초고성능액체크로마토그래피를 이용한 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 Ａ2의 동시 분석법 {Method of simultaneous analysing for apamin, melittin and phospholipase A2 in bee venom using Ultra-high performance liquid chromatography}

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 필터여과된 봉독 수용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.

봉독(bee venom)이란 벌이 가지고 있는 독으로 항균 작용, 항산화 작용 및 항염증 작용에 관여한다고 알려져 있으며, 사람에게는 관절염, 요통 및 동맥경화 등을 치료하는 목적으로 사용되고 있다. 또한, 봉독은 면역기능 활성화에 관여하여 질병을 치료하는 효과를 나타내기 때문에 몇몇 농가에서 시범적으로 생봉침액을 이용하여 가축의 질병 예방을 시도하고 있다.

봉독의 구성성분은 펩티드와 단백질(eg 효소), 활성 아민 등을 포함하여 40가지 이상의 물질로 구성되어 있으며, 이들 성분은 진통억제, 소염, 항균 작용과 함께 뇌하수체 호르몬 분비 촉진, 혈액순환 촉진 등의 효과가 있다고 알려져 있다.

이 중 가장 특징적인 주성분은 멜리틴으로 건조 봉독의 40~50%를 함유하고 있고, 1954년에 뉴만과 하버만에 의해 직접 용혈성 요소로 처음 발견되었고, 1972년 하버만에 의해 적혈구 용해시의 세포막활성 성질이 관찰되었다. 구조적으로 26개의 아미노산을 함유하고 있으며, 대식세포의 이동을 강하게 억제하고, 포스포리파제 A2와 상승적으로 작용하여 서로의 활동성을 증가시킨다. 뇌하수체와 부신피질체계를 자극하여 카테콜라민(Catecholamine)과 코르티손(Cortisone) 분비를 촉진하고, 리소좀의 세포막을 안정화시켜 항염증 작용을 한다. 또한 용해, 효소, 통증유발, 방사능 저항성 작용 등이 알려져 있다.

포스포리파제 A2는 봉독의 12%를 함유하고 있고 이 효소는 세포막 구성 지질인 포스포리피드의 그리세린의 BDP 결합하는 지방산을 유리시켜 리조포스파티드로 만들기 때문에 세포조직 파괴성과 용혈작용을 가지고 있고 촉매작용을 한다.

이외에도 봉독의 성분으로 아파민, 히스타민, 엠시디 펩타이드, 히알루로니다아제, 아돌라핀, 도파민, 프로테아제 억제인자, 세카핀, 델티아핀, 프로가민, 알파-글루코시다제 등이 있다.

최근에 봉독은 인체 또는 동물의 질병 예방과 치료에 효과가 있음이 밝혀지고 있는데, 대한민국 등록특허 제10-1391911호(증체율 및 면역기능이 향상된 봉독조성물), 대한민국 등록특허 제10-1156082호(젖소 유방염 치료용 조성물), 대한민국 등록특허 제10-1055689호(봉독을 포함하는 젖소 유방염 주입제의 약제학적 조성물). 대한민국 등록특허 제10-1318787호(항균 기능성 천연 사료 첨가제), 대한민국 공개특허 제10-1999-0037904호(생봉독을 이용한 모돈의 무유증 치료법), 대한민국 등록특허 제10-1288380호(봉독을 유효성분으로 함유하는 양계용 사료 조성물) 등은 봉독성분이 질병예방 및 치료효과가 있음을 보여주고 있다.

한편, 봉독의 품질관리를 위해서는 봉독을 채취하고 있는 농가에서부터 정제된 봉독의 주요성분에 대한 철저한 분석이 요구된다. 그러나 양봉농가나 관련 업체에서 이들 성분을 각각 분리하는데 소요되는 비용이 크고, 공인된 시험법이 아직까지 없기 때문에 이에 관한 어려움을 겪고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 봉독의 정확한 함량 분석을 위해 한 번의 실험방법을 이용하여 봉독 내의 지표 물질인 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석하는 방법을 확인함으로써 양봉 농가 및 관련 업체가 봉독의 품질관리 및 봉독 채취량 분석에 관련된 비용을 절감할 수 있는 방법을 용이하게 제공할 수 있게 되었다.

