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具有点击官能团的ε-聚-L-赖氨酸衍生物、其制法以及其用途

阅读：412发布：2020-05-08

专利汇可以提供具有点击官能团的ε-聚-L-赖氨酸衍生物、其制法以及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供具有通式(1)所示的结构的化合物或其盐、以及药理活性物质，所述药理活性物质是在药理作用物质中通过化学键导入有上述化合物或其盐、一并改善了生物膜通透性和水溶性的物质，所述通式(1)中，n为2至100；P表示被一个氨基取代的(C1-C5)亚烷基；Q为下述通式(2)，上述通式(2)中，X表示氧原子，Y1和Y2表示碳原子数1至6的亚烷基，m为1至30的整数；Z表示点击官能团。，下面是具有点击官能团的ε-聚-L-赖氨酸衍生物、其制法以及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有通式(1)所示的结构的化合物或其盐，
通式(1)
式中，n为2至100；
P表示用氨基取代的(C1-C5)亚烷基；
Q为下述通式(2)或下述通式(3)所示的结构，
上述通式(2)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y1和Y2可以相同或不同，表示碳原子数1至6的亚烷基、氧原子或亚氨基，m为1至30的整数；
上述通式(3)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y表示碳原子数1至6的亚烷基、氧原子或亚氨基，m为1至30的整数；
Z表示点击官能团。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其由通式(4)所示：
式中，n为2至100的整数；
m为1至30的整数；
X为氧原子或亚氨基；
Y表示碳原子数1至6的亚烷基；
Z表示点击官能团。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其盐，其中，点击官能团为叠氮基、烯基、炔基、腈基、硫醇基、马来酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、环硫乙烷基或三唑基。
4.一种根据权利要求1所述的化合物或其盐的制造方法，包括：
在通式(2a)或通式(3a)所示的化合物或其盐的存在下，培养ε-聚-L-赖氨酸、ε-聚-D-赖氨酸、ε-聚-L-β-赖氨酸、ε-聚-D-β-赖氨酸、δ-聚-L-鸟氨酸、δ-聚-D-鸟氨酸、δ-聚-L-β-鸟氨酸、δ-聚-D-β-鸟氨酸、γ-聚-L-二氨基丁酸、γ-聚-D-二氨基丁酸、β-聚-L-二氨基丙酸或β-聚-D-二氨基丙酸生产菌的工序，
上述通式(2a)中，X、Y1、Y2、Z和m与上述通式(1)中的含义相同，
上述通式(3a)中，X、Y、Z和m与上述通式(1)中的含义相同；以及
收集所产生的根据权利要求1所述的化合物或其盐的工序。
5.一种根据权利要求2所述的化合物或其盐的制造方法，包括：
在通式(3a)所示的化合物或其盐的存在下培养ε-PL生产菌的工序，
上述通式(3a)中，X表示氧原子或亚氨基，Y表示碳原子数1至6的亚烷基，Z表示点击官能团，m表示1至30的整数；以及
收集所产生的根据权利要求2所述的化合物或其盐的工序。
6.一种药理作用物质，其中，通过化学键导入有根据权利要求1所述的化合物或其药学上允许的盐。
7.一种药理作用物质，其中，通过化学键导入有下述通式(4)所示的化合物或其药学上允许的盐，
式中，n是2至100的整数，
m是1至30的整数，
X表示氧原子或亚氨基，
Y表示碳原子数1至6的亚烷基，
Z表示点击官能团。
8.根据权利要求6或7所述的物质，其中，药理作用物质至少是抗菌剂、抗菌抗生剂及抗癌剂的任一者。
9.根据权利要求8所述的物质，其中，抗菌剂是(A)抗真菌剂；抗菌抗生剂是(B)β内酰胺类抗生物质、(C)氨基糖苷系抗生物质、(D)四环素类抗生物质、或(E)肽类抗生物质、(F)能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗菌抗生物质；或抗癌剂是(G)能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗癌剂。
10.根据权利要求9所述的物质，其中，
(A)抗真菌剂是(a-1)选自两性霉素B、制霉菌素、曲霉素和匹马星中的多烯类抗生物质、(a-2)米卡芬净、(a-3)伊曲康唑、(a-4)酮康唑、(a-5)氟康唑、(a-6)咪康唑、或(a-7)氟胞嘧啶；
(B)β内酰胺类抗生物质是(b-1)青霉素、(b-2)氨苄西林、(b-3)塔兰西林、(b-4)巴基西林、(b-5)头孢菌素C、(b-6)头孢氨苄、(b-7)头孢拉定、(b-8)头霉素、或(b-9)亚胺培南；
(C)氨基糖苷系抗生物质是(c-1)庆大霉素、(c-2)卡那霉素、(c-3)妥布霉素、(c-4)阿米卡星、(c-5)阿贝卡星、或(c-6)核霉素；
(D)四环素类抗生物质是(d-1)氧四环素、或(d-2)四环素，
(E)肽类抗生物质是(e-1)杆菌肽、(e-2)短杆菌肽、(e-3)多粘菌素B、(e-4)万古霉素、或(e-5)替考拉宁；
(F)作为能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗菌抗生物质，具有氨基、亚氨基、羧基、羟基、羰基、硫醇基、磷酸基、醛基等中的任一者的抗菌抗生物质；或者(G)作为能够有机化学地或者生物化学地导入点击官能团的抗癌剂，是具有氨基、亚氨基、羧基、羟基、羰基、硫醇基、磷酸基、醛基等中的任一者的抗癌剂，例如为(f-1)放线菌素D，(f-2)丝裂霉素，(f-3)选自阿霉素、柔红霉素、以及阿克拉霉素中的蒽环霉素系抗肿瘤药，(f-4)博来霉素，或(f-5)顺铂。
11.根据权利要求6或7所述的物质，其中，药理作用物质至少是蛋白质和基因中的任一者。
12.根据权利要求11所述的物质，其中，蛋白质和基因能够有机化学或生物化学地导入点击官能团。
13.根据权利要求7所述的药理作用物质的制造方法，其特征在于，将根据权利要求7所述的通式(4)所示的化合物或其药学上允许的盐通过化学键导入药理作用物质。
14.根据权利要求7至10中任一项所述的物质，其为通式(5)所示的、通过点击化学被ε-PL修饰了的两性霉素B，
式中n是2至100的整数。
15.根据权利要求7至10中任一项所述的物质，其为通式(5-2)所示的、通过点击化学被ε-PL修饰了的阿霉素，
式中n是2至100的整数。
16.根据权利要求7至10中任一项所述的物质，其为通式(5-3)所示的、通过点击化学ε-PL修饰的单体Azami-Green荧光蛋白，
式中，n为2至100的整数，式(5-3)’
所示的基团是式(5-3)”
所示的单体Azami-Green荧光蛋白去除了一个氢原子而形成的基团。
17.一种通式(2a)或(3a)所示的化合物或其盐的、用于制造根据权利要求1所述的通式(1)所示的化合物或其盐的用途。
18.一种通式(3a)所示的化合物或其盐的、用于制造根据权利要求7所述的通式(4)所示的化合物或其盐的用途，
X表示氧原子或亚氨基，Y表示碳原子数1至6的亚烷基，Z表示点击官能团，m表示1至30的整数。
19.一种药理作用物质的生物膜通透性改善方法，其特征在于，将通式(1)所示的化合物或其盐导入药理作用物质。
20.一种通式(1)所示的化合物或其盐的、用于制造改善了生物膜通透性的药理作用物质的用途。
21.一种药理作用物质的水溶性提高方法，其特征在于，将通式(1)所示的化合物或其盐导入药理作用物质。
22.一种通式(1)所示的化合物或其盐的、用于制造提高了水溶性的药理作用物质的用途。

说明书全文

具有点击官能团的ε-聚-L-赖氨酸衍生物、其制法以及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及将羧基末端用点击官能团修饰了的ε-聚-L-赖氨酸衍生物、其制造方法以及一并改善药理作用物质的生物膜通透性和水溶性、产业用基材的聚阳离子修饰和抗菌涂层的用途或使用。

背景技术

[0002] ε-聚-L-赖氨酸(以下记为ε-PL)是作为蛋白质性氨基酸的L-赖氨酸连接成10～35个残基的直链状的氨基酸均聚物，其特征是L-赖氨酸的羧基和ε位的氨基通过异肽键连接的结构。ε-PL由包括放线菌在内的多种微生物生产，其肽链长度(L-赖氨酸的数量)根据生产菌而不同(非专利文献1～4)。关于ε-PL的最初的报告中，是从作为放线菌的白色链霉菌(Streptomyces albulus)No.346-D株的培养液鉴定的25～35个残基的ε-PL，之后，鉴定到比该ε-PL链长更短的ε-PL(短链长ε-PL)。但是，由36个残基以上的L-赖氨酸构成的ε-PL尚未在自然界发现。ε-PL的α氨基(-NH2)例如由于在生物体内的pH从中性到酸性的条件下被+质子化(-NH3)，因此ε-PL作为超水溶性的聚阳离子肽存在，与合成聚阳离子抗菌剂相同地对广范围的微生物种显示抗菌活性(非专利文献4)。通过白色链霉菌(Streptomyces albulus)No.346-D株生产并由25～35个残基构成的ε-PL由于具有广范围的抗菌活性和高安全性，因此，被用作食品防腐剂或食品保存料。另外，不仅仅在食品产业，在化学工业领域、医疗领域等中也被期待为安全性高、环境负荷少的可生物降解的天然抗菌剂。

