抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法
阅读：129发布：2020-06-09
专利汇可以提供抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种通过表达抗 口 蹄 疫 病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因 家畜 的方法：是将携带shRNA 碱 基序列及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线性化并 转染 正常家畜的 胎儿 成 纤维 细胞 ，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供 体细胞 ，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。杂合子转基因 公畜 和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖即获得纯合子转基因家畜。用本方法获得的转基因家畜可表达抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能 力 。，下面是抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：是将携带shRNA碱基序列及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供体细胞，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。
2.根据权利要求1所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于，还包括以下方法：杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖而获得纯合子转基因家畜。
3.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述家畜为牛、羊或猪。
4.根据权利要求3所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述家畜为奶牛或肉牛。
5.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述家畜胎儿成纤维细胞为35～150日龄胎儿不同组织来源的成纤维细胞。
6.根据权利要求5所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述家畜胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞。
7.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或磷酸钙沉淀法。
8.根据权利要求7所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞方法为脂质体转染法，脂质体转染法的条件为：
线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA∶脂质体LTX＝1∶3。
9.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述将抗口蹄疫病毒RNAi转基因核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
10.根据权利要求1或2所述的通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法，其特征在于：所述去核卵母细胞不带有第一极体。
抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种获得抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的动物转基因技术方法，属于细胞工程领域。
背景技术
[0002] 口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，占其国内生产总值的1.1％；2005年我国部分地区暴发Asia I型FMD，2009年初多个省区又发生了A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。
[0003] 目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始探索防控FMD的新策略，RNA interference(RNAi)因快速、特异的抗病毒能力而成为新的研究热点。
[0004] 表达针对病毒不同基因的RNAi可切断病毒复制的源头，进而阻断病毒感染及其扩散和传播，将打破传统的通过免疫学手段预防病毒病的思维模式，为控制和消灭家畜病毒病开辟新的途径。RNAi是抑制病毒增殖的理想工具，其抗病毒功能在HIV(Chang等，2005；Das等；2004；Dave和Pomerantz，2004；Wu等，2007)、HBV(Wu等，2005；Wu等，2007)、埃博拉病毒(Geisbert等，2006)、脊髓灰质炎病毒(Gitlin等，2005)等病毒病的防控中进行了广泛的研究，并得到了验证。
[0005] 许多学者针对FMDV不同基因并在细胞、实验动物及敏感动物猪等不同水平对RNAi抗FMDV作用进行了探索和研究，目前的研究结果如下：Liu等(2005)体外合成针对FMDV基因组5’NCR、VP4、VPg、3D和3’NCR保守区的siRNA可抑制同种及异种FMDV在BHK-21细胞内的增殖，病毒感染48h后的抑制率为10-1000倍，其特异性的抑制作用可持续6天以上；该研究以多基因交叉保护的方式抑制了FMDV在BHK-21细胞内的复制，为高度变异的FMDV的防控提供了新的策略。de los Santos等(2005)构建了针对4种血清型2B基因保守区的shRNA表达质粒，转染猪细胞后，可明显抑制病毒RNA及蛋白的合成，并减少了病毒的产率，该shRNA抗病毒作用是其序列特异性的，并不是诱导产生的干扰素导致的。Kahana等(2004)针对FMDV所有血清型3B和3D基因的保守区设计并合成了3个siRNA，共转染BHK-21细胞后，病毒在细胞内的增殖被100％的抑制。Kim等(2008)在FMDV感染前，接种表达siRNA的腺病毒有效地抑制了FMDV在猪IBRS-2细胞内的增殖，若在FMDV感染前和感染后均使用siRNA，其抗病效果更理想。Lv等(2009)利用T7RNA聚合酶体外合成的3个siRNA可特异性地沉默VP1-EGFP融合基因在293细胞内的表达；瞬时转染的siRNA可抑制FMDV在BHK-21细胞内的增殖。Pengyan等(2008)针对7个血清型的3D和2B1基因的siRNA/shRNA可减少FMDV在BHK-21细胞内的生长滴度；颈部皮下注射shRNA表达质粒后，FMDV对乳鼠的攻击减弱。Joyappa等(2009)将表达针对3D基因的shRNA的质粒转
