一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法
阅读：1031发布：2020-09-15
专利汇可以提供一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及运用Red重组系统对目的菌株的相关基因进行敲除，获得新的突变体。具体为涉及以布洛芬降解克隆菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5（该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚2,3-双加 氧 酶基因内）为出发菌株，借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，敲除4F6菌株中的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，获得新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5。，下面是一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法专利的具体信息内容。
1.一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株
3G7-G9和3G7-H5；
(2)使用布洛芬邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(Ipf C23O)正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的Ipf C23O基因来对步骤(1)所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在；
(3)以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞；
(4)将λ-red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤(3)得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于添加氯霉素和氨苄青霉素的LB双抗平板筛选到阳性转化子
4F6-pKD46菌株；
(5)以步骤(1)所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5为模板,使用Ipf C23O F和R引物分别PCR扩增出突变株3G7-G9和3G7-H5中的线性DNA；制备步骤(4)所得到的阳性转化子4F6-pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46菌株中，于添加氯霉素和四环素的LB双抗平板筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株；
(6)消除步骤(5)所得的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株中的重组质粒pKD46；使用Ipf C23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株；
(7)对步骤(1)和步骤(6)所得的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和
4F6-H5以及步骤(1)中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性(MC)测定；
其中，所述步骤(2)、步骤(5)和步骤(6)中的PCR反应引物为：Ipf C23O F:5'-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3'；Ipf C23O R:5'-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3'；反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，35个循环；72℃10分钟；
所述步骤(3)中制备菌株4F6的感受态细胞的方法具体为：转移600μL 4F6菌株的过夜培养液至5.4mL添加氯霉素的LB培养液中，37℃培养3小时；上述培养液分装至1.5mL离心管，14,000rpm离心1.5分钟，弃上清，重复离心2次；用1mL 300mM的冰冻蔗糖洗涤上述细胞3次，再次悬浮至100μL冰冻蔗糖中获得上述感受态细胞；
其中，菌株3G7的保藏编号为CGMCC No.6722；菌株4F6的保藏编号为CGMCC No.6719。
2.根据权利要求1所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于：步骤(3)-(5)中的LB培养基中氯霉素终浓度为12.5μg/mL，氨苄青霉素终浓度为150μg/mL，四环素终浓度为5μg/mL。
一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法
技术领域
背景技术
[0002] 布洛芬是苯丙酸类非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）的典型代表，属于重要的药物及个人护理药品（pharmaceuticals and personal care products,PPCPs）类物质。大量生产和广泛使用的布洛芬在为人类减轻病痛的同时，也带来了诸多的环境污染危害，已经成为重要的潜在环境污染物之一。