[0003] 本发明者关注到聚阳离子性化合物显示抗菌活性，同时具有高极性且兼具高生物膜通透性，考虑了通过在药理作用物质上结合ε-PL(以下记为ε-PL修饰)，是否能够期待同时改善药理作用物质中的水溶性和生物膜通透性(非专利文献4)。另外，考虑到如果能够用ε-PL修饰塑料、金属、木材、纸、纤维等各种各样的医疗基材、工业用基材等(以下总称记为产业用基材)的表面，是否可能赋予由于聚阳离子性带来的抗菌活性、培养细胞粘合效果、防滴漏效果以及防静电功能等各种各样理想的功能。然而，到目前为止，关于药理作用物质的ε-PL修饰完全没有报告例。但是，关于产业用基材的ε-PL修饰，报告了利用ε-PL的聚阳离子性(正电荷)和产业用基材的表面负电荷的静电的相互作用的方法(专利文献1)。但是，该通过非共价键的化学修饰法的稳定性和耐久性极低，未确立实用的ε-PL修饰法。另外，仅能应用于带有表面负电荷的材料，不能称之为通用的修饰法。另外，ε-PL的聚阳离子性(正电荷)是用于发挥抗菌活性、培养细胞粘合效果、防滴漏效果和防静电功能等的重要的化学性质，利用了静电的相互作用的产业用基材的ε-PL修饰由于导致ε-PL的聚阳离子性降低，因此存在不能充分发挥所期待的功能的问题。本发明者开发了利用共价键而不利用静电的相互作用的ε-PL修饰法，同时发现了强力的作用效果。作为ε-PL的制造法，已知利用从自然界分离的白色链霉菌(Streptomyces albulus)No.346-D株(NBRC14147)的制造方法(专利文献2)。另外，作为白色链霉菌以外的菌种，已知利用了诺氏链霉菌(Streptomyces noursei)(专利文献3)、链霉菌sp.SP-72株(Streptomyces sp.SP-72)(专利文献4)的制造方法。另外，已知利用了链霉菌sp.SP-66株(Streptomyces sp.SP-66)(专利文献5)的短链长ε-PL的制造方法。为了完全不损害ε-PL的聚阳离子性，通过更稳定的共价键对药理作用物质和产业用基材进行化学修饰，需要利用ε-PL中仅存的一个羧基的有机合成化学。但是，需要用保护基保护ε-PL的全部的α氨基(-NH2)的高度的有机合成化学的技术，其成功例未曾有报道。点击化学(Click Chemistry)是利用了不使用保护基的反应特异性高的官能团(以下记作点击官能团)的有机合成技术，是不光在化学工业领域，而且在其他领域也利用着的化学技术。虽然考虑如果能够在ε-PL的羧基上导入点击官能团，则能够极其容易地进行药理作用物质和产业用基材的ε-PL修饰，但是即使在向ε-PL的羧基导入点击官能团的情况下，需要用保护基来保护ε-PL的全部的α氨基(-NH2)的高度的有机合成化学的技术，尚未报道其成功例。另外，也尚不知道通过ε-PL生产微生物导入了点击官能团的ε-PL衍生物的生产。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1：日本专利3111216号

[0007] 专利文献2：日本特公昭59-20359号公报

[0008] 专利文献3：日本特开平1-187090号公报

[0009] 专利文献4：日本特开2000-69988号公报

[0010] 专利文献5：日本特开2001-017159号公报

[0011] 非专利文献

[0012] 非专利文献1：Shima S,Sakai H.1977.Polylysine produced by Streptomyces.[0013] 1977.

[0014] 非专利文献2：Oppermann-Sanio FB，Steinbuechel A.2002.Occurrence,functions and biosynthesis of polyamides in microorganisms and biotechnological production.2002.

[0015] 非专利文献3：Takehara M,Hirohara H.2010.Amino-acid homopolymers occurring in nature,p.1-22.In Hamano Y(ed.),Microbiology Monographs,vol.15.Springer,NewYork.

[0016] 非专利文献4：Hamano Y.2010.Amino-acid homopolymers occurring in nature:Biochemistry and enzymology of poly-epsilon-L-lysine,p23-44.In Hamano(ed),Microbiology Monographs,vol.15.Springer,New York.

发明内容

[0017] 发明要解决的问题

[0018] 本发明的目的是提供具有通式(1)所示的结构的化合物或者其化学或药学上允许的盐以及这些化合物或其化学或药学上允许的盐的制造方法(以下将化学上允许的盐和药学上允许的盐统一简称为盐)。

[0019]

[0020] (式中，n为2至100；

[0021] P表示用氨基取代的(C1-C5)亚烷基；

[0022] Q为下述通式(2)或下述通式(3)所示的结构，

[0023]

[0024] (上述通式(2)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y1和Y2可以相同或不同，表示碳原子数1至6的亚烷基，m为1至30的整数。)

[0025]

[0026] (上述通式(3)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y表示碳原子数1至6的亚烷基，m为1至30的整数。)

[0027] Z表示点击官能团。)

[0028] 本发明的另一目的在于提供具有通式(4)所示的结构的ε-聚-L-赖氨酸(ε-PL)衍生物或者其化学或药学上允许的盐、以及这些化合物或其化学上或药学上允许的盐的制造方法(以下将化学上允许的盐和药学上允许的盐统一简称为盐)。

[0029]

[0030] (式中，n为2至100的整数；

[0031] m为1至30的整数；

[0032] X为氧原子或亚氨基；

[0033] Y表示碳原子数1至6的亚烷基；

[0034] Z表示点击官能团。)

[0035] 本发明的另一目的在于提供例如不仅仅是向抗菌或抗癌性物质等低分子化合物及中分子化合物，而且向作为蛋白质(含酶)等的高分子化合物的药理作用物质通过共价键导入了上述化合物(含ε-PL衍生物)的、一并改善了生物膜通透性和水溶性的药理作用物质、以及其制造方法。另外，本发明的另一目的在于提供用于药理作用物质的生物膜通透性改善的上述化合物(含ε-PL衍生物)的使用。

[0036] 另外，通过在产业用基材的表面通过共价键使用上述化合物(含ε-PL衍生物)，从而向各种产业用基材导入上述化合物，将聚阳离子性所带来的抗菌活性、培养细胞粘合效果、防滴漏效果以及防静电功能等各种各样的功能赋予产业用基材。

[0037] 用于解决问题的手段

[0038] 本发明为了解决上述问题，包含以下的各发明。

[0039] [1]具有通式(1)所示的结构的化合物或其盐，

[0040]

[0041] 式中，n为2至100；

[0042] P表示用氨基取代的(C1-C5)亚烷基；

[0043] Q为下述通式(2)或下述通式(3)所示的结构，

[0044]

[0045] 上述通式(2)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y1和Y2可以相同或不同，表示碳原子数1至6的亚烷基、氧原子或亚氨基，m为1至30的整数；

[0046]

[0047] 上述通式(3)中，X表示氧原子、亚氨基、硫原子、NHCO或CONH，Y表示碳原子数1至6的亚烷基、氧原子或亚氨基，m为1至30的整数；

[0048] Z表示点击官能团。

[0049] [2]根据上述[1]所述的化合物或其盐，其由通式(4)所示：

[0050]

[0051] 式中，n为2至100的整数；

[0052] m为1至30的整数；

[0053] X为氧原子或亚氨基；

[0054] Y表示碳原子数1至6的亚烷基；

[0055] Z表示点击官能团。

[0056] [3]根据上述[1]或[2]所述的化合物或其盐，其中，点击官能团为叠氮基、烯基、炔基、腈基、硫醇基、马来酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、环硫乙烷基或三唑基。

[0057] [4]一种根据上述[1]所述的化合物或其盐的制造方法，包括：

[0058] 在通式(2a)或通式(3a)所示的化合物或其盐的存在下，培养ε-聚-L-赖氨酸、ε-聚-D-赖氨酸、ε-聚-L-β-赖氨酸、ε-聚-D-β-赖氨酸、δ-聚-L-鸟氨酸、δ-聚-D-鸟氨酸、δ-聚-L-β-鸟氨酸、δ-聚-D-β-鸟氨酸、γ-聚-L-二氨基丁酸、γ-聚-D-二氨基丁酸、β-聚-L-二氨基丙酸或β-聚-D-二氨基丙酸生产菌的工序；以及

[0059] 收集所产生的上述[1]所述的化合物或其盐的工序，

[0060] 通式(2a)为

[0061]

[0062] 上述通式(2a)中，X、Y1、Y2、Z和m与上述通式(1)中的含义相同；

[0063] 通式(3a)为

[0064]

[0065] 上述通式(3a)中，X、Y、Z和m与上述通式(1)中的含义相同。

[0066] [5]根据上述[2]所述的化合物或其盐的制造方法，包括：

[0067] 在通式(3a)所示的化合物或其盐的存在下培养ε-PL生产菌的工序、以及收集所产生的上述[2]所述的化合物或其盐的工序，

[0068] 通式(3a)为

[0069]

[0070] 上述通式(3a)中，X表示氧原子或亚氨基，Y表示碳原子数1至6的亚烷基，Z表示点击官能团，m表示1至30的整数。

[0071] [6]一种药理作用物质，其中，通过化学键导入有上述[1]所述的化合物或其药学上允许的盐。

[0072] [7]一种药理作用物质，其中，通过化学键导入有通式(4)所示的化合物或其药学上允许的盐，

[0073]

[0074] 式中，n是2至100的整数，

[0075] m是1至30的整数，

[0076] X表示氧原子或亚氨基，

[0077] Y表示碳原子数1至6的亚烷基，

[0078] Z表示点击官能团。

[0079] [8]根据上述[6]或[7]所述的物质，其中，药理作用物质至少是抗菌剂、抗菌抗生剂及抗癌剂中的任一者。

[0080] [9]根据上述[8]所述的物质，其中，

[0081] 抗菌剂是(A)抗真菌剂；

[0082] 抗菌抗生剂是(B)β内酰胺类抗生物质、(C)氨基糖苷系抗生物质、(D)四环素类抗生物质、或(E)肽类抗生物质、(F)能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗菌抗生物质；或

[0083] 抗癌剂是(G)能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗癌剂。

[0084] [10]上述[9]所述的物质，其中，

[0085] (A)抗真菌剂是(a-1)选自两性霉素B(以下记为AmpB)、制霉菌素、曲霉素和匹马星中的多烯类抗生物质、(a-2)米卡芬净、(a-3)伊曲康唑、(a-4)酮康唑、(a-5)氟康唑、(a-6)咪康唑、或(a-7)氟胞嘧啶；

[0086] (B)β内酰胺类抗生物质是(b-1)青霉素、(b-2)氨苄西林、(b-3)塔兰西林、(b-4)巴基西林、(b-5)头孢菌素C、(b-6)头孢氨苄、(b-7)头孢拉定、(b-8)头霉素、或(b-9)亚胺培南；

