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貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法

阅读：10发布：2020-05-13

专利汇可以提供貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法。该二联灭活疫苗有效成分包括重组杆状病毒RDPV-SN1株转染 Sf9细胞培养获得的貉细小病毒VP2蛋白和犬瘟热病毒灭活抗原；本发明针对貉犬瘟热、细小病毒二联活疫苗存在毒力返强风险，而市场上使用的二联灭活疫苗普遍存在貉细小病毒灭活后免疫效力较低问题，提供了一种由貉细小病毒VP2蛋白与病毒含量较高的犬瘟热病毒灭活抗原制备的二联灭活疫苗。该二联苗可同时应用于貉细小病毒性肠炎和犬瘟热两种疾病的预防，具有免疫原性好、安全性高、可控性强、培养效率和自动化程度高、可规模化生产等优势，可达到“一针两防”目的，具有广阔的应用前景。，下面是貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的有效成分包括重组杆状病毒RDPV-SN1株表达的貉细小病毒VP2蛋白、犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原、氢氧化铝胶佐剂；
所述该疫苗用于预防貉犬瘟热和细小病毒性肠炎。
2.如权利要求1所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于所述的貉细小病毒VP2蛋白是由表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株转染Sf9细胞，培养至细胞出现感染获得，该株病毒被命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株，已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17685。
3.如权利要求1所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于所述犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原是由犬瘟热病毒CDV-11株经BEI灭活后获得，该毒株已于2009年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3201。
4.如权利要求1，2所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于的表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建包含如下步骤：
(1)转移载体的构建：在pVL1393载体上添加蜂毒素信号肽(HBM)以及β-肌动蛋白绝缘子(HS4)序列，构建转移载体pVL-HBM-HS4；
(2)重组转移载体的构建：提取貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因，将提取的VP2基因(SEQ ID No:3)克隆至转移载体pVL-HBM-HS4中，获得重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2；
(3)重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建：将重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组DNA共转染Sf9细胞，获得表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株。
5.根据权利要求1所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法包括以下步骤：
(1)貉细小病毒VP2蛋白：选择生长旺盛的Sf9细胞接种细胞培养罐进行全悬浮培养，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，27℃培养。当细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×106～3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养
72～96h，收获细胞培养物，向其中加入2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活
48h，对1％猪红细胞血凝效价≥1:2048，然后向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得貉细小病毒VP2蛋白；
(2)犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原：选择生长旺盛的Vero细胞接种细胞培养罐进行微
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载体悬浮培养，当细胞培养罐中Vero细胞密度达到2.0×10～2.5×10个细胞/ml时，按MOI＝0.1接种CDV-11株犬瘟热病毒，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯去除细胞碎片，收获细胞培养物，犬瘟热病毒含量应不低于107.5TCID50/ml；向收获的细胞培养物中加入
2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活48h，然后向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原；
(3)将步骤(1)获得的貉细小病毒VP2蛋白稀释至对1％猪红细胞血凝效价不低于1:
256，与步骤(2)获得的犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原按适当比例混合均匀，与灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌后即成。

说明书全文

貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

[0002] 貉细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属貉细小病毒引起的急性、高度接触性传染病。目前貉细小病毒性肠炎广泛存在于世界各个国家，该病主要引起貉的肠炎，死亡率可达30％～60％。

[0003] 犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可成慢性、持续性感染，临床症状以双相体温升高、伴有卡他性肺炎、胃肠炎为主要特征，偶有神经症状出现，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80％，是危害我国毛皮动物养殖业的最严重的疫病之一。貉犬瘟热全年任何季节都能够发生，尤其是仔貉在断乳前后以及育成期更加敏感，具有非常高的发病率和死亡率。

[0004] 由于貉犬瘟热和细小病毒性肠炎具有发病急、缺乏特效治疗方法的特点，目前仍以疫苗接种作为主要的防控手段。

[0005] 目前市场上无貉专用的犬瘟热、细小病毒性肠炎疫苗销售，很多养殖户使用替代疫苗，无法取得较好的免疫保护效果，因此，往往需要对貉进行二次免疫，既提高了成本，又加大了养殖户的工作量，同时引起貉子较大的应激反应。且犬瘟热疫苗多为活苗，存在毒力返强的风险；细小病毒性肠炎制备的疫苗主要为全病毒灭活疫苗或活疫苗，灭活疫苗免疫原性较差，活疫苗存在毒力返强的风险。

[0006] 因此，貉细小病毒杆状病毒载体、犬瘟热二联灭活疫苗的研制迫在眉睫，可有效控制貉犬瘟热和细小病毒性肠炎，实现“一针两防”目的。

发明内容

[0007] 我们从临床疑似貉细小病料中分离出一株貉细小病毒，并成功扩增出该貉细小病毒VP2基因，我们采用昆虫细胞杆状病毒——苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒表达系统构建了表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，转染SF9细胞，培养并获得病毒样颗粒，该病毒样颗粒具有良好的免疫原性、安全性；我公司分离的犬瘟热自然弱毒株CDV-11株，经悬浮培养，病毒含量在107.5TCID50/ml以上，经灭活后，仍对貉子具有较好的免疫原性，灭活后安全性高。

[0008] 本发明的目的是提供一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法，以应对目前貉细小病毒性肠炎和犬瘟热流行形势。

[0009] 本发明的技术方案

[0010] 1.一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的有效成分包括重组杆状病毒RDPV-SN1株表达的貉细小病毒VP2蛋白、犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原、氢氧化铝胶佐剂；所述该疫苗用于预防貉犬瘟热和细小病毒性肠炎。

[0011] 2.本发明所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于所述的貉细小病毒VP2蛋白是由表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株转染Sf9细胞，培养至细胞出现感染获得，该毒株被命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株，已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17685。

[0012] 3.本发明所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于所述犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原是由犬瘟热病毒CDV-11株经BEI灭活后获得，该毒株已于2009年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3201。