[0003] 尽管材料科学家、生态毒理学家、环境化学家和环境工程学家们已经进行了静电纺丝中布洛芬的释放；土壤中布洛芬的淋溶潜能；布洛芬臭氧降解以及布洛芬光芬顿体系降解等的超氧化过程（advanced oxidation processes,AOPs）尝试，但是化学降解存在自身的缺点，因为许多氧化降解的过程是氧化剂和紫外照射的结合（O3/H2O2/UV）或者催化剂2+
和紫外照射的结合（Fe /H2O2；UV/TiO2），其突出的3个缺点是：（1）过多电能的需求；（2）相当数量氧化剂和催化剂的投入；（3）处理过程pH的控制。上述3点限制了其大规模商业化的应用。
和紫外照射的结合（Fe /H2O2；UV/TiO2），其突出的3个缺点是：（1）过多电能的需求；（2）相当数量氧化剂和催化剂的投入；（3）处理过程pH的控制。上述3点限制了其大规模商业化的应用。
[0004] 目前有关布洛芬微生物降解的相关研究集中于降解菌株的筛选以及提高其降解效率等方面，而对降解菌株降解机制的探究和降解基因的克隆研究甚少，高效降解菌株降解机制的探究和降解基因的克隆研究无疑为安全的布洛芬降解工程菌株的构建和研发奠定了基础。
[0005] 尽管布洛芬的微生物降解较化学降解具有优势，但是某些菌株在氧化过程中产生的代谢副产物（羟基布洛芬和羧基布洛芬等）在水环境中显示出与布洛芬相近的毒理效应，因此微生物降解的生态风险仍然存在。筛选安全高效的布洛芬降解菌株，查明菌株降解途径并对该菌株的代谢中间产物和终产物进行毒理效应检测，则会提高该降解菌株用于布洛芬污染环境修复的安全性。高效降解菌株降解机理的探讨和降解基因的克隆研究无疑为安全的布洛芬降解工程菌株的构建和研发奠定了理论基础。
[0006] 基因敲除是上世纪80年代后期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，该技术除了可以中止某一基因的表达外，还可以引入新基因及定点突变。上世纪80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1987年，世界上首例小鼠基因打靶试验完成，试验者首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。目前最常用的基因敲除靶细胞是小鼠ES细胞，国际敲除小鼠协会（the International Knock-out Mouse Consortium，IKMC）的成立使得敲除所有小鼠基因的复杂性和费用降低，在其网站可浏览所有IKMC成员生产的载体、ES细胞、小鼠和种质资源等信息。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率很低（约百万分之一），导致筛选基因敲除成功的细胞很困难。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。
[0007] 微生物基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA重组系统，该方法为研究微生物基因的功能奠定了重要的技术基础。RecA重组系统是由RecA和RecBCD组成的E.coli内源性同源重组机构。Murphy首先利用噬菌体λ的重组功能采用线性ds DNA构建了重组分子，此研究拉开了用噬菌体λ的Red重组系统在E.coli中建立快速敲除原核基因的序幕。Red重组需要2个基因：redα与redβ。基因α产物是作用于线性ds DNA的5′-3′外切酶；基因β产物结合于ss DNA上，激发互补链退火，但不能促进DNA链的插入和自身交换。噬菌体λ编码的Gam蛋白抑制了宿主细胞中RecBCD的活性，辅助redα与redβ产物的重组功能。应用Red系统进行基因敲除可直接利用线性打靶DNA，两侧同源臂长度为
35-60bp即可发生同源重组且重组效率高。Murphy研究表明λ-Red介导的重组率比RecA重组系统高10-100倍。因为被引入受体的噬菌体编码的蛋白质促进了同源重组，Red同源重组操作在E.coli以及其他细菌菌株中均是可行的。
35-60bp即可发生同源重组且重组效率高。Murphy研究表明λ-Red介导的重组率比RecA重组系统高10-100倍。因为被引入受体的噬菌体编码的蛋白质促进了同源重组，Red同源重组操作在E.coli以及其他细菌菌株中均是可行的。
[0008] Anthony G.Hay的实验室从污水样品中分离到以布洛芬（500mg/L）为唯一碳源和能源的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）菌株Ibu-2，该菌株具有降解布洛芬独特途径，即去除布洛芬羧酸基侧链先于苯环裂解。我们随后报道了基于Ibu-2菌株的高效降解布洛芬亚克隆菌株构建以及降解调节因子基因定位研究，重点关注2个可降解布洛芬福斯质粒菌株3G7和4F6间位苯环裂解活性(meta-cleavage activity)差异的分子鉴定。根据出发布洛芬降解福斯质粒菌株4F6间位苯环裂解活性极显著地高于3G7的差异，提出3个假设：a.4F6菌株有2个邻苯二酚-2,3-双加氧酶（C23O）基因；b.4F6菌株有邻苯二酚降解的正调控因子；c.3G7菌株有邻苯二酚降解的负调控因子。我们先前的研究表明福斯质粒菌株4F6间位苯环裂解活性极显著地高于福斯质粒菌株3G7，为了探究其分子机制，我们开展了基于菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5（该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚2,3-双加氧酶基因内），利用λ-red同源重组酶质粒pKD46敲除4F6菌株中的C23O基因，获得新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5，拟验证上述a假设：4F6菌株有2个C23O基因，开展菌株3G7和4F6间位苯环裂解活性差异的分子鉴定工作。本研究将为从分子水平阐明布洛芬的微生物降解机理提供尝试，亦可丰富我国布洛芬这一医药品污染的微生物降解关键基因库。