[0087] (C)氨基糖苷系抗生物质是(c-1)庆大霉素、(c-2)卡那霉素、(c-3)妥布霉素、(c-4)阿米卡星、(c-5)阿贝卡星、或(c-6)核霉素；

[0088] (D)四环素类抗生物质是(d-1)氧四环素、或(d-2)四环素，

[0089] (E)肽类抗生物质是(e-1)杆菌肽，(e-2)短杆菌肽，(e-3)多粘菌素B、(e-4)万古霉素、或(e-5)替考拉宁；

[0090] (F)作为能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团的抗菌抗生物质，是具有氨基、亚氨基、羧基、羟基、羰基、硫醇基、磷酸基、醛基等中的任一者的抗菌抗生物质；或者[0091] (G)作为能够有机化学地或者生物化学地导入点击官能团的抗癌剂，是具有氨基、亚氨基、羧基、羟基、羰基、硫醇基、磷酸基、醛基等中的任一者的抗癌剂，例如为(f-1)放线菌素D，(f-2)丝裂霉素，(f-3)选自阿霉素(以下记为Dox)、柔红霉素、以及阿克拉霉素中的蒽环霉素系抗肿瘤药，(f-4)博来霉素，或(f-5)顺铂。

[0092] [11]根据上述[6]或[7]所述的物质，其中，药理作用物质至少是例如酶或抗体等蛋白质和基因中的任一者。

[0093] [12]根据上述[11]所述的物质，其中，蛋白质和基因能够有机化学地或生物化学地导入点击官能团。

[0094] [13]根据上述[7]所述的药理作用物质的制造方法，其特征在于，将上述[7]所述的通式(4)所述的化合物或其药学上允许的盐通过化学键导入药理作用物质。

[0095] [14]根据上述[7]至[10]中任一项所述的物质，其为通式(5)所示的、通过点击化学被ε-PL修饰了的AmpB(以下记为ε-PL-DBCO-AmpB)，

[0096]

[0097] 式中n是2至100的整数。

[0098] [15]根据上述[7]至[10]中任一项所述的物质，其为通式(5-2)所示的、通过点击化学被ε-PL修饰了的Dox(以下记为ε-PL-DBCO-Dox)，

[0099]

[0100] 式中n是2至100的整数。

[0101] [16]根据上述[7]至[10]中任一项所述的物质，其为通式(5-3)所示的、通过点击化学被ε-PL修饰了的mAG(以下记为ε-PL-DBCO-mAG)，

[0102]

[0103] 式中，n为2至100的整数，式(5-3)’

[0104]

[0105] 所示的基团是式(5-3)”

[0106]

[0107] 所示的单体Azami-Green(以下记为mAG)荧光蛋白去除了一个氢原子而形成的基团。

[0108] [17]通式(2a)或(3a)所示的化合物或其盐的用于制造上述[1]所述的通式(1)所示的化合物或其盐的用途。

[0109] [18]通式(3a)所示的化合物或其盐的用于制造上述[7]所述的通式(4)所示的化合物或其盐的用途，

[0110] 通式(3a)：

[0111]

[0112] X表示氧原子或亚氨基，Y表示碳原子数1至6的亚烷基，Z表示点击官能团，m表示1至30的整数。

[0113] [19]一种药理作用物质的生物膜通透性改善方法，其特征在于，将通式(1)所示的化合物或其盐导入药理作用物质；或者一种通式(1)所示的化合物或其盐的用于制造改善了生物膜通透性的药理作用物质的用途。

[0114] [20]一种药理作用物质的生物膜通透性改善方法，其特征在于，将上述[7]所述的通式(4)所示的化合物或其盐导入药理作用物质；或者一种通式(4)所示的化合物或其盐的用于制造改善了生物膜通透性的药理作用物质的用途。

[0115] [21]一种药理作用物质的水溶性提高方法，其特征在于，将通式(1)所示的化合物或其盐导入药理作用物质。

[0116] [22]一种通式(1)所示的化合物或其盐的、用于制造提高了水溶性的药理作用物质的用途。

[0117] [23]一种药理作用物质的水溶性提高方法，其特征在于，将上述[7]所述的通式(4)所示的化合物或其盐导入药理作用物质；或者一种通式(4)所示的化合物的、用于制造提高了水溶性的药理作用物质的用途。

[0118] 发明的效果

[0119] 病原菌或癌细胞中的药物排泄功能的亢进与对治疗药物的耐药性相关联。如果能够改善药物等药理作用物质的生物膜通透性，则不仅能够避开该耐药机制，而且可重新利用由于耐药性而不能利用的药理作用物质，以及可增强生理活性。膜通透性改善的一般的对策是将药理作用物质疏水化。但是，另一方面产生的水溶性的降低会产生出现不预期的副作用和制剂制备变复杂等新的问题。因此，本发明者考虑，如果能够开发同时改善生物膜通透性和水溶性的功能性低分子的化学修饰技术，则能够进一步加速现代社会要求的药物开发速度。

[0120] 蛋白质(包括酶)那样的高分子化合物通常不透过细胞膜。该性质在维持细胞动态平衡中是重要的，另一方面，可以说难以以功能分析、控制或医疗目的，将这些分子从细胞外直接导入内部。目前使用了微注射、电穿孔等瞬间破坏细胞膜而导入的方法、使用脂质体导入的方法等。但是，由于导入效率、对细胞的损伤大，因此，不一定能获得满意结果。另一方面，有关注到碱性(聚阳离子性)肽优异的细胞膜通透性，尝试用聚阳离子性肽修饰蛋白质(含酶)，直接导入细胞内的方法(非专利文献、S.R.，Schwarze等人，Science，285，1569，1999)。实际上，也报道了很多作为与聚阳离子性肽的化学交联体或融合蛋白质制备聚阳离子修饰了的蛋白质，仅增加到细胞培养液能控制细胞功能的例子，被认识为细胞生物化学方法之一，并且作为生物医药品(抗体医药等)的新的传递方法法也受到关注。本发明者，作为能够解决这些问题的化合物，想到包括ε-PL的聚阳离子体，ε-PL同时具有高极性和超水溶性且高生物膜通透性的聚阳离子性天然化合物。细菌的细胞膜表层上露出有酸性磷脂质，动物细胞表面大量存在含有很多硫酸基或羧基的糖链，因此其表层带有负电。本发明者想到含有正电荷的ε-PL的聚阳离子体、被吸引到该负电荷表层，容易透过细胞膜，移动到细胞内。即，本公开中，聚阳离子体是指，例如，具有聚阳离子性的化合物。聚阳离子体例如在聚赖氨酸的赖氨酸基的氨基上，在例如生物体内通过添加H+而生成。

[0121] 另外，例如，γ-聚-L-二氨基丁酸、γ-聚-D-二氨基丁酸、β-聚-L-二氨基丙酸等ε-PL以外的天然聚阳离子类似物等中也可以获得同样的效果。

[0122] 本发明者发现，包括通式(1)所示的ε-PL衍生物的上述[1]所述的化合物，通过点击化学容易经由稳定的共价键结合到各种各样的药理作用物质。通常、水溶性高的化合物的生物膜通透性低，共价键导入了包括ε-PL的聚阳离子体的药理作用物质，虽然包括ε-PL的聚阳离子体水溶性非常高，但是由于其聚阳离子性生物膜通透性也非常高。如此，本发明的重要特征之一在于，简便的包括ε-PL的聚阳离子体修饰法所需的化合物的简便且有效的新的制造方法，其中包括ε-PL的聚阳离子体修饰法一并改善药理作用物质的生物膜通透性和水溶性。

[0123] 另外，蛋白质(包括酶)那样的高分子化合物中，可能通过点击化学聚阳离子化，赋予生物膜通透性。通过本公开，能够提供用于将高分子化合物直接传送到细胞内的新的制造方法。另外，点击化学以往已经充分确立，本发明中可以照此操作。

[0124] 本发明中，通过用导入了上述通式(1)所示的化合物(本说明书中，包括通式(4)所示的化合物)或其盐的药理作用物质进行处理，能够将各种各样的产业基材(例如、塑料制品制、纤维制等的医疗机械材料、功能性材料等)等聚阳离子化(包括ε-PL修饰)，能够该产业机械材料等予赋优异的抗菌活性、培养细胞粘合效果、浸水处理、防滴漏效果、防静电功能。附图说明

[0125] 图1A示出通过ESI-TOF-MS/HPLC分析对Streptomyces albulus NBRC14147的培养上清液色谱分析的结果。上图示出无添加培养液的分析结果，中图示出添加了ε-PL-PEG-叠氮化物的培养液的分析结果，下图示出添加了ε-PL-PEG-炔烃的培养液的分析结果。

[0126] 图1B示出ε-PL(上图)、ε-PL-PEG-叠氮化物(中图)和ε-PL-PEG-炔烃(下图)的ESI-TOF-MS的结果。

[0127] 图2A示出由ε-PL生产菌Streptomyces albulus NBRC14147生产的17～26mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物的由1H-NMR的结构确定的结果。

[0128] 图2B示出由ε-PL生产菌Streptomyces albulus NBRC14147生产的ε-PL-PEG-炔烃的1H-NMR结构确定的结果。

[0129] 图3A示出通过点击化学合成了ε-PL-DBCO-FAM的反应溶液的ESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱的结果。

[0130] 图3B示出合成的ε-PL-DBCO-FAM的ESI-TOF-MS的结果。

[0131] 图4示出使用了式(12)所示的DBCO-PEG4-5/6-FAM和通式(13)所示的ε-PL-DBCO-FAM中使用HeLa细胞进行的生物膜通透性试验的结果。

[0132] 图5示出针对通式(13)所示的ε-PL-DBCO-FAM中的使用HeLa细胞进行生物膜通透性评价，用共聚焦激光显微镜观察的结果。生物膜和核分别用Alexa594WGA(小麦胚芽凝集素)和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。

[0133] 图6A示出通过点击化学合成了ε-PL-DBCO-AmpB的反应溶液的ESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱的结果。

[0134] 图6B示出合成的ε-PL-DBCO-AmpB的ESI-TOF-MS的结果。

[0135] 图7示出ε-PL-DBCO-AmpB的水溶性。

[0136] 图8A示出通过点击化学合成了ε-PL-DBCO-Doc的反应溶液的ESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱的结果。

[0137] 图8B示出合成的ε-PL-DBCO-DocのESI-TOF-MS的结果。

[0138] 图9A示出通式(5-3)”所示的mAG的ESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱(左)、ESI-TOF-MS的质谱(中)、所得的质谱的去卷积(右)的结果。

