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针对单核细胞增生李斯特氏菌的抗微 生物肽

阅读：309发布：2020-05-12

专利汇可以提供针对单核细胞增生李斯特氏菌的抗微生物肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及具有序列VRLIVX1VRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4)的至少一种肽作为针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的杀菌性抗微生物剂的用途，其中X1选自A或K并且X2选自W和K。，下面是针对单核细胞增生李斯特氏菌的抗微生物肽专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽或者其盐或溶剂合物作为用于防止和/或处理单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)对产品或表面之污染的抗微生物剂的用途，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。
2.根据权利要求1所述的用途，其中X2是W(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3)。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，所述混合物优选为具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。
4.根据权利要求1至3所述的用途，其中所述单核细胞增生李斯特氏菌是抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，优选对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的血清型和/或4b或1/2c血清型。
5.根据权利要求1至4所述的用途，其中所述至少一种肽不与其他杀菌化合物联合，优选地其不与抗生素联合。
6.根据权利要求1至5所述的用途，其中所述产品是食品、材料或物体，优选地其是用于食品的储存或加工的物体或材料。
7.根据权利要求1至6所述的用途，其中所述至少一种肽作为涂层组合物被施加在所述产品的表面上或施加在所述表面上，或者通过共价键与所述产品或表面连接。
8.具有序列VRLIVX1VRIX2RR的肽或肽混合物或者其可药用盐或溶剂合物，其用于在对象中治疗来自单核细胞增生李斯特氏菌的感染，其中X1选自A和K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)，优选是W(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3)。
9.根据权利要求8所述应用的肽或肽混合物，其中所述单核细胞增生李斯特氏菌是抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，优选对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的血清型和/或4b或1/2c血清型。
10.根据权利要求8或9所述应用的肽或肽混合物，其中所述肽是其中X1是K并且X2是W(SEQ ID NO：3)的肽，并且所述肽混合物是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选地所述肽混合物是具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。
11.抗微生物组合物或药物组合物，其包含具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，所述混合物优选为具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。
12.至少一个表面与具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽连接的产品，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)，其中所述肽通过所述肽的N端氨基与所述表面上的化学基团之间的共价键来与所述表面连接。
13.纳米粒，其包含与其表面共价连接的具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。
14.如权利要求12中所要求保护的产品或如权利要求13中所要求保护的纳米粒，其中所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。
15.如权利要求13或14中所要求保护的纳米粒，其通过动态光散射(DLS)测量的平均流体力学直径为5至90nm，优选5至70nm，优选5至50nm，优选5至40nm，优选5至30nm，优选5至
30nm或更优选为15nm。
16.如权利要求13至15中所要求保护的纳米粒，其是杂化纳米粒，更优选是杂化金属纳米粒，甚至更优选银或金杂化纳米粒。
17.如权利要求12或13中所要求保护的产品或权利要求13至16中所要求保护的纳米粒，其中所述至少一种肽的N端氨基与所述表面上的选自羧基、激发的羟自由基、活化的烷氧基或活化的醛或酮基的化学基团共价键合。
18.根据权利要求1至6所述的用途，其中所述至少一种肽与如权利要求13至17中所要求保护的纳米粒的表面连接。
19.根据权利要求8至10所述应用的肽或肽混合物，其中所述肽与如权利要求13至17中所要求保护的纳米粒的表面连接。

说明书全文

针对单核细胞增生李斯特氏菌的抗微 生物肽

技术领域

[0001] 本发明涉及对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)具有杀菌活性的肽，并涉及其作为抗微生物剂或用于治疗李斯特氏菌病的用途。

[0002] 本发明还涉及在其表面上涂覆或固定有上述肽的产品。

背景技术

[0003] 消费者对与食品质量有关的可能的健康影响的关注正对食品加工和保鲜行业产生重大影响。与过去相比，如今的消费者越来越意识到和关注食品中存在的化学防腐剂的量以及常规方法和创新性防腐技术二者以延长广泛范围食品的耐久性并提高广泛范围食品的安全性的有效性。当今有数种微生物被认为是引起食品感染的原因，即与食品的消费有关，其中肯定有单核细胞增生李斯特氏菌、革兰氏阳性细菌、李斯特氏菌病的病原体。实际上，这可能会污染广泛多种的食品，其通常是生的(例如未煮熟的)肉、生蔬菜、鱼产品、由未经巴氏消毒的牛奶制备的奶酪或经工业加工并需要在低温下保存的即食食品。单核细胞增生李斯特氏菌一旦摄入，可穿过肠、胎盘和脑屏障，引起具有不同临床特征的感染，其包含严重的病理事件，例如自然流产、脑膜脑炎(meningoencephalitis)、败血病和胃肠炎。由食品引起的李斯特氏菌病是相当罕见但严重的疾病，死亡率为20％至30％，可与其他食品疾病(例如沙门氏菌病)的死亡率相比较。关于其发病率和严重程度，李斯特氏菌病的经济和社会影响被认为是食源性疾病中最高的(Barbuddhe SB和Chakraborty T.，2009，Curr Top Microbiol Immunol337：173-95；Barbuddhe SB等，2012，Int J Food Microbiol 154(3)：113-8)。

[0004] 该微生物对食品的污染非常普遍，并且难以抵抗，因为其能够适应不同的食品储存和生产过程条件。实际上，单核细胞增生李斯特氏菌可在不同的pH条件和0至45℃的温度下生长和繁殖，因此在环境以及加工、储存和冷藏的食品中持续存在。还显示单核细胞增生李斯特氏菌能够抵抗清洁、消毒、干燥和UV线处理，因此提高了环境污染的可能性(Mullapudi S等，2008，Appl Environ Microbiol 74：1464-8；Saá Ibusquiza P等，2011，Food Microbiol 28(3)：418-25)。

[0005] 传统上已经通过施用青霉素类或碳青霉烯类来治疗单核细胞增生李斯特氏菌感染(Espaze EP和Reynaud AE，1988，Infection 16Suppl 2：S160-S164；Troxler R等，2000，Clin Microbiol Infect 6：525-535)。然而，近年来，已经鉴定了数种李斯特氏菌(Listeria)菌株，其显示出对抗生素的多重抗性，包含选择用于治疗感染的那些抗生素(Walsh D等，2001，J Appl Microbiol 90：517-522；Prazac AM等，J Food Prot.65：1796-1799；Charpentier E等，1995，J Infect Dis 172：277-281)。特别地，临床李斯特氏菌病分离物中最具代表性的菌株是4b血清型(Gilot P等，1996，J Clinical Microbiol 34(4)：
1007-1010；Mammina C等，2009，J Clinical Microbiol47(9)：2925-2930)。该菌株比参照ATCC(美国模式菌种收集中心，American Type Culture Collection)或NTCC(国家模式菌种收集中心，National Type Culture Collection)菌株更具毒性，该菌株可在市场上获得。此外，最常从食品分离出的血清型之一的1/2c血清型已经显示出对青霉素G和氨苄青霉素的特异性抗性(Ayaz等，2010，J.Food protection 73：967-972)。

[0006] 鉴于上述情况，认为需要鉴定新的分子，其允许采取有效行动来防止和/或处理单核细胞增生李斯特氏菌对产品(特别是食品)的污染，和李斯特氏菌病感染，特别是在抗生素抗性菌株的情况下。

[0007] 在最近的十年中，已经认识到存在具有多种多样的抗微生物活性的天然肽(称为抗微生物肽或AMP(Antimicrobial Peptide))(De Smet K和Contreras R，2005，Biotechnol Lett 18：1337-47)。在人和其他哺乳动物中，这些肽已经被鉴定为固有免疫的重要组成部分，其有助于防御感染的第一道防线(Henzler Wildman KA等，2003，Biochemistry 42(21)：6545-58；Bals R，2000，Respir Res.1(3)：141-50；Agerberth B等，1999，Am J Respir Crit Care Med 160：283-290)。

[0008] AMP的特异性抗微生物活性和选择性取决于其化学物理特性，例如：两亲特性、净电荷、电荷角、总疏水性和构象柔性(Teixeira V等，2012，Prog Lipid Res.51(2)：149-77，2012；Palmieri G等，2016，Food Chem211：546-54)。特别地，该肽显示出抗生物膜活性的结构-活性关系，其不同于针对浮游细胞的杀菌活性所需的结构-活性关系(De la Fuente-
C，2014，PLoS Pathog 10(5)：e1004152)。

[0009] 近年来，通过多种技术，例如天然宿主防御肽的筛选和测试、计算机分析或肽库的筛选，许多肽已经被鉴定为潜在的新的抗微生物剂。这些肽中的一些已经显示出针对细菌生物膜形成的活性，其浓度通常低于其针对浮游形式(planktonic form)的相同细菌细胞的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。还已经指出，所鉴定的肽的抗微生物活性没有以任何方式与杀菌活性相关，因为肽的结构/功能关系对于杀菌或抗生物膜活性是不同的(Overhage J等2008，Infect Immun 76(9)：4176-82；Amer LS等，2010，Biochem Biophys Res Commun 396(2)：246-51；Pompilio等，2011，Peptides 32(9)：1807-14；De la Fuente- C等，2012，Antimicrob Agents Chemother 56(5)：2696-704；De la Fuente- C等，2014，PLoS Pathog10(5)：e1004152)。

[0010] 特别地，WO2015038339描述了具有7至12个氨基酸的序列的749个肽，其被指示为具有非常特异性的抗生物膜和/或免疫调节活性。在本文中，公开了具有序列VRLIVAVRIWRR的名为IDR-1018的肽、具有序列VRLIVKVRIWRR的名为IDR-1018-K6或2001的肽和具有序列VRLIVAVRIKRR的名为IDR-1018-K10的肽。这些肽的抗生物膜活性被证明是针对许多不同的微生物，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica ssp.)、鼠伤寒(Typhimurium)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)或者金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

[0011] 同一作者在PLoS Pathog 10(5)：e1004152中也报道了肽1018针对由铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和伯克霍尔德氏菌形成的生物膜的抗生物膜活性。

