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一种整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用

阅读：309发布：2020-05-15

专利汇可以提供一种整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属药学领域，涉及整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用，尤其是多功能靶向D构型多肽分子DVS，及L构型多肽LVS及D构型多肽修饰的复合物、递药系统及其肿瘤诊断和治疗中的用途，实验结果显示：DVS在血清中比LVS更稳定；DVS和LVS所修饰的模型药物均被肿瘤细胞、新生血管内皮细胞、脑胶质瘤干细胞样细胞和肿瘤组织特异性摄取，具有良好的肿瘤靶向和影像功能；DVS和LVS修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统均有效地将所包载模型药物递送至靶组织，能显著提高肿瘤的诊断与治疗效果，LVS或DVS均可介导药物或纳米递药系统主动寻靶，且DVS的效果优于LVS，在肿瘤诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。，下面是一种整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.与整合素αvβ3和α6β1具有高亲和的D构型多肽DVS，其特征为D构型氨基酸序列为DSDVDADFDPDSDYDRDHDRDSDFDWDSDV，可用于药物或纳米递药系统的靶向递送。
2.按权利要求1所述的D构型多肽DVS，其特征是能够介导整合素αvβ3和α6β1途径，实现药物分子或纳米载药系统的肿瘤靶向递送。
3.按权利要求1所述的D构型多肽DVS，其特征是巯基化后能与含有马来酰亚胺基团的影像物质反应，获得DVS-X复合物。
4.与整合素αvβ3和α6β1具有高亲和的L构型多肽与影像物质的复合物LVS-X，其特征是L
VS(氨基酸序列为VSWFSRHRYSPFAVS)巯基化后与含有马来酰亚胺基团的影像物质反应，获得LVS-X复合物。
5.按权利要求3、4所述的DVS-X复合物和LVS-X复合物，其特征是复合物中X是荧光物质Fluorescein，近红外染料Cy7、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA，放射影像剂99mTc-DTPA，可用作高表达整合素αvβ3和α6β1肿瘤的影像诊断和示踪。
6.按权利要求1所述的D构型多肽DVS，其特征是通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得DVS-Y复合物。
7.与整合素αvβ3和α6β1具有高亲和的L构型多肽与药物的复合物LVS-Y，其特征是LVS通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得LVS-Y复合物。
8.按权利要求6、7所述的DVS-Y复合物和LVS-Y复合物，其特征是复合物中Y是抗肿瘤药物中的阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱等喜树碱类药物、长春新碱等长春碱类药物、硼替佐米等佐米类药物、p53激活肽和蜂毒肽等多肽类药物，可用作高表达整合素αvβ3和α6β1肿瘤的靶向治疗。
9.按权利要求1所述的D构型多肽DVS，其特征是巯基化后能与含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇-Z复合物连接，得到DVS-聚乙二醇-Z复合物。
10.与整合素αvβ3和α6β1具有高亲和的L构型多肽与高分子材料的复合物LVS-聚乙二醇-Z，其特征是LVS巯基化后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，得到LVS-聚乙二醇-Z复合物。
11.按权利要求9、10所述的DVS-聚乙二醇-Z复合物和LVS-聚乙二醇-Z复合物，其特征是复合物中Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)。
12.按权利要求11所述的DVS-聚乙二醇-磷脂复合物和LVS-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是可用于脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统和聚合物圆盘递药系统的制备。
13.按权利要求11所述的DVS-聚乙二醇-聚乳酸复合物、DVS-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、DVS-聚乙二醇-聚己内酯复合物、LVS-聚乙二醇-聚乳酸复合物、LVS-聚乙二醇-L
乳酸羟基乙酸共聚物复合物、VS-聚乙二醇-聚己内酯复合物，其特征是可用于聚合物胶束递药系统、纳米粒递药系统的制备。
14.按权利要求12、13所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统，其特征是可用于包载肿瘤诊断药物。
15.按权利要求14所述的递药系统所包载诊断药物，其特征是所包载药物是荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy7、IR820、DiR、DiD，磁共振影像剂Gd-DTPA，可用于高表达整合素αvβ3和α6β1肿瘤的影像诊断和示踪。
16.按权利要求12、13所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统，其特征是可用于包载肿瘤治疗药物。
17.按权利要求16所述的递药系统所包载肿瘤治疗药物，其特征是所包载药物是阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱等喜树碱类药物、长春新碱等长春碱类药物、硼替佐米和卡非佐米等佐米类药物、小白菊内酯等内脂类药物、p53激活肽和蜂毒肽等多肽类药物，可用于高表达整合素αvβ3和α6β1肿瘤的靶向治疗。