[0139] 图9B示出DBCO-mAG的ESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱(左)、ESI-TOF-MS的质谱(中)、所得的质谱的去卷积(右)的结果。

[0140] 图9C示出通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAGのESI-TOF-MS/HPLC分析的色谱(左)、ESI-TOF-MS的质谱(中)、所得的质谱的去卷积(右)的结果。

[0141] 图10示出通式(5-3)”所示的mAG和通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG中的使用了HeLa细胞的生物膜通透性试验的结果。

[0142] 图11示出针对通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG中的使用了HeLa细胞的生物膜通透性评价，用共聚焦激光显微镜观察的结果。将生物膜用Alexa594WGA(小麦胚芽凝集素)染色。

[0143] 图12A示出针对通式(15)所示的ε-PL-炔烃的酯键的化学的稳定性进行了验证的结果。将ε-PL-炔烃以1mM的浓度溶解在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，60℃下加热5分钟后，用ESI-TOF-MS/HPLC分析。#表示ε-PL-炔烃的信号，*表示ε-PL-炔烃的酯键被水解而产生的ε-PL的信号。

[0144] 图12B示出针对通式(11)所示的ε-PL-PEG-炔烃的酯键的化学的稳定性进行验证的结果。将ε-PL-PEG-炔烃以1mM的浓度溶解在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，60℃加热5分钟后，用ESI-TOF-MS/HPLC分析。+表示ε-PL-PEG-炔烃的信号，*表示ε-PL-PEG-炔烃的酯键被水解而产生的ε-PL的信号。

具体实施方式

[0145] 本发明中，通式(1)所示的化合物中的P是被1或2个以上的氨基取代的(C1-C5)亚烷基。(C1-C5)亚烷基可以是直链状，也可以是分支的，优选为直链状。通式(1)所示的化合物中的P优选是被1个氨基取代的(C1-C5)亚烷基，具体而言，可以例示CH2CH2CH2CH2C*H(NH2)、CH2CH2CH2C*H(NH2)CH2、CH2CH2C*H(NH2)CH2CH2、CH2C*H(NH2)CH2CH2CH2、C*H(NH2)CH2CH2CH2CH2、* * * * *CH2CH2CH2CH(NH2)、CH2CH2C H(NH2)CH2、CH2CH(NH2)CH2CH2、CH(NH2)CH2CH2CH2、CH2CH2C H(NH2)、CH2C*H(NH2)CH2、C*H(NH2)CH2CH2、CH2C*H(NH2)或C*H(NH2)CH2等。这里，*表示不对称碳，可以是R型，也可以是S型。本发明中，关于通式(1)所示的化合物，X所示的亚氨基用―NR―表示，作为R，可以举出H或适当的取代基，例如甲基、乙基等碳原子数1至6的低级烷基，例如苯基等芳基，例如，可以举出呋喃基、吡啶基、噻吩基等含有杂原子1至3个的杂环基等。其中，R优选5至6元杂环基。

[0146] 作为Y、Y1或Y2所示的碳原子数1至6的亚烷基，例如可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚戊基、亚己基等。其中，Y优选碳原子数2至6的亚烷基。该亚烷基可以被通常的取代基取代，作为这样的取代基，可例示卤素原子(例如溴原子、氯原子、氟原子等)、羟基、氨基、巯基、羧基、磺基等。亚烷基中例如可以含有―O―、―S―、―S―S―、甲硅烷基等插入基团。作为本发明中的点击官能团，例如可举出叠氮基(―N3)、烯基(例如，―CH＝CH2、―CH＝CH―CH3)、炔基(例如，―C≡CH、―C≡C―CH3)、腈基、硫醇基、马来酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、环硫乙烷基、三唑基等。

[0147] 通式(1)、(4)、(5)、(5-2)和(5-3)以及后述的通式(6)、(7)、(10)、(11)、(13)和(15)的每个中，n可以是2至100中的任一者，优选是10至40左右，更优选9至30左右。n根据培养的菌的种类、菌的培养条件(例如，pH、温度、时间等)而不同，因此不能一概而论，但通常优选n为2至35的化合物、25至35的化合物、9至18的化合物、或17至26的化合物。

[0148] 通式(1)或(4)中，m可以是1至30的任一者，优选2至20左右。通过m是2以上，由此导入了通式(1)所示的化合物或其盐的药理作用物质的生物膜通透性改善效果或水溶性提高效果可以进一步提高，并且可以具有化学上的高稳定性。

[0149] 通式(1)所示的化合物(其中，Q表示通式(2)所示的结构的情况)的具体例如以下所示。

[0150] [表1]

[0151] 化合物编号 X Y1 Y2 Z m n1 O CH2 O N3 4 30
2 O CH2CH2 NH N3 12 10
3 O CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 20
4 O CH2CH2CH2CH2 O N3 4 40
5 O CH2CH2CH2CH2CH2 NH N3 4 50
6 O CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 N3 2 60
7 NH CH2 O N3 30 70
8 NH CH2CH2 NH N3 10 80
9 NH CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 90
10 NH CH2CH2CH2CH2 O N3 4 100
11 NH CH2CH2CH2CH2CH2 NH N3 4 2
12 NH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 25
13 NCH3 CH2 O N3 20 30
14 NCH3 CH2CH2 NH N3 8 35
15 NCH3 CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 25
16 NCH3 CH2CH2CH2CH2 O N3 4 30
17 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 NH N3 4 35
18 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 25
19 NHCO CH2 O N3 16 30
20 NHCO CH2CH2 NH CH＝CH2 6 35
21 NHCO CH2CH2CH2 NCH3 CH＝CHCH3 4 25
22 NHCO CH2CH2CH2CH2 O C≡CH 4 30
23 NHCO CH2CH2CH2CH2CH2 NH C≡CCH3 4 35
24 NHCO CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 腈基 4 25
25 CONH CH2 O 硫醇基 14 30
26 CONH CH2CH2 NH 马来酰亚胺基 4 35
27 CONH CH2CH2CH2 NCH3 环氧基 4 25
28 CONH CH2CH2CH2CH2 O 氮丙啶基 4 30
29 CONH CH2CH2CH2CH2CH2 NH 环硫乙烷基 4 35
30 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 三唑基 4 30

[0152] 上述表1中，P表示CH2CH2CH2CH2C*H(NH2)(这里不对称碳是R型)。

[0153] [表2]

[0154] 化合物编号 X Y1 Y2 Z m n31 O CH2 O N3 4 30
32 NH CH2CH2 NH N3 10 80
33 NH CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 90
34 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 O N3 4 25
35 NHCO CH2 NH N3 16 30
36 O CH2CH2 NCH3 CH＝CH2 6 35
37 O CH2CH2CH2 O CH＝CHCH3 4 25
38 O CH2CH2CH2CH2CH2 NH C≡CH 4 30
39 O CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 C≡CCH3 4 35
40 O CH2 O 腈基 4 25
41 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 NH 硫醇基 14 30
42 NCH3 CH2CH2 NCH3 马来酰亚胺基 4 35
43 CONH CH2CH2CH2 O 环氧基 4 25
44 CONH CH2CH2CH2CH2 NH 氮丙啶基 4 30
45 CONH CH2 NCH3 环硫乙烷基 4 35
46 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 O 三唑基 4 30
47 O CH2 NH N3 4 30
48 NH CH2CH2 NCH3 N3 10 80
49 NH CH2CH2CH2 O N3 4 90
50 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NH N3 4 25
51 NHCO CH2 NCH3 N3 16 30
52 O CH2CH2 O CH＝CH2 6 35
53 O CH2CH2CH2 NH CH＝CHCH3 4 25
54 O CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 C≡CH 4 30
55 O CH2CH2CH2CH2CH2 O C≡CCH3 4 35
56 O CH2 NH 腈基 4 25
57 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 硫醇基 14 30
58 NCH3 CH2CH2 O 马来酰亚胺基 4 35
59 CONH CH2CH2CH2 NH 环氧基 4 25
60 CONH CH2CH2CH2CH2 NCH3 氮丙啶基 4 30

[0155] 上述表2中，化合物编号31～45中的P表示CH2CH2CH2C*H(NH2)CH2(这里，不对称碳是S型)，化合物编号46～60中的P表示CH2CH2CH2C*H(NH2)(这里，不对称碳是R型)。

[0156] [表3]

[0157] 化合物编号 X Y1 Y2 Z m n61 O CH2 O N3 4 30
62 NH CH2CH2 NH N3 10 80
63 NH CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 90
64 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 O N3 4 25
65 NHCO CH2 NH N3 16 30
66 O CH2CH2 NCH3 CH＝CH2 6 35
67 O CH2CH2CH2 O CH＝CHCH3 4 25
68 O CH2CH2CH2CH2CH2 NH C≡CH 4 30
69 O CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 C≡CCH3 4 35
70 O CH2 O 腈基 4 25
71 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 NH 硫醇基 14 30
72 NCH3 CH2CH2 NCH3 马来酰亚胺基 4 35
73 CONH CH2CH2CH2 O 环氧基 4 25
74 CONH CH2CH2CH2CH2 NH 氮丙啶基 4 30
75 O CH2 NCH3 N3 4 30
76 NH CH2CH2 O N3 10 80
77 NH CH2CH2CH2 NH N3 4 90
78 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 N3 4 25
79 NHCO CH2 O N3 16 30
80 O CH2CH2 NH CH＝CH2 6 35
81 O CH2CH2CH2 NCH3 CH＝CHCH3 4 25
82 O CH2CH2CH2CH2CH2 O C≡CH 4 30
83 O CH2CH2CH2CH2CH2 NH C≡CCH3 4 35
84 O CH2 NCH3 腈基 4 25
85 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 O 硫醇基 14 30
86 NCH3 CH2CH2 NH 马来酰亚胺基 4 35
87 CONH CH2CH2CH2 NCH3 环氧基 4 25
88 CONH CH2CH2CH2CH2 O 氮丙啶基 4 30
89 CONH CH2 NH 环硫乙烷基 4 35
90 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 NCH3 三唑基 4 30