[0012] 上述文件公开了该肽显示出特异性的抗生物膜活性，该活性独立于针对浮游形式的细胞的杀菌活性，并且在所测试的浓度下对浮游细胞不显示任何活性。

[0013] 鉴于上述情况，在WO2015038339中，建议将所述肽与抗生素结合，一旦生物膜被破坏，则抗生素将杀死从生物膜释放的细菌。

[0014] 属于李斯特氏菌属的细菌表现出非常独特的特性，并且有许多证据表明，能够有效抑制其他细菌生长的肽反而极少显示出针对单核细胞增生李斯特氏菌的活性(Gravesen A等2002，Microbiology 148：2361-2369；Gravesen A等，2001，Microb Drug Resist 7：127-135；Rasch M和 S 1998，Lett Appl Microbiol 27：275-278)。

[0015] 数项研究表明，与其他微生物(例如假单胞菌或葡萄球菌)相比，生物膜的形成在李斯特氏菌引起的感染中不那么重要，因为该病原体形成生物膜的能力较低(Renier S等，2011，Environ Microbiol 13：835-50；Djordjevic D等，2002，Appl Environ Microbiol
68：2950-2958；Borucki MK等，2003，Appl Environ Microbiol 69：7336-7342；Harvey J等，2007，Food Microbiol 24：380-92)。最近，对从临床和食品来源分离出的广泛的单核细胞增生李斯特氏菌菌株进行的检测显示出极端的变异性和形成生物膜的不良趋势(Doijad SP等，2015，PlosOne 10(9)：e0137046；Borucki MK等，2003，Appl Environ Microbiol 69：
7336-7342)。特别是，来自动物和人临床病例的菌株均未显示出强大的生物膜形成能力(Doijad SP等，2015，PlosOne 10(9)：e0137046)。另外，由李斯特氏菌形成的膜和细菌黏附到表面的机制似乎与其他细菌的机制完全不同。特别地，李斯特氏菌不能分泌足够量的胞外基质多糖以产生如上所列出的细菌的三维膜，而是通过疏水相互作用形成二维膜而黏附至表面(Silva EP等，2013Appl Microbiol Biotechnol 97：957-68；Doijad SP等，2015，PlosOne 10(9)：e0137046)。

[0016] 在李斯特氏菌的情况下，为了有效地防止或消除该微生物的污染，需要针对浮游细胞具有强杀菌活性的抗微生物剂。利用抗生素对李斯特氏菌污染或感染的实际治疗发现，这些细菌的许多菌株产生的抗性有很大限制。越来越多的李斯特氏菌菌株似乎对多种抗生素(例如氨苄青霉素类、青霉素类和庆大霉素类)的易感性令人担忧地降低(Facinelli B等，1991，Lancet 338：1272；Safdar A和Armstrong D，2003，J Clin Microbiol 41：483-485；Popowska M等，2006，Pol J Microbiol 55：279-288)。

[0017] 因此，强烈需要鉴定出显示强的杀菌活性的针对李斯特氏菌感染的新抗微生物剂，其任选地还与抑制生物膜形成的能力有关，尤其是针对抗生素抗性菌株。

[0018] 能够针对李斯特氏菌菌株进行有效的杀菌和抗生物膜活性二者的分子可显著提高食品安全水平，也确保了更好的治疗和预防李斯特氏菌病。

[0019] 发明简述

[0020] 本发明人已经出乎意料地发现，肽IDR-1018和IDR-1018-K6(后者在下文中被称为Bac-amp1)以及表现出具有相同长度、碱度、净电荷和疏水性特征的序列的肽表现出针对单核细胞增生李斯特氏菌的杀菌作用，其MIC低于10μM且抗生物膜活性较弱，MIC为25至50μM。

[0021] 观察到的这些肽针对李斯特氏菌的生物活性完全意想不到。实际上，这与上述现有技术所公开的相同肽针对其他微生物的活性显著不同，该肽显示出在低浓度肽时的抗生物膜活性，在该浓度下未鉴定出针对浮游细胞的活性。

[0022] 上述肽代表了卓越的候选物，其能够满足食品安全要求、降低消费时的污染水平并改善针对由致病剂单核细胞增生李斯特氏菌引起的李斯特氏菌病的防御和预防。

[0023] 因此，本发明的第一个目的是具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽或者其盐或溶剂合物作为用于防止和/或处理(去除)被单核细胞增生李斯特氏菌黏附的产品(优选食品、材料、物体)或表面上的污染的抗微生物剂的用途，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0024] 此外，本发明人已经发现，即使在极端pH值(pH 1.0或11.0)下，根据本发明的肽也显示出高的构象稳定性，所述构象稳定性根据X1的特征而变化。特别地，其中X1是K的本发明的肽，例如Bac-amp1，在pH 11.0下显示出更强的构象稳定性；相反，其中X1是A的本发明的肽，例如IDR-1018，在pH 1.0下具有较高的构象稳定性。这些特性使得有可能在酸性或碱性环境中，例如在存在用于消毒用制剂的化合物的情况下，单独或组合使用这些肽。这允许开发具有较低浓度的化学物质(酸性或强碱性)并从而降低对环境的影响的消毒用生态友好的生物制剂。

[0025] 此外，上述两种肽的联合是特别有利的，因为其允许获得在非常宽的pH范围内有效的抗微生物组合物。

[0026] 因此，本发明的第二个目的是抗微生物组合物，其包含具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，混合物优选为具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0027] 本发明的第三个目的是具有序列VRLIVX1VRIX2RR的肽或者其可药用盐或溶剂合物，其用于在对象中治疗来自单核细胞增生李斯特氏菌的感染，优选用于治疗李斯特氏菌病，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0028] 本发明的第四个目的是用于通过施用具有序列VRLIVX1VRIX2RR的肽或肽混合物或者其可药用盐或溶剂合物来在对象中治疗来自单核细胞增生李斯特氏菌的感染(优选李斯特氏菌病)的方法，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0029] 本发明的第五个目的是药物制剂，其包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽或者其可药用盐或溶剂合物，其中X1选自A或K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0030] 根据一个优选的实施方案，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，混合物优选为具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0031] 本发明的第六个目的是涂层组合物，其包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A或K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0032] 本发明的第七个目的是至少一个表面覆盖有黏附于所述表面的涂层的产品，所述涂层包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A或K，且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0033] 本发明人还出乎意料地发现，当上述肽的N端氨基与产品表面共价连接时，游离肽的杀菌活性得以维持。

[0034] 因此，本发明的第八个目的是至少一个表面与具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽共价连接的产品，其中X1选自A或K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0035] 本发明的第九个目的是包含纳米粒的液体抗微生物组合物，所述纳米粒包含与其表面共价连接的具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0036] 本发明的第十个目的是包含与其表面共价连接的具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽的纳米粒作为用于防止和/或处理细菌对产品或表面的污染的抗微生物剂的用途，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0037] 本发明的第十一个目的是用于通过施用包含与其表面共价连接的具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽的纳米粒来在对象中治疗细菌感染的方法，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0038] 本发明的第十二个目的是包含纳米粒的药物组合物，所述纳米粒包含与其表面共价连接的具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)，其任选地与可药用赋形剂或载体组合。附图说明

[0039] 图1和图2分别显示了在不同的温度条件下在存在10mM SDS的情况下获得的Bac-amp1和IDR1018肽的圆二色性(Circular Dichroism，CD)谱，如实施例2a中所述。

[0040] 图3和图4分别显示了在不同的pH条件下在存在或不存在(SDS)10mM SDS的情况下获得的Bac-amp1和IDR1018肽的圆二色性(CD)谱，如实施例2b中所述。

[0041] 该图具体显示了随波长变化的每个残基的平均摩尔椭圆率值×10-3，其以度cm2/dmol表示。

[0042] 在添加最终10mM浓度的SDS之后，通过CD谱(C)和荧光(D)技术在25℃下监测Bac-amp1肽的折叠动力学24小时。

[0043] 图5显示了通过如实施例2c中所述在4℃下在mozzarella盐水中孵育24小时的IDR-1018或Bac-amp1肽样品上进行的RP-HPLC色谱获得的色谱图。该图显示了220nm处的吸光度值与洗脱液体积的函数关系，其以ml测量。

[0044] 图6显示了利用Bac-amp-1肽获得的针对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的剂量反应曲线，表示为相对于没有肽的相应的对照板在存在不同肽浓度的情况下孵育时在用细菌培养物接种的平板上观察到的菌落形成单位(colony forming unit，CFU)的百分比，如实施例3中所述。

[0045] 图7和图8显示了箱线图，其是用于通过简单分散和位置指数来描述样品分布的图形表示，其是通过Graphpad Prism 软件获得的。该图显示了分别在不存在(Ctrl)或存在不同浓度的Bac-amp1或IDR-1018肽的情况下，在用结晶紫对用标准单核细胞增生李斯特氏菌接种物在37℃下孵育72小时的钢制圆盘染色之后在492nm处测量的吸光度值，如实施例4a中所述。

[0046] 图9显示了在存在浓度为50μM的Bac-amp1肽的情况下(图9a，放大倍数×1000；图9c，放大倍数×5000)，或仅在对照介质中(图9b，放大倍数×1000；图9d，放大倍数×5000)使用标准单核细胞增生李斯特氏菌接种物处理的钢制圆盘的扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)在不同放大倍数下获得的图像，如实施例4b中所述。

[0047] 图10显示了在存在浓度为50μM的IDR-1018肽的情况下(图10a，放大倍数×1000；图10b，放大倍数×5000)使用标准单核细胞增生李斯特氏菌接种物处理的钢制圆盘在不同SEM放大倍数下的图像，如实施例4b中所述。

[0048] 图11显示了平板接种单核细胞增生李斯特氏菌样品之后测量的菌落形成单位数，所述单核细胞增生李斯特氏菌用利用Bac-amp1肽(SOSF)进行官能化的材料或在不存在用该肽(KSOS)进行官能化的情况下利用相同的材料孵育了不同的时间间隔(1小时、4小时和6小时)，如实施例5中所述。

