瑞香素在抗幽门螺杆菌中的应用
阅读：121发布：2020-05-14
专利汇可以提供瑞香素在抗幽门螺杆菌中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及瑞香素在抑制幽 门 螺杆菌中的新用途。所述的瑞香素对多种耐药表型幽门螺杆菌具有良好的杀伤作用。特别是发现，在浓度100μg/disc时能够产生直径39‑53mm的抑菌圈，其最小抑菌浓度(MIC)范围为25‑100μg/ml。所述瑞香素的新用途为抑制幽门螺杆菌药物提供了新选择。，下面是瑞香素在抗幽门螺杆菌中的应用专利的具体信息内容。
1.瑞香素在制备抑制幽门螺杆菌产品中的应用；
所述瑞香素的最小抑菌浓度范围为25-100μg/ml；
所述抑制幽门螺杆菌产品是利用瑞香素与幽门螺杆菌内的DNA相互作用而发挥抗菌作用的；
所述幽门螺杆菌为耐药表型幽门螺杆菌；
所述耐药表型幽门螺杆菌为：TE+MTZ、LEV+MTZ+AMX+CLA、LEV+MTZ、TE+LEV+MTZ、LEV+MTZ+CLA、LEV+CLA、TE+MTZ+CLA、MTZ+CLA；
所述TE为四环素；
所述MTZ为甲硝唑；
所述LEV为左氧氟沙星；
所述AMX为阿莫西林；
所述CLA为克拉霉素。
2.瑞香素在制备抗幽门螺杆菌药物组合物中的应用；
所述幽门螺杆菌为耐药表型幽门螺杆菌；
所述耐药表型幽门螺杆菌为：TE+MTZ、LEV+MTZ+AMX+CLA、LEV+MTZ、TE+LEV+MTZ、LEV+MTZ+CLA、LEV+CLA、TE+MTZ+CLA、MTZ+CLA；
所述TE为四环素；
所述MTZ为甲硝唑；
所述LEV为左氧氟沙星；
所述AMX为阿莫西林；
所述CLA为克拉霉素；
所述抗幽门螺杆菌药物组合物是利用瑞香素与幽门螺杆菌内的DNA相互作用而发挥抗菌作用的。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物制成药学领域可接受的任一剂型，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述由幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病为慢性胃炎、胃溃疡、胃癌。
瑞香素在抗幽门螺杆菌中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 瑞香素(Daphnetin)是从瑞香属植物长白瑞香(Daphne Korean Nakai)中提取出来的有效成分，又名祖师麻甲素，其为我国首创的新药，化学名为7,8-二羟基香豆素(7,8-dithydroxycoumarin)，主要存在于瑞香科属植物中。
[0003] 瑞香素的药理作用十分广泛，包括：抗血栓形成、降血脂、抗炎、镇痛作用、镇静催眠、抗疟疾作用、杀蚜虫作用、抗菌作用等。目前已有其抗菌活性的报道，主要包括：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌等。但还未见其针对幽门螺杆菌(Helicobacteria pylori，Hp)活性抑制的报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是通过以下方案实现的。
[0006] 本发明提供了瑞香素在抑制幽门螺杆菌中的应用。
[0007] 所述瑞香素的最小抑菌浓度(MIC)范围为25-100μg/ml。
[0008] 所述幽门螺杆菌为耐药表型幽门螺杆菌。
[0010] 优选地，所述耐药表型幽门螺杆菌为：TE+MTZ、LEV+MTZ+AMX+CLA、LEV+MTZ、TE+LEV+MTZ、LEV+MTZ+CLA、LEV+CLA、TE+MTZ+CLA、MTZ+CLA、TE+MTZ+CLA。
[0011] 本发明还提供瑞香素在制备抗幽门螺杆菌药物组合物中的应用。所述药物组合物中瑞香素含量为5-95％。
[0012] 所述药物组合物可制成药学领域可接受的任一剂型，优选粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液等剂型。
[0013] 本发明还提供瑞香素在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物中的应用。所述由幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病主要有慢性胃炎、胃溃疡、胃癌等。
[0014] 本发明研究人员在对瑞香素深入研究过程中意外发现了其对幽门螺杆菌有显著抑制作用的特性，并通过药敏纸片法和琼脂稀释法验证了瑞香素对多种耐药表型幽门螺杆菌具有良好的杀伤作用。特别是发现，在浓度100μg/disc时能够产生直径39-53mm的抑菌圈，其最小抑菌浓度(MIC)范围为25-100μg/ml。
[0016] 图1为经瑞香素处理后的幽门螺杆菌的形态学变化。其中，未处理组为A，B和C；经12.5μg/ml瑞香素处理组(3d)为D，E和F；放大倍数：A、D为3000倍，B、E为5000倍，C、F为8000倍。
[0017] 图2为流式细胞仪检测瑞香素处理后DNA断裂情况。
[0018] 图3为激光扫描共聚焦显微镜观察瑞香素处理后DNA断裂情况。
[0019] 图4为DNA Ladder检测DNA断裂情况。
具体实施方式