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染BHK-21细胞后，用10TCID50的FMDV攻毒，与对照组比，病毒生长滴度下降3倍；用该质
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粒接种豚鼠后，对10GPID50的FMDV攻毒保护率为80％。Chen等(2004)转染针对VP1的shRNA重组表达质粒，可使FMDV VP1在BHK-21细胞内的表达下降80-90％，进而特异性地抗病毒感染，其抗病毒作用可持续48h；皮下注射该质粒的乳鼠对FMDV的敏感性显著下降。
Chen等(2006)利用表达针对3D基因siRNA的复制缺陷型的人5型腺病毒阻止同种和异种FMDV对猪IBRS-2细胞的感染，并显著地降低了豚鼠及猪对FMDV感染的敏感性。Cong等(2010a)构建了可针对VP1基因的不同靶点的siRNA表达质粒，在BHK-21细胞内其对A、O和Asia I型VP1的表达具有沉默作用，并可抑制O型和Asia I型病毒的增殖；颈部皮下注射其可明显地降低乳鼠对O型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21细胞病毒感染及乳鼠攻毒保护试验，筛选出针对3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDVRNAi；
在豚鼠的攻毒保护试验中，携带p3D-NT56的Salmonella choleraesuis C500减毒疫苗株(p3D-NT56/S.cho)对RNAi同种的FMDV的攻毒保护率为80％；预先接种p3D-NT56/S.cho
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剂量为5x10CFU的猪，在FMDV攻毒后9天内的保护率为100％。上述研究结果表明，RNAi是控制高传染性FMDV在家畜中传播的可选择的具有潜力的策略。
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染BHK-21细胞后，用10TCID50的FMDV攻毒，与对照组比，病毒生长滴度下降3倍；用该质
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粒接种豚鼠后，对10GPID50的FMDV攻毒保护率为80％。Chen等(2004)转染针对VP1的shRNA重组表达质粒，可使FMDV VP1在BHK-21细胞内的表达下降80-90％，进而特异性地抗病毒感染，其抗病毒作用可持续48h；皮下注射该质粒的乳鼠对FMDV的敏感性显著下降。
Chen等(2006)利用表达针对3D基因siRNA的复制缺陷型的人5型腺病毒阻止同种和异种FMDV对猪IBRS-2细胞的感染，并显著地降低了豚鼠及猪对FMDV感染的敏感性。Cong等(2010a)构建了可针对VP1基因的不同靶点的siRNA表达质粒，在BHK-21细胞内其对A、O和Asia I型VP1的表达具有沉默作用，并可抑制O型和Asia I型病毒的增殖；颈部皮下注射其可明显地降低乳鼠对O型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21细胞病毒感染及乳鼠攻毒保护试验，筛选出针对3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDVRNAi；
在豚鼠的攻毒保护试验中，携带p3D-NT56的Salmonella choleraesuis C500减毒疫苗株(p3D-NT56/S.cho)对RNAi同种的FMDV的攻毒保护率为80％；预先接种p3D-NT56/S.cho
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剂量为5x10CFU的猪，在FMDV攻毒后9天内的保护率为100％。上述研究结果表明，RNAi是控制高传染性FMDV在家畜中传播的可选择的具有潜力的策略。
[0006] 转基因体细胞克隆技术是比较常用的家畜转基因技术，是基因组修饰技术与动物体细胞核移植技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，它部分地克服了传统转基因动物外源基因整合率低、大动物生产成本高的技术瓶颈，代表当前转基因动物制作的主流方向。在该方法中，核供体细胞在核移植前要经过重组质粒载体转染或重组病毒载体感染、筛选和鉴定等环节，提高了转基因动物的阳性率。各种转基因动物的制作方法均需先构建目的基因的重组载体，用于转基因技术的基因载体可分为病毒载体、质粒载体及人工染色体等。其中Lenti-virus在介导基因转移研究中，发挥了重要作用。以人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)为代表的Lenti-virus是复杂的逆转录病毒，经改造的Lenti-virus作为外源基因载体，具有其独特的优势。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点(Cockrell等，2007)，是较好的RNAi转基因载体。Golding等(2006)利用RNAi技术针对引起牛疯牛病和羊痒病的PRNP基因序列设计有效的siRNA，获得1头转基因羊胎儿，检测发现siRNA很好地抑制了体内PRNP基因的表达。
[0007] 本发明根据Kahana等(2004)及Joyappa等(2009)验证的抗FMDV siRNA/shRNA序列(本发明中分别为3B1、3D1和3D2)，构建了表达抗FMDV的shRNA重组Lenti-virus载体，利用转基因体细胞克隆技术获得了抗FMDV RNAi转基因家畜。
[0008] 参考文献：
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发明内容
[0029] 针对上述现有技术，本发明的发明人进行了研究，研究表明，通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得的杂合子或纯合子转基因家畜的FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。因此，制备抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的方法是获得抗FMD转基因家畜的最佳方法之一。
[0030] 本发明的目的是提供一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法。通过本发明的方法获得的转基因家畜抑制FMDV在体内的增殖，其FMDV感染率明显下降。