[0049] 图12显示了与肽Bac-amp1(Au-NPs-Bac-amp1)共价连接的金纳米粒的制备示意图，如实施例6中所述。

[0050] 图13显示了接枝到金纳米粒上的肽的HPLC定量，如实施例8中所述。具体地，色谱图显示了具有初始(时间＝0)肽浓度的参照溶液(Bac-amp1)、官能化反应结束时的上清液(未结合Bac-amp1)，以及从纳米粒表面裂解肽之后的上清液(结合Bac-amp1)的吸光度。

[0051] 图14显示了利用Bac-amp1肽进行官能化的金纳米粒的滴定曲线与肽浓度的函数关系。显示了Bac-amp1浓度为31、75、125或250μM时获得的固定化产率。

[0052] 图15显示了指示浓度(CFU/ml)下的与肽Bac-amp1共价连接(Au-NPs-Bac-amp1，灰条)或没有肽(Au-NPs，黑条)的金纳米粒，浓度为0.16μM时，针对单核细胞增生李斯特氏菌细胞的杀菌活性(表示为杀死的细菌细胞的百分比)。

[0053] 图16显示了指示浓度(CFU/ml)下的与金纳米粒共价连接的肽Bac-amp1(浓度为0.16μM)(Au-NPs-Bac-amp1，灰条)或没有该肽的金纳米粒(Au-NPs，黑条)针对鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)细胞的杀菌活性(表示为杀死的细菌细胞的百分比)。

[0054] 图17显示了针对单核细胞增生李斯特氏菌的杀菌活性的长期稳定性，持续达7个月的时期。

[0055] 图18显示了指示浓度(CFU/ml)下的无肽(浓度为0.16μM时)或与纳米粒共价连接(浓度为0.16μM时)的肽针对单核细胞增生李斯特氏菌的杀菌活性。

[0056] 定义

[0057] 根据本发明的术语“生物膜”是指嵌入由胞外聚合物构成的胞外基质内并附接至活的或非生物表面的细菌细胞。

[0058] 根据本发明的表述“抗生物膜”或“生物膜抑制活性”是指肽防止或抑制细菌的生物膜形成或抑制细菌在生物膜中的生长的能力。

[0059] 根据本发明的表述“杀菌活性”意指肽杀死浮游(自由游动)细菌细胞的能力(针对浮游细胞的杀菌活性)。

[0060] 如上所限定的肽化合物(由至少10个氨基酸组成的蛋白质链)针对特定微生物的抗生物膜或杀菌活性的效力在本领域中被认为适合用作抗微生物剂或治疗剂，当该化合物针对该微生物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和/或最低生物膜抑制浓度(minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC)不大于20μM时。

[0061] 这样的肽的活性浓度(MIC；MBIC)高于20μM，将导致在不同工业领域中应用的成本缺乏竞争力。

[0062] 根据本发明的表述“抗微生物活性”意指防止或根除活生物体中或产品例如食品、材料或物体上的细菌感染的能力。

[0063] 根据本发明的表述“抗微生物剂”或“抗微生物组合物”分别是指具有抗微生物活性的化合物或组合物。

[0064] 根据本发明的表述“溶剂合物”意指本发明的肽与溶剂的复合物，在所述溶剂中合成反应发生或在溶剂中所述肽沉淀或结晶。例如，与水的复合物被称为“水合物”。

[0065] 根据本发明的表述“杂化纳米粒”是指由无机化合物(优选一种或更多种金属，更优选银或金)以及有机化合物(优选一种或更多种聚合物，更优选由聚合乙二醇(乙烷-1，2-二醇)单元)制成的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)构成的纳米粒。根据本发明的杂化纳米粒包含具有不同官能末端反应性基团的聚合物组分，例如PEG二胺和PEG巯基乙醚乙酸或PEG二酸。

[0066] 发明详述

[0067] 如将在实验部分中所示出的，本发明人已经鉴定了具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽IDR-1018和具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽Bac-amp1具有有效的杀菌活性，其显示针对单核细胞增生李斯特氏菌的MIC浓度在低微摩尔范围内。鉴于这些肽针对现有技术中公开的其他微生物的活性，这是意想不到的，其在测试的浓度下显示出选择性的抗生物膜活性并且没有杀菌活性。

[0068] 因此，本发明的第一个目的是具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽或者其盐或溶剂合物作为用于防止和/或处理(去除)单核细胞增生李斯特氏菌对产品或表面的污染的抗微生物剂的用途，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0069] 上述产品可以是易受李斯特氏菌污染的任何产品，例如食品、材料或物体。

[0070] 优选地，所述产品是这样的物体，例如容器或工具或机器的操作部件，或者材料，例如包装材料，优选用于食品的储存或加工。

[0071] 优选地，所述表面是用于食品的加工或储存的设施的表面。

[0072] 优选地，根据本发明的第一个目的的用途是用于为加工食品所准备的设施或机器的消毒。

[0073] 当MIC为浓度低于10μM，优选低于5μM，更优选低于1μM时所述抗微生物剂针对李斯特氏菌浮游细胞具有杀菌活性。

[0074] 根据肽和感染中涉及的李斯特氏菌的菌株，抗微生物剂也可具有抗生物膜活性。

[0075] 优选地，所述抗微生物剂具有针对李斯特氏菌的组合的杀菌活性和抗生物膜活性。

[0076] 优选地，所述至少一种肽以至多10μM，更优选低于8μM，更优选低于5μM，甚至更优选低于3μM的浓度使用。

[0077] 优选地，所述至少一种肽以0.5至10μM，更优选0.5至8μM，更优选0.5至5μM，甚至更优选0.5至3μM的浓度使用。

[0078] 特别优选的是根据本发明的肽的用途，其中X2是W(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3)，更优选地，肽的用途，其中X1是K并且X2是W(SEQ ID NO：3)。

[0079] 适用于本发明目的的盐或溶剂合物是不会导致根据本发明的肽的构象或稳定性修饰并且因此不干扰其生物活性的盐或溶剂合物。

[0080] 如将在实验部分中所示出的，本发明的肽表现出强的杀菌活性。所述肽针对单核细胞增生李斯特氏菌的高杀菌活性使得能够有效防止或根除该微生物，而不必使其与其他杀菌化合物(例如抗生素)联合。

[0081] 因此，根据本发明的一个优选的实施方案，所述至少一种肽不与杀菌化合物联合，优选地其不与抗生素联合。

[0082] 如在实验部分中所示出的，本发明的肽针对单核细胞增生李斯特氏菌表现出高的杀菌活性，特别地，针对从受污染的食品和环境样品中分离出的属于4b血清型或1/2c血清型的该细菌菌株也表现出高的杀菌活性，其比市售的参照ATCC(美国模式菌种收集中心)或NTCC(国家模式菌种收集中心)菌株更具毒性，并且对多种抗生素具有抗性(Ayaz等，2010，J.Food protection 73：967-972)。

[0083] 因此，优选地，所述单核细胞增生李斯特氏菌为抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，更优选地，其是对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的单核细胞增生李斯特氏菌血清型。优选地，所述血清型是4b或1/2c血清型。

[0084] 出乎意料地，与针对参照ATCC菌株观察到的相比，具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽针对该细菌的野生菌株，特别是属于4b血清型或1/2c血清型的菌株显示出显著更有效的杀菌活性。

[0085] 更优选地，所述单核细胞增生李斯特氏菌血清型是抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，更优选对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的单核细胞增生李斯特氏菌血清型，甚至更优选4b或1/2c血清型并且所述至少一种肽是VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)。

[0086] 根据另一个优选的实施方案，根据本发明的第一个目的的用途是作为食品的防腐剂，特别是用于防止和/或处理单核细胞增生李斯特氏菌对其的污染。

[0087] 优选地，根据该实施方案，所述用途提供将根据本发明的至少一种肽施加在食品的表面上和/或主体内。替代地，所述用途提供将根据本发明的至少一种肽施加在食品包装的表面上。

[0088] 如将在实验部分中所示出的，这两种肽对温度和pH的变化具有高的稳定性，并且因此特别适合在用于食品包装材料的官能化中使用，并在材料本身的生产步骤之后仍维持其活性。

[0089] 特别地，本发明人已经发现，即使在极端pH值(pH 1.0或11.0)下，根据本发明的肽也显示出高的构象稳定性，所述构象稳定性根据X1的特征而变化。特别地，其中X1是K(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的本发明的肽，例如Bac-amp1，在pH 11.0下显示出更大的构象稳定性；相反，其中X1是A(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的本发明的肽，例如IDR-1018，在pH 1.0下显示出更大的构象稳定性。

[0090] 根据本发明的第一个目的，具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽被用于pH值为1.0至4.0，优选4.0的食品包装，而具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽被用于pH值高至11，优选为8.0的食品包装。更优选地，根据本发明的第一个目的的用途提供了在食品包装中，使用具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0091] 前述肽之间的联合是特别有利的，因为其允许具有在非常宽的pH范围内有效和具有抗性的抗微生物组合物。

[0092] 优选地，在根据本发明的第一个目的的用途中，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0093] 此外，根据上述，本发明的第二个目的是抗微生物组合物，其包含具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选包含具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0094] 根据本发明的肽或肽混合物也可用于治疗由单核细胞增生李斯特氏菌引起的疾病，特别是用于治疗李斯特氏菌病。

[0095] 因此，本发明的第三个目的是具有序列VRLIVX1VRIX2RR的肽或肽混合物或者其可药用盐或溶剂合物，其用于在对象中治疗来自单核细胞增生李斯特氏菌的感染，优选用于治疗李斯特氏菌病，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0096] 本发明的第四个目的是用于通过施用具有序列VRLIVX1VRIX2RR的肽或肽混合物或者其可药用盐或溶剂合物来在对象中治疗来自单核细胞增生李斯特氏菌的感染(优选李斯特氏菌病)的方法，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0097] 优选地，根据本发明的第三或第四个目的，所述对象是哺乳动物，更优选其是人。

[0098] 根据本发明的第三或第四个目的的一个优选的实施方案，所述肽或肽混合物是其中X1是K并且X2是W(SEQ ID NO：3)的肽或包含其的肽。

[0099] 根据本发明的第三或第四个目的的盐或溶剂合物是可药用盐，其不会导致根据本发明的肽的构象或稳定性修饰。

[0100] 可药用酸加成盐包含与以下形成的那些盐：盐酸、氢溴酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸和等离子酸。其他酸，例如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用作用于获得本发明化合物及其可药用盐的中间体。被认为可接受的碱盐包含铵盐、碱金属盐(例如钾和钠盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)以及与有机碱的盐，例如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺。

