一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法
阅读：175发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 蜂毒 溶血肽隐蔽溶血毒 副作用 的方法，其以天然蜂毒干粉或者采用 生物 多肽固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽为原料，经过凝胶过滤色谱柱分离、反相高效液相色谱纯化，制得 质量 含量大于98%蜂毒溶血肽，其中在凝胶过滤色谱柱分离过程中采用隐蔽剂溶解；然后将蜂毒溶血肽经过 超滤 膜、纳滤膜、半透膜中的一种或几种分子筛处理后，即得到无溶血活性的 蜂毒肽 ；通过本发明方法处理后即可“隐蔽”蜂毒溶血肽的溶血毒副作用；如果以小于1mmol/L 有机酸 及其盐缓冲液处理，其又具有溶血活性，这一点用纯 水 （注射用水）处理后即可证实。，下面是一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法专利的具体信息内容。
1.一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：以天然蜂毒干粉或者采用生物多肽固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽为原料，经过凝胶过滤色谱柱分离、反相高效液相色谱纯化，制得质量含量大于98%蜂毒溶血肽，其中在凝胶过滤色谱柱分离过程中采用隐蔽剂溶解；然后将蜂毒溶血肽经过超滤膜、纳滤膜、半透膜中的一种或几种分子筛处理后，即得到无溶血活性的蜂毒肽。
2.根据权利要求1所述的蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：天然蜂毒干粉含有45-55%的蜂毒溶血肽。
3.根据权利要求1所述的蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：隐蔽剂为
1mmol/L～1000mmol/L的有机酸溶液或1mmol/L～1000mmol/L有机酸-有机酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：凝胶过滤色谱柱分离具体操作为用隐蔽剂平衡凝胶过滤色谱柱，将天然蜂毒干粉或者采用生物固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽用隐蔽剂溶解后，上样至凝胶过滤色谱柱中，用隐蔽剂作为洗脱液进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：超滤膜的截留分子量小于10000 Da，纳滤膜的截留分子量为100-1000 Da；半透膜为截留分子量小于
10000 Da的透析膜。
6.根据权利要求1所述的蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其特征在于：生物多肽固相合成法合成蜂毒溶血肽粗肽是采用FMOC保护的氨基酸固相合成法，以2%交联度的氯甲基树脂作载体，以C端为酰胺的多肽，按一级结构的氨基酸残基序列依次合成26个氨基酸残基组成的蜂毒溶血肽，在含质量百分比10%苯甲醚的无水氢氟酸中0℃下反应1h，反应完成后将蜂毒溶血肽从氯甲基树脂上切割下来，同时脱掉侧链的保护基而制得。
一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法
技术领域
背景技术
[0002] 众所周知，蜂毒是工蜂用其螫针刺向敌害时从螫针内排出的毒汁，故称蜂毒。我国传统中医利用蜂毒疗法治疗疾病已有悠久的历史，特别是对于治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎等疾病都有较好的疗效。近年来，随着分离、纯化和生物合成技术的不断提高，在研究蜂毒组成成分、结构的基础之上，探讨了其功能及作用机理，为进一步临床应用奠定了基础，并展示了较好的应用前景。
[0003] 蜂毒溶血肽（Melittin）（或蜂毒肽或蜂毒素）是具有抗耐药病菌抗生素的重要候选分子之一，具有很强的广谱抗菌消炎活性，但因其有溶血的毒副作用和从天然获得较困难而限制了它的应用。因此，我们在保留抗菌活性基础上，消除其溶血活性。蜂毒溶血肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒溶血肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。
