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释放一化氮的海藻酸盐作为可生物降解抗菌支架和相关方法

阅读:1042发布:2020-05-26

专利汇可以提供释放一化氮的海藻酸盐作为可生物降解抗菌支架和相关方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本文公开了共价改性以储存和释放一 氧 化氮的大分子量藻酸盐,以及其制备和使用方法。所述共价改性的藻酸盐可以被调节以受控的方式释放一氧化氮,并且可用于根除浮游 生物 和基于 生物膜 的细菌。,下面是释放一化氮的海藻酸盐作为可生物降解抗菌支架和相关方法专利的具体信息内容。

1.一种官能化藻酸盐,其包括,
一个或多个共价改性的式I单体
和任选地,至少一个式II的单体
其中,
R1和R2各自独立地选自氢、C1-5烷基(C=O)-和C1-5烷基;
R3为氢或C1-5烷基;
R4在每种情况下为氢或C1-5烷基;
Q是–(CRaRb)v-;
其中Ra和Rb独立地为氢或C1-5烷基;v是2到6的整数;
A是
其中,L是S、O或N;和
G在每种情况下是氢,与L一起形成一化氮供体,或者不存在;
p是1到10的整数;
B选自氢、–Y-Z和C1-5烷基,其中所述C1-5烷基任选被基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或–NRc(CO)Rd取代,
其中Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基,
其中Y具有以下结构:
其中Rp、Rq、Rs和Rt在每种情况下独立地为氢或羟基;和
k是1至20的整数;和
Z的结构为:
其中j在每种情况下是1至100的整数;和
其中至少一个式I单体含有一氧化氮供体。
2.根据权利要求1所述的官能化藻酸盐,其中所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
3.根据权利要求2所述的官能化藻酸盐,其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
4.根据权利要求1所述的官能化藻酸盐,其中
R1和R2为氢或C1-5烷基;
R3是氢;和
R4在每种情况下是氢或C1-5烷基。
5.根据权利要求4所述的官能化藻酸盐,其中
R1、R2、R3和R4是氢。
6.根据权利要求1所述的官能化藻酸盐,其中
v为2或3;
L是N;和
p是1至3的整数。
7.根据权利要求6所述的官能化藻酸盐,其中B是-Y-Z。
8.根据权利要求7所述的官能化藻酸盐,其中Y的结构如下:
9.根据权利要求7所述的官能化藻酸盐,其中Z具有以下结构:
10.根据权利要求6所述的官能化藻酸盐,其中B选自氢和C1-5烷基,其中所述C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或-NRc(CO)Rdc d
取代,并且其中R和R各自独立地选自由氢和C1-6烷基。
11.根据权利要求10所述的官能化藻酸盐,其中B是氢或未取代的C1-5烷基。
12.根据权利要求11所述的官能化藻酸盐,其中B是氢或C3烷基。
13.根据权利要求12所述的官能化藻酸盐,其中-(Q-A-)p-B具有以下结构:
14.根据权利要求13所述的官能化藻酸盐,其中G与结构vi、vii、viii或ix中的氮一起形成一氧化氮供体。
15.根据权利要求14所述的官能化藻酸盐,其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
16.根据权利要求12所述的官能化藻酸盐,其中-(Q-A-)p-B具有以下结构:
17.根据权利要求16所述的官能化藻酸盐,其中G与结构vii中的氮一起形成一氧化氮供体。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的官能化藻酸盐,其中,所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的官能化藻酸盐,其中所述官能化藻酸盐是溶性的。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的官能化藻酸盐,其中所述官能化藻酸盐的总可释放一氧化氮储存量在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的官能化藻酸盐,其中所述一氧化氮释放具有在
0.1-24小时范围内的半衰期
22.根据权利要求1-21中任一项所述的官能化藻酸盐,其中一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的官能化藻酸盐,其中4小时后的总一氧化氮释放在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol NO的范围内。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的官能化藻酸盐,其中在所述官能化藻酸盐中的所述单体的15%以上是式I的单体。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的官能化藻酸盐,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为1-600kDa。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的官能化藻酸盐,其包括式I的两个或更多个不同的共价改性的单体。
27.一种制备权利要求1至26中任一项所述的官能化藻酸盐的方法,所述方法包括:
i.使式III的胺在肽偶联试剂存在下接触
藻酸盐,其中
R4、Q、A、B和p如上所述,其中制备共价改性的式I单体
R1、R2、R4、Q、A、B和p如上所述;和
ii.使含有共价改性的式I单体的藻酸盐接触
一氧化氮源,其中,
R1、R2、R4、Q、A、B和p如上所述,其中制备权利要求1所述的官能化藻酸盐。
28.根据权利要求27所述的方法,其中
R1和R2为氢或C1-5烷基;
R3为氢或C1-5烷基;和
R4在每种情况下为氢或C1-5烷基;
v为2或3;
L是N;和
p是1至3的整数。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中-(Q-A-)p-B具有以下结构:
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法,其中G与氮一起形成一氧化氮供体。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法,其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
32.一种将一氧化氮输送至受试者的方法,包括:
施用有效量的权利要求1至26中任一项所述的官能化藻酸盐至所述受试者。
33.一种治疗疾病状态的方法,其包括:
施用有效量的权利要求1至26中任一项所述的官能化藻酸盐至有需要的受试者,其中所述疾病状态选自癌症,心血管疾病生物感染;由血液暴露于医疗器械引起的血小板聚集和血小板粘附;细胞增殖异常导致的病理状况;移植排斥,自身免疫性疾病炎症,血管疾病;疤痕组织;伤口收缩,再狭窄疼痛,发烧,胃肠道疾病,呼吸系统疾病,性功能障碍和性传播疾病。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述疾病状态是微生物感染。
35.一种药物制剂,其包括:
i.权利要求1至26中任一项所述的官能化藻酸盐;和
ii.药学上可接受的赋形剂。
36.根据权利要求35所述的药物制剂,其中所述官能化藻酸盐是水溶性的。
37.一种官能化藻酸盐,其包括,
一个或多个共价改性的式I单体
和任选地,式II'的至少一个单体
其中,
R1、R1'、R2、R2'、R3和R4各自独立地选自氢、-((CH2)nO)m-H、-(((CH2)nO)m-(CH2)oH和C1-5烷基,其中m、n和o独立地是0至6的整数;
Q是–(CRaRb)v-;
其中Ra和Rb独立地为氢;v是2到6的整数;
A是
其中,L是S、O或N;和
G在每种情况下是氢,与L一起形成一氧化氮供体,或者不存在;
其中所述一氧化氮供体,如果存在,选自:
p是1到10的整数;
B不存在或选自氢、–Y-Z和C1-5烷基,其中所述C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或–NRc(CO)Rd取代,
其中Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基,
其中Y具有以下结构:
其中Rp、Rq、Rs和Rt在每种情况下独立地为氢或羟基;和
k是1至20的整数;和
Z的结构为:
其中j在每种情况下是1至100的整数;和
其中至少一个式I单体含有一氧化氮供体。
38.根据权利要求37所述的官能化藻酸盐,其中 具有选自以下的一个或
多个的结构:
39.根据权利要求37或38所述的官能化藻酸盐,其中 具有选自以下的一
个或多个的结构:
40.根据权利要求37-39中任一项所述的官能化藻酸盐,其中R1、R1'、R2、R2'、R3和R4是氢。
41.一种用于减少微生物的化合物,其包括:
释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与所述藻酸盐的至少一个重复单元共价结合的含胺基团,
其中所述含胺基团包括一氧化氮供体,
其中所述一氧化氮供体生成一氧化氮并诱导氧化和/或亚硝化损伤微生物DNA和膜结构,从而减少微生物负荷。
42.根据权利要求41所述的化合物,其中所述官能化包括使所述藻酸盐与偶联剂和含胺基团接触以使所述含胺基团与所述藻酸盐共价结合。
43.根据权利要求42所述的化合物,其中所述含胺基团具有式III的结构。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的化合物,其中所述一氧化氮供体包括二醇二氮烯鎓。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的化合物,其中所述官能化的藻酸盐具有在1-
600kDa范围内的分子量,其中所述化合物具有约1至15小时之间的范围内的一氧化氮释放半衰期,并且其中所述化合物不导致形成亚硝胺。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的化合物,其中所述化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的化合物,其中所述化合物的一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的化合物,其中4小时后的总一氧化氮释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
49.根据权利要求41至48中任一项所述的化合物,其中所述化合物中至少15%的重复单元是式I的单体。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的化合物,其中所述化合物任选还包含至少一个式II'的重复单元。
51.根据权利要求41至50中任一项所述的化合物,其中所述微生物负荷包括存在以下的一种或多种:人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、疹、狂犬病、炎、出血性病毒性发热、H1N1、朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌、绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙氏菌、志贺氏菌、耐青霉烯的肠杆菌科、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌。
52.根据权利要求51所述的化合物,其中所述微生物负荷包括金黄色葡萄球菌的存在。
53.根据权利要求51所述的化合物,其中所述微生物负荷包括铜绿假单胞菌的存在。
54.根据权利要求51所述的化合物,其中所述微生物负载包括洋葱伯克霍尔德菌的存在。
55.一种用于降低微生物负荷和降低粘液粘弹性的双重作用化合物,包括:
水溶性官能化藻酸盐,其包含与藻酸盐的至少一个重复单元偶联的含胺基团,
其中所述含胺基团包括产生一氧化氮的一氧化氮供体,
其中一氧化氮诱导对微生物DNA和膜结构的损伤,从而减少微生物负荷,和
其中一氧化氮破坏在粘液层的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而降低粘液的粘弹性。
56.根据权利要求55所述的双重作用化合物,其中,所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
57.根据权利要求55或56的双重作用化合物,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为
200-600kDa。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述双重作用化合物的一氧化氮释放半衰期约1至15小时之间。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述化合物不导致亚硝胺的形成。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述双重作用化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述化合物的一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的双重作用化合物,其中,4小时后的总一氧化氮释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
63.根据权利要求55-62中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述至少一个重复基团包含式I的单体。
64.根据权利要求63所述的双重作用化合物,其中,所述化合物中总重复单元的至少
15%是式I的单体。
65.根据权利要求55-64中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述双重作用化合物任选地还包含至少一个式II'的重复单元。
66.根据权利要求55-65中任一项所述的双重作用化合物,其中,所述微生物负荷包括存在以下的一种或多种:人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、肺炎、出血性病毒性发热、H1N1、朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌。
67.根据权利要求66所述的化合物,其中所述微生物负荷包括金黄色葡萄球菌的存在。
68.根据权利要求66所述的化合物,其中所述微生物负荷包括铜绿假单胞菌的存在。
69.根据权利要求66所述的化合物,其中所述微生物负载包括洋葱伯克霍尔德菌的存在。
70.化合物在制备用于治疗囊性纤维化的药物中的用途,所述化合物包括:
水溶性官能化藻酸盐,其包含与藻酸盐的至少一个重复单元偶联的含胺基团,
其中所述含胺基团包括产生一氧化氮的一氧化氮供体,
其中一氧化氮诱导对微生物DNA和膜结构的损伤,从而减少微生物负荷,
其中一氧化氮破坏在粘液层的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而降低粘液的粘弹性,和其中粘液粘弹性降低可以改善微生物的肺清除率。
71.根据权利要求70所述的化合物的用途,其中配制所述化合物用于递送至患有囊性纤维化的受试者的肺部。
72.根据权利要求70或71所述的化合物的用途,其中配制所述化合物以每日至少两次递送至患有囊性纤维化的受试者。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的化合物的用途,其中所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的化合物的用途,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为1-600kDa。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的化合物的用途,其中所述双重作用化合物的一氧化氮释放半衰期约1至15小时之间。
76.根据权利要求70至75中任一项所述的化合物的用途,其中所述化合物不导致亚硝胺的形成。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的化合物的用途,其中所述双重作用化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的化合物的用途,其中所述化合物的一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的化合物的用途,其中4小时后的总NO释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
80.根据权利要求70至79中任一项所述的化合物的用途,其中所述囊性纤维化是由于金黄色葡萄球菌的存在。
81.根据权利要求70至79中任一项所述的化合物的用途,其中所述囊性纤维化是由于铜绿假单胞菌的存在。
82.根据权利要求70至79中任一项所述的化合物的用途,其中所述囊性纤维化是由于洋葱伯克霍尔德菌的存在。
83.根据权利要求70至82中任一项所述的化合物的用途,其中化合物适于与另外的药物一起施用,其中所述另外的药物包括以下的一种或多种:阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢地尼、头孢菌素C、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、多西环素、红霉素、莫匹罗星、利福平、四环素和万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和阿米卡星。
84.一种减少表面上的微生物负荷的方法,包括
将化合物施用于被多种微生物污染的表面;
其中所述化合物包括释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与所述藻酸盐的至少一个重复单元共价结合的含胺基团,其中所述含胺基团包括一氧化氮供体,
其中所述一氧化氮供体生成一氧化氮并诱导氧化和/或亚硝化损伤微生物DNA和膜结构,从而减少微生物负荷,并且其中所述多种微生物包括以下的两种或更多种:革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、酵母和病毒。
85.根据权利要求84所述的方法,其中所述表面是有机表面。
86.根据权利要求84或85所述的方法,其中所述表面是人的皮肤
87.根据权利要求86所述的方法,其中所述施用不会引起皮肤刺激。
88.根据权利要求84或85所述的方法,其中,所述表面是动物皮肤。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述施用不会引起皮肤刺激。
90.根据权利要求84或85所述的方法,其中,所述表面是人气道组织。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述施用不会引起气道上皮细胞的刺激。
92.根据权利要求84所述的方法,其中所述表面是无机表面。
93.根据权利要求92所述的方法,其中所述无机表面是医疗装置的外表面或内表面。
94.根据权利要求93所述的方法,其中施用所述化合物在医疗装置的外表面或内表面上产生抗微生物涂层。
95.根据权利要求93或94所述的方法,其中所述医疗装置包括内窥镜
96.根据权利要求84至95中任一项所述的方法,其中所述微生物负荷包括耐药细菌。
97.根据权利要求96所述的方法,其中所述耐药细菌包括耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌。
98.根据权利要求96所述的方法,其中所述耐药细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