[0101] 根据本发明的第三或第四个目的的一个优选的实施方案，所述肽混合物是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选其是具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0102] 在经口施用的情况下，上述肽的联合允许克服与在胃肠系统水平上遇到的将肽降解为酸性或碱性pH之后吸收的肽量降低有关的技术问题。在pH值的两个相对端，两种肽的相容性导致大量的活性肽被吸收并到达作用部位。

[0103] 优选地，所述李斯特氏菌病是由抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，更优选对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的血清型引起的。更优选地，所述李斯特氏菌病是由属于4b或1/2c血清型的菌株引起的。

[0104] 更优选地，所述单核细胞增生李斯特氏菌血清型是抗生素抗性单核细胞增生李斯特氏菌血清型，更优选对选自头孢菌素类、氨苄青霉素类、四环素类、红霉素类和青霉素类的一种或更多种抗生素具有抗性的单核细胞增生李斯特氏菌血清型，甚至更优选4b或1/2c血清型并且所述肽是VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)或所述肽混合物包含VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)。

[0105] 本发明的第五个目的是药物制剂或组合物，其包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽或者其可药用盐或溶剂合物，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)，其任选地与可药用赋形剂或载体组合。

[0106] 根据本发明的第五个目的的一个优选的实施方案，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0107] 根据本发明的药物制剂包含适合于经口、肠胃外(包含皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)使用、通过吸入(包含可通过多种类型的加压气雾剂分配器、喷雾器或吹入器产生的特别小的颗粒或雾的粉末)的那些制剂，尽管最合适的途径可能取决于例如接受者的状况。

[0108] 制剂可方便地以单位剂型存在并且可通过任何公知的制药技术方案来制备。所有方法都提供了使活性成分与载体缔合的步骤，所述载体构成一种或更多种可药用辅助成分。通常，通过将活性成分与细分的固体或液体载体或二者缔合，然后如果需要的话，通过将产品配制成期望制剂来以均匀的方式制备制剂。

[0109] 适用于经口施用的本发明的制剂可以以离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每一种均包含预定量的活性成分；例如粉末或颗粒；作为在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬剂；或作为液体水包油乳液或作为液体油包水乳液。活性成分也可以以大丸剂(bolus)、栓剂或糊剂存在。数种可药用载体在标准制剂工作中进行描述，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin。另见Wang，Y.J.和Hanson，M.A.，Journal of Parenteral Science and Technology，technical report no.10，Supp。用于经口施用的组合物包含混悬剂，所述混悬剂可包含例如用于赋予质量的微晶纤维素、作为助悬剂的藻酸或藻酸钠、作为黏度增强剂和甜味剂或矫味剂的甲基纤维素，例如制药业中已知的那些；立即释放片剂，其可包含例如微晶纤维素、磷酸钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、黏合剂、增量剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，例如制药技术中已知的那些。

[0110] 肠胃外施用制剂包含用于水性和非水性无菌注射剂的溶液，所述溶液可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物和使制剂等渗的溶质；水性和非水性无菌混悬剂，其可包含表面活性剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量容器中或存在于多剂量容器中，例如小瓶和密封的小瓶中，并且可以以冷冻干燥的形式存储，仅需要在使用之前立即添加无菌液体支持即可。用于施用吸入或鼻用气雾剂的组合物包含盐溶液，所述盐溶液可包含例如苯甲醇或其他合适的防腐剂，其促进吸收以改善生物利用度，和/或其他增溶剂，例如药学技术中已知的那些。在用于施用吸入或鼻用气雾剂的组合物中，本发明的化合物使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以来自加压容器或喷雾器的气雾剂的形式施用。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以提供测量的量来确定剂量单位。优选的单位剂量制剂是包含如上所述的有效剂量或适当比例的活性成分的那些制剂。

[0111] 应当指出，除了上述具体提及的成分之外，考虑到讨论中的制剂的类型，本发明的制剂可包含在制药技术中使用的其他常规试剂，例如适合于经口施用的那些制剂可包含矫味剂。本发明的化合物也适当地以连续和控制释放系统施用。本发明的连续释放系统的合适的实例包含合适的聚合物材料，例如半透性聚合物基质(例如膜或微胶囊)；特定的疏水材料，例如在合适的油或离子交换树脂中的乳液；和本发明化合物的衍生物，例如可溶性盐。

[0112] 根据根据本发明的第一个目的的用途的一个实施方案，其还与上述其他优选的实施方案组合，可将至少一种肽通过与存在于所述表面上的反应性基团共价键合而并入施加在所述表面上的涂层中从而施加至产品的表面或要被保护或处理以免受李斯特氏菌污染的表面。

[0113] 这允许延长要被保护以免受污染的表面上肽的杀菌浓度的持久期，并因此在所述表面上发挥长期持续的保护活性。

[0114] 根据根据本发明的第一个目的的用途的一个实施方案，所述至少一种肽作为涂层组合物被施加在所述产品的表面上或所述表面上。

[0115] 在这种情况下，根据本发明的第一个目的的肽或肽混合物的用途提供了将包含所述至少一种肽和任选的成膜聚合物的液体抗微生物组合物施加至所述产品的表面，然后干燥，从而形成涂层。

[0116] 因此，本发明的第六个目的是涂层组合物，其包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A或K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0117] 所述涂层组合物优选还包含成膜剂。这些是能够在所述物体或材料的表面上形成膜的化合物，其有利于肽或肽混合物在其上的持久性。优选地，所述成膜剂是成膜聚合物。

[0118] 本发明的第七个目的是至少一个表面覆盖有黏附于所述表面的涂层的产品，所述涂层包含具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽，其中X1选自A或K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)以及任选的成膜聚合物。

[0119] 所述涂层可覆盖所述表面的一部分或全部。

[0120] 优选地，所述产品是如上所限定的材料或物体。

[0121] 根据本发明的第六或第七个目的的一个优选的实施方案，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0122] 根据根据本发明的第一个目的的用途的另一个实施方案，所述至少一种肽通过共价键与所述产品的表面或所述表面连接。

[0123] 实际上，如将在实施例中所示的，本发明人已经发现，当上述肽的N端基团与表面共价连接时，尽管连接肽的构象受到约束，但仍维持杀菌活性。

[0124] 在这种情况下，肽或肽混合物的用途提供了通过与表面上存在的反应性基团形成共价键来施加根据本发明的肽或肽混合物。这允许获得具有这样的表面的产品，其特征在于针对单核细胞增生李斯特氏菌的杀菌活性，该产品长时间稳定。

[0125] 根据根据本发明的第一、第三或第四个目的的用途的另一个实施方案，所述至少一种肽可通过共价键与可用作抗微生物剂的纳米粒的表面连接。

[0126] 因此，本发明的第八个目的是至少一个表面与具有序列VRLIVX1VRIX2RR的至少一种肽共价连接的产品，其中X1选自A或K，并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：和SEQ ID NO：4)。

[0127] 优选地，所述肽通过肽的N端氨基与所述表面上的化学基团之间的共价键来与所述表面连接。

[0128] 所述肽可与所述表面的一部分或全部连接。优选地，根据本发明的八个目的，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。所述产品可以是具有带有能够与肽的N端氨基形成共价键的化学基团的表面的任何产品。优选地，所述化学基团选自羧基、激发的羟基、活化的烷氧基或活化的醛或酮基。

[0129] 优选地，具有至少一个表面的所述产品是这样的物体，例如用于储存食品的容器、工具或机器的操作部件(例如用于食品加工)，或者材料，例如包装材料、聚合物、金属或半导体。

[0130] 用于将肽或蛋白质的氨基与表面结合的技术是本领域技术人员已知的，并且根据所使用的材料而变化。

[0131] 例如，在具有金属(金、铂银)和半导体(钛、锌、锡、锆和锗)表面的材料的情况下，可使用硅烷化工艺。例如，这涉及与将用硫酸(H2SO4)和氧过氧化物(H2O2)的混合物处理的材料的反应，其能够通过产生容易被更稳定的键(例如Si-C或Au-S)所取代的表面原子和羟基(-OH)的键来活化上述表面。活化的表面可在用硅烷化剂(例如氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷)和具有两个能够与肽氨基形成肽共价键的官能团的化合物(例如戊二醛或双琥珀酰亚胺)处理之后与感兴趣的肽共价键合。这些处理是水性溶液化学的典型处理，并且因此其被称为湿法工艺，这是有利的，因为其不需要特定的技术设备，但仅限于优选的可毫无困难地润湿和干燥的刚性材料。

[0132] 在塑料或聚合物表面的情况下，作为替代，可通过应用上述湿法工艺或通过应用高电磁能辐射(例如通过激光、紫外线、γ射线)将其官能化，以钩住(hook)目标肽。对于所谓的软材料，例如非刚性塑料，湿法工艺可能并不完全有效，因此，优选基于表面与气体等离子体或电磁辐射相互作用的所谓干官能化过程。聚合物表面与电磁辐射的相互作用通过破坏可接近的聚合物键而引起表面活化，因此C＝C键变为-C-C-，从而允许对表面本身进行随后的化学修饰。相同的操作原理适用于活化聚合物表面的其他方法，并且存在于用电离气体(气态等离子体)对其进行处理中。该过程是特别有利的，因为由于等离子体是冷的，所以经处理的材料的温度相对于环境温度不会达到高值。此方法需要低压(0.1-100Pa)和存在工作气体(通常为N2、O2或Ar、CF4)[Hegemann，Dirk，Herwig Brunner，和Christian Oehr.″Plasma treatment of polymers for surface and adhesion improvement.″Nuclear instruments and methods in physics research section B：Beam interactions with materials and atoms 208(2003)：281-286]。

[0133] 根据本发明的第八个目的的一个特别的实施方案，所述产品存在于纳米粒中。如将在实验部分中所示的，当本发明的肽连接在纳米粒的表面上时，杀菌活性出乎意料地显著提高。此外，该肽在长时间内显示出稳定性。