[0004] 蜂毒干粉中含有肽类、酶类及非肽类的主要活性成分。肽类主要包括蜂毒溶血肽、蜂毒明肽及肥大细胞脱颗粒多肽。酶类主要是磷脂酶A2受蜂螫之后产生过敏反应的主要物质。非肽类物质包括组胺、各种生物胺类物质，其与受蜂螫之后产生疼痛有关。
[0005] 蜂毒溶血肽是蜂毒的主要组成成分及活性成分，约占蜂毒干重的50%左右；具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学作用。蜂毒溶血肽为白色或类白色粉末，分子量为 2840 D，由26个氨基酸残基组成，其一级结构的氨基酸残基序列为：
NH2-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO-ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH
自从1967年Habermanm等人首先从蜂毒中分离出由26个氨基酸组成的蜂毒溶血肽以来，分析了其氨基酸序列，证明其结构中无二硫键。1980年Anderson等观察了三级结构，结果表明蜂毒肽的空间结构可分为四个区域：即(1～10)N末端α螺旋结构，(11～13)C以120°角连接两个螺旋的绞链结构，(13～20)C α螺旋结构，(2l～26)C末端是正电荷区域。这样的四个单体通过疏水基相连，形成了四聚体的稳定结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒溶血肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，具有广谱抗菌，抗病毒功能和较强的溶血活性等特点。但当蜂毒溶血肽与细胞膜结合发挥作用时，却是以单体的形式排列在细胞膜表面，但仍具有明显的细胞毒作用（溶血活性）。蜂毒肽是广谱抗菌肽，其抗菌、抗病毒的作用是蜂毒肽通过与膜结合的方式破坏细菌胞膜达到杀菌的目的。
NH2-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO-ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH
自从1967年Habermanm等人首先从蜂毒中分离出由26个氨基酸组成的蜂毒溶血肽以来，分析了其氨基酸序列，证明其结构中无二硫键。1980年Anderson等观察了三级结构，结果表明蜂毒肽的空间结构可分为四个区域：即(1～10)N末端α螺旋结构，(11～13)C以120°角连接两个螺旋的绞链结构，(13～20)C α螺旋结构，(2l～26)C末端是正电荷区域。这样的四个单体通过疏水基相连，形成了四聚体的稳定结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒溶血肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，具有广谱抗菌，抗病毒功能和较强的溶血活性等特点。但当蜂毒溶血肽与细胞膜结合发挥作用时，却是以单体的形式排列在细胞膜表面，但仍具有明显的细胞毒作用（溶血活性）。蜂毒肽是广谱抗菌肽，其抗菌、抗病毒的作用是蜂毒肽通过与膜结合的方式破坏细菌胞膜达到杀菌的目的。
[0006] 生物广谱抗菌肽(antibacterial peptides)，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，有非特异性抗细菌、抗真菌和抗病毒等作用，故又可称为肽抗生素(peptide antibiotics)。这类多肽的氨基酸残基数小于40个，可形成α-螺旋结构，含有较多的碱性氨基酸（在生理条件下带有正电荷）和较多的疏水性氨基酸。生物抗菌肽是通过其两亲性正电荷与微生物细胞膜磷脂分子负电荷的静电吸引而结合在细菌膜上，疏水端插入细胞膜中，最终通过膜内分子间的位移而聚集在一起形成离子通道，使细菌失去膜电势，不能维持正常渗透压而死亡。由于其独特的抗菌机理，细菌不易对其产生耐药性；生物抗菌肽杀菌能力强，抗菌谱广，不良反应少。
发明内容
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，该方法以天然蜂毒干粉或者采用生物多肽固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽为原料，经过凝胶过滤色谱柱分离、反相高效液相色谱纯化，制得质量含量大于98%蜂毒溶血肽，其中在凝胶过滤色谱柱分离过程中采用隐蔽剂溶解；然后将蜂毒溶血肽经过超滤膜、纳滤膜、半透膜中的一种或几种分子筛处理后，即得到无溶血活性的蜂毒肽。