[0013] 4.本发明所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于的表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建包含如下步骤：

[0014] (1)转移载体的构建：在pVL1393载体上添加蜂毒素信号肽(HBM)以及β-肌动蛋白绝缘子(HS4)序列，构建转移载体pVL-HBM-HS4；

[0015] (2)重组转移载体的构建：提取貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因，将提取的VP2基因(SEQ ID No:3)克隆至转移载体pVL-HBM-HS4中，获得重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2；

[0016] (3)重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建：将重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组DNA共转染Sf9细胞，获得表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株。

[0017] 5.本发明所述貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法包括以下步骤：

[0018] (1)貉细小病毒VP2蛋白：选择生长旺盛的Sf9细胞接种细胞培养罐进行全悬浮培养，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，27℃培养。当细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×106～3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，向其中加入2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活48h，对1％猪红细胞血凝效价≥1:2048，然后向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得貉细小病毒VP2蛋白；

[0019] (2)犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原：选择生长旺盛的Vero细胞接种细胞培养罐进行微载体悬浮培养，当细胞培养罐中Vero细胞密度达到2.0×106～2.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.1接种CDV-11株犬瘟热病毒，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯去除7.5
细胞碎片，收获细胞培养物，犬瘟热病毒含量应不低于10 TCID50/ml；向收获的细胞培养物中加入2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活48h，然后向细胞培养物中添加
50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原；

[0020] (3)将步骤(1)获得的貉细小病毒VP2蛋白稀释至对1％猪红细胞血凝效价不低于1:256，与步骤(2)获得的犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原按适当比例混合均匀，与灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌后即成。

[0021] 本发明有益效果

[0022] 本发明一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法。本发明涉及的一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗的制备，关键在于利用昆虫细胞杆状病毒——苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒表达系统构建了表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，并利用悬浮培养的生产工艺生产表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒和犬瘟热病毒(自然弱毒株)，经灭活后，与氢氧化铝胶混合制备二联苗。该二联苗可同时用于貉细小病毒性肠炎和犬瘟热两种疾病的预防，具有安全性和免疫原性好，适合大规模产业化生产的优点。

[0023] 本发明制备的貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗采用悬浮培养的生产工艺，具有培养病毒含量高、无需混合、批间差异小、培养方式自动化、无需大量生产人员、培养需求面积小、污染小、成本低等优点，成功解决了转瓶培养生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题，是疫苗制备中首选的生产工艺。

[0024] 本发明的貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗经安全性试验结果表明，对2月龄以上貉子单剂量接种(1ml/只)、单剂量重复接种和超剂量接种(3.0ml/只)，接种后观察21日，貉子均健活，精神、饮食、粪便均正常，无其他异常临床症状；剖检，各脏器均正常，均无病变，即该二联灭活疫苗对貉子安全。效力试验表明，单剂量接种疫苗后，免疫后14日貉细小病毒HI抗体即达到保护性水平；免疫后21日，貉犬瘟热病毒中和抗体达到保护性水平以上；且免疫后6个月，免疫貉子仍具有对犬瘟热病毒、细小病毒100％的抵抗力。疫苗的免疫期定为6个月，保存期为2～8℃18个月。

[0025] 本发明涉及的微生物菌种资源信息

[0026] 本发明的一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其制备用毒株为表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株，被命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株，该毒株已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17685；犬瘟热病毒CDV-11株已于2009年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3201(参见CN101612396B)。附图说明

[0027] 图1是貉细小病毒VP2基因PCR扩增结果图中：1为貉细小病毒VP2基因扩增产物；2为空白对照；M为DL2000Marker。

[0028] 图2是菌落PCR验证VP2基因连接到pVL-HBM-HS4载体图中：1-3为3个不同菌落PCR电泳结果；4为空白对照；M为DL2000Marker。

具体实施方式

[0029] 1.重组杆状病毒RDPV-SN1株构建

[0030] (1)貉细小病毒RDPV-SN1株分离取发病貉肠内容物加入适量的生理盐水，加入约总量1/3的氯仿，充分振荡15min，3000r/min离心30min，取上清，过滤除菌，按照MOI为0.1～0.4接种F81细胞上，细胞贴壁后换含2％新生牛血清的MEM培养液，37℃培养96～120h，观察细胞病变，当出现拉网、脱落的典型细小病毒细胞病变时收获，冻存于-20℃。

[0031] 将分离的貉细小病毒RDPV-SN1株接种于长成80％单层的F81细胞中，37℃培养72～120h，75％以上病变后，冻融收获。

[0032] (2)貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因扩增貉细小病毒RDPV-SN1株DNA为模板，以VP2-F，VP2-R作为引物进行PCR扩增，根据GenBank上公布的RDPV VP2基因序列设计引物：

[0033] VP2-F：5’-aatgaattca gtgatggagc agttcaacc(EcoRⅠ)-3’29(序列1)[0034] VP2-R：5’-atgggtacct taatataatt ttctaggtg(KpnⅠ)-3’29(序列2)[0035] 结果扩增出1755bp大小的目的条带，与预期结果相符，凝胶电泳结果见图1。扩增片段如下(序列3)：

[0036]

[0037] (3)转移载体pMD19-VP2构建与鉴定将纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，将培养菌液浓缩后涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养16h，挑取平板上的菌落培养后进行菌落PCR鉴定，结果扩增出1.7kb大小的目的条带。测序，结果为1755bp，序列如SEQ ID NO:3所示。表明貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因成功克隆到pMD19-T载体上。将克隆有貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因的pMD19-T质粒命名为pMD-VP2。

[0038] (4)转移载体pVL-HBM构建与鉴定

[0039] 以pMD19-HBM质粒作为模板，HBM-F、HBM-R作为引物进行HBM基因PCR扩增。引物序列为：

[0040] HBM-F：5’-agcggatcca aaccatgaaa ttc-3’(BamHⅠ)23(序列4)