99.根据权利要求84至95中任一项所述的方法,其中所述微生物负荷包括存在以下的一种或多种:人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、肺炎、出血性病毒性发热、H1N1、朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌。
100.根据权利要求99所述的方法,其中所述微生物负荷包括金黄色葡萄球菌的存在。
101.根据权利要求99所述的方法,其中所述微生物负荷包括铜绿假单胞菌的存在。
102.根据权利要求99所述的方法,其中所述微生物负载包括洋葱伯克霍尔德菌的存在。
103.根据权利要求84-102中任一项所述的方法,还包括施用以下的一种或多种:阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢地尼、头孢菌素C、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、多西环素、红霉素、莫匹罗星、利福平、四环素、万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和阿米卡星。
104.根据权利要求103所述的方法,其中施用阿莫西林。
105.根据权利要求103所述的方法,其中施用头孢地尼。
106.根据权利要求103所述的方法,其中施用四环素。
107.一种治疗微生物感染的方法,包括:
使被多种微生物污染的表面与包含以下物质的化合物接触:
释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与所述藻酸盐的至少一个重复单元共价结合的含胺基团,其中所述含胺基团包括一氧化氮供体,
其中所述一氧化氮供体生成一氧化氮和诱导对微生物的膜和/或DNA的损伤,从而减少活的微生物的数量和治疗所述感染,并且
其中所述多种微生物包括病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、耐药细菌、霉菌、酵母、真菌及其组合中的一种或多种。
108.根据权利要求107所述的方法,其中配制所述化合物用于通过局部途径、通过注射、通过摄取或通过吸入施用。
109.根据权利要求107或108所述的方法,其中所述表面是人的皮肤。
110.根据权利要求109所述的方法,其中所述施用不会引起皮肤刺激。
111.根据权利要求107或108所述的方法,其中所述表面是人气道组织。
112.根据权利要求111所述的方法,其中所述施用不会引起气道上皮细胞的刺激。
113.根据权利要求107-112中任一项所述的方法,其中所述方法用于治疗囊性纤维化。
114.根据权利要求107-113中任一项所述的方法,其中所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
115.根据权利要求107-114中任一项所述的方法,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为1-600kDa。
116.根据权利要求107-115中任一项所述的方法,其中所述化合物的一氧化氮释放半衰期约1至15小时之间。
117.根据权利要求107-116中任一项所述的方法,其中所述化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
118.根据权利要求107-117中任一项所述的方法,其中所述化合物的一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
119.根据权利要求107-118中任一项所述的方法,其中4小时后的总一氧化氮释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
120.根据权利要求107-119中任一项所述的方法,其中,所述至少一个重复基团包含式I的单体。
121.根据权利要求107-120中任一项所述的方法,其中,所述化合物任选还包含至少一个式II'的重复单元。
122.根据权利要求107-121中任一项所述的方法,其中所述化合物不导致亚硝胺的形成。
123.根据权利要求107至122中任一项所述的方法,其中所述多种微生物包括以下的一种或多种:人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、肺炎、出血性病毒性发热、H1N1、朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌。
124.根据权利要求123所述的方法,其中所述多种微生物包括金黄色葡萄球菌。
125.根据权利要求123所述的方法,其中所述多种微生物包括铜绿假单胞菌。
126.根据权利要求123所述的方法,其中所述多种微生物包括洋葱伯克霍尔德菌。
127.根据权利要求107-126中任一项所述的方法,还包括施用以下的一种或多种:阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢地尼、头孢菌素C、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、多西环素、红霉素、莫匹罗星、利福平、四环素、万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和阿米卡星。
128.根据权利要求127所述的方法,其中施用阿莫西林。
129.根据权利要求127所述的方法,其中施用头孢地尼。
130.根据权利要求127所述的方法,其中施用四环素。
131.一种降低粘液层的粘弹性的方法,包括:
使包含粘液层的表面与包含以下的化合物接触:
释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与所述藻酸盐的至少一个重复单元共价结合的含胺基团,其中所述含胺基团包括一氧化氮供体,
其中所述一氧化氮供体生成一氧化氮并且其中一氧化氮破坏在所述粘液层中的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而降低粘液的粘弹性。
132.根据权利要求131所述的方法,其中配制所述化合物用于通过局部途径、通过注射、通过摄取或通过吸入施用。
133.根据权利要求131或132所述的方法,其中所述表面是人气道组织。
134.根据权利要求133所述的方法,其中所述施用不会引起气道上皮细胞的刺激。
135.根据权利要求131-134中任一项所述的方法,其中所述方法用于治疗囊性纤维化。
136.根据权利要求131-135中任一项所述的方法,其中所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
137.根据权利要求131-136中任一项所述的方法,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为1-600kDa。
138.根据权利要求131-137中任一项所述的方法,其中所述化合物的一氧化氮释放半衰期约1至15小时之间。
139.根据权利要求131-138中任一项所述的方法,其中所述化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
140.根据权利要求131-139中任一项所述的方法,其中所述化合物的一氧化氮释放的总持续时间为1-60小时。
141.根据权利要求131-140中任一项所述的方法,其中4小时后的总一氧化氮释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
142.根据权利要求131-141中任一项所述的方法,其中所述至少一个重复基团包含式I的单体。
143.根据权利要求131-142中任一项所述的方法,其中所述化合物任选还包含至少一个式II'的重复单元。
144.根据权利要求131-143中任一项所述的方法,其中所述化合物不导致亚硝胺的形成。
145.根据权利要求131-144中任一项所述的方法,其中所述粘液层包含多种微生物,所述多种微生物包括以下的一种或多种:人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、肺炎、出血性病毒性发热、H1N1、朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌。
146.根据权利要求145所述的方法,其中所述多种微生物包括金黄色葡萄球菌。
147.根据权利要求145所述的方法,其中所述多种微生物包括铜绿假单胞菌。
148.根据权利要求145所述的方法,其中所述多种微生物包括洋葱伯克霍尔德菌。
149.根据权利要求131-148中任一项所述的方法,还包括使所述表面与以下的一种或多种接触:阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢地尼、头孢菌素C、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、多西环素、红霉素、莫匹罗星、利福平、四环素、万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和阿米卡星。
150.根据权利要求149所述的方法,其中施用阿莫西林。
151.根据权利要求149所述的方法,其中施用头孢地尼。
152.根据权利要求149所述的方法,其中施用四环素。
153.一种将抗微生物浓度的一氧化氮递送至目标部位至少1至15小时时间的方法,包括:
使受微生物负荷污染的目标部位与包含以下的化合物接触:
释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与所述藻酸盐的至少一个重复单元共价结合的含胺基团,其中所述含胺基团包括一氧化氮供体,
其中所述一氧化氮供体以足以减少在目标部位上的活微生物的数量的浓度产生一氧化氮。
154.根据权利要求153所述的方法,其中所述接触是通过局部接触、通过注射、通过摄取或通过吸入。
155.根据权利要求153或154所述的方法,其中所述表面是人气道组织。
156.根据权利要求155所述的方法,其中所述施用不会引起气道上皮细胞的刺激。
157.根据权利要求153至156中任一项所述的方法,其中所述方法用于治疗囊性纤维化。
158.根据权利要求153-157中任一项所述的方法,其中所述一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。
159.根据权利要求153-158中任一项所述的方法,其中所述官能化藻酸盐的分子量范围为1-600kDa。
160.根据权利要求153-159中任一项所述的方法,其中所述化合物的一氧化氮释放半衰期约1至15小时之间。
161.根据权利要求153-160中任一项所述的方法,其中所述化合物的总可释放一氧化氮储存量在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围。
162.根据权利要求153-161中任一项所述的方法,其中4小时后的总一氧化氮释放在每毫克化合物0.1-1.0μmol一氧化氮的范围内。
163.根据权利要求153-162中任一项所述的方法,其中目标部位处的一氧化氮浓度在约1和200μM之间。

说明书全文

释放一化氮的海藻酸盐作为可生物降解抗菌支架和相关

方法

[0001] 通过引用并入
[0002] 任何优先权申请
[0003] 本专利申请要求分别于2017年1月3日和2017年4月10日提交的美国临时专利申请号62/441,742和62/483,505的优先权权益,其全部内容通过引用结合于此用于所有目的。
[0004] 政府利益
[0005] 本发明是在国立卫生研究院授予的AI112029的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

[0006] 本公开的主题一般涉及释放一氧化氮的藻酸盐聚合物,其被共价改性以以受控方式储存和释放一氧化氮。另外公开了合成和使用藻酸盐聚合物作为抗菌剂的方法。

背景技术

[0007] 细菌感染对社区和医院环境中的人类健康构成了巨大挑战。几种慢性感染,例如与植入装置、慢性伤口和囊性纤维化相关的慢性感染,通常由形成生物膜的病原体如绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌引起。生物膜是由外多糖(EPS)基质包裹的细菌的合作群落,所述基质保护细菌免于宿主免疫应答和抗生素。据报道,相对于浮游细菌所需的抗生素浓度,根除生物膜可能需要高1000倍的抗生素浓度。若干因素有助于观察到生物膜的抗菌性,包括较慢的细菌代谢、抗菌剂在EPS基质内的有限扩散、以及改变的微环境(例如,营养物耗尽的区域)。

发明内容

[0008] 由于生物膜对常规抗菌剂的抗性,非常需要能够有效渗透和根除基于生物膜的细菌菌落的新型抗菌剂。本文提供了这些试剂及其制备方法,以及它们在减少和/或消除微生物负荷中的用途。
[0009] 一氧化氮(NO)作为信号分子发挥多种生理作用,并且如本文所公开的,还可以在病理生理学中发挥重要作用,例如作为治疗剂。迄今为止尚未充分利用用作治疗剂的NO,这至少部分地基于治疗组合物的有限NO负载、NO释放速率比期望的更快以及缺乏靶向NO递送。本文提供了NO释放支架,产生此类支架的方法,以及使用这样的支架治疗各种病理生理学的方法,所述支架利用增强的NO释放特征并利用NO释放药理学潜的丰富潜力。特别地,本文提供了作为抗微生物剂非常有效的化合物。
[0010] 在若干实施方案中,提供官能化的藻酸盐,其包括一种或多种式I的共价改性的单体
[0011]
[0012] 其中,至少一种式I的单体含有一氧化氮供体。在若干实施方案中,R1和R2各自独立地选自氢、C1-5烷基(C=O)-和C1-5烷基或其组合。在若干实施方案中,R3为氢或C1-5烷基。在若干实施方案中,R4在存在R4的每种情况下为氢或C1-5烷基。在若干实施方案中,Q为–(CRaRb)v-,其中Ra和Rb独立地为氢或C1-5烷基,并且v为2至6的整数。在若干实施方案中,A具有以下结构(或其变体):
[0013]
[0014] 其中,L是S、O或N。在若干实施方案中,G在每种情况下是氢,与L一起形成一氧化氮供体,或者,取决于实施方案,不存在。在若干实施方案中,p是1至10的整数。在若干实施方案中,B选自氢、-Y-Z和C1-5烷基。根据实施方案,C1-5烷基任选被基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或-NRc(CO)Rd取代。取决于实施方案,可以在化合物中使用C1-5烷基中的这些取代的组合。在若干实施方案中,Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基。在若干实施方案中,Y具有以下结构之一:
[0015]
[0016]
[0017] 在若干实施方案中,Rp、Rq、Rs和Rt在每种情况下独立地为氢或羟基。取决于实施方案,Y的结构的组合可用于化合物中。在若干实施方案中,k是1至20的整数。在若干实施方案中,Z具有以下结构之一:
[0018]
[0019] 在若干实施方案中,j在每种情况下是1到100的整数。
[0020] 在若干实施方案中,官能化藻酸盐还包含至少一种式II的单体。
[0021]
[0022] 在一些实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺或羟基脲。在若干实施方案中,使用一氧化氮供体的组合。在若干实施方案中,由官能化藻酸盐产生的一氧化氮可任选地补充有一种或多种另外的一氧化氮源(外源或内源,例如增强内源性一氧化氮形成的另外的化合物)。在若干实施方案中,官能化藻酸盐使用二醇二氮烯鎓作为一氧化氮供体。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得R1和R2为氢或C1-5烷基,R3为氢且R4在每种情况下为氢或C1-5烷基。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得R1、R2、R3和R4为氢。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得v为2或3,L为N,p为1、2或3。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得B为–Y-Z。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得Y具有结构:
[0023]
[0024] 在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得Z具有以下结构:
[0025]
[0026] 在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得B选自氢和C1-5烷基,其中C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或-NRc(CO)Rd取代,Rc和Rd各自独立地选自由氢和C1-6烷基。在若干实施方案中,B是氢或未取代的C1-5烷基。在若干实施方案中,B是氢或C3烷基。在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得-(Q-A-)p-B具有结构:
[0027]
[0028] 在若干实施方案中,G与结构vi、vii、viii或ix中的氮一起形成一氧化氮供体。如上所述,取决于实施方案,一氧化氮供体可以变化。在若干实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
[0029] 在若干实施方案中,配制官能化藻酸盐使得-(Q-A-)p-B具有以下结构:
[0030]
[0031] 在若干实施方案中,G与结构vii中的氮一起形成一氧化氮供体。
[0032] 还提供了官能化的藻酸盐,其包含式I的一个或多个共价改性的单体
[0033]
[0034] 和任选地,式II'的至少一种单体
[0035]
[0036] 其中至少一种式I单体含有一氧化氮供体。在若干实施方案中,R1、R1'、R2、R2'、R3和R4各自独立地选自氢、-((CH2)nO)m-H、-(((CH2)nO)m-(CH2)oH和C1-5烷基,其中m、n和o独立地是0至6的整数。在若干实施方案中,Q是–(CRaRb)v-。在若干实施方案中,Ra和Rb独立地为氢。在若干实施方案中,v是2至6的整数。在若干实施方案中,A是
[0037]
[0038] 其中L是S、O或N。在若干实施方案中,G在每种情况下是氢,与L一起形成一氧化氮供体,或者不存在。在若干实施方案中,存在时,一氧化氮供体选自:
[0039]
[0040] 在若干实施方案中,p是1至10的整数。在若干实施方案中,B不存在或选自氢、–Y-Z和C1-5烷基,其中C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或–NRc(CO)Rd取代。在若干实施方案中,Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基。在若干实施方案中,Y具有以下结构:
[0041]
[0042] 在若干实施方案中,Rp、Rq、Rs和Rt在每种情况下独立地为氢或羟基。在若干实施方案中,k是1至20的整数。在若干实施方案中,Z具有以下结构:
[0043]
[0044] 其中j在每种情况下是1至100的整数。
[0045] 在若干实施方案中, 具有选自以下的一个或多个的结构:
[0046]
[0047] 在若干实施方案中, 具有选自以下的一个或多个的结构:
[0048]
[0049] 在若干实施方案中,R1、R1'、R2、R2'、R3和R4是氢。
[0050] 在若干实施方案中,官能化藻酸盐是溶性的。在若干实施方案中,官能化藻酸盐的总可释放一氧化氮储存量在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol NO的范围,包括约0.1-0.3μmol/mg、0.3-0.5μmol/mg、0.5-0.7μmol/mg、0.7-0.9μmol/mg、0.9-1.0μmol/mg,以及它们之间的任何储存量,包括端点。在若干实施方案中,NO释放的半衰期为0.1-24小时,包括约0.1至约0.5小时、约0.5至约1小时、约1至约2小时、约2至约4小时、约4至约6小时、约6至约10小时、约10至约15小时、约15至约20小时和约20至约24小时,包括其间的任何时间,包括端点。在若干实施方案中,NO释放的总持续时间为1-60小时,包括约1至约5小时、约5至约