한편, 본 발명에 대한 선행기술로서, 대한민국 등록특허 제10-0744755호에는 겔 필트레이션 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)를 이용하여 봉독 내의 멜리틴을 분석하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1413715호에는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast protein liquid chromatography; FPLC) 장치의 45 내지 90㎛ 크기의 겔 입자를 포함하는 컬럼에 봉독 포함 수용액을 주입하고 이를 분리정제하여 봉독의 유효성분을 분리하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0758814호에는 봉독을 증류수에 용해하고 이를 여과지를 이용하여 여과하는 방법에 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1364506호에는 한외여과막으로 알러지 성분이 분리된 분리정제봉독 제조방법이 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시 분석법을 제공하는 데에 있다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 필터여과된 봉독 수용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 봉독 내의 멜리틴(melittin), 아파민(apamin) 및 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 동시 분석법에 관한 것이다.

상기 동시 분석법은, 바람직하게는,

(1단계) 봉독, 멜리틴 표준품, 아파민 표준품 및 포스포리파아제 A2 표준품을 각각 증류수에 녹여 수용액을 준비하는 단계;

(2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 수용액을 필터로 여과한 액상을 초고성능액체크로마토그래피용 시료로 준비하는 단계;

(3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계;

(4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 봉독 내의 단백질을 분리하는 단계; 및,

(5단계) 분리된 단백질의 초고성능액체크로마토그래피 흡광도 분석을 통해 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 함량을 분석하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 1단계에서 봉독을 증류수에 녹여 얻은 수용액의 농도는 1~20㎎/㎖일 수 있다.

상기 1단계에서 멜리틴 표준품, 아파민 표준품 및 포스포리파아제 A2 표준품을 각각 증류수에 녹여 얻은 수용액의 농도는 0.5~6㎎/㎖일 수 있다.

상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 더 좋다.

상기 4단계의 혼합용매는 트리플루오로아세트산과 아세토나이트릴 및 물을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 혼합한 것이며, A용액은 10~30mM 트리플루오로아세트산의 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 10~30mM 트리플루오로아세트산의 수용액일 수 있다.

또한, 상기 혼합용매는, 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 하여 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼;

ii) 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 표준품; 및,

iii) 10~30mM 트리플루오로아세트산의 아세토나이트릴 용액, 및, 10~30mM 트리플루오로아세트산의 수용액;

을 함유하는 봉독 분석용 진단키트를 제공한다.

상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다.

이에 본 발명은 상기 봉독 분석용 진단키트를 이용한 봉독의 품질분석방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 봉독의 정확한 품질검사를 하기 위해 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 봉독 내의 멜리틴(melittin), 아파민(apamin) 및 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)를 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.

상기 동시 분석법은, 바람직하게는, (1단계) 봉독, 멜리틴 표준품, 아파민 표준품 및 포스포리파아제 A2 표준품을 각각 증류수에 녹여 수용액을 준비하는 단계; (2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 수용액을 필터로 여과한 액상을 초고성능액체크로마토그래피용 시료로 준비하는 단계; (3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; (4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 봉독 내의 단백질을 분리하는 단계; 및, (5단계) 분리된 단백질의 초고성능액체크로마토그래피 흡광도 분석을 통해 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 함량을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 1단계에서 봉독을 증류수에 녹여 얻은 수용액의 농도는 1~20㎎/㎖일 수 있다. 이 때, 봉독 수용액의 농도가 1㎎/㎖ 미만이거나 20㎎/㎖를 초과하게 되면, 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시분석이 어려울 수 있다.

