神经元胞吐抑制性肽类
阅读：219发布：2024-02-12
专利汇可以提供神经元胞吐抑制性肽类专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及可调节神经元胞吐的通式(I)的肽类、它们的立体异构物及其外消旋或非外消旋混合物，及其美容或药学上可接受的盐：R1-AA-R2(I)其中AA是3至40个包含在SNAP-25 蛋白质 的 氨 基酸序列中的相邻氨基酸序列，R1是选自H或烷基、芳基、芳烷基或酰基；并且R2是选自经脂肪族或环状基团取代或未经取代的氨基、羟基或硫醇基，条件是当R1是H或乙酰基时，R2不是未经取代的氨基、羟基或硫醇基。本发明还涉及一种获得该肽类的方法、包含该肽类的美容或药物组合物及它们用于 治疗 那些需要神经元胞吐调节的病症的用途，优选是用于治疗 皮肤 。，下面是神经元胞吐抑制性肽类专利的具体信息内容。
1.选自如下组的氨基酸序列的肽：
CH3-(CH2)8-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)10-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)12-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)14-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)16-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)18-CO-EEMQRR-NH2
CH3-(CH2)20-CO-EEMQRR-NH2
Ac-EEMQRR-NH-(CH2)11-CH3
Ac-EEMQRR-NH-(CH2)13-CH3
Ac-EEMQRR-NH-(CH2)15-CH3；
它的混合物，及它的美容和药学上可接受的盐。
2.一种获得权利要求1的肽的方法，其特征在于该法是在固相中实施。
3.一种美容或药物组合物，包含美容或药物有效量的至少一种权利要求1的肽，该组合物包含至少一种美容或药学上可接受的赋形剂或佐剂。
4.如权利要求3的美容或药物组合物，其特征在于所述肽是包含在美容或药学上可接受的持续释放系统或选自脂质体、毫胶囊、微胶囊、纳米胶囊、海绵、囊胞、微团、脂球、微乳液、纳米乳液、毫颗粒、微颗粒和纳米颗粒的载体中。
5.如权利要求3的美容或药物组合物，其特征在于所述肽是吸附在美容或药学上可接受的选自滑石、皂粘土、硅石、淀粉或麦芽糊精中的有机聚合物或固相矿物质载体上。
6.一种美容或药物组合物，包含美容或药物有效量的至少一种权利要求1的肽，其特征在于包含额外的美容或药学有效量的选自去角质剂、润湿剂、脱色或美白剂、原色素剂(pro-pigmentation agent)、去妊娠纹剂、除皱剂、抗氧化剂、抗糖化剂、一氧化氮合成酶抑制剂、抗老化剂、可减少和/或消除眼袋的药剂、刺激皮肤或表皮分子合成和/或防止它们降解的药剂、刺激纤维母细胞和/或角质细胞增生及刺激角质细胞分化的药剂、欲改善真皮-表皮交界处的药剂、皮肤舒缓剂、固化剂、抗大气污染和/或抗自由基药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、安定剂、抗炎剂、抗微生物剂、作用于细胞代谢的药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、维生素、螯合剂、可抗紫外线A和/或B的有机或矿物性光保护剂、及其混合物的活性剂。
7.一种权利要求1的肽在制备用于治疗哺乳动物中需要神经元胞吐调节的那些病症的美容或药物组合物中的用途。
8.一种权利要求1的肽在制备用于治疗、清洁或照顾皮肤的美容或药物组合物中的用途。
9.一种权利要求1的肽在制备用于减少和/或消除面部皱纹和/或面部不对称的美容或药物组合物中的用途。
10.如权利要求9的肽的用途，其用于制备减少和/或消除面部表情纹的美容或药物组合物。
11.一种权利要求1的肽在制备用于减少和/或消除肌肉痉挛的美容或药物组合物中的用途。
神经元胞吐抑制性肽类
【技术领域】
[0002] 人类老化最明显可见的征兆之一就是皮肤经历的变化：干燥、出现斑点、松弛和皱纹。这些作用可由外在因素诸如长期曝晒阳光、大气污染或接触例如清洁产品中的化学物质造成，但也可能由人体组织内在的生理学、生物化学和组织学变化造成，因为蛋白质诸如胶原或弹性蛋白的合成降低、蛋白质水解增加，和皮肤屏障、结缔组织和内聚力的整体破坏。
[0003] 用于预防和减少老化症状的不同活性成分已被描述，诸如维A酸、羟酸、类黄酮或维生素C及E衍生物。该化合物通常通过改善皮肤含水量、增加细胞修复或预防形成皮肤的组织退化来发挥作用；然而，它们在预防和治疗因肌肉收缩所造成的面部皱纹的效果有限。面部表情纹形成基础或机制是向内牵引皮肤的表皮肌肉的张力。该肌肉张力是削弱面部肌肉的神经过度活跃的结果。神经过度活跃的特征为不受控制和过度释放激活肌肉纤维的神经递质。因此，调节神经元胞吐的分子可松弛肌肉张力，由此消除面部皱纹。
[0004] 因此需要发展经证实具有疗效的新颖活性成分，以制备用于调节神经元胞吐并由此治疗肌肉痉挛及减少和/或消除面部不对称和/或面部皱纹(特别是表情纹)的美容或药物组合物。
[0005] 表情纹是由负责在面部皮肤上制造面部表情的面部肌肉收缩压力所造成的皱纹。表情纹出现的位置通常在前额、眉毛之间区域、嘴周围和/或眼睛周围。根据面部形状、表情频率及抽搐与否(经常重复的痉挛性运动，由一种或数种肌肉不自主收缩造成，此例中为面部肌肉)，表情纹甚至可能在青少年时期出现。外在因素诸如阳光曝晒加强它们的深度及可见度。
[0006] 肉毒杆菌毒素已被广泛用于减少和/或消除表情纹，特别是血清型A(Cosmetic，Allergan Inc.)[Carruthers J.D.andCarruthers J.A.(1992)“Treatment of glabellar frown lines withC.Botulinum-A exotoxin”J.Dermatol.Surg.Oncol.18，
17-21；Mendez-Eastman S.K.(2003)“Botox：a review”Plast.Surg.Nurs.23，64-69]。
的治疗和美容处理包括局部注射经稀释的药物制剂(500千道尔顿A型肉毒杆
菌-血球凝集素复合体)至肌肉张力所在的区域。该毒素的麻痹作用在平均6个月期间内可被逆转[Jankovic J.and Brin F.M.(1991)“Therapeutic uses of botulinum toxin”NewEngl.J.Med.324，1186-1194；Jankovic J.(1994)“Botulinumtoxin in movement disorders”Curr.Opin.Neurol.6，358-366]。因此该治疗需要重复注射肉毒杆菌毒素。该治疗的主要问题在于可能出现对该药物制剂的免疫反应，因为其分子大小会被患者的免疫系统识别的事实。抗肉毒杆菌毒素的抗体出现是一个严重的问题，因为它导致治疗疗效明显丧失[Jankovic J.and Brin F.M.(1991)“Therapeutic uses of botulinum toxin”New Engl.J.Med.324，1186-1194；Jankovic J.(1994)“Botulinum toxin in movementdisorders”Curr.Opin.Neurol.6，358-366；Jankovic J.and BrinM.F.(1997)“Botulinum toxin：historical perspective andpotential new indications”Muscle Nerve Suppl.6，S129-S145；Davis L.E.(1993)“Botulinum toxin-from poison to medicine”WestJ.Med.128，25-28；HughesA.J.(1994)“Botulinum toxin inclinical practise”Drugs 48，888-893；Hambleton P.(1992)“Clostridium botulinum toxins a general review of involvementin disease，structure，mode of action and preparation forclinical use”J.Neurol.239，16-20；Borodic G.E.and PearcesL.B.(1994)“New concepts in botulinum toxin therapy”DrugSafety 11，
145-152：Brin M.F.，BlitzerA.，Stewart C.，Pine Z.，Borg-Stein J.，Miller J.，Nagalapura N.S. and RosenfeldD.B.(1993)“Disorders with excessive
muscle contraction；Candidates for treatment with intramuscular botulinum toxin( )”Botulinum and Tetanus Neurotoxins(Ed.B.R.DasGupata)，559-576]。
所述 的治疗效果的丧失导致随后治疗必须增加该制剂的浓度，如此有可能引起免疫应答。曾考虑使用不同血清型的肉毒杆菌毒素诸如BoTox B、BoTox F和BoTox E作为血清型A的肉毒杆菌毒素治疗的替代疗法。然而，使用不同血清型的药物应用不能被视为该问题的解决方案，因为免疫反应迟早会再次发生。另外，肉毒杆菌毒素治疗昂贵，主要是因为包含它们的药物制剂容易变化和不稳定。
17-21；Mendez-Eastman S.K.(2003)“Botox：a review”Plast.Surg.Nurs.23，64-69]。
的治疗和美容处理包括局部注射经稀释的药物制剂(500千道尔顿A型肉毒杆
菌-血球凝集素复合体)至肌肉张力所在的区域。该毒素的麻痹作用在平均6个月期间内可被逆转[Jankovic J.and Brin F.M.(1991)“Therapeutic uses of botulinum toxin”NewEngl.J.Med.324，1186-1194；Jankovic J.(1994)“Botulinumtoxin in movement disorders”Curr.Opin.Neurol.6，358-366]。因此该治疗需要重复注射肉毒杆菌毒素。该治疗的主要问题在于可能出现对该药物制剂的免疫反应，因为其分子大小会被患者的免疫系统识别的事实。抗肉毒杆菌毒素的抗体出现是一个严重的问题，因为它导致治疗疗效明显丧失[Jankovic J.and Brin F.M.(1991)“Therapeutic uses of botulinum toxin”New Engl.J.Med.324，1186-1194；Jankovic J.(1994)“Botulinum toxin in movementdisorders”Curr.Opin.Neurol.6，358-366；Jankovic J.and BrinM.F.(1997)“Botulinum toxin：historical perspective andpotential new indications”Muscle Nerve Suppl.6，S129-S145；Davis L.E.(1993)“Botulinum toxin-from poison to medicine”WestJ.Med.128，25-28；HughesA.J.(1994)“Botulinum toxin inclinical practise”Drugs 48，888-893；Hambleton P.(1992)“Clostridium botulinum toxins a general review of involvementin disease，structure，mode of action and preparation forclinical use”J.Neurol.239，16-20；Borodic G.E.and PearcesL.B.(1994)“New concepts in botulinum toxin therapy”DrugSafety 11，
