一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法
阅读：728发布：2020-05-18
专利汇可以提供一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用 体细胞 克隆技术培育地方优良 家畜 品种的方法。利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种，通过从家畜群体中筛选出经济性状优良的个体，建立 成 纤维 细胞 系，利用体细胞核移植技术对上述筛选出的个体进行克隆，待克隆出生的个体达到适配年龄后，进行组合杂交，再对每一杂交组合的F1代个体的经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后对相应的父母个体进行淘汰，对留下的后代个体中可以稳定遗传的父母再进行组群，选育出优良家畜品种。通过对本发明的实施，能批量地获得具有极其优良经济性状的家畜个体，实现家畜特有品种资源的可持续开发利用，提高家畜的育种效率和选育的成功率。，下面是一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法，其特征在于，利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种的方法按照以下操作步骤进行：
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有优良性状的家畜个体
（1）获取具有优良性状家畜的耳等组织，建立家畜成纤维细胞系并进行传代培养，做体细胞核移植备用；
（2）收集卵丘-卵母细胞复合体，然后置于成熟培养液中进行成熟培养；
（3）卵母细胞经过体外成熟培养后，用透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将已获得的具有优良性状的家畜成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得克隆重构胚；
（4）选择代孕家畜进行胚胎移植，带自然分娩后批量获得相应的克隆家畜个体；
第二步、克隆家畜个体的杂交选育
在同一批克隆出生的家畜个体中，通过培育后，到达适宜的配种年龄时，让来自不同公畜供体细胞的克隆公畜个体分别与来自不同母畜供体细胞的克隆母畜进行自然杂交，待新生家畜个体出生后，再对每一杂交组合的F1代个体的肉品质或绒毛细度等相关经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后再对相应的父母个体进行淘汰，逐步筛选出符合目的优良性状的家畜个体；
第三步、扩群
对经过第二步筛选后留下的后代个体中可以稳定遗传优良经济性状的父母再进行组群，选育出地方优良家畜品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种的方法，其特征在于：在第一步步骤（2）收集和体外培养卵母细胞中，具体步骤为：从屠宰场收集家畜卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，将卵巢表面2～6mm的卵泡切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，然后置于成熟培养液中进行成熟培养。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种的方法，其特征在于：在第一步步骤（2）中，成熟培养液的组成为：M199、10%FBS、0.1g/L L-半胱氨酸、l0ug/ml FSH、5ug/m1 LH、10ng/ml EGF、1ug/ml 17β-雌二醇、0.075g/L卡拉霉素，培养时间为20～22h。
4.根据权利要求1所述的一种利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种的方法，其特征在于：在第一步步骤（4）中，选取自然发情的家畜作为胚胎移植的代孕家畜，再将经过电融合、化学激活后并培养至囊胚阶段的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管伞第一弯曲部位后进行发育，待代孕家畜妊娠达到预产期时，自然分娩后批量获得相应的克隆家畜个体。