发明内容
[0009] 本发明的目的旨在敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因，拟初步探明布洛芬降解基因组中影响布洛芬下游降解途径中邻苯二酚降解的调节因子。将为从分子水平阐明布洛芬的微生物降解机制提供尝试，提供了一种简便有效的定位并敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因（ipf C23O）的方法，为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础，亦可丰富我国布洛芬这一医药品污染的微生物降解关键基因库。
[0010] 为达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：
[0011] 原理：本研究主要运用Red重组系统对目的菌株的相关基因进行敲除，获得新的突变体，并开展后续的分子鉴定工作。具体为：以布洛芬降解克隆菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5（该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚2,3-双加氧酶基因内）为出发菌株，借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，敲除4F6菌株中的C23O基因，获得新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5。从而验证假设：4F6菌株有2个C23O基因，开展菌株3G7和4F6间位苯环裂解活性差异的分子鉴定工作。
[0012] 本发明提供的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法包括下列步骤：
[0013] （1）以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5。
[0014] （2）使用布洛芬邻苯二酚2,3-双加氧酶基因（Ipf C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的IpfC23O基因来对步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在。
[0015] （3）以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞。
[0016] （4）将λ-red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤（3）得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于LB（添加氯霉素和氨苄青霉素）双抗平板筛选到阳性转化子4F6-pKD46菌株。
[0017] （5）以步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5为模板,使用ipf23O F和R引物分别PCR扩增出突变体G9和H5中的线性DNA；制备步骤（4）所得到的阳性转化子4F6-pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46菌株中，于LB（添加氯霉素和四环素）双抗平板筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株。
[0018] （6）消除步骤（5）所得的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株中的重组质粒pKD46；使用ipf23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体。
[0019] （7）对步骤（1）和步骤（6）所得的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5(分别简写为3-G9,3-H5，4-G9和4-H5)以及步骤（1）中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性（MC）测定。
[0020] 具体地，本发明提供的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法包括下列步骤：
[0021] （1）以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5。
[0022] （2）使用布洛芬邻苯二酚2,3-双加氧酶基因（Ipf C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的IpfC23O基因来对步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在。
[0023] 具体方法为：使用布洛芬邻苯二酚2,3-双加氧酶基因（Ipf C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5中的Ipf C23O基因，据此确认所构建菌株3G7-G9和3G7-H5中确实存在Tn5插入片段。
