技术领域
[0001] 本
发明属于牛繁殖领域，具体涉及
奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法。
背景技术
[0002] 体外受精技术是指
哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。应用体外受精方法可充分利用屠宰场废弃的卵巢和优质奶牛的冷冻精液进行胚
胎体外生产，不仅成本低廉，而且效果稳定，不需要对母牛进行超数排卵及
同期发情处理，大大减少工作量、降低生产成本，同时大幅度提高优良种
公畜的利用率，使优良种公畜获得大量的后代，从而扩大其在畜群遗传改良中的作用。
[0003] 然而实际生产中，奶牛饲养成本较高，奶牛的淘汰率偏低，即使淘汰的奶牛也是老弱病残，因此，屠宰场屠宰的奶牛多是老年奶牛或者生病的奶牛，严重影响了体外受精的效果。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于建立一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法，为奶牛胚胎
生物技术的应用提供合理的技术路线，充分发挥高产优质奶牛的遗传潜
力。
[0005] 为了解决
现有技术存在问题，本发明提供如下技术方案：
[0006] 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法，其步骤为：
[0007] (1)将屠宰场采集的黄牛卵巢放入添加双抗的25℃灭菌生理盐
水中恒温保存7h内带回实验室，依次用30℃、35℃无菌生理盐水洗涤，分别洗涤2次后置39℃水浴锅中备用，10毫升一次性
注射器抽吸法获取卵丘-卵母细胞
复合体(COCs)；
[0008] (2)将捡取的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)用提前2h于39℃水浴锅中预热的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS缓冲液洗涤3次，再用提前2h于39℃
培养箱中预热的体外成熟培养液洗涤3次后置于CO2培养箱中进行体外成熟培养，采用五孔板培养，培养浓度：100-150枚/500μL；培养条件39℃,5％CO2，饱和湿度；培养时间22-24h；
[0009] 体外成熟培养液配方：TCM-199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL双抗(即100IU/mL)+10IU/mL人绒毛膜促性腺
激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E2)；
[0010] (3)奶牛冷冻精液用BO液上浮法处理：从液氮罐取细管冻精放入37℃水浴中30～40s快速解冻，用75％酒精消毒后剪开细管，将精子放入含有1mLBO液的离心管中，用移液枪轻轻吹打后，上下颠倒几次后，置于二
氧化
碳培养箱中静置20-30min，使精子上浮，上浮后将上浮的精子离心处理，1500r/min，5min，用BO，液再次离心处理两次，1500r/min，5min；
[0011] BO液的配方：6.55mg/mL
氯化钠+0.3mg/mL氯化
钾+0.249mg/mL氯化
钙+0.0497mg/mL氯化镁+0.0869mg/mL
磷酸二氢钠+3.104mg/mL
碳酸氢钠+2.5mg/mL
葡萄糖+0.055mg/mL丙
酮酸钠+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL
硫酸链霉素；BO，液的配方：BO液+5mM咖啡因+10mg/mL肝素钠+3mg/mLBSA；
[0012] (4)步骤(2)中体外成熟后的卵母细胞经2％透明质酸酶消化脱去卵丘细胞后置于体外受精液BO，中平衡30min；
[0013] (5)步骤(3)中处理好的精子加入含有步骤(4)中卵母细胞的体外受精微滴中，精子的终浓度为3×105个/mL；
[0014] (6)体外受精6h后，用移液器轻轻吹打受精卵，除去浮在受精卵表面的精子，用提前2h于39℃培养箱中预热的体外受精胚胎培养液洗涤三遍后置于培养液中进行培养；培养浓度：50μL的培养滴中培养10-15个受精卵；24h半量换液，7d后可获得囊胚；