[0041] HBM-R：5’-ataagatctg catgcggtac ccc-3’(PstⅠ)23(序列5)

[0042] 获得HBM基因扩增PCR产物，目的条带大小为170bp。用限制性内切酶BamHⅠ/PstⅠ对HBM基因扩增产物和质粒pVL1393进行酶切，经凝胶电泳后分别回收纯化，使用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞。将转化产物接种含有Amp的LB液体培养基，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定。将鉴定正确菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。

[0043] 所述HBM基因PCR扩增体系为：25μl，其组成为：pMD19-HBM质粒1μl，2×Pfu PCR MasterMix 10μl，2×Taq PCR MasterMix 2.5μl，上下游引物1μl，ddH2O 9.5μl；所述PCR扩增反应条件为：94℃5min；95℃45min，60℃45min，72℃30min，30个循环；72℃10min，4℃保藏。

[0044] 所述HBM基因酶切反应体系为：50μl，其组成为：HBM基因PCR产物胶回收的DNA片段10μl，反应Buffer 5μl，BamHⅠ酶2μl，PstⅠ酶2μl，ddH2O 31μl。

[0045] 所述pVL1393质粒酶切反应体系为：50μl，其组成为：pVL1393质粒5μl，反应Buffer 5μl，BamHⅠ酶2μl，PstⅠ酶2μl，ddH2O 36μl。

[0046] 所述HBM基因与pVL1393质粒连接体系为：酶切HBM基因PCR产物6μl，酶切pVL1393质粒2μl，反应Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl。

[0047] (5)转移载体pVL-HBM-HS4构建与鉴定

[0048] 以pMD19-HS4质粒作为模板，HS4-F，HS4-R作为引物进行HS4基因PCR扩增。引物序列为：

[0049] HS4-F：5’-atatacgtag agctcacggg gacagccccc ccccaaag(SnaBⅠ)-3’38(序列6)[0050] HS4-R：5’-acatacgtaa atattctcac tgactccgtc ctggagtt(SnaBⅠ)-3’38(序列7)[0051] 获得HS4基因扩增PCR产物，目的条带大小约1.3kb。用限制性内切酶SnaBⅠ对HS4基因扩增产物和质粒pVL-HBM进行酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后将目的片段与pVL-HBM载体连接，转化DH5α感受态细胞。将转化产物接种含有Amp的LB液体培养基，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定。将鉴定正确菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。

[0052] 所述HS4基因PCR扩增体系为：25μl，其组成为：pMD19-HS4质粒1μl，2×Pfu PCR MasterMix 10μl，2×Taq PCR MasterMix 2.5μl，上下游引物1μl，ddH2O 9.5μl；所述PCR扩增反应条件为：94℃5min；95℃45min，60℃45min，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保藏。

[0053] 所述HS4基因酶切反应体系为：50μl，其组成为：HS4基因PCR产物胶回收的DNA片段10μl，反应Buffer 5μl，SnaBⅠ酶2μl，碱性磷酸酶1μl，ddH2O 32μl。

[0054] 所述pVL-HBM质粒酶切反应体系为：50μl，其组成为：pVL-HBM质粒5μl，反应Buffer5μl，SnaBⅠ酶2μl，碱性磷酸酶1μl，ddH2O 32μl。

[0055] 所述HS4基因与pVL-HBM质粒连接体系为：酶切HS4基因PCR产物6μl，酶切pVL-HBM质粒2μl，反应Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl。

[0056] (6)转移载体pVL-HBM-HS4-VP2构建与鉴定

[0057] 将转移载体pVL-HBM-HS4与pMD-VP2质粒分别用EcoRⅠ/KpnⅠ37℃酶切3h，酶切产物凝胶电泳后回收、纯化。将酶切纯化的pVL-HBM-HS4质粒和酶切纯化的VP2基因使用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞。将转化产物接种含有Amp的LB液体培养基，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，约1.7kb处出现目的条带。具体结果见图2。将鉴定正确菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。

[0058] 所述质粒pVL-HBM-HS4与pMD-VP2酶切反应体系均为：50μl，其组成为：质粒5μl，反应Buffer 5μl，EcoRⅠ酶2μl，KpnⅠ2μl，ddH2O 36μl。

[0059] 所述pVL-HBM-HS4质粒与pMD-VP2质粒连接体系为：酶切产物VP2基因6μl，酶切质粒pVL-HBM-HS4 2μl，反应Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl。

[0060] (7)重组杆状病毒的转染与纯化

[0061] 1)转染将成功构建的转移载体pVL-HBM-HS4-VP2与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒基因组DNA共转染Sf9细胞，27℃培养至第3日开始出现细胞病变，第5日时收获细胞培养物上清。

[0062] 2)蚀斑纯化将收获的重组杆状病毒进行蚀斑纯化。在直径为6cm的细胞培养皿中接种2.0×106～2.5×106个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释(稀释度：10-4～10-7)上述共转染病毒上清，每一个培养皿中接种1.0ml不同稀释度的病毒液，室温放置1h，使病毒充分感染细胞。无菌水配制2％琼脂糖，添加1体积的2×Grace培养基，混合均匀。弃细胞培养皿中培养液上清，在细胞表面覆盖4.0ml 1％琼脂糖，琼脂糖凝固后将培养皿放置在湿润环境中，27℃培养7日，观察蚀斑。挑取培养皿上单个蚀斑琼脂块接种SF-SFM无血清培养基，4℃摇晃过夜，收获培养物，接种Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，即为重组杆状病毒RDPV-SN1株F0代病毒液，该重组杆状病毒被命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株，已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17685。

[0063] 2.重组杆状病毒RDPV-SN1株鉴定

[0064] (1)病毒继代将Sf9细胞密度稀释至2.0×106个细胞/ml，接种F0代重组杆状病毒RDPV-SN1株，置27℃恒温摇床培养，转速为100～105r/min。培养72～96h，收获细胞培养物，即为F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株病毒液。

