技术领域
[0001] 本
发明涉及分子
生物医学领域，特别涉及用于结核耐药诊断的血清代谢标志物及其应用。
背景技术
[0002] 结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的、以
呼吸道传播为主的慢性传染病，近年来，多药耐药结核病(Multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(Extensively rug resistant tuberculosis，XDR-TB)现象已变得日趋严重。根据2018年WHO报道，全球范围内2017年新增的670万结核病患者中，约6.8％为MDR-TB，其中印度、中国和俄罗斯分别占24％、13％、10％。MDR-TB是结核分枝杆菌至少对异烟肼(isoniazid,INH)和利福平(rifampicin,RIF)这两个抗结核
治疗一线药物耐药，是导致患者死亡的主要原因，大多数结核病相关的死亡可以通过早期诊断和治疗进行
预防，这提示我们使用快速、准确的工具对于结核的早期诊断异常重要。
[0003] 耐药结核的诊断主要包括表型检测和分子基因型检测。作为结核分支杆菌耐药表型检测的主要方法，传统药物敏感性检测、
显微镜观察药物敏感性检测等存在着检测周期长、成本高等缺点。分子基因型药敏检测技术，如GeneXpert MTB/RIF和Xpert法、实时
荧光定量探针溶解曲线法、线性探针技术、
基因芯片、DNA测序技术，与表型检测法相比具有检测迅速、特异性和灵敏度高的特点，但它无法鉴定未知的耐药突变和部分一、二线药物耐药突变，且对异质性耐药标本检测敏感性低，因此在临床上的应用受到了一定的限制。
[0004] 小分子
代谢物作为细胞调控过程的终产物，其种类和数量的变化被视为生命体对基因或环境变化的最终响应。GC-MS、LC-MS和NMR等高通量、高灵敏度的代谢组学检测技术，是目前代谢物检测的主流方法。迄今为止，代谢组学技术已广泛应用于临床研究中，如在新的生物标志物识别、标志物如何有助于改善
疾病的发现和诊断等，比如乙型
肝炎血清代谢标志物(侯玉洁,祝文君,陈长功,et al.基于气相色谱-质谱联用技术的乙型肝炎血清代谢标志物的探究[J].色谱,2015,33(4):383-388.)、糖尿病肾病早期诊断的血清代谢标志物(糖尿病肾病早期诊断的血清代谢标志物测定方法:,CN102901789A[P].2013.)、急性心肌梗死患者血清代谢标志物(急性心肌梗死患者血清代谢标志物的筛选研究[D].天津医科大学,2013.)、活动性
肺结核血清代谢标志物(杜岩青.活动性肺结核血清代谢轮廓研究[D].天津医科大学,2014.)等。但至今没有耐药TB血清代谢物的相关报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供用于结核耐药诊断的血清代谢标志物及其应用。
[0006] 在本发明的第一方面，本发明提出了：
[0007] 用于结核耐药诊断的血清代谢标志物，所述血清代谢物选自硬脂酰谷
氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二
甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid、乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸
四环素、Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-
酮-八烷醇胺、TG(12:
0/12:0/20:1(11Z))[iso3]、三甲胺、藜芦生
碱、Cer(d18:0/12:0)、PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:
0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)中的至少一种。
[0008] 进一步地，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid用于预测结核耐药
风险。
[0009] 进一步地，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A七种代谢物的丰度上调，且9,15-dioxo-
11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid代谢物丰度下调标志着结核耐药风险高。
[0010] 进一步地，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸四环素用于预测结核耐异烟肼药物风险。
[0011] 进一步地，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)四种代谢物的丰度上调，且油酸四环素代谢物的下调标志着结核耐异烟肼风险高。
[0012] 进一步地，Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]用于预测结核耐利福平药物风险。
[0013] 进一步地，Ala His Pro Thr、十六烷基胺丰度的上调，且Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]丰度的下调标志着结核耐利福平风险高。
[0014] 进一步地，三甲胺、藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)用于预测结核耐多药风险。
