一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法
阅读：334发布：2020-05-20
专利汇可以提供一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法，以奶山羊基因组DNA为模板，利用2对引物分别扩增催乳素受体（PRLR）基因的外显子9和 乳蛋白 转录因子（ELF5）基因内含子1，以浓度为1.5%的琼脂糖凝胶 电泳 对各扩增产物进行大小判定，采用DNA测序技术筛查2对引物扩增产物的位点突变，然后利用浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳对PRLR和ELF5基因的2个位点的SNPs进行基因分型和基因 频率 分析，分析不同基因型组合与产奶性状之间的关系，筛选最佳基因型组合。，下面是一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法，其特征在于，以奶山羊基因组DNA为模板，在PCR条件下，利用2对引物P1和P2，分别扩增催乳素受体基因的外显子9和乳蛋白转录因子基因的内含子1，其中：
所述的引物P1如下：
上游引物1F：5'-CTTACCACAACATTGCTGAC-3'；
下游引物1R：5'-CCTTGGCTGGATTCTATGG-3'；
所述的引物P2如下：
上游引物2F：5'-CCTCTCCAACCTCAATCAG-3'；
下游引物2R：5'-CAGTCCAAGCAGGCAATA-3'；
引物P1扩增催乳素受体基因的外显子9，用于筛查奶山羊催乳素受体基因外显子9位点的突变；
引物P2扩增乳蛋白转录因子基因内含子1，用于筛查奶山羊乳蛋白转录因子基因内含子1位点的突变；
用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳对2对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查到催乳素受体基因外显子9和乳蛋白转录因子基因内含子1共有3个碱基的突变；
再利用浓度为3.5％的琼脂糖凝胶电泳对这3个位点的SNPs进行基因分型，分析不同基因型组合与奶山羊产奶性状之间的关系，筛选最佳基因型组合，分析含有最佳基因型组合的高产个体形成的选配方式，应用这些选配方式选育奶山羊的多基因聚合良种核心群；
所述分析不同基因型组合与奶山羊产奶性状之间的关系是利用SPSS软件分析品种、年龄、场和基因位点与产奶性状的相关性：在数据处理中，根据影响产奶性状的因素不同，考虑场效应、品种效应、种公畜效应、种公畜内母畜间效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用yijkmnpq＝μ+Farmi+Bj+Sp+SDq+Ak+Cm+Xn+eijkmnpq模型进行分析，其中：yijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farmi：场别效应；Bj：品种效应；Sp：种公畜效应；SDq：种公畜内母畜间效应；Ak：年龄效应；Cm：组合基因型效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，eijkmnpq：
随机误差；运用SPSS软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各组合基因型间产奶性状进行差异显著性检验；
所述的PCR扩增的条件是：
15μL反应体系：包括DNA模板50ng，7.5μl 2×Taq MasterMix，10μM的上下游引物各0.25μl，加灭菌水至15μl；
PCR反应程序如下：
1)利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，57.3℃退火30s，
72℃延伸32s，共进行33个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
2)利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸32s，共进行33个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
所述的催乳素受体基因外显子9在61677bp存在G→A，在61865bp存在G→A的突
变，这2个突变分别导致PRLR氨基酸序列的第485处丝氨酸突变为天冬酰胺和第548处的缬氨酸突变为蛋氨酸，所述的乳蛋白转录因子基因内含子1在3694bp存在C→G的突变；
所述的基因分型是浓度为3.5％的琼脂糖凝胶电泳分析引物P1和P2的PCR扩增产物，结果如下：
引物P1位点在G61677A的突变处存在2种基因型，纯合型GG在61677bp位的碱基是
G，杂合型GA在61677bp位的碱基是G\A；
引物P1位点在G61865A的突变处存在3种基因型，纯合型GG在61865bp位的碱基是
G，杂合型GA在61865bp位的碱基是G\A，纯合型AA在61865bp位的碱基是A；
引物P2位点在C3694G的突变处存在3种基因型，纯合型CC在3694bp位的碱基是C，
杂合型CG在3694bp位的碱基是C\G，纯合型GG在3694bp位的碱基是G；
所述的最佳基因型组合为GGGGCC，产奶量最低的基因型组合为GAGACC；
所述的不同基因型组合对奶山羊产奶性状的影响为：
GGGGCC组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于GAGACC和GAGACG型个体，P<0.05；