[0065] (2)SDS-PAGE凝胶电泳将收获的F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒(无外源基因杆状病毒)的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×Loading Buffer，沸水浴5min，
12000r/min离心1min，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后，结果F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物在65kD附近出现明显目的条带，感染空杆状病毒的Sf9细胞培养物未出现相应条带。

[0066] (3)Western Blot鉴定将收获的F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物进行Western Blot检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞培养物和Sf9细胞培养物作为阴性对照。具体操作如下：取80μl收获的细胞培养物，加入20μl的5×Loading Buffer，沸水浴5min，取样进行SDS-PAGE凝胶(12％)电泳。将SDS-PAGE电泳后的产物转印到PVDF(聚偏二氟乙烯膜)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2h，漂洗，加入1:100稀释的兔源抗貉子肠炎病毒阳性血清孵育2h，漂洗，加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体孵育2h，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用X光胶片压片曝光。

[0067] 结果F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物在65kD处出现明显的目的条带，表明VP2蛋白在Sf9细胞中成功表达。

[0068] (4)病毒含量测定将收获的F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株病毒液按MTT相对效力法(黄仕和,余模松.测定杆状病毒滴度方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2007(02):79-83.)测定病毒含量，结果为6.0×107.0PFU/ml。

[0069] (5)表达蛋白血凝效价测定将收获的F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物按照貉细小病毒血凝(HA)试验方法测定表达蛋白血凝效价，结果为1:2048。

[0070] (6)表达蛋白VP2蛋白含量测定用双抗体夹心ELISA法进行蛋白含量测定。结果F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株表达蛋白蛋白含量为72.5mg/L。

[0071] (7)表达蛋白电镜观察将重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物经蔗糖密度梯度超速离心，蔗糖溶液浓度分别为40％、50％、60％，离心速度为29000r/min，离心2h，然后收集位于50％和60％浓度交界处的条带。将少量纯化浓缩后的病毒样颗粒样品滴加到有碳膜的铜网上，风干后，滴加2％磷钨酸钠溶液进行负染，电镜观察，结果F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株表达的貉细小病毒样颗粒与貉细小病毒粒子大小相当、形态学相近。

[0072] (8)安全性试验将F1代重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物腿部皮下接种2～12月龄健康易感貉子5只，3.0ml/只，观察10日，结果所有接种貉子均健活。

[0073] (9)免疫原性试验将毒种接种生长良好的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。经二乙烯亚胺(BEI)灭活完全后，将细胞培养物和灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例制备疫苗，腿部皮下接种5只2～12月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)，1.0ml/只，同时取5只条件相同的貉子不接种作为对照。免疫后14日，免疫貉子RDPV HI抗体效价均不低于1:32，对照貉子RDPV HI抗体效价均不高于1:4；同时对所有貉子分别经食道灌服途径接种貉细小病毒RDPV-SN1株病毒液15ml(含15×107.0TCID50)，连续观察10日，结果免疫貉子全部健活，对照貉子全部发病。

[0074] 3.貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗的制备和成品检验

[0075] (1)疫苗制备

[0076] 1)貉细小病毒VP2蛋白的制备：选择生长旺盛的Sf9细胞接种细胞培养罐进行全悬浮培养，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，27℃培养，当细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×106～3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，向其中加入2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后
37℃灭活48h，然后向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌
1h后终止灭活；经无菌和灭活检验，即得貉细小病毒VP2蛋白，对1％猪红细胞血凝效价≥1:
2048，2～8℃保存备用；

[0077] 2)犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原的制备：选择生长旺盛的Vero细胞接种细胞培养罐进行微载体悬浮培养，当细胞培养罐中Vero细胞密度达到2.0×106～2.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，接毒时采用含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，温度为34℃，接毒后不同时间取样观察，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯去除细胞碎片，收获细胞培养物，犬瘟热病毒含量应不低于107.5TCID50/ml；向收获的细胞培养物中加入2％BEI溶液，使BEI终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活48h，然后向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活，经无菌和灭活检验合格后，即得犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原，2～8℃保存备用：

[0078] 3)将步骤(1)获得的貉细小病毒VP2蛋白稀释至对1％猪红细胞血凝效价不低于1:256，与步骤2)获得的犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原按适当比例混合均匀，与灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌后定量分装，加盖、贴签。

[0079] (2)貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗成品检验

[0080] 1)性状静置后，上层为澄清液体，下层为少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

[0081] 2)无菌检验、装量、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[0082] 3)安全检验用2～12月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)5只，各腿部皮下注射疫苗3.0ml，接种后，每日定时观察并测定貉子体温1次(与接种前测温时间一致)，连续观察21日。接种貉子全部健活，精神、饮食、粪便、体温与接种前相比无明显变化，无其它异常临床症状；或体温升高超过1℃，但稽留应不超过2日。

[0083] 4)效力检验

[0084] ①血清学方法用2～12月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)5只，各腿部皮下注射疫苗1.0ml，同时取5只条件相同的貉子不接种作为对照。免疫后14日，分别采血，分离血清，测定RDPV HI抗体效价和犬瘟热病毒中和抗体效价，免疫貉子RDPV HI抗体效价均应不低于1:32，对照貉子RDPV HI抗体效价均应不高于1:4；免疫后21日，分别采血，测定犬瘟热病毒中和抗体效价，免疫貉子犬瘟热病毒中和抗体效价均应不低于1:50，对照貉子犬瘟热病毒中和抗体效价均应不高于1:4。