[0024] 其中，PCR反应引物为：Ipf C23OF:5'-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3'；Ipf C23OR:5'-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3'。反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，35个循环；72℃10分钟。
[0025] 3G7菌株扩增出的C23O基因大约1.0kb，从突变体3G7-G9和3G7-H5扩增出的C23O基因在2.0-3.0kb之间。对比福斯质粒文库克隆菌株3G7中的C23O基因，Tn5转座子插入导致突变体菌株中扩增出的C23O基因约增加了1.0kb多，推断Tn5确实存在于出发突变体菌株中。
[0026] （3）以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞。
[0027] 具体方法为：转移600μL4F6菌株的过夜培养液至5.4mL添加氯霉素的LB培养液中，37℃培养3小时。上述培养液分装至1.5mL离心管，14,000rpm离心1.5分钟，弃上清，重复离心2次。用1mL300mM的冰冻蔗糖洗涤上述细胞3次，再次悬浮至100μL冰冻蔗糖中获得感受态细胞。
[0028] （4）将λ-red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤（3）得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于LB（添加氯霉素和氨苄青霉素）双抗平板筛选到阳性转化子4F6-pKD46菌株。
[0029] 具体方法为：添加80μL的感受态细胞4F6和1mLλ-red同源重组酶质粒pKD46至冰冻电击转化杯，选择1.8kv电击，迅速加入600μL LB，30℃恢复培养1小时。8,500rpm离心1分钟，移去500μL培养液将剩余细胞涂布于LB（添加氯霉素和氨苄青霉素）双抗平板筛选到阳性转化子，30℃培养，所生长菌株命名为4F6-pKD46。挑选8株单克隆4℃保存备用。
[0030] （5）以步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5为模板，使用ipf23O F和R引物分别PCR扩增出突变体G9和H5中的线性DNA；制备步骤（4）所得到的阳性转化子4F6-pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46菌株中，于LB（添加氯霉素和四环素）双抗平板筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株。
[0031] 具体方法为：其中的PCR反应条件同步骤（2）。4F6-pKD46菌株感受态的制备同步骤（3）。琼脂糖凝胶检测表明3个G9模板和4个H5模板扩增出的条带均在2.0-3.0kb之TM间。分别各自合并上述G9和H5样品，再次用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit试剂盒浓缩提纯该线性DNA。将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6-pKD46菌株中，于LB（添加氯霉素和四环素）双抗平板筛选新的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株。
[0032] （6）消除步骤（5）所得的阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株中的重组质粒pKD46；使用ipf23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体。
[0033] 具体方法为：其中的PCR反应条件同步骤（2）。将布洛芬福斯质粒文库克隆出发菌株3G7和4F6转接至添加氨苄青霉素的LB平板以确认其没有氨苄青霉素抗性。之后将4F6-G9和4F6-H5突变株单菌落划线至LB（添加氯霉素和四环素）双抗平板，42℃培养，以消除重组质粒pKD46。相同菌落再次转接至LB平板（添加氨苄青霉素）30℃培养。连续划线2次，即42℃下pKD46质粒被消除2次后，LB平板（添加氨苄青霉素）上无菌落形成。初步表明4F6的Tn5突变体内已经成功消除了质粒pKD46。
[0034] 使用ipf23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体。4F6-G9和4F6-H5为模板的PCR检测结果表明扩增出的ipf C23O基因与阳性对照3G7-G9和3G7-H5均在2.0-3.0kb之间，结合LB抗性平板试验，断定借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，消除pKD46质粒，敲除4F6菌株中C23O基因，构建获得了4F6-G9和4F6-H5突变体。
[0035] （7）对步骤（1）和步骤（6）所得的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5(分别简写为3-G9,3-H5，4-G9和4-H5)以及步骤（1）中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性（MC）测定。