GGGGCG组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于GAGACC型个体；GGGGCC、GGGGCG和GGGGGG组合基因型个体第2泌乳期产奶量显著高于GAGACC型个体；GGGGCC和GGGGCG组合基因型个体第3泌乳期和平均泌乳期的产奶量显著高于GAGACC型个体。
一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子遗传育种学领域，具体涉及一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法，该方法应用PCR-RFLP和DNA测序技术检测被检个体催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1的单链DNA碱基突变多态性，通过分析不同基因型组合与奶山羊奶羔数之间的关系，筛选出最佳基因型组合，分析含有最佳基因型组合的高产个体的选配方式，再应用这些选配方式选育奶山羊的多基因聚合良种核心群。
背景技术
[0002] 产奶性状是奶山羊的主要经济性状，包括产奶量、乳脂率和乳蛋白率等。目前，许多学者认为这些数量性状的表现不仅受微效多基因或QTL控制，而且也与主效基因调控密切相关。因此，寻找这些性状的主效基因或与之相连锁的分子标记，研究功能基因的调控机理，是开展奶山羊分子育种工作的前提。以分子标记辅助选择为核心的多基因聚合育种技术能直接在DNA水平上对产奶性状的基因型进行选择，克服了传统育种方法准确性低的问题，可显著加快遗传进展，提高育种效率。因此，将分子标记辅助育种技术与传统育种技术有效结合，集成创新新的育种技术体系是奶山羊育种发展的必然趋势。基因聚合（Gene pyramiding）是通过基因工程手段，将分散在不同品种或品系中的优良基因通过杂交、回交、复合杂交等手段聚合到同一个品种中。畜禽的大部分经济性状具有加性效应，基因表达呈累加作用，即集中到一个品种中的同效基因越多表达越充分。目前，国内外关于羊分子育种的研究主要集中在羊的分子标记检测及其与性状的相关性方面，对于基因聚合育种技术大多数仍然仅停留于概念上，对其理论的研究相对滞后。
[0003] 单核苷酸多态性（Single nucleotide polynorphisms,SNPs）是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异导致的DNA序列的多态性，其中最少一种等位基因在群体中出现的频率不小于1%。SNP是继RFLP、SSR后的第三代分子标记。研究发现，在人类基因组中，CG序列是最易发生突变的位点，SNP在CG序列中出现的频率最多，约占总SNP的25%，而且多是C突变为T。根据基因组中SNPs所处的位置不同，可以将SNP位点分成几类，即存在于基因启动子、内含子和外显子中的SNP位点叫做gene-based SNPs；对基因的功能没有影响的SNP位点叫做anonymous SNPs。其中，存在于编码蛋白质序列中的SNP位点称为coding SNPs（cSNPs），在cSNPs中，如果氨基酸序列发生了改变，则称为non-synonymous SNPs；反之，则这样的单核苷酸多态性称为synonymous SNPs。目前对SNP进行检测与分析的常用技术主要为PCR-RFLP、变形梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）、变性的高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）等。
[0004] 随着人类基因组测序工作的完成，研究者们已将焦点转为SNP的筛选及检测方面，与遗传表型相关的DNA序列变异成为遗传学研究的主题之一。人类和动物中基因序列的变异大多数是单核苷酸的突变，而且不同的人群和动物种群其SNP的频率分布存在差异，这些差异反映出人或动物种群间的遗传差异。研究发现，SNP在人类基因组中是普遍存在的，而且平均每500-1000个碱基对中就出现一个SNP，估计有300多万个单核苷酸多态位点存在于人类的整个基因组中，其中的单核苷酸位点约有三分之二位于不编码基因的DNA序列，它们对个体的表现型意义不大，但对于群体而言，这些SNPs在群体遗传和生物进化的研究中作为遗传标记使用意义重大。剩余的三分之一则位于基因内，而且，单核苷酸多态性的分布在同一条染色体上不是均匀存在的。因此，对SNPs的研究有助于解释个体间的表型差异，利用一系列相关基因的SNP可以鉴定候选基因并进行相关的研究。
[0005] 催乳素是一种垂体前叶肽类激素，已报道的催乳素作用有300多种，主要表现在参与动物生长发育、繁殖、泌乳、代谢、免疫调节和电解质平衡等方面。这些作用均是通过催乳素受体（Prolactin receptor,PRLR）调节实现的。PRLR基因位于常染色体上。编码奶牛PRLR的基因定位在20q17上；人的PRLR基因定位于5p13～5p14上；猪的PRLR基因定位在16q1.4或16q2.2～16q2.3上；小鼠的定位在15号染色体上；大鼠的PRLR基因定位在2号染色体上；绵羊的PRLR基因定位于16号染色体上。