145-152：Brin M.F.，BlitzerA.，Stewart C.，Pine Z.，Borg-Stein J.，Miller J.，Nagalapura N.S. and RosenfeldD.B.(1993)“Disorders with excessive
muscle contraction；Candidates for treatment with intramuscular botulinum toxin( )”Botulinum and Tetanus Neurotoxins(Ed.B.R.DasGupata)，559-576]。
所述 的治疗效果的丧失导致随后治疗必须增加该制剂的浓度，如此有可能引起免疫应答。曾考虑使用不同血清型的肉毒杆菌毒素诸如BoTox B、BoTox F和BoTox E作为血清型A的肉毒杆菌毒素治疗的替代疗法。然而，使用不同血清型的药物应用不能被视为该问题的解决方案，因为免疫反应迟早会再次发生。另外，肉毒杆菌毒素治疗昂贵，主要是因为包含它们的药物制剂容易变化和不稳定。
[0007] 因此迫切需要发展模拟肉毒杆菌毒素的麻痹作用但具有更为简单稳定且不诱发免疫反应的分子结构的分子，及其生产费用具成本效益的分子。肽分子的性质符合这些特性。
[0008] 在分子层面上，肉毒杆菌毒素是降解神经元蛋白质的蛋白酶，该神经元蛋白质与钙离子活化的胞吐机制有关[Schiavo G.，Rossetto O.and Montecucco C.(1996)“Bases Moleculares del tétanos y delbotulismo”Investigacióny Ciencia 234，46-55；Montecucco Cand Schiavo G.(1994)“Mechanism of action of tetanus andbotulinum neurotoxins”Mol.Microbiol.13，1-8；Schiavo G.，Rosetto O.，Benfenati F.，Poulain B.and Montecucco，C.(1994)“Tetanus and botulinum neurotoxins are zinc proteases specificfor components of the neuroexocytosis apparatus”Ann.NY Acad.Sci.710，
65-75]。举例来说，因为其应用可消除面部皱纹及面部不对称及缓解痉孪性疾病的症状学而最常被用于临床实践及化妆品中的A型肉毒杆菌毒素截短神经元SNAP-25蛋白质。
此SNAP-25蛋白质对于神经分泌非常重要，因为其与引导及控制囊泡中累积的乙酰胆碱释放的蛋白质复合体(称为SNARE或融合复合体)形成有关。该融合复合体的核心是由位于突触前质膜上的突触融合蛋白和SNAP-25蛋白质与位于囊泡质膜上的突触囊泡蛋白(synaptobrevin)或VAMP蛋白质形成[Calakos N.and Scheller R.H.(1996)“Synaptic vesiclebiogenesis，docking and fusion：a molecular description”Physiol.Rev.76，
1-29：Sutton R.B.，Fasshauer D.，Jahn R.andBrunger A.T.(1998)“Crystal structure of a SNARE complexinvolved in synaptic exocytosis at resolution”Nature
395，347-356]。该融合复合体的主要功能是移动装载神经递质(乙酰胆碱)的囊泡靠近并将其放置接触突触前质膜[Calakos N.and SchellerR.H.(1996)“Synaptic vesicle biogenesis，docking and fusion：a molecular description”Physiol.Rev.76，1-29：
Sutton R.B.，Fasshauer D.，Jahn R.and Brunger A.T.(1998)“Crystal structureof a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at resolution”Nature 395，
347-353]。如此有利于为应答钙离子浓度上升而造成两个质膜融合，导致神经递质释放。该囊泡融合和锚定SNARE蛋白质复合体因此成为控制神经分泌的重要目标。截短任何形成该融合复合体的蛋白质防止其组合，因而抑制囊泡释放及调节神经元胞吐。
65-75]。举例来说，因为其应用可消除面部皱纹及面部不对称及缓解痉孪性疾病的症状学而最常被用于临床实践及化妆品中的A型肉毒杆菌毒素截短神经元SNAP-25蛋白质。
此SNAP-25蛋白质对于神经分泌非常重要，因为其与引导及控制囊泡中累积的乙酰胆碱释放的蛋白质复合体(称为SNARE或融合复合体)形成有关。该融合复合体的核心是由位于突触前质膜上的突触融合蛋白和SNAP-25蛋白质与位于囊泡质膜上的突触囊泡蛋白(synaptobrevin)或VAMP蛋白质形成[Calakos N.and Scheller R.H.(1996)“Synaptic vesiclebiogenesis，docking and fusion：a molecular description”Physiol.Rev.76，
1-29：Sutton R.B.，Fasshauer D.，Jahn R.andBrunger A.T.(1998)“Crystal structure of a SNARE complexinvolved in synaptic exocytosis at resolution”Nature
395，347-356]。该融合复合体的主要功能是移动装载神经递质(乙酰胆碱)的囊泡靠近并将其放置接触突触前质膜[Calakos N.and SchellerR.H.(1996)“Synaptic vesicle biogenesis，docking and fusion：a molecular description”Physiol.Rev.76，1-29：
Sutton R.B.，Fasshauer D.，Jahn R.and Brunger A.T.(1998)“Crystal structureof a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at resolution”Nature 395，
347-353]。如此有利于为应答钙离子浓度上升而造成两个质膜融合，导致神经递质释放。该囊泡融合和锚定SNARE蛋白质复合体因此成为控制神经分泌的重要目标。截短任何形成该融合复合体的蛋白质防止其组合，因而抑制囊泡释放及调节神经元胞吐。
[0009] 目前本领域知道源自形成SNARE复合体的蛋白质序列的特定肽类可抑制神经元胞吐，诸如源自SNAP-25蛋白质的氨基及羧基结构域的肽类[Apland J.P.，Biser J.A.，Adler M.，Ferrer-Montiel A.V.，Montal M，Canaves J.M.and Filbert，M.G.(1999)“Peptides thatmimic the carboxy-terminal domain of SNAP-25
blockacetylcholine release at an aplysia synapse”J.Appl.Toxicol.19，Suppl.1：
S23-S26；Mehta P.P.，Batternger E.and WilsonM.(1996)“SNAP-25 and synaptoagmin
2+
involvement in the finalCa -dependent triggering of neurotransmitter
exocytosis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10471-10476；Ferrer-Montiel A.V.，Gutierrez L.M.，Apland J.P.，Canaves J.M.，Gil A.，Viniegra S.，Biser J.A.，Adler M.and Montal M.(1998)“The 26-mer peptidereleased from cleavage by botulinum neurotoxin E inhibitsvesicle docking”FEBS Lett.435，84-88；Gutierrez L.M.，CanavesJ.M.，Ferrer-Montiel A.V.，Reig J.A.，Montal M.and ViniegraS.(1995)“A
2+
peptide that mimics the carboxy-terminal domainof SNAP-25 blocks Ca -dependent exocytosis in chromaffin cells”FEBS Lett.372，39-43；Gutierrez L.M.，Viniegra S.，Rueda J.，Ferrer-Montiel A.V.，Canaves J.M.and Montal M.(1997)“A peptidethat mimics the C-terminal sequence of SNAP-25 inhibitssecretory vesicle docking in chromaffin cells”J.Biol.Chem.272，2634-2639；Blanes-Mira C，Valera E.，Fernández-BallesterG.，Merino J.M.，Viniegra S.，Gutierrez L.M.，Perez-PayáE.and Ferrer-Montiel A.(2004)“Small peptides patterned after theN-terminus doma in of SNAP-25 inhibi tSNARE complex assembly andregulated exocytosis”J.Neurochem.88，
124-135]、源自突触融合蛋白氨基酸序列的肽类[Martin F.，Salinas E.，Vazquez J.，Soria B.and Reig J.A.(1996)“Inhibition of insulin release bysynthetic peptides show that the H3 region at the C-terminaldomain of syntaxin-1 is
2+
crucial for Ca -but not for guanosine5’-[gamma-thio]thriphosphate-induced secretion”Biochem.J.320，201-205]、源自突触囊泡蛋白氨基酸序列的肽类[Cornille F.，Deloye F.，Fournie-Zaluski M.C.，Roques B.P.and PoulainB.(1995)“Inhibition of neurotransmitter release by syntheticproline-rich peptides shows that the N-terminal domain ofvesicle-associated membrane protein/synaptobrevin is criticalfor neuron-exocytosis”J.Biol.Chem.270，16826-16830]、突源自触结合蛋白氨基酸序列的肽类[Mehta P.P.，Batternger E.andWilson M.(1996)“SNAP-25
2+
and synaptotagmin involvement in thefinal Ca -dependent triggering of
neurotransmitter exocytosis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10471-10476]、及 源 自snapin蛋白氨基酸序列的肽类[Ilardi J.M.，Mochida S.and Sheng Z.H.(1999)“Snapin：
A SNARE associated protein implicated in synaptictransmission”Nat.Neurosci.2，