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021] Karmali血平皿：将Karmali培养基(Oxioid，生产批号：1769512)溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血(北京万丰动物饲养场)，混匀，随后取
15ml倒入平皿中，晾干备用。
15ml倒入平皿中，晾干备用。
[0022] 1000×抗生素储存液：100mg甲氧苄氨嘧啶/Trimethoprim(生产批号BB02BA007)，160mg两性霉素B/Amphotericin B(生产批号BB10BA003)生工生物工程(上海)有限公司，加入至20ml的DMSO中。1ml每管分装，储存于-20℃。
[0023] 200×抗生素储存液：50mg头孢磺啶钠/Cefsulodin Sodium Salt(生产批号52152-93-9)百灵威科技有限公司，100mg万古霉素/Vancomycin Hydrochloride(生产批号R3/171/251)INALCOSPAMILANO，3.3mg多粘菌素B/Polymyxin B Sulfate(生产批号B326BA3329)生工生物工程(上海)有限公司，加入至50ml双蒸水中并用0.22μm的滤膜过滤，
5ml每管分装，储存于-20℃。
5ml每管分装，储存于-20℃。
[0024] β-环糊精：取1g加入5ml DMSO中(现配现用)。
[0025] MH抗性平皿：将Mueller Hinton Agar培养基(BD，生产批号：5264522)溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血、1000×抗生素储存液、200×抗生素储存液、β-环糊精，混匀，随后取15ml倒入平皿中，晾干备用。
[0026] MH血平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取15ml倒入平皿中，晾干备用。
[0027] 甲硝唑临界平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取13.5ml倒入含有40mg/ml，80mg/ml，
160mg/ml甲硝唑(中国食品药品检定研究院，生产批号100191-201507)的平皿中，晾干备用。
160mg/ml甲硝唑(中国食品药品检定研究院，生产批号100191-201507)的平皿中，晾干备用。
[0028] 左氧氟沙星临界平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取13.5ml倒入含有5mg/ml，10mg/ml，
20mg/ml左氧氟沙星中国食品药品检定研究院，生产批号130455-201106)的平皿中，晾干备用。
20mg/ml左氧氟沙星中国食品药品检定研究院，生产批号130455-201106)的平皿中，晾干备用。
[0029] 四环素临界平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取13.5ml倒入含有5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml四环素中国食品药品检定研究院，生产批号130306-201419)的平皿中，晾干备用。
[0030] 克拉霉素临界平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取13.5ml倒入含有5mg/ml，10mg/ml，
20mg/ml克拉霉素中国食品药品检定研究院，生产批号130356-200102)的平皿中，晾干备用。
20mg/ml克拉霉素中国食品药品检定研究院，生产批号130356-200102)的平皿中，晾干备用。
[0031] 阿莫西林临界平皿：将Mueller Hinton Agar培养基溶解于双蒸水中，121℃，15min。待其冷却至55℃时，加入5％的羊血，混匀，随后取13.5ml倒入含有5mg/ml，10mg/ml，
20mg/ml阿莫西林中国食品药品检定研究院，生产批号130409-200208)的平皿中，晾干备用。实施例1多药耐药幽门螺杆菌菌株的获取
20mg/ml阿莫西林中国食品药品检定研究院，生产批号130409-200208)的平皿中，晾干备用。实施例1多药耐药幽门螺杆菌菌株的获取
[0032] 1、幽门螺杆菌的培养与传代
[0033] 将收集的幽门螺杆菌菌株培养于Karmali血平皿中，培养条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养3天。幽门螺杆菌出现生长时取出传代，从微氧罐中取出待传代的幽门螺杆菌，放入超净工作台，用接种环刮取足量的幽门螺杆菌菌落至生理盐水中，调整浓度至2
8
×10 cfu/ml，100μL涂布于MH加抗生素平皿中，将其与产气袋(日本三菱株式会社)一同放于培养罐(日本三菱株式会社)中，37℃培养3d。
8
×10 cfu/ml，100μL涂布于MH加抗生素平皿中，将其与产气袋(日本三菱株式会社)一同放于培养罐(日本三菱株式会社)中，37℃培养3d。
[0034] 2、鉴定
[0035] 形态学：菌落特征为无色透明，表面光滑湿润。经涂片革兰氏染色后油镜下观察呈弧形或S形。
[0036] 生化反应：将菌悬液滴入3％的过氧化氢(北京化工厂，生产批号20150516)溶液中有气泡产生；将菌悬液滴于尿素酶试纸(珠海市克迪科技开发有限公司，生产批号151003)上，尿素酶试纸变红；通过16SrRNA测序与NCBI数据库中幽门螺杆菌序列进行比对，相似度高于95％。