[0006] PRLR属于细胞因子受体家族成员。根据对PRLR初级转录物的选择性剪接形成的膜内区长度的不同，将PRLR分为三种类型：即长型（LPRLR）、中型（IPRLR）和短型（sPRLR）。研究表明由于各型催乳素受体膜内区不同，因而所启动的下游信号通路也不同。如LPRLR激活后主要启动JAK-STAT途径，而iPRLR和sPRLR则不能启动该途径或者改变其信号转导的方向，但sPRLR则对LF有抑制作用。奶牛有两种形式的PRLR存在，即长型PRLR：由557个氨基酸组成的；短型PRLR：由272个氨基酸组成。LPRLR和sPRLR在泌乳周期、发情周期和妊娠周期均表达，但因各周期的激素环境不同其表达具有组织特异性。研究绵羊卵巢PRLR的表达情况发现：LPRLR在动情期表达量增加，在黄体中期和卵泡发生初期表达降低等，而sPRLR则在整个发情周期稳定表达。PRLR被认为是与产奶量及奶成分有关的重要候选基因。目前，关于PRLR基因的研究报道很多，主要集中在其多态性与产奶性能及繁殖性能等方面。由于PRLR在促进奶牛及奶山羊等动物的乳腺发育、乳汁生成和维持泌乳等方面发挥重要作用，人们通过对PRLR基因多态性分析，希望找到有效的遗传分子标记，以用于产奶动物产奶性状的标记辅助选择。
[0007] ETS转录因子家族有50多个成员组成，是转录因子家族中的最大的一个家族之一。该家族基因在人中有29个，在老鼠中有28个，在线虫中有10个，在果蝇中有9个。ETS家族是一个有翼的螺旋-转折-螺旋超家族，与E26鸟类的骨髓成红血细胞增多症病毒编码的v-ets致癌基因同源，且带有一个保守的同源DNA结合域。EST家族有很多功能，包括细胞分化、免疫应答、迁移、增殖与凋亡的调控及血管生成等。人类Ets家族基因在进化上高度保守，其共同点是在C-端的Ets区有一个大约85个氨基酸的DNA结合域。可识别并结合富含嘌呤的DNA核心序列A/CGGAA/T。大多数ETS家族基因的表达范围较广泛，但少数基因的表达是上皮特异性的，ELF5是其中的一个。ELF5作为ETS家族中的一个转录因子，该基因在人上被定位于11号染色体上（11p13-15处），它能够激活许多上皮特异性的基因启动子，包括SPRR2A、PSA、PSP。
[0008] 研究发现ELF5是一个重要的乳腺腺泡发育调控因子，可以调控腔先驱细胞向腺泡结构分化。在乳腺发育过程中，ELF5功能的发挥是受催乳素调控的，而且它是催乳素发挥作用的中介因子。研究发现，在ELF5＋/－鼠中，乳腺不能够分泌乳汁。研究发现在老鼠体内ELF5和乳蛋白基因的表达是直接相关的，并且在催乳素受体缺失鼠中ELF5可以代替催乳素信号发挥作用。研究发现ELF5基因在牛乳腺中表达，胰岛素对其表达起着促进作用，并且它可能是一个重要的乳蛋白基因转录因子。从以上众多研究报道可以发现，ELF5很可能是一个能够对动物泌乳性能产生重要影响的候选基因。但目前还没有研究ELF5基因对动物产奶性能影响的报道。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于，提供一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法。以对动物繁殖性状有重要调控作用的PRLR和ELF5基因为研究对象，采用PCR-RFLP和DNA测序技术研究这2个基因在奶山羊中的SNPs及其与产奶性状的关联性；用数量遗传学分析方法研究PRLR和ELF5基因聚合效应对产奶性状的影响，为集成创新奶山羊产奶性状的多基因聚合育种技术体系提供试验依据和理论依据。
[0010] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
[0011] 一种利用双基因聚合效应选育奶山羊产奶性状的方法，其特征在于，以奶山羊基因组DNA为模板，在PCR条件下，利用2对引物P1和P2，分别扩增催乳素受体（PRLR）基因的外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因的内含子1，其中：
[0012] 所述的引物P1如下：
[0013] 上游引物1F：5'-CTTACCACAACATTGCTGAC-3'；
[0014] 下游引物1R：5'-CCTTGGCTGGATTCTATGG-3';
[0015] 所述的引物P2如下：
[0016] 上游引物2F：5'-CCTCTCCAACCTCAATCAG-3'；
[0017] 下游引物2R：5'-CAGTCCAAGCAGGCAATA-3'；
[0018] 引物P1扩增催乳素受体（PRLR）基因的外显子9，用于筛查奶山羊催乳素受体（PRLR）基因外显子9位点的突变；
[0019] 引物P2扩增乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1，用于筛查奶山羊乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1位点的突变；
[0020] 用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳对2对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查到催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1共有3个碱基的突变。
[0021] 再利用浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳对这3个位点的SNPs进行基因分型，分析不同基因型组合与奶山羊产奶性状之间的关系，筛选最佳基因型组合，分析含有最佳基因型组合的高产个体形成的选配方式，应用这些选配方式选育奶山羊的多基因聚合良种核心群。
[0022] 所述的PCR扩增的条件是：
[0023] 15μL反应体系：包括DNA模板50ng，7.5μl2×Taq MasterMix，上下游引物（10μM）各0.25μl，加灭菌水至15μl；
[0024] PCR反应程序如下：