说明书全文

一种整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中

的应用

技术领域

[0001] 本发明属药学领域，涉及整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用，具体涉及一种高度稳定且与αvβ3和α6β1具有高亲和活性的D构型多肽及L构型多肽和稳定性D构型多肽的药物复合物和修饰的纳米递药系统，还涉及D构型多肽DVS(D构型氨D D D D D D D D D D D D D D D L基酸序列 SVAF PS YRHR SFW SV)，及L构型多肽VS(氨基酸序列VSWFSRHRYSPFAVS)和稳定性DVS的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统，以及在肿瘤诊断和靶向治疗中的应用。

背景技术

[0002] 现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷，因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略，主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将药物或纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中。常用的对应配体包括单克隆抗体、多肽、核酸适体、小分子化合物等；配体修饰后的药物或纳米递药系统可通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现对肿瘤的主动靶向；然而研究显示，目前的配体多数只是针对某一受体或某一细胞的靶向，对于肿瘤组织不只有肿瘤细胞，还有肿瘤干细胞，肿瘤新生血管等的客观现状，研发具有多重靶向功能的配体将具有重要的临床意义。

[0003] 研究公开了整合素是细胞表面重要的受体，对肿瘤的生长、侵袭、转移以及凋亡等过程都有非常重要的作用。整合素是由alpha和beta两个亚基通过非共价键连接形成的异二聚体，其中αvβ3和α6β1是整合素的两个亚型，有研究报道整合素αvβ3在许多肿瘤细胞及其肿瘤新生血管内皮细胞上高表达，而α6β1在脑胶质瘤细胞及脑胶质瘤干细胞上高表达。

[0004] 基于现有技术的有关LVS(氨基酸序列VSWFSRHRYSPFAVS)是通过噬菌体展示技术筛选出的与整合素受体α6β1有高度结合性的15肽，以及整和素alpha亚基之间的序列同源性大概为30％，beta亚基之间的序列同源性大概为45％等的特点，且LVS与整合素受体结合实现肿瘤的多重靶向功能的相关研究尚未见报道的现状，本申请的发明人拟提供整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供整合素配体VS多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的应用。经实验证实所述LVS多肽不仅能与整合素α6β1特异性结合，而且能与整合素αvβ3亦有较高的结合活性。

[0006] 本发明提供了LVS(氨基酸序列VSWFSRHRYSPFAVS)修饰的药物复合物和修饰的纳米递药系统，能实现肿瘤的靶向诊断和治疗；同时针对L构型多肽的体内稳定性差，在血液中易降解，可能导致肿瘤靶向能力降低的问题，进而提供了高度稳定且与整合受体αvβ3和α6β1有高度结合活性的D构型多肽靶向分子DVS，并构建其药物复合物和修饰的纳米递药系统，获得了更好的体内肿瘤靶向效果。

[0007] 本发明中，所述的LVS多肽其氨基酸序列为VSWFSRHRYSPFAVS；所述的D构型多肽靶向分子DVS其氨基酸序列为DSDVDADFDPDSDYDRDHDRDSDFDWDSDV。

[0008] 本发明制备了具有高稳定性的D构型多肽DVS，并以LVS和DVS修饰药物分子和高分子载体材料，构建VS-药物复合物提及VS修饰的纳米递药系统，进一步用于实现药物对肿瘤的靶向诊疗。