[0158] 上述表3中，化合物编号61～70中的P表示CH2CH2C*H(NH2)CH2(这里，不对称碳是S型)，化合物编号71～80中的P表示CH2CH2C*H(NH2)(这里，不对称碳是R型)，化合物编号81～*90中的P表示CH2CH(NH2)(这里，不对称碳是S型)。通式(1)所示的化合物(其中，Q表示通式(3)所示的结构的情况)的具体例如以下所示。

[0159] [表4]

[0160] 化合物编号 X Y Z m n91 O CH2 N3 4 30
92 O CH2CH2 N3 12 10
93 O CH2CH2CH2 N3 4 20
94 O CH2CH2CH2CH2 N3 4 40
95 O CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 50
96 O CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 2 60
97 NH CH2 N3 30 70
98 NH CH2CH2 N3 10 80
99 NH CH2CH2CH2 N3 4 90
100 NH CH2CH2CH2CH2 N3 4 100
101 NH CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 2
102 NH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
103 NCH3 CH2 N3 20 30
104 NCH3 CH2CH2 N3 8 35
105 NCH3 CH2CH2CH2 N3 4 25
106 NCH3 CH2CH2CH2CH2 N3 4 30
107 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 35
108 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
109 NHCO CH2 N3 16 30
110 NHCO CH2CH2 CH＝CH2 6 35
111 NHCO CH2CH2CH2 CH＝CHCH3 4 25
112 NHCO CH2CH2CH2CH2 C≡CH 4 30
113 NHCO CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CCH3 4 35
114 NHCO CH2CH2CH2CH2CH2CH2 腈基 4 25
115 CONH CH2 硫醇基 14 30
116 CONH CH2CH2 马来酰亚胺基 4 35
117 CONH CH2CH2CH2 环氧基 4 25
118 CONH CH2CH2CH2CH2 氮丙啶基 4 30
119 CONH CH2CH2CH2CH2CH2 环硫乙烷基 4 35
120 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 三唑基 4 30

[0161] 在上述表4中，P表示CH2CH2CH2CH2C*H(NH2)(这里，不对称碳是S型)。

[0162] [表5]

[0163] 化合物编号 X Y Z m n121 O CH2 N3 4 30
122 NH CH2CH2 N3 10 80
123 NH CH2CH2CH2 N3 4 90
124 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
125 NHCO CH2 N3 16 30
126 O CH2CH2 CH＝CH2 6 35
127 O CH2CH2CH2 CH＝CHCH3 4 25
128 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CH 4 30
129 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CCH3 4 35
130 O CH2 腈基 4 25
131 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 硫醇基 14 30
132 NCH3 CH2CH2 马来酰亚胺基 4 35
133 CONH CH2CH2CH2 环氧基 4 25
134 CONH CH2CH2CH2CH2 氮丙啶基 4 30
135 CONH CH2 环硫乙烷基 4 35
136 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 三唑基 4 30
137 O CH2 N3 4 30
138 NH CH2CH2 N3 10 80
139 NH CH2CH2CH2 N3 4 90
140 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
141 NHCO CH2 N3 16 30
142 O CH2CH2 CH＝CH2 6 35
143 O CH2CH2CH2 CH＝CHCH3 4 25
144 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CH 4 30
145 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CCH3 4 35
146 O CH2 腈基 4 25
147 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 硫醇基 14 30
148 NCH3 CH2CH2 马来酰亚胺基 4 35
149 CONH CH2CH2CH2 环氧基 4 25
150 CONH CH2CH2CH2CH2 氮丙啶基 4 30

[0164] 上述表5中，化合物编号121～135中的P表示CH2CH2CH2C*H(NH2)CH2(这里，不对称碳是R型)，化合物编号136～150中的P表示CH2CH2CH2C*H(NH2)(这里，不对称碳是S型)。

[0165] [表6]

[0166] 化合物编号 X Y Z m n151 O CH2 N3 4 30
152 NH CH2CH2 N3 10 80
153 NH CH2CH2CH2 N3 4 90
154 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
155 NHCO CH2 N3 16 30
156 O CH2CH2 CH＝CH2 6 35
157 O CH2CH2CH2 CH＝CHCH3 4 25
158 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CH 4 30
159 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CCH3 4 35
160 O CH2 腈基 4 25
161 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 硫醇基 14 30
162 NCH3 CH2CH2 马来酰亚胺基 4 35
163 CONH CH2CH2CH2 环氧基 4 25
164 CONH CH2CH2CH2CH2 氮丙啶基 4 30
165 O CH2 N3 4 30
166 NH CH2CH2 N3 10 80
167 NH CH2CH2CH2 N3 4 90
168 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 N3 4 25
169 NHCO CH2 N3 16 30
170 O CH2CH2 CH＝CH2 6 35
171 O CH2CH2CH2 CH＝CHCH3 4 25
172 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CH 4 30
173 O CH2CH2CH2CH2CH2 C≡CCH3 4 35
174 O CH2 腈基 4 25
175 NCH3 CH2CH2CH2CH2CH2 硫醇基 14 30
176 NCH3 CH2CH2 马来酰亚胺基 4 35
177 CONH CH2CH2CH2 环氧基 4 25
178 CONH CH2CH2CH2CH2 氮丙啶基 4 30
179 CONH CH2 环硫乙烷基 4 35
180 CONH CH2CH2CH2CH2CH2CH2 三唑基 4 30

[0167] 上述表6中，化合物编号151～160中的P表示CH2CH2C*H(NH2)CH2(这里，不对称碳是R*型)，化合物编号161～170中的P表示CH2CH2C H(NH2)(这里，不对称碳是S型)，化合物编号
171～180中的P表示CH2C*H(NH2)(这里，不对称碳是R型)。作为通式(1)或(4)的药理学上可允许的盐，例如，例示出与盐酸、硫酸、磷酸等无机酸的盐，例如，与草酸、马来酸、琥珀酸、醋酸等有机酸的盐，例如与钠、钾等无机碱的盐，例如二甲胺、三乙胺等有机碱的盐。

[0168] 通式(1)所示的化合物或其盐能够通过对通式(6)

[0169]

[0170] (式中、P+表示被1或2以上的(优选1个)N+H3取代的(C1-C5)亚烷基，n与前述含义相同)所示的化合物、通式HQZ(式中，Q和Z与前述含义相同)所示的化合物或其盐施加缩合反应而制造。

[0171] 另外，通式(4)所示的化合物或其盐能够通过对通式(7)

[0172]

[0173] (式中，n与前述含义相同。)

[0174] 所示的ε-PL和通式(3a)

[0175]

[0176] (式中，X、Y和m与前述含义相同。)

[0177] 所示的化合物或其盐施加缩合反应而制造。

[0178] 缩合反应前，与原料物质的反应相关的氨基可由保护基预先保护，缩合反应后除去，由此能够得到作为目标物的通式(1)所示的化合物或其盐。缩合反应的方法目前为止在该领域中已经充分确立，因此，本发明中可以照此进行。通过对目标物的合成反应液的浓缩、转溶、色谱等常规手段，能够获取通式(1)所示的化合物。这样的技术在肽合成的领域中已经充分确立，因此本发明也可照此进行。通式(6)所示的化合物(包括通式(7)所示的化合物ε-PL)可以是例如通过发酵法、化学合成等化学反应中任一种方法而得到的，也可以是从赖氨酸通过化学合成而得到的。例如，可以举出按如下方式获得的ε-PL：将日本专利第1245361号说明书中所述的Streptomyces Alblas Subspecies Lysinopolymeras在培养基中培养，例如在调整为葡萄糖5重量％、酵母提取物0.5重量％、硫酸铵1重量％、磷酸氢二钾
0.08重量％、磷酸二氢钾0.136重量％、七水硫酸镁0.05重量％、七水硫酸锌0.004重量％、七水硫酸铁0.03重量％、调整到pH6.8的培养基中培养，从所得的培养物分离、收集ε-聚赖氨酸。

[0179] 另外，包括通式(7)所示的化合物ε-PL的类似物的聚阳离子体可以由任何方法获得，也可以采用下述非专利文献所述的方法而获得。

[0180] 例如，γ-聚-L-二氨基丁酸例如可以通过参照论文(Takehara,M.,Saimura,M.,Inaba,H.&Hirohara,H.Poly(gamma-L-diaminobutanoic acid),a novel poly(amino acid),coproduced with poly(epsilon-L-lysine)by two strains of Streptomyces celluloflavus.FEMS Microbiol Lett 286,110-7(2008).)而制造。

[0181] 另外，γ-聚-D-二氨基丁酸例如可以通过参照论文(Ohkuma,H.,Tenmyo,O.,Konishi,M.,Oki,T.&Kawaguchi,H.BMY-28190,a novel antiviral antibiotic complex.J Antibiot(Tokyo)41,849-54(1988).)而制造。

[0182] 另外，β-聚-L-二氨基丙酸例如可以参照论文(Xia,J.,Xu,H.,Feng,X.,Xu,Z.&Chi,B.Poly(L-diaminopropionic acid),a novel non-proteinic amino acid oligomer co-produced with poly(epsilon-L-lysine)by Streptomyces albulus PD-1.Appl Microbiol Biotechnol 97,7597-605(2013).或Xu,Z.等人Systematic unravelling of the biosynthesis of poly(L-diaminopropionic acid)in Streptomyces albulus PD-1.Sci Rep 5,17400(2015).)而制造。

[0183] 本发明中使用的通式(7)所示的ε-PL等聚阳离子体也可以作为盐使用，作为这样的盐，可举出盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸等无机酸以及聚阳离子体所形成的聚阳离子体的无机酸盐，醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、马来酸、己二酸、葡萄糖酸以及乳酸等有机酸和聚阳离子体所形成的聚阳离子体的有机酸盐，己酸、月桂酸以及硬脂酸等中链及长链的饱和脂肪酸和聚阳离子体所形成的聚阳离子体的饱和脂肪酸盐，油酸、亚油酸以及花生四烯酸等中链和长链的不饱和脂肪酸和聚阳离子体所形成的聚阳离子体的不饱和脂肪酸盐等。

[0184] 由通式(2a)和(3a)所示的化合物是公知化合物，或者是与公知化合物类似的化合物。因此，通式(2a)和(3a)所示的化合物能够通过公知方法或本身公知的方法而容易制造。

[0185] 通式(1)或(4)所示的化合物能够通过下述的微生物培养方法而简便且高效地制造。

[0186] 作为本发明中使用的微生物，只要是具有生产ε-PL等聚阳离子体的能力的微生物则均可，优选北里孢菌(Kitasatospora)属细菌或链霉菌(Streptomyces)属细菌。