[0134] 因此，本发明的一个特别优选的目的是纳米粒，其包含与其表面共价连接的如上所述的根据本发明的至少一种肽，所述肽具有序列VRLIVX1VRIX2RR，其中X1选自A和K并且X2选自W和K(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。

[0135] 优选地，所述至少一种肽是具有序列VRLIVAVRIX2RR(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)的至少一种肽与具有序列VRLIVKVRIX2RR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)的至少一种肽的混合物，其中X2选自W和K，优选具有序列VRLIVAVRIWRR(SEQ ID NO：1)的肽与具有序列VRLIVKVRIWRR(SEQ ID NO：3)的肽的混合物。

[0136] 优选地，所述肽通过肽的N端氨基与所述表面上的化学基团之间的共价键来与纳米粒的所述表面连接。

[0137] 优选地，所述至少一种肽的N端氨基与所述纳米粒表面上的选自羧基、激发的羟自由基、羟自由基、活化的烷氧基或活化的醛或酮基的化学基团共价键合。

[0138] 优选地，所述至少一种肽在纳米粒的整个表面上基本均匀地连接。

[0139] 优选地，所述纳米粒的通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测量的平均流体力学直径为5至90nm，优选5至70nm，优选5至50nm，优选5至40nm，优选5至30nm，优选5至30nm或更优选为15nm。

[0140] 优选地，所述纳米粒是杂化纳米粒，更优选是杂化金属纳米粒，甚至更优选银或金杂化纳米粒。

[0141] 优选地，所述杂化纳米粒包含聚合物作为有机组分，该聚合物优选选自用不同的反应性基团进行官能化的PEG分子，例如PEG二胺和PEG巯基乙醚乙酸和PEG二酸。

[0142] 上述纳米粒可用于将根据本发明的肽递送至其活性位点。

[0143] 因此，在本发明的第一、第三或第四个目的的一个优选的实施方案中，所述至少一种肽与如上所述的根据本发明的纳米粒的表面连接。

[0144] 特别适合于治疗性递送活性化合物的纳米粒是天然材料或衍生物(壳聚糖、葡聚糖(dextran)、明胶、脂质体、藻酸盐、淀粉)、树枝状聚合物、富勒烯、聚合物载体(聚乳酸、聚(氰基)丙烯酸酯、聚乙烯胺、聚己内酯)、金属纳米粒、量子点、二氧化硅纳米粒。

[0145] 因此，在本发明的第十、第十一或第十二个目的的上述实施方案中，纳米粒由选自以上的材料或材料的组合制成。

[0146] 如将在实验部分中所示的，本发明人已经出乎意料地发现，根据本发明的纳米粒不仅能够提高肽针对李斯特氏菌的杀菌活性，而且还能够提高针对不同于单核细胞增生李斯特氏菌的细菌的杀菌活性。

[0147] 因此，上述纳米粒可有利地用于防止和/或处理许多其他细菌的污染或感染。

[0148] 可将根据本发明的上述纳米粒分散在可用作抗微生物组合物的液体组合物中。

[0149] 因此，本发明的第九个目的是包含根据本发明的纳米粒的液体抗微生物组合物，如上所述。

[0150] 本发明的第十个目的是根据本发明的上述纳米粒作为用于防止或处理细菌对产品或表面的污染的抗微生物剂的用途。优选地，所述细菌选自单核细胞增生李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。

[0151] 优选地，根据本发明的第九个目的的用途是用于为加工食品所准备的设施或机器的消毒。

[0152] 根据另一个优选的实施方案，根据本发明的第九个目的的用途是作为食品的防腐剂，特别是用于防止和/或处理单核细胞增生李斯特氏菌对其的污染，特别是用于防止和/或消除对其及其中包含的食品的细菌污染。

[0153] 优选地，根据第九个实施方案，所述用途提供将根据本发明的至少一种肽施加在食品的表面和/或主体内。替代地，所述用途提供将根据本发明的至少一种肽施加在食品包装材料的表面上。

[0154] 纳米粒也适合于将肽递送至患者。

[0155] 因此，本发明的第十个目的是纳米粒，如上所述，其用于在对象中治疗细菌感染，优选用于治疗针对单核细胞增生李斯特氏菌的感染。本发明的第十一个目的是用于通过施用纳米粒来在对象中治疗细菌感染的方法，如上所述。优选地，根据本发明的第十和第十一个目的，所述对象是哺乳动物，更优选其是人。

[0156] 本发明的第十二个目的是包含如上所述的纳米粒的药物组合物，其任选地与可药用赋形剂或载体组合。

[0157] 优选地，在本发明的第十、第十一或第十二个目的的上述实施方案中，纳米粒是：天然材料或衍生物(壳聚糖、葡聚糖、明胶、脂质体、藻酸盐、淀粉)、聚合物载体(聚乳酸、聚(氰基)丙烯酸酯、聚乙烯胺、聚己内酯)、金属纳米粒、二氧化硅纳米粒。
实施例

[0158] 实施例1-肽的合成

[0159] 具有表1中所示序列的Bac-amp1和IDR-1018肽是使用氟甲氧基羰基(Fmoc)保护基通过固相肽合成而合成的。

[0160] 表1

[0161]肽序列
Bac-amp1 VRLIVKVRIWRR-NH2(SEQ ID NO：3)
IDR-1018 VRLIVAKVRIWRR-NH2(SEQ ID NO：1)

[0162] 将取代度为0.5mmol/g的Rink-Amide MBHA树脂用作固体载体。树脂提供了“接头”，其提供酰胺键并将酰胺化的肽释放至C端。

[0163] 合成结束时，通过用DMF中的40％(v/v)哌啶的溶液处理去除保护基，同时通过用由95％的三氟乙酸、2.5％的三异丙基硅烷和2.5％的H2O(v/v/v)构成的酸溶液处理，可实现与树脂的分离和氨基酸侧链上保护基的去除。

[0164] 与固体支持物分离之后，将每种肽在-20℃下的冷乙醚中沉淀。为了回收沉淀，将每个样品以3500rpm离心5分钟。将沉淀物溶解在CH3CN/H2O(95∶5)的混合物中，冷冻并冷冻干燥。

[0165] 实施例2-肽稳定性的分析

[0166] 在第一组实验中，评估了Bac-amp1和IDR-1018在不同的温度和pH条件下的稳定性。

[0167] 在不同的温度和pH条件下，通过在存在浓度为10mM的十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)胶束的情况下通过圆二色性(CD)谱研究其二级结构来模拟细胞膜状况来评估Bac-amp1和IDR-1018肽的稳定性。

[0168] 用配备有恒温吸收池室的Jasco J-810旋光分光计进行CD测定。将样品加载到0.1em长的石英收池室(Hellma Analytics)中，并且对于每个样品在15℃或90℃的温度下在190nm至250nm内分析谱。

[0169] 以20nm/分钟的扫描速度获得CD谱，并且记录的结果代表5次扫描的平均。在零时和2小时之后收集90℃下的谱，以评价肽在高温下的热稳性。

[0170] 使用以下公式计算残基的平均椭圆率([θ]，度em2 dmol-1)：

[0171] [θ]＝100θ/cnl

[0172] 其中θ代表椭圆率(m度)，c是肽的浓度(mM)，n是残基数。通过DICHROWEB位点计算二级结构(Whitmore L和Wallace BA，2004，Nucleic Acids Research 32：668-673，Whitmore L和Wallace BA，2008，Biopolymers 89：392-400，Lobley等，2002，Bioinformatics 18：211-212)，使用三种不同的算法(SELCON3，CONTIN-LLe CDSSTR)(Sreerema N和Woody RW，1993，Analytical Biochemistry 287：252-260；Sreerema N等，1999，Protein Science 8：370-380，Provencher SW和Glockner J，1981，Biochemistry
20：33-37，Van Stokkum IHM等，1990，Analytical Biochemistry 191：110-118，Compton LA和Johnson WC，1986，Analytical Biochemistry155：155-167，Manavalan P和Johnson WC，1987，Analytical Biochemistry167：76-85，Sreerama N等，2000，Protein Science 8：
370-380)，并选择SMP180蛋白作为比较数据集，其中包含大量可溶性蛋白和膜蛋白(Abdul-GaderA等，2011，Bioinformatics 27：1630-1636)。

[0173] 实施例2a-热稳性测定

[0174] 将0.1g/L的Bac-amp1或IDR-1018肽溶解在pH 6和10mM SDS的100mM乙酸钠缓冲液中。将制备的样品在15℃或90℃下孵育2小时。对存储在15℃的样品以及在90℃下孵育2小时之前和之后的样品进行CD分析。Bac-amp1或IDR-1018获得的结果分别如图1和2中所示。

[0175] 如图1中所示，所有Bac-amp1 CD谱在215nm和222nm处都有两个负带，指示由α螺旋结构组成的肽的构象状态。此外，即使在该温度下孵育2小时之后，在90℃的样品谱中也没有发现显著变化。这些数据表明，Bac-amp1在15至90℃内维持其结构不变，因此具有高的热稳性的特征。

[0176] 如图2中所示，所有IDR-1018CD谱在约212nm处都有一个单负带，指示肽的构象状态主要由β片层结构组成。此外，即使在该温度下孵育2小时之后，对于这种肽，在90℃下的样品谱中也没有发现显著变化。因此，IDR-1018肽也具有高的热稳性的特征。两种肽的不同构象说明了对特异性的微生物的不同的杀菌活性，这将在下面讨论，即以不同的有效性对比病原性细菌(例如单核细胞增生李斯特氏菌)的生长的能力。

[0177] 实施例2b-pH稳定性测定

[0178] 将0.1g/L的Bac-amp1或IDR-1018肽溶解在100mM浓度的不同的溶液中，特别是：氯化钾-HCl(pH1)；甘氨酸-HCL缓冲液(pH2)；乙酸钠缓冲液(pH4和6)；tris-HCL缓冲液(pH8)；甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10)；碳酸氢钠-NaOH(pH 11)。在25℃下孵育一个小时之后，制备了每种包含浓度为10mM的SDS溶液的样品。将所得样品和未添加SDS的甘氨酸-HCL缓冲液样品在37℃下孵育另外的24小时，并通过CD进行分析。获得的结果示于图3和4中。