119-124]。相同的，通过合理设计或通过跟踪可干扰SNARE复合体形成的合成性化学库所获得的抑制神经元胞吐的合成肽类也曾被描述[Blanes-Mira C.，Pastor M.T.，Valera E.，Fernández-Ballester G.，Merino J.M.，Gutierrez L.M.，Perez-Pava E.and Ferrer-Montiel A.(2003)“Identification ofSNARE complex modulators that inhibit exocytosis form an α-helix-constrained combinatorial library”Biochem J.375，
159-166]。
blockacetylcholine release at an aplysia synapse”J.Appl.Toxicol.19，Suppl.1：
S23-S26；Mehta P.P.，Batternger E.and WilsonM.(1996)“SNAP-25 and synaptoagmin
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involvement in the finalCa -dependent triggering of neurotransmitter
exocytosis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10471-10476；Ferrer-Montiel A.V.，Gutierrez L.M.，Apland J.P.，Canaves J.M.，Gil A.，Viniegra S.，Biser J.A.，Adler M.and Montal M.(1998)“The 26-mer peptidereleased from cleavage by botulinum neurotoxin E inhibitsvesicle docking”FEBS Lett.435，84-88；Gutierrez L.M.，CanavesJ.M.，Ferrer-Montiel A.V.，Reig J.A.，Montal M.and ViniegraS.(1995)“A
2+
peptide that mimics the carboxy-terminal domainof SNAP-25 blocks Ca -dependent exocytosis in chromaffin cells”FEBS Lett.372，39-43；Gutierrez L.M.，Viniegra S.，Rueda J.，Ferrer-Montiel A.V.，Canaves J.M.and Montal M.(1997)“A peptidethat mimics the C-terminal sequence of SNAP-25 inhibitssecretory vesicle docking in chromaffin cells”J.Biol.Chem.272，2634-2639；Blanes-Mira C，Valera E.，Fernández-BallesterG.，Merino J.M.，Viniegra S.，Gutierrez L.M.，Perez-PayáE.and Ferrer-Montiel A.(2004)“Small peptides patterned after theN-terminus doma in of SNAP-25 inhibi tSNARE complex assembly andregulated exocytosis”J.Neurochem.88，
124-135]、源自突触融合蛋白氨基酸序列的肽类[Martin F.，Salinas E.，Vazquez J.，Soria B.and Reig J.A.(1996)“Inhibition of insulin release bysynthetic peptides show that the H3 region at the C-terminaldomain of syntaxin-1 is
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crucial for Ca -but not for guanosine5’-[gamma-thio]thriphosphate-induced secretion”Biochem.J.320，201-205]、源自突触囊泡蛋白氨基酸序列的肽类[Cornille F.，Deloye F.，Fournie-Zaluski M.C.，Roques B.P.and PoulainB.(1995)“Inhibition of neurotransmitter release by syntheticproline-rich peptides shows that the N-terminal domain ofvesicle-associated membrane protein/synaptobrevin is criticalfor neuron-exocytosis”J.Biol.Chem.270，16826-16830]、突源自触结合蛋白氨基酸序列的肽类[Mehta P.P.，Batternger E.andWilson M.(1996)“SNAP-25
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and synaptotagmin involvement in thefinal Ca -dependent triggering of
neurotransmitter exocytosis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10471-10476]、及 源 自snapin蛋白氨基酸序列的肽类[Ilardi J.M.，Mochida S.and Sheng Z.H.(1999)“Snapin：
A SNARE associated protein implicated in synaptictransmission”Nat.Neurosci.2，
119-124]。相同的，通过合理设计或通过跟踪可干扰SNARE复合体形成的合成性化学库所获得的抑制神经元胞吐的合成肽类也曾被描述[Blanes-Mira C.，Pastor M.T.，Valera E.，Fernández-Ballester G.，Merino J.M.，Gutierrez L.M.，Perez-Pava E.and Ferrer-Montiel A.(2003)“Identification ofSNARE complex modulators that inhibit exocytosis form an α-helix-constrained combinatorial library”Biochem J.375，
159-166]。
[0010] 此类化合物的产业应用受到限制。美容工业已大力发展模拟肉毒杆菌毒素专门用于治疗和预防表情纹形成的作用的化合物[Blanes-Mira C.，Clemente J.，Jodas G.，Gil A.，Fern ández-Ballester G.，Ponsati B.，Gutierrez L.M.，Pérez-Pay áE.and Ferrer-Montiel A.(2002)“A synthetic hexapeptide( )withanti-wrinkle activity”Int.J.CosmeticRes.24，303-310]。具体地说，Lipotec，S.A.的专利EP1,180,524描述具有抗皱功能的衍生自SNAP-25蛋白质氨基末端片段的肽类，并且国际专利申请WO97/34620也描述可抑制神经元胞吐的衍生自SNAP-25蛋白质氨基酸序列特别是源自其羧基末端区域、或源自突触囊泡蛋白或源自突触融合蛋白的肽类。
[0011] 上述专利没有一个涉及SNAP-25蛋白质的不可逆的化学修饰衍生物作为神经元胞吐的调节剂。专利EP1,180,524描述了潜在的可逆的化学修饰的SNAP-25蛋白质氨基末端的肽类，以增加其生物利用度及便于通过血脑屏障和上皮组织，诸如酯化天冬氨酸及谷氨酸残基的侧链，该肽随后将在活体内由细胞内酯酶降解，恢复为具有生物活性的未经修饰的肽。意外的是，本发明的申请人发现对该肽类的氨基和羧基末端进行不可逆的化学修饰不仅令它们对细胞内蛋白酶的降解有更高抗性，导致它们作为神经元胞吐调节剂作用的更长持续时间，更意外的是它们在活体外的疗效相对于未修饰肽可增加2至30倍。
[0012] 以脂链修饰蛋白质若发生在蛋白质序列的氨基基团上被称为不可逆修饰，不论是它们的氨基末端或赖氨酸残基的侧链，但若发生在半胱氨酸残基的硫醇基团上则被认为是可逆的，因为经修饰的肽或蛋白质在活体内会被对应的硫酯酶水
解 [Magee A.I.(1990)“Lipidmodification of proteins and its relevance
to proteintargeting”J.Cell Sci.97，581-584；Mumby S.M.(1997)“Reversible palmitoylation of signaling proteins”Curr.Opin.Cell Biol.9，148-154]。 现有技术描述以脂肪酸链衍生物不可逆的修饰肽类的实例，其目的为改善它们活体内疗效、增加它们通过皮肤的渗透[Lintner K.and Peschard O.(2000)“Biologically activepeptides：from a labora tory bench curiosity to a functional
skincare product”Int.J.Cosmet.Sci.22，207-218]或实现更好的免疫应答以发展成为潜在的疫 苗[Gahery H.，Choppin J.，BourgaultI.，Fischer E.，Maillere B.and Guillet J.E.(2005)“HIVpreventive vaccine research at the ANRS：the lipopeptidevaccine approach”Therapie 60，243-248]，以及诱导对细菌[Eisenstein B.I.(2004)“Lipopeptides，focusing on daptomycin，for the treatment of Gram-positive infections”Expert Opin.Investig.Drugs 13，1159-1169] 或
对 真 菌 [Avrahami D.and ShaiY.(2004)“A New Group of Antifungal and
AntibacterialLipopeptides Derived from Non-membrane Active PeptidesConjugated to Palmitic Acid”J.Biol.Chem.279，12277-12285]更高的细胞毒作用。这种修饰不一定造成该肽类在活体外的疗效改变；举例来说，GHK三肽的十六酰化不改变其诱导纤维母细胞合成胶原的能力[Lintner K.and Peschard O.(2000)“Biologically activepeptides：
from a laboratory bench curiosity to a functional skincare product”Int.J.Cosmet.Sci.22，207-218]，所以本领域技术人员在本发明提出时无法预测经烃基修饰的肽相对于该对应的未修饰肽其活体外疗效将是会增加、降低或不改变。
解 [Magee A.I.(1990)“Lipidmodification of proteins and its relevance
to proteintargeting”J.Cell Sci.97，581-584；Mumby S.M.(1997)“Reversible palmitoylation of signaling proteins”Curr.Opin.Cell Biol.9，148-154]。 现有技术描述以脂肪酸链衍生物不可逆的修饰肽类的实例，其目的为改善它们活体内疗效、增加它们通过皮肤的渗透[Lintner K.and Peschard O.(2000)“Biologically activepeptides：from a labora tory bench curiosity to a functional