[0187] 作为北里孢菌属细菌，例如可举出Interenational Journal of Systematic Bacteriology、47卷、1048-1054页、1997年所述的细菌，但是其中优选Kitasatosporakifunense，更优选Kitasatospora KifunenseMN-1株(FERMP-19712)。

[0188] 作为链霉菌属，例如可举出Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus No.346-D株(IFO14147、日本特公昭59-20359号公报)、Streptomyces albras subspecies lysinopolymeras 11011A株(日本特公平3-42070公报)、Streptomyces albras subspecies lysinopolymeras B21021株(日本特开平09-173057号公报)、Streptomyces albras subspecies lysinopolymeras B15208株(日本特开平10-290688号公报)、Streptomyces Albras Subspecies SP-25株(日本特开2002-095467号公报)、链霉菌sp.SP-72株(日本特开2000-069988号公报)、链霉菌sp.SP-66株(日本特开2001-017159号公报)、Streptomyces herbali color SP-13株(日本特开2002-095466号公报)、
Streptomyces Ravendurae USE-53株(日本特开2003-052358号公报)、Streptomyces norsei(日本特开平1-187090号公报)等。其中，优选分类至白色链霉菌的微生物，更优选Streptomyces albras subspecies lysinopolymeras No.346-D株(与Streptomyces albulus NBRC14147株相同的株)。

[0189] 另外，本发明中使用的微生物可以是上述γ-聚-L-二氨基丁酸、γ-聚-D-二氨基丁酸、β-聚-L-二氨基丙酸等ε-PL的类似物的生产菌。

[0190] 这些培养微生物的培养基中，添加包括点击官能团的通式(2a)或(3a)所示的化合物。通式(2a)或(3a)所示的化合物只要是属于通式(2a)或(3a)所示的化合物的范围则可以是任何化合物，例如可以举出PEG-叠氮化物、PEG-炔烃(即，炔基PEG)等。向培养基中添加的通式(2a)或(3a)所示的化合物的浓度优选0.1％～1.0％(％为容量百分率)。另外，作为通式(2a)或(3a)所示的化合物以外的培养基成分，只要是适当含有碳源、氮源、无机物和其他营养物等的培养基则可以使用任何培养基。作为碳源，只要聚阳离子体生产株能同化则可以使用任何碳源，例如，可以举出葡萄糖、果糖、淀粉、甘油等。碳源的含量优选1.0％～10.0％，更优选1.0％～5.0％。作为氮源，例如可举出、蛋白胨、酪蛋白水解物、氨基酸、无机铵盐、硫酸铵等，其中优选硫酸铵。氮源的含量优选0.1％～5.0％，更优选0.1％～1.0％。碳源或氮源可以在培养中途依次添加。作为无机物，可举出磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、锌离子、鉄离子、镁离子、镍离子、硫酸离子等。为了使菌的生长良好，优选使培养基中含有酵母提取物。酵母提取物的含量优选0.05％～0.5％，更优选0.1％～0.5％。培养基的pH只要使能够培养微生物的pH即可，例如可举出pH3～pH8，其中微生物的生长中优选中性付近(pH6～8)，通式(1)所示的化合物的生产中更优选pH3～pH5。另外，本发明中，％除非特别说明，是w/v％。更详细地说，参照下述的实施例。

[0191] 培养优选振荡培养或搅拌培养等，在供给氧的有氧条件下进行。培养温度只要是聚阳离子体生产株能够生长则无特别限定，例如可举出25～35℃等。培养开始后，随着菌的增殖，培养液的pH降低，但是作为用于维持pH的方法，例如可举出向培养液中添加碱溶液等，将培养液的pH维持在4附近的方法等。添加的碱溶液不特别限定，例如，可举出氢氧化钠、氨水等。

[0192] 在从上述培养液离心分离或过滤器过滤除去菌体之后，将菌体除去液吸附在弱酸性阳离子交换树脂上。弱酸性阳离子交换树脂不特别限定，例如可举出Amberlite IRC-50(罗门哈斯公司制)等。吸附后，用盐酸溶出，由此能够得到高纯度的通式(1)所示的聚阳离子体衍生物。另外，也能够通过硼酸四苯酯法(非专利文献、H.Katano等、Anal.Sci.，28，1153-1157，2012)对其分离精制。

[0193] 接着，将通式(1)所示的化合物利用点击化学通过共价键导入药理作用物质。点击化学被本领域技术人员熟知。本发明中，可以按照这样已知的技术。作为本发明中使用的药理作用物质，只要能够通式(1)所示的化合物或其盐能够通过基于点击官能团的共价键形成而导入，则可以是任何物质。例如，优选具有三键(例如，-C≡C-)的化合物。总之，作为药理作用物质，优选与点击官能团反应化学键合的药理作用物质等那样的物质。由此，同时改善生物膜通透性和水溶性。

[0194] 作为药理作用物质，例如可举出含有抗真菌剂的抗菌剂、抗菌抗生剂、抗癌剂、酶或抗体等蛋白质、基因等。作为抗真菌剂，例如，多烯类抗生物质(两性霉素B、制霉菌素、曲霉素、吡马辛等)、米卡芬净、伊曲康唑、酮康唑、氟康唑、咪康唑、氟胞嘧啶等。作为抗菌抗生剂，例如，可举出β内酰胺类抗生物质(青霉素、氨苄西林、塔兰西林、巴基西林、头孢菌素C、头孢氨苄、头孢拉定、头霉素、亚胺培南等)、氨基糖苷系抗生物质(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、阿贝卡星、核霉素等)、四环素类抗生物质(氧四环素、四环素等)、肽类抗生物质(杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素B、万古霉素、替考拉宁等)等。作为抗癌剂，例如，可举出能够导入点击官能团的抗癌剂等。作为能够导入点击官能团的抗癌剂，例如可举出放线菌素D、丝裂霉素、蒽环霉素系抗肿瘤药(阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素等)、博来霉素、顺铂。作为蛋白质，可例示mAG等荧光蛋白质、作为CRISPR-Cas9系统中使用的Cas蛋白质(Cas，Cas9)、Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc等基因产物的中山因子蛋白质、基因表达控制蛋白质等。作为酶，胰蛋白酶、CreRecombinase、λ-Redrecombinase等。作为抗体，可例示IgG抗体、IgA抗体、IgY抗体等的免疫球蛋白等。作为基因，使用质粒、寡核苷酸、Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc等中山因子、CRISPR-Cas9系统中使用的PAM序列、gRNA(向导RNA，guideRNA，sgRNA)等。

[0195] 在将通式(1)所示的化合物或其盐导入药理作用物质的情况下，使用在点击化学领域用作现有通常手段的插入基是很方便的。插入基简言之是用于将药理作用物质和通式(1)所示的化合物或其盐一体化而可插入的基团，只要不妨碍本发明的目的，可以使用任何基团。作为这样的插入基，可举出例如下述式(9a)～(9d)中任一项所述的、原本具有插入基的化合物的氨基、羧基或羟基与药理作用物质中的羧基、羟基或氨基反应形成共价键，该化合物中的三键与通式(1)所示的化合物或其盐中的点击官能团反应形成共价键的介在基，这样的基团的种类、向药理作用物质导入的方法(酰胺化反应、酯化反应、huisgen反应等)等在点击化学领域已经充分确立，因此本发明可以照此进行。

[0196]

[0197] 在将通式(1)或其盐导入药理作用物质的情况下，例如，也可以使DBCO(二苯并环辛炔)等点击化学插入化合物插入。即，向使药理作用物质和DBCO等点击化学插入化合物结合而得到的化合物中导入通式(1)所示的化合物或其盐是有利的。

[0198] 例如，将作为通式(1)所示的化合物通过共价键导入药理作用物质的例子，可以举出下述的例子。

[0199] 通过从式(8)

[0200]

[0201] 所示的水溶性差的Amp-B出发进行有机合成反应，制造式(9)

[0202]

[0203] 所示的AmpB-DBCO。该反应可以通过公知的方法或本身公知的酰胺化反应来进行。使如此制造的化合物(9)或其盐与通式(10)

[0204]

[0205] (式中n为2至100的整数)所示的ε-PL衍生物(以下，记作ε-PL-PEG-叠氮化物)或其盐反应，能够制造通式(5)

[0206]

[0207] (式中n是2至100的整数)所示的水溶性的ε-PL-DBCO-AmpB或其盐。更详细地，参照下述的实施例。

[0208] 如此制造的通式(5)所示的水溶性的ε-PL-DBCO-AmpB或其盐能够维持作为深部真菌病治疗药有用的两性霉素B的抗菌效力的同时，不仅能够克服作为两性霉素B的缺点即难以经肠道吸收，难以口服施用，只能依赖静脉施用的问题，而且克服水溶性差(静脉滴注时间长)的缺点。

[0209] 通式(5-2)所示的水溶性ε-PL-DBCO-Dox和其盐能够通过与通式(5)所示的化合物的制造方法同样的方法来制造。更详细参照下述实施例。

[0210] 如此制造的通式(5-2)所示的水溶性的ε-PL-DBCO-Dox或其盐不仅可以维持作为抗癌剂有用的阿霉素的抗癌活性，而且可以降低经肠道的吸收和副作用。ε-PL-DBCO-Dox的Dox结构嵌入DNA的双螺旋结构，因此仅此仅将质粒DNA、基因片段、或、RNA和ε-PL-DBCO-Dox混合，即可以在不使DNA或RNA共价键合的情况下，进行聚阳离子修饰。通过本方法，可以将聚阳离子修饰的质粒DNA或基因片段、或RNA直接传递到细胞内。更详细地，参照下述的实施例。

[0211] 通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG或其盐能够用与通式(5)所示的化合物的制造方法同样的方法制造。更详细地参照下述的实施例。

[0212] 如此制造的通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG或其盐可以直接将作为荧光蛋白质的mAG传递到细胞内。同样地，可以通过将高分子药理作用物质，例如，蛋白质(包括酶、抗体)等也进行ε-PL修饰直接传递到细胞内。