[0037] 实施例2临床菌株耐药表型的确定
[0038] 1、临界值法：
[0039] (1)接种：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF2.0-4.0(约1×108CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液(2.5μL/spot)加入含有不同抗生素种类和浓度的临界平皿中。
[0040] 所述抗生素种类具体为甲硝唑MTZ、克拉霉素CLA、左氧氟沙星LEV、阿莫西林AMX、四环素TE。
[0041] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0042] (3)结果读取：
[0043] 若临界平皿中有菌生长，则记为相应抗生素的耐药菌。
[0044] 若低于临界值有菌生长而临界值无菌生长，也记为相应抗生素的耐药菌，但随后用E-test法对其进行验证。
[0045] 若临界平皿以及低于临界值平皿中均无生长则记为敏感菌。
[0046] 2.E-test法：
[0047] (1)涂布：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF2.0-4.08
(约1×10CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于MH血平皿中晾干，随后将E-test条(oxioid，生产批号1003258670/克拉霉素，1003409180/甲硝唑，1003198540/阿莫西林，
1003374650/四环素)贴入平皿中。
(约1×10CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于MH血平皿中晾干，随后将E-test条(oxioid，生产批号1003258670/克拉霉素，1003409180/甲硝唑，1003198540/阿莫西林，
1003374650/四环素)贴入平皿中。
[0048] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0049] (3)结果读取：根据E-test产生的抑菌圈，读取相应的MIC值。
[0050] 表1.收集到的幽门螺杆菌的耐药表型
[0051]
[0052] *耐药临界值：甲硝唑8μg/ml；克拉霉素1μg/ml；左氧氟沙星2μg/ml；四环素1μg/ml；阿莫西林1μg/ml。N表示未检测。
[0053] 表2.全国幽门螺杆菌耐药表型分布情况
[0054]
[0055]
[0056] 由表1、表2可知，我们收集到各种耐药表型的幽门螺杆菌菌株且耐药情况分布与全国幽门螺杆菌耐药情况基本一致。
[0057] 实施例3药敏试验
[0058] 1.纸片法
[0059] (1)涂布：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF2.0-4.0(约1×108CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于MH血平皿中晾干，随后将含100μg瑞香素(大连美仑生物技术有限公司，生产批号A1228AS)的药敏纸片(oxioid，生产批号1829617)贴入。
[0060] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0061] (3)结果读取：通过游标卡尺测量产生的抑菌圈直径。
[0062] 2.平皿二倍稀释法
[0063] (1)接种：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF 2.0-4.0(约1×108CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液(2.5μL/spot)加入含有不同瑞香素浓度(100,50,25,12.5,6.25,0μg/ml)的MH血平板中。
[0064] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0065] (3)结果读取：无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)；
[0066] 表3瑞香素对不同耐药表型幽门螺杆菌的抑制作用
[0067]
[0068]
[0069] *ATCC43504对不同抗生素规定范围(CLSI)/实际测得:克拉霉素(0.015-0.12)/0.016，阿莫西林(0.015-0.12)/0.016，甲硝唑(64-256)/256，对质控菌的MICs均在CLSI规定范围内。
[0070] 由表3可知，瑞香素对临床上各种耐药表型幽门螺杆菌均具有抑制作用，对临床上最常见的甲硝唑耐药以及多药耐药幽门螺杆菌抑制作用显著。
[0071] 实施例4作用机制
[0072] 本申请还对瑞香素抗幽门螺杆菌的抗菌机制进行研究。
[0073] 1、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察电子密集体(electrondense bodies,EDB)