[0026] 2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸32s，如此进行33个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
[0027] 所述的催乳素受体（PRLR）基因外显子9在61677bp存在G→A，在61865bp存在G→A的突变，这2个突变分别导致PRLR氨基酸序列的第485处丝氨酸突变为天冬酰胺（Ser→Asn）和第548处的缬氨酸突变为蛋氨酸（Val→Met），所述的乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1在3694bp存在C→G的突变。
[0028] 所述的基因分型是浓度为3.5%的琼脂糖凝胶电泳分析引物P1和P2的PCR扩增产物，结果如下：
[0029] 引物P1位点在G61677A的突变处存在2种基因型，纯合型GG在61677bp位的碱基是G，杂合型GA在61677bp位的碱基是G\A；
[0030] 引物P1位点在G61865A的突变处存在3种基因型，纯合型GG在61865bp位的碱基是G，杂合型GA在61865bp位的碱基是G\A，纯合型AA在61865bp位的碱基是A；
[0031] 引物P2位点在C3694G的突变处存在3种基因型，纯合型CC在3694bp位的碱基是C，杂合型CG在3694bp位的碱基是C\G，纯合型GG在3694bp位的碱基是G；
[0032] 所述的最佳基因型组合为C4（GGGGCC）。产奶量最低的基因型组合为C1（GAGACC）。
[0033] 所述的不同组合基因型组合对奶山羊产奶性状的影响为：
[0034] C4（GGGGCC）组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）和C2（GAGACG）型个体（P<0.05）；C5（GGGGCG）组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）；C4（GGGGCC）、C5（GGGGCG）和C6（GGGGGG）组合基因型个体第2泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）；C4（GGGGCC）和C5（GGGGCG）组合基因型个体第3泌乳期和平均泌乳期的产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0036] 提出了与奶山羊产奶性状相关的功能基因催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1的3个SNPs，这3个SNPs能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。
[0037] 对这3个基因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，检测母羊个体的基因型组合与产奶性状的关系，挑选最佳的基因型组合，分析含有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成奶山羊的多基因聚合良种核心群。附图说明
[0038] 图1是奶山羊催乳素受体（PRLR）基因外显子9利用引物P1进行PCR扩增产物电泳图；
[0039] 图2是奶山羊乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1利用引物P2进行PCR扩增电泳图；
[0040] 图3是催乳素受体（PRLR）基因外显子9利用引物P1进行PCR扩增产物的BfmI酶切产物的电泳检测结果。
[0041] 图4是催乳素受体（PRLR）基因外显子9利用引物P1进行PCR扩增产物的SmaI酶切产物的电泳检测结果；
[0042] 图5是乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1利用引物P2进行PCR产物的BstXI酶切产物的电泳检测结果；
[0043] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
[0044] 以下是通过对奶山羊基因组DNA的提取、检测和浓度分析，以及在PCR扩增条件下，利用引物P1和P2扩增的催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析的实施例。
[0045] A、利用引物P1和P2分别扩增的催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1及其多态性的检测：
[0046] 1、山羊血样的采集及处理
[0048] 本实施例血液样本共采集712份，其中关中奶山羊（GZ）血样327份，采自陕西圣唐乳液有限公司养殖基地；西农萨能奶山羊（SN）血样385份，采自陕西省千阳县羊场。
[0049] 2、基因组DNA的提取
[0050] ①取290μl加入抗凝剂的冷冻或新鲜血液，放入1.5ml离心管中；
[0052] ③加入145μl异丙醇（陈旧血加290μl异丙醇），剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
[0053] 上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时加入样品粘稠不易混匀时可以涡旋震荡15秒混匀，但不可用手剧烈震荡，以免剪切DNA。