[0031] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0032] 一种通过表达抗口蹄疫病毒RNAi获得抗口蹄疫转基因家畜的方法：是将携带shRNA碱基序列(如表1)及GFP报告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重组Lenti-virus载体线性化并转染正常家畜的胎儿成纤维细胞，利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪筛分转基因核供体细胞，将核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。
[0033] 还包括以下方法：杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖而获得纯合子转基因家畜。
[0034] 所述家畜为牛、羊或猪，优选奶牛或肉牛。
[0037] 所述脂质体转染法的条件为：线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA：脂质体LTX＝1∶3。
[0038] 所述将抗口蹄疫病毒RNAi转基因核供体细胞核导入家畜的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
[0039] 所述去核卵母细胞不带有第一极体。
[0040] 本发明利用RNAi技术和体细胞克隆的方法将线性化的携带有抗口蹄疫病毒RNAi及报告基因的重组Lenti-virus载体转染家畜胎儿成纤维细胞，获得抗口蹄疫病毒RNAi转基因核供体细胞，将其细胞核导入家畜的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕家畜子宫中，得到的子代即为抗口蹄疫病毒RNAi的杂合子转基因家畜。经杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配或人工授精繁殖而获得纯合子转基因家畜。用本方法获得的转基因家畜可表达抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。本发明打破了传统的通过免疫学手段预防FMD的思维模式，为控制和消灭家畜FMD开辟了新的途径，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
附图说明
附图说明
[0041] 图1为体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi转基因家畜的生产流程图。
[0042] 图2Lenti-virus H1载体酶切结果，其中，M：DL marker 10,000；1：SmaI和AgeI双酶切H1载体；2：XbaI和AgeI双酶切H1载体。
[0043] 图3RNAi重组H1载体的PCR鉴定结果，其中，M：DL marker 2,000；1：阳性对照；2：空载体阴性对照；3：RNAi-3B1；4：RNAi-3D1；5：RNAi-3D2#1；6：RNAi-3D2#2。
[0044] 图4抗口蹄疫病毒RNAi转基因奶牛胎儿的PCR鉴定结果，其中，M：DL marker2,000；1和2：转基因胎儿，3：非转基因奶牛胎儿对照。
具体实施方式
[0045] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明。
[0046] 下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自Sigma公司。
[0047] 实施例1：体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi转基因奶牛的生产及分子生物学检测[0048] 体细胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi杂合子转基因奶牛的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：
[0049] 1.shRNA重组H1表达质粒的构建
[0050] 将化学合成的RNAi-3B11和RNAi-3B12、RNAi-3D11和RNAi-3D12、RNAi-3D21和RNAi-3D22(见表1)分别退火后，与经XbaI和AgeI双酶切的H1Lenti-virus载体所获得的12.5kb以及经SmaI和AgeI双酶切H1载体所获得的1.5kb片段(图2)按照如下体系连接：12.5kb载体片段，100ng；1.5kb载体片段，50ng；shRNA oligo，50ng；T4DNA连接酶，0.5μL；10×T4DNA连接酶buffer，2μL，补足H2O使体系至20μL，16℃过夜连接。转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组H1载体，用于后续试验。
[0051] PCR鉴定阳性重组质粒的方法是以小提质粒为模板，以已知重组阳性质粒及空载体为对照，在引物LT-P1：
[0052] 5’-TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’
[0053] 和引物LT-P2：
[0054] 5’-GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’
[0055] 的引导下，反应条件如下：94℃30s；94℃20s 57℃20s 68℃30s，35个循环；68℃3min，反应结束后对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测，重组shRNA的质粒PCR扩增结果为300bp片段，空载体的扩增结果为250bp片段。结果如图3所示，其中，M：DL marker2,000；1：阳性对照；2：空载体阴性对照；3：RNAi-3B1；4：RNAi-3D1；5：RNAi-3D2#1；6：RNAi-3D2#2。
[0056] 表1 沉默FMDV 3B及3D基因的shRNA序列
[0057]
[0058] 注：下划线：针对靶序列的正链RNAi序列；斜体下划线：针对靶序列的负链RNAi；黑体字：shRNA中的Loop；U6tenminator及其互补序列：TTTTTT/AAAAAA；方框：XbaI酶切位点
[0059] 2.牛胎儿皮肤成纤维细胞系的建立
[0060] 选用2月龄的荷斯坦奶牛胎儿(购自山东奥克斯生物技术有限公司)，用70％酒精清洗包被奶牛胎儿的羊膜数次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗数遍，取胎儿3