[0036] 具体方法为：邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）催化邻苯二酚外开环即间位裂解，其裂解产物2-羟基粘糠酸半醛（2-HMS）是一种黄色物质，最大吸收波长为375nm，30℃下测量375nm处吸光度增加值用以测定C23O酶活，但此类方法操作繁琐、耗时，操作过程中难以避免酶活损失。我们在上述测量方法基础上略作改进，使用multi-detection microplate reader spectrophotometer(Synergy HT TM,Bio-Tek instruments,inC.Winooski,V.T.,USA)同时读取各菌株的OD375和OD600值，连续检测4小时，间隔0.5小时读取数据，采用KC4V3.4.软件分析记录实验数据。
[0037] 分别接种上述菌株的单菌落至16mL添加不同抗生素的LB培养液，37℃过夜培养。吸取3mL新鲜培养液再次转接至12mL LB，37℃培养4小时。9,000rpm离心10分钟，再次悬浮至5mL LB。准备2种混合培养液：其一为5mL LB中添加5μL拷贝数调控溶液（1000x）和5μL布洛芬母液；其二为5mL LB中添加5μL拷贝数调控溶液（1000x）和5μL甲醇。在eppendorf离心管中，将200μL细胞悬浮液分别接种至上述500μL混合培养液中，37℃过夜培养。8,500rpm离心2分钟（包括3个重复，2个处理）。1mL磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞，8,500rpm再次离心2分钟。细胞重新悬浮于200μL磷酸盐缓冲液中。将上述200μL细胞悬浮液添加至96孔细胞培养板，磷酸盐缓冲液作1:10稀释2次：即吸取20μL原始细胞悬浮液至另一孔中，添加180μL磷酸盐缓冲液充分混匀。2μL邻苯二酚添加至各反应孔中。
[0038] 福斯质粒文库克隆菌株4F6的MC活性高于菌株3G7。添加布洛芬诱导后，4F6的MC活性明显高于3G7。所有的4株突变株MC活性均比出发菌株3G7和4F6低，添加布洛芬诱导后结果相同。4株突变株OD375/OD600值几乎与3G7出发菌株相同。上述数据表明从原始出发菌株4F6敲除C23O基因所构建的4F6突变株几乎具有与3G7突变株相同的MC活性。尽管4-G9菌株比3-G9菌株V2/OD600值略高，但是仍旧低于出发菌株3G7的V2/OD600值。菌株间位苯环裂解活性测定数据，结合PCR检测结果可以初步推断4F6菌株中仅有1个C23O基因。
[0039] 本研究尽管是利用传统的DNA同源重组系统，但是仍然准确便捷地敲除了菌株4F6的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，构建了其Tn5转座子插入突变体。该结果再次印证了Red体系对于催化线性分子和环状分子之间的重组更为有效。
[0040] 其中，在本发明上述方法中，步骤（1）中的布洛芬福斯质粒文库克隆菌株3G7和4F6的筛选以康奈尔大学微生物系Dr.Anthony G.Hay实验室分离所得布洛芬降解菌株TM
Ibu-2为出发菌株，利用该菌株的染色体DNA，按照Epicentre公司的CopyControl Fosmid Library Production Kit试剂盒的使用说明，在96孔培养板构建该菌株的福斯质粒文库。
福斯质粒文库需要900个克隆以涵盖大约7×的染色体基因组，添加25%的甘油-80℃保存文库。
Ibu-2为出发菌株，利用该菌株的染色体DNA，按照Epicentre公司的CopyControl Fosmid Library Production Kit试剂盒的使用说明，在96孔培养板构建该菌株的福斯质粒文库。
福斯质粒文库需要900个克隆以涵盖大约7×的染色体基因组，添加25%的甘油-80℃保存文库。
[0041] 用影印仪转接其中1套保存的文库至添加无机盐培养液的96孔培养板，待文库中所有菌株均存活后，添加50mg/L布洛芬至上述文库培养板的液体培养基中，检测发现转化子3G7是福斯质粒文库中唯一积累深褐色邻苯二酚多聚物的阳性克隆菌株。离心菌体，收集的上清液经气相色谱/质谱（GC/MS）检验证实，该产物是异丁基邻苯二酚。
[0042] 当添加邻苯二酚至上述文库培养板的液体培养基中，检测发现4F6克隆菌株积累黄色产物。此黄色产物表明产生了间位苯环裂解代谢物，因此被认为是产生间位苯环裂解代谢物的阳性指示代谢物。将4F6菌株划线转接至布洛芬为唯一碳源的无机盐培养基，4F6生长良好，表明4F6菌株也能够降解利用布洛芬。
[0043] 据此表明3G7是福斯质粒文库中唯一积累深褐色邻苯二酚多聚物的阳性克隆菌株；而4F6菌株虽然能够降解利用布洛芬，但是并不积累深褐色邻苯二酚多聚物中间产物。鉴于上述差异，我们筛选布洛芬福斯质粒文库克隆菌株3G7和4F6为布洛芬降解备选菌株。
[0044] 本发明涉及生物材料保藏信息如下：
[0045] 本发明所述的一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法中涉及到的4株菌株均为大肠杆菌Escherichia coli，菌株名称、保藏编号和分类命名分别是：
[0046] （1）4F6菌株，保藏编号为CGMCC No.6719，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株；
[0047] （2）4F6-H5菌株，保藏编号为CGMCC No.6720，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6的Tn5转座子插入突变株；
[0048] （3）4F6-G9菌株，保藏编号为CGMCC No.6721，分类命名为布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6的Tn5转座子插入突变株；
[0049] （4）3G7菌株，保藏编号为CGMCC No.6722，分类命名为布洛芬福斯质粒克隆菌株。
[0050] 上述菌株已于2012年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