[0009] 具体的，本发明利用逆序翻转和固相多肽合成技术，设计并制备了D构型多肽DVS，该多肽对血清具有高稳定性、与整合素αvβ3和α6β1具有高亲和力。

[0010] 本发明中，LVS和所设计的DVS连接半胱氨酸后的，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化影像物质(如Fluorescein、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、磁共振影像剂Gd-DTPA、放射影像剂99mTc-DTPA等)反应而形成复合物。

[0011] 本发明中，LVS和所设计的DVS修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)的VS-药物复合物。

[0012] 本发明中，LVS和所设计的DVS连接半胱氨酸后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于LVS和DVS修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

[0013] 本发明的LVS和DVS修饰的纳米递药系统可包载阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱等喜树碱类药物、长春新碱等长春碱类药物、硼替唑米和卡非佐米等佐米类药物、小白菊内酯等内酯类药物、p53激活肽和蜂毒肽等多肽类药物等抗肿瘤药物；也可包载影像物质，如香豆素6、FAM，近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD、磁共振影像剂Gd-DTPA等。

[0014] 本发明的DVS可介导药物或纳米递药系统靶向整合素αvβ3和α6β1高表达的细胞及其组织，用于肿瘤的靶向诊断和治疗。

[0015] 本发明中进行了下述实验：

[0016] 1.合成VS及其荧光标记物(VS-FAM)

[0017] 采用固相合成的方法合成LVS与DVS，并进一步获得了荧光素标记的VS(LVS-FAM与DVS-FAM)，HPLC、MS及圆二色谱(CD)表征结构。

[0018] 2.合成VS-DTPA-Gd与VS-DTPA-99mTc

[0019] 通过固相合成法在VS上接入一个Cys，然后通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了DVS-DTPA或LVS-DTPA，螯合Gd或99mTc得VS-DTPA-Gd或VS-DTPA-99mTc。

[0020] 3.VS肽的稳定性和亲和性评价

[0021] 从与血清稳定性、受体蛋白结合能力和细胞摄取能力三方面进行VS性质的考察。将LVS、DVS分别与大鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度进行稳定性的比较。采用表面等离子共振方法(SPR)测定LVS、DVS肽与受体蛋白(Integrinαvβ3和Integrinα6β1)的结合常数Kd值。比较LVS-FAM、DVS-FAM对整合素αvβ3和α6β1高表达的(如：脑胶质瘤细胞U87、脐静脉内皮细胞HUVEC和脑胶质瘤干细胞样细胞GSC)的体外靶向性。

[0022] 4.制备VS-药物复合物

[0023] 连接半胱氨酸后的LVS和DVS与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的VS-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物；

[0024] 连接半胱氨酸后的LVS和DVS与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的VS-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物；

[0025] LVS和DVS通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的VS-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物；

[0026] LVS和DVS通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。

[0027] 5.VS胶束递药系统的构建与表征

[0028] 首先合成VS修饰的高分子材料VS-PEG-PLA，通过连接半胱氨酸的多肽上的游离巯基与Mal-PEG-PLA所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成。将VS-Cys与Mal-PEG-PLA在pH7.2的PBS和DMF的混合溶液中反应得到VS-PEG-PLA，1H-NMR表征；

[0029] 然后制备VS胶束(VS-MS)。以一定比例的VS-PEG-PLA、mPEG-PLA和药物(香豆素-6、DiR或者阿霉素)采用成膜法制备胶束(VS-MS/C6、VS-MS/DiR或VS-MS/DOX)，激光散射粒度仪表征胶束粒径和粒径分布。

[0030] 6.VS胶束递药系统体内靶向性评价

[0031] U87皮下瘤及原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射MS/DiR、LVS-MS/DiR和DVS-MS/DiR，在活体成像仪下观察并比较上述胶束在肿瘤的分布；