상기 1단계에서 멜리틴 표준품, 아파민 표준품 및 포스포리파아제 A2 표준품을 각각 증류수에 녹여 얻은 수용액의 농도는 0.5~6㎎/㎖일 수 있다. 이 때, 각각의 표준품 수용액의 농도가 0.5㎎/㎖ 미만이거나 6㎎/㎖를 초과하게 되면, 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시분석이 어려울 수 있다.

상기 2단계에서 사용하는 필터의 pore size는 0.2μm인 것이 바람직하다.

상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다. 상기 컬럼 중, 도데실실란(C12) 컬럼 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼을 사용하는 것이 더 좋기 때문이다. 상기 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.

이 때, 상기 컬럼은 길이 80~120mm, 내경은 4~5mm, 입자크기 2~3 μm인 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직한 컬럼의 길이는 100mm, 내경 4.6mm, 입자크기는 2.7μm 일 수 있다. 제품명으로는 Halo ES-18(4.6 x 100 mm, 2.7 μm)을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH ₂ )가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 봉독성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에는 바람직하지 않다.

상기 3단계 및 4단계에서 시료 및 혼합용매가 주입되어 이동할 때의 컬럼 온도는 40~60℃인 것이 특징이다. 이 때, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 이 온도로 준비되는 것이 바람직하다.

상기 4단계에서 사용되는 혼합용매는, 액체크로마토그래피에 사용되는 이동상으로서, 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 상기 이동상으로 유기용매에 수용액을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴을 사용할 수 있다. 다만 아세토나이트릴 혼합용매를 사용할 경우에는, 수용성 용매로 물을 사용함에 피크가 비극성이거나 피크 분리가 관찰될 수 있는데, 이러한 문제는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 사용하여 해결할 수 있다.

따라서, 상기 4단계의 혼합용매는 트리플루오로아세트산과 아세토나이트릴 및 물을 포함하는 것을 사용하는 것이 좋다. 더 바람직하게는, 상기 혼합용매로서 A용액과 B용액을 혼합한 것을 사용하며, A용액은 10~30mM 트리플루오로아세트산의 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 10~30mM 트리플루오로아세트산의 수용액인 것을 사용하는 것이 좋다. 가장 바람직하게는 A용액은 20mM 트리플루오로아세트산의 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 20mM 트리플루오로아세트산의 수용액인 것이 더 좋다. 이 때, A용액 또는 B용액 내의 트리플루오로아세트산의 농도가 10mM 미만이거나 30mM를 초과하게 되면 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 검출이 동시에 되지 않을 수 있다.

또한, 상기 이동상으로서 사용되는 혼합용액은, 봉독의 주요성분들을 겹치지 않고 선택성 있게 동시에 이동시킬 수 있도록 하기 위하여, 유기용매인 10~30mM 트리플루오르아세트산의 아세토나이트릴 용액, 10~30mM 트리플루오르아세트산의 수용액의 혼합비를 시간에 따라 달리하여 분리할 수 있다.

즉, 상기 혼합용매는, 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 혼합조건을 벗어나게 되면 역시 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 검출이 동시에 되지 않을 수 있다.

상기 5단계의 흡광도 분석은 자외선 검출기를 200~280 nm 범위에서 사용할 수 있으며, 220nm 로 하는 것이 가장 바람직하다. 200 nm 미만과 280 nm 초과 파장에서는 빛의 흡수가 작아 검출이 되지 않는다.

본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼; ii) 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 표준품; 및, iii) 이동상인 10~30mM 트리플루오로아세트산의 아세토나이트릴 용액, 및, 10~30mM 트리플루오로아세트산의 수용액;을 함유하는 봉독 분석용 진단키트와 상기 진단키트를 이용한 봉독의 품질분석방법을 제공한다.

본 발명에서 봉독 성분은 초고성능액체크로마토그래피 UPLC(Ultra-high performance liquid chromatography) 장치인 Waters 회사의 I class 모델을 이용하여 분석할 수 있다. UPLC의 원리는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질인 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 Packing 되어있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는데 있다. 따라서 봉독 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게 된다. 상기 컬럼을 통과한 봉독 성분들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 봉독 성분은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 봉독 성분 함량을 계산할 수 있다(정량 분석).