[0051] 在本发明上述方法中，步骤（1）中以上述福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株。构建转座子插入突变体文库可以鉴定阳性克隆菌株的降解基因，验证其降解功能。挑选福斯质粒克隆文库中阳性克隆菌株3G7，即积累深褐色邻苯二酚多聚物的克隆菌株，进一步构建其转座子插入突变体文库。由于转座子的插入，使得该位点基因结构破坏，继而导致相关功能丧失，产生不同的突变体，这些功能丧失突变体为确定该基因功能提供了便利。按照Epicentre公司EZ::TNInsertion Kit试剂盒的使用说明，将反应物包装至噬菌体提取物中（MaxPlax Lambda Packaging Extract,Epicentre），转染E.coli epi300，在添加氯霉素（终浓度25mg/L）和四环素（终浓度10mg/L）的双抗LB平板上筛选阳性菌株。将转座子突变体克隆文库保存至96孔培养板中，重点追踪转座子插入导致丧失积累褐色邻苯二酚聚合物的突变体，因为该Tn5插入位点基因一定与代谢布洛芬产生异丁基-邻苯二酚密切相关。对该功能丧失突变体，围绕Tn5插入位点应用转座子特异性正向和反向引物测序的结果可以较好地揭示插入位点基因的功能。
[0052] 从所构建的转座子插入突变体文库中筛选到福斯质粒菌株3G7的Tn5插入突变株3G7-G9和3G7-H5。对该功能丧失突变体围绕Tn5插入位点应用转座子特异性正向引物（FP）和反向引物（RP）进行测序。该引物序列详见Epicentre网站上试剂盒使用说明书（EZ::TNInsertion Kit）。结果表明该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因内。这为本专利提供了原始突变体菌株。
[0053] 其中，在本发明所述方法中，步骤（2）、（5）和（6）中的PCR反应引物为：Ipf C23OF:5'-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3'；Ipf C23OR:5'-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3'。反应条件为：95℃，5分钟;95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环;72℃，10分钟。
[0055] 在本发明所述方法中，步骤（3）-（5）中的LB培养基中氯霉素终浓度为12.5μg/mL，氨苄青霉素终浓度为150μg/mL，四环素终浓度为5μg/mL。
[0056] 另外，在本发明所述方法中，步骤（7）间位苯环裂解活性测定方法有所改进。邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）催化邻苯二酚外开环即间位裂解，其裂解产物2-羟基粘糠酸半醛（2-HMS）是一种黄色物质，最大吸收波长为375nm。30℃下测量375nm处吸光度增加值是传统的用以测定C23O酶活的方法，但此类方法操作繁琐、耗时，操作过程中难以避免酶活损失。本发明在上述测量方法基础上略作改进，使用multi-detection microplate reader spectrophotometer(Synergy HT TM,Bio-Tek instruments,inC.Winooski,V.T.,USA)同时读取各菌株的OD375和OD600值，连续检测4h，间隔0.5h读取数据，采用KC4V3.4.软件分析记录实验数据。
[0057] 本发明的有益效果：
[0058] 本发明利用传统的DNA同源重组系统，准确便捷地敲除了布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，构建了其Tn5转座子插入突变体。该结果再次印证了Red体系对于催化线性分子和环状分子之间的重组更为有效。本发明有助于推动我国水资源布洛芬污染的微生物降解基因的精细定位，亦可为布洛芬降解调节因子基因定位的研究奠定基础。附图说明
[0059] 图1是3G7Tn5突变体的确认；
[0060] 第1泳道:3G7-G9;第2泳道：3G7-H5;第3泳道:3G7-G9;第4泳道:3G7-H5;第5泳道:阴性对照;第6泳道：阳性对照.
[0061] M:1kb标准分子量（千碱基对表示）.
[0062] 图2是3G7-G9和3G7-H5中PCR扩增线性DNA的确认
[0063] 1-3泳道:3G7-G9;4-7泳道:3G7-H5
[0064] M:1kb标准分子量（千碱基对表示）.
[0065] 图3是pKD46质粒消除1次后4F6Tn5突变体的PCR确认
[0066] 1-2泳道:4F6-G9;3-4泳道:4F6-H5;5泳道:阴性对照;6泳道:阳性对照4F6.[0067] M:1kb标准分子量（千碱基对表示）
[0068] 图4是pKD46质粒消除2次后4F6Tn5突变体的PCR确认
[0069] 左图:第一批;1-8泳道:4F6-G9;9泳道:4F6-H5;10泳道:阴性对照;11-13泳道:阳性对照(分别是4F6,3G7-G9,3G7-H5).
[0070] 右图:第二批;1-3泳道:4F6-G9;4-6泳道:4F6-H5;7泳道:阴性对照;8-10泳道:阳性对照(分别是4F6,3G7-G9,3G7-H5).
[0071] M:1kb标准分子量（千碱基对表示）.
[0072] 图5是供试菌株Mean V2/OD600
[0073] 注:mean V2=ΔOD375/ΔT,数值是在0-2h测得;2h时的OD600.
[0074] 每个菌株重复三次.
[0075] 柱状图表示平均数值和标准偏差.
[0076] 180μL磷酸缓冲液中添加2μL邻苯二酚作为空白对照.