skincare product”Int.J.Cosmet.Sci.22，207-218]或实现更好的免疫应答以发展成为潜在的疫 苗[Gahery H.，Choppin J.，BourgaultI.，Fischer E.，Maillere B.and Guillet J.E.(2005)“HIVpreventive vaccine research at the ANRS：the lipopeptidevaccine approach”Therapie 60，243-248]，以及诱导对细菌[Eisenstein B.I.(2004)“Lipopeptides，focusing on daptomycin，for the treatment of Gram-positive infections”Expert Opin.Investig.Drugs 13，1159-1169] 或
对 真 菌 [Avrahami D.and ShaiY.(2004)“A New Group of Antifungal and
AntibacterialLipopeptides Derived from Non-membrane Active PeptidesConjugated to Palmitic Acid”J.Biol.Chem.279，12277-12285]更高的细胞毒作用。这种修饰不一定造成该肽类在活体外的疗效改变；举例来说，GHK三肽的十六酰化不改变其诱导纤维母细胞合成胶原的能力[Lintner K.and Peschard O.(2000)“Biologically activepeptides：
from a laboratory bench curiosity to a functional skincare product”Int.J.Cosmet.Sci.22，207-218]，所以本领域技术人员在本发明提出时无法预测经烃基修饰的肽相对于该对应的未修饰肽其活体外疗效将是会增加、降低或不改变。
[0013] 由共价连接重复性聚乙二醇单位的方式对肽类及蛋白质进行不可逆的化学修饰称为“聚乙二醇化”，其目的基本上是为了增加肽类及蛋白质的活体内半衰期、降低其毒性及减少其免疫原性及抗原性，这在本领内也是公知的[Savoca K.V.，Abuchowski A.，van Es T.，DavisF.F.and Palczuk N.C.(1979)“Preparation of a non-immunogenicarginase by the covalent attachment of polyethylene glycol”Biochim.Biophys.Acta 578，47-53；Hershfield M.S.，BuckleyR.H.，Greenberg M.L.，Melton A.L.，Schiff R.，Hatem C.，Kurtzberg J.，Markert M.L.，Kobayashi R.H.，Kobayashi A.L.，etal.(1987)“Treatment of adenosine deaminase deficiency withpolyethylene glycol-modified adenosine deaminase”N.Engl.J.Med 316，589-596；Katre N.V.(1990)“Immunogenicity ofrecombinant IL-2 modified by covalent attachment ofpolyethylene glycol”J.Immunol.144，209-213；Wang Q.C.，PaiL.H.，Debinski W.，FitzGerald D.J.and Pastan I.(1993)“Polyethylene glycol-modified chimeric toxin composed
oftransforming growth factor oc and Pseudomonas exotoxin”CancerRes.53，
4588-4594；Clark R.，Olson K.，Fuh G.，Marian M.，Mortensen D.，Teshima G.，Chang S.，Chu H.，Mukku V.，Canova-Davis E.，Somers T.，Cronin M.，Winkler M.and WellsJ.A.(1996)“Long-acting growth hormones produced by conjugationwith polyethylene glycol”J.Biol.Chem.271，21969-21977；HeX.H.，Shaw P.C.and Tam S.C.(1999)“Reducing the immunogenicityand improving the in vivo activity of trichosanthin bysite-directed pegylation”Life Sci.65，355-368；Harris J.M.and Chess R.B.(2003)“Effect of PEGylation on pharmaceuticals”Nat.Rev.Drug Discov.2，214-221]。现有技术中的实例描述为了改善肽类和蛋白质分布及排泄的药理学特性及在不需改变它们活体外生物活性下改善它们活体内生物活性所进行的修饰，但是这些实例并未提到潜在的聚乙二醇化可增加蛋白质的活体外生物活性，相反的，在诸如聚乙二醇化干扰素的实例中其活体外活性相对于天然干扰素是下降的[Rajender Reddy K.，Modi M.W.and Pedder S.(1992)“Useof peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment ofhepatitis C”Adv.Drug Deliv.Rev.54(4)，571-86]。
oftransforming growth factor oc and Pseudomonas exotoxin”CancerRes.53，
4588-4594；Clark R.，Olson K.，Fuh G.，Marian M.，Mortensen D.，Teshima G.，Chang S.，Chu H.，Mukku V.，Canova-Davis E.，Somers T.，Cronin M.，Winkler M.and WellsJ.A.(1996)“Long-acting growth hormones produced by conjugationwith polyethylene glycol”J.Biol.Chem.271，21969-21977；HeX.H.，Shaw P.C.and Tam S.C.(1999)“Reducing the immunogenicityand improving the in vivo activity of trichosanthin bysite-directed pegylation”Life Sci.65，355-368；Harris J.M.and Chess R.B.(2003)“Effect of PEGylation on pharmaceuticals”Nat.Rev.Drug Discov.2，214-221]。现有技术中的实例描述为了改善肽类和蛋白质分布及排泄的药理学特性及在不需改变它们活体外生物活性下改善它们活体内生物活性所进行的修饰，但是这些实例并未提到潜在的聚乙二醇化可增加蛋白质的活体外生物活性，相反的，在诸如聚乙二醇化干扰素的实例中其活体外活性相对于天然干扰素是下降的[Rajender Reddy K.，Modi M.W.and Pedder S.(1992)“Useof peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment ofhepatitis C”Adv.Drug Deliv.Rev.54(4)，571-86]。
[0014] 意外的是，本发明显示源自SNAP-25蛋白质的肽序列的不可逆化学修饰可增加该序列的神经元胞吐抑制功效。现有技术并未显示该功效一定会增加该肽类的抑制作用，因此本领域技术人员无法推论出要增加肽类抑制神经元胞吐能力所需要的修饰特性。
[0015] 因此本发明为存在需求提供一种新颖的解决方案，其包含发现源自SNAP-25蛋白质的不可逆化学修饰肽序列，其相对于现有技术中已知的该对应未修饰肽可以更有效和延长的方式抑制神经元胞吐。【发明内容】
[0016] 本发明提供一种简单有效且无风险的调节神经元胞吐的解决方案，其包含施用包含至少一种具有源自SNAP-25蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列的肽且其氨基和/或羧基端经不可逆化学修饰的组合物至哺乳动物身体。
[0017] 因此，本发明的第一个方面涉及可调节神经元胞吐的通式(I)的肽：
[0018] R1-AA-R2
[0019] (I)
[0020] 其立体异构物及其外消旋或非外消旋混合物，及其美容或药学上可接受的盐类，其中
[0021] AA是3至40个包含在氨基酸序列SEQ ID NO.1中的相邻氨基酸的序列；
[0022] R1是选自H或烷基、芳基、芳烷基或酰基中；且R2是选自经脂肪族或环状基团取代或未经取代的氨基、羟基或硫醇基中；
[0023] 条件是当R1是H或乙酰基时，R2不是未经取代的氨基、羟基或硫醇基。
[0024] 通式(I)所示的肽的优选结构是其中
[0025] R1是H或乙酰基或饱和或不饱和的直链、支链或环状C3至C24酰基基团或聚乙二醇聚合物；
[0026] R2是经饱和或不饱和的直链、支链或环状C1至C24脂肪族任意取代的氨基或羟基；
[0027] 条件是当R1是H或乙酰基时，R2不是未经取代的氨基或羟基。
[0028] 更优选的结构是其中该聚乙二醇聚合物是
[0029]
[0030] 其中n可从1至100不等，且更优选的是其可从1至5不等。
[0031] 此外，优选的结构是其中R1是化学式CH3-(CH2)m-CO-的酰基，其中m可从1至22不等。
[0032] 本发明的肽类可以立体异构体或立体异构体的混合物存在；举例来说，形成它们的氨基酸可具有L-、D-构型，或可各自独立为外消旋形式。因此根据不对称碳的数目及存在何种异构体或异构体混合物，可能获得异构体混合物以及消旋体或非对映异构体的混合物或纯的非对映异构体或对映异构体。本发明的肽的优选结构是纯的异构体，即对映异构体或非对映异构体。
[0033] 在本发明中，术语“脂肪族”涉及饱和或不饱和的直链或环状基团。
[0034] 本发明所使用的术语“烃基”举例来说包含烷基、烯基或炔基。
[0035] 术语“烷基”涉及饱和的直链或支链烃基，包括例如甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、庚基、十二基、十六基、十八基、戊基、2-乙基己基、2-甲基丁基、5-甲基己基等。
[0036] 术语“烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃基，诸如乙烯基。
[0037] 术语“炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的不饱和直链或支链烃基。
[0038] 术语“环状基团”涉及封闭的烃环，其可被分成脂环族、芳香族或杂环基团。
[0039] 术语“脂环基团”涉及具有脂肪族类似特性的环状烃基。
[0040] 术语“芳香族”或“芳基”涉及单环或多环的芳香烃基。
[0042] 术语“聚乙二醇聚合物”涉及经取代或未经取代的包含重复性-CH2CH2O-基团单位的烃链。
[0043] 如在本技术领域所了解的，高度取代的存在不仅是被接受而是更为推荐的。因此，本发明的肽可被取代。为了简化本发明的说明书，“基团(group)”和“段(block)”将被用来区别允许取代或可被取代的化学物种(基团)和不允许取代或无法被取代的化学物种(段)。这样，当术语“基团”被用于描述化学取代基，该被描述的化学物质包括未被取代的基团及包含O、N或S原子的基团。
[0044] 另一方面，当术语“段”被用来描述化学化合物或取代基时，只有未被取代的化学物质可被包括。举例来说，“烷基基团”的表示方式不只包括开放链的饱和烷基化合物诸如甲基、乙基、丙基、异丁基等，同时也包括包含其它现有技术的已知的取代基的烷基取代基诸如羟基、烷氧基、氨基、羧基、羧酰胺、卤素原子、氰基、硝基、烷基磺酰基及其它。这样，“烷基基团”包括醚、卤烷基、醇、硫醇基、羧基、胺、羟烷基、磺烷基、胍基团及其它。另一方面，“烷基段”的表示方式仅限于包括开放链的饱和烷基取代基，诸如甲基、乙基、丙基、异丁基等。