10小时、约10至约15小时、约15至约20小时、约20至约30小时、约30至约50小时或约50至约
60小时,以及它们之间的任何时间,包括端点。在若干实施方案中,这些NO释放特征是特别有利的,因为它们允许将有效量的NO递送至期望的目标位点,持续允许减少微生物负荷的时间(以及其他有益效果)。鉴于已知的NO的短半衰期,这是特别有利的,已知的NO的短半衰期缺少本文公开的技术,限制了NO的效用。在若干实施方案中,4小时后的总NO释放在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol NO的范围内。在若干实施方案中,本文公开的化合物是特别有利的,因为与其他递送NO的方法相比,它们允许将更高浓度的NO递送至目标位点。例如,在若干实施方案中,化合物(及其使用方法)在目标位点产生约10至500μM的NO浓度,包括约
10至约20μM、20至约50μM、50至约100μM、100至约150μM、150至约200μM、200至约250μM、250至约300μM、300至约350μM、350至约400μM、400至约450μM、450至约500μM,以及列出的那些之间的任何浓度,包括端点。在若干实施方案中,将这些浓度维持超过其他NO递送方法所达到的时间。例如,在若干实施方案中,NO的杀微生物浓度维持约1小时、约2小时、约4小时、约
8小时、约12小时、约18小时或约24小时(或其间的任何时间,包括端点)。
[0051] 在若干实施方案中,官能化藻酸盐中15%或更多的单体是式I的单体。在若干实施方案中,官能化藻酸盐的分子量为1-600kDa。在若干实施方案中,官能化藻酸盐具有两个或更多个不同的式I的共价改性单体。
[0052] 在一些实施方案中,本文还提供了用于减少微生物的化合物,其包含释放一氧化氮(NO)的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含至少与藻酸盐的重复单元共价结合的含胺基团,其中含胺基团包含NO供体,其中NO供体产生NO并诱导对微生物DNA和膜结构的氧化和/或亚硝化损伤,从而减少微生物负荷。在若干实施方案中,化合物中至少15%的重复单元是式I的单体。在若干实施方案中,化合物任选进一步包含至少一个式II'的重复单元。在若干实施方案中,该化合物不会导致亚硝胺的形成。
[0053] 本文还提供了用于降低微生物负荷和降低粘液粘弹性的双重作用化合物,其包含水溶性官能化藻酸盐,其包含与藻酸盐的至少一个重复单元偶联的含胺基团,其中含胺基团包含产生NO的NO供体,其中NO诱导对微生物DNA和膜结构的损害,从而减少微生物负荷,并且其中NO破坏粘液层中的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而降低粘液粘弹性。在若干实施方案中,NO的二硫化物还原反应性至少部分地负责降低粘液粘度。在若干实施方案中,降低的粘液粘度可以增强后续NO处理的功效和/或增加受试者的先天免疫系统进一步控制微生物负荷的能力。在一些实施方案中,双重作用化合物不会导致亚硝胺的形成。
[0054] 在一些实施方案中,本文还提供了用于微生物减少的化合物,其包含水溶性的释放一氧化氮(NO)的支架,其包含与支架偶联的含胺基团,其中含胺基团包含NO供体,其中NO供体产生NO并诱导对微生物DNA和膜结构的氧化和/或亚硝化损伤,从而减少微生物负荷。在若干实施方案中,支架包含生物聚合物。在若干实施方案中,生物聚合物是壳聚糖、藻酸盐或透明质酸,以及本文公开的其他物质。在一些实施方案中,水溶性的释放一氧化氮(NO)的支架不包含和/或缺乏壳聚糖或透明质酸。在一些实施方案中,水溶性的释放一氧化氮(NO)的支架不包含和/或缺乏树枝状大分子。在一些实施方案中,水溶性的释放一氧化氮(NO)的支架不包含和/或缺少聚酰胺-胺或聚氨酯。在若干实施方案中,释放一氧化氮的支架不会导致亚硝胺的形成。
[0055] 在若干实施方案中,本文还提供了包含本文公开的任何官能化释放NO的藻酸盐和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
[0056] 还提供了制备如本文公开的官能化藻酸盐的方法。例如,在若干实施方案中,该方法包括使式III的胺在肽偶联试剂存在下接触
[0057]
[0058] 藻酸盐,形成式I的改性单体
[0059]
[0060] 使含有共价改性的式I单体的藻酸盐与一氧化氮源接触,形成如上所述的官能化藻酸盐。在若干实施方案中,R1、R2、R4、Q、A、B和/或p如上所述。在若干实施方案中,R1和R2是氢或C1-5烷基,R3是氢或C1-5烷基,R4在每种情况下是氢或C1-5烷基,v是2或3,L是N,p是1至3的整数。在若干实施方案中,-(Q-A-)p-B具有结构:
[0061]
[0062] 在若干实施方案中,G与氮一起形成一氧化氮供体。在若干实施方案中,该方法包括使用二醇二氮烯鎓作为一氧化氮供体。在若干实施方案中,所得的官能化藻酸盐是水溶性的。
[0063] 本文还提供了向受试者递送一氧化氮的方法,包括向受试者施用有效量的本文公开的任何官能化藻酸盐。本文还提供了治疗疾病状态的方法,该方法包括,在若干实施方案中,向需要治疗的受试者施用有效量的本文公开的任何官能化藻酸盐,其中所述疾病状态选自:癌症,心血管疾病,微生物感染;由血液暴露于医疗器械引起的血小板聚集和血小板粘附;细胞增殖异常导致的病理状况;移植排斥,自身免疫性疾病炎症,血管疾病;疤痕组织;伤口收缩,再狭窄疼痛,发烧,胃肠道疾病,呼吸系统疾病,性功能障碍和性传播疾病。在若干实施方案中,疾病状态是微生物感染。在若干实施方案中,疾病状态是囊性纤维化。
[0064] 本文还提供了化合物在制备用于治疗囊性纤维化的药物中的用途,该化合物包含水溶性官能化藻酸盐,其包含与藻酸盐的至少一个重复单元偶联的含胺基团,其中含胺基团包含产生NO的NO供体,其中NO诱导对微生物DNA和膜结构的损害,从而减少微生物负荷,其中NO破坏粘液层中的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而降低粘液粘弹性,并且其中粘液粘弹性降低允许改善微生物的清除率。在若干实施方案中,配制化合物用于递送至患有囊性纤维化的受试者的肺部。在若干实施方案中,配制化合物以每日至少两次递送至患有囊性纤维化的受试者。
[0065] 在若干实施方案中,本文提供了降低表面上微生物负荷的方法,包括将化合物施用于被多种微生物污染的表面,其中所述化合物包含释放一氧化氮(NO)的水溶性官能化藻酸盐,所述官能化藻酸盐包含与藻酸盐的至少重复单元共价结合的含胺基团,其中含胺基团包含NO供体,其中NO供体产生NO并诱导对微生物DNA和膜结构的氧化和/或亚硝化损伤,从而减少微生物负荷,并且其中多种微生物包括以下中的两种或更多种:革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌酵母和病毒。在若干实施方案中,表面是有机表面。在若干实施方案中,表面是人体皮肤。在若干实施方案中,化合物的施用不会引起皮肤刺激。在若干实施方案中,表面是动物皮肤。在若干实施方案中,化合物的施用不会引起皮肤刺激。在若干实施方案中,表面是人呼吸道组织。在若干实施方案中,化合物的施用(例如,吸入)不会引起气道上皮细胞的刺激。在若干实施方案中,表面是无机表面。在若干实施方案中,无机表面是医疗装置的外表面或内表面。在若干实施方案中,化合物的施用在医疗装置的外表面或内表面上产生抗微生物涂层。在若干实施方案中,医疗装置包括内窥镜
[0066] 在若干实施方案中,待减少和/或消除的微生物负荷包括耐药细菌。在若干实施方案中,耐药细菌包含耐青霉烯的肠杆菌科细菌。在若干实施方案中,耐药细菌包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在若干实施方案中,微生物包括人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、流感、肝炎、柯萨奇病毒、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、疹、狂犬病、肺炎、出血性病毒性发热、H1N1等,朊病毒、寄生虫、真菌、霉菌、酵母和细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性),包括白色念珠菌、黑曲霉、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S.aureus),A组链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、空肠弯曲杆菌、沙氏菌、志贺氏菌和多种耐药细菌,等等。术语微生物(microorganism)和微生物(microbe)应互换使用。微生物可包括野生型、基因工程或改性的生物。在若干实施方案中,本文公开的制剂和方法用于局部使用或治疗表面。
[0067] 在若干实施方案中,提供了一种治疗微生物感染的方法,包括使被多种微生物污染的表面与包含释放一氧化氮(NO)的水溶性官能化藻酸盐的化合物接触,所述官能化藻酸盐包含共价结合至藻酸盐的至少重复单元的含胺基团,其中含胺基团包含NO供体,其中NO供体产生NO并诱导对微生物的膜和/或DNA的损害,从而减少活微生物的数量和治疗感染,并且其中多种微生物包括病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、耐药细菌、霉菌、酵母、真菌及其组合中的一种或多种。
[0068] 在若干实施方案中,提供了降低粘液层的粘弹性的方法,包括使包含粘液层的表面与包含释放一氧化氮的水溶性官能化藻酸盐的化合物接触,所述官能化藻酸盐包含共价结合到藻酸盐的至少一个重复单元的含胺基团,其中含胺基团包含一氧化氮供体,其中一氧化氮供体产生一氧化氮,并且其中一氧化氮破坏粘液层中的粘蛋白-粘蛋白相互作用,从而减少粘液粘弹性。在若干实施方案中,粘液层由多种微生物的存在产生。在若干实施方案中,微生物包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在若干实施方案中,微生物包含铜绿假单胞菌。在若干实施方案中,微生物包括洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)。在若干实施方案中,微生物有助于囊性纤维化的发展。在若干实施方案中,该方法还包括使粘液层与抗微生物剂接触。在若干实施方案中,抗微生物剂是阿莫西林。在若干实施方案中,抗微生物剂是头孢地尼。在若干实施方案中,抗微生物剂是四环素
[0069] 取决于实施方案,所述方法和用途使用本文公开的化合物,其配制用于通过局部途径、通过注射、通过摄取或通过吸入施用。在若干实施方案中,途径是吸入(例如,通过吸入器),并且释放NO的化合物的方法和用途用于治疗囊性纤维化。
[0070] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及具有小分子多胺的官能化高分子量藻酸盐,所述小分子多胺可以用N-二醇二氮烯鎓NO供体改性以产生能够具有多种和可调节释放动力学的释放NO的生物聚合物。藻酸盐骨架中的至少一个结构单元含有式I的结构单元。
[0071]
[0072] 任选地,藻酸盐的至少一个结构单元还包含式II的结构单元和/或式II'的结构单元。
[0073]
[0074] 有利地,在一些实施方案中,本文所述的藻酸盐是水溶性的,可调节NO储存量和NO释放动力学,和/或能够将NO递送至靶标。
[0075] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及制备藻酸盐的方法,所述藻酸盐包含至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元。
[0076] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及向受试者递送和/或释放NO的方法。在一些实施方案中,所述方法包括向受试者施用包含至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元的藻酸盐。
[0077] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及治疗受试者的疾病状态的方法。在一些实施方案中,该方法包括向受试者施用包含至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元的藻酸盐。
[0078] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及药物组合物,其包含藻酸盐,所述藻酸盐含有至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元,和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0079] 在一些实施方案中,本文公开的主题涉及通过使用包含至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元的藻酸盐来破坏、根除和/或预防生物膜的方法。
[0080] 在本文所述的若干实施方案中,NO从任一种释放一氧化氮的支架释放和/或产生。在其他实施方案中,NO、NO+和NO-中的一种或多种从任一种释放一氧化氮的支架释放和/或产生。
附图说明
[0081] 图1A和1B显示(图1A)来自释放NO的藻酸盐的实施方案的前1小时的实时NO释放曲线;和(图1B)总NO释放与时间的关系图。
[0082] 图2A和2B显示了释放NO的藻酸盐的实施方案的基于时间的杀菌效力。图2A显示了8mg/mL浓度的释放NO的藻酸盐物质的实施方案的杀菌效力。图2B显示快速释放NO的藻酸盐的实施方案在24小时时各自的最小生物膜根除浓度(MBEC24h)的杀菌效力。
[0083] 图3A和3B显示暴露于对照和释放NO的藻酸盐的实施方案的A549细胞的活力。具体而言,在MBEC24h下对抗(图3A)铜绿假单胞菌和(图3B)金黄色葡萄球菌。研究包括至少三次实验,其中误差条代表标准偏差。
[0084] 图4A-4D显示了Alg-DETA的实施方案(图4A)、(图4B)Alg-DPTA的实施方案、(图4C)Alg-PAPA的实施方案和(图4D)D2O中Alg-SPER的实施方案的代表性1H NMR谱。
[0085] 图5A-5D显示了Alg-DETA的实施方案(图5A)、(图5B)Alg-DPTA的实施方案、(图5C)Alg-PAPA的实施方案和(图5D)D2O中Alg-SPER的实施方案的代表性13C NMR谱。
[0086] 图6A-6D显示了(图6A)Alg-DETA/NO、(图6B)Alg-DPTA/NO的实施方案、(图6C)Alg-PAPA/NO的实施方案和(图6D)Alg-SPER/NO的实施方案的仲胺和N-二醇二氮烯鎓藻酸盐的实施方案的代表性UV-可见光谱
[0087] 图7A和7B显示了NO释放(填充标记)和对照(空心标记)藻酸盐对浮游生物(图7A)铜绿假单胞菌和(图7B)金黄色葡萄球菌的实施方案的抗细菌功效。对于所有测量,n≥3个合并实验。
[0088] 图8A和8B显示了NO释放(填充标记)和对照(空心标记)藻酸盐对(图8A)铜绿假单胞菌和(图8B)金黄色葡萄球菌生物膜的实施方案的抗生物膜功效。对于所有测量,n≥3个合并实验。
[0089] 图9A-9D显示用(图9A)PBS pH 7.4和用32mg/mL(图9B)藻酸盐(图9C)Alg-SPER的实施方案、(图9C)Alg-SPER/NO的实施方案和(图9D)Alg-SPER/NO的实施方案处理24小时的A549细胞的代表性显微镜图像。
[0090] 图10显示了Alg-DETA/释放NO的藻酸盐的实施方案的UV-可见光谱。将330nm附近的区域加框以突出显示即使在PBS pH 7.4中释放NO 24小时后也不存在对应于亚硝胺形成的尖峰。
[0091] 图11显示了Alg-DPTA/释放NO的藻酸盐的实施方案的UV-可见光谱。将330nm附近的区域加框以突出显示即使在PBS pH 7.4中释放NO 24小时后也不存在对应于亚硝胺形成的尖峰。
[0092] 图12显示了Alg-PAPA/释放NO的藻酸盐的实施方案的UV-可见光谱。将330nm附近的区域加框以突出显示即使在PBS pH 7.4中释放NO 24小时后也不存在对应于亚硝胺形成的尖峰。
[0093] 图13显示了Alg-SPER/释放NO的藻酸盐的实施方案的UV-可见光谱。将330nm附近的区域加框以突出显示即使在PBS pH 7.4中释放NO 24小时后也不存在对应于亚硝胺形成的尖峰。
[0094] 图14显示了氧化降解为壳聚糖寡糖(CSO)暴露于HBE粘蛋白的耗散随时间的变化。显示了第3、第5、第7、第9、第11和第13个泛音(overtone)。黑色箭头表示PBS漂洗,虚线箭头表示CSO-1引入。
[0095] 图15显示了藻酸盐随时间的耗散变化。显示了第3、第5、第7、第9、第11和第13个泛音。黑色箭头表示PBS漂洗,虚线箭头表示Alg引入。
[0096] 图16A显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量,图16B显示了在37℃下用藻酸盐生物聚合物处理18小时后HBE粘液在10rad/s下的复数粘度。(*p<0.05,**p<0.01)。
[0097] 图17A显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量,图17B显示了在37℃下用AOD和HA生物聚合物处理18小时后HBE粘液在10rad/s下的复数粘度。(*p<0.01,**p<0.001)。
[0098] 图18显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量。

具体实施方式

[0099] 需要新的抗菌剂,一氧化氮(NO)是一种内源性产生的广谱抗菌剂,能够根除浮游细菌和生物膜,主要是通过形成引起对微生物DNA和膜结构的氧化性和亚硝化损害的NO副产物(如过氧亚硝酸盐和三氧化二氮)。NO发挥其抗菌作用的广泛机制使得细菌不太可能产生抗性。然而,与输送气态NO相关的困难需要使用能够在特定环境条件下储存和释放NO的分子NO供体。特别地,N-二醇二氮烯鎓NO供体由于其在生理条件下的自发的、质子引发的NO释放而引起了对受控NO递送中的应用的兴趣。可以基于若干参数调节NO释放动力学,例如pH、温度和如本文所述的前体胺的化学结构。尽管低分子量N-二醇二氮烯鎓NO供体已广泛用作治疗剂,但间接NO递送至特定作用位点和脱靶毒性仍然是一个问题。因此,需要开发大分子NO释放支架作为替代递送剂,其可以被调整以控制和定位感兴趣位点处的NO释放(例如,树枝状大分子、二氧化纳米颗粒)。
[0100] 一些实施方案涉及化学改性以储存和释放一氧化氮(NO)的高分子量藻酸盐。在一些实施方案中,首先使用偶联化学(例如,碳二亚胺化学)用一系列小分子胺基团改性藻酸盐羧酸部分。在一些实施方案中,偶联反应产生包含仲胺的藻酸盐。在一些实施方案中,仲胺与加压的NO气体反应以形成N-二醇二氮烯鎓NO供体。在一些实施方案中,本文所述的所得的释放NO的大分子藻酸盐具有一系列NO释放(μmolNO·mg-1)性质。在一些实施方案中,所得的释放NO的大分子藻酸盐具有不同的NO释放动力学(例如,t1/2)。在一些实施方案中,藻酸盐的释放动力学取决于前体胺结构。
[0101] 生物大分子如壳聚糖、纤维素等由于其低毒性和生物降解性而代表潜在的NO供体支架。然而,基于聚合物如PLGA和壳聚糖的高分子量生物大分子具有低水溶性和低的一氧化氮载量。在一些实施方案中,本发明公开的释放一氧化氮(NO)的藻酸盐有利地是可生物降解的、水溶性的和/或在NO负载量、储存和释放方面可调节的。在一些实施方案中,这些性质中的一种或多种有助于本发明公开的藻酸盐在治疗剂和/或治疗疾病状态中的有用性,其中水溶性治疗剂是有利的,例如在细菌的治疗中。根据一些实施方案,本发明公开的官能化NO释放藻酸盐具有的相对于已知NO释放颗粒的一些优点包括但不限于以下一种或多种:
[0102] 1)在若干实施方案中,通过使含胺链与非官能化藻酸盐接触,产生有效且独特的合成路线和所得化学组合物;
[0103] 2)生成的一氧化氮释放支架的NO储存和NO释放动力学可以针对特定应用进行调整。在若干实施方案中,通过改变例如式I的官能化单体的类型和/或数量来实现该调节。在若干实施方案中,在所产生的一氧化氮释放支架中的胺的额外官能化,例如通过不同疏水性/亲水性的化合物,进一步使得能够控制NO释放动力学。实际上,本发明公开的官能化藻酸盐观察到优异的NO储存;