[0179] 在这两个图中，可以看出，对于这两种肽，在未添加SDS的情况下在pH 2下样品均显示出向198nm偏移的负带，这指示存在无序的“随机线圈”结构，而所有其他样品均显示出有序结构，对于Bac-amp1是α螺旋类型并且对于IDR-1018是β片层类型。

[0180] 如图3中所示，在存在SDS的情况下在不同pH条件下记录的所有Bac-amp1CD谱均指示，在所有分析条件下，肽均具有与该肽功能相关的α螺旋构象。

[0181] 如图4中所示，在未添加SDS的情况下在pH 2下记录的IDR-1018的CD谱具有向198nm偏移的负带，这指示在这些条件下该肽采取不同的构象状态；在不同的pH条件下在存在SDS的情况下记录的该肽的CD谱指示肽采取β片层构象。

[0182] 总体而言，这些结果显示，Bac-amp1肽在整个pH范围内比IDR-1018肽更好地维持其结构完整性。实际上，与Bac-amp1相比，IDR-1018肽的CD谱的分析清楚地指示，在IDR-1018的pH范围为8.0至11.0和Bac-amp1为1.0至4.0内，无序无规卷曲结构的百分比提高。因此，这两种肽在特定pH范围内显示出不同的构象稳定性，并且因此在杀菌活性方面显示出不同的功能性，因为这严格取决于其构象，无论是α螺旋还是β片层。

[0183] 根据这些结果，本发明人已经显示两种肽的组合确保了在宽pH范围内的杀菌活性，其是在食品工业中发现有用应用的特征。

[0184] 实施例2c-使用条件下的稳定性分析

[0185] 在存在Bac-amp1或IDR-1018或不存在Bac-amp1或IDR-1018(对照)的情况下将mozzarella盐水样品在4℃下孵育24小时。盐水是从脱脂的经巴氏消毒的揉合水得到的，添加3％至5％NaCl并用乳酸或柠檬酸酸化至pH 3.8至3.9。通过在mBondpack C18反相色谱柱(reverse phase column，RP)上进行HPLC来分析这三个样品。

[0186] 在图5中，显示了每个测试样品获得的色谱图；如该色谱图所示，在孵育过程中既没有发生肽的沉淀也没有发生肽的降解，因此其在盐水中完全稳定。

[0187] 实施例3-杀菌活性测定

[0188] 评价了Bac-amp1和IDR-1018肽针对革兰氏+(单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏-(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))病原性细菌的杀菌活性。

[0189] 对于三种选定的细菌种类，使用经认证和表征的菌株，如表2中所指不。

[0190] 如Bílikova等(2015，Peptides 68：190-196)中所述进行最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的评价，并且如Wang HX和Ng TB(2003，Peptides 24：969-972)中所述，用肉汤的微稀释液进行降低两种肽的50％细菌群体的有效浓度(EC50)的评价。

[0191] 使用GraphPad Prism版本6.00(Graph-Pad Software，La Jolla California USA)确定每个平板三次孵育的标准偏差和EC50评价。

[0192] 单核细胞增生李斯特氏菌

[0193] 关于单核细胞增生李斯特氏菌，向试验添加了五种野生菌株(野生株)SSl(4b血清型)、SS2(4b血清型)、SS3(4b血清型)、SS4(4b血清型)、SS5(1/2c血清型)，如表2中所示。这些菌株是从食品公司的工作台获得的200份食品废料(特别是鱼类产品和牛奶衍生物)的样品中分离出来的。所有样品均在官方控制的背景下收集。根据ISO-11290-1标准进行单核细胞增生李斯特氏菌菌株的分离。简而言之，将25克样品在HalfFraser Broth培养基(AES Laboratoire，Route de Dol，Combourg，France)中均质化(1：10w/v)，并在37℃下孵育18小时。将1ml培养液转移至Fraser Broth培养基(Fraser JA和Sperber WH，1988，J Food Protect 51(10)：762-765)，并在37℃下孵育24小时。随后，将浓缩液在37℃下在ALOA和牛津琼脂(Oxoid，Basingstoke，UK)上划线24小时。用李斯特氏菌API(BioMerieux，Marcy l′Etoile，France)生化鉴定单核细胞增生李斯特氏菌菌落。

[0194] 对于获得的所有五种野生菌株，均使用在美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)的《分析细菌学手册》中认证和报告的方案以及通过使用针对体细胞(O)和鞭毛(H)抗原的商业抗体(Denkan Seiken Co.Ltd，Tokyo，Japan)进行血清分型(脉冲电场凝胶电泳PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)，使用AscI和ApaI限制性内切酶的PulseNet)。特别地，发现SS1至SS4菌株属于4b血清型，其对人最具致病性和攻击性，引起至少50％的李斯特氏菌病病例，而SS5菌株属于1/2c血清型。制备对照储液混悬液，其中将103CFU的单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC菌株和如上所述分离的SS1、SS2、SS3、SS4和SS5菌株)接种于10ml的Half Fraser Broth中，并对混悬液进行连续稀释(100至0.01μM)。然后制备DMSO中两种肽的5mM储液，并在Fraser Broth中进行连续稀释(100至0.01μM)，将其用
103CFU(菌落形成单位)的单核细胞增生李斯特氏菌接种并在37℃下孵育6小时。同时，以相同方式处理对照样品，但不添加两种肽。将50μl的每种细菌混悬液接种在不同的培养板中：
血琼脂和ALOA(Oxoid，Basingstoke，UK)，然后将其在37℃下孵育24至48小时。每个稀释系列包含具有细菌以及没有肽的单独的DMSO的对照板。如上所述，与ATCC菌株和从海洋食品分离出的2种野生株平行进行测定。

[0195] 鼠伤寒沙门氏菌

[0196] 制备对照储液混悬液，其中将103CFU的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC13311菌株)接种在10ml的BPW(Oxoid，Basingstoke，UK)中。然后，制备两种肽的5mM储液，并在BPW中进行系列稀释(100至1μM)，用103CFU的鼠伤寒沙门氏菌接种并在37℃下孵育6小时。将50μl的每种细菌混悬液接种在具有血琼脂或发色琼脂(Oxoid，Basingstoke，UK)的培养皿中并在37℃下孵育20小时。每个稀释系列包含接种有没有肽的DMSO的对照板以及具有单独的细菌的对照板。

[0197] 金黄色葡萄球菌

[0198] 制备对照储液混悬液，其中将103CFU的鼠伤寒沙门氏菌(6571菌株)接种在10ml的BPW中。然后，制备两种肽的5mM储液，并在BPW中进行系列稀释(100到1μM)，将其用103CFU的金黄色葡萄球菌接种并在37℃下孵育6小时。同样在这种情况下，稀释系列包含接种有没有肽的DMSO的对照板以及仅具有细菌的对照板。

[0199] 将50μl的每种细菌混悬液倒入具有血琼脂或兔血浆纤维蛋白原琼脂的培养皿中，并在37℃下孵育20小时。

[0200] 在所有研究的实验条件下，均使用平板计数法评估肽的杀菌活性。具体地，计数并比较在不存在或存在肽的单独稀释液的情况下在具有接种有细菌混悬液的琼脂的平板上生长的菌落数目。使用统计软件确定每个平板三次孵育的标准偏差。

[0201] 所有杀菌活性测定均使用2log CFU(未另作指定)进行，这代表新鲜食品中可能包含的污染水平的实际近似值。图6显示了Bac-amp-1肽针对金黄色葡萄球菌(NCTC)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC)、单核细胞增生李斯特氏菌(SS1)和单核细胞增生李斯特氏菌(SS2)获得的剂量反应曲线。

[0202] 根据这两种肽获得的剂量反应曲线，对于从食品和工作表面分离出的其他三种李斯特氏菌菌株，针对市售细菌菌株(ATCC、NTCC)和李斯特氏菌野生菌株(SS1至SS5)的EC50值(降低培养基中存在的细菌群体的50％的有效肽浓度)，可用数据仅允许鉴定出两种肽仍具有活性的浓度阈值(表2)。

[0203] 表2

[0204]致病物种 EC50 IDR-1018 EC50 Bac-amp1
金黄色葡萄球菌(NCTC) 1.58μM 1.66μM
鼠伤寒沙门氏菌(ATCC) 3.12μM 2.83μM
单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC) 0.22μM 0.55μM
单核细胞增生李斯特氏菌(SS1) 0.69μM 0.28μM
单核细胞增生李斯特氏菌(SS2) 0.40μM 0.08μM
单核细胞增生李斯特氏菌(SS3) ＜25μM ＜1μM
单核细胞增生李斯特氏菌(SS4) ＜25μM ＜1μM
单核细胞增生李斯特氏菌(Ss5) ＜25μM ＜1μM

[0205] 表2中报道的数据表明，与针对金黄色葡萄球菌和鼠沙门氏菌菌株记录的具有中等强度的杀菌活性相比，两种肽针对单核细胞增生李斯特氏菌都具有强大的杀菌活性。

[0206] 实际上，两种肽在所有李斯特氏菌菌株上均显示出小于0.7μM的EC50值。此外，尽管IDR-1018肽针对商业李斯特氏菌菌株显示出更有效的活性，但Bac-amp1肽似乎对5种野生菌株具有特定的作用特异性，其EC50值为＜1μM至0.28μM。这些结果表明，在Bac-amp1的情况下，存在针对李斯特氏菌的精确抗微生物作用机制，该机制涉及细菌通过膜移位，以与参与重要代谢过程的特定胞内靶标相互作用和抑制参与重要代谢过程的特定胞内靶标。

[0207] 如果我们考虑，通常，从环境和/或食品分离出的微生物菌株显示出针对抗生素和消毒剂的适应性或抗性，其可能是由于存在携带抗性基因的移动遗传元件或改变了细菌细胞壁的通透性，那么从适用的角度来看，Bac-amp1肽的这种活性代表了非常相关的数据。