[0074] (1)接种：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF 2.0-4.0(约10^8CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于含有不同浓度瑞香素的MHA平皿中
[0075] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0076] (3)收集菌体：用生理盐水润湿的棉棒轻轻刮取平皿中的Hp，并将其稀释于生理盐水中。
[0077] (4)固定：吸取800μl菌液，3000rpm离心3min，去上清，加入500μl的1×PBS洗2-3次；在沉淀中加入4％戊二醛(ACROS ORGANICS,生产批号A0365322)1ml，充分混匀，4℃静置过夜。
[0078] (5)送样前样品处理：3000rpm离心3min，去上清，加入500μl的1×PBS洗2～3次；在沉淀中缓慢加入2％戊二醛500μl，充分混匀，4℃放置1h；3000rpm离心3min，去上清，加入500μl的1×PBS洗2～3次
[0079] (6)送样：将处理好的样品4℃保存，送至天坛电镜室进行后续的样品处理。
[0081] (1)接种：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF 2.0-4.0(约10^8CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于含有不同浓度瑞香素的MHA平皿中。
[0082] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2 5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0083] (3)收集菌体：用生理盐水润湿的棉棒轻轻刮取平皿中的Hp，并将其稀释于生理盐水中。
[0084] 细菌悬液的流式细胞术检测(北京全式金生物技术有限公司，产品批号K10606)：
[0085] (1)细菌悬液经3000rpm离心3min，弃掉上清，用1mlPBS洗两次，3000rpm离心3min，弃上清。
[0086] (2)固定：加入1ml甲醛固定液，轻柔颠倒数次以充分重悬细胞，室温固定30min(期间应颠倒重悬2-3次)。
[0087] (3)用1ml PBS洗细胞3次，3000rpm离心3min，弃上清。
[0088] (4)通透：加入1ml细胞通透液，轻柔地重悬细胞并室温静置10min(期间应颠倒重复2-3次)。
[0089] (5)标记：3000rpm离心3min，弃上清，将250μL 1×Labeling Solution与10μL TdT混匀后加入其中，随后轻柔地充分重悬，37℃避光标记1h。
[0090] (6)3000rpm离心3min，弃上清，用1ml细胞通透液轻柔地充分重悬细胞，重复2次，随后用1ml PBS轻柔地充分重悬细胞，进行流式细胞仪检测。
[0091] 共聚焦检测
[0092] (1)取10μL细胞悬液滴于载玻片上晾干，加入0.5ml甲醛固定液，室温固定30min。随后用1ml PBS静置洗涤3次，每次5min。
[0093] (2)吸干上一步残留液体，滴加100μL细胞通透液，室温静置5min。
[0094] (3)标记：将50μL 1×Labeling Solution与2μL TdT混匀后滴加至样品表面，37℃避光标记1h。
[0095] (4)向标本上滴加100μL细胞通透液，室温静置5min，然后小心吸取样品周围液体，重复3次。
[0096] (5)小心吸取样品周围液体，滴加2.5μL抗淬灭封片剂，使用盖玻片封片。
[0098] (1)接种：用接种环刮取生长于抗性平板中Hp到生理盐水中，并稀释至McF 2.0-4.0(约10^8CFU/ml)。用移液枪将稀释好的菌液150μL涂布于含有不同浓度瑞香素的MHA平皿中。
[0099] (2)培养：将平板放入培养罐中并放入产气包使气体条件为10％CO2，5％O2和85％N2，37℃培养72h。
[0100] (3)收集菌体：用生理盐水润湿的棉棒轻轻刮取平皿中的Hp，并将其稀释与生理盐水中。
[0101] (4)吸取800μl菌液，3000rpm离心3min，弃上清，加入200μL PBS，轻轻吹散细胞，是细胞重悬于PBS中。
[0102] (5)加入4μL RNaseA，Vortex混匀，室温放置3-5分钟；加入20μL蛋白酶K,Vortex混匀；加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀，70℃孵育10min；加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
[0103] (6)将混合物加入到DNA纯化柱中，≥8000rpm离心1min，倒掉收集管内液体。
[0104] (7)加入500μL洗涤液I，≥8000rpm离心1min，倒掉收集管内液体。
[0105] (8)加入600μL洗涤液Ⅱ，≥8000rpm离心1min，倒掉收集管内液体。
[0106] (9)≥12000rpm离心2min，去除残留的乙醇。
[0107] (10)室温放置几分钟，将DNA纯化柱至于一洁净的1.5ml离心管中，加入50-100μL洗脱液，室温放置1-3min，≥12000rpm离心1min。
[0108] (11)取10μL样品，1％琼脂糖凝胶电泳分析。
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