[0104] 3)与颗粒相反,本文所述的官能化藻酸盐是水溶性的,促进了更广泛的应用,包括需要水溶性的生物医学应用。据信,释放NO的壳多糖不是水溶性的。因此,在若干实施方案中,本发明公开的水溶性官能化藻酸盐可以容易地渗透和根除生物膜;和
[0105] 4)减少可能产生不良影响的副产物或化合物的产生。例如,即使在PBSpH 7.4中释放NO 24小时后,在本文公开和/或测试的任何NO释放藻酸盐的UV-可见光谱中未观察到亚硝胺的存在。因此,在一些实施方案中,在显著NO释放之前或之后,通过UV-可见光谱不能检测到亚硝胺的形成。亚硝胺与动物癌症的形成有关。
[0106] 在一些实施方案中,仲胺基团直接影响N-二醇二氮烯鎓的稳定性,允许控制NO储存和释放动力学。释放NO的材料的抗菌功效取决于NO有效负载和相关的释放动力学。本文公开了藻酸盐在NO释放动力学、总NO储存和胺结构方面的杀菌功效。
[0107] 本文描述的主题可以以不同的形式体现,并且不应该被解释为限于这里阐述的实施方案。相反,提供这些实施方案是为了说明,并且使得本公开彻底和完整,并且将本主题的范围传达给本领域技术人员。例如,关于一个实施方案示出的特征可以结合到其他实施方案中,并且可以删除关于特定实施方案示出的特征以提供另一个实施方案。另外,鉴于本公开,本文考虑对本文提出的实施方案的许多变化和添加,其不脱离本主题。
[0108] 除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本主题所述领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在本文主题的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,并不旨在限制主题。
[0109] 如本文所用,“一个”、“一种”或“该”可以表示一个或多于一个。例如,“一个”NO释放部分可以表示单个或多个。
[0110] 同样如本文所用,“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合,以及当在替代方案(“或”)中解释时缺乏组合。
[0111] 此外,当提及诸如当前主题的化合物或药剂的量、剂量、时间、温度等的可测量值时,术语“约”意指包括指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。
[0112] 如本文所用,术语“有效量”是指给予患有病症、疾病或疾患的受试者调节作用(其例如可以是有益作用)的官能化藻酸盐的量,所述调节作用包括改善受试者的状况(例如一种或多种症状),延迟或减少病症的进展,预防或延迟疾病的发作,和/或临床参数、疾病或疾患的变化等,如本领域所熟知的。例如,有效量可以指将受试者的病症改善至少5%的组合物、化合物或药剂的量,例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。在一些实施方案中,病症的改善可以是感染的减少。在一些实施方案中,改善可以是减少表面上或受试者中的细菌负荷(例如,生物负载)。在一些实施方案中,粘液层的厚度、产量或其他特征的减少是改善。可以改变本发明公开主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平,以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素,包括组合物的活性、制剂、给药途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病症的严重程度、以及所治疗受试者的身体状况和既往病史。优选地,施用最小剂量,并且在没有剂量限制性毒性的情况下将剂量升级至最低有效量。本文考虑了有效剂量的确定和调整,以及何时以及如何进行这种调整的评估。
[0113] “治疗(Treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指给予患有病症、疾病或疾患的受试者调节作用(其例如可以是有益作用)的任何作用类型,所述调节作用包括改善受试者的状况(例如一种或多种症状),延迟或减少病症的进展,和/或临床参数、疾病或疾患的变化等,如本领域所熟知的。
[0114] 术语“破坏”和“根除”是指本发明公开的官能化藻酸盐对抗生物膜的能力。生物膜可以被部分根除或破坏,这意味着细胞不再彼此附着或附着到表面。生物膜可以被完全根除,这意味着生物膜在很大程度上不再是相互连接的、粘性的或连续的细胞网络。取决于实施方案,生物膜(或细菌)减少至少约20%、约30%、约40%、约50%、约60%或更多。在若干实施方案中,生物膜基本上被根除,使得生物膜不再能够例如产生引起感染症状的环境(例如,局部环境)。
[0115] 如本文所用,术语“水溶性”是指藻酸盐能够溶解在水中。在一些实施方案中,本文公开的水溶性官能化藻酸盐是可溶的,使得每mL水溶解>20mg官能化藻酸盐。在一些实施方案中,本文公开的水溶性官能化藻酸盐是可溶的,使得每mL水溶解>50mg官能化藻酸盐。在一些实施方案中,本文公开的水溶性官能化藻酸盐是可溶的,使得每mL水溶解>75mg官能化藻酸盐。在一些实施方案中,本文公开的水溶性官能化藻酸盐是可溶的,使得每mL水溶解>100mg官能化藻酸盐。在一些实施方案中,本文公开的水溶性官能化藻酸盐是可溶于水至浓度大于或等于约10mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL的藻酸盐,或包括和/或跨越上述值的范围。
[0116] 如本文所用,术语“高分子量”是指聚合物的分子量>10kDa。特别有用的藻酸盐是尺寸范围为10kDa至1000kDa、50kDa至800kDa、200kDa至600kDa或300kDa至400kDa的聚合物。在一些实施方案中,“高分子量”聚合物是分子量大于或等于约10kDa、50kDa、200kDa、300kDa、400kDa、600kDa、800kDa、1000kDa或包括和/或跨越上述值的范围的聚合物。
[0117] 术语“一氧化氮供体”或“NO供体”是指提供、释放和/或直接或间接转移一氧化氮物质和/或刺激体内内源性一氧化氮生成和/或提高体内内源性一氧化氮水平的物质,其使得一氧化氮物质的生物活性在预期的作用位点表达。
[0118] 术语“释放一氧化氮”是指提供、释放和/或直接或间接转移三种氧化还原形式的一氧化氮(NO+、NO-、NO)中的任何一种(或两种或更多种)的物种和/或提供、释放和/或直接或间接转移三种氧化还原形式的一氧化氮(NO+、NO-、NO)中的任何一种(或两种或更多种)的方法。在一些实施方案中,完成一氧化氮释放,使得一氧化氮物质的生物活性在预期的作用位点表达。
[0119] 如本文所用的术语“微生物感染”是指细菌、真菌、病毒、酵母感染,以及其他微生物及其组合。
[0120] 在一些实施方案中,在本文公开的许多实施方案中治疗的“患者”或“受试者”是人类患者,但应理解,本发明公开的主题的原理表明本发明公开的主题是对于所有脊椎动物物种有效的,包括哺乳动物,其旨在包括在术语“受试者”和“患者”中。合适的受试者通常是哺乳动物受试者。本文描述的主题可用于研究以及兽医和医学应用。本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、绵羊、山羊、猪、、猫、狗、兔、啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、猴子等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。
[0121] 在一些实施方案中,受试者可以是需要本文公开的方法的受试者,其可以是正在经历疾病状态和/或预期经历疾病状态的受试者,并且本文描述的主题的方法和组合物用于治疗和/或预防性治疗。
[0122] 如本文所用,术语“官能化藻酸盐”是指含有一种或多种共价改性单体的藻酸盐聚合物。这种“官能化藻酸盐”可以或可以不具有连接的一氧化氮供体部分。如本文所用,“共价改性单体”是指作为甘露糖酸和/或古洛糖醛酸单体的类似物或衍生物的单体。术语“单体”是指单个单元,其可以或可以不与其他糖连接以形成例如藻酸盐。因此,术语单体包括聚合物链中的单体单元(例如,重复单元)。单体的非限制性实例是古洛糖醛酸和甘露糖醛酸。
[0123] 藻酸盐是从藻类来源收获的天然存在的阴离子聚合物,由1,4-连接的α-1-古洛糖醛酸(G)和β-d-甘露糖醛酸(M)单元组成。
[0124]
[0125] 藻酸盐是一种生物聚合物,即使在高分子量(包括超过200kDa的分子量)下也能保持其水溶性。有利地,本文公开的官能化藻酸盐是水溶性的。在一些实施方案中,本文公开的官能化藻酸盐具有100mg/mL或更高的溶解度,如本文其他地方所公开的。藻酸盐已经用于许多生物医学应用,包括作为伤口敷料、药物递送载体和用于囊性纤维化的粘蛋白改性剂等。藻酸盐可以使用羟基和羧酸官能团进行化学改性。有用的藻酸盐的有利特征是碳水化合物主链上的可用羧酸,其根据本文所述的方法衍生化以形成释放NO的藻酸盐。
[0126] 如本文别处所公开的,一些实施方案涉及官能化的藻酸盐。在一些实施方案中,官能化藻酸盐包含一个或多个共价改性的式I单体
[0127]
[0128] 任选地,至少一个式II的单体和/或任选的至少一个式II'的单体:
[0129]
[0130] 其中,在每种情况下R1、R1'、R2和R2'各自独立地选自氢、C1-5烷基(C=O)-和C1-5烷基;
[0131] R3在每种情况下为氢或C1-5烷基;
[0132] R4在每种情况下为氢或C1-5烷基;
[0133] Q是–(CRaRb)v-;
[0134] 其中Ra和Rb独立地为氢或C1-5烷基;v是2到6的整数;
[0135] A是
[0136]
[0137] 其中,L是S、O或N;和
[0138] G在每种情况下是氢,与L一起形成一氧化氮供体,或者不存在;
[0139] p是1到10的整数;
[0140] B选自氢、–Y-Z和C1-5烷基,其中C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或–NRc(CO)Rd取代;
[0141] 其中Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基,
[0142] 其中Y具有以下结构:
[0143]
[0144] 其中Rp、Rq、Rs和Rt在每种情况下独立地为氢或羟基;和
[0145] k是1至20的整数;和
[0146] Z的结构为:
[0147]
[0148] 其中j在每种情况下是1至100的整数;和
[0149] 其中至少一种式I单体含有一氧化氮供体。
[0150] 在若干实施方案中,官能化藻酸盐,其中一氧化氮供体选自二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。在一些实施方案中,一氧化氮供体(例如,G与L一起)可以在结构上描述为:
[0151]
[0152] 在一些实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
[0153] 在一些实施方案中,R1、R1'、R2和R2'为氢或C1-5烷基;
[0154] R3是氢;和/或
[0155] R4在每种情况下是氢或C1-5烷基。
[0156] 在一些实施方案中,R1、R1'、R2、R2'、R3和R4是氢。
[0157] 在一些实施方案中,R1、R1'、R2、R2'、R3和R4各自独立地选自氢、-((CH2)nO)m-H、-(((CH2)nO)m-(CH2)oH和C1-5烷基。在一些实施方案中,m、n和o独立地是0至10的整数。在一些实施方案中,m、n和o独立地是0至6的整数。在一些实施方案中,n为2。
[0158] 在一些实施方案中,v为2或3;
[0159] L是N;和/或
[0160] p是1至3的整数。
[0161] 在一些实施方案中,B是–Y-Z。
[0162] 在一些实施方案中,Y具有以下结构:
[0163]
[0164] 在一些实施方案中,Z具有以下结构:
[0165]
[0166] 在一些实施方案中,B选自氢和C1-5烷基,其中C1-5烷基任选被氨基、羟基、腈、CO2H、单(C1-6)烷基氨基-、二(C1-6)烷基氨基-、-(CO)NRcRd或–NRc(CO)Rd取代,
[0167] 其中Rc和Rd各自独立地选自氢和C1-6烷基。
[0168] 在一些实施方案中,B是氢或未取代的C1-5烷基。
[0169] 在一些实施方案中,B为氢或C3烷基。
[0170] 在一些实施方案中,在每种情况下,-(Q-A-)p-B具有以下结构中的一个或多个:
[0171]
[0172] 在一些实施方案中,G与结构vi、vii、viii或ix中的氮一起形成一氧化氮供体(例如,通过用G取代vi、vii、viii或ix中的一个或多个中的胺H以提供L-G)。
[0173] 在一些实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
[0174] 在一些实施方案中,-(Q-A-)p-B具有以下结构:
[0175]
[0176] 在一些实施方案中,G与结构vii中的氮一起形成一氧化氮供体。
[0177] 在一些实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
[0178] 在一些实施方案中,所述官能化的藻酸盐包括式Ia的一个或多个共价改性的单体:
[0179]
[0180] 和任选地,至少一个式II'a的单体:
[0181]
[0182] 其中R1、R1'、R2、R2'、R3、R4和-(Q-A-)p-B如本文其他地方所定义。
[0183] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐包含式I、Ia、II、II′和/或IIa的一个或多个共价改性单体,其中R1、R1'、R2、R2'、R3、R4和-(Q-A-)p-B如本文其他地方所定义。
[0184] 在一些实施方案中,-(Q-A-)p-B具有选自以下的一个或多个的结构:
[0185]
[0186]
[0187] 在一些实施方案中, 如本文其它地方所示,具有选自以下的一个或多个的结构:
[0188]
[0189] 在一些实施方案中, 如本文其它地方所示,具有选自以下的一个或多个的结构:
[0190]
[0191]
[0192] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐是水溶性的。
[0193] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐的总可释放一氧化氮储存量在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol NO的范围。在一些实施方案中,总可释放一氧化氮储存量为每毫克官能化藻酸盐约0.15-0.9、0.2-0.8、0.3-0.7或0.4-0.6μmol的NO。在一些实施方案中,基于每毫克官能化藻酸盐的μmol NO,官能化藻酸盐具有大于或等于约0.1、0.15、0.2、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0的总可释放一氧化氮储存量,或者包括和/或跨越上述值的范围。
[0194] 在若干实施方案中,官能化的藻酸盐,其中NO释放的半衰期为0.1-24小时。在一些实施方案中,半衰期为约0.25-18小时、0.5-13小时、1-8小时、2-6小时或3-4小时。在一些实施方案中,官能化藻酸盐的NO释放半衰期大于或等于约:0.1小时,0.25小时,0.5小时,1小时,2小时,3小时,4小时,6小时,8小时,13小时,18小时,24小时,或包括和/或跨越上述值的范围。
[0195] 在一些实施方案中,NO释放的总持续时间为1-60小时。在一些实施方案中,总持续时间在约2-50小时、3-40小时、4-30小时、5-20小时或6-10小时的范围内。在一些实施方案中,总持续时间大于或等于约:1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,10小时,20小时,30小时,40小时,50小时,60小时,或包括和/或跨越上述值的范围。
[0196] 在一些实施方案中,4小时后的总NO释放在每毫克官能化藻酸盐0.1-1.0μmol NO的范围内。在一些实施方案中,4小时后的总可释放一氧化氮储存量为每毫克官能化藻酸盐约0.15-0.9、0.2-0.8、0.3-0.7或0.4-0.6μmol的NO。在一些实施方案中,4小时后的总可释放一氧化氮储存量(以每毫克官能化藻酸盐的μmol NO计)大于或等于约:0.1、0.15、0.2、0.3、0.3、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或包括和/或跨越上述值的范围。
[0197] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐中超过15%的单体(例如,重复单元)是式I的单体。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中所述单体的百分比是大于20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的式I单体。在一些实施方案中,具有式I的官能化藻酸盐中的单体百分比大于或等于约:20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%、95%或99%,或包括和/或跨越上述值的范围。
[0198] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐的分子量为200-600kDa。在一些实施方案中,官能化藻酸盐的分子量为约1kDa至1000kDa、5kDa至900kDa、50kDa至800kDa、200kDa至600kDa或300kDa至400kDa。在一些实施方案中,官能化藻酸盐的分子量大于或等于约:1kDa、5kDa、10kDa、50kDa、200kDa、300kDa、400kDa、600kDa、800kDa、1000kDa,或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方案中,官能化藻酸盐的分子量小于或等于约:5kDa、10kDa、50kDa、
200kDa、300kDa、400kDa、600kDa、800kDa、1000kDa,或包括和/或跨越上述值的范围。
[0199] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐包括两个或更多个不同的式I的共价改性单体。
[0200] 有用的NO释放部分包括本领域已知的任何NO释放基团。在一些实施方案中,NO释放部分是NO释放基团的残基,即NO供体,其与官能化藻酸盐上的N共价结合。在一些实施方案中,NO供体与藻酸盐上的与其结合的原子一起形成选自二醇二氮烯鎓的部分,作为亚硝基硫醇基团的一部分的-NO,例如亚硝胺、羟基亚硝胺、羟胺、羟基脲及其组合。优选地,NO释放部分是二醇二氮烯鎓。在一些实施方案中,这些基团可以盐的形式存在。
[0201] 在一些实施方案中,NO供体是N-二醇二氮烯鎓(即,1-氨基取代的二氮烯-1-鎓-1,2-二醇盐)。由于它们在生物条件下自发产生NO的能力,N-二醇二氮烯鎓作为NO供体特别有吸引力。已经使用一系列亲核残基合成了几种N-二醇二氮烯鎓化合物,所述亲核残基包括伯胺和仲胺、多胺和仲氨基酸。在N-二醇二氮烯鎓的形成中,一当量的胺在升高的压力下与两当量的一氧化氮反应。(例如,醇盐如甲醇盐)从胺氮中除去质子以产生阴离子,稳定的[N(O)NO]基团。在环境条件下稳定的同时,N-二醇二氮烯鎓在水性介质中自发分解以产生NO,其速率取决于pH、温度和/或胺部分的结构。例如,已开发N-二醇二氮烯鎓改性的脯氨酸(PROLI/NO)、2-(二甲基氨基)-乙基腐胺(DMAEP/NO)、N,N-二甲基己二胺(DMHD/NO)和二亚乙基三胺(DETA/NO)作为在pH7.4和37℃下具有半衰期为2秒至20小时的不同NO释放半衰期的小分子NO供体。
[0202] 在一些实施方案中,在N-二醇二氮烯鎓形成期间不存在亚硝胺。
[0203] 在一些实施方案中,在NO释放期间不存在亚硝胺。在一些实施方案中,NO释放可以在约0.01小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、48小时或60小时的时期内发生。在一些实施方案中,NO释放发生在小于或等于约:0.01小时,0.1小时,0.25小时,0.5小时,1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,10小时,15小时,20小时,24小时,36小时,48小时,60小时,或包括和/或跨越上述值的范围。如本文所用,短语“不存在亚硝胺”是指通过UV-可见光谱(或通过本领域其他可接受的方法)测定是不可检测的亚硝胺水平。