[0054] ④将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱VI中，（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；
[0055] ⑤加入725μl抑制物去除IR，12000rpm离心30秒，弃废液；
[0056] ⑥加入750μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
[0057] ⑦加入750μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
[0058] ⑧将吸附柱VI放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0059] ⑨取出吸附柱VI，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加70μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65℃～70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，-20℃保存；
[0060] 注意：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
[0061] 3、DNA池的构建
[0062] （1）浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测
[0063] 选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。
[0064] （2）OD值测定
[0065] 用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
[0066] DNA浓度（μg/mL）=50×OD260值×稀释倍数
[0067] （3）品种DNA池的构建
[0068] DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至80ng/μl～100ng/μl，然后从每个样品中吸取5μl的DNA样品混合构建DNA池。
[0069] 4、PCR扩增引物设计
[0070] 根据GenBank数据库中牛PRLR基因的DNA序列（GenBank No.NC_007318），利用Primer6.0设计引物P1，扩增催乳素受体（PRLR）基因外显子9，筛查奶山羊PRLR基因P1位点的突变；
[0071] 根据GenBank数据库中牛ELF5基因的DNA序列（GenBank No.AC_000172），利用Primer6.0设计引物P2，扩增奶山羊乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1，筛查奶山羊ELF5基因P2位点的突变。
[0072] 所述的引物P1如下：
[0073] 上游引物1F：5'-CTTACCACAACATTGCTGAC-3'；
[0074] 下游引物1R：5'-CCTTGGCTGGATTCTATGG-3';
[0075] 所述的引物P2如下：
[0076] 上游引物2F：5'-CCTCTCCAACCTCAATCAG-3'；
[0077] 下游引物2R：5'-CAGTCCAAGCAGGCAATA-3'；
[0078] 5、PCR扩增
[0079] 分别以单个奶山羊群体的DNA池为模版，利用引物P1和P2分别扩增的催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1，PCR扩增条件及程序如下所示：
[0080] PCR扩增的条件是：
[0081] 15μL反应体系：包括DNA模板50ng，7.5μl2×Taq MasterMix，上下游引物（10μM）各0.25μl，加灭菌水至15μl；
[0082] PCR反应程序如下：
[0083] 1）利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，57.3℃退火30s，72℃延伸32s，共进行33个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
[0084] 2）利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸32s，如此进行33个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；
[0085] 6、PCR产物纯化和测序
[0086] PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1、图2和图3所示，可以清楚看到465bp和430bp的条带，说明目的基因片段扩增成功；
[0087] 然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
[0088] （1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0089] （2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
[0090] （3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
[0091] （4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