[0077] 缩写:3-G9:3G7-G9菌株;4-G9:4F6-G9菌株;3-H5:3G7-H5菌株;4-H5:4F6-H5菌株
[0078] 图6是2h时各菌株OD375/OD600。
具体实施方式
[0079] 以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。
[0080] 实施例一：福斯质粒文库克隆菌株3G7Tn5突变体G9和H5的确认
[0081] （1）使用MilliQ system制备PCR反应试验用纯水之后，再次使用0.2μm无菌滤膜过滤备用。
[0082] （2）将上述无菌dd H2O分装至eppendorf离心管，UV灯下灭菌10min，作为PCR反应所需用水。
[0083] （3）Start PCR Master Mix buffers10μL，引物ipf23O F（5'-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3'）和R（5'-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3'）各1μL，补足dd H2O至20μL。加入微量单菌落（分别是3G7的Tn5突变体G9和3G7的Tn5突变体H5）于PCR反应管，不加菌落的PCR反应管为阴性对照，添加EPI3003G7单菌落的PCR反应管作为阳性对照。
[0084] （4）PCR反应结束，分别添加5μL1kb Marker和10μL PCR反应液至1.0%(w/v)琼脂糖凝胶孔，168伏持续1小时。
[0085] 结果见附图1。3G7菌株扩增出的C23O基因大约1.0kb(lane6)，从突变体3G7-G9和3G7-H5扩增出的C23O基因在2.0-3.0kb之间(lane1-4)，阴性对照（lane5）无扩增条带。很显然，对比福斯质粒文库克隆菌株3G7中的C23O基因，Tn5转座子插入导致突变体菌株中扩增出的C23O基因约增加了1.0kb多，初步推断Tn5确实存在于出发突变体菌株中。另外，我们已经确认3G7菌株中Ipf C23O基因在布洛芬降解基因簇中位于844-1718bp之间，Tn5插入位点在1500bp处，且Tn5的片段长度约为1100-1200bp，这与图1检测结果相符。
[0086] 实施例二重组质粒pKD46的电击转化
[0087] 首先制备4F6菌株的感受态细胞，具体操作如下：
[0088] （1）转移600μL4F6菌株的过夜培养液至5.4mL添加氯霉素的LB培养液中，（抗生素添加量参见表1），37℃培养3小时。
[0089] （2）上述培养液分装至1.5mL离心管，14,000rpm离心1.5分钟,弃上清，重复离心2次。
[0090] （3）用1mL300mM的冰冻蔗糖洗涤上述细胞3次，再次悬浮至100μL冰冻蔗糖中。
[0091] （4）添加80μL的感受态细胞和1μL的pKD46质粒至冰冻电击转化杯（使用宽度为1毫米的电击转化杯），选择1.8千伏电击，迅速加入600μL LB培养液，30℃恢复培养1小时。8,500rpm离心1.0分钟，移去500μL培养液，将剩余细胞涂布于添加氯霉素和氨苄青霉素的LB双抗平板，30℃培养，所生长菌株命名为4F6-pKD46。
[0092] 筛选到阳性转化子4F6-pKD46若干，挑选8株单克隆4℃保存备用。
[0093] 表1菌株和质粒
[0094]
[0095]
[0096] 注：Cmr表示氯霉素抗性(LB中终浓度12.5μg/mL);Ampr表示氨苄青霉素抗性(LBr中终浓度150μg/mL);Tet表示四环素抗性(LB中终浓度5μg/mL).
[0097] 实施例三3G7Tn5突变体中线性DNA的电击转化
[0098] (1)使用ipf23O F和R引物分别扩增3G7的Tn5突变体G9和H5中的线性DNA，PCR扩增步骤同实施例一。
[0099] (2)切胶，ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit纯化回收样品，1.0%(w/v)琼脂糖凝胶检测上述线性DNA。
[0100] PCR扩增出的3G7Tn5突变体G9和H5中的线性DNA琼脂糖凝胶检测见图2。3个G9模板和4个H5模板扩增出的条带均在2.0-3.0kb之间。与图1结果相同。
[0101] 4F6-pKD46菌株的感受态细胞制备过程中需要添加1000×拷贝数诱导溶液培养1.5小时，其余电击转化方法同实施例二，设置2个重复。
[0102] (3)细胞涂布于添加氯霉素和四环素的LB双抗平板，30℃培养，所生长菌株分别命名为4F6-G9和4F6-H5。上述试验重复2次。
[0103] 2批试验分别得到了阳性转化子4F6-G9和4F6-H5菌株，第一批试验中突变体4F6-G9克隆数较多，第二批试验阳性转化子4F6-H5克隆数居多。
[0104] 实施例四重组质粒pKD46的消除