5.根据权利要求1所述的一种利用体细胞克隆技术培育家畜优良品种的方法，其特征在于：在第一步步骤（1）中，具有优良性状家畜成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立中，所用的材料为相应家畜的耳组织。
一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法，属于动物遗传育种与繁殖学领域。
背景技术
[0002] 传统的优良家畜品种选育方法主要是通过选择具有优良性状的公母个体进行不断杂交，在后代中对优良个体进行反复选择，以此获得具有优良性状的目标家畜个体。对于在同一个家畜品种中存在的极少数的特别优良的个体甚至是已经面临着濒危灭绝的珍惜家畜个体，通过传统的选育方法很难实现具有优良品种目标个体的选育，而且面临着品种资源不足、选育周期长、选育成功率低的难题，很不利于优良家畜个体的产业化以及优良家畜品种资源的可持续利用。
[0003] 近几年来，随着家畜育种学的不断发展和进步，新型的细胞工程技术、基因工程技术在动物育种中逐渐浮现，家畜胚胎生物学的研究和应用也取得了巨大的进展，超数排卵、体外胚胎生产、胚胎移植以及性别鉴定、控制等技术日趋变得更加成熟，而动物转基因技术、体细胞克隆技术在家畜育种中也逐渐得到了开发和利用，但也面临着家畜体细胞克隆难度远大于胚胎克隆等的难题、而且克隆胚胎移植后母畜妊娠率低、流产率高, 胎儿和初生家畜个体发育异常、死亡率偏高，这在很大程度上也制约了家畜体细胞克隆技术在家畜优良品种培育中的推广和应用。
[0004] 云南省地方优良肉羊品种总体存在种群小，而且在同一种群中存在个体差异大，优良品种个体少的问题。如云南省的乌骨绵羊因有非常好的药用价值而享誉全国，但由于全省存栏不到2000只，主要分布于兰坪、剑川、永胜、香格里拉等四个县，而肉、骨、血等全身组织器官均呈乌骨的比例不足7%，数量极少。目前一只全乌的乌骨绵羊销售价为1.5～2.0万元，而且全国市场需求在1万只以上，如果只靠传统的繁育手段短期内解决不了市场的需求内蒙古二狼山白绒山羊属内蒙古绒山羊一个品种类型，是中国羊绒品质最优的绒山羊之一，已被列入国家首批发布的动物遗传资源一级保护名录（冯美玲等，2010）。其主要分布在内蒙古自治区西部地区的荒漠和半荒漠草原，具有较强的适应性和抗病性。以其羊绒纤维细、光泽好、强度大、纤维长、手感柔软、净绒率高等优良品质而出名，属于我国重要的绒用经济动物。近年来，随着绒毛市场对毛品质和需求量的急剧增加，改良绒山羊品种，增加绒毛的产量和质量显得尤为重要（阎思进，冯平，李福贵，2016）。但是，由于山羊绒收购没有体现以质论价、优质优价，为提高山羊个体的产绒量，牧民近年来引进一些产绒量高但细度差的绒山羊种羊，与当地绒山羊品种杂交，产绒量显著增加，而绒质量却大幅下降（李福贵，徐绚绚，2012），细度作为山羊绒品质的重要指标，在各个地区、各个山羊品种的羊绒细度逐年变粗（田文亮，2015），山羊绒平均直径由2004年的15.25µm增加到2010年的15.85µm（李福贵，徐绚绚，2012），羊绒产业的资源优势出现弱化。2015年在内蒙古自治区西部阿拉善右旗、以及巴彦淖尔市杭锦后旗等地区，发现了少数羊绒细度较细的二狼山绒山羊，其羊绒细度从12.8µm到13.89µm，属于细度较细、经济价值较好的羊绒。这些个体为选育出羊绒细度较细的二狼山绒山羊提供了良好的材料。然而，目前羊的培育方法主要是以传统的“杂交-横交固定-选育提高”的杂交育种模式为主（谭晓山，李冰等，2015），且品种优良的二狼山绒山羊数目不多又分散于不同的地区和不同的羊群中，这就在一定程度上制约了杂交育种改良的步伐。同时，也有很多时候这些优良品种在发现时，大多数个体的年龄较大，已不宜用于自然繁殖，有的甚至已经死亡，如果采取传统的保种方式，很可能导致这一优良品种的最终消亡。
发明内容
[0005] 为针对以上技术问题，本发明提供了一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法，利用体细胞克隆技术对在同一个家畜品种中存在的极少数特别优良的家畜个体进行批量克隆，经过对克隆个体的不断杂交筛选、淘汰，成功批量地获得了具有特别优良性状的家畜个体，该方法技术实用可靠，家畜个体的遗传性状和表型较稳定、培育周期较短、资源投入低、能高效批量生产遗传和表型稳定的基因修饰猪个体，便于建立新型家畜优良品种的培育模式，实现优良家畜品种的可持续开发和利用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法，利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法按照以下操作步骤进行：