[0032] U87皮下瘤模型裸鼠尾静脉注射DVS-micelle/C6，一定时间后取出肿瘤，制作冰冻切片，进行肿瘤血管与肿瘤干细胞共定位。

[0033] 7.VS胶束递药系统体内外抗肿瘤效果评价

[0034] 以MTT法考察MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX对U87细胞、HUVEC细胞和GSC细胞的体外生长抑制效果，并以U87肿瘤球体积的变化考察胶束对肿瘤球生长抑制作用。通过对U87皮下瘤与原位瘤模型裸鼠尾静脉注射生理盐水，游离阿霉素、MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX后，以肿瘤体积变化、肿瘤组织的HE染色以及模型裸鼠的中位生存期为指标评价各胶束的体内抗肿瘤效果。

[0035] 本发明提供了DVS的制备和性质考察以及上述LVS和DVS所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础，本发明的实验结果表明：LVS和DVS均可介导肿瘤的体内主动靶向；与LVS相比，所述DVS在血清中稳定性更好，因而其介导的体内主动靶向效果更优。附图说明

[0036] 图1：VS的HPLC和ESI-MS图谱，其中，

[0037] 色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV214nm；图A和B分别是LVS与DVS的HPLC和ESI-MS图谱，结果说明多肽合成产物纯度高，与理论分子量相符合。

[0038] 图2：VS的CD图谱，其中，

[0039] 采用方法：分别配制浓度为0.1mg/mL的LVS多肽和DVS多肽溶液放置于径宽0.1cm测量皿中，然后在室温条件下进行圆二色谱的实验，扫描波长范围设定为190nm-260nm，分辨率设为1nm，扫描速度设为10nm/min。以平均残积摩尔椭圆率设为纵坐标，扫描波长范围设置为横坐标，绘制LVS和DVS两种构型多肽的圆二色谱，结果表明两种构型多肽分别为L构型与D构型。

[0040] 图3：LVS-PEG-PLA和DVS-PEG-PLA的1H-NMR图谱，其中，

[0041] A为Mal-PEG-PLA的核磁图谱，B、C分别为LVS-PEG-PLA和DVS-PEG-PLA的核磁图谱；A图箭头指示为马来酰亚胺峰，而B、C图中该峰消失，说明Mal-PEG-PLA中的马来酰亚胺基团已与LVS和DVS多肽中的巯基反应。

[0042] 图4：LVS和DVS多肽的血清稳定性，其中，

[0043] 图纵坐标为完整多肽的残留百分比，可见LVS在10h内已完全降解，而DVS在24h含量仍接近100％，表现出良好的血清稳定性。

[0044] 图5：U87细胞对LVS多肽和DVS多肽的摄取，其中，

[0045] A图：LVS-FAM和DVS-FAM在37℃与U87细胞作用4h后的激光共聚焦显微镜照片；B图：流式细胞仪对上述细胞进行检测；定性与定量结果均表明，与LVS多肽相比，DVS多肽与上述细胞有更强的亲和能力。

[0046] 图6：HUVEC细胞对LVS多肽和DVS多肽的摄取，其中，

[0047] A图：LVS-FAM和DVS-FAM在37℃与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦显微镜照片；B图：流式细胞仪对上述细胞进行检测；定性与定量结果均表明，与LVS多肽相比，DVS多肽与上述细胞有更强的亲和能力。

[0048] 图7：GSC细胞对LVS多肽和DVS多肽的摄取，其中，

[0049] A图：LVS-FAM和DVS-FAM在37℃与GSC细胞作用4h后的激光共聚焦显微镜照片；B图：流式细胞仪对上述细胞进行检测；定性与定量结果均表明，与LVS多肽相比，DVS多肽与上述细胞有更强的亲和能力。

[0050] 图8：荷U87皮下瘤裸鼠模型的活体成像，其中，

[0051] 荷U87皮下瘤裸鼠尾静脉注射MS/DiR、LVS-MS/DiR或DVS-MS/DiR后不同时间点分离皮下肿瘤(g)及主要的脏器(a:心、b:肝、c:脾、d:肺、e:肾、f:脑)的荧光成像图，荧光图像结果表明，靶向胶束组的肿瘤部位荧光素蓄积量显著大于普通胶束组，并且DVS修饰的靶向胶束在皮下肿瘤组织靶向效果更优。