[0045] 本发明中“源自SNAP-25蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列”是指任何包含在SEQ ID No.1所定义的SNAP-25蛋白质氨基酸序列中的氨基酸序列或片段，或任何通过突变、插入、删除或取代至少一个氨基酸或通过遗传密码简并而与包含在SEQ ID No.1序列中的序列不同的氨基酸序列，条件是该序列对应具有SNAP-25蛋白质活性的肽。该突变、插入或取代可借助于基因编码的氨基酸或非编码的氨基酸发生，不论该氨基酸是天然或合成的，诸如但不限于瓜氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、锁链素、正缬氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氯苯基丙氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、环丝氨酸、卡尼汀、胱氨酸、青霉胺、焦谷氨酸、噻吩丙氨酸、羟脯氨酸、别异壳氨酸、别苏氨酸、六氢异烟酸、异丝氨酸、苯甘氨酸、抑制素、β-丙氨酸、正亮氨酸、N-甲基氨基酸、β-氨基酸或γ-氨基酸等以及它们的衍生物。合成氨基酸的清单可见于文献“Unusual amino acidsin peptide synthesis”by Roberts D.C.and Vellaccio F.，in thePeptides，Vol.5(1983)，Chapter VI，Gross E.and Meienhofer J.，Eds.，Academic Press，New York，USA或该领域专门公司的商业目录中，诸如NeoMPS，Bachem，Novabiochem，Sigma-Aldrich，PeptidesInternational，Advanced ChemTech，Chem-Impex，MaybridgeChemical，Chirotech Technology，Peninsula Laboratories或RSPAmino Acid Analogues等。
[0046] 在本发明衍生自SEQ ID No.1所定义的SNAP-25氨基酸序列且经不可逆化学修饰的肽类中，优选的序列是那些具有包含在SEQ ID No.2所定义的SNAP-25蛋白质的氨基末端区域、或SEQ ID No.3所定义的SNAP-25蛋白质的羧基末端区域的序列中的氨基酸序列的序列，更优选的是包含在SEQ ID No.4所定义的残基10至22之间所包含的区域、或包含在SEQ ID No.5所定义的残基25至40之间所包含的区域、或包含在SEQ ID No.6所定义的残基65至81之间所包含的区域、或包含在SEQ ID No.7所定义的残基181至206之间所包含的区域、更具体为包含在SEQ ID No.8所定义的残基12至19之间所包含的区域、或包含在SEQ ID No.9所定义的残基26至38之间所包含的区域、或包含在SEQ ID No.10所定义的残基68至79之间所包含的区域、和特别是包含在SEQ ID No.11所定义的残基12至17之间所包含的区域。
[0047] 本发明也包括实质上与源自SNAP-25蛋白质氨基酸序列的不可逆化学修饰肽类同源的肽类。“实质上同源的肽类”被认为是指那些与SEQ ID No.1序列具有至少60％、优选80％及更优选95％一致性的氨基酸序列。“一致性百分比”涉及二个经最佳比对比较的氨基酸序列之间一致的氨基酸百分比，其中该百分比仅为统计性，二个氨基酸序列之间的差异随机遍布在序列中。“最佳比对”是被了解为比对氨基酸序列以产生更高的一致性百分比。一致性百分比的计算是测定二个比较序列中氨基酸相同的一致性位置的数目，将一致性位置的数目除以比较位置的数目，得到的结果乘以100以获得二个序列之间的一致性百分比。二个氨基酸序列之间的序列比较可由人工或通过计算机程序诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)算法进行，其可通过网络在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上取得。
[0048] 本发明所提供的肽的美容或药学上可接受的盐是包含在本发明的范围内。“美容或药学上可接受的盐”包括通常用于形成金属盐或酸加成盐的盐，不论是有机酸加成盐(诸如醋酸盐、柠檬酸盐、油酸盐、三氟醋酸盐、草酸盐或葡糖酸盐等)或无机酸加成盐(诸如氯化物、硫酸盐、硼酸盐或碳酸盐等)。该盐的性质并不重要，条件是为美容或药学上可接受的。本发明的肽的美容或药学上可接受的盐可由现有技术所熟知的常规方法获得。
[0049] 本发明的肽的合成可根据现有技术所熟知的常规方法进行，例如采用固相肽nd合 成 法 [Stewart J.M.and Young J.D.(1984)“SolidPhase Peptide Synthesis，2 edition”，Pierce Chemical Company，Rockfor d，Illinois.Bodanzsky M.and Bodanzsky A.(1984)“Thepractice of Peptide Synthesis”，Springer Verlag，New York；
Lloyd-Williams，P.，Albericio，F.and Giralt，E.(1997)“Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides andProteins”CRC，Boca Raton(FL，USA)]、溶液合成、固相合成及溶液合成法的组合或酶合成法[Kullmann W.(1980)“Proteases ascatalysts for enzymic syntheses of opioid peptides”J.Biol.Chem.255，8234-8238]。该肽也可通过经基因工程修饰或未修饰以产生所需序列的菌株发酵，或通过控制释放包含至少该所需序列的肽片段的动物或植物来源，优选为植物来源的蛋白质水解来获得。
Lloyd-Williams，P.，Albericio，F.and Giralt，E.(1997)“Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides andProteins”CRC，Boca Raton(FL，USA)]、溶液合成、固相合成及溶液合成法的组合或酶合成法[Kullmann W.(1980)“Proteases ascatalysts for enzymic syntheses of opioid peptides”J.Biol.Chem.255，8234-8238]。该肽也可通过经基因工程修饰或未修饰以产生所需序列的菌株发酵，或通过控制释放包含至少该所需序列的肽片段的动物或植物来源，优选为植物来源的蛋白质水解来获得。
[0050] 举例来说，获得本发明的肽的一种方法是其中具有游离羧基或其反应衍生物的本发明的肽的片段是与具有含至少一个游离氢原子的氨基基团的互补片段反应以形成酰胺类键，其中如果存在不参予形成酰胺类键的所述片段官能团，那么该官能团是由暂时或永久的保护性基团方便地保护。
[0051] 其它获得本发明的肽的方法的实例是其中具有离去基团诸如甲苯磺酰基、甲磺酰基及卤素基团等的本发明的肽的片段是与具有含至少一个游离氢原子的氨基基团的互补片段借助于亲核取代反应的方式反应，其中如果存在不参予N-C键形成的所述片段官能团，那么该官能团是由暂时或永久的保护性基团方便地保护。保护性基团的实例、它们的插入及删除描述在文献[Greene T.W.(1981)“Protective groupsin organic synthesis”John Wiley & Sons，New Cork；AthertonB.and Sheppard R.C.(1989)“Solid Phase Peptide Synthesis：Apractical approach”IRL Oxford University Press]中。术语“保护性基团”也包括使用于固相合成中的聚合性支持物。
[0052] 当该合成完全或部分在固相中进行时，下列提到的可作为本发明的方法中所使用的固相载体：由聚苯乙烯、聚乙二醇接枝聚苯乙烯等所制成的载体，诸如对甲基二苯甲胺树脂(MBHA)[Matsueda G.R.andSteewart J.M.(1981)“A p-methylbenzhydrylamine resin forimproved solid-phase synthesis of peptide amides”Peptides 2，45-50]、2-氯三苯甲基树脂[(a)Barlos K.，Gatos D.，Kallitsis J.，Papaphotiu G.，Sotiriu P.，Wenqing Y.and W.(1989)“Darstellung geschützten peptid-fragmente untereinsatzsubstituierter triphenylmethyl-harze”Tetrahedron Lett.30，3943-3946；
(b)Barlos K.，Gatos D.，Kapolos S.，Papaphotiu G.， W.，and Wenqing
Y.(1989)“Veresterung von partiell geschützten peptid-fragmenten mit harzen.Einsatz von2-chlorotritylchlorid zur synthese von Leu15-gastrin I”Tetrahedron Lett.30，3947-3951]、 树脂(Rapp PolymereGmbH)、 树脂
(Matrix Innovation，Inc)等，其可包括或不包括允许化合物脱保护和同时从该聚合性载体上裂解的不稳定间隔物(spacer)，诸如5-(4-氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL)[Albericio F.，Kneib-Cordonier N.，Biancalana S.，Gera L.，Masada R.I.，Hudson D.and Barany G.(1990)“Preparation andapplication of the 5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3，5-dimethoxy-phenoxy)valeric acid(PAL)handlefor the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amidesunder mild conditions”J.Org.Chem.55，3730-3743]、2-[4-氨基甲基(aminometily)-(2，4-二甲氧基苯基)苯氧醋酸(AM)[RinkH.(1987)“Solid-phase synthesis of protectedpeptide fragmentsusing a trialkoxy-diphenyl-methylester resin”TetrahedronLett.28，3787-3790]、Wang[Wang S.S.(1973)“p-AlkoxybenzylAlcohol Resin and p-Alkoxybenzyloxycarbonylhydrazide Resin forSolid Phase Synthesis of Protected Peptide Fragments”J.Am.Chem.Soc.95，1328-1333]等。
(b)Barlos K.，Gatos D.，Kapolos S.，Papaphotiu G.， W.，and Wenqing
Y.(1989)“Veresterung von partiell geschützten peptid-fragmenten mit harzen.Einsatz von2-chlorotritylchlorid zur synthese von Leu15-gastrin I”Tetrahedron Lett.30，3947-3951]、 树脂(Rapp PolymereGmbH)、 树脂