[0085] ②免疫攻毒法用2～12月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)10只，各腿部皮下注射疫苗1.0ml，同时取10只条件相同的貉子不接种作为对照。免疫后14日，随机选取5只免疫貉子和5只对照貉子分别经食道灌服途径接种貉细小病毒RDPV-SN1株病毒液15ml(含15×107.0TCID50)，连续观察10日，对照貉子应100％发病，免疫貉子应100％保护；免疫后21日，剩余的5只免疫貉子和5只对照貉子分别滴鼻接种2.0ml、腹腔注射8.0ml(共
10.0ml，含1.0×105.5TCID50)犬瘟热病毒ZC株病毒液，攻毒后连续观察21日，对照貉子应
100％发病，免疫貉子应100％保护。

[0086] 实施例

[0087] 以下实施例结合附图进一步说明本发明。但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。

[0088] 实施例1——重组杆状病毒RDPV-SN1株悬浮培养工艺研究

[0089] 1.重组杆状病毒RDPV-SN1株三角瓶培养工艺研究

[0090] (1)细胞密度对表达蛋白血凝效价的影响

[0091] 当Sf9细胞密度为1.5×106个细胞/ml、2.0×106个细胞/ml、2.5×106个细胞/ml、3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.5接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，接种后60h、72h、84h、
96h、108h、120h取样，测定表达蛋白血凝效价。

[0092] 结果将重组杆状病毒RDPV-SN1株接种不同细胞密度的Sf9细胞，当接毒时Sf9细胞密度为1.5×106、2.0×106、2.5×106、3.0×106个细胞/ml时，表达蛋白血凝效价无明显差异，接毒后72h表达蛋白血凝效价达到高峰，均不低于1:2048，并维持至96h。具体结果见表1。

[0093] 表1不同细胞密度样品表达蛋白血凝效价

[0094]

[0095] (2)病毒接种量对表达蛋白血凝效价的影响

[0096] 当Sf9细胞密度为1.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，接种后60h、72h、84h、96h、108h、120h取样，测定表达蛋白血凝效价。

[0097] 结果MOI为0.2、0.5、1.0、2.0时，表达蛋白血凝效价无明显差异。接毒后72h表达蛋白血凝效价达到高峰，均不低于1:2048，并维持至96h；当MOI为0.05、0.1、3.0时表达蛋白血凝效价较低。具体结果见表2。

[0098] 表2不同感染复数样品表达蛋白血凝效价

[0099]

[0100]

[0101] (3)不同收获时间对表达蛋白血凝效价的影响

[0102] 当Sf9细胞密度为1.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，接种后60h、72h、84h、96h、108h、120h取样，测定表达蛋白血凝效价。

[0103] 结果接毒后72h表达蛋白血凝效价达到高峰，并维持至96h，表达蛋白血凝效价均不低于1:2048；接毒后120h表达蛋白血凝效价开始下降。具体结果见表3。

[0104] 表3不同收获时间样品表达蛋白血凝效价

[0105]

[0106] 综上试验结果，考虑到生产等因素，我们将重组杆状病毒RDPV-SN1株生产工艺定为：接种初始细胞密度为1.5×106～3.0×106个细胞/ml，MOI为0.2～2.0，接毒后72～96h，收获细胞培养物。

[0107] 2.重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养罐接种工艺试验

[0108] (1)细胞接种及放大培养将三角瓶培养生长良好的Sf9细胞接种30L细胞培养罐，接种密度定为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，细胞培养温度为27℃，溶氧为45％，培养期间定时取样，观察细胞状态并记录细胞密度及活力；待细胞密度达到3.0×106个细胞/ml以上时，补加培养基，继续培养至细胞密度高于3.0×106个细胞/ml，将Sf9细胞悬液转移至90L细胞培养罐中进行培养，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，培养期间定时取样，观察细胞状态并记录活细胞密度及活力。待细胞密度达到3.0×106个细胞/ml以上时，补加培养基，继续培养至细胞密度达到3.0×106个细胞/ml以上，将Sf9细胞悬液转移至350L细胞培养罐中进行培养。按同样方法放大至1000L细胞培养罐培养。

[0109] (2)1000L细胞培养罐接毒试验待1000L细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×106个细胞/ml，3.0×106个细胞/ml时，分别按照MOI＝0.2、2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株毒种，分别于72h、96h取样，测定表达蛋白血凝效价。结果接毒后72h、96h，表达蛋白血凝效价无明显差异，均不低于1:2048。具体结果见表4。

[0110] 表4 1000L细胞培养罐接毒试验表达蛋白血凝效价测定结果

[0111]

[0112] 我们进行了重组杆状病毒RDPV-SN1株三角瓶培养工艺研究，根据试验结果进行了细胞培养罐工艺验证试验，最终确定了重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养罐悬浮培养工艺：当细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×106～3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物。

[0113] 实施例2——犬瘟热病毒CDV-11株悬浮培养工艺研究

[0114] 1.犬瘟热病毒CDV-11株7L细胞培养罐培养工艺研究

[0115] (1)微载体准备及灭菌每次称取CytodexⅠ型微载体后，用无Ca2+、Mg2+的PBS(0.1mol/L，pH值为7.2，下同)清洗2～3遍，加入PBS 121℃灭菌30min。灭菌结束后弃掉PBS，补加含8％新生牛血清的MEM细胞培养液，在36.5℃、含5％CO2培养箱内放置4h。

[0116] (2)Vero细胞微载体悬浮培养选择形态良好、生长旺盛的Vero转瓶细胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化制备细胞悬液，接种搅拌式细胞培养瓶，转速为30r/min，细胞密度为4.5×105个细胞/ml，微载体浓度为4g/L，培养温度为36.5℃～37.5℃。

[0117] (3)培养温度对病毒含量的影响Vero细胞接种搅拌式细胞培养瓶培养，当细胞密度达到2.0×106个细胞/ml时，换含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，分别置31℃、34℃、37℃培养。接毒后48h、72h、96h、120h分别取样，测定犬瘟热病毒含量。