[0204] 术语“氨基”和“胺”是指含氮基团,例如NR3、NH3、NHR2和NH2R,其中R可以如本文其他地方所述。因此,如本文所用的“氨基”可以指伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施方案中,氨基中的一个R可以是二醇二氮烯鎓(即,NONO)。
[0205] 术语“季胺”是指具有另外的(即,第四)基团例如氢或与氮键合的烷基的氨基。因此,季胺带有正电荷。
[0206] 术语“烷基”表示含有1-24个碳原子例如1-12个碳原子的直链或支链链。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。无论何时在本文出现,诸如“1至24”或1-24的数值范围指的是给定范围内的每个整数;例如,“1至10个碳原子”或“C1-C5烷基”是指烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成,最多且包括10个碳原子,(尽管本定义还涵盖其中没有指定数值范围例如1至24的术语“烷基”的出现)。仅举例来说,“C1-C5烷基”表示烷基链中有一至五个碳原子,即烷基链选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(支链的和直链的)等等。常用的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。
[0207] 给定整数范围时,范围包括落入范围内的任何数字和定义范围末端的数字。例如,当使用术语“1至10的整数”时,该范围中包括的整数是1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
[0208] 术语“共价结合”或“共价连接”是指通过共用一对或多对电子形成的化学键。
[0209] 如本文所用,术语“接触”是指紧邻的试剂,从而可发生反应。
[0210] 在一些实施方案中,取代基和/或变量的组合仅在这样的组合产生符合每个原子的已知化合价的化合物时是允许的。
[0211] 一些实施方案涉及制备官能化藻酸盐的方法。在一些实施方案中,该方法包括以下步骤中的一个或多个:
[0212] i.使式III的胺在肽偶联试剂存在下接触
[0213]
[0214] 藻酸盐,其中R4、Q、A、B和p如上所述,其中制备共价改性的式I单体
[0215]
[0216] R4、Q、A、B和p如上所述;和
[0217] ii.使含有共价改性的式I单体的藻酸盐接触
[0218]
[0219] 一氧化氮源,其中,
[0220] R1、R2、R4、Q、A、B和p如上所述,其中制备了官能化的藻酸盐。
[0221] 在一些实施方案中,R1和R2是氢或C1-5烷基;
[0222] R3为氢或C1-5烷基;和
[0223] R4在每种情况下为氢或C1-5烷基;
[0224] v为2或3;
[0225] L是N;和
[0226] p是1至3的整数。
[0227] 在一些实施方案中,-(Q-A-)p-B具有以下结构中的一种或多种:
[0228]
[0229] 在一些实施方案中,G与氮一起形成一氧化氮供体。
[0230] 在一些实施方案中,一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
[0231] 官能化的藻酸盐可以通过任何可用的藻酸盐聚合物的共价改性来制备。可以使用本领域已知的各种合成方法将共价改性的单体引入藻酸盐聚合物中。
[0232] 藻酸盐的代表性化学结构如下:
[0233]
[0234] 各个单元标记为甘露糖醛酸(M)和古洛糖醛酸(G)单元。该表示描述了非限制性的潜在聚合物键,其被指定为代表性藻酸盐内的G嵌段、M嵌段、GM嵌段和MG嵌段。在一些实施方案中,M或G中的至少一个被式I的单体取代。在一些实施方案中,官能化的藻酸盐中式I的单体的百分比为至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%。在一些实施方案中,官能化藻酸盐还包含一定百分比的式II单体。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中式II单体的百分比为至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中式II单体的百分比大于或等于约:15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、至少95%、
99%或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中式I和式II的单体的组合百分比为至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少
60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中式I和式II的单体的组合百分比大于或等于约:15%、20%、25%、30%、40%、50%、
60%、70%、80%、90%、至少95%、99%或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方案中,式II的单体是未改性的M或G单体。在一些实施方案中,式I与式II单体的比率可为约:
30:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:20、1:30,上述比率之间的比率,或其他。
[0235] 藻酸盐中这些G和M嵌段的比例、分布和长度可以影响藻酸盐聚合物的化学和物理性质。在一些实施方案中,使用“高G藻酸盐”的实施方案。在高G藻酸盐中,存在比其他类型的单体更多的古洛糖醛酸酯单体,或者存在比甘露糖醛酸单体更多的古洛糖醛酸酯单体。例如,高G藻酸盐可包含超过藻酸盐单体的约50%或至少约65%作为古洛糖醛酸盐的摩尔百分比或重量百分比。在一些实施方案中,使用“高-M藻酸盐”的实施方案。在高M藻酸盐中,存在比其他类型单体更多的甘露糖醛酸单体,或者存在比古洛糖醛酸单体更多的甘露糖醛酸单体。例如,高M藻酸盐可包含超过藻酸盐单体的约50%或至少约65%作为甘露糖醛酸酯的摩尔百分比或重量百分比。在一些实施方案中,存在与G单体一样多的M单体。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中“G”单体的百分比为至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,或至少99%。在一些实施方案中,官能化藻酸盐中“M”单体的百分比为至少15%,至少20%,至少25%,至少
30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,或至少
99%。
[0236] 在一些实施方案中,通过其羧酸部分的酯化和/或酰胺化,共价改性甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体。共价改性期间反应物的化学计量变化可用于改变官能化藻酸盐中共价改性单体的量。例如,在一个实施方案中,在官能化藻酸盐形成期间EDC:单体或胺:单体的化学计量比可以是10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1或0.5:1。优选地,该比例为2:1的EDC:单体和/或2:1的胺:单体。除了下面讨论的反应之外,用于共价改性甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单体的替代合成方法也是本领域已知的。(参见例如Smith,M.和March,J.,March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,5th ed.,New York:Wiley,2001)。此外,本领域已知其他反应条件的变化,例如溶剂、pH和温度。
[0237] 如本文所用,“缓冲剂”是当向其中加入酸或碱时抵抗pH变化的溶液。缓冲剂通常包括弱的酸或碱与其一种盐。缓冲剂的非限制性实例是Tris、HEPES、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、三乙基乙酸铵缓冲液和三乙基碳酸氢铵缓冲液。缓冲液可具有指定的浓度和/或pH。在一个实施方案中,缓冲液的pH为约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12或12.5。在一些实施方案中,pH为约7.3至约11。在其他实施方案中,pH为约7.8至约9.3。在一些实施方案中,pH为约6.5。在一些实施方案中,pH为约7.5。在一些实施方案中,pH为约8.5。在一些实施方案中,肽偶联反应可以在缓冲溶液中进行。
[0238] 如本文所用,术语“肽偶联试剂”是指用于促进胺和羧酸之间的反应以形成酰胺键的化学品。在一些实施方案中,合适的肽偶联试剂包括但不限于碳二亚胺试剂,例如二环己基碳二亚胺(DCC)或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC);鏻试剂,例如(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP);和脲试剂,例如O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟酸盐(TBTU)。在一些实施方案中,一种或多种肽偶联试剂可用于通过藻酸盐的羧酸将含伯胺或仲胺的基团与藻酸盐共价连接。在一些实施方案中,如本文其他地方所述,双(3-氨基丙基)胺(DPTA)、二亚乙基三胺(DETA)、N-丙基-1,3-丙二胺(PAPA)、精胺(SPER)中的一种或多种可以被官能化到藻酸盐中以提供官能化的藻酸盐。在一些实施方案中,肽偶联试剂与一种或多种化合物一起使用以提供具有-(Q-A-)p-B的官能化藻酸盐,所述-(Q-A-)p-B具有选自vi、vii、viii和ix的一种或多种结构。
[0239] 如本文所用,术语“一氧化氮源”是指可用于形成例如二醇二氮烯鎓NO供体的一氧化氮源。一氧化氮源的非限制性实例是NO气体。
[0240] 在一些实施方案中,提供了向受试者递送一氧化氮的方法,包括向受试者施用有效量的官能化藻酸盐。
[0241] 在一些实施方案中,提供了治疗疾病状态的方法,包括向有此需要的受试者施用有效量的官能化藻酸盐。在一些实施方案中,疾病状态选自癌症,心血管疾病,微生物感染;由血液暴露于医疗器械引起的血小板聚集和血小板粘附;细胞增殖异常导致的病理状况;
移植排斥,自身免疫性疾病,炎症,血管疾病;疤痕组织;伤口收缩,再狭窄,疼痛,发烧,胃肠道疾病,呼吸系统疾病,性功能障碍、性传播疾病和/或囊性纤维化。在一些实施方案中,疾病状态是微生物感染,例如细菌感染。在一些实施方案中,微生物感染与另一种疾病状态如囊性纤维化相关。
[0242] 在一些实施方案中,提供了破坏、根除或预防生物膜的方法。在一些实施方案中,该方法包括使含有生物膜或易受形成或占据一些或全部表面或区域的生物膜影响的表面或区域与本文所述的官能化藻酸盐接触。术语“生物膜”旨在表示一种或多种微生物的聚集体,其中细胞通常在表面上彼此粘附。大多数任何自由漂浮的微生物都可以形成生物膜和/或附着在表面上。微生物可以通过范德瓦尔斯力通过弱的可逆粘附力粘附到表面或彼此上。微生物可以使用细胞粘附或诸如菌毛的结构更永久地锚定。
[0243] 在一些实施方案中,提供了包含官能化藻酸盐的药物制剂。在一些实施方案中,药物制剂包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,官能化藻酸盐是水溶性的,如本文其他地方所述。
[0244] 如本文所用,“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不合需要的材料,即,该材料可以与本文所述主题的组合物一起施用于个体,而不会引起显著的有害生物学效应或与包含它的组合物的任何其他组分以有害的方式相互作用。自然地选择该材料以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化(参见,例如,Remington's Pharmaceutical Science;20ed.2005)。用于本文所述主题的组合物的药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于无菌无热原水和无菌无热原生理盐水溶液。
[0245] 在一些实施方案中,本发明公开的治疗组合物包含一种组合物,所述组合物包含本发明公开的释放一氧化氮的藻酸盐和药学上可接受的赋形剂。合适的组合物包括但不限于水性和非水性无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质;以及水性和非水性无菌悬浮液,其可包括悬浮剂和增稠剂
[0246] 在一些实施方案中,本文公开的方法中使用的组合物可以采取诸如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式,并且可以含有配制剂,例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可以是粉末形式,用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。
[0247] 在一些实施方案中,本文其他地方公开的治疗组合物可以单位剂量或多剂量容器存在,例如密封的安瓿和小瓶,并且可以冷冻或冷冻干燥(冻干)状态储存,仅需要使用前立即添加无菌液体载体。
[0248] 在一些实施方案中,对于口服给药,本文其他地方公开的组合物可以采取例如通过常规技术用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂的形式,赋形剂例如粘合剂(例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷或羟丙基甲基纤维素);填料(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢);润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅);崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠);或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域已知的方法包衣。例如,治疗剂可以与氢氯噻嗪组合配制,并且作为pH稳定的核心,其具有肠溶或延迟释放包衣,包衣保护治疗剂直至其到达目标器官。
[0249] “药学上可接受的赋形剂”是指药物制剂中除活性成分外的成分,其对受试者无毒。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、载体、稳定剂或防腐剂。在一些实施方案中,本文公开的主题涉及包含官能化藻酸盐和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
[0250] 在一些实施方案中,可以制备公开的化合物的液体制剂。在一些实施方案中,用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式,或者它们可以作为干燥产品存在,用于在使用前用水或其它合适的载体构建。在一些实施方案中,这种液体制剂可以通过常规技术用药学上可接受的添加剂制备,例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶);非水性载体(如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油);和防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在一些实施方案中,制剂可以适当地含有缓冲盐、调味剂着色剂甜味剂。在一些实施方案中,口服给药制剂可以适当配制以提供活性化合物的控制释放。在一些实施方案中,对于口腔给药,组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
[0251] 在一些实施方案中,本文其他地方公开的化合物也可以配制成用于植入或注射的制剂。因此,例如,在一些实施方案中,化合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如,作为可接受的油中的乳液)和/或离子交换树脂和/或作为微溶衍生物(例如,作为微溶盐)配制。在一些实施方案中,化合物还可以配制成直肠组合物(例如,含有常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯的栓剂或保留灌肠剂)、乳膏或洗剂和/或透皮贴剂
[0252] 在一些实施方案中,提供了本文公开的化合物的药物制剂。在一些实施方案中,药物制剂适于通过吸入作为气雾剂给药。在一些实施方案中,本文所述的官能化藻酸盐以溶液和/或气溶胶形式配制。在一些实施方案中,这些制剂包含本文所述的释放NO的藻酸盐的溶液或悬浮液。在一些实施方案中,可将所需制剂置于小室中并雾化。在一些实施方案中,雾化可以通过压缩空气或通过超声能量来完成,以形成包含释放NO的藻酸盐的多个液滴或固体颗粒。例如,在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐可以通过吸入给药以治疗与囊性纤维化相关的细菌感染。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐可以提供双重作用的抗细菌和粘液溶解作用。在一些实施方案中,这种双重作用有益于囊性纤维化的治疗。
[0253] 囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因的功能障碍引起的遗传性疾病。CFTR蛋白用作氯离子和碳酸氢根离子的离子通道,其影响气道上皮细胞周围的pH和粘液粘弹性,这是由水、蛋白质、盐、脂质和粘蛋白组成的杯状细胞分泌的异质凝胶。这些通道的功能障碍导致上皮表面脱水和粘蛋白浓度增加。尽管CF影响所有产生粘液的器官,但肺病的进展是最危及生命的作用。CF中粘液的粘弹性增加有助于疾病的发病机理,因为从肺部去除病原体变得非常困难。增厚的粘液层粘附在气道上皮表面,粘膜纤毛清除失败,导致气道阻塞、细菌感染、慢性炎症和气道永久性结构损伤。
[0254] 粘性粘液的积聚为细菌生长提供了理想的环境,既是物理支持又是营养源,并导致气道进一步发炎。感染大约80%的CF成人的病原体如铜绿假单胞菌引起的肺部感染可能变成慢性,形成传统抗生素即使在高剂量下也不能根除的生物膜。此外,在CF气道中发现的异常粘液减轻了抗菌剂向菌落的渗透并导致慢性感染、肺阻塞和患者死亡。生物膜生长恶化了粘液流变学,因为募集到感染部位的中性粒细胞死亡并将DNA释放到粘液中,进一步增加粘度。CF患者的高弹性粘液与细菌定植和疾病严重程度恶化相关。
[0255] 大多数商业上可获得的CF治疗旨在控制粘液分泌过多并根除细菌感染。设计用于直接影响粘液流变学的目前使用的两种疗法是N-乙酰半胱氨酸(NAC)和阿法链道酶(dornase alfa),分别通过二硫键破坏和DNA的酶促降解来起作用。NAC的功效受到低效力和气道刺激的限制,而阿法链道酶治疗与上呼吸道刺激、皮疹、胸痛和结膜炎有关,一些患者对药物产生抗药性。此外,通过在粘性粘液中形成生物膜,CF铜病原体如铜绿假单胞菌在很大程度上受到保护而不受传统抗生素治疗(即妥布霉素和阿奇霉素)的影响。治疗后存活的细菌可以重建生物膜并促进抗生素抗性菌株。本文公开了改进的CF治疗剂,其结合细菌根除和降低粘液粘弹性以改善清除。