[0015] 培养液为CRlaa：114.7mM NaCl、3.1mM KCl、26.2mM NaHCO3、0.4mM
丙酮酸钠、5.0mM乳酸半钙、3mg/mL BSA、1.0mM。
[0016] 本发明所述的奶牛为西蒙塔尔牛。
[0017] 本发明提供的技术方案具有以下特点：
[0018] (1)卵巢于25℃条件下可以恒温保存7小时且不影响获取的COCS的
质量，提高了人力资源的利用率，减少了人力资源上的浪费；
[0019] (2)卵巢处理：采用
温度递增的生理盐水进行洗涤处理。置于25℃生理盐水条件下的卵巢，带回实验室后依次用30℃、35℃无菌生理盐水洗涤，洗涤后的卵巢置于39℃水浴锅中保存，获取的含有COCS的卵泡液置于39℃水浴锅中恒温保存，COCS捡取过程中始终置于39℃热台上，避免了外界
环境温度的变化对卵母细胞体外成熟的影响，保证了卵母细胞的质量及体外成熟效率；
[0020] (3)解冻后的精液，于BO液进入培养箱中上浮之前用移液器轻轻吹打或者轻轻上下颠倒数次精液-BO的
混合液，避免存在精子团，大大提高了体外受精效率，受精卵卵裂率较对照组高。
[0021] 本发明中采用黄牛的卵母细胞来代替奶牛卵母细胞，并且通过技术细节的改进，获得了较好的效果。
附图说明
[0022] 图1为Hoechst 33342
染色的
实施例1步骤(6)中受精后的卵母细胞；
[0023] 图2为囊胚和孵化囊胚；
[0024] 图3为解冻后精子处理方法不同呈现的精子团和单个精子；
具体实施方式
[0025] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0026] 【实施例1】西蒙塔尔牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法
[0027] (1)将屠宰场采集的黄牛卵巢放入添加双抗的25℃灭菌生理盐水中恒温保存7h内带回实验室，依次用30℃、35℃无菌生理盐水洗涤，分别洗涤2次后置39℃水浴锅中备用，10毫升一次性注射器抽吸法获取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；
[0028] (2)将捡取的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)用提前2h于39℃水浴锅中预热的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS缓冲液洗涤3次，再用提前2h于39℃培养箱中预热的体外成熟培养液洗涤3次后置于CO2培养箱中进行体外成熟培养，采用五孔板培养，培养浓度：100-150枚/500μL；培养条件39℃,5％CO2，饱和湿度；培养时间22-24h；
[0029] 体外成熟培养液配方：TCM-199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL双抗(即100IU/mL)+10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E2)；
[0030] (3)西蒙塔尔牛冷冻精液用BO液上浮法处理：奶牛冷冻精液购买于武汉市奶牛改良站，品种为西蒙塔尔奶牛；精子的处理方法：从液氮罐取细管冻精放入37℃水浴中30～40s快速解冻，用75％酒精消毒后剪开细管，将精子放入含有1mLBO液的离心管中，用移液枪轻轻吹打后，上下颠倒2-3次，置于二氧化碳培养箱中静置20-30min，使精子上浮，上浮后将上浮的精子离心处理，1500r/min，5min，用BO，液再次离心处理两次，1500r/min，5min；
[0031] BO液的配方：6.55mg/mL氯化钠+0.3mg/mL
氯化钾+0.249mg/mL
氯化钙+0.0497mg/mL氯化镁+0.0869mg/mL磷酸二氢钠+3.104mg/mL碳酸氢钠+2.5mg/mL葡萄糖+0.055mg/mL丙酮酸钠+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL硫酸链霉素；BO，液的配方：BO液+5mM咖啡因+10mg/mL肝素钠+3mg/mLBSA；
[0032] (4)步骤(2)中体外成熟后的卵母细胞经2％透明质酸酶消化脱去卵丘细胞后置于体外受精液BO，中平衡30min；