皮肤组织，剪碎成小块(体积小于1mm)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋自酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含10％胎牛血清的DMEM：F12营养液分散，1000rpm
5
10min，再加入10％胎牛血清的DMEM：F12营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10 的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用
0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％DMEM：F12，10％FBS和10％DMSO)，获得牛胎儿皮肤成纤维细胞系。
皮肤组织，剪碎成小块(体积小于1mm)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋自酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含10％胎牛血清的DMEM：F12营养液分散，1000rpm
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10min，再加入10％胎牛血清的DMEM：F12营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10 的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用
0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％DMEM：F12，10％FBS和10％DMSO)，获得牛胎儿皮肤成纤维细胞系。
[0061] 3.牛胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选
[0062] 处于对数生长期的牛胎儿皮肤成纤维细胞，用Opti-MEM洗1次细胞，将载体DNA线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染细胞(DNA∶脂质体LTX＝1∶3)，24h后加入700μg/mL G418和8μM Gancvilor作为筛选压力进行筛选，每3d换液1次，
10d后用0.25％胰蛋白酶消化形成的克隆细胞，培养2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。
10d后用0.25％胰蛋白酶消化形成的克隆细胞，培养2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。
[0063] 4.卵母细胞的成熟培养
[0064] 将取自周边地区屠宰场的成年奶牛和黄牛的卵巢，用37℃的PBS液清洗3遍后，用直径为0.7mm的针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体，将其用成熟液(M199培养液中添加10％FBS，0.01U/mL bFSH，0.01U/mL bLH和1μg/mL雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO2的培养箱中培养约20h，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞和卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀，并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。
[0065] 5.核移植和克隆胚胎的体外培养
[0066] 将步骤3获得的第一极体的卵母细胞移入操作液(M199培养液中添加10％FBS，7.5μg/mL细胞松弛素B)中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体上方的透明带切一小口，再用内径20μm的玻璃管将第一极体及其下方的卵母细胞的染色体一并吸除，再用含20％的FBS的M199液体培养基洗3遍，置于38.5℃、5％CO2的培养箱中备用。将步骤2获得的转基因细胞活化至长满单层，用0.25％胰蛋白酶消化，悬浮细胞，离心，再加微量的营养液悬浮，用玻璃针选择直径为10-12μm的胎儿皮肤成纤维细胞的细胞核，用20μm的玻璃管将其移
2+
入去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/L Ca 和0.15mmol/
2+
LMg 的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5KV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入添加10％FBS的M199培养液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理，将重构胚放入5μmol/L离子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CRIaa液中，在38.5℃、5％CO2的培养箱中培养，分别在2d和7d后观察胚胎的发育状况。
2+
入去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/L Ca 和0.15mmol/
2+
LMg 的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5KV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入添加10％FBS的M199培养液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理，将重构胚放入5μmol/L离子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CRIaa液中，在38.5℃、5％CO2的培养箱中培养，分别在2d和7d后观察胚胎的发育状况。
[0067] 6.胚胎移植与妊娠检测
[0068] 将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛48头，移植60d后的直肠检测表明，其中25头怀孕。手术取2个胎儿进行鉴定，均为转基因阳性。
[0069] 7.转基因胎儿及克隆牛的分子生物学鉴定
[0070] (1)PCR鉴定及序列测定分析
[0071] 以转基因克隆牛胎儿或新生犊牛耳部组织的基因组DNA为模板，在引物LT-P1：
[0072] 5’-TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’
[0073] 和引物LT-P2：
