8+T细胞的扩增来调节Ag特异性免疫。以此方式，佐剂IL-33改善了由疫苗诱导的T细胞免疫。
[0395] 对公开的实施方案的各种变化和修改将为本领域技术人员显而易知。可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出这类变化和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用的方法有关的那些变化和修改。
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