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有优良性状的家畜个体
（1）获取具有优良性状家畜的耳等组织，建立家畜成纤维细胞系并进行传代培养，做体细胞核移植备用；
（2）从屠宰场收集家畜卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，将卵巢表面2～6mm的卵泡快速切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，然后置于成熟培养液中进行成熟培养；
（3）卵母细胞经过体外成熟培养后，用透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将已获得的具有优良性状的家畜成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得克隆重构胚；
（4）选取自然发情的家畜作为胚胎移植的代孕家畜，再将经过电融合、化学激活后并培养至囊胚阶段的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管伞第一弯曲部位后进行发育，待代孕家畜妊娠达到预产期时，自然分娩后批量获得相应的克隆家畜个体；
第二步、克隆家畜个体的杂交选育
在同一批克隆出生的家畜个体中，通过一定时期的培育后，到达适宜的配种年龄时，让来自不同公畜供体细胞的克隆公畜个体分别与来自不同母畜供体细胞的克隆母畜进行自然杂交，待新生家畜个体出生后，再对每一杂交组合的F1代个体的肉品质或绒毛细度等相关经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后再对相应的父母个体进行淘汰，逐步筛选出符合目的优良性状的家畜个体。
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有优良性状的家畜个体
（1）获取具有优良性状家畜的耳等组织，建立家畜成纤维细胞系并进行传代培养，做体细胞核移植备用；
（2）从屠宰场收集家畜卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，将卵巢表面2～6mm的卵泡快速切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，然后置于成熟培养液中进行成熟培养；
（3）卵母细胞经过体外成熟培养后，用透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将已获得的具有优良性状的家畜成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得克隆重构胚；
（4）选取自然发情的家畜作为胚胎移植的代孕家畜，再将经过电融合、化学激活后并培养至囊胚阶段的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管伞第一弯曲部位后进行发育，待代孕家畜妊娠达到预产期时，自然分娩后批量获得相应的克隆家畜个体；
第二步、克隆家畜个体的杂交选育
在同一批克隆出生的家畜个体中，通过一定时期的培育后，到达适宜的配种年龄时，让来自不同公畜供体细胞的克隆公畜个体分别与来自不同母畜供体细胞的克隆母畜进行自然杂交，待新生家畜个体出生后，再对每一杂交组合的F1代个体的肉品质或绒毛细度等相关经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后再对相应的父母个体进行淘汰，逐步筛选出符合目的优良性状的家畜个体。
[0007] 第三步、扩群对经过第二步筛选后留下的后代个体中可以稳定遗传优良经济性状的父母再进行组群，选育出地方优良家畜品种。
[0008] 进一步，作为优选，在第一步具有优良性状家畜成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立中，所用的材料为相应家畜的耳等组织。
[0009] 进一步，作为优选，第三步中，重构胚的供体细胞所用的材料是用家畜胎儿建立的成纤维细胞。