[0208] 实施例4-抗生物膜活性测定

[0209] 通过分析Bac-amp1和IDR-1018肽抑制单核细胞增生李斯特氏菌细菌生物膜形成的能力来测试其抗生物膜活性。

[0210] 由于已知抗微生物剂的抗生素活性在很大程度上取决于实验方法，因此其可能有利于抑制生物膜并高估其实际有效性，在本发明中对这样的肽抵抗细菌生物膜形成的能力的评估是在钢制圆盘上进行的，该圆圆盘是一种在食品工业中广泛使用的惰性材料。

[0211] 实施例4a-用结晶紫染色进行抗生物膜活性测定

[0212] 根据具有一些修改的G.Di Bonaventura等.(2008，J Appl Microbiol104(6)：1552-61)中描述的微量培养板测定确定肽防止单核细胞增生李斯特氏氏菌生物膜形成的能力。

[0213] 通过在37℃下接种脑心浸出液肉汤(Sigma-Aldrich，City and State)至对数生长期来制备单核细胞增生李斯特氏菌培养物(ATCC7644和EURL12MOB098LM)。然后将10ml的3
细菌混悬液离心，将细胞沉淀物在PBS中洗涤并在BHI肉汤中稀释，达到约10 CFU/ml的标准化接种物的浓度。

[0214] 使用在食品工业中用作食品接触表面的直径为14.5mm(SS)的Aisi304 不锈钢圆盘作为目标表面进行生物膜形成测定。将圆盘放置在具有平底和盖的24孔组织培养板上(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts，USA)。使用之前，将不锈钢圆盘浸入10％丙酮中，并在室温下弱搅拌30分钟。在超纯无菌水中洗涤之后，将圆盘在≥99.8％的乙醇中于弱搅拌下孵育10分钟，并且然后在超纯无菌水中洗涤，干燥，包装并在121℃、1atm下灭菌15分钟。

[0215] 在每组实验中，在存在或不存在浓度为12.5μM、25μM或50μM的每种肽的情况下，将600μl标准化接种物添加至包含先前经处理的不锈钢材料的24孔培养板。BHI肉汤用作阴性对照。将平板在静态条件下在37℃下孵育72小时。单核细胞增生李斯特氏菌的细胞计数，根据ISO11290-2：98方法。孵育之后，将SS圆盘用PBS洗涤3次并放置在新的平板中以在60℃下干燥1小时。向每个孔添加1ml的95％乙醇中的0.2％结晶紫，以对黏附在SS圆盘表面的细菌细胞进行染色。弱搅拌15分钟之后，将SS圆盘用无菌水洗涤3次，并且然后转移至新的平板以在37℃下干燥1小时。通过添加1ml的33％乙酸进行生物膜产生的定量分析，该乙酸从黏附的细胞去除染料。将200μl的获得的溶液转移至微量培养板并在492nm处测量结晶紫水平(OD)。

[0216] 每种孵育条件的细菌生物量的量由“箱形图”表示；箱外的点被认为是异常值(离群值)。通过应用非参数方差分析(Kruskal-Wallis检验)进行统计学显著性检验，然后使用Dunn检验和Bonferroni校正(p＜0.05)进行多对比较。使用 Excel进行统计学测定。

[0217] 如图7中所示，Bac-amp1肽显示出显著的抗生素活性，对应于MBIC100(最低生物膜抑制浓度)的值，在浓度为20至25μM时微生物生物量降低70％至80％，并且浓度为25至50μM时降低100％。

[0218] 如图8中所示，与Bac-amp1相比，IDR-1018肽在所采用的任何实验条件下均不能100％抑制细菌生物膜的形成，在50μM浓度下的达到81.5％的最大抑制率。

[0219] 这些结果表明，Bac-amp1肽能够完全抑制李斯特氏菌形成抗生物膜，而IDR-1018具有稍弱的抗生物膜活性。

[0220] 这些数据还表明，Bac-amp1肽所采用的构象比IDR-1018肽更适合于防止单核细胞增生李斯特氏菌产生的生物膜的生长。

[0221] 实施例4b-用SEM进行抗生物膜活性测定

[0222] 通过扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM)进一步研究Bac-amp1和IDR-1018肽在单核细胞增生李斯特氏菌生物膜上的活性。

[0223] 具体而言，在该实施例中，研究了在不锈钢材料上开发的三维生物膜结构。

[0224] 根据实施例4a的相同的方法，在存在或不存在浓度为25μM或50μM的每种肽的情况下用600μl的标准化接种物或用对照培养基处理直径为14.5mm(SS)的Aisi 304不锈钢圆盘，并在无菌PBS中反复洗涤以去除浮游细胞，并用1ml的包含缓冲液0.064M(Electronic Microscopy Science，Hatfield，PA，USA)中的5％戊二醛、4％多聚甲醛的卡尔诺夫斯基固定剂(Kamovsky fixative)在新的平板上在4℃下固定1小时。此后，将样品在pH 7.4的0.1M钙酸钠缓冲液中洗涤(Electronic Microscopy Science，Hatfield，PA，USA)，并将固定的细胞在一系列不同浓度(特别是25％、50％、75％和100％)的丙酮水溶液中脱水。将样品胶黏到抛光的铝样品架(Electronic Microscopy Science，Hatfield，PA，USA)上，并用K950高真空涡轮蒸发器和K 350 联轴器(Emitech Ltd，Ashford，UK)均匀地真空涂覆有20nm厚的金层。在JEOL 6700FEG场发射电子显微镜(SEM Jeol，City and State)以1000×至5000×的放大倍数检查涂层样品。对于每个样品，随机分析以电子图像获取的许多图像(5至10)。

[0225] 观察到，用Bac-amp1进行的处理在25μM时已经显著降低了生物膜的形成，而在50μM时观察到最好的结果。

[0226] 图9示出了显示浓度为50μM时的Bac-amp1肽对生物膜形成的影响的显微图像。

[0227] 如图9a中所示，用Bac-amp1处理的样品的1000×图像显示细胞比未经处理的对照样品的细胞更稀疏和分散，其图像示于图9b中。

[0228] 如图9c中所示，用Bac-amp1处理的样品的5000×图像显示几乎不存在细胞，而存在于未经处理的对照样品中，其图像示于图9d中。

[0229] 图10示出了显示浓度为50μM时的IDR-1018肽对生物膜形成的影响的显微图像。

[0230] 如图10a中所示，与用Bac-amp1处理的样品的1000×图像相比，用IDR-1018处理的样品的1000×图像显示出更多的细胞，如图9a中所示。此外，如可在图10b中看出，与用Bac-amp1处理的样品的5000×图像相比，用IDR-1018处理的样品的5000×图像显示出更多的细胞，如图9c中所示。

[0231] 这些结果确定Bac-amp1肽也能够在生物膜上发挥其杀菌活性，并且具有抑制由单核细胞增生李斯特氏菌产生的生物膜形成的能力，该能力明显优于IDR-1018肽。

[0232] 实施例5-在用Bac-amp1官能化的支持物上的杀菌活性测定

[0233] 在室温下，将主要由氧化硅(SiO2)组成的固体载体(以下称为SOS)浸入体积比为4∶1的硫酸(H2SO4)和过氧化氢(H2O2)的溶液中30分钟，为了在SOS的表面上形成Si-OH基团，之后在脱盐水中洗涤样品。此后，将样品在室温下在包含按体积计5％的作为硅烷化剂的氨基丙基三乙氧基硅烷的无水甲苯溶液中浸泡六十分钟，以用更强的Si-C键替代热力学稳定的Si-OH键。孵育结束时，将样品放置在100℃下的热平板上十分钟。然后将样品在包含溶解于PBS溶液(0.1M pH＝7.4)中的浓度为1.6mM的150μl的辛二酸双琥珀酰亚胺(能够通过N端末端与Bac-amp1肽共价结合的双官能团)的溶液中在4℃下孵育5小时。

[0234] 将具有Bac-amp1的官能化材料(SOSF)与单核细胞增生李斯特氏菌(3×103CFU/ml)的培养物在合适的容器中孵育，并通过在不同时间间隔采集的培养样品上的重要菌落计数来评价固定化肽的杀菌活性。使用非官能化支持(KSOS)作为对照进行了相同的分析。

[0235] 图11中显示的数据指示在存在官能化材料的情况下，在孵育6小时之后可观察到CFU的显著降低。获得的结果支持用于在不同工业部门应用的“特别的”官能化材料的生产。

[0236] 实施例6-与IDR-Bac-amp1缀合的金纳米球的制备

[0237] 导致肽缀合的金纳米球形成的化学反应示意地如图12中解释说明。

[0238] 详细地，通过分别混合作为表面活性剂和还原剂的聚(乙二醇)二酸(0.25mM，0.25mL，PEG-diacid，Sigma-Aldrich，USA)和四氢硼酸钠(0.01M，20mL，NaBH4，Sigma-Aldrich，USA)，由氯金酸(0.25mM，25mL；HAuCl4 3H2O，Sigma-Aldrich，USA)合成PEG稳定的金纳米粒，如Spadavecchia等，Analyst2014，139，157-164(doi：10.1039/C3AN01794J)中所述。

[0239] 添加还原剂之后，观察到PEG稳定的金纳米粒的形成是溶液从淡黄色到亮红色的瞬时颜色变化。将反应混合物在15.000rpm下离心30分钟3次，并且然后弃去上清液。将所得的金纳米粒沉淀重悬在20ml的MilliQ水中。

[0240] 如图12中所示，通过与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC 5mM/NHS 2.5mM，Sigma-Aldrich，USA)反应，将获得的PEG稳定的金纳米粒的羧基与Bac-amp1(0.125或0.030mM)的N胺基共价缀合，如Terracciano，等，Nanoscale 2015，7，20063-20074中所述在室温下搅拌过夜。(doi：10.1039/C5NR05173H)。

[0241] 通过降低发生PEG化反应的pH来控制肽N端处PEG羧基的位点特异性加成。实际上，pH的酸值选择了PEG-COOH和N端之间的反应，因为其pKa等于2.18，而赖氨酸残基侧链上的氨基的pKa也可能是EDC/NHS共轭化学的有吸引力的靶标，其等于8.95。