[0256] 囊性纤维化相关的细菌感染包括但不限于寡养单胞菌(stenotrophomonis)、胞内病毒分枝杆菌(mybacterium avium intracellulaire)和脓肿分枝杆菌(m.abcessus)、洋葱伯克霍尔德菌(burkhoderia cepacia)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染。在一些实施方案中,公开的释放NO的藻酸盐可用于治疗由寡养单胞菌、胞内病毒分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和/或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的一种或多种的感染。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐是粘液溶解的。在一些实施方案中,如本文其他地方所公开的,所公开的释放NO的藻酸盐既是粘液溶解的又是抗微生物的,并且为CF提供增强的治疗功效。
[0257] 在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐可以使与CF相关的粘液的粘度降低至少约20%、50%、70%、90%、95%或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐可以使与CF相关的粘液的弹性降低至少约10%、20%、50%、60%、80%或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐不会引起与CF相关的粘蛋白层的塌陷和/或保持粘蛋白层的厚度。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐不会增加和/或降低与CF相关的粘蛋白层的粘弹性。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐降低粘液的G'、G”和/或η*以促进药物通过粘液扩散。在一些实施方案中,所公开的释放NO的藻酸盐使粘液的G'、G”和/或η*降低至少约20%、50%、70%、90%、
95%或包括和/或跨越上述值的范围。
[0258] 在一些实施方案中,对于施用本文公开的组合物,可以进行基于施用于鼠动物模型的剂量外推人剂量的常规方法。在一些实施方案中,可以使用以下转换因子进行外推,以将小鼠剂量转换为人剂量:每kg人剂量=每kg小鼠剂量×12。在一些实施方案中,药物剂量也可以毫克/平方米体表面积给出,因为该方法而不是体重实现与某些代谢和排泄功能的良好相关性。此外,体表面积可用作成人和儿童以及不同动物物种中药物剂量的共同标准。简而言之,在任何给定物种中表示mg/kg剂量作为等效mg/sq m剂量,将该剂量乘以适当的
2
km因子。在成年人中,100mg/kg相当于100mg/kg×37kg/sqm=3700mg/m。
[0259] 在一些实施方案中,用于向受试者施用本发明公开主题的组合物的合适方法包括但不限于全身施用、肠胃外施用(包括血管内、肌肉内、动脉内施用)、口服递送、口腔递送、皮下施用、吸入、气管内安装、手术植入、透皮给药、局部注射和超高速注射/轰击。在一些实施方案中,在适用的情况下,连续输注可以增强目标位点处的药物积累。
[0260] 根据本发明公开的主题的方法使用的具体给药方式取决于各种因素,包括但不限于所用的药剂和/或载体、待治疗病症的严重程度、以及代谢的机制或在给药后活性剂的除去。
[0261] 在一些实施方案中,一种或多种另外的治疗剂可以与官能化的藻酸盐组合使用。在一些实施方案中,此类另外的药剂可以是包含官能化藻酸盐的制剂的一部分,或者在作为包含官能化藻酸盐的制剂之前、之后或同时(并行)作为单独的制剂给药。在一些实施方案中,此类另外的治疗剂特别包括抗癌治疗剂、抗微生物剂、止痛剂、抗炎剂、血管扩张剂和免疫抑制剂,以及可以增强被治疗的疾病或病症的缓解的任何其他已知治疗剂。在一些实施方案中,“并行地”意味着同时或足够接近以产生组合效果(即,并行地可以是同时地,或者它可以是在彼此之前或之后的短时间段内发生的两个或更多个事件)。在一些实施方案中,“并行地”施用两种或更多种化合物意指两种化合物在时间上足够紧密地施用,使得一种化合物的存在改变另一种的生物学效应。在一些实施方案中,两种化合物可以相同或不同的制剂或顺序给药。在一些实施方案中,并行施用可以通过在施用之前混合化合物,或通过以两种不同的制剂施用化合物来进行,例如,在相同的时间点但在不同的解剖部位或使用不同的施用途径。
[0262] 在一些实施方案中,与释放NO的藻酸盐组合使用的其他治疗剂的选择将取决于各种因素,包括但不限于疾病的类型、受试者的年龄和一般健康状况、疾病进展的侵略性、以及受试者耐受构成组合的药剂的能力。
[0263] 在一些实施方案中,另外的治疗剂是抗微生物剂。如本文所用,术语“抗微生物剂”是指杀死、抑制细菌、真菌、酵母或病毒生长或阻止细菌、真菌、酵母或病毒生长的任何试剂。可以掺入本发明公开的释放NO的官能化藻酸盐中以帮助治疗或预防微生物感染的合适的抗微生物剂包括但不限于抗生素,例如万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和丁胺卡那霉素。其他抗微生物剂包括抗菌剂,如2-对磺酰基苯胺基乙醇、4,4'-亚磺酰基二苯胺、4-磺酰胺基水杨酸、醋地砜(acediasulfone)、乙酰砜、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、阿帕西林、阿哌环素(apicycline)、阿普拉霉素、阿贝卡星、阿扑西林(aspoxicillin)、叠氮氯霉素(azidamfenicol)、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、巴姆霉素、比阿培南、布罗霉素、丁酰苷菌素(butirosin)、卷曲霉素、羧苄青霉素、碳霉素、卡芦莫南(carumonam)、头孢羟氨苄、头孢羟唑(cefamandole)、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢克定(cefclidin)、头孢地尼、头孢地嗪、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、cefininox、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替坦、头孢替安、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢丙烯、头孢沙定(cefroxadine)、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢三嗪、头孢唑喃、头孢氨苄、头孢、头孢菌素C、头孢拉定、氯霉素、金霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯米可林、粘菌素、环青霉素、氨苯砜、去甲环素、全膜壳素、达苄霉素、双氢链霉素、地红霉素、多西环素、依诺沙星、恩维霉素、epicillin、红霉素、氟氧头孢、阿司米星、庆大霉素、葡胺苯砜、苯丙砜、短杆菌肽S、短杆菌肽、格列帕沙星、愈创木霉素、海他西林、亚胺培南、异帕米星、交沙霉素、卡那霉素、亮霉素、林可霉素、洛美沙星、卢森霉素、淋巴环素、美乐霉素、美罗培南、美罗培南、美环素、微胶素、米地霉素、莫莫莫莫克林、莫匹罗星、纳替沙星、纳坦霉素、新霉素、奈替米星、诺氟沙星、竹桃霉素、土霉素、对磺胺基苄胺、帕尼培南、巴西霉素、帕米沙星、青霉素N、匹哌环素、吡哌酸、多粘菌素、伯霉素、喹辛西林、核糖霉素、利福胺、利福平、利福霉素SV、利福喷汀、利福昔明、瑞斯托菌素、利培南、六合霉素、劳力特霉素、罗红霉素、罗红霉素、沙拉唑磺胺嘧啶、三环素、西索米星、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、疏枝霉素、磺胺黄曲霉素、磺胺甲霜霉素、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、替考拉宁、替马沙星、替莫西林、四环素、四氢氧苄啶、噻苯尼考、噻唑砜、硫链菌素、替卡西林、提格莫南、妥布霉素、妥舒沙星、甲氧苄啶、红霉素、曲伐沙星、放线菌素和万古霉素。抗微生物剂还可包括抗真菌剂,例如两性霉素B、重氮丝氨酸、杀蝇素、氯苄青霉素、抑制素、菲律宾、真菌素、美帕曲霉素、制霉菌素、寡霉素、表霉素A、结核菌素、咪唑、三唑和灰黄霉素。在若干实施方案中,抗微生物剂选自阿莫西林、两性霉素B、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢地尼、头孢菌素C、氯霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、多西环素、红霉素、莫匹罗星、利福平、四环素和万古霉素。
[0264] 在一些实施方案中,释放NO的藻酸盐可以掺入聚合物膜中。在一些实施方案中,这种掺入可以通过将藻酸盐物理嵌入聚合物表面,通过将藻酸盐静电结合到聚合物表面上,或通过将官能化藻酸盐共价连接到聚合物表面上的反应性基团上。在一些实施方案中,官能化的藻酸盐可以混合到液体聚合物前体的溶液中,当聚合物固化时,其被包埋在聚合物基质中。在一些实施方案中,可聚合基团也可用于进一步官能化藻酸盐,因此,藻酸盐可在聚合过程中共聚合成聚合物。在一些实施方案中,可以掺入释放NO的藻酸盐的合适聚合物包括聚烯烃,例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯和聚偏二乙烯,以及聚酯、聚醚、聚氨酯等。在一些实施方案中,聚氨酯可包括医学上分段的聚氨酯。医学上分段的聚氨酯还可以包括一个或多个膨胀剂部分,例如亚烷基链,其为聚合物增加额外的长度或重量。这种聚氨酯通常也是无毒的。医学上分段的聚氨酯的一个例子是
[0265] 在一些实施方案中,释放NO的藻酸盐可以掺入可生物降解和/或生物相容的聚合物中。在一些实施方案中,释放NO的聚合物为不是基于藻酸盐的可生物降解和/或生物相容的聚合物。在一些实施方案中,可生物降解和/或生物相容的聚合物可包括聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(己内酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、聚羟基丁酸酯、壳聚糖、透明质酸、水凝胶、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、聚(乙二醇)、壳聚糖、聚(L-丙交酯)及其组合的一种或多种(例如共聚物或混合物)。在一些实施方案中,释放NO的藻酸盐可以掺入膜中的可生物降解和/或生物相容的聚合物中。
[0266] 在一些实施方案中,含有释放NO的藻酸盐的聚合物膜可用于涂覆各种制品,特别是手术工具、生物传感器和医用植入物,以防止血小板粘附、防止细菌感染、起到血管扩张剂的作用。在一些实施方案中,这些制品可用于血管医疗装置、泌尿科医疗装置、胆道医疗装置、胃肠医疗装置、适于放置在手术部位的医疗装置、以及适于放置在皮肤伤口或开口上的医疗装置。在一些实施方案中,聚合物可用于涂覆动脉支架、导丝导管套管针、骨锚骨螺钉、保护性层、髋关节和关节置换物、电引线、生物传感器、探针、缝合线、手术单、伤口敷料和绷带。
[0267] 在一些实施方案中,被涂覆的装置可具有金属表面,例如不锈、镍、、铜、金、、铂及其组合。在一些实施方案中,含有释放NO的藻酸盐的膜或聚合物可用于涂覆非金属表面,例如玻璃或纤维(例如布或纸)。
[0268] 在一些实施方案中,含有释放NO的藻酸盐的聚合物本身可用于形成装置。例如,聚合物可以制成用于血液或组织的储存袋或作为伤口敷料。
[0269] 在一些实施方案中,可以与官能化藻酸盐接触以防止或破坏生物膜的表面包括选自医疗装置、管道装置、冷凝器盘管、光学表面、船体和飞机的那些。其他非限制性实例包括台面窗户,电器,硬地板,地毯,浴盆,淋浴,镜子,厕所,坐浴盆,浴室固定装置,水槽,箱,微波炉,小厨房用具,桌子,椅子,橱柜,抽屉,沙发,双人沙发,长凳,床,凳子,衣橱,箱子,梳妆台,展示柜,钟表,饮食柜台,灯罩,百叶窗,娱乐中心,扶手,灯,栏杆,图书馆,橱柜,书桌,门,架子,沙发,推车,钢琴,雕像和其他艺术品,架子,风扇,灯具,台球桌,乒乓球桌,足球桌,牌桌,工具(例如手动和/或手持工具,电动工具,气动工具等),电话,收音机,电视,立体声设备,CD和DVD播放器,模拟和数字声音设备,掌上电脑,笔记本电脑,台式和塔式电脑,电脑显示器,MP3播放器,记忆存储设备,照相机,便携式摄像机,车辆表面(例如挡风玻璃;轮胎;金属,玻璃纤维,复合材料和/或塑料外表面;织物和/或乙烯基树脂外表面;织物,乙烯基树脂和/或皮革内表面;金属,塑料,木材和/或复合材料内表面,玻璃内表面等),自行车地车,摩托车,越野车,庭院设备,农场设备,洗涤设备(例如电动洗衣机等),涂装设备(如电动和气动涂装设备等),医疗和/或牙科设备,船用设备(如帆船,动力艇,筏,帆板,独木舟,划艇等),玩具,书写工具手表,加框架图片或绘制物,书籍和/或类似物。希望使一种或多种类型的液体从表面流出、不被吸收到表面中和/或不使表面染色的任何表面都可以是基材。例如,暴露于环境条件的表面。此外,表面可以成为微生物粘附的位置,例如与身体组织或流体接触的医疗装置是特别优选的。
[0270] 在一些实施方案中,如本文其他地方所公开的,可以用官能化藻酸盐涂覆或以其他方式处理医疗装置以预防或破坏生物膜。适于通过血管或其他体腔移动的诸如导管的医疗装置通常设置有低摩擦外表面。如果医疗装置的表面不是低摩擦表面,则将装置插入体腔和从体腔移除装置变得更加困难,并且可能发生身体组织的损伤或炎症。低摩擦表面还有益于减少由于某些长期装置(例如,长期导管)与周围组织之间的移动而可能产生的不适和伤害,例如,由于患者活动。医疗装置包括各种可植入和可插入的医疗装置(在本文中也称为“内部医疗装置”)。这种医疗装置的实例包括涉及输送或移除流体的装置(例如,含有药物的流体,加压流体,例如膨胀流体,体液,造影剂,热或冷介质等)以及用于插入和/或通过各种体腔的装置,包括心血管系统的管腔,例如心脏、动脉(例如冠状动脉、股动脉、主动脉、髂动脉、颈动脉和椎-基底动脉)和静脉,泌尿生殖系统的管腔,例如尿道(包括前列腺尿道)、膀胱、输尿管、阴道、子宫、精索和输卵管,鼻泪管,咽鼓管,呼吸道的管腔,如气管、支气管、鼻腔和鼻窦,胃肠道的管腔,如食道、肠、十二指肠、小肠、大肠、直肠、胆管和胰管系统,淋巴系统的管腔,主要的体腔(腹膜、胸膜、心包)等等。内部医疗装置的非限制性具体实例包括血管装置,例如血管导管(例如球囊导管),包括用于其的球囊和充气管,水解器导管,导丝,回拉护套,过滤器(例如腔静脉过滤器),左心室辅助装置,全人工心脏,注射针,给药管,引流管,胃肠和结肠镜管,内窥镜装置,气管导管等气管内装置,泌尿道导尿管和输尿管支架等用于泌尿道的装置,以及用于神经区域的装置,例如导管和导线,套管针,骨锚,骨螺钉,保护性镀层,关节置换物,电导线,生物传感器,探针,缝合线,手术单,伤口敷料和绷带。根据本文描述的主题的许多装置具有一个或多个圆柱形的部分,包括实心和中空圆柱形状。
[0271] 在一些实施方案中,实心基材材料可以用官能化藻酸盐涂覆或以其他方式处理,以防止或破坏生物膜。实心基材材料可包括有机材料(例如,含有50wt%或更多有机物质的材料),例如聚合物材料,和无机材料(例如,含有50wt%或更多无机物质的材料),例如金属材料(例如,金属和金属合金)和非金属材料(例如,包括碳、半导体、玻璃和陶瓷,其可包含各种金属和非金属氧化物、各种金属和非金属氮化物、各种金属和非金属金属碳化物、各种金属和非金属硼化物、各种金属和非金属磷酸盐、以及各种金属和非金属硫化物等)。非金属无机材料的具体实例可以是包含以下的一种或多种的材料:金属氧化物,包括氧化铝和过渡金属氧化物(例如,钛、锆、铪、钽、钼、钨、铼和铱的氧化物);硅;硅基陶瓷,例如含有氮化硅、碳化硅和氧化硅的硅基陶瓷(有时称为玻璃陶瓷);磷酸钙陶瓷(如羟基磷灰石);碳;和碳基陶瓷类材料,如碳氮化物。
[0272] 此外,释放NO的藻酸盐可以掺入洗涤剂中,例如但不限于抗微生物皂。在一些实施方案中,嵌入皂条中的官能化藻酸盐的NO释放可以通过在使用时与水接触和/或pH下降来触发。在一些实施方案中,当条的外表面被侵蚀或溶解时,条表面内的另外的官能化藻酸盐变得暴露以用于条的后续使用。释放NO的藻酸盐也可以悬浮在液体肥皂中。这种肥皂或洗涤剂可用于个人卫生或为纤维提供抗微生物处理。这种肥皂或洗涤剂也可用于处理家具表面或医院或其他医疗环境中可能暴露于微生物如细菌、真菌或病毒的任何表面。
[0273] 术语“生物相容的”在本文中是指当以一定量施用于患者时不诱导毒性或不需要的副作用的有机溶剂
[0274] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐可以作为药学上可接受的盐提供。制剂包括其所有药学上可接受的盐形式。这些盐的实例包括衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱的盐。合适的酸式盐的实例包括但不限于乙酸盐,己二酸盐,藻酸盐,天冬氨酸盐,苯甲酸盐,丁酸盐,柠檬酸盐,富马酸盐,乙醇酸盐,半硫酸盐,庚酸盐,己酸盐,盐酸盐,氢溴酸盐,氢碘酸盐,2-羟基乙磺酸盐,乳酸盐,马来酸盐,丙二酸盐,甲磺酸盐,烟酸盐,硝酸盐,草酸盐,棕榈酸盐,果胶酸盐,过硫酸盐,羟基酸盐,新戊酸盐,丙酸盐,水杨酸盐,琥珀酸盐,硫酸盐,酒石酸盐,硫氰酸盐,甲苯磺酸盐和十一酸盐。其它酸,例如草酸,虽然本身不是药学上可接受的,但可用于制备可用作中间体的盐,以获得本文所述主题的化合物及其药学上可接受的酸加成盐
[0275] 在一些实施方案中,使用衍生自适当碱的盐。这些盐包括但不限于碱金属(例如钠、)、碱土金属(例如镁和钙)、铵和N-(烷基)4+盐。
[0276] 在一些实施方案中,官能化藻酸盐还包括其中具有任何碱性含氮基团季铵化的那些,从而提供季胺。
[0277] 在一些实施方案中,所公开的官能化的释放NO的藻酸盐具有抗微生物活性并且在静态条件下在4小时内在聚合物浓度等于或小于8mg/mL下用铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌进行的细菌活力测定中提供大于或等于99%的细菌减少。在一些实施方案中,所公开的官能化的释放NO的藻酸盐在聚合物浓度等于或小于8mg/mL下用铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌在4小时(MBC4h)中引起细菌存活率至少约3-log减少(即,99.9%杀死)。在一些实施方案中,所公开的官能化的释放NO的藻酸盐具有抗微生物活性并且在静态条件下在4小时内在聚合物浓度等于或小于8mg/mL下进行的细菌活力测定中提供大于或等于99%的细菌减少。在一些实施方案中,所公开的官能化的释放NO的藻酸盐在聚合物浓度等于或小于8mg/mL下在4小时(MBC4h)中引起细菌存活率至少约3-log减少(即,99.9%杀死)。在一些实施方案中,所公开的官能化的释放NO的藻酸盐在聚合物浓度等于或小于8mg/mL下在8小时中引起细菌存活率至少约5-log减少。
[0278] 为简单起见,本文的讨论是在不提及立体异构的情况下提供的。本文所述的藻酸盐可含有一个或多个不对称中心,因此以外消旋体和外消旋混合物、单一光学异构体、单独的非对映异构体和非对映异构体混合物形式存在。这些化合物的所有这些异构形式明确地包括在本主题中。
[0279] 在以下非限制性实施例中更详细地解释本主题的若干实施方案。
[0280] 实施例
[0281] 实施例1:合成方法
[0282] 材料.来自褐藻(低粘度)、双(3-氨基丙基)胺(DPTA)、二亚乙基三胺(DETA)、N-丙基-1,3-丙二胺(PAPA)、精胺(SPER)和台盼蓝溶液(0.4%)的海藻酸钠盐购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。常用的实验室盐和溶剂购自Fischer Scientific(Fair Lawn,NJ)。除非另有说明,否则所有化学品均未经进一步纯化直接使用。胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)获自Becton,Dickinson,and Company(Franklin Lakes,NJ)。实验室铜绿假单胞菌(P.aeruginosa;ATCC#19143)、金黄色葡萄球菌(S.aureus;ATCC#29213)和A549人肺腺癌细胞(ATCC CCL-185)获自American Type Tissue Culture Collection(Manassas,VA)。用于细胞生长的支气管上皮细胞生长培养基(BGEM)获自UNC Tissue Procurement and Cell Culture Core(Chapel Hill,NC)。氩气、二氧化碳(CO2)、氮气(N2)、一氧化氮(NO)校准(25.87ppm,余量N2)气瓶购自Airgas National Welders