(Matrix Innovation，Inc)等，其可包括或不包括允许化合物脱保护和同时从该聚合性载体上裂解的不稳定间隔物(spacer)，诸如5-(4-氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL)[Albericio F.，Kneib-Cordonier N.，Biancalana S.，Gera L.，Masada R.I.，Hudson D.and Barany G.(1990)“Preparation andapplication of the 5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3，5-dimethoxy-phenoxy)valeric acid(PAL)handlefor the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amidesunder mild conditions”J.Org.Chem.55，3730-3743]、2-[4-氨基甲基(aminometily)-(2，4-二甲氧基苯基)苯氧醋酸(AM)[RinkH.(1987)“Solid-phase synthesis of protectedpeptide fragmentsusing a trialkoxy-diphenyl-methylester resin”TetrahedronLett.28，3787-3790]、Wang[Wang S.S.(1973)“p-AlkoxybenzylAlcohol Resin and p-Alkoxybenzyloxycarbonylhydrazide Resin forSolid Phase Synthesis of Protected Peptide Fragments”J.Am.Chem.Soc.95，1328-1333]等。
[0053] 本发明的肽可通过任何导制该化合物以包含它们的组合物的形式与哺乳动物，优选为人的身体上的作用部位接触的方式给予以调节神经元胞吐。从这个角度讲，本发明提供一种包含至少一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐的美容或药学组合物。该组合物可通过本领域技术人员所熟知的常规方法制备。
[0054] 本发明的肽是以可达到所需效果的美容或药物有效浓度被用于本发明的美容或药物组合物中；优选为在0.00000001％(重量)和20％(重量)之间；优选在0.00001％(重量)和10％(重量)之间及更优选在0.0001％(重量)和5％(重量)之间。
[0055] 本发明的肽对象根据它们序列的特性或它们在氨基及羧基端的修饰而有不同的水溶性。不溶于水的肽可溶解于常规的美容或药学上可接受的溶剂中，诸如乙醇、丙醇或异丙醇、丙二醇、甘油、丁二醇或聚乙二醇。
[0056] 本发明中必须被给予以治疗病理状态的肽和/或药物组合物的药物有效量以及其剂量将视一些因素而定，包括患者的年龄、病症、该病损或疾病的严重性、给药方法及频率以及所使用的特定肽。
[0057] 包含本发明的肽的药物组合物可具有任何给药形式例如固体或液体，例如可经任何适当途径给予例如口服、鼻道、非肠道、经直肠、局部或经皮，为此它们将包含必须的药物赋形剂以配制成所需的给药形式。在本发明中，术语“非肠道”包括皮下、皮内、血管内注射诸如静脉内、肌肉内、脊椎、颅内、关节内、鞘内及腹腔内注射，以及任何其它类似的注射或输注技术。有关医学产品给药的不同的医药形式和用于获得它们的必要赋形剂的回顾可见于例如“Tratado deFarmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，1993，Luzán 5，S.A.Ediciones，Madrid。
[0058] 本发明的肽也可被预先加入美容或药物持续释放系统和/或载体系统中诸如脂质体、毫米颗粒、微米颗粒及纳米颗粒、海绵、囊胞、微团、毫米球、微米球及纳米球、脂球体、毫米胶囊、微米胶囊及纳米胶囊、以及微米乳剂及纳米乳剂，为了达到活性成分更大的穿透力和/或改善其药物代谢动力学及药效学特性。该控制释放制剂可由现有技术中已知的方法制备，其可通过例如局部给药包括粘性贴剂、或经口、经直肠或通过皮下在、或通过直接在身体特定部分植入，且必须优选地释放相对稳定量的本发明的肽。该控制释放制剂所包含的肽的量将视例如给药部位、本发明的释放肽的释放动力学及释放时间以及所欲治疗或预防的病症的特性而定。
[0060] 包含本发明的肽的美容或药物制剂可被用于供局部施用的不同类型的制剂中，诸如但不限于霜剂、油和/或二甲硅油(silicon)在水中的乳剂、水在油和/或二甲硅油中的乳剂、油类、乳制品、香油、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、肥皂、软膏、摩丝、油膏、棒(bars)、笔(pencils)及喷剂，包括“不须冲洗”及“需洗净”的制剂，也可由本领域技术人员所熟悉的技术被加入到不同类型的固相配件中诸如药巾、凝胶、粘性(或无粘性)贴片或面膜，或可被包含于不同的化妆品方面的产品中诸如粉底、乳液、卸妆乳、遮瑕膏、眼影及唇彩等。
[0061] 该肽也可被加入到供制造直接与身体皮肤接触的衣服的织物中，以使本发明的肽通过系统生物降解以锚定至组织或通过衣服与身体摩擦、通过身体湿度、通过皮肤pH值或通过身体温度释放。衣服、织物及在组织中固定肽类的方法包括微胶囊化的实例是描述在文献中且属于现有技术[Schaab C.K.(1986)“Impregnating Fabrics WithMicrocapsules”，HAPPI May 1986；Nelson G.(2002)“Applicationof microencapsulation in textiles”Int.J.Pharm.242，55-62]。优选的衣服是绷带(bandages)。
[0062] 本发明的美容或药物组合物对象可被应用于需要治疗或照顾的身体区域，通过皮下注射、真皮内注射、蒸气包裹的方式或通过离子透入法的方式以实现更多的有效成分穿透的目的。施用区域是由所欲治疗的病症的特性决定。优选的施用区域是具有表情纹的前额区域以及眉毛之间区域、嘴部周围和/或眼睛周围的皱纹及细纹。
[0063] 本发明所要求保护的美容或药物组合物可包含其它经常用于照顾、清洁及治疗皮肤的组合物中的成分，诸如但不限于乳化剂、润肤剂、有机溶剂、皮肤调理剂诸如湿润剂、α羟酸、润湿剂、维生素、色素或染料、凝胶聚合物、增稠剂、软化剂、除皱剂、可减少或消除眼袋的药剂、美白或脱色剂、去角质剂、抗老化剂、捕捉自由基和/或抗大气污染的药剂、一氧化氮合成酶抑制剂、抗氧化剂、抗糖化剂、抗微生物剂、抗真菌剂、刺激皮肤或表皮大分子合成和/或可防止它们降解的药剂诸如刺激胶原合成的药剂、刺激弹性蛋白合成的药剂、刺激核心蛋白聚糖合成的药剂、刺激层粘连蛋白合成的药剂、抑制胶原降解的药剂、抑制弹性蛋白降解的药剂、刺激纤维母细胞增生的药剂、刺激角质形成细胞增生的药剂、刺激角质形成细胞分化的药剂、刺激脂质及角质层组分(神经酰胺、脂肪酸等)合成的药剂、皮肤舒缓剂(relaxing agent)、刺激糖胺聚糖合成的药剂、固化剂、去妊娠纹剂(anti-stretch marks agents)、安定剂(calming agent)、抗炎剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、作用于细胞代谢的药剂、刺激和/或抑制黑色素形成的药剂、欲改善真皮-表皮交界处的药剂、防腐剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、由生物发酵得到的药剂、矿物盐、细胞提取物及遮光剂(可抗紫外线A和B的有机或矿物性光保护剂)等，条件是它们与该组合物中的其它组分并且特别是本发明的组合物所包含的通式(I)的肽在物理和化学上相容。该其它成分的特性可以是合成的或天然的诸如植物提取物，或可来自生物发酵程序。
[0064] 本发明的其它方面涉及美容或药物组合物，其包含美容或药物有效量的至少一种本发明的肽并且也包含美容或药物有效量的至少一种具抗皱和/或抗老化活性的提取物例如但不限于葡萄(Vitisvinifera)、玫瑰果油(Rosa canina)、姜黄(Curcuma longa)、香根鸢尾(Iris pallida)、可可(Theobroma cacao)、银杏(Ginkgo biloba)、或盐藻(Dunaliella salina)提取物等，或也包含至少一种具抗皱和/或抗老化活性的合成化合物、提取物或生物发酵产物例如但不限于Sederma上市的 Pentapharm上市的 或Syn- Cognis上市的MyoxinolTM、Exsymol上市的Algisum
或 Hydroxyprolisilane Lipotec 上 市 的
或 InstitutEuropeen
de Biologie Cellulaire上 市的 Vincience上 市的 或
钙离子通道拮抗剂诸如阿尔维林、锰或镁盐、某种仲胺或叔胺、视黄醇
及其衍生物、艾地苯醌及其衍生物、辅酶Q10及其衍生物、乳香酸及其衍生物、γ-氨基丁酸或氯离子通道激动剂等。
或 Hydroxyprolisilane Lipotec 上 市 的
或 InstitutEuropeen
de Biologie Cellulaire上 市的 Vincience上 市的 或
钙离子通道拮抗剂诸如阿尔维林、锰或镁盐、某种仲胺或叔胺、视黄醇
及其衍生物、艾地苯醌及其衍生物、辅酶Q10及其衍生物、乳香酸及其衍生物、γ-氨基丁酸或氯离子通道激动剂等。
[0065] 本发明的组合物可包含或可与止痛化合物和/或抗炎化合物组合给予，其目的是减少敏感性皮肤的肿胀及刺激。类固醇型化合物诸如氢化可的松、非类固醇型化合物诸如对乙酰氨基酚或乙酰水杨酸或具有内在止痛及抗炎活性的天然提取物或精油。
[0066] 本发明的肽抑制神经元胞吐的作用机制与肉毒杆菌毒素类似，因此可以认为该肽可有效治疗面部皱纹和/或面部不对称以及治疗出现肌肉痉挛的病症诸如难产(dystonias)、斜视、眼睑痉挛、斜颈、抽搐等。
[0067] 因此本发明的其它方面涉及至少一种通式(I)的肽在制备治疗那些哺乳类中(特别是人)需要神经元胞吐调节的病症的美容或药物组合物中的用途。本发明的其它方面涉及至少一种通式(I)的肽在制备用于治疗、清洁或照顾皮肤的美容或药物组合物中的用途。本发明的其它方面涉及至少一种源自SNAP-25蛋白质氨基酸序列的不可逆化学修饰肽在制备用于减少和/或消除面部不对称及面部皱纹优选为表情纹的美容或药物组合物中的用途。本发明的其它方面涉及至少一种源自SNAP-25蛋白质氨基酸序列的不可逆化学修饰肽在制备用于治疗那些出现肌肉痉挛的神经障碍或病态诸如难产、斜视、眼睑痉挛、斜颈、抽搐等的美容或药物组合物中的用途。
[0068] 本发明的其它方面涉及一种用于治疗那些哺乳动物中(特别是人)需要神经元胞吐调节的病症的美容或药物方法，其包含给予有效量的至少一种通式(I)的肽，优选是包含该肽的美容或药物组合物的形式。本发明另外提供一种用于减少和/或消除面部皱纹或用于治疗面部不对称的美容或药物方法，其包含向面部皮肤施用包含至少一种本发明的肽或其美容或药学上可接受的盐的美容或药物组合物。本发明也提供一种用于治疗那些出现肌肉痉挛的神经障碍或病态诸如难产、斜视、眼睑痉挛、斜颈、抽搐等的美容或药学方法，其包含施用包含至少一种本发明的肽或其美容或医药上可接受的盐的美容或药物组合物。
[0069] 施用频率视各每个受试者的需求可具有广泛差异，建议的施用范围从一个月一次至一天10次，优选为一周一次至一天4次，更优选为一周三次至一天二次，甚至更优选为一天一次。
[0071] 图1显示在本发明的肽以0.1mM的浓度存在下，在大鼠海马神经元的初级培养物3
释放的[H]-L-谷氨酸盐，被抑制超过40％，这表明该化合物为神经元胞吐抑制剂。被衍生自SEQ ID No.11所定义的SNAP-25蛋白的氨基酸序列的未修饰的肽以相同浓度仅抑制5％
3
的[H]-L-谷氨酸盐的释放，需要高出30倍(3μM)的浓度范围以达到与不可逆修饰肽相同的抑制作用。
释放的[H]-L-谷氨酸盐，被抑制超过40％，这表明该化合物为神经元胞吐抑制剂。被衍生自SEQ ID No.11所定义的SNAP-25蛋白的氨基酸序列的未修饰的肽以相同浓度仅抑制5％
3
的[H]-L-谷氨酸盐的释放，需要高出30倍(3μM)的浓度范围以达到与不可逆修饰肽相同的抑制作用。
[0072] 【实施方式】
[0073] 下列提供的特定实施例可用于说明本发明的特性。这些包含的实施例仅用于说明的目的，不可被解释为本文所要求保护的发明的限制。
[0074] 化学合成