[0010] 进一步，作为优选，在第一步步骤（2）收集和体外培养卵母细胞中，具体步骤为：从屠宰场收集家畜卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，将卵巢表面2～6mm的卵泡切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，然后置于成熟培养液中进行成熟培养。
[0011] 进一步，作为优选，在第一步步骤（4）中，选取自然发情的家畜作为胚胎移植的代孕家畜，再将经过电融合、化学激活后并培养至囊胚阶段的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管伞第一弯曲部位后进行发育，待代孕家畜妊娠达到预产期时，自然分娩后批量获得相应的克隆家畜个体。
[0012] 进一步，作为优选，在第一步步骤（4）中，重构胚需在电压参数为150V/mm、25us、2DC下进行融合，其中，电融合液的组成为：3mol/L的山梨醇、1mmol/L硫酸镁、5uM/L氯化钙、
0.05% BSA，随后移入激活液中进行激活；用5μM离子霉素作用5min后移入预先平衡好的含
2mM 6DMAP的胚胎培养液中继续激活培养。
0.05% BSA，随后移入激活液中进行激活；用5μM离子霉素作用5min后移入预先平衡好的含
2mM 6DMAP的胚胎培养液中继续激活培养。
[0013] 本发明的有益效果：本发明利用体细胞克隆技术培育的地方优良家畜的品种，在一定程度上克服了在家畜现有的传统选育方法中存在的选育周期长、资金、资源等投入大、选育成功率低的难题，同时也打破了家畜体细胞克隆技术在家畜育种与繁殖学领域中应用不充分的瓶颈。
[0014] 在本发明中不断地优化克隆技术，使家畜体细胞克隆效率最大化，能够对在同一个家畜品种中存在的极少数的特别优良性状的个体进行批量克隆，使极其优良的家畜个体数量扩大，最大限度地保持家畜遗传和表型的稳定性，同时在克隆家畜后代个体中通过杂交选配的方法使家畜优良品种不断地向着基因型纯合的方向转化，批量地获得具有特别优良性状的家畜个体，实现家畜特有品种资源的可持续开发利用，大大缩短了家畜的育种年限，加速了家畜的育种进程，提高了家畜的育种效率，使之在生产实践中创造更大的经济效益。附图说明
[0015] 图1为本发明的流程示意图；图2为克隆个体间杂交组合示意图。
具体实施方式
[0016] 下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017] 实施例1如图1、2所示，一种利用体细胞克隆技术培育云南兰坪乌骨绵羊的方法，具体操作过程按以下步骤进行：
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有优良肉质性状的乌骨绵羊个体
（1）获取具有优良肉质性状乌骨绵羊的耳等组织，建立乌骨绵羊成纤维细胞系并进行传代培养，作体细胞核移植备用。
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有优良肉质性状的乌骨绵羊个体
（1）获取具有优良肉质性状乌骨绵羊的耳等组织，建立乌骨绵羊成纤维细胞系并进行传代培养，作体细胞核移植备用。
[0018] 选取具有优良肉质性状的云南兰坪乌骨绵羊，用酒精擦拭耳部进行消毒，尽量挑选耳组织上血管较细少的部位，用手术剪取一块乌骨绵羊的耳组织，保存于含有5% Pencillin-Streptomycin Solution的DMEM中，置于碎冰中并立即运回实验室，在超净工作台上，置于无菌的培养皿中，然后用含5% Pencillin-Streptomycin Solution的PBS充分清洗3遍，并用无菌的手术刀片充分刮去毛，再用无菌PBS清洗1遍后去除Pencillin-Streptomycin Solution后用眼科剪充分剪碎，转移至T-25培养瓶中并加入4ml 0.1%的胶原蛋白酶放入37℃、5% CO2的培养箱中消化约4h后用DMEM洗3遍，再将消化清洗后的细胞悬液全部转入到T-75培养瓶中，加入10ml含10%FBS的DMEM并放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养并传代。
[0019] （2）羊卵母细胞的准备从当地屠宰场收集的羊卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，用灭菌手术刀片快速将卵巢表面2～6mm 的卵泡切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，选择胞质均含2 层以上颗粒细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体，在D-PBS中清洗3次，再用预先平衡2h的成熟液M199冲洗