[0118] 结果犬瘟热病毒在34℃条件下培养病毒含量最高，37℃条件下培养的病毒含量稍低于34℃条件下病毒含量，31℃条件下培养病毒含量最低。具体结果见表5。

[0119] 表5不同培养温度样品病毒含量

[0120]

[0121] (4)接毒时细胞密度对病毒含量的影响Vero细胞接种搅拌式细胞培养瓶培养，当细胞密度达到1.5×106个细胞/ml、2.0×106个细胞/ml、2.5×106个细胞/ml、3.0×106个细胞/ml时，换含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，分别按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，培养温度为34℃。接毒后48h、72h、96h、120h分别取样，测定犬瘟热病毒含量。

[0122] 结果接毒时细胞密度为2.0×106个细胞/ml和2.5×106个细胞/ml时病毒含量最高，接毒时细胞密度为1.5×106个细胞/ml和3.0×106个细胞/ml时病毒含量略低。根据试验结果生产接毒时细胞密度为2.0×106～2.5×106个细胞/ml。具体结果见表6。

[0123] 表6不同细胞密度样品病毒含量

[0124]

[0125] (5)接毒量对病毒含量的影响Vero细胞接种搅拌式细胞培养瓶培养，当细胞密度达到2.0×106个细胞/ml时，换含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，分别按MOI＝0.05、0.1、0.15接种犬瘟热病毒CDV-11株，培养温度为34℃。接毒后48h、72h、96h、120h分别取样，测定犬瘟热病毒含量。

[0126] 结果按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株时病毒含量最高，按MOI＝0.05、0.15接种犬瘟热病毒CDV-11株时病毒含量均低于按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株病毒含量。根据试验结果将生产时犬瘟热病毒接毒量确定为MOI＝0.1。具体结果见表7。

[0127] 表7不同接毒量样品病毒含量

[0128]

[0129]

[0130] (6)血清浓度对病毒含量的影响Vero细胞接种搅拌式细胞培养瓶培养，当细胞密度达到2.0×106个细胞/ml时，分别换含0、1％、2％、3％新生牛血清的DMEM细胞培养液，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，培养温度为34℃。接毒后48h、72h、96h、120h分别取样，测定犬瘟热病毒含量。

[0131] 结果用含2％、3％新生牛血清的DMEM细胞培养液培养病毒，病毒增殖较快，病毒含量较高；用含无血清的DMEM细胞培养液和含1％新生牛血清浓度的DMEM细胞培养液培养病毒时病毒含量较低。根据试验结果，生产时培养基选择含新生牛血清浓度为2％的DMEM细胞培养液。具体结果见表8。

[0132] 表8不同血清浓度样品病毒含量

[0133]

[0134] (7)不同收获时间对病毒含量的影响Vero细胞接种搅拌式细胞培养瓶培养，当细6
胞密度达到2.0×10个细胞/ml时，换含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，培养温度为34℃。接毒后48h、72h、96h、120h取样，观察细胞病变情况，并测定犬瘟热病毒含量。

[0135] 接毒后48h，细胞无明显病变，病毒含量较低；接毒后72h，微载体上70％～80％细胞变圆突起出现病变，少量细胞从微载体上脱落，病毒含量达到高峰值；接毒后96h，细胞病变明显，80％左右细胞从微载体上脱落，培养基中游离大量死亡细胞，病毒含量维持在高峰值；接毒后120h，几乎无正常细胞，细胞从微载体上脱落，微载体上几乎无细胞，病毒含量有所下降。结果表明接毒后72～96h，微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，可收获病毒液。具体结果见表9。

[0136] 表9不同收获时间对病毒含量影响

[0137]

[0138]

[0139] 根据以上试验研究，确定了犬瘟热病毒CDV-11株悬浮培养生产工艺参数：Vero细胞培养至细胞密度为2.0×106～2.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，接毒时培养基采用含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，培养温度为34℃，接毒后不同时间取样，观察细胞状态，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，收获病毒液。

[0140] 2.细胞培养罐验证试验

[0141] (1)细胞培养罐清洗灭菌及微载体平衡将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30min，灭菌结束后，完成空罐溶氧电极的100％点校正。将已灭菌的微载体打入细胞培养罐，补加平衡培养基至最小培养体积，平衡时间不少于4h。

[0142] (2)42L细胞培养罐接毒试验Vero细胞接种7L细胞培养罐，当细胞密度达到2.0×106个细胞/ml以上时，进行消化转移，7L细胞培养罐细胞转移至42L细胞培养罐培养，接种密度不低于4.5×105个细胞/ml。细胞在42L细胞培养罐培养2～3日，细胞密度达到2.0×106～2.5×106个细胞/ml时，换2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，培养温度为34℃，接毒后不同时间取样，观察细胞状态，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯依次去除细胞碎片，取样测定犬瘟热病毒含量。结果显示犬瘟热病毒含量均在107.5TCID50/ml以上。

[0143] 我们从培养温度、接毒时细胞密度、接毒量、血清浓度、收获时间五个方面研究了犬瘟热病毒悬浮培养生产工艺，并进行细胞培养罐工艺验证试验，根据试验结果确定了犬瘟热病毒悬浮培养生产工艺为：Vero细胞培养至细胞密度为2.0×106～2.5×106个细胞/ml时，按MOI＝0.1接种犬瘟热病毒CDV-11株，接毒时培养基采用含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，培养温度为34℃，接毒后观察细胞状态，接毒后72～96h，微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯去除细胞碎片。

[0144] 实施例3——重组杆状病毒RDPV-SN1株BEI灭活工艺研究

[0145] 取001、002、003批重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物各300ml，定量分装，100ml/瓶。每瓶细胞培养物中加入2％BEI溶液，使其终浓度分别为0.05％、0.1％、0.2％，置
37℃灭活，期间每隔4～8h混匀1次，分别于24h、32h、40h、48h取样，加入50％的硫代硫酸钠溶液使其终浓度为BEI的2倍，搅拌1h终止灭活，取样进行灭活检验。