[0242] 与Bac-amp1肽缀合之后，将金用MilliQ水洗涤两次并重悬浮在MilliQ水中。

[0243] 实施例7-裸金纳米粒和经Bac-amp1修饰的金纳米粒的表征

[0244] 在用125μM Bac-amp1缀合之前和之后，使用透射电子显微术(TEM)研究实施例6中获得的纳米球的形态。为此目的，将1ml的样品以15000rpm离心30分钟并弃去上清液。将固体部分重新分散在1ml的MilliQ水中，然后将10μL的NPs分散体放置在带有花边碳膜的TEM铜栅上，在室温下干燥并且然后通过FEI Tecnai G2 Spirit BT TEM在100KV的加速电压下观察。

[0245] 使用配备有He-Ne 激光器(633nm、固定散射角为173°、室温25℃)的Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments，Malvern，UK)，通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测量分散在水(pH 7)中的纳米粒的流体动力学直径(尺寸)和ζ电位(表面电荷)。在每次测量之前，将1mL的NPs溶液以15000rpm离心30分钟，然后重新分散在MilliQ水中。使用来自Jasco Int.Co.Ltd，Tokyo，Japan的V-570UV/VIS/NIR Cary 100(Agilent)分光光度计在300至900nm内记录裸金纳米粒的和经修饰的金纳米粒(1mL)的吸收谱。

[0246] 使用DLS量化裸纳米粒的平均直径为8±2nm，而Bac-amp1-HAuNPs为16±4。由于-COOH PEG基团的暴露，在125μM肽缀合之前，表面电荷为-26mV，并且由于具有4个正净电荷的Bac-amp1的正氨基酸，偶联之后为+27mV。

[0247] Bac-amp1纳米粒胶体溶液随时间表现出杰出的化学稳定性：第一批在6月底合成并且即使在室温下储存在工作台上，其在12月的实验中也发挥作用；进一步的对照分析(通过DLS和CD)确定，三月份的大小和构象参数没有变化。

[0248] TEM成像显示，Bac-amp1接枝之后，平均尺寸为13±5nm(图1(d))和14±7nm(图1(e))的纳米粒分散良好。这些数据在其实验误差范围内与DLS一致。尽管有很高的负表面电荷和高的溶液中的稳定性，但Bac-amp1纳米粒在干燥之后仍显示出一些聚集的趋势。该作用可能是由于肽聚类。

[0249] 实施例8：官能化产率分析

[0250] 使用反相高效液相色谱法(Reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)通过直接和间接方法分析实施例6中获得的纳米球的官能化产率。

[0251] 准备了三种不同的解决方案用于分析。

[0252] 一旦官能化完成，将反应混合物在……下离心。

[0253] 离心之后，回收包含未结合肽的上清液(未结合Bac-amp1)。

[0254] 在室温下搅拌过夜，用50％(v/v)三氟乙酸(TFA，Sigma-Aldrich，USA)处理从上清液分离的肽结合纳米粒，如Solid-phase peptide synthesis，Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology，Volume 32(2006)：221-296中所述。在10℃下以15000rpm离心30分钟之后，回收包含从纳米粒切割的结合肽的上清液。

[0255] 通过RP-HPLC平行分析以上获得的两种溶液的样品，并与用于官能化的具有初始肽浓度(125μM)的参照溶液(Bac-amp1)一起进行了分析。

[0256] 为了进行分析，使用乙腈中的0.1％TFA的线性梯度(5％至95％)将200μl样品注入连接至UFLC系统(Shimadzu)的μBondapakC18反相色谱柱(3.9×300mm，Waters Corporation)。所有测量均重复三次。

[0257] 三个样品获得的吸光度曲线示于图13中，其显示了参照溶液(Bac-amp1)、从纳米粒表面切割肽之后上清液(结合Bac-amp1)和官能化反应结束时上清液(未结合Bac-amp1)的吸光度曲线。

[0258] 在直接方法中，通过将从裂解反应上清液获得的峰面积与从参照溶液获得的峰面积进行比较来测量以百分比表示的官能化反应的产率。

[0259] 这些数据表明，不超过9.0±1.0％的肽与金纳米粒表面共价缀合。

[0260] 为了进一步验证结果，还通过间接方法评估了结合肽，其中计算了未附接于纳米粒的肽的峰面积，并将其与从参照溶液中获得的峰面积进行了比较。与直接方法相比，在这种情况下，峰面积量化了未与纳米粒表面结合的肽量。结果表明与直接定量法获得的结果相似的趋势，偶联产率等于11.0±1.0％。

[0261] 因此，平均而言，我们假设初始肽浓度(125μM)的10％共价键合在金纳米粒上，在Bac-amp1偶联的纳米粒溶液中产生约12.5μM肽浓度。

[0262] 为了测试Bac-amp1浓度对固定化产率的影响，其是实现稳定和活性纳米粒形成的最关键参数之一，测试了不同量的肽以优化偶联反应条件。如图14中所示，很明显，在肽浓度为125μM的情况下获得了用于提高固定化产率的最合适的偶联条件。实际上，当在混合物中添加较少量的Bac-amp1时，与125μM浓度的肽相比，偶联反应产生的有效性较低，并且其还伴随有纳米粒的沉淀，这可能是由于表面未被肽完全覆盖，因此有利于其团聚。类似地，浓度的进一步提高并未确定肽与金纳米粒的缀合产率的显著变化。因此，125μM被认为是饱和浓度，并且最适合于进一步的实验。

[0263] 实施例9-Bac-amp1偶联的纳米粒的抗微生物活性

[0264] 确定了实施例6中制备的官能化金纳米粒针对单核细胞增生李斯特氏菌(LM2食品分离菌株)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 13311株)细菌的杀菌效力。其允许评价最低杀菌浓度(MBC50)，该浓度对应于能够导致琼脂平板上活菌数量降低至少50％的最低肽浓度。

[0265] 单核细胞增生李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌分别在37℃下在Half Fraser(Biorad-Italia)和BPW(Biomerieux-Italia)肉汤中生长。

[0266] 在一组实验中，将具有不同稀释度的单核细胞增生李斯特氏菌细胞(15×102至15×105)或鼠伤寒沙门氏菌细胞(15×101至15×103)的培养物与偶联至纳米粒(Au-NPs-Bac-amp1平板)或未官能化的金纳米粒(Au-NPs平板)的固定浓度的Bac-amp1(0.16μM)进行孵育。

[0267] 通过对Au-NPs-Bac-amp1平板和Au-NPs平板中的存活菌落形成单位(CFU)进行编号来确定数据，并表示为CFU数目相对于CFU初始数目降低的百分比。误差棒代表三次重复实验(n＝3)与平均值的标准偏差(standard deviation，SD)。

[0268] 用单核细胞增生李斯特氏菌细菌获得的结果示于图15中，并且用鼠伤寒沙门氏菌细胞获得的结果示于图16中。

[0269] 如可从图15看出，与两个未偶联的HAuNPs相比，Bac-amp1负载的纳米粒针对食品分离的单核细胞增生李斯特氏菌菌株LM2发挥了强大的杀菌活性，导致CFU数目显著降低。实际上，在分别接种有104和105细菌浓度的平板中观察到99.8％和99.9％的细菌生长抑制，而使用102CFU/ml接种物的抑制程度提高至100％。在这种情况下，抗微生物剂机制的增强还归因于未经涂覆的金纳米粒的内在作用，该内在作用引起革兰氏阳性细菌生长中的
96.2％的抑制，这可能是由于金离子从纳米粒核芯的释放。

[0270] 还测试了开发的Bac-amp1偶联的纳米粒针对鼠伤寒沙门氏菌(被选为革兰氏阴性细菌模型的最危险的食源性病原体之一)的杀菌特性。

[0271] 如图16中所示，只有负载的纳米粒导致当以103细菌浓度0.16μM时鼠伤寒沙门氏菌的活细菌细胞数量的显著降低(99.91％)，与针对较低细胞密度观察到的相比(101细菌浓度)，其中未经涂覆的纳米粒表现出30％的抗微生物活性。

[0272] 这些结果表明，与纳米粒缀合之后的束缚肽(tethered peptide)即使在食源性病原体引起爆发的感染剂量下也显示出杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二者的卓越的能力，因此表明偶联的纳米粒在广泛工业部门中的潜在应用。

[0273] 在这些结果的基础上，发现约15×104CFU/ml的起始接种物(在此时裸HAuNPs没有显示出致死活性)对于以剂量依赖性方式评估HAuNPs-Bac-amp1抗微生物活性是最佳的。

[0274] 因此，在另一组实验中，Bac-amp1偶联的纳米粒的活性是通过将15×104CFU/mL(菌落形成单位/mL)的李斯特氏菌与递增浓度(0.10μM至0.58μM)的偶联的纳米粒(Au-NPs-Bac-amp1平板)、未官能化的金纳米粒(Au-NPs平板)或游离肽(Bac-amp1平板)在37℃下孵育6小时确定的。对每个测试浓度下不同平板的活菌落数目进行计数。

[0275] 如图18中所示，Au-NPs-Bac-amp1板(灰条)和Bac-amp1板(白条)均显示出剂量依赖性细菌细胞死亡。但是，当肽结合在金颗粒上时，测量了显著更高的杀伤活性。

[0276] 这些数据表明，Bac-amp1与金纳米粒的缀合不仅不会破坏抗微生物肽的活性，而且出乎意料地增强了其抗微生物活性。

[0277] 通过在不同的时间间隔测量0.16μM偶联的纳米粒针对10×104CFU/mL(菌落形成单位/mL)的单核细胞增生李斯特氏菌的杀菌活性，来评价缀合的纳米粒的抗微生物活性随时间的稳定性。获得的结果表明，金束缚肽在储存和再使用期间具有卓越的长期稳定性，并且活性维持稳定持续至少7个月。推测高稳定性来自两个因素：纳米粒将活性肽牢固地维持在其表面上的能力以及固定在表面上的肽之间的空间排斥，其从而防止了纳米粒的聚集和沉淀。从应用的角度来看，这种行为可能具有重要的影响，因为有可能多次循环利用缀合物而不失去其效力。

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针对单核细胞增生李斯特氏菌的抗微生物肽

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