2次，然后置于预先在37.5℃、5%CO2、饱和湿度平衡2小时的卵母细胞成熟培养液：M199、10% FBS、0.1g/L L-半胱氨酸、l0ug/ml FSH、5ug/m1 LH、10ng/ml EGF、1ug/ml 17β-雌二醇、
0.075g/L卡拉霉素培养20～22h。
2次，然后置于预先在37.5℃、5%CO2、饱和湿度平衡2小时的卵母细胞成熟培养液：M199、10% FBS、0.1g/L L-半胱氨酸、l0ug/ml FSH、5ug/m1 LH、10ng/ml EGF、1ug/ml 17β-雌二醇、
0.075g/L卡拉霉素培养20～22h。
[0020] （3）重构胚的构建卵母细胞经过体外成熟培养后，用含0.1%透明质酸酶的H199消化颗粒细胞，选择胞质完好且均匀排出第一极体的卵母细胞，置于含5ug/m1细胞松弛素B（CB）的10%FBS的H199中进行去核和导入已获得的具有优良性状的云南兰坪乌骨绵羊成纤维供体体细胞，获得重构胚。构建好的重构胚移入3mol/L的山梨醇、1mmol/L硫酸镁、5uM/L氯化钙、1mmol/L 0.05%BSA中平衡1分钟，在电压参数为150V/mm、25us、2DC下融合。随后移入培养液中培养1.5h，进行化学激活后继续培养。
[0021] （4）胚胎移植及具有优良性状乌骨绵羊个体的获取选取自然发情的普通羊作为胚胎移植的代孕母羊，再将激活后培养2～48小时的胚胎通过外科手术移植到经过同期发情处理后的普通羊两侧近输卵管伞的第一弯曲部。移植30～50d左右用B超检测妊娠情况，待代孕家畜妊娠到一定时期时，自然分娩后获得相应的克隆乌骨绵羊个体。
[0022] 第二步、克隆乌骨绵羊个体的杂交选育在同一批克隆出生的乌骨绵羊个体中，通过一定时期的培育后，到达适宜的配种年龄时，让来自不同公乌骨绵羊供体细胞的克隆公乌骨绵羊个体分别与来自不同母乌骨绵羊供体细胞的克隆母乌骨绵羊进行自然杂交，待新生乌骨绵羊个体出生后，再对每一杂交组合的F1代乌骨绵羊个体的肉品质等相关经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后再对相应的父母个体进行淘汰，逐步筛选出符合目的优良性状的乌骨绵羊个体。
[0023] 第三步、组群对经过第二步筛选后留下的后代个体中可以稳定遗传优良经济性状的父母进行组群繁殖，选育出地方优良乌骨绵羊品种。
[0024] 实施例2如图1、2所示，一种利用体细胞克隆技术培育内蒙古二狼山白绒山羊的方法，具体操作过程按以下步骤进行：
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有羊绒细度较细的内蒙古二狼山白绒山羊个体（1）获取羊绒细度较细的内蒙古二狼山白绒山羊的耳等组织，建立乌骨绵羊成纤维细胞系并进行传代培养，作体细胞核移植备用。
第一步、利用体细胞克隆技术获得具有羊绒细度较细的内蒙古二狼山白绒山羊个体（1）获取羊绒细度较细的内蒙古二狼山白绒山羊的耳等组织，建立乌骨绵羊成纤维细胞系并进行传代培养，作体细胞核移植备用。
[0025] 选取具有优良羊绒性状云南兰坪乌骨绵羊，用酒精擦拭耳部进行消毒，尽量挑选耳组织上血管较细少的部位，用手术剪取一块内蒙古二狼山白绒山羊的耳组织，保存于含5% Pencillin-Streptomycin Solution的DMEM中，置于碎冰中并立即运回实验室，在超净工作台上，置于无菌的培养皿中，然后用含5% Pencillin-Streptomycin Solution的PBS充分清洗3遍，并用无菌的手术刀片充分刮去毛，再用无菌PBS清洗1遍后去除Pencillin-Streptomycin Solution后用眼科剪充分剪碎，转移至T-25培养瓶中并加入4ml 0.1%的胶原蛋白酶后放入37℃、5% CO2的培养箱中消化约4h，后用DMEM洗3遍，再将消化清洗后的细胞悬液全部转入到T-75培养瓶中，加入10ml含10%FBS的DMEM并放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养并传代。