[0092] （5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
[0093] （6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。
[0094] （7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。
[0095] （8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。
[0096] 把以上以2个奶山羊群体DNA池为模板的PCR纯化产物送英俊公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，结果表明，所述的催乳素受体（PRLR）基因外显子9在61677bp存在G→A，在61865bp存在G→A的突变，这2个突变分别导致PRLR氨基酸序列的第485处丝氨酸突变为天冬酰胺（Ser→Asn）和第548处的缬氨酸突变为蛋氨酸（Val→Met），所述的乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1在3694bp存在C→G的突变。
[0097] B、利用引物P1和P2扩增得到的奶山羊催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1的3个SNPs的琼脂糖凝胶电泳分析：
[0098] 利用引物P1和P2分别对2个奶山羊品种712份基因组DNA进行PCR扩增，然后利用如下方法对每个奶山羊的催乳素受体（PRLR）基因外显子9和乳蛋白转录因子（ELF5）基因内含子1进行基因分型，具体方法如下：
[0100] C、SNP位点的遗传结构分析
[0101] 基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。多态信息含量（PIC）用来估计标记位点的多态，PIC<0.25为低度多态，0.250.5为高度多态。杂合度（He）是度量某一
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群体中特定位点上等位基因杂合程度的指标。采用皮尔逊χ统计量对某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性进行检测（表1）。
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群体中特定位点上等位基因杂合程度的指标。采用皮尔逊χ统计量对某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性进行检测（表1）。
[0102] 表1：SNP位点的遗传结构
[0103]
[0104] D、奶山羊PRLR基因和ELF5基因聚合效应对产奶性状的影响
[0105] 生产数据：西农萨能奶山羊和关中奶山羊第1、2和3泌乳期的产奶量以及平均乳蛋白率和乳脂率。
[0106] 关联分析模型：
[0108] 在数据处理中，根据影响产奶性状的因素不同，考虑到场效应（Farm）、品种效应（Breed）、种公畜效应（S）、种公畜内母畜间效应（SD）、年龄（Age）、基因型效应（Genotype）及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：
[0109] yijkmnpq=μ+Farmi+Bj+Sp+SDq+Ak+Cm+Xn＋eijkmnpq
[0110] 其中：yijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farmi：场别效应；Bj：品种效应；Sp：种公畜效应；SDq：种公畜内母畜间效应；Ak：年龄效应；Cm：组合基因型效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：F×B，F×A，F×G，B×A，B×C，A×C，B×A×C等；eijkmnpq：随机误差；运用SPSS（16.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各组合基因型间产奶性状进行差异显著性检验。分析结果如表2所示：
[0111]
[0112] C4（GGGGCC）组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）和C2（GAGACG）型个体（P<0.05）；C5（GGGGCG）组合基因型个体第1泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）；C4（GGGGCC）、C5（GGGGCG）和C6（GGGGGG）组合基因型个体第2泌乳期产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）；C4（GGGGCC）和C5（GGGGCG）组合基因型个体第3泌乳期和平均泌乳期的产奶量显著高于C1（GAGACC）型个体（P<0.05）。
因此，通过分析母羊个体的组合基因型与产性状的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成高产奶山羊多基因聚合良种核心群。
因此，通过分析母羊个体的组合基因型与产性状的关系，挑选最佳的基因型组合，分析拥有最佳基因型组合个体的选配方式，应用这些选配方式形成高产奶山羊多基因聚合良种核心群。
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