[0146] 结果0.05％BEI溶液，37℃灭活48h，0.1％BEI溶液，37℃灭活40h，0.2％BEI溶液，37℃灭活40h，可以完全灭活重组杆状病毒RDPV-SN1株，具体结果见表10。为保证重组杆状病毒RDPV-SN1株灭活彻底，同时考虑生产成本，确定生产中采用终浓度为0.1％的BEI，37℃灭活48h。

[0147] 表10重组杆状病毒RDPV-SN1株不同浓度BEI溶液灭活试验

[0148]

[0149] 注：“+”代表灭活完全，“—”代表未灭活完全。

[0150] 实施例4——犬瘟热病毒CDV-11株BEI灭活工艺研究

[0151] 取001、002、003批犬瘟热病毒CDV-11株细胞培养物各300ml，定量分装，100ml/瓶。每瓶细胞培养物中加入2％BEI溶液，使其终浓度分别为0.05％、0.1％、0.2％，置37℃灭活，期间每隔4～8h混匀1次，分别于24h、32h、40h、48h取样，加入50％的硫代硫酸钠溶液使其终浓度为BEI的2倍，搅拌1h终止灭活，取样进行灭活检验。

[0152] 结果0.05％BEI溶液，37℃灭活48h，0.1％BEI溶液，37℃灭活40h，0.2％BEI溶液，37℃灭活40h，可以完全灭活犬瘟热病毒CDV-11株，具体结果见表11。为保证犬瘟热病毒CDV-11株灭活彻底，同时考虑生产成本，确定生产中采用终浓度为0.1％的BEI，37℃灭活
48h。

[0153] 表11犬瘟热病毒CDV-11株不同浓度BEI溶液灭活试验

[0154]

[0155]

[0156] 注：“+”代表灭活完全，“—”代表未灭活完全。

[0157] 实施例5——貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗的制备

[0158] 1.貉细小病毒VP2蛋白制备

[0159] (1)生产用毒种制备

[0160] 1)毒种繁殖将毒种按MOI＝0.2～2.0接种生长良好、细胞密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml的Sf9细胞，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，定量分装。注明名称、收获日期、代次等。

[0161] 2)毒种检验

[0162] ①病毒含量按MTT相对效力法进行测定，每毫升病毒含量应≥1.0×107.0PFU。

[0163] ②纯净性按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

[0164] ③特异性

[0165] 毒种PCR检测用PCR法进行检测，应出现约1.7kb的条带。

[0166] 表达蛋白特异性将重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物用PBS(0.015mol/L，pH值为6.4，下同)稀释为8个血凝单位的悬液，与等量的貉细小病毒特异性抗血清充分混匀，作为中和组，同时设立阳性对照组(重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物用PBS稀释为8个血凝单位的悬液与等量的PBS充分混匀)和阴性对照组(PBS)，37℃中和60min，振摇2～3次。中和完毕后，将以上3组各加入V型96孔微量血凝板，每组至少10孔，每孔0.025ml，然后每孔再加入1％猪红细胞0.025ml，充分振摇，2～8℃作用40～50min，观察结果。中和组和阴性对照组均应不出现凝集，阳性对照组应全部出现凝集。

[0167] 3)毒种继代应不超过3代。

[0168] 4)毒种保存2～8℃保存，保存期为9个月。

[0169] (2)细胞制备

[0170] 1)细胞复苏取液氮保存的Sf9细胞，立即投入37℃温水进行快速溶解，将Sf9细胞悬液620r/min离心5min，弃上清，用SF-SFM无血清培养基重悬细胞，置于合适容量的三角瓶，27℃摇床培养，转速为100～105r/min。

[0171] 2)细胞扩大培养当Sf9细胞密度达到3.0×106个细胞/ml以上时，进行传代，接种细胞密度为1.0×106～1.5×106个细胞/ml，细胞传代至一定数量，接种细胞培养罐，27℃继续培养。

[0172] (3)制苗用抗原制备

[0173] 1)细胞培养罐清洗、灭菌将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30min，灭菌结束后，校正溶氧电极。

[0174] 2)细胞接种及放大培养选择生长旺盛的Sf9细胞，接种细胞培养罐，接种密度为6 6 6
1.5×10～2.0×10个细胞/ml，27℃培养，待细胞密度高于3.0×10个细胞/ml时，补加培养基，继续培养至细胞密度高于3.0×106个细胞/ml时，将细胞培养罐内细胞悬液转移至新细胞培养罐培养，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml。

[0175] 3)接毒及收获当Sf9细胞密度达到1.5×106～3.0×106个细胞/ml时，按MOI＝0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，注明名称、收获日期、批号等，置-15℃以下保存，待检备用。

[0176] (4)灭活向细胞培养物中加入2％BEI溶液，使其终浓度为0.1％，37℃灭活48h；灭活结束后，向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活，2～8℃保存，待检备用。

[0177] 2.犬瘟热病毒CDV-11株半成品制备与检验

[0178] (1)细胞制备复苏Vero细胞，生长液为含10％新生牛血清的细胞培养液，置37℃、含5％CO2培养箱中培养，当长成致密单层时，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化细胞，传代增殖培养。

[0179] (2)生产毒种制备与检验

[0180] 1)生产毒种制备取生长良好的Vero细胞单层，弃去生长液(含10％新生牛血清的MEM细胞培养液)，按维持液(含2％新生牛血清的MEM细胞培养液)量2％的比例将毒种加入到维持液中，然后分装到细胞瓶，置37℃、含5％CO2培养箱中继续培养，待80％左右的细胞出现典型融合型细胞病变时收获，冻融1次，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

[0181] 2)毒种检验

[0182] ①病毒含量将毒种用含2％新生牛血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别接种已长成单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设不接毒对照8孔。每孔补加含2％新生牛血清的MEM细胞培养液100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120h，记录细胞病变(CPE)的孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量应≥105.5TCID50。