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 필터여과된 봉독 수용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 봉독 내의 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다. 종래에는 멜리틴과 같은 단일 물질만을 봉독의 지표물질로서 확인하여 봉독의 품질확인에 대한 실험결과가 정확하지 않았지만, 본 발명을 통해 봉독의 정확한 함량 분석을 위해 한 번의 실험방법을 이용하여 봉독 내의 지표 물질인 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석하는 방법을 확인함으로써 양봉 농가 및 관련 업체가 봉독의 품질 관리 및 봉독 채취량 분석에 관련된 비용을 절감할 수 있는 방법을 용이하게 제공할 수 있게 되었다.

도 1은 실시예 2의 분석조건 A에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 봉독 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 분석조건 A에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 아파민 표준품의 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2의 분석조건 A에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 포스포리파아제 A2 표준품의 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 분석조건 A에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 멜리틴 표준품의 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 분석조건 B에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 봉독 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 2의 분석조건 C에 따른 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 봉독 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 2의 분석조건 D에 따른 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 봉독 수용액 시료를 분석한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 시료 준비>

정제봉독(청진 바이오텍) 40 ㎎을 3차 증류수 10 ㎖에 녹여 PTFE 0.2 μm필터로 여과하였고, 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2 표준품도 동일하게 3차 증류수에 녹여 2 ㎎/㎖로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하여 준비하였다.

<실시예 2. 시료의 UPLC 분석>

분석조건 A.

봉독 성분 분석용 초고성능액체크로마토그래피(UPLC) 분석기기는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였으며, Advanced materials technology사의 Halo peptide ES-C18(입자크기: 2.7 μm, 내경: 4.6mm, 길이: 10 cm) 컬럼을 장착하였다. 이동상으로는, A용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 수용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다. 이동상의 흐름속도는 1.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 4 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 220 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.

분석 결과, 도 2 내지 도 4의 아파민 표준품, 포스포리파아제 A2, 멜리틴 표준품의 수용액 시료에 나타나는 각각의 피크가 도 1의 봉독 수용액 시료 내에서도 나타나는 것으로 확인되었고, 상기 봉독 수용액 시료 내의 각 피크에서 나타내는 물질의 함량이 하기 표 2와 같이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 방법을 통해서 1회의 시험분석을 통해서 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 동시에 분석함으로써 농가에서 생산한 정제봉독의 품질확인이 용이하게 수행될 수 있음을 확인하였다.

한편, 초고성능액체크로마토그래피의 일부 조건을 하기의 분석조건 B와 분석조건 C로 변경하여 봉독 수용액의 성분을 분석한 바, 도 5 및 도 6에서와 같이 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 모두 동시에 확인할 수 없어, 본 발명의 조건에서만 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2의 동시 검출이 가능함을 알 수 있었으며, 분석조건 D에서처럼 HPLC를 수행한 조건에서도 역시 봉독 내 멜리틴, 아파민 및 포스포리파아제 A2를 모두 동시에 확인할 수 없었다.

분석조건 B.

실시예 1의 조건으로 봉독 수용액을 준비하여 분석조건 A와 동일하게 초고성능액체크로마토그래피 하되, 다음조건, 즉, 컬럼온도는 30℃, 이동상의 (A)용액은 아세토나이트릴, (B)용액은 물을 사용하는 것으로 변경하였다.

분석조건 C.

실시예 1의 조건으로 봉독 수용액을 준비하여 분석조건 A와 동일하게 초고성능액체크로마토그래피 하되, 다음조건, 즉, 컬럼온도는 30℃, 이동상의 (A)용액은 메탄올, (B)용액은 물을 사용하는 것으로 변경하였다.

분석조건 D.

실시예 1의 조건으로 봉독 수용액을 준비하고 하기 표 3의 조건으로 고성능액체크로마토그래피(HPLC)하였다.