[0026] （2）羊卵母细胞的准备从当地屠宰场收集的羊卵巢，保存于适温生理盐水中并在4h内运送回实验室，剪去卵巢系膜，用温生理盐水冲洗3遍，然后放入含50ug/ml肝素的PBS液里，用灭菌手术刀片快速将卵巢表面2～6mm 的卵泡切开，收集卵丘-卵母细胞复合体，选择胞质均含2 层以上颗粒细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体，在D-PBS中清洗3次，再用预先平衡2h的成熟液M199冲洗
2次，然后置于预先在37.5℃、5%CO2、饱和湿度平衡2h的卵母细胞成熟培养液：M199、10% FBS、0.1g/L L-半胱氨酸、l0ug/ml FSH、5ug/m1 LH、10ng/ml EGF、1ug/ml 17β-雌二醇、
0.075g/L卡拉霉素培养20～22h。
2次，然后置于预先在37.5℃、5%CO2、饱和湿度平衡2h的卵母细胞成熟培养液：M199、10% FBS、0.1g/L L-半胱氨酸、l0ug/ml FSH、5ug/m1 LH、10ng/ml EGF、1ug/ml 17β-雌二醇、
0.075g/L卡拉霉素培养20～22h。
[0027] （3）重构胚的构建卵母细胞经过体外成熟培养后，用含0.1%透明质酸酶的H199消化颗粒细胞，选择胞质完好且均匀排出第一极体的卵母细胞，置于含5ug/m1细胞松弛素B（CB）的10%FBS的H199中进行去核和导入已获得的具有优良羊绒性状的内蒙古二狼山白绒山羊成纤维供体体细胞，获得重构胚，构建好的重构胚移入3mol/L的山梨醇、1mmol/L硫酸镁、5uM/L氯化钙、1mmol/L
0.05%BSA中平衡1分钟，在电压参数为150V/mm、25us、2DC下融合。随后移入培养液中培养
1.5h，进行化学激活后继续培养。
0.05%BSA中平衡1分钟，在电压参数为150V/mm、25us、2DC下融合。随后移入培养液中培养
1.5h，进行化学激活后继续培养。
[0028] （4）胚胎移植及具有优良羊绒性状内蒙古二狼山白绒山羊个体的获取选取自然发情的普通羊作为胚胎移植的代孕母羊，再将激活后培养2～48小时的胚胎通过手术法移植到经过同期发情处理后的普通羊两侧近输卵管伞的第一弯曲部。移植后30～50d左右用B超检测妊娠情况，待代孕家畜妊娠到一定时期时，自然分娩后获得相应的克隆内蒙古二狼山白绒山羊个体。
[0029] 第二步、克隆内蒙古二狼山白绒山羊个体的杂交选育在同一批克隆出生的内蒙古二狼山白绒山羊个体中，通过一定时期的培育后，到达适宜的配种年龄时，让来自不同公二狼山白绒山羊供体细胞的克隆公二狼山白绒山羊个体分别与来自不同母二狼山白绒山羊供体细胞的克隆母二狼山白绒山羊进行自然杂交，待新生二狼山白绒山羊个体出生后，再对每一杂交组合的F1代二狼山白绒山羊个体的羊绒等相关经济性状进行鉴定，对达不到选育标准的F1代个体父母，查明是父代还是母代遗传引起的性状，然后再对相应的父母个体进行淘汰，逐步筛选出符合目的优良性状的二狼山白绒山羊个体。
[0030] 第三步、组群对经过第二步筛选后留下的后代个体中可以稳定遗传优良经济性状的父母进行组群繁殖，选育出具有地方优良羊绒性状内蒙古二狼山白绒山羊品种。
[0031] 本实施例中卵母细胞的准备、重构胚的构建中等关键技术参数针对内蒙古二狼山白绒山羊进行限定和优化，在这个参数的选择下，能够在家畜群体中选择具有优良性状的极少数家畜个体进行体细胞克隆，能够批量地获得具有目标优良性状的家畜个体，并且，能够大大提高了家畜品种选育的成功率，缩短了家畜育种的年限，最大限度地保持了家畜优良品种资源的遗传稳定性，使家畜中的具有优良性状的极少数家畜个体品种得以可持续开发利用。
[0032] 本发明利用体细胞克隆技术培育的地方优良家畜的品种，在一定程度上克服了在家畜现有的传统选育方法中存在的选育周期长、资金、资源等投入大、选育成功率低的难题，同时也打破了家畜体细胞克隆技术在家畜育种与繁殖学领域中应用不充分的瓶颈。在本发明中不断地优化克隆技术，使家畜体细胞克隆效率最大化，能够对在同一个家畜品种中存在的极少数的特别优良性状的个体进行批量克隆，使极其优良的家畜个体数量最大化，最大限度地保持家畜遗传和表型的稳定性，同时在克隆家畜后代个体中通过杂交选配的方法使家畜优良品种不断地向着基因型纯合的方向转化，批量地获得具有特别优良性状的家畜个体，实现家畜特有品种资源的可持续开发利用，大大缩短了家畜的育种年限，加速了家畜的育种进程，提高了家畜的育种效率，使之在生产实践中创造更大的经济效益。
[0033] 最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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