[0052] 图9：荷U87原位瘤裸鼠模型的活体成像，其中，

[0053] A图：U87原位瘤裸鼠尾静脉注射MS/DiR、LVS-MS/DiR或DVS-MS/DiR后24h剥离原位肿瘤组织的荧光成像图；B图：各制剂给药24h后剥离原位肿瘤组织的荧光半定量结果；结果表明，靶向胶束组的肿瘤部位荧光素蓄积量显著大于普通胶束组，并且DVS修饰的靶向胶束原位肿瘤组织靶向效果更优。

[0054] 图10：皮下肿瘤组织冰冻切片的免疫荧光染色，其中，

[0055] 将DVS-MS/C6通过尾静脉注入荷皮下瘤裸鼠模型体内，一定时间后取出肿瘤，进行冰冻切片，对切片进行免疫荧光染色，结果表明，DVS-MS/C6分布在肿瘤组织中，且与血管标记物CD31(红色)及肿瘤干细胞标记物CD133(红色)重合，共定位结果说明DVS修饰的胶束不但能靶向肿瘤细胞还能够靶向肿瘤新生血管及肿瘤干细胞，实现多重靶向功能。

[0056] 图11：原位肿瘤组织冰冻切片的免疫荧光染色，其中，

[0057] 将DVS-MS/C6通过尾静脉注入荷原位瘤裸鼠模型体内，一定时间后取出肿瘤，进行冰冻切片，对切片进行免疫荧光染色，结果表明，DVS-MS/C6分布在肿瘤组织中，且与血管标记物CD31(红色)和肿瘤干细胞标记物CD133(红色)重合。

[0058] 图12：胶束形态，

[0059] 其中的透射电镜图结果显示，胶束外观圆整规则、粒径均在20nm左右。

[0060] 图13：胶束的释放行为，

[0061] 其中的胶束在pH5.0和pH7.4的释放介质中的释放曲线显示，所有阿霉素聚合物胶束释放均具有一定的缓释性能且在酸性介质下释放较快。

[0062] 图14：LVS-MS/DOX或DVS-MS/DOX对体外U87、HUVEC及GSC细胞生长抑制，[0063] MTT法考察DOX、MS/DOX、LVS-MS/DOX或DVS-MS/DOX对U87细胞、HUVEC细胞及GSC细胞的体外生长抑制情况，结果表明，DVS-MS/DOX能更好的抑制上述三种细胞的生长。

[0064] 图15：LVS-MS/DOX或DVS-MS/DOX对U87肿瘤球的体外生长抑制

[0065] 以U87肿瘤球体积的变化来考察不同制剂对肿瘤球生长的抑制作用，结果表明，DVS-MS/DOX抑制U87肿瘤球生长作用最强。*p<0.05，**p<0.005。

[0066] 16：荷皮下瘤裸鼠体内药效，其中，

[0067] A为荷瘤裸鼠肿瘤体积随时间变化图，B图为实验结束后各给药组剥离皮下瘤的图片；结果表明，与生理盐水组相比，游离DOX组、MS/DOX组、LVS-MS/DOX组和DVS-MS/DOX组对肿瘤的生长均有良好的抑制作用，LVS-MS/DOX组和DVS-MS/DOX组对肿瘤的生长抑制作用明显优于其他给药组，其中DVS-MS/DOX组在整个治疗过程中的肿瘤抑制效果最明显，统计表明DVS-MS/DOX组与其他三组相比具有极显著性差异(n＝6，P<0.01)。

[0068] 图17：HE染色，其中，

[0069] A为肿瘤组织的HE染色图，结果表明，LVS-MS/DOX组和DVS-MS/DOX组的肿瘤组织有明显的坏死灶，DVS-MS/DOX坏死灶更明显；B为心肌组织的HE染色图，结果表明，游离阿霉素有明显的心肌毒性，而所有的胶束制剂未观察到明显的心肌毒性，结果表明，VS修饰可显著提升聚合物胶束的抗肿瘤作用，并能降低阿霉素的心肌毒性。