[0033] (5)步骤(3)中处理好的精子加入含有步骤(4)中卵母细胞的体外受精微滴中，精子的终浓度为3×105个/mL；
[0034] (6)体外受精6h后，用移液器轻轻吹打受精卵，除去浮在受精卵表面的精子，用提前2h于39℃培养箱中预热的体外受精胚胎培养液洗涤三遍后置于培养液中进行培养；培养浓度：50μL的培养滴中培养10-15个受精卵；24h半量换液，7d后可获得囊胚；
[0035] 培养液为CRlaa：114.7mM NaCl、3.1mM KCl、26.2mM NaHCO3、0.4mM丙酮酸钠、5.0mM乳酸半钙、3mg/mL BSA、1.0mM。
[0036] 【实施例2】Hoechst 33342染色鉴定
[0037] (1)取部分实施例1步骤(6)中受精后的卵母细胞用DPBS洗涤3遍；
[0038] (2)2％透明质酸酶消化脱去卵丘细胞；
[0039] (3)Hoechst 33342避光染色5-7min；
[0040] (4)倒置
显微镜荧光下观察如图1所示，左图为受精后的卵母细胞，右图为在荧光
视野下可见2处发光的小圆点，即为被Hoechst 33342染色的雄原核和雌原核，这表明异种精子体外受精方法可行。
[0041] 【实施例3】囊胚的孵化
[0042] (1)将采集的黄牛卵巢3h内于生理盐水(含双抗)中带回实验室，用抽吸法获取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；
[0043] (2)将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)洗涤后培养22-24h；
[0044] (3)西蒙塔尔牛精液用BO液上浮法处理；
[0045] (4)步骤(2)中成熟后的卵母细胞经消化脱去卵丘细胞；
[0046] (5)步骤(3)中的精子移入受精液中，受精液中含有步骤(4)中的卵母细胞；
[0047] (6)受精6-8h后，经洗涤后培养，24h半量换液；
[0048] (7)培养7d后，观察到囊胚，24h半量换液，结果如图2所示，左图为囊胚，右图为在继续培养时会出现透明带破裂，胚胎从中扩展出来即孵化囊胚。
[0049] 【实施例4】温度递增法洗涤卵巢的对比实验
[0050] 实验设计：实施例1的步骤(1)分成3组后续步骤一样，第1组：25℃恒温生理盐水洗涤卵巢后置入39℃水浴锅中；第2组：生理盐水温度递增法(25℃、30℃、35℃、39℃)洗涤卵巢后置入39℃水浴锅中；第3组：直接用39℃保存用生理盐水洗涤卵巢置入39℃水浴锅中。
[0051] 结果如表1：温度递增式洗涤卵巢，对卵母细胞起到一定的缓冲作用，对获取的卵母
细胞质量影响显著，获取A级COCS的比例较直接用25℃和39℃生理盐水洗涤卵巢高，有显著差异(89.4％vs64.5％vs61.6％)，卵母细胞成熟率也高，差异显著(79.5％vs51.6％vs48.2％)，但是卵裂率并没有显著差异。
[0052] 表1温度递增法洗涤卵巢的对比实验
[0053]
[0054] 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
[0055] 【实施例5】解冻后精子处理方法不同的结果对比实验
[0056] 实验设计：实施例1的步骤(3)分成2组，其与步骤一样，第1组为对照组：精子解冻后直接进行直接置入受精液中于培养箱中上浮；第2组为实验组：精子解冻后置入受精液中用移液枪轻轻吹打后于培养箱中上浮。
[0057] 结果如表2：实验组中用移液器轻轻吹打精子后，受精卵卵裂率高，较对照组差异显著(88.7％vs54.5％)。
[0058] 表2解冻后精子处理方法不同的结果对比实验
[0059]
[0060] 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
[0061] 图3左图显示：精子解冻后置入受精液中，部分精子以精子团的形式存在，加上精子容易抱团的特性，大大降低了精子的可用率，但是经过移液枪轻轻吹打后，精子团中的精子被释放出来，单个精子的比例大幅度提高(如图3右图所示)，大大提高了可用精子的比例，减少了精子的浪费，提高受精率。
[0062] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