(Raleigh,NC)。从Praxair(Sanford,NC)获得纯NO气体(99.5%)。将蒸馏水纯化至电阻率为
18.2MΩ.cm,使用Millipore Milli-Q UV Gradient A10System(Bedford,MA)测得总有机物含量≤10ppb。
[0283] 仪器.在Bruker(600MHz)光谱仪上记录1H和13C核磁共振(NMR)谱。使用PerkinElmer Elemental Analyzer Series 2400Instrument(Waltham,MA)进行元素(碳、氢和氮;CHN)分析。使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments,UK)在磷酸盐缓冲液(PB;
pH 7.4)中进行ζ电位测量。使用UV-vis40λ分光光度计(PerkinElmer,Waltham,MA)在50mM氢氧化钠(NaOH)中获得所有UV测量值。
[0284] 多胺官能化海藻酸钠的合成.藻酸盐材料(称为“Alg-多胺”)用二乙烯三胺(DETA)、双(3-氨基丙基)胺(DPTA)、N-丙基-1,3-丙二胺(PAPA)或精胺(SPER)通过在藻酸盐的羧酸部分和多胺的伯胺之间形成共价酰胺键改性。简言之,将藻酸盐(100mg)溶于10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS;10mM;pH6.5)中,其中相对于藻酸盐支架的羧基部分,1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔比为2:1,N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1。
然后将相对于藻酸盐支架的羧酸基团为2:1摩尔比的多胺加入混合物中,并使反应在室温下进行24小时。胺官能化的藻酸盐在甲醇中沉淀,通过离心收集,用甲醇洗涤两次,并在真空中干燥,得到每种改性的白色固体。
[0285] 藻酸盐和多胺官能化藻酸盐的代表性1H NMR包括下述峰。
[0286] 藻酸盐:1H NMR(600MHz,D2O,δ)3.60-4.05(OCHCH(OH)CH(OH)),4.30(OCHCH(OH)CH(OH),4.50-4.60(NHCOCH),4.90(OCH(CHOH)O)。
[0287] Alg-DETA:1H NMR(600MHz,D2O,δ)2.30-3.30(CH2CH2NHCH2CH2NH2),3.60-4.05(OCHCH(OH)CH(OH)),4.30(OCHCH(OH)CH(OH),4.50-4.60(NHCOCH),4.90(OCH(CHOH)O)。
[0288] Alg-DPTA:1H NMR(600MHz,D2O,δ)1.60-1.80(CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2),2.60-2.30(CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2),2.80-3.10(CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2),3.60-4.05(OCHCH(OH)CH(OH)),4.30(OCHCH(OH)CH(OH),4.50-4.60(NHCOCH),4.90(OCH(CHOH)O)。
[0289] Alg-PAPA:1H NMR(600MHz,D2O,δ)0.70-0.80(NHCH2CH2CH3),1.52(NHCH2CH2CH3),1.85(CH2CH2CH2NHCH2CH2CH3),2.80-3.10(CH2CH2CH2NHCH2CH2CH3),3.60-4.05(OCHCH(OH)CH(OH)),4.30(OCHCH(OH)CH(OH),4.50-4.60(NHCOCH),4.90(OCH(CHOH)O)。
[0290] Alg-SPER:1H NMR(600MHz,D2O,δ)1.13(NHCH2(CH2)2CH2NH),1.56(NHCH2CH2CH2NH),1.80(C(O)NHCH2CH2CH2NH),2.20-2.40(CH2CH2CH2NH,NHCH2(CH2)
2CH2NH,NHCH2CH2CH2NH2),2.68(NHCH2CH2CH2NH2),2.80-3.10(C(O)NHCH2CH2CH2NH,
NHCH2CH2CH2NH2),3.60-4.05(OCHCH(OH)CH(OH)),4.30(OCHCH(OH)CH(OH),4.50-4.60(NHCOCH),4.90(OCH(CHOH)O)。
[0291] 藻酸盐和多胺官能化藻酸盐的代表性13C NMR包括下述峰。
[0292] 藻酸盐:12C NMR(600MHz,D2O,δ)65.0-80.0(OCHCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(O)),100.0(OCHCH(OH)),175.0(CHC(O))。
[0293] Alg-DETA:12C NMR(600MHz,D2O,δ)39.0-47.0(C(O)NHCH2CH2NHCH2CH2NH2),65.0-80.0(OCHCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(O)),100.0(OCHCH(OH)),160.0(CHC(O)NH),175.0(CHC(O))。
[0294] Alg-DPTA:13C  NMR(600MHz,D2O,δ)26.9-29.5(C(O)NHCH2CH2CH2NH,NHCH2CH2CH2NH2),37.6-46.0CH2(C(O)NHCH2CH2CH2NH,NHCH2CH2CH2NH2),65.0-80.0(OCHCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(O)),100.0(OCHCH(OH)),160.0(CHC(O)NH),175.0(CHC(O))。
[0295] 13C NMR(600MHz,D2O,δ)10.9(NHCH2CH2CH3),20.0(NHCH2CH2CH3),31.3-49.0(C(O)NHCH2CH2CH2NH,NHCH2CH2CH3),65.0-80.0(OCHCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(O)),100.0(OCHCH(OH)),160.0(CHC(O)NH),175.0(CHC(O))。
[0296] 13C  NMR(600MHz,D2O,δ)23.2(NHCH2(CH2)2CH2NH),34.8-45.0(C(O)NHCH2CH2CH2NH),65.0-80.0(OCHCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(O)),100.0(OCHCH(OH)),160.0(CHC(O)NH),175.0(CHC(O))。
[0297] 仲胺官能化藻酸盐的合成.藻酸盐通常在自然界中被发现为多分散的高分子量聚合物(200-500kDa)并且即使作为大多糖也是水溶性的。通过随后形成例如N-二醇二氮烯鎓NO供体,添加带有仲胺的官能团和其他基团允许一氧化氮储存和释放藻酸盐的能力。如本文所述,通过EDC/NHS反应将小分子胺连接到藻酸盐的羧酸部分(方案1)。
[0298]
[0299] 方案1
[0300] 方案1描述了胺官能化藻酸盐的合成。
[0301] 1H和13CNMR均用于表征所得的藻酸盐改性(图4和图5)并验证藻酸盐骨架的改性。元素分析也证实了胺的附着(表1)。在藻酸盐骨架上接枝小胺部分导致Alg-PAPA、Alg-DETA、Alg-DPTA和Alg-SPER的氮含量增加~6至8重量%(即~40-50%反应转化率)的存在。
随着支架中存在的胺的增加,也观察到分子表面电荷的正向变化(表1)。
[0302] 表1.仲胺官能化海藻酸盐的元素(CHN)分析和ζ电位测量.a
[0303]
[0304] a对每个参数进行多次重复分析(n≥3)。b在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中测量。
[0305] 释放NO的藻酸盐的合成.为了在藻酸盐支架上形成N-二醇二氮烯鎓NO供体,使用50mM NaOH溶液(3mL)在1-dram玻璃小瓶中溶解多胺官能化的藻酸盐(45mg)。将开口小瓶置于不锈钢反应器中,连续磁力搅拌。通过用氩气(10秒,7巴)吹扫三次从容器中除去氧气,然后用氩气(10分钟,7巴)进行另外三次长时间吹扫。然后用NO气体(用氢氧化钾纯化)将容器加压至10巴,持续3天。然后,重复相同的氩气吹扫方案以除去未反应的NO。然后将释放NO的藻酸盐在甲醇中沉淀,通过离心收集,在真空中干燥过夜,并在-20℃下储存为白色粉末。
[0306] NO储存和释放的表征.使用Sievers 280i化学发光NO分析仪(NOA,Boulder,CO)实时评估一氧化氮释放。在分析之前,用通过NO零过滤器(0ppm NO)的空气和25.87ppm NO标准气体(余量N2)校准NOA。在典型的测量中,将释放NO的藻酸盐(1mg)溶解在30mL PBS(pH 7.4,37℃)中。使氮气以70mL/min的流速流过溶液,以将释放的NO从藻酸盐支架运送到分析仪。向烧瓶中提供额外的氮气流以匹配仪器的收集速率(200mL/min)。当NO水平低于10ppb的NO/mg藻酸盐(仪器的检测限)时,一氧化氮分析终止。
[0307] N-二醇二氮烯鎓官能化海藻酸盐的合成.在碱性条件下将仲胺官能化的藻酸盐暴露于高压NO,以形成N-二醇二氮杂烯鎓NO供体。通过使用50mM NaOH水溶液作为反应溶剂,针对每个样品优化一氧化氮储存。使用UV-可见光谱法确认N-二醇二氮杂烯鎓的形成,其中在253nm处存在特征吸收最大值——在二醇二氮烯鎓形成之前仲胺官能化藻酸盐的吸收光谱中不存在该峰(图6)。
[0308] 图1显示了在37℃下在PBS(pH 7.4)中N-二醇二氮烯鎓官能化藻酸盐的代表性NO-释放曲线。发现Alg-SPER/NO和Alg-PAPA/NO具有相似的总NO储存量~0.6μmol/mg,而Alg-DETA/NO和Alg-DPTA/NO均释放出较低量的NO(~0.4μmol/mg;表2)。上述值与其他大分子释放NO的生物聚合物支架相当,包括用释放NO的壳聚糖寡糖(线性可生物降解的支架)实现的NO总量。然而,对于藻酸盐支架,观察到广泛范围的NO释放动力学,其中Alg-PAPA/NO具有最短的NO释放半衰期(~0.5h),并且Alg-DETA/NO具有最长(~13h)。不受理论束缚,据信NO释放动力学的这些趋势取决于胺前体结构。已经报道了小分子前体的半衰期值。本文描述的这些实施例证明了通过改变接枝在藻酸盐骨架上的胺前体的化学结构来调节和控制总NO储存和释放动力学的非常理想的特异性的能力。
[0309] 表2.N-二醇二氮烯鎓官能化藻酸盐在PBS(pH7.4,37℃)中的一氧化氮释放特性.a[0310]
[0311] a对每个参数进行多次重复分析(n≥3)。b释放的NO总量。cNO释放的最大通量。dNO-释放半衰期。e释放NO的持续时间。f4小时后释放的总NO。
[0312] 实施例2:生物学测定
[0313] 浮游杀菌试验.铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌培养物在37℃下在TSB中从冷冻(-80℃)原液中生长过夜。将500μL等分试样的培养物在50mL新鲜TSB中培养至浓度为108菌落形成单位/mL(CFU/mL)。通过将细菌悬浮液铺板在TSA上并在37℃下温育过夜来产生工作细菌原液。每周制备TSA细菌原液并储存在4℃。对于杀菌测定,从TSA板中取出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的菌落,在37℃下接种于3mL TSB中过夜,并在新鲜TSB(50mL)中再培养至浓度为108CFU/mL。将这些培养物离心,重悬于PBS中,并稀释至106CFU/mL。将称重的不释放NO和释放NO的藻酸盐样品加入1-dram小瓶中。然后加入相应体积的106CFU/mL细菌以获得一系列藻酸盐浓度(0.5至16mg/mL)并在37℃下温育4小时。在每个实验中包括未处理的对照(空白)以确保在实验期间细菌活力。处理后,将细菌溶液连续稀释(10倍和
100倍稀释),使用Eddy Jet螺旋计(IUL;Farmingdale,NY)在TSA上螺旋铺板,并在37℃温育过夜。使用Flash&Go菌落计数器(IUL;Farmingdale,NY)评估细菌活力。暴露4小时后的最低杀菌浓度(MBC4h)定义为与未处理的细胞相比实现细菌活力降低3-log(即细菌数量从106减
3 3
少到10CFU/mL)所需的最小浓度。所用的平板计数方法的检测限为2.5×10CFU/mL。通过将藻酸盐样品的MBC4h(mg/mL)与PBS中的可用NO(pH7.4;μmol NO/mg藻酸盐)相乘来计算相应的NO剂量。
[0314] 生物膜根除测定.与浮游实验相似,将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的细菌培8
养物在37℃下在TSB中生长过夜,并在新鲜的TSB再培养至10CFU/mL的浓度。然后,在无菌介质中将细菌溶液稀释至106CFU/mL(绿脓杆菌,TSB;金黄色葡萄球菌,TSB+0.1%葡萄糖)中并伴随轻轻摇动在37℃下生长48小时。形成的粘性微菌落生物膜很容易通过移液管从生长培养基中分离出来。将生物膜(250μL)与750μLPBS合并,并加入含有不释放NO和释放NO的藻酸盐预测定样品的1-dram小瓶中,最终藻酸盐浓度范围为4-64mg/mL。将样品在37℃温和振荡24小时进行温育。在每个实验中包括未处理的对照(空白)以确保在实验期间细菌活力。将分散的生物膜涡旋,连续稀释(10、100、1000和10,000倍稀释),使用Eddy Jet螺旋铺板计(IUL;Farmingdale,NY)在TSA板上铺板,并在37℃温育过夜。使用Flash&Go菌落计数器(IUL;Farmingdale,NY)评估细菌活力。24小时(MBEC24h)的最小生物膜根除浓度定义为在24小时处理后将生物膜的活力降低至低于平板计数方法检测限(2.5×103CFU/mL)的浓度。通过将藻酸盐样品的MBEC24h(mg/mL)与PBS中的可用NO(pH7.4;μmol NO/mg藻酸盐)相乘来计算相应的NO剂量。
[0315] 基于时间的生物膜根除测定.根据生物膜根除测定的相同方案,生长铜绿假单胞菌生物膜并用释放NO的藻酸盐(8mg/mL)处理。包括未处理的对照(空白)以确保在实验期间细菌活力。将样品在37℃温和振荡下温育,暴露时间长度不同(1-8小时),然后使用Eddy Jet螺旋板(IUL;Farmingdale,NY)在TSA平板上铺板,并在37℃下温育过夜。使用Flash&Go菌落计数器(IUL;Farmingdale,NY)评估细菌活力。对于Alg-PAPA/NO和Alg-SPER/NO,在MBEC24h进行类似的实验,以与8mg/mL下的基于时间的杀伤进行比较。
[0316] 体外细胞毒性测定.将A549人腺癌细胞在BGEM培养基中培养,并在37℃下在湿润/需氧条件下在5%CO2中温育。在达到80%汇合后,将细胞以每孔1×104个细胞/mL的密度接种到聚苯乙烯96孔板上,并在37℃下温育24小时。然后吸出上清液并用在PBS中200μL新鲜生长培养基和20μL藻酸盐替换,最终藻酸盐浓度相当于针对铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌生物膜的MBEC24h。在37℃温育24小时后,加入50μL台盼蓝溶液,并将混合物在室温下温育约3分钟。吸出上清液,用PBS洗涤孔。使用Nikon Eclipse TE2000-E倒置显微镜在配备有Nikon Digital Sight DS-U2控制器的40x放大倍数下对每个孔中的细胞成像。使用NIS成像软件处理图像,并使用自定义MATLAB脚本来区分和计算每个图像中的活细胞和死细胞的数量。每个样品的细胞活力计算如下:
[0317]
[0318] 实施例3:抗菌研究
[0319] 释放NO的藻酸盐对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌病原体的杀菌活性取决于NO释放动力学,相对于更快的释放系统,约4小时的释放半衰期需要更低的藻酸盐浓度以根除浮游生物和生物膜为基础的细菌。NO释放和对照藻酸盐均以对生物膜为基础的细菌的生存力降低5-log所需的浓度引发对人呼吸道上皮细胞(A549)的低毒性。
[0320] 对浮游细菌的抗菌作用.对照和释放NO的藻酸盐的抗菌活性针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行了评估,它们是与慢性感染相关的两种最常见的病原体。在静态条件下进行细菌活力测定以确定在4小时内(MBC4h)引起细菌活力的3-log降低(即,99.9%杀死)所需的释放NO的藻酸盐的最小浓度。表3中提供了每种藻酸盐改性所需的MBC4h和杀菌NO剂量。在相同浓度下,对照藻酸盐材料对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的细菌存活率没有显著降低,暗示NO作为杀菌剂(图7)。
[0321] 表3.对浮游铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC4h).a
[0322]
[0323] a对每个参数进行多次重复分析(n≥3)。b从在pH7.4的PBS中4小时的NO总量计算NO剂量。
[0324] 每种释放NO的藻酸盐支架在相对低浓度(<8mg/mL)下达到≥99.9%的细菌杀灭,带负电荷较少的藻酸盐改性需要较低浓度达到杀菌活性(表1)。先前的研究已经报道,带正电荷的支架更容易与细菌结合,导致增强的杀菌作用。本文公开的数据显示,Alg-SPER/NO需要最低浓度以引发杀菌作用,而Alg-PAPA/NO需要最高浓度。不受理论束缚,据信释放动力学在引发藻酸盐材料的杀菌作用所需的浓度中起作用,分别针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌,Alg-PAPA/NO具有与Alg-DPTA/NO和Alg-DETA/NO相同的MBC浓度。尽管总NO释放更多(~0.6μmol/mg),但与Alg-PAPA/NO相关的快速释放动力学可能是由于NO过早释放(即在与细菌结合之前)。另一方面,Alg-DETA/NO所需的更高浓度可归因于与其他三种藻酸盐改性相比,4小时(~0.10μmol/mg)后系统释放的NO量较低。
[0325] 更高浓度的释放NO的藻酸盐对于相对于铜绿假单胞菌实现金黄色葡萄球菌的杀菌活性是必需的。认为这种易感性的降低是由于革兰氏阳性和阴性细菌之间的肽聚糖层组成的差异。革兰氏阴性细菌例如铜绿假单胞菌具有富含脂质的外膜和薄的肽聚糖片,而不是在革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌的外壁上更厚的更具抗性的肽聚糖层。据信这种更坚固的膜减少NO向细菌的扩散,因此需要更高的NO剂量来实现杀灭。
[0326] 抗生物膜功效.除了对浮游细菌表现出杀菌作用外,释放NO的藻酸盐支架也证明对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜有效。为了评估不同释放NO的藻酸盐支架的抗生物膜功效,将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜暴露于在PBS(pH7.4)中的4-64mg/mL的释放NO的藻酸盐24小时。与浮游生物研究相似,与金黄色葡萄球菌生物膜相比,观察到针对铜绿假单胞菌的杀菌活性增加(表4)。Worley等人证明释放NO的聚(酰氨基胺)树枝状聚合物相对于铜绿假单胞菌降低了渗透到金黄色葡萄球菌生物膜中,这是由于与生物膜结构相关的差异。不受特定机制的束缚,该观察结果表明由于受阻的NO供体支架扩散,金黄色葡萄球菌生物膜相对于铜绿假单胞菌的NO耐受性增加。此外,据报道,铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜表现出不同的浮游分散机制,据信这些机制会影响它们对抗微生物剂的敏感性。
[0327] 表4.针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的最低生物膜根除浓度a
(MBEC24h).