[0070] 图18：抗原位脑胶质瘤裸鼠的生存曲线，其中，

[0071] 生理盐水组、游离DOX组、MS/DOX组、LVS-MS/DOX组和DVS-MS/DOX组的中位生存期分别为22.5、23.5、24、25.5和29天，表明VS-MS/DOX可以延长原位脑胶质瘤模型鼠的生存时间，分别比无VS修饰的胶束递药系统抗肿瘤效果提高了1.0倍和3.3倍，DVS-MS/DOX效果又L比 VS-MS/DOX增强了1.17倍。

具体实施方式

[0072] 通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

[0073] 实施例1VS、VS-FAM、VS-药物、VS-PEG-PLA的制备与表征

[0074] 1)LVS和DVS的合成与表征

[0075] 采用固相合成法，设计并合成由D构型氨基酸所构成的DVS(D构型氨基酸序列DSDVDADFDPDSDYDRDHDRDSDFDWDSDV)，以及L构型氨基酸所构成的LVS(氨基酸序列VSWFSRHRYSPFAVS)；

[0076] 采用下述方法：以Boc固相多肽合成法，在PAM-Boc树脂上按序列依次接入氨基酸，以HBTU/DIEA为缩合剂、TFA为脱保护剂进行反应，反应完成后，将树脂用含P-cresol的氟化氢进行切割，冰浴搅拌反应1h，反应结束后减压抽去管中氟化氢，冰乙醚沉淀并洗涤沉淀3次，沉淀以20％乙腈重新溶解，收集滤液后旋蒸，得到多肽粗品溶液，多肽粗品经制备液相，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化，HPLC、ESI-MS和CD表征多肽的纯度、分子量和结构如图1和图2所示。

[0077] 2)LVS-FAM和DVS-FAM的合成

[0078] 同上固相合成法，在完成所有氨基酸序列缩合，TFA脱去N端氨基酸的Boc保护基后，加入5-羧基荧光素(5-FAM)的DMF溶液，并以HBTU/DIEA为缩合剂，室温反应过夜，树脂洗L D涤干燥后，氟化氢切割，纯化后得VS-FAM和VS-FAM。

[0079] 3)制备VS-DTPA-Gd与AE-DTPA-99mTc

[0080] 固相合成法制备VS-Cys(VS氨基端加入一个半胱氨酸)，将LVS-Cys或DVS-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，maleimide-DTPA溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待反应完全后经制备液相，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化，冷冻干燥得LVS-DTPA或DVS-DTPA纯品，螯合Gd或99mTc即得VS-DTPA-Gd或VS-DTPA-99mTc。

[0081] 4)制备VS-药物复合物

[0082] 以VS-阿霉素复合物制备作为VS连接含酮或醛基药物的实施例：

[0083] 10mgVS-Cys(DVS-Cys或LVS-Cys)溶于3mL 磷酸盐缓冲液(0.1mM，pH7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于4℃搅拌20min。然后加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h，反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得DVS或LVS-阿霉素复合物；

[0084] 以VS-紫杉醇复合物作为VS以二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例：200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入39.99mgDCC及60.4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜，反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mLDMF中，1.5倍摩尔量的VS-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5，将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至VS-Cys溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得VS-紫杉醇复合物；

[0085] 以VS-硼替佐咪复合物作为VS连接含硼酸基团药物的实施例：

[0086] 依照VS的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护，加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h，树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得VS-多巴胺衍生物，在pH7.4的缓冲液中，VS-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得VS-硼替佐咪复合物；

[0087] 以VS-PMI复合物作为VS连接多肽药物的实施例：

[0088] 直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定VS-PMI多肽序列后，按与制备VS相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得VS-PMI复合物。

[0089] 5)VS-PEG-PLA的合成与表征

[0090] 将DVS-Cys或LVS-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，取Mal-PEG-PLA溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待Mal-PEG-PLA反应完全后停止反应，过量的DVS-Cys、LVS-D LCys透析(截留分子量3.5kDa)除去，冷冻干燥得VS-PEG-PLA或VS-PEG-PLA，NMR表征其结构如图3所示。