[0075] 所有合成过程是在配备有多孔聚乙烯盘的聚丙烯注射器中进行。所有试剂和溶剂是合成级的，使用上不须经任何其它处理。以抽吸方式清除溶剂和试剂。芴甲氧羰(Fmoc)基团是由哌啶-DMF(2∶8，v/v)清除(1x1分钟，1x5分钟；5mL/g树脂)[Lloyd-Williams P.，AlbericioF.and Giralt，E.(1997)“Chemical Approaches to the Synthesisof Peptides and Proteins”CRC，Boca Raton(FL，USA)]。在脱保护、偶合及再次脱保护步骤之间的洗涤是经DMF(3x1分钟)进行，每克树脂使用10毫升溶剂。偶合反应利用3毫升溶剂/克树脂进行。偶合的控制是利用茚三酮试验进行[Kaiser E.，Colescott R.L.，Bossinger C.D.and Cook P.I.(1970)“Color test for detectionof free terminal amino groups in the solid-phase synthesis ofpeptides”Anal.Biochem.34，595-598]。所有合成转换及洗涤均在25℃下进行。
[0076] 在LCMS-QP 8000 Shimadzu设备(Kyoto，Japan)中进行电喷雾质谱分析，用MeCN∶H2O 4∶1(+0.1％TFA)混合物作为移动相，流速0.2mL/min。
[0077] 缩写：
[0078] 氨基酸所使用的缩写按照IUPAC-IUB生物化学命名委员会在Eur.J.Biochem.(1984)138，9-37及J.Biol.Chem.(1989)264，633-673中的规定。
[0079] AM，2-[4-氨基甲基-(2，4-二甲氧基苯基)]-苯氧醋酸；BoNT A，A型肉毒杆菌毒素；cps，厘泊；DCM，二氯甲烷；DIEA，N，N-二异丙基乙胺；DIPCDI，N，N’-二异丙基碳二亚胺；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DPPC，二棕榈酰磷脂酰胆碱；eq.，当量；Fmoc，芴甲氧羰基；HOBt，1-羟苯并三唑；INCI，国际化妆品原料名称；MBHA，对-甲基二苯甲胺；MeCN，乙腈；MLV，多层囊胞；MeOH，甲醇；NMP，N-甲基吡咯烷酮；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PEG，聚乙二醇；PEGn，-[NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-CH2CH2-CO-]n；rpm，每分钟转数；SNAP-25，突触相关膜蛋白(25千道尔顿)；tBu，叔丁基；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；ULV，单层囊胞。
[0080] 实施例1
[0081] 获得Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHA
[0082] 具有0.628mmol/g(95mmol，1eq.)功能化的151.3克Fmoc-AM-MBHA树脂根据所描述的消除Fmoc基团的一般方案经哌啶-DMF处理。在DIPCDI(36.6mL，237mmol，2.5eq.)和HOBt(35.6g，237mmol，2.5eq.)存在下将154.1g的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(237mmol，2.5eq.)加到未保护的树脂，使用DMF作为溶剂1小时。
[0083] 该树脂接着所描述的一般方法洗涤，重复脱Fmoc基团的处理以连接下一个氨基酸。根据所述的方案，连续以154.1g的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(237mmol，2.5eq.)、87.5g的Fmoc-Gln-OH(474mmol，5eq.)、88.2g 的Fmoc-L-Met-OH(237mmol，2.5eq.)、和 105.3g 的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(237mmol，2.5eq.) 和 105.3g 的 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(237mmol，2.5eq.)进 行 偶 合，每 个 偶 合 步 骤 有 36.5g HOBt(237mmol，2.5eq.)和 36.6mL DIPCDI(237mmol，2.5eq.)存 在，除 了 连 接Fmoc-L-Gln-OH 的 步 骤 中 使 用 71.3g HOBt(474mmol，5eq.)。
[0084] 所得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHA经DMF(5x1分钟)、DCM(4x1分钟)、二乙基醚(4x1分钟)洗涤并在真空中干燥。
[0085] 实施例2
[0086] 获得CH3-(CH2)m-CO-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2
[0087] 1.68克 Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHA(0.5mmol，0.296mmol/g，1eq.)的氨基末端Fmoc基团如在一般方法中所述脱去，并且在770mg HOBt(5mmol，10eq.)和770μLDIPCDI(5mmol，10eq.)存在下与预先溶解在DMF(10mL)中的CH3-(CH2)m-COOH(5mmol，10eq.)连接。允许其反应15小时，随后该树脂经THF(5x1分钟)、DCM(5x1分钟)、DMF(5x1分钟)、MeOH(5x1分钟)、DMF(5x1分钟)、THF(5x1分钟)、DMF(5x1分钟)、DCM(4x1分钟)、醚(3x1分钟)洗涤并在真空中干燥。
[0088] 1.00g干燥肽基树脂在室温下经15mL的TFA-iPr3Si-H2O(90∶5∶5)处理2小时。在冷的二乙基醚(100mL)上收集滤液，经4000rpm离心5分钟，轻轻倒出该醚溶液。以醚重复洗涤5次。最终沉淀物在真空下干燥。
[0089]
[0090] 实施例3
[0091] 获得Ac-PEGn-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2
[0092] 321.0毫 克 Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHA(0.095mmol，0.296mmol/g，1eq.)的氨基末端Fmoc基团如在一般方法中所述的脱去，并在36.5mg HOBt(0.237mmol，2.5eq.)和36.6μL DIPCDI(0.237mmol，2.5eq.)存在下加入预先溶解在NMP中的Fmoc-PEG1-OH(2.5eq.)，保持40-60分钟。该氨基末端Fmoc基团是如一般方法中所述，连接Fmoc-PEG1-OH和脱去Fmoc的反应进行(n-1)次，其中n＝1-100以得到不同的衍生物。氨基末端的乙酰化是与con Ac2O(2.5eq.)和DIEA(2.5eq.)在DMF中进行
30分钟。
30分钟。
[0093] 该Ac-PEGn-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHA树脂经DMF(5x1分钟)、DCM(4x1分钟)、二乙基醚(4x1分钟)洗涤并在真空中干燥。
[0094] 22.4mg的Ac-PEGn-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM-MBHAi在0℃下经1.57mL的TFA-Pr3Si-H2O(95∶2.5∶2.5)鸡尾酒处理5分钟，然后在室温下处理90分钟。该滤液在冷的二乙基醚(10mL)上收集，经4000rpm离心5分钟，轻轻倒出该醚溶液。以醚重复洗涤5次。最终油性残余物在MeCN∶H2O1∶1中复溶，并冷冻干燥。
[0095]
[0096] 实施例4
[0097] 获得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH-(CH2)s-CH3
[0098] 2.10克的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(3.23mmol，1equiv)被溶解在已添加500微升DIEA(2.9mmol，0.90equiv)的20毫升DCM中，其与干燥2-氯三苯甲基树脂(2.0g，3.3mmol)连接。放置搅拌5分钟，随后加入1mL的DIEA(5.9mmol，1.81eq.)，允许反应40分钟。其它氯基团通过加入1.6mL的MeOH处理保护。
[0099] 氨基末端Fmoc基团如一般方法中所述的脱去，在DIPCDI(770μL，5mmol，5eq.)和HOBt(770g，5mmol，5eq.)存在下将3.24g的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(5mmol，5eq.)与1mmol的氨酰树脂Fmoc-L-Arg(Pbf)- 连接1小时，使用DMF作为溶剂。该树脂接着如在一般方法中所描述的洗涤，重复脱去Fmoc基团的处理以连接下一个氨基酸。根据所述的方案，连续进行1.84g的Fmoc-L-Gln-OH(5mmol，5eq.)、1.86g的Fmoc-L-Met-OH(5mmol，
5eq.)、2.12g的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH和2.12g的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(5mmol，5eq.)偶合，每个偶合步骤有770mgHOBt(5mmol，5eq.)和770μL DIPCDI(5mmol，5eq.)存在，除了连接Fmoc-L-Gln-OH的步骤中添加1.54g HOBt(10mmol，10eq.)。
5eq.)、2.12g的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH和2.12g的Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(5mmol，5eq.)偶合，每个偶合步骤有770mgHOBt(5mmol，5eq.)和770μL DIPCDI(5mmol，5eq.)存在，除了连接Fmoc-L-Gln-OH的步骤中添加1.54g HOBt(10mmol，10eq.)。
[0100] 氨基末端Fmoc基团如在一般方法中所描述的脱去，该肽基树脂在4.28mL DIEA(25mmol，25eq.)存在下经2.36mL醋酸酐(25mmol，25eq.)处理30分钟，以DMF为溶剂，经DMF(5x1分钟)、DCM(4x1分钟)、二乙基醚(4x1分钟)洗涤并在真空中干燥。
[0101] 该完全保护的肽[Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH]是通过使预先在真空下KOH存在时干燥的肽基树脂经在DCM中的3％的TFA溶液处理5分钟获得。在冷的二乙基醚上收集滤液，重复该处理三次。醚溶液在室温下旋转蒸发至干燥；沉淀物再悬浮在水中的50％MeCN中并冷冻干燥。获得279mg的粗产物(367μmol)在气球中称重，加入3当量的CH3-(CH2)s-NH2和30mL的无水DMF。添力120μL的DIPCDI(2eq.)，允许其在47℃磁搅拌下反应。该反应借助于HPLC通过初产物消失控制反应在24小时后完全。溶剂被蒸发至干燥，使用DCM共蒸发二次。所获得的残余物[Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)i
-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH-(CH2)s-CH3]重悬在50mL的TFA-Pr3Si-H2O(90∶5∶5)混合物中，允许在室温下反应30分钟。加入250mL冷的二乙基醚，溶剂经旋转蒸发并使用醚额外进行二次共蒸发。残余物溶解在在水中的50％MeCN的混合物中并冷冻干燥。