[0183] ②纯净性按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体和外源病毒检验，应无菌、无支原体生长，也无外源病毒污染。

[0184] ③特异性将毒种用无菌生理盐水稀释成103.0TCID50/ml，与10倍稀释的犬瘟热病毒特异性抗血清等量混合，作为中和组，同时设不中和对照组(将毒种用无菌生理盐水稀释成3.0
10 TCID50/ml与等量MEM细胞培养液混合)和细胞对照组，37℃中和30min。中和结束后分别接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，中和组接种12孔，0.5ml/孔，不中和对照组和细胞对照组各接种6孔，0.5ml/孔，每孔补加含2％新生牛血清的MEM细胞培养液0.5ml，置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120h。中和组和细胞对照组均应不出现细胞病变，不中和对照组均应出现细胞病变。

[0185] (3)制苗用病毒液的制备

[0186] 1)细胞培养罐清洗、灭菌及微载体平衡将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30min。灭菌结束后将灭菌完全的微载体打入细胞培养罐，加入含8％新生牛血清的MEM细胞培养液至最小培养体积进行平衡，平衡时间不少于4h。平衡载体期间完成溶氧电极100％点的校正。

[0187] 2)细胞接种选择生长良好的Vero细胞单层，用EDTA-胰蛋白酶消化后，接种细胞培养罐，接种密度不低于4.5×105个细胞/ml，培养基为含8％新生牛血清的MEM细胞培养液，连续培养2～3日，当细胞密度高于2.0×106个细胞/ml时进行消化转移。

[0188] 3)细胞消化转移将细胞悬液转移至消化器中，弃上清，往消化器中加入PBS(0.01mol/L，pH7.2)清洗2次，弃PBS，加入胰蛋白酶进行消化，消化完全后加入含8％新生牛血清的MEM细胞培养液终止消化。将细胞悬液转入到新的细胞培养罐培养，接种密度不低于4.5×105个细胞/ml。

[0189] 4)接毒及收获细胞悬液转入到新的细胞培养罐培养2～3日，当细胞密度达到2.06 6
×10～2.5×10个细胞/ml时，接种犬瘟热病毒CDV-11株，接毒时采用含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，温度为34℃，接毒量为MOI＝0.1。接毒后不同时间取样，观察细胞状态，待微载体表面80％左右细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm左右滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯依次去除细胞碎片，标明名称、收获日期、批号，-15℃以下保存，待检备用。

[0190] (4)半成品检验

[0191] 1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[0192] 2)病毒含量按1.2.1.1项进行测定，每毫升病毒含量应≥107.5TCID50。

[0193] (5)灭活向细胞培养物中加入2％BEI溶液，使其终浓度为0.1％，37℃灭活48h；灭活结束后，向细胞培养物中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h后终止灭活，2～8℃保存，待检备用。

[0194] 3.配苗及分装将灭活检验合格的重组杆状病毒RDPV-SN1株细胞培养物和犬瘟热CDV-11株灭活抗原按适当比例混合均匀，与灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌，定量分装，加盖、贴签，制备貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗。

[0195] 实施例6——貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗成品检验

[0196] 1.性状静置后，上层为澄清液体，下层为少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

[0197] 2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。检验结果见表12。

[0198] 3.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。检验结果见表12。

[0199] 表12装量检查结果

[0200]

[0201] 4.安全检验将貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗分别腿部皮下接种2月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)5只，3.0ml/只，作为免疫组；另取5只貉子不免疫，作为对照组。接种后，每日定时观察并测定貉子体温1次(与接种前测温时间一致)，连续观察21日，结果免疫组貉子全部健活，精神、饮食、粪便、体温与接种前相比无明显变化，无其它异常临床症状，未出现因疫苗引起的局部和全身不良反应。与对照组无明显差异。具体结果见表13。

[0202] 表13疫苗安全性检验结果

[0203]

[0204]

[0205] 5.效力检验

[0206] (1)血清学方法用2月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)5只，各腿部皮下注射疫苗1.0ml，同时取5只条件相同的貉子不接种作为对照。免疫后14日，对所有貉子分别采血，进行RDPV HI抗体效价测定，结果免疫貉子RDPV HI抗体效价均不低于1:32(保护性抗体值)，对照貉子RDPV HI抗体效价均不高于1:4；免疫后21日，对所有貉子分别采血，进行犬瘟热病毒中和抗体效价测定，结果免疫貉子犬瘟热病毒中和抗体效价均不低于1:50(保护性抗体值)，对照貉子犬瘟热病毒中和抗体效价均不高于1:4。具体结果见表14。

[0207] 表14血清学方法效力检验结果

[0208]

[0209] (2)免疫攻毒法用2月龄健康易感貉子(RDPV HI抗体效价不高于1:4)10只，各腿部皮下注射疫苗1.0ml，同时取10只条件相同的貉子不接种作为对照。免疫后14日，随机选取5只免疫貉子和5只对照貉子分别经食道灌服途径接种貉细小病毒RDPV-SN1株病毒液15ml(含15×107.0TCID50)，连续观察10日，对照貉子100％发病，免疫貉子100％保护；免疫后21日，剩余的5只免疫貉子和5只对照貉子分别滴鼻接种2.0ml、腹腔注射8.0ml(共10ml，含1.0×105.5TCID50)犬瘟热病毒ZC株病毒液，攻毒后连续观察21日，对照貉子100％发病，免疫貉子100％保护。具体结果见表15、表16。

[0210] 表15貉细小病毒攻毒后临床观察结果

[0211]

[0212] 表16犬瘟热病毒攻毒后临床观察结果

[0213]

[0214] 6.汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。3批疫苗结果均符合规定，具体结果见表17。

[0215] 表17汞类防腐剂残留量测结果

[0216]

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