[0213] 经由本发明的点击官能团的聚阳离子体导入法，也可以应用于例如产业基材(例如、塑料制品制或纤维性等医疗基材或功能性材料)等。作为医疗基材，例如，可举出细胞培养皿、医疗器具、再生医疗基材等。作为功能性材料，例如可举出电子基板、特殊镀膜玻璃等。通过将本发明的聚阳离子体导入产业基材等，例如能够赋予抗菌活性、培养细胞粘合效果、亲水效果、防滴漏效果、防静电效果等。

[0214] 以下示出几个实施例，对本发明的实施方式进一步详细说明。本发明不限于以下的实施例，毫无疑问，对细节可能有各种方式。另外，本发明不限于技术的实施方式，可以进行权利要求所示的各种变更，将公开的技术手段分别适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术的范围。

[0215] [实施例1]

[0216] 通过微生物生产通式(1)所示的化合物的生产方法

[0217] 作为ε-PL生产菌使用Streptomyces albulus NBRC1417，作为短链ε-PL生产菌，使用plsL883P/pLAE009/S.albulusCRM003(非专利文献：Y.Hamano等，Appl.Environ.Microbiol.，80，4993-5000，2014)。另外，该培养中使用了灭菌的SLB培养基(将蔗糖、10.3g；胰蛋白胨、10g；酵母提取物、5g的各成分溶解在1L的蒸馏水中的物质)、以及M3G培养基(将葡萄糖、50g；硫酸铵、10g；酵母提取物、5g；磷酸二氢钾、1.36g；磷酸氢二钠·十二水、1.58g；硫酸锌七水和物、0.04g；硫酸鉄(II)七水和物、0.03g；硫酸镁七水和物、0.5g的各成分溶解在1L的蒸馏水中，用氢氧化钠水溶液调节成pH7.0的物质)。

[0218] 将Streptomyces albulusNBRC14147、或plsL883P/pLAE009/S.albulusCRM003的孢子悬浮液接种在SLB培养基3mL中，于28℃振荡培养36小时。另外，在plsL883P/pLAE009/S.albulusCRM003的培养中，将作为选择药剂的抗生物质新霉素以50μg/mL的浓度添加到培养基中培养。将该培养液500μL添加到M3G培养基50mL，于28℃培养8小时，作为通式(2a)或(3a)所示的化合物，添加2-[2-[2-(2-丙炔-1-基氧)乙氧基]乙氧基]乙醇(以下，记作PEG-炔烃)、或2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙醇(以下，记作PEG-叠氮化物)至培养液中使浓度达到0.2％(w/v)，28℃下进一步振荡培养2～4天。将培养液离心分离，得到培养上清液を得た。

[0219] 通式(1)的结构确定

[0220] 将实施例1中得到的Streptomyces albulusNBRC14147的培养上清液用电离喷雾电离飞行时间质谱/高效液相色谱(以下，记作ESI-TOF-MS/HPLC)分析，测定精密分子量(图1A和1B)。使用ESI-TOF-MS/HPLC的ESI-TOF-MS使用布鲁克·道尔顿公司制的maXisplus，HPLC使用安捷伦技术公司的Agilent 1290Infinity LC系统。HPLC的条件为，色谱柱为SunShell RP-AQUA(Chromanik technology公司制、2.6μm、内径2.1mm、长度50mm)、色谱柱温度为40℃，移动相A使用了含有0.05％甲酸和0.05％七氟丁酸的水溶液，移动相B使用了含有0.05％甲酸和0.05％七氟丁酸的乙腈。移动相流速设为0.3mL/分，分析开始的3分钟之前，以移动相B10％～25％的线性梯度、从3分钟至12分钟以移动相B25％～90％的线性梯度、从12分钟到16分钟以移动相B90％～100％的线性梯度、从16分钟至18分钟以移动相B100％进行分析。溶出物的监控通过ESI-TOF-MS的计测来进行。

[0221] 结果

[0222] 确认到产生了ε-PL的羧基和PEG-叠氮化物以酯键连接的通式(1)所示的化合物，即通式(10)(其中，式中n为17至26的整数)所示的ε-PL-PEG-叠氮化物、以及ε-PL的羧基和PEG-炔烃以酯键连接的通式(1)所示的化合物，即通式(11)(其中，式中n为17至26的整数)所示的ε-PL-PEG-炔烃。另外，从培养液以硼酸四苯酯法分离精制ε-PL-PEG-叠氮化物和ε-PL-PEG-炔烃(非专利文献H.Katano等、Anal.Sci.，28，1153-1157，2012)、通过核磁共振光谱(1H-NMR)确认了其化学结构(图2A和2B)。基于该结果，确定了通过利用作为ε-PL生产菌的Streptomyces albulus NBRC14147，由17～26mer的ε-PL构成的ε-PL-PEG-叠氮化物、以及ε-PL-PEG-炔烃被生产。另一方面，通过利用作为短链ε-PL生产菌的plsL883P/pLAE009/S.albulusCRM003，能够生产短链长的ε-PL-PEG-叠氮化物和ε-PL-PEG-炔烃。

[0223]

[0224] [实施例2]

[0225] 通过化合物的ε-PL修饰来同时改善水溶性和生物膜通透性

[0226] 作为ε-PL修饰同时改善化合物的水溶性和生物膜通透性的模型实验，进行式(12)所示的水溶性差的荧光色素(DBCO-PEG4-5/6-FAM)的ε-PL修饰。

[0227]

[0228] 将式(12)所示的市售DBCO-PEG4-5/6-FAM(0.5μmol)和通式(10)(其中，式中n是9至18的整数)所示的9～18mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物(1.0μmol)溶解在80％二甲基亚砜(以下，记作DMSO)中，在30℃下一边搅拌一边进行点击化学反应24小时。按照实施例1所述的方法，将反应溶液用ESI-TOF-MS/HPLC进行分析后，确认到增加的DBCO-PEG4-5/6-FAM全部转换成了通式(13)(其中，式中n是9至18的整数)所示的化合物(ε-PL-DBCO-FAM)(图3A和3B)。另外，明确了从反应溶液精制的ε-PL-DBCO-FAM由于容易溶解于水，通过ε-PL修饰水溶性差的DBCO-PEG4-5/6-FAM转变为了水溶性。

[0229]

[0230] 式(12)所示的DBCO-PEG4-5/6-FAM未显示生物膜通透性。这里，使用作为动物细胞的HeLa细胞确认了ε-PL修饰的DBCO-PEG4-5/6-FAM、即通式(13)(其中，式中n是9至18的整数)所示的ε-PL-DBCO-FAM的生物膜通透性。HeLa细胞的培养中，使用含10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco’smodifiedEagle’s培养基(DMEM)，在37℃下在含有5％的二酸化碳的大气中培养。通过该培养条件，将HeLa细胞在12孔板中培养至70～80％融合，用不含FBS的DMEM(DMEMw/oFBS)将细胞清洗两次。向细胞中添加DMEMw/oFBS，冷却至4℃之后，分别添加式(12)所示的DBCO-PEG4-5/6-FAM、或通式(13)(其中，式中n是9至18的整数)所示的ε-PL-DBCO-FAM至浓度分别为30μM，在4℃下保温30分钟。将细胞用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗两次，用含肝素(100μg/mL)的PBS或者仅用PBS清洗之后，再用PBS清洗两次。添加300μL含有1％TritonX-100的100mMTris-盐酸缓冲液(pH8.0)，提取进入细胞内的化合物，通过离心分离除去不溶性部分之后，测定荧光强度。其结果，确认了为了清洗细胞表层结合的ε-PL-DBCO-FAM而进行肝素清洗的情况和、不进行的情况两者中，与式(12)所示的DBCO-PEG4-5/6-FAM比较，通式(13)所示的ε-PL-DBCO-FAM生物膜的通透性约3.5倍高(图4)。另外，证明了在不清洗肝素的情况下，由于ε-PL-DBCO-FAM处理中，其荧光高度较高，因此，结合在细胞表层的ε-PL-DBCO-FAM的一部分被摄入细胞内(图4)。实际上，通过共聚焦激光显微镜视觉确认了通式(13)所示的ε-PL-DBCO-FAM存在于细胞内，而且其中一部分也存在于核内(图5)。

[0231] 通过本实验明确了，通过对化合物进行ε-PL修饰，能够一并解决水溶性赋予和生物膜通透性改善。

[0232] [实施例3]

[0233] 为了进一步评价通式(1)所示的化合物、即通式(10)(其中，式中n是9至18的整数)所示的ε-PL-PEG-叠氮化物的有用性，进行了式(8)所示的抗真菌抗生物质AmpB的ε-PL修饰。AmpB由于对真菌显示出抗菌活性，一次作为以深部真菌病为代表的各种各样的真菌感染症的治疗药而利用着的临床上重要的抗生物质。但是，由于基本不溶于水、水溶性差，因此存在制剂调整复杂、肾毒性等副作用的问题。另外，现在讨论了改善其水溶性差的脂质体制剂等各种制剂技术，但是没有得到十分满意的结果。AmpB由于口服基本不被肠道吸收，因此，最新的制剂技术中，也不能克服肠道吸收的问题。另一方面，ε-PL修饰的AmpB如果能够维持强力的抗真菌活性，则与开发易溶于水的AmpB相关联，期待一并改善上述的多个问题。

[0234] 抗真菌抗生物质AmpB的ε-PL修饰

[0235] 将AmpB(NakaraiTesque公司制)100mg和N-[(9H-氟-9-甲氧基)羰氧基]琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)73mg溶解在无水二甲基甲酰胺30mL中。28℃下搅拌4小时，合成了AmpB的氨基糖的氨基被Fmoc基保护的化合物(AmpB-Fmoc)。反应液中加入25mM盐酸水溶液420mL，将离心分离得到的白色沉淀AmpB-Fmoc溶解于DMSO，冷冻干燥，得到AmpB-Fmoc的粉末。将AmpB-Fmoc24.8mg、N，N-二异丙基乙胺8.88μL、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物9.0mg溶解在无水二甲基甲酰胺4.5mL中。将反应液在室温一边搅拌一边反应30分钟后，加入市售的DBCO-PEG4-胺12.5mg，28℃搅拌5小时，加入哌啶1.2mL，由此使Fmoc基脱保护，合成通式(9)所示的AmpB-DBCO。向反应液中加入120mL二乙醚，将离心分离得到的黄色沉淀AmpB-DBCO溶解在DMSO中，通过使用了逆相色谱柱(SunniestRP-AQUA，5μm，250×10mm，ChromaNikTechnologies)的高效液相色谱(HPLC)精制。HPLC的各条件如下所述。色谱柱温度、30℃；检测、UV405nm的吸收；移动相A、0.1％(v/v)甲酸水溶液；移动相B、乙腈；移动相的梯度、30分钟B液40％～100％的线性梯度。从含有通式(9)所示的AmpB-DBCO的溶出成分中蒸馏掉乙腈，冷冻干燥得到通式(6)所示的AmpB-DBCO的黄色粉末。将通式(9)所示的AmpB-DBCO366μg、和通式(7)所示的9～18mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物689μg溶解到86％DMSO水溶液中，30℃下一边搅拌一边进行点击化学反应5小时。用ESI-TOF-MS/HPLC对反应溶液进行分析，确认合成了通式(5)(其中，式中n为9至17的整数)所示的ε-PL-DBCO-AmpB的合成(图6A和6B)。