[0105] (1)质粒pKD46是温敏型质粒，42℃可以较有效地消除该质粒。将出发菌株EPI3003G7和4F6转接至添加氨苄青霉素的LB平板以确认其没有氨苄青霉素抗性。
[0106] (2)将实施例三所获得的4F6-G9和4F6-H5突变株划线至添加氯霉素和四环素的LB双抗平板，42℃培养，相同菌落再次转接至添加氨苄青霉素的LB平板30℃培养。连续划线2次，直到在含有氨苄青霉素的LB平板上没有菌落形成。
[0107] (3)使用Ipf C23O F和Ipf C23O R引物，开展菌落PCR的具体操作同实施例一，再次确认4F6-G9和4F6-H5突变体。
[0108] 消除pKD46质粒1次后，Ipf C23O F和R引物进行菌落PCR以确认4F6-G9和4F6-H5突变体。附图3显示，质粒消除1次后，4F6-G9和4F6-H5中扩增所得ipf C23O基因在1-1.6kb之间（lane2-4），阳性对照4F6菌株中约为1.0kb。借助来自pKD46质粒的λ-red同源重组酶，Tn5片段敲除取代了部分ipf C23O基因，但是重组结合于4F6受体菌中的该Tn5片段可能小于位于ipf C23O基因内的被取代片段，因此出现该条带并未出现在
2.0-3.0kb之间。42℃下pKD46质粒被消除2次后，氨苄青霉素平板上无菌落形成。初步表明4F6的Tn5突变体内已经成功消除了质粒pKD46。
2.0-3.0kb之间。42℃下pKD46质粒被消除2次后，氨苄青霉素平板上无菌落形成。初步表明4F6的Tn5突变体内已经成功消除了质粒pKD46。
[0109] 菌落PCR确认检测结果见附图4，图4（左）表明，lane7和9扩增出的ipf C23O gene大抵在2.0-3.0kb之间，鉴于第一批试验检测到的阳性转化子效果不佳，我们继续开展第二批试验。图4（右）4F6-G9和4F6-H5为模板的PCR检测结果表明扩增出的ipf C23O基因与阳性对照3G7-G9和3G7-H5均在2.0-3.0kb之间，结合LB抗性平板试验，我们断定借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，消除pKD46质粒，敲除4F6菌株中C23O基因，构建获得了4F6-G9和4F6-H5突变体。
[0110] 实施例五菌株间位苯环裂解活性测定
[0111] 对已经构建的Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5(分别简写为3-G9和3-H5)连同本试验构建的4F6-G9和4F6-H5(分别简写为4-G9和4-H5)突变体以及原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性测定。
[0112] (1)分别接种上述菌株的单菌落至16mL添加不同抗生素的LB（表1），37℃过夜培养。吸取3mL新鲜培养液再次转接至12mL LB，37℃培养4小时。9,000rpm离心10分钟，再次悬浮至5mL的LB培养液中。
[0113] (2)准备2种混合培养液：其一为5mL LB中添加5μL拷贝数调控溶液（1000x）和5μL布洛芬母液；其二为5mL LB中添加5μL拷贝数调控溶液（1000x）和5μL甲醇（制备布洛芬母液的溶剂）。
[0114] (3)在eppendorf离心管中，将200μL细胞悬浮液分别接种至上述500μL混合培养液中，37℃过夜培养。8,500rpm离心2分钟（包括3个重复，2个处理）。1mL磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞，8500rpm再次离心2分钟。细胞重新悬浮于200μL磷酸盐缓冲液中。
[0115] (4)将上述200μL细胞悬浮液添加至96孔细胞培养板，磷酸盐缓冲液作1:10稀释2次：即吸取20μL原始细胞悬浮液至另一孔中，添加180μL磷酸盐缓冲液充分混匀。随后将2μL邻苯二酚添加至各反应孔中。
[0116] (5)使用multi-detection microplate reader spectrophotometer同时读取各菌株的OD375和OD600值，连续检测4小时，间隔0.5小时读取数据，采用KC4V3.4.软件分析记录实验数据。
[0117] 福斯质粒文库克隆菌株4F6的MC活性高于菌株3G7。添加布洛芬诱导后，4F6的MC活性明显高于3G7。所有的4株突变株MC活性均比出发菌株3G7和4F6低，添加布洛芬诱导后结果相同(附图5)。附图6显示，4株突变株OD375/OD600值几乎与3G7出发菌株相同。上述数据表明从原始出发菌株4F6敲除C23O基因所构建的4F6突变株几乎具有与3G7突变株相同的MC活性。尽管4-G9菌株比3-G9菌株V2/OD600值略高(图3-5)，但是仍旧低于出发菌株3G7的V2/OD600值。
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