[0015] 进一步地，三甲胺丰度的上调，且藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)丰度的下调标志着结核耐多药风险高。
[0016] 进一步地，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)用于预测结核多耐药风险。
[0017] 进一步地，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)丰度的上调标志着结核多耐药风险高。
[0018] 在本发明的第二方面，本发明提出了：
[0019] 定量血清代谢物含量的
试剂在制备结核耐药诊断试剂中的应用，其中，血清代谢物选自硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid、乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸四环素、Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]、三甲胺、藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)、PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)中的至少一种。
[0020] 进一步地，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid用于预测结核耐药风险。
[0021] 进一步地，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A七种代谢物的丰度上调，且9,15-dioxo-
11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid代谢物丰度下调标志着结核耐药风险高。
[0022] 进一步地，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸四环素用于预测结核耐异烟肼药物风险。
[0023] 进一步地，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)四种代谢物的丰度上调，且油酸四环素代谢物的下调标志着结核耐异烟肼风险高。
[0024] 进一步地，Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]用于预测结核耐利福平药物风险。
[0025] 进一步地，Ala His Pro Thr、十六烷基胺丰度的上调，且Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]丰度的下调标志着结核耐利福平风险高。
[0026] 进一步地，三甲胺、藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)用于预测结核耐多药风险。
[0027] 进一步地，三甲胺丰度的上调，且藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)丰度的下调标志着结核耐多药风险高。
[0028] 进一步地，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)用于预测结核多耐药风险。
[0029] 进一步地，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)丰度的上调标志着结核多耐药风险高。
[0030] 本发明的有益效果是：
[0031] 本发明提供了一种快速诊断结核耐药类型的生物标志物及其应用，根据不同结核耐药类型个体的血清代谢物进行分析，从血清代谢物的
角度为结核耐药诊断提供新的思路。
附图说明
[0032] 图1血清代谢物火山图：在MR-INH、MR-RFP、MDR、PR组中的表达。
[0033] 图2血清代谢物热图
聚类分析；在MR-INH、MR-RFP、MDR、PR组中的表达。
具体实施方式
[0034] 下面进一步列举
实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
[0035] 下述实施例中涉及的血清代谢物对应的IUPAC Name如下：
[0036]
[0037]
[0038]
[0039] 实施例1
[0040]
发明人基于测定的总计30例结核药敏(drug sensitivity,DS)、8例单耐药异烟肼(monoresistance isoniazide,MR-INH)、2例单耐药利福平(monoresistance rifampin,MR-RFP)、14例耐多药(Multidrug resistance,MDR)、24例多耐药(polyresistance,PR)患者的血清样本代谢物结果分析，
鉴别出其中的代谢标志物。
[0041] 耐药和药敏组差异代谢物的相对丰度如表1所示。
[0042] 表1结核耐药和DS组差异代谢物的相对丰度
[0043]