[0008] 所述天然蜂毒干粉含有45-55%的蜂毒溶血肽。
[0009] 所述生物固相合成法合成蜂毒溶血肽粗肽是采用FMOC保护的氨基酸固相合成法，根据文献方法制备（参考Lou Carpino 1972（FMOC）中的方法）以2%交联度的氯甲基树脂作载体，以C端为酰胺的多肽，按一级结构的氨基酸残基序列依次合成26个氨基酸残基组成的蜂毒溶血肽，在含质量百分比10%苯甲醚的无水氢氟酸中0℃下反应1小时，反应完成后将蜂毒溶血肽从氯甲基树脂上切割下来，同时脱掉侧链的保护基而制得。
[0011] 所述凝胶过滤色谱柱分离具体操作为用隐蔽剂平衡凝胶过滤色谱柱，将天然蜂毒干粉或者采用生物固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽用隐蔽剂溶解后，上样至凝胶过滤色谱柱中，用隐蔽剂作为洗脱液进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥。
[0012] 所述超滤膜的截留分子量小于10000 Da，纳滤膜的截留分子量为100-1000 Da；半透膜的截留分子量是小于10000 Da的透析膜。
[0013] 本发明方法制得的无溶血活性的蜂毒肽是一种生物广谱抗菌肽；该生物抗菌肽是蜂毒溶血肽隐蔽了溶血活性的蜂毒肽（26P），具有广谱抗细菌，抗真菌，抗病毒活性，没有溶血活性。
[0014] 所述无溶血活性的蜂毒肽可以制备成注射剂药物，如注射用蜂毒肽和蜂毒肽注射液；也可制备成外用制剂，如喷雾剂、凝胶剂和搽剂，可用于治疗蚊虫叮咬，消肿止痛和止痒；也可用于婴幼儿湿疹的治疗。
[0015] 蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的原理：蜂毒溶血肽在1mmol/L～1000mmol/L的有机酸及其盐的作用下，经分子筛过滤作用（超滤膜超滤过程、纳滤膜纳滤过程和/或生物半透膜作用过程）使蜂毒溶血肽一级结构的11～
13肽链的120°转角复原，与红细胞膜无静电吸附作用，失去“穿孔”效应，故无溶血作用，解决了蜂毒溶血肽的毒副作用，而对原核细胞的“穿孔”作用无影响，使杀菌作用不变（这是蜂毒肽的13～26肽的“穿孔”效应）。
13肽链的120°转角复原，与红细胞膜无静电吸附作用，失去“穿孔”效应，故无溶血作用，解决了蜂毒溶血肽的毒副作用，而对原核细胞的“穿孔”作用无影响，使杀菌作用不变（这是蜂毒肽的13～26肽的“穿孔”效应）。
[0016] 本发明方法制备工艺简单、易操作，蜂毒溶血肽以有机酸及其盐缓冲剂溶解，以凝胶过滤色谱柱分离，反相高效液相色谱纯化，通过超滤、纳滤和半透膜等分子筛处理后，即可“隐蔽”蜂毒溶血肽的溶血毒副作用；实验表明如果以小于1mmol/L有机酸及其盐缓冲液处理，其又会具有溶血活性，用纯水（注射用水）处理证实。附图说明
[0017] 图1为通过分析型高效液相色谱检测蜂毒肽纯度的结果；图2为无溶血活性的蜂毒肽的抗菌活性的检测结果示意图。
具体实施方式
[0018] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
[0019] 实施例1：本蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法及溶血性检测内容如下：1、取含有50%蜂毒溶血肽的蜂毒干粉1.0g，加10mL乙酸-乙酸铵缓冲液（100mmol/L）溶解，2000转离心10min，取上清液，用SephadexG-50凝胶过滤色谱柱（50mm×600mm）初步分离，以100mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液平衡层析柱，上样后在流速为1.0mL/min条件下，用
100mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰；
其中半制备型高效液相色谱仪进行纯化是使用C18反相柱(300Å，10μm，19mm×300mm)；
将凝胶过滤色谱柱分离得到的产物溶于2mL超纯水中，10000g离心5min，加载到已用BufferA（0.1%三氟乙酸）平衡好的反相柱上；用BufferB（含0.1%三氟乙酸的乙腈）梯度洗脱；流速为10mL/min，215nm检测，收集丰度最大峰；
2、将收集液依次经过截留分子量5000Da的超滤膜超滤、截留分子量200Da纳滤膜纳滤和截留分子量3000Da透析膜透析处理后，即得无溶血活性的蜂毒肽（26P）。
100mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰；
其中半制备型高效液相色谱仪进行纯化是使用C18反相柱(300Å，10μm，19mm×300mm)；
将凝胶过滤色谱柱分离得到的产物溶于2mL超纯水中，10000g离心5min，加载到已用BufferA（0.1%三氟乙酸）平衡好的反相柱上；用BufferB（含0.1%三氟乙酸的乙腈）梯度洗脱；流速为10mL/min，215nm检测，收集丰度最大峰；
2、将收集液依次经过截留分子量5000Da的超滤膜超滤、截留分子量200Da纳滤膜纳滤和截留分子量3000Da透析膜透析处理后，即得无溶血活性的蜂毒肽（26P）。
[0020] 蜂毒肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)HPLC测定其含量达到99.2%；结果见图1；经氨基酸分析和用MALDI-TOF质谱仪分析测定所制得的蜂毒肽是目标产物蜂毒溶血肽。
[0021] 3、无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性实验按照国家药品标准WS1-XG-016-2001蜂毒质量标准的活性测定方法测定溶血活性，方法如下：
在步骤2制得的蜂毒溶血肽中加入质量浓度0.9%的氯化钠溶液制成8μg/mL的蜂毒溶血肽溶液，作为供试品；
抗凝兔血的制备：将新采兔血20mL加入2%草酸钾溶液2mL中，缓缓摇动，制成抗凝兔血；
取抗凝兔血8mL，加入0.9%氯化钠溶液10mL，摇匀，即得稀释兔血；
取试管9支，其中3支分别加入供试品10mL；3支分别加入0.9%氯化钠溶液10mL，作为阴性对照；3支分别加入水10mL，作为阳性对照；各管置于37℃水浴中保温20min后，分别加稀释兔血0.2mL，轻轻摇匀，并计时继续在37℃水浴中保温30min，取出，置于冰水浴中5min后，以2000转/min离心5min，分别吸取上清液，在545nm的波长处测定吸收度A；阴性对照管平均值Anc不得大于0.03，阳性对照管平均值Apc应为0.8±0.03，如不在此范围内，应另行试验；
结果按下式计算溶血活性：
(Ai-Anc)×100%
Apc-Anc
式中Ai —供试品吸收度；
Anc—阴性对照吸收度；
Apc—阳性对照吸收度；
结果见表1，步骤2制得的无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性为0；
表1
。
在步骤2制得的蜂毒溶血肽中加入质量浓度0.9%的氯化钠溶液制成8μg/mL的蜂毒溶血肽溶液，作为供试品；
抗凝兔血的制备：将新采兔血20mL加入2%草酸钾溶液2mL中，缓缓摇动，制成抗凝兔血；
取抗凝兔血8mL，加入0.9%氯化钠溶液10mL，摇匀，即得稀释兔血；
取试管9支，其中3支分别加入供试品10mL；3支分别加入0.9%氯化钠溶液10mL，作为阴性对照；3支分别加入水10mL，作为阳性对照；各管置于37℃水浴中保温20min后，分别加稀释兔血0.2mL，轻轻摇匀，并计时继续在37℃水浴中保温30min，取出，置于冰水浴中5min后，以2000转/min离心5min，分别吸取上清液，在545nm的波长处测定吸收度A；阴性对照管平均值Anc不得大于0.03，阳性对照管平均值Apc应为0.8±0.03，如不在此范围内，应另行试验；
结果按下式计算溶血活性：
(Ai-Anc)×100%
Apc-Anc
式中Ai —供试品吸收度；
Anc—阴性对照吸收度；
Apc—阳性对照吸收度；
结果见表1，步骤2制得的无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性为0；
表1
。
[0022] 实施例2：本蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法及溶血性检测如下：1、采用FMOC保护的氨基酸固相合成法，根据文献方法制备以2%交联度的氯甲基树脂作载体，以C端为酰胺的多肽，按其一级结构的氨基酸残基序列依次合成26个氨基酸残基组成的蜂毒溶血肽（26P），在含质量百分比10%苯甲醚的无水氢氟酸中0℃下反应1h，将蜂毒溶血肽从树脂上切割下来，同时脱掉侧链的保护基，制得蜂毒溶血肽粗肽；其中蜂毒溶血肽从树脂上切割下来的试剂为三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1,2-二巯基乙醇（三氟乙酸、苯酚、水、苯甲硫醚、1,2-二巯基乙醇的体积比8∶0.5∶0.5∶0.5∶0.25），在室温下反应5h，旋转蒸发除去大部分三氟乙酸后，在0℃滴加乙醚得絮状沉淀，离心后即得蜂毒溶血肽粗肽；