[0091] 实施例2VS的血清稳定性考察实验

[0092] 将LVS和DVS多肽溶解于25％大鼠血清中，终浓度为1mg/mL，37℃孵育，分别于0、5、10、30min，1、2、4、6和8h取出样品0.1mL，加入蛋白沉淀剂甲醇0.4mL或三氯乙酸(TCA)20μL，涡旋后放置30min，离心(12000rpm，10min)，取上清液20μL进行HPLC分析，计算降解百分率及SD值，血清稳定性结果(如图4所示)表明，DVS具有比LVS更好的血清稳定性。

[0093] 实施例3VS与整合素结合活性考察实验

[0094] 通过biacore系统进行预结合分析，选取pH4.0为最佳整合素蛋白αvβ3和α6β1与CM5芯片结合pH。将整合素蛋白αvβ3和α6β1偶联至CM5芯片上，RU值达到目标值，将LVS，DVS和LS分别配置成一系列浓度的样品溶液，从低到高依次进样，用Biacore3000Evaluationsoftware 软件分析LVS和DVS与整合素蛋白αvβ3和α6β1的结合活性，并分别计算其KD值(如表1所示)。

[0095] 表1.肽的序列、分子量及KD值

[0096]

[0097] 实施例4VS的体外细胞靶向性验证

[0098] 1)VS对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性

[0099] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度L D条件下培养24h后，用培养液配制浓度为10μM的VS-FAM、VS-FAM及FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液，用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图5A所示，另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图5B所示。

[0100] 2)VS对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

[0101] 取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，同上试验，细胞内化照片见附图6A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图6B所示。

[0102] 3.VS对脑胶质瘤干细胞样细胞GSC的体外靶向性

[0103] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤干细胞样细胞(GSC细胞)，同上试验，细胞内化照片如图7A所示，另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图7B所示。

[0104] 实施例5VS胶束的靶向性验证

[0105] 1)VS-MS/C6或VS-MS/DiR的制备

[0106] 取适量的mPEG-PLA和VS-PEG-PLA(LVS-PEG-PLA或DVS-PEG-PLA)溶于乙腈中，加入适量C6或DiR，37℃水浴，减压(～0.085MPa)旋转蒸发除去有机溶媒，成均匀膜，室温真空干燥过夜，加入适量生理盐水水化，CL-4B柱层析除去未包封的C6或DiR，制得VS-MS/C6和VS-MS/DiR。

[0107] 2)VS胶束体内靶向性验证

[0108] 建立荷皮下脑胶质瘤裸鼠模型：

[0109] 当脑胶质瘤细胞(U87细胞)处于对数生长期时，使用胰蛋白酶消化为单细胞悬液，用PBS溶液洗涤离心后，然后重悬分散到PBS溶液中，使U87细胞的终浓度为5×107个/mL，接种100μL上述细胞混悬液至裸鼠右背侧近腋部皮下，接种后的裸鼠在SPF级的环境中饲养，每天观察接种后肿瘤大小，待肿瘤大小合适时，挑选肿瘤形状规则且肿瘤无坏死的荷瘤裸鼠，随机进行分组开展后续试验；

[0110] 建立荷原位脑胶质瘤裸鼠模型：

[0111] 当U87脑胶质瘤细胞处于对数生长期时，使用胰蛋白酶消化为单细胞悬液，用PBS溶液洗涤离心后，然后重悬分散到PBS溶液中，备用。7％水合氯醛溶液麻醉裸鼠后，用脑立体定位仪固定麻醉裸鼠并进行脑定位，再将制备好的悬浮细胞以5×105个/5μL接种至每只裸鼠接的纹状体部位(即前囟向前0.6mm，向右1.8mm，纵深3mm)，然后定期观察接种后裸鼠的状态，待相应时间随机分组进行后续试验；