[0236] 通式(5)所示的ε-PL-DBCO-AmpB的水溶性

[0237] 将通式(5)(其中，式中n是9至17的整数)所示的ε-PL-DBCO-AmpB和式(8)所示的AmpB溶解在水中时，AmpB、1.08mM的浓度下完全不溶于水，但是通式(5)(其中，式中n是9至17的整数)所示的ε-PL-DBCO-AmpB在5.63mM的浓度下也容易溶于水，显示出高水溶性(图
7)。由此可见，对水溶性差的AmpB进行ε-PL修饰，能够赋予高水溶性，并且表示通过利用通式(10)(其中，式中n为9至18的整数)所示的ε-PL-PEG-叠氮化物，能够有效且简便地对医药品等的药物进行ε-PL修饰，明确了其有用性。

[0238] 通式(5)所示的ε-PL-DBCO-AmpB的抗真菌活性

[0239] 作为真菌的测试菌使用AspergillusbrasiliensisNBRC9455，测定了通式(5)(其中，式中n是9至17的整数)所示的ε-PL-DBCO-AmpB、式(8)所示的AmpB、通式(10)(其中，式中n是9至18的整数)所示的9～18mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物的最小生长抑制浓度(MIC)。培养基使用市售的RPMI-1640培养基，30℃下培养5天时，通式(5)所示的ε-PL-DBCO-AmpB的MIC是1.9μg/mL，式(8)所示的AmpB的MIC是0.3μg/mL，通式(10)所示的9～18mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物的MIC是72μg/mL。由以上结果可知，ε-PL修饰的AmpB、即通式(5)所示的ε-PL-DBCO-AmpB是水溶性，而且维持了充分的抗真菌活性。式(8)所示的水溶性差的AmpB由于口服不被肠道吸收，因此仅适应于口腔或食道等消化道的真菌感染症。但是，可知通式(5)所示的水溶性的ε-PL-DBCO-AmpB通过ε-PL修饰(聚阳离子修饰)能够改善生物膜通透性，即使口服也能够应用于深部真菌病。

[0240] [实施例4]

[0241] 抗癌剂Dox的ε-PL修饰

[0242] 将Dox(盐酸盐、Funakoshi公司制)17.4mg、DBCO-PEG4-NHSEster19.4mg和N，N-二甲基-4-氨基吡啶4.9mg溶解在DMSO3mL中。室温搅拌4小时，合成了Dox的氨基糖的氨基上结合有DBCO-PEG4的化合物(DBCO-Dox)。将合成的DBCO-Dox通过使用了逆相色谱柱(Sunniest RP-AQUA，5μm，250×10mm，ChromaNik Technologies)的高效液相色谱(HPLC)精制。HPLC的各条件如下所述。色谱柱温度、35℃；检测、UV254nm的吸收；移动相A、0.05％(v/v)甲酸水溶液和0.05％(v/v)HFBA水溶液；移动相B、0.05％(v/v)甲酸乙腈溶液和0.05％(v/v)HFBA乙腈溶液；移动相的梯度洗脱、18分钟B液50％的等度洗脱。从含有DBCO-Dox的溶出成分中蒸馏掉乙腈，用醋酸乙酯提取DBCO-Dox，并使之干燥。将DBCO-Dox用氯仿1mL完全溶解，再次干燥。将DBCO-Dox10μmol和ε-PL-PEG-叠氮化物11μmol溶解在80％DMSO水溶液中，室温下一边搅拌一般进行点击化学反应3小时。通过ESI-TOF-MS/HPLC对反应溶液进行分析，确认合成了通式(5-2)(其中，式中n是18至29的整数)所示的ε-PL-DBCO-Dox的合成(图8A和B)。

[0243] 通式(5-2)所示的ε-PL-DBCO-Dox的细胞毒性(抗癌活性)

[0244]

[0245] 关于式(14)所示的Dox和通式(5-2)(其中，式中n是18至29的整数)所示的ε-PL-DBCO-Dox，对针对人慢性骨髄性白血病细胞K562细胞和Dox耐药性的K562细胞K562/ADR细胞的细胞毒性进行了验证。K562细胞和K562/ADR细胞的培养中，使用含有10％的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，在含有5％的二酸化碳的大气中37℃下培养。将各个细胞悬浮在培养基中使之成为1×105细胞/mL的浓度，每100μL(1×104细胞)接种在96-well板上，培养24小时。添加含有各种浓度的Dox和ε-PL-DBCO-Dox的培养基100μL，培养48小时。通过MTT测定对活细胞数进行计测，计算细胞毒性。其结果，式(14)所示的Dox的K562细胞和K562/ADR细胞中的IC50分别为239±72nM、1，043±72nM。另外，通式(5-2)所示的ε-PL-DBCO-Dox的K562细胞和K562/ADR细胞中的IC50分别为12.5±1.31μM和49.9±9.43μM。因此，虽然确认到通式(5-2)所示的ε-PL-DBCO-Dox与式(14)所示的Dox相比约50倍的抗癌活性的降低，但是在维持了作为抗癌剂有用的阿霉素的抗癌活性的同时，从肠道的吸收和副作用可以被降低。另外，本结果由于示出ε-PL-DBCO-Dox的Dox结构嵌入DNA的双螺旋结构，因此仅通过将质粒DNA或基因片段、或RNA与ε-PL-DBCO-Dox混合，即可在不使DNA、RNA共价键合的情况下，进行聚阳离子修饰。本方法中，可以将聚阳离子修饰的质粒DNA或基因片段、或者RNA直接传递到细胞内。

[0246] [实施例5]

[0247] 高分子药理作用物质的ε-PL修饰

[0248] 作为高分子药理作用物质的例，对单体Azami-Green(mAG)荧光蛋白进行了ε-PL修饰。将mAG作为C末端his tag融合蛋白质高表达的质粒(mAG/pET21a)导入大肠杆菌BL21(DE3)中。将该大肠杆菌接种在LB培养基(含有100μg/mL的氨苄西林)中，于37℃下培养2.5小时，以0.1mMIPTG进行mAG表达诱导后，18℃下培养整夜。回收菌体，在缓冲液(50mMTris-HCl、300mMNaCl、10mM咪唑、pH7.0)中悬浮后，用超声波破碎菌体。将破碎液离心分离回收无细胞提取液，使用Ni亲和色谱柱精制mAG。精制的mAG使用透析外液100mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)透析整夜。针对mAG将1当量的DBCO-sulfo-NHS在4℃下一边搅拌一遍1小时内分三次添加，总共反应3小时，制备DBCO化的mAG(DBCO-mAG)。透析外液用100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)整夜透析后，对DBCO-mAG添加1.1当量的通式(10)(其中，式中n是20至30的整数)所示的20～30mer的ε-PL所构成的ε-PL-PEG-叠氮化物，在4℃下反应1小时。将反应溶液用ESI-TOF-MS/HPLC分析后，确认到合成了通式(5-3)(其中，式中n是23至29的整数)所示的ε-PL-DBCO-mAG(图9A、9B和9C)。

[0249] ε-PL-DBCO-mAG的生物膜通透性评价

[0250] 通常、蛋白质不能通过细胞膜等生物膜。因此，使用动物细胞HeLa细胞确认了ε-PL修饰的mAG、即通式(5-3)(其中，式中n是23至29的整数)所示的ε-PL-DBCO-mAG是否通过生物膜。HeLa细胞的培养中，使用含有10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)，在含有5％的二酸化碳的大气中37℃下进行培养。以该培养条件，在12孔板上培养HeLa细胞直至达到70～80％融合，用不含FBS的DMEM(DMEMw/oFBS)将细胞分2回清洗。向细胞中添加DMEMw/oFBS，冷却到4℃后，分别添加mAG、或通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG至分别达到50μM，于4℃下保温30分钟。将细胞用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗两次，用含有肝素(100μg/mL)的PBS清洗之后，再用PBS清洗两次。添加含有300μL的1％TritonX-100的100mMTris-盐酸缓冲液(pH8.0)，提取摄入细胞内的化合物，通过离心分离除去不溶性成分后，测定了荧光强度。其结果，确认了与通式(5-3)”所示的mAG相比，通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG的生物膜通透性高约10倍(图10)。另外，实际上，用共焦点激光显微镜观察后，视觉确认了通式(5-3)所示的ε-PL-DBCO-mAG存在于细胞内，而且其一部分也存在于核内(图11)。

[0251] [实施例6]

[0252] 通式(11)所示的ε-PL-PEG-炔烃的化学的稳定性试验

[0253] 对通过与实施例1所得的通式(11)(其中，式中n是17至26的整数)所示的ε-PL-PEG-炔烃和实施例1同样的方法得到的通式(15)(其中，式中n是17至26的整数)所示的ε-PL-炔烃的酯键的化学的稳定性进行验证。将ε-PL-PEG-炔烃和ε-PL-炔烃以1mM的浓度溶解在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，于60℃加热5分钟后，用ESI-TOF-MS/HPLC分析。其结果，判明了与ε-PL-炔烃相比，ε-PL-PEG-炔烃的酯键难以水解，化学的稳定性高(图12A和B)。

[0254]

[0255] 工业应用性

[0256] 本发明通过用化学键导入至药理作用物质，不仅提供改善该药理作用物质的生物膜通透性的聚阳离子体衍生物，而且提供通过聚阳离子体衍生物导入而改善了生物膜通透性的药理作用物质。

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