2、用SephadexG-25凝胶过滤色谱柱初步分离，用质量浓度30%的醋酸溶液平衡柱子，上样后在流速为1mL/min下，用质量浓度30%醋酸进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；再用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰；
3、将收集液依次经过截留分子量5000Da的超滤膜超滤、截留分子量200Da纳滤膜纳滤和截留分子量3000Da透析膜透析处理后，即得到无溶血活性的蜂毒肽（26P）；
蜂毒肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)HPLC测定其含量达到99.5%；经氨基酸分析和用MALDI-TOF质谱仪分析测定以确认所制备蜂毒肽是目标产物蜂毒溶血肽；
4、无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性实验，方法同实施例1步骤3，通过检测本实施例步骤3制得的无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性为0（见表2）；
表2
。
2、用SephadexG-25凝胶过滤色谱柱初步分离，用质量浓度30%的醋酸溶液平衡柱子，上样后在流速为1mL/min下，用质量浓度30%醋酸进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；再用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰；
3、将收集液依次经过截留分子量5000Da的超滤膜超滤、截留分子量200Da纳滤膜纳滤和截留分子量3000Da透析膜透析处理后，即得到无溶血活性的蜂毒肽（26P）；
蜂毒肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)HPLC测定其含量达到99.5%；经氨基酸分析和用MALDI-TOF质谱仪分析测定以确认所制备蜂毒肽是目标产物蜂毒溶血肽；
4、无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性实验，方法同实施例1步骤3，通过检测本实施例步骤3制得的无溶血活性的蜂毒肽的溶血活性为0（见表2）；
表2
。
[0023] 实施例3：本蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法及溶血性检测如下：1、取含有52%蜂毒溶血肽的蜂毒干粉1.0g，加10mL乙酸-乙酸铵缓冲液（200mmol/L）溶解，2000转离心10min，取上清液，用SephadexG-50凝胶过滤色谱柱（50mm×600mm）初步分离，以200mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液平衡层析柱，上样后在流速为1.0mL/min条件下，用
200mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰，收集液干燥；
2、步骤1干燥产物采用透析膜进行处理
采用进口MD34-3.5(7)透析袋，截流分子量3500（7000）Da；按每次投料量剪取1-3m透析袋；
新透析袋处理：透析袋先用含有2%碳酸氢钠和1mol/L乙二胺四乙酸二钠的水溶液煮沸
10min，放冷，用注射用水充分洗3-5次；再用1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液煮沸10min，放冷，用注射用水充分洗3-5次，浸泡于注射用水中4℃保存备用；取用处理后的透析袋应戴手套。
200mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲溶液洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥；用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰，收集液干燥；
2、步骤1干燥产物采用透析膜进行处理
采用进口MD34-3.5(7)透析袋，截流分子量3500（7000）Da；按每次投料量剪取1-3m透析袋；