[0328]
[0329] a对每个参数进行多次重复分析(n≥3)。b从在pH7.4的PBS中24小时的NO总量计算NO剂量。
[0330] 相比于具有较短半衰期(约0.5-1小时)的藻酸盐支架,具有较长半衰期(约4-13小时)的藻酸盐支架始终需要较低的藻酸盐浓度,因此降低NO剂量,以消除基于生物膜的细菌。无论Gram类如何,均观察到该特征,并且表明较慢、持续的NO释放确保更有效的NO递送。与此基本原理一致,Alg-SPER/NO和Alg-PAPA/NO的过早NO释放降低了递送至生物膜的NO的量。为了测试材料随时间的根除效力,用相同浓度(8mg/mL)的不同释放NO的藻酸盐处理铜绿假单胞菌生物膜(图2A),并在各种暴露时间评估活力。在1小时时,用Alg-PAPA/NO或Alg-SPER/NO处理导致生物膜细菌活力降低1至2-log,正如基于两种释放NO的藻酸盐的NO-释放半衰期(~0.5-1.4小时)预期的。然而,藻酸盐在较长持续时间释放的低NO浓度不足以引起
8
细菌死亡,因为活的铜绿假单胞菌的浓度在4小时后恢复至~10 CFU/mL。在MBEC24h,Alg-SPER/NO和Alg-PAPA/NO(图2B)在1小时和4小时暴露后引起细菌活力的5-log降低,长达12小时没有可观察到细菌生长。不受理论束缚,据信增加的藻酸盐(即NO)浓度通过由大的初始NO爆发引起的快速细菌死亡改善了更快释放NO的藻酸盐的功效。
[0331] 与快速NO释放系统相比,具有较慢释放动力学的藻酸盐支架(Alg-DPTA/NO和Alg-DETA/NO分别为约4小时和13小时)在相同浓度下引起生长力的逐渐降低(即8mg/mL),最终在暴露8小时后达到5-log降低。实际上,结果表明,当使用较低的藻酸盐浓度时,较慢的持续的NO释放曲线优选用于生物膜根除。
[0332] 对A549细胞的体外细胞毒性.用于生物医学应用的藻酸盐的一个性质是其对哺乳动物细胞的低毒性。然而,用含有N-二醇二氮杂烯鎓的多胺改性藻酸盐骨架的效果是未知的。因此,通过暴露人呼吸道上皮(A549)细胞来比较对照和释放NO的藻酸盐的细胞毒性。A549细胞通常用作体外细胞毒性研究的肺上皮细胞模型。藻酸盐支架的毒性在其MBEC下针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行超过24小时的评估。使用台盼蓝染料排除测定法测定细胞活力;具有受损细胞膜的死细胞允许包含台盼蓝染料,而具有完整细胞膜的活细胞排除该染料。如图3所示,与其他更有毒的大分子NO释放系统相比(例如,二氧化硅纳米颗粒和树枝状大分子),对照和释放NO的藻酸盐支架在其MBEC对A549细胞没有显示出显著的毒性,突出了这些材料作为抗生物膜剂的优势。与藻酸盐对照相比,释放NO的支架还促进细胞活力的轻微增加,证实了先前的报道,即某些水平的NO可促进细胞增殖。总的来说,释放NO的藻酸盐在杀菌浓度下的低毒性显示出它们用作伤口愈合和囊性纤维化的治疗剂的希望。
[0333] 作为可生物降解的抗菌剂,开发了具有多种NO释放动力学(0.5-13小时半衰期)的N-二醇二氮烯鎓官能化藻酸盐支架。证明了释放NO的藻酸盐材料的对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的浮游和生物膜基形式的杀生物功效。导致缓慢和持续释放NO的藻酸盐改性(即Alg-DPTA/NO和Alg-DETA/NO)证明对本研究中使用的革兰氏阴性和革兰氏阳性生物膜更有效,导致在低藻酸盐/NO浓度中的根除。这些材料对A549细胞几乎没有毒性或没有毒性,突出了与使用释放NO的藻酸盐相关的独特益处。在该工作的基础上,释放NO的藻酸盐材料可以用作慢性感染中的抗菌剂(例如作为囊性纤维化的治疗)。
[0334] 实施例4:CF研究.一氧化氮(NO)是一种内源性产生的自由基,具有杀菌作用并调节相关的生物过程,具有作为治疗CF的治疗剂的潜力。NO对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱抗菌活性是由于亚硝化和氧化应激,通过脂质过氧化和DNA脱氨作用破坏细胞功能。一氧化氮作为粘液溶解剂起作用并刺激纤毛清除,使其成为CF治疗剂的候选物。虽然使用气态NO的初步研究显示气道炎症减少和肺功能改善,但治疗益处受到毒性问题和患者依从性的限制。在一些实施方案中,由于改善的杀菌效力和可调节的释放动力学以及持续释放的能力,在生理条件下释放NO的大分子支架更适合于生物医学。特别地,生物聚合物,例如壳聚糖、藻酸盐和透明质酸,由于其生物相容性和可生物降解的特性,可以代表成功的候选物作为NO递送支架。
[0335] 阳离子壳聚糖寡糖显示出一些活性,作为对抗浮游生物和生物膜铜绿假单胞菌的释放NO的支架。然而,对比研究表明,透明质酸(一种阴离子生物聚合物)比壳聚糖更具粘膜粘附性。显示聚合物上的强阴离子电荷对于生物粘附是必需的。
[0336] 以下实验显示了三种不同的多糖在粘液溶解清除潜力和NO释放方面的测试,两种天然生物聚合物,藻酸盐(Alg)和透明质酸(HA),以及一种合成的羧甲基纤维素(CMC)。在一些实施方案中,这些聚合物和其他生物相容性聚合物可用于治疗CF。通过将生物聚合物的流变学益处与NO的抗微生物和粘液溶解作用相结合,提供了一种新的CF治疗剂,其能够穿透气道中的粘稠粘液并根除慢性细菌感染、生物膜和耐药菌株。测试了支架对粘液流变学和NO的杀菌和粘液溶解作用的影响。
[0337] 不受特定机制的束缚,据信较大分子量的阴离子生物聚合物显著影响粘液流变学,因为阴离子电荷破坏了粘蛋白链的静电相互作用,并且较高分子量改善了生物粘附、粘蛋白网络缠结和接触时间。
[0338] 表5.通过光散射测定或供应商报告的所选生物聚合物的分子量(*)
[0339]生物聚合物 分子量(kDa)
CSO 5±1
Alg 232±77
AlgG 16±8
AlgM 21±8
AOD 5
*HA 1500-1800
*CMC 250
[0340] 生物聚合物的降解和表征.阐明降低粘液粘弹性的生物聚合物性质提供了对NO释放支架用于CF疗法的有用性的见解。因此,评估了许多生物聚合物组合物和分子量。高分子量壳聚糖是具有低水溶性的阳离子支架。为了赋予溶解性,将壳聚糖氧化降解以产生壳聚糖寡糖(CSO)。阴离子支架包括藻酸盐(Alg)、透明质酸(HA)和羧甲基纤维素(CMC),但是根据实施方案,可以设想使用其他生物相容性阴离子聚合物。通过酸水解降解高分子量藻酸盐以产生具有不同古洛糖醛酸(G)残余物含量的相似大小的多糖:AlgG-70%和AlgM-30%。为了比较藻酸盐和CSO,将Alg氧化降解以产生藻酸盐寡糖(AOD)。例如,300kDa藻酸盐(Alg300)的氧化降解得到藻酸盐5kDa寡糖(Alg5)。支架的分子量通过GPC/SEC-MALS测定。
对这些生物聚合物的评估允许比较电荷、尺寸和组成对粘液流变学的影响。
[0341] 使用具有耗散的石英晶体微量天平(QCM-D)分析粘弹性.用QCM-D研究生物聚合物和粘蛋白的相互作用,以评估由于生物聚合物暴露引起的粘蛋白的流变学变化。不受特定理论的束缚,通过破坏粘蛋白网络相互作用来增加粘蛋白层厚度和降低粘弹性的能力应该导致粘液中药物扩散的改善。使用Q-Sense分析仪(Biolin Scientific,Stockholm,Sweden)QCM-D、蠕动和在两侧具有金电极的压电AT切割石英晶体进行相互作用研究。使HBE粘蛋白溶液流过晶体,直到共振频率(Δf)和耗散(ΔD)信号建立基线,然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。然后将生物聚合物溶液流过室并在信号达到新的基线后用PBS洗涤。
[0342] 粘蛋白的结合被证明是不可逆的,因为频率不受用PBS冲洗的影响(图14)。CSO与粘蛋白相互作用,略微增加耗散,并在PBS冲洗后返回接近基线。虽然CSO最初似乎对粘蛋白层的刚性几乎没有影响,但是在Voight建模后暴露的影响是明显的(表6)。如表6所示,CSO显著降低粘蛋白层厚度。
[0343] 表6.通过Voight建模确定暴露于生物聚合物支架后吸附层的信息。(*p<0.05,**p<0.001)。
[0344]支架 厚度(nm) 粘度(mPa.s) 弹性(kPa)
空白 26.9±5.4 11.89±6.09 1.103±0.132
CSO 19.4±1.8* 19.02±7.85 1.194±0.129
Alg 28.8±9.4 11.47±1.28 1.134±0.128
AlgG 28.6±5.4 8.39±2.20 0.997±0.126
AlgM 26.6±9.0 3.05±3.40 1.077±0.125
AOD 21.4±1.5 13.36±3.04 1.019±0.125
HA 8.7±0.4** 119.84±20.58* 1.562±0.124*
CMC 7.5±0.5** 7.48±1.09* 1.480±0.124
[0345] 带正电荷的壳聚糖支架和带负电荷的粘蛋白之间的静电吸引可能导致粘蛋白层塌陷和交联增加,随后降低吸附层的厚度。图14显示了CSO-1暴露于HBE粘蛋白时耗散随时间的变化。显示了第3、第5、第7、第9、第11和第13个泛音。黑色箭头表示PBS漂洗,虚线箭头表示CSO-1引入。与图14中观察到的变化类似,在暴露于Alg、CMC和HA之后也观察到质量和耗散的轻微变化,仅显示Alg用于比较(图15)。图15显示了Alg的耗散随时间的变化。显示了第3、第5、第7、第9、第11和第13个泛音。黑色箭头表示PBS漂洗,虚线箭头表示Alg引入。Alg和CMC均导致聚合物溶液流过腔室时的耗散大幅增加,表明柔软的粘弹性层与晶体偶联。一旦用PBS漂洗,耗散曲线返回到基线,表明聚合物不强烈地结合到粘蛋白层,但显著影响了粘弹性和曝光过程中的膜的水合作用。透明质酸略微增加了耗散,但建立了低于粘蛋白原始耗散值的基线,表明暴露于HA增加了层的刚性。其他藻酸盐基线未发现变化。
[0346] HA和CMC均显著降低层厚度,比CSO更大(表6)。高分子量HA和纤维素醚如CMC增加溶液粘度。这些聚合物的大分子量,分别为1.5MDa和250kDa,可有助于改善生物粘附和缠结,从而增加粘度,这与粘蛋白层崩解发生时层厚度的减少一致。藻酸盐支架对粘蛋白没有显著影响,但AOD显示出层厚度减小的趋势。寡聚糖醛酸通过中断粘蛋白-粘蛋白相互作用来改性粘蛋白网络,这可能导致观察到厚度减少。基于该数据,藻酸盐衍生物似乎是不增加粘蛋白层粘弹性的支架,因此可能对大量粘液流变学具有有益效果。
[0347] 生物聚合物暴露对平行板流变学表征的粘液的影响.从粘蛋白的QCM-D实验获得的信息可以与粘液上的平行板流变学实验结合使用,以更清楚地理解来自聚合物支架的NO递送。平行板流变学代表了一种宏观流变学技术,其允许表征CF粘液的整体流变学(即粘性模量(G”)、弹性模量(G')和复数粘度(η*)。体积流变学可用于确定粘液的性质和/或宏观功能,包括粘膜纤毛清除。QCM-D实验的结果表明藻酸盐衍生物由于其对粘蛋白层的低影响而有希望作为治疗剂。CSO、HA和CMC表现出相对于藻酸盐增加的粘蛋白粘弹性。选择藻酸盐支架以评估分子量和G残基含量对大量粘液流变学的影响。选择HA进行额外的测试,因为它显著增加了粘蛋白的粘弹性。
[0348] 将生物聚合物支架接种到HBE粘液(3%固体wt/wt)中至终浓度为10mg/mL,并在37℃下旋转温育18小时。在Discovery HR-3流变仪(TA Instruments,New Castle,DE)上通过振幅扫描和频率扫描实验测量每个样品的流变性质,其中20mm平行板设定为50μm的间隙厚度。实验在23℃下一式三份进行,以防止样品脱水。
[0349] 有用的递送支架可以减少G'、G”和/或η*以促进药物通过粘液扩散,和/或粘度和弹性的降低与模型研究(例如,青蛙研究等)中改善的纤毛清除率相关。暴露于AOD后,粘液的G'、G”和η*显著降低(图16A-16B)。图16A显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量,图16B显示了在37℃下用藻酸盐生物聚合物处理18小时后HBE粘液在10rad/s下的复数粘度。(*p<0.05,**p<0.01)。不受特定机制的束缚,这可能是由于低聚古洛糖酸盐通过与粘蛋白上的氨基相互作用中断粘蛋白-粘蛋白相互作用并干扰氢键而引起的。据信,由AOD引起的粘弹性降低应该改善咳嗽和纤毛清除,这对于去除病原体并且在很大程度上取决于粘液粘弹性是重要的,使得AOD成为非常有前途的NO-递送支架。
[0350] 另外,Alg和AlgG略微降低了粘蛋白层的弹性。不受特定理论的束缚,据信这是由古洛糖醛酸残基与粘蛋白的氢键结合和粘蛋白-粘蛋白相互作用的破坏、减少交联引起的。相反,具有较少G残基含量的AlgM没有显著改变粘液流变学。值得注意的是,HA引起G'、G”和η*的显著增加(图17A-17B)。图17A显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量,图17B显示了在37℃下用AOD和HA生物聚合物处理18小时后HBE粘液在10rad/s下的复数粘度。(*p<0.01,**p<
0.001)。
[0351] 该数据证实了在HA增加粘弹性的QCM-D实验中看到的趋势。不受特定理论束缚,这可能是由于显著的生物粘附和缠结。根据这些数据,暴露于HA会对咳嗽清除和纤毛搏动产生负面影响。
[0352] 在考虑QCM-D和平行板流变学结果时,AOD似乎是促进粘液清除的有希望的支架。较低分子量、高G残基含量和负电荷似乎是降低粘液粘弹性的性质。低聚古洛糖酸盐降低粘蛋白层厚度并导致粘液的体积粘弹性显著降低。据信这些趋势在含有生物膜的粘液中以及对粘液转运的影响方面继续存在。
[0353] 一氧化氮释放对粘弹性的影响.通过添加NO释放进一步增强了上述阳性粘液溶解结果。如图18所示,添加NO释放能力,无论是快速(例如,PAPA)还是更持久(例如,DPTA)都进一步降低弹性和粘性模量。图18显示了弹性(实心)和粘性(条纹)模量。
[0354] 因此,释放NO的藻酸盐(例如,低MW、Alg5;或高MW,Alg300)具有双重抗菌和粘液溶解性质。由于具有良好的生物相容性和生物降解性,以及降低生物膜粘度的能力,使NO释放支架(例如,藻酸盐支架)成为极具吸引力的CF治疗剂。
[0355] 表7.藻酸盐在PBS pH 7.4中的一氧化氮释放特性。值得注意的是,NO供体前体选择很容易改变释放动力学。
[0356]
[0357] 表8.释放NO的藻酸盐的浮游生物MBC。细菌培养物在TSB中生长并暴露于含有1%TSB的PBS,pH 7.4中的藻酸盐中。正如所料,革兰氏阳性细菌需要更大的剂量。
[0358]
[0359] 表9.释放NO的藻酸盐的生物膜MBEC。生物膜首先在TSB中生长2天,然后暴露于pH7.4的PBS中的藻酸盐24小时。值得注意的是,NO释放动力学在生物膜根除中发挥了关键作用。一致且连续的NO释放证明比仅初始的高NO爆发更好。
[0360]
[0361] 尽管为了清楚和理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述内容,但是可以预期,在不脱离本公开的精神的情况下可以进行修改。因此,应该清楚地理解,本文公开的形式仅是说明性的,并不旨在限制本公开的范围,而是还涵盖了具有本发明实施方案的真实范围和精神的所有修改和替代方案。
[0362] 考虑可以进行上面公开的实施方案的特定特征和方面的各种组合或子组合,并且仍然落入本发明的一个或多个中。此外,本文中与实施方案相关的任何特定特征、方面、方法、性质、特性、质量、属性、元件等的公开内容可以用于本文阐述的所有其他实施方案中。因此,应该理解的是,所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替换,以便形成所公开的发明的变化模式。因此,意图是本文公开的本发明的范围不应受上述具体公开的实施方案的限制。此外,尽管本发明易于进行各种修改和替换形式,但是其具体实例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而,应该理解,本发明不限于所公开的特定形式或方法,相反,本发明将覆盖落入描述的各种实施方案和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文公开的任何方法不需要按照所述顺序进行。本文公开的方法包括实施者采取的某些动作;但是,它们也可以明确地或暗示地包括这些动作的任何第三方指示。例如,诸如“施用释放一氧化氮的化合物”的动作包括“指示施用释放一氧化氮的化合物”。此外,在以马库什组的形式描述本公开的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到,本公开也因此以马库什组的任何个体成员或成员子组的形式描述。
[0363] 本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“在......之间”等语言包括所述的数字。在诸如“约”或“大约”之类的术语之后的数字包括所引用的数字。例如,“约10纳米”包括“10纳米”。
[0364] 除非另有明确说明,否则本申请中使用的术语和短语及其变体,尤其是所附权利要求中的术语和短语应被解释为开放式的而非限制性的。作为前述的实例,术语“包括”应该被理解为表示“非限制性地包括”、“包括但不限于”等。
[0365] 不定冠词“一”或“一个”不排除多个。本文所用的术语“约”用于例如定义分子量的值和范围,意味着所指示的值和/或范围的限度可在±20%内变化,例如在±10%内。在数字之前使用“约”包括数字本身。例如,“约5”表示对“5”的明确支持。
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