-Met-Gln-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH-(CH2)s-CH3]重悬在50mL的TFA-Pr3Si-H2O(90∶5∶5)混合物中，允许在室温下反应30分钟。加入250mL冷的二乙基醚，溶剂经旋转蒸发并使用醚额外进行二次共蒸发。残余物溶解在在水中的50％MeCN的混合物中并冷冻干燥。
[0102]
[0103] 实施例5
[0104] 根据实施例1至4所描述的一般方案，通过试剂和肽序列的特性的常规变化，可额外获得下列属于本发明的范围内的衍生自SNAP-25蛋白质的序列的不可逆化学修饰肽。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123] 实施例6
[0124] 源自SNAP-25蛋白质的不可逆化学修饰肽对神经元胞吐(3H)-L-谷氨酸盐的活性测试
[0125] 为了确定本发明的肽是否抑制神经元胞吐神经递质，观察它们对大鼠海马神经元初级培养物释放L-谷氨酸盐神经递质的作用。该神经递质在神经元培养物中的胞吐可通过细胞的电去极化获得。使用常规方法制备大鼠胚胎海马初级培养物[Blanes-Mira C.，Merino J.M.，Valera E.，Fernández-Ballester G.，Gutiérrez L.M.，ViniegraS.，Pérez-PayáE.and Ferrer-Montiel A.“Small peptidespatterned after the N-terminus domain of SNAP25 inhibit SNAREcomplex assembly and regulated exocytosis”J.Neurochem.88，124-135]，持续在培养器中以37℃和5％CO2培养14天。该培养物与3 3
[H]-L-谷氨酸盐一起培养以使其在37℃下负载[H]-L-谷氨酸盐3小时。接着清洗多余
3 3
的[H]-L-谷氨酸盐，并且它们与0.1mM所欲研究的肽在37℃下培养1小时。[H]-L-谷氨酸盐借助于在37℃的生理缓冲液缓冲的75mM KCl和2mM CaCl2去极化10分钟释放。收集
3 3
该培养液，以β射线测定仪定量[H]-L-谷氨酸盐的量。[H]-L-谷氨酸盐释放的结果在无肽存在时标准化，并由不含钙时的基础释放校正。
[H]-L-谷氨酸盐一起培养以使其在37℃下负载[H]-L-谷氨酸盐3小时。接着清洗多余
3 3
的[H]-L-谷氨酸盐，并且它们与0.1mM所欲研究的肽在37℃下培养1小时。[H]-L-谷氨酸盐借助于在37℃的生理缓冲液缓冲的75mM KCl和2mM CaCl2去极化10分钟释放。收集
3 3
该培养液，以β射线测定仪定量[H]-L-谷氨酸盐的量。[H]-L-谷氨酸盐释放的结果在无肽存在时标准化，并由不含钙时的基础释放校正。
[0126] 实施例7
[0127] 制备包含CH3-(CH2)14-CO-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-CONH2的美容组合物[0128] 下列制剂根据本发明所述制备：
[0129] 在够大的反应器中的相A的组分是已称重的，混合物加热至80℃以融化蜡。在适合全部内容物的容器中的相B的组分是已称重的，加热至70℃。将相A缓慢加入剧烈搅拌的相B中，接着将相C加入先前搅拌的混合物中。当加入完成后，轻轻搅拌以待温度下降，当混合物降至室温时，加入CH3-(CH2)14-CO-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-CONH2含水溶液和卵磷脂，其经过均质化，若需要时经三乙醇胺校正pH值。
[0130] 所得到的乳膏具有介于6至7的pH值，粘稠度为10,000-15,000cps(6/50)。
[0131]
[0132]
[0133] 实施例8
[0134] 制备包含CH3-(CH2)14-CO-ELEEMQRRADQLA-NH2的脂质体
[0135] 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)经称重并溶解在氯仿中。该溶剂在真空中蒸发，直到获得一层薄的磷脂层，此层于55℃下经包含所需浓度的肽(包含 )的含水溶液处理水化，获得MLV脂质体。ULV脂质体通过将MLV脂质体浸入超声波浴槽中在55℃下进行8次2分钟循环，每次间隔5分钟获得。
[0136]
[0137] 根据第一个方面，本发明涉及一种通式(I)的肽：
[0138] R1-AA-R2
[0139] (I)
[0140] 其立体异构物、其美容和药学上可接受的盐类及其混合物，其中：
[0141] AA是3至40个包含在氨基酸序列SEQ ID NO.1中的相邻氨基酸的序列；
[0142] R1是选自H或烷基、芳基、芳烷基或酰基中；并且R2是选自经脂肪族或环状基团取代或未经取代的氨基、羟基或硫醇基，
[0143] 条件是当R1是H或乙酰基时，R2不是未经取代的氨基、羟基或硫醇基。
[0144] 根据第二个重要方面，在通式(I)的肽中R1优选是饱和或不饱和的直链、支链或环状C3至C24酰基。R1优选是式CH3-(CH2)m-CO-的酰基，其中m可自1至22不等。
[0145] 根据本发明的其它重要方面，在通式(I)的肽中R1优选是聚乙二醇聚合物。
[0146] 根据本发明的其它重要方面，在通式(I)的肽中R1优选是分子量介于200至35,000道尔顿之间的聚乙二醇聚合物。
[0147] 根据本发明的其它重要方面，在通式(I)的肽中R1优选是下式的聚乙二醇聚合物[0148]
[0149] 其中n可自1至100不等。在本发明优选的方面中，n可自1至5不等。
[0150] 根据本发明的重要方面，在通式(I)的肽中R2优选是经饱和或不饱和的直链、支链或环状C1至C24脂肪族取代或未经取代的氨基或羟基。
[0151] 根据本发明的重要方面，在通式(I)的肽中AA优选是由包含在选自氨基酸序列 MAEDADMRNELEEMQRRADQL、ADESLESTRRMLQLVEESKDAGI、ELEEMQRRADQLA、ELEEMQRRADQL、ELEEMQRRADQ、ELEEMQRRAD、ELEEMQRRA、ELEEMQRR、LEEMQRRADQL、LEEMQRRADQ、LEEMQRRAD、LEEMQRRA、LEEMQRR、EEMQRRADQL、EEMQRRADQ、EEMQRRAD、EEMQRRA、EEMQRR、LESTRRMLQLVEE、NKDMKEAEKNLT、KNLTDL、IMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG、SNKTRIDEANQRATKMLGSG、TRIDEANQRATKMLGSG、DEANQRATKMLGSG、NQRATKMLGSG和QRATKMLGSG中的序列中的3至40个相邻氨基酸序列组成。
[0152] 根据其它重要方面，本发明涉及一种取得通式(I)的肽的方法，其根据固相肽合成。
[0153] 根据其它重要方面，本发明关于一种取得通式(I)的肽的方法，该法使用选自芴甲氧羰基/叔丁基(Fmoc/tButyl)、芴甲氧羰基/三苯基(Fmoc/trityl)及芴甲氧羰基/烯丙基(Fmoc/allyl)的保护性基团。
[0154] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其包含美容或药物有效量的至少一种通式(I)的肽及至少一种美容或药学上可接受的赋形剂或佐剂。
[0155] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药组合物，其包含至少一种包含在美容或药学上可接受的持续释放系统和/或选自脂质体、毫胶囊(millicapsules)、微胶囊、纳米胶囊、海绵、囊胞、微团、毫球(millisplceres)、微球、纳米球、脂球、微乳液、纳米乳液、毫颗粒(milliparticles)、微颗粒及纳米颗粒的载体中的通式(I)的肽。
[0156] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其包含至少一种吸附在选自滑石、皂粘土、硅石、淀粉及麦芽糊精中的固相有机聚合物或矿物质载体上的通式(I)的肽。
[0157] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中通式(I)的肽是存在于选自霜剂、油和/或二甲硅油在水中的乳剂、水在油和/或二甲硅油中的乳剂、油类、乳制品、香油、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、肥皂、软膏、摩丝、油膏、棒、笔及喷剂的调合物中。
[0158] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中通式(I)的肽是包含在选自药巾、凝胶、粘性贴片、无粘性贴片及面膜中的固相载体中。
[0159] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中通式(I)的肽是包含在织物中，优选为绷带的形式。
[0160] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中通式(I)的肽是包含在选自遮瑕膏、粉底、卸妆液、卸妆乳、眼影及唇彩的化妆品中。
[0161] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其包含从0.00000001％至20％重量百分比的浓度的通式(I)的肽。
[0162] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中通式(I)的肽的浓度优选是从0.0001％至5％的重量百分比。
[0163] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其包含额外的美容或药物有效量的选自去角质剂、润湿剂、脱色剂或美白剂、原色素剂(pro-pigmentation agent)、除皱剂、可减少或消除眼袋的药剂、抗氧化剂、抗糖化剂、一氧化氮合成酶抑制剂、抗老化剂、刺激皮肤或表皮分子合成和/或防止它们降解的药剂、刺激纤维母细胞和/或角质细胞增生或刺激角质细胞分化的药剂、皮肤舒缓剂、固化剂、抗大气污染和/或抗自由基药剂、作用于毛血管循环和/或微循环的药剂、安定剂、抗炎剂、作用于细胞代谢的药剂、可抗紫外线A和/或B的有机或矿物性光保护剂、及其混合物。该活性剂优选是合成的或植物提取物或来自生物发酵。
[0164] 根据其它重要方面，本发明涉及一种美容或药物组合物，其中该抗皱剂和/或抗老化剂是选自Lipotec上市的和
[0165] 根据重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备调节神经元胞吐的美容或药物组合物中的用途。
[0166] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备用于治疗、清洁或照顾皮肤的美容或药物组合物中的用途。
[0167] 根据重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备用于减少和/或消除面部皱纹和/或面部不对称的美容或药物组合物中的用途。
[0168] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备减少和/或消除面部表情纹的美容或药物组合物中的用途。
[0169] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备通过局部施用于前额、眉毛之间区域和/或嘴周围和/或眼睛周围的皱纹和细纹以减少和/或消除面部表情纹的美容或药物组合物中的用途。
[0170] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备通过离子透入法施用于前额、眉毛之间区域和/或嘴周围和/或眼睛周围的皱纹和细纹以减少和/或消除面部表情纹的美容或药物组合物中的用途。
[0171] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备通过皮下或真皮内注射施用于前额、眉毛之间区域和/或嘴周围和/或眼睛周围的皱纹和细纹以减少和/或消除面部表情纹的美容或药物组合物中的用途。
[0172] 根据其它重要方面，本发明涉及一种通式(I)的肽或其美容或药学上可接受的盐在制备用于减少和/或消除肌肉痉挛的美容或药物组合物中的用途。
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