新透析袋处理：透析袋先用含有2%碳酸氢钠和1mol/L乙二胺四乙酸二钠的水溶液煮沸
10min，放冷，用注射用水充分洗3-5次；再用1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液煮沸10min，放冷，用注射用水充分洗3-5次，浸泡于注射用水中4℃保存备用；取用处理后的透析袋应戴手套。
[0025] 溶解蜂毒粉：称取步骤1干燥产物，按6%的比例溶于上述透析液中，充分溶解；取出已处理的透析袋，先用橡皮圈扎起一端，灌入2/3的注射用水，颠倒透析袋数次，将透析袋内水弃之，如此清洗2-3次；然后将溶解有干燥产物的蜂毒液装入透析袋内（约2/3），用橡皮圈扎起另一端，放入其5倍体积的上述透析液中透析；透析提取大于30h，取出透析袋，容器内的溶液即为蜂毒溶血肽透析液Ⅰ号液；二次透析：将透析袋转入其6倍体积的注射用水中继续透析30h；取出透析袋，容器内的溶液即为蜂毒溶血肽透析液Ⅱ号液；同上再进行第3-4次透析；可得到蜂毒溶血肽透析液Ⅲ、Ⅳ号液；即蜂毒肽原液，紫外含量检测和溶血活性测定。经测定蜂毒溶血肽透析液Ⅰ、Ⅱ没有溶血活性；蜂毒溶血肽透析液Ⅲ、Ⅳ有溶血活性，8μg/mL的溶液，其溶血活性大于60%（见表3）；结果表明用注射用水处理，蜂毒溶血肽又会具有溶血活性；
表3
。
表3
。
[0026] 实施例4：无溶血活性的蜂毒肽的抗菌活性检测检测上述实施例制得的无溶血活性的蜂毒肽的抗菌活性，具体为将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取60μL的待测菌液（OD600＝
0.3）加入20mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5mm左右，水平室温放置待凝固；在琼脂上打直径为2.7mm的圆孔，分别在孔中加入无溶血活性的蜂毒肽10μl，用无菌水做阴性对照，用Amp做阳性对照；加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果。本试验中供试细菌为金黄色葡萄球菌，实验结果见图2；结果显示无溶血活性的蜂毒肽具有抑杀金黄色葡萄球菌抗菌活性。
0.3）加入20mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5mm左右，水平室温放置待凝固；在琼脂上打直径为2.7mm的圆孔，分别在孔中加入无溶血活性的蜂毒肽10μl，用无菌水做阴性对照，用Amp做阳性对照；加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果。本试验中供试细菌为金黄色葡萄球菌，实验结果见图2；结果显示无溶血活性的蜂毒肽具有抑杀金黄色葡萄球菌抗菌活性。
[0027] 无溶血活性的蜂毒肽最小抑菌浓度（MIC）的测定将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为5×106CFU/mL，加入96孔培养板中，测试孔每孔加入菌液90μl，然后加入倍比稀释的不同浓度的蜂毒肽溶液10μl/孔；阳性对照为
100μL/孔的菌液，阴性对照为相应的100μL培养基；然后于37℃慢摇培养约16h，用酶标仪测OD630；抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表4；
表4：蜂毒肽MIC(抑制细菌生长的最低浓度)
以上所述的实施例仅仅是本发明优选实施方法进行描述的，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案所作各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
100μL/孔的菌液，阴性对照为相应的100μL培养基；然后于37℃慢摇培养约16h，用酶标仪测OD630；抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表4；
表4：蜂毒肽MIC(抑制细菌生长的最低浓度)
以上所述的实施例仅仅是本发明优选实施方法进行描述的，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案所作各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
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