[0074] 5’-GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’
[0075] 的引导下，反应条件如下：94℃30s；94℃20s 57℃20s 68℃30s，35个循环；68℃3min，反应结束后对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR阳性扩增结果为
300bp。转基因牛胎儿鉴定结果如图4所示，M：DL marker 10,000(Takara公司)，第1和2泳道为转基因胎儿，PCR检测结果阳性，第3泳道为非转基因奶牛胎儿对照，PCR阴性。回收PCR产物，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒，送测序公司测序，序列分析结果表明，这2头转基因胎儿为抗FMDVRNAi转基因阳性胎儿。
300bp。转基因牛胎儿鉴定结果如图4所示，M：DL marker 10,000(Takara公司)，第1和2泳道为转基因胎儿，PCR检测结果阳性，第3泳道为非转基因奶牛胎儿对照，PCR阴性。回收PCR产物，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒，送测序公司测序，序列分析结果表明，这2头转基因胎儿为抗FMDVRNAi转基因阳性胎儿。
[0076] (2)Southern杂交鉴定
[0077] 取约10μg转基因克隆牛胎儿或新生犊牛耳部组织的基因组DNA，以普通荷斯坦奶牛胎儿或新生犊牛的基因组DNA作为阴性对照，以混合0.2ng(Lenti-virus H1/dsRNAi)/50μL普通荷斯坦奶牛胎儿或新生犊牛的基因组DNA作为阳性对照，用限制性内切酶Xho I/Apa I酶切消化后，30V低压电泳，转膜，进行Southern杂交。杂交所用探针为32
利用rediprimerTMII randomprimer labeling system(amersham)、由[α- P]dCTP同位素标记的、以Lenti-virus H1/dsRNAi为模板，在引物TZ414U：
利用rediprimerTMII randomprimer labeling system(amersham)、由[α- P]dCTP同位素标记的、以Lenti-virus H1/dsRNAi为模板，在引物TZ414U：
[0078] 5’-GAAGAACGGCATCAAGGTG-3’
[0079] 与TZ414L：
[0080] 5’-TTGCTTCCCGTATGGCTT-3’
[0082] (3)反相PCR方法检测shRNA在染色体上的定位
[0083] 取约10μg转基因克隆牛胎儿或新生犊牛耳部组织的基因组DNA，用限制性内切酶XhoI/BstX I酶切消化后，回收全部的酶切片段，经过T4DNA Polymerase处理，使其末端平滑化，经过T4DNALigase连接，形成环状DNA，由酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提、乙醇沉淀获得的产物为模板，在引物Primer1：
[0084] 5’-TTTCGGGTTTATTACAGGGA-3’
[0085] 和引物Primer2：
[0086] 5’-ATCATGCTATTGCTTCCCGTAT-3’
[0087] 的引导下，PCR扩增，反应条件为94℃30s；94℃20s 57℃20s 68℃3min，35个循环；68℃7min。回收所有PCR产物，作为第二次PCR反应的模板，在引物Primer3：
[0088] 5’-TTGGAGCGGGTTGATGAC-3’
[0089] 和Primer4：
[0090] 5’-TTGCCACGGCGGAACTCA-3’
[0091] 的引导下，做槽式PCR，反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收所有产物片段，分别连接到pMD19-T载体中，进行测序，测序的结果，与NCBI公布的荷斯坦奶牛基因组DNA进行比对，确定shRNA插入的染色体及基因的位置。
[0092] (4)杂合子、纯合子转基因胎儿及牛的鉴定。
[0093] 上述3种方法可鉴定转基因胎儿及牛，但不能区分杂合子和纯合子。由反相PCR方法确定shRNA插入的染色体及基因的位置后，在shRNA插入基因序列的两端设计特异引物进行PCR扩增，设计的原则是未插入shRNA的PCR扩增片段长度在3kb以内。在上述3种方法确认为转基因胎儿及牛的基础上，因为shRNA重组Lenti-virus载体整合到染色体的片段应大于10kb，若PCR扩增出了3kb以内的插入基因序列，该转基因胎儿或牛为杂合子；若PCR不能扩增出3kb以内的插入基因序列，表明该转基因胎儿或牛为纯合子。
[0094] 8.转基因牛的FMDV攻毒实验
[0095] (1)牛半数感染量(ID50)的测定
[0096] 选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄荷斯坦奶牛12头，分成4组，每组5 6
3头，分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量分别为0、10、10
7
和10TCID50，观察8天，未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的实验组病牛表现为蹄、口腔及其周围和母畜的乳头等部位出现水泡。统计发病牛的数量，按照Reed-Muench方法计
6
算ID50，该组织培养毒的ID50为4×10。
3头，分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量分别为0、10、10
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和10TCID50，观察8天，未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的实验组病牛表现为蹄、口腔及其周围和母畜的乳头等部位出现水泡。统计发病牛的数量，按照Reed-Muench方法计
6
算ID50，该组织培养毒的ID50为4×10。
[0097] (2)转基因牛的FMDV攻毒实验
[0098] 选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄左右正常及转基因荷斯坦奶牛各6头，分为4组，每组3头。正常及转基因牛中，各有一组不接种病毒，另一组分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量为100ID50，观察8天。未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的正常奶牛组奶牛全部发病，统计转基因发病牛的数量并与正常组发病牛的症状进行比较，计算发病率。
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