[0112] 体内靶向性验证：取皮下瘤模型裸鼠或原位瘤模型裸鼠分别尾静脉注射MS/DiR、LVS-MS/DiR和DVS-MS/DiR溶液，皮下瘤模型组于1、4、8、24h剖取肿瘤组织及主要的脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)用活体成像记录荧光信号，结果如图8所示，原位瘤模型于4、12、24h记录裸鼠体内的荧光信号分布并于24h剖取脑组织进行荧光成像及荧光半定量分析，结果如图9所示；

[0113] DVS胶束在肿瘤组织分布考察：取荷皮下脑胶质瘤及原位脑胶质瘤的裸鼠，分别尾静脉注射DVS-MS/C6溶液，给药后8h或24h取肿瘤组织，制作10μm的冰冻切片；将切片与CD133-PE抗体或CD31抗体孵育并进一步与Dylight594标记的goatanti-ratIgG孵育以定位肿瘤干细胞或肿瘤血管，切片用DAPI复染以显示细胞核，封片后，用共聚焦显微镜观察，结果如图10和11所示。

[0114] 实施例6载阿霉素VS胶束的体外药效学试验

[0115] VS-MS/DOX的制备与表征：以制备VS-MS/C6相同的方法制备VS-MS/DOX，测定其包封率，激光散射粒度仪表征胶束的粒径和粒径分布，结果如表2所示；透射电镜表征胶束的形态结果如图12所示；透析法测定DOX从胶束中的释放行为结果如图13所示；

[0116] 表2.各载阿霉素胶束制剂的包封率、载药量与粒径大小及分布

[0117]

[0118] VS-MS/DOX体外药效学试验：以7.5×103个/孔将U87细胞和HUVEC细胞接种于96孔板，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下24h后，将培养液吸出，加入200μL一系列浓度的游离DOX、MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX，共培养4h后吸出药液，加入含10％FBS的DMEM培养液，继续培养72h后，加入MTT溶液孵育4h，弃去培养液，加入150μLDMSO，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值，采用MTT法测定细胞存活率，结果如图14所示；

[0119] VS-MS/DOX对肿瘤球的生长抑制试验：将2％低分子琼脂糖溶液热加入到48孔板中，每孔150μL。放冷待其自然凝固，每孔接种5×103个U87细胞悬液，7天后肿瘤球即得，肿瘤球分别与含DOX浓度为10μg/mL的游离DOX、MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX孵育，每天测量肿瘤球的长径和短径，连续测量5天，采用按公式(V＝π×长径×短径/6)计算肿瘤球体积，绘制肿瘤球体积变化曲线，结果如图15所示。

[0120] 实施例6载阿霉素VS胶束的体内药效学试验

[0121] VS-MS/DOX对皮下肿瘤生长抑制作用评价：构建U87皮下瘤模型，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为50-100mm3时，分组进行试验，分别尾静脉注射生理盐水、游离DOX、MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX；给药组DOX总给药剂量为10mg/kg，分为五次，每次给药间隔为两天，隔天以游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)，根据公式(V瘤体积＝0.5(a×b2))计算各组裸鼠肿瘤体积，绘制肿瘤相对体积随时间的变化曲线，计算各组统计学差异；并在实验结束后剥离各给药组实验动物皮下的肿瘤进行拍照，结果如图16所示；

[0122] VS-MS/DOX的心肌毒性考察：将皮下瘤药效学试验的各给药组小鼠的肿瘤组织和心脏解剖后固定于4％多聚甲醛的PBS溶液中，石蜡包埋切片，进行HE染色，在显微镜下观察、拍摄图片(如图17所示)；

[0123] VS-MS/DOX抗原位胶质瘤的药效评价：将原位脑胶质瘤模型裸鼠分组进行实验，分别在建模后第9、12、15和18天尾静脉注射生理盐水、游离DOX、MS/DOX、LVS-MS/DOX和DVS-MS/DOX，单次DOX的注射剂量为3mg/Kg，记录模型裸鼠的生存时间，结果如图18所示。

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