[0044] 通过对结核耐药个体和结核药敏个体的血清样本的代谢物丰度进行差异比较分析，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid在结核耐药个体的痰液样本含量显著高于结核药敏个体的含量，且具有统计学意义，因此硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A、9,15-dioxo-11R-hydroxy-2,3,4,5-tetranor-prostan-1,20-dioic acid可作为结核耐药的潜在标志物，硬脂酰谷氨酸、5-Pentacosyl-1,3-benzenediol、25-羟基胆固醇、1alpha,25-dihydroxy-26,27-dimethyl-20,21-didehydro-23-oxavitamin D3、邻苯二甲酸单2-乙基己酯、Eicosanoyl-EA、Penaresidin A七种代谢物的丰度上调，且Tetranor-PGEM-d6代谢物丰度下调标志着结核耐药风险高。
[0045] 耐异烟肼和药敏组差异代谢物的相对丰度如表2所示，血清代谢物火山图如图1A。
[0046] 表2 MR-INH和DS组差异代谢物的相对丰度
[0047]
[0048] 通过对结核异烟肼耐药个体和结核药敏个体的血清样本的代谢物丰度进行差异比较分析，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸四环素在结核异烟肼耐药个体的痰液样本含量显著高于结核药敏个体的含量，且具有统计学意义，因此乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)、油酸四环素可作为结核耐异烟肼的潜在标志物，乙酰胍、氨基戊醇、PAF C-16、PE(18:0/0:0)四种代谢物的丰度上调，且油酸四环素代谢物的下调标志着结核耐异烟肼风险高。
[0049] 耐利福平和药敏组差异代谢物的相对丰度如表3所示，血清代谢物火山图如图1B。
[0050] 表3 MR-RFP和DS组差异代谢物的相对丰度
[0051]
[0052]
[0053] 通过对耐利福平个体和结核药敏个体的痰液样本的代谢物丰度进行差异比较分析，Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]在结核利福平耐药个体的痰液样本含量显著高于结核药敏个体的含量，且具有统计学意义，因此Ala His Pro Thr、十六烷基胺、Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]可作为结核耐利福平的潜在标志物，Ala His Pro Thr、十六烷基胺丰度的上调，且Glycinoprenol-9、对苯二酸、2-亚胺-4-甲基哌啶、2-羟基-24-酮-八烷醇胺、TG(12:0/12:0/20:1(11Z))[iso3]丰度的下调标志着结核耐利福平风险高。
[0054] 结核耐多药和药敏组差异代谢物的相对丰度如表4所示，血清代谢物火山图如图1C。
[0055] 表4 MDR和DS组差异代谢物的相对丰度
[0056]
[0057] 通过对结核耐多药个体和结核药敏个体的痰液样本的代谢物丰度进行差异比较分析，三甲胺、藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)在结核耐多药个体的痰液样本含量显著高于结核药敏个体的含量，且具有统计学意义，因此三甲胺、藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)可作为结核耐多药的潜在标志物，三甲胺丰度的上调，且藜芦生碱、Cer(d18:0/12:0)丰度的下调标志着结核耐多药风险高。
[0058] 结核多耐药和药敏组差异代谢物的相对丰度如表5所示，血清代谢物火山图如图1D。
[0059] 表5 PR和DS组差异代谢物的相对丰度
[0060]
[0061]
[0062] 通过对结核多耐药个体和结核药敏个体的痰液样本的代谢物丰度进行差异比较分析，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)在结核多耐药药个体的痰液样本含量显著高于结核药敏个体的含量，且具有统计学意义，因此PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:0(2OH))、PG(14:0/14:0)可作为结核多耐药的潜在标志物，PIP(18:1(11Z)/18:3(6Z,
9Z,12Z))、Pro ArgTrp Tyr、N-甲基二辛基胺、His HisArgArg、甘油氨基酸、Cer(d18:0/20:
0(2OH))、PG(14:0/14:0)丰度的上调标志着结核多耐药风险高。
[0064] 发明人另外收集了共30个样品作为测试集，其中药敏8人，耐异烟肼6人，耐利福平3人，耐多药6人，多耐药7人。所述的代谢标志物在人群中的丰度情况如表6～10所示：
[0065] 表6结核耐药和DS组差异代谢物的相对丰度
[0066]
[0067] 表7 MR-INH和DS组差异代谢物的相对丰度
[0068]
[0069] 表8 MR-RFP和DS组差异代谢物的相对丰度
[0070]
[0071] 表9 MDR和DS组差异代谢物的相对丰度
[0072]
[0073] 表10 PR和DS组差异代谢物的相对丰度
[0074]
[0075]
[0076] 预测结果如表11～15所示：
[0077] 表11耐药分类模型评估混淆矩阵
[0078]
[0079] 表12耐异烟肼分类模型评估混淆矩阵
[0080]
[0081] 表13耐利福平分类模型评估混淆矩阵
[0082]
[0083] 表14耐多药分类模型评估混淆矩阵
[0084]
[0085] 表15多耐药分类模型评估混淆矩阵
[0086]
[0087] 由上述结果可知，本发明中的标志物及预测模型表现良好。对于耐药分类模型，模型预测了22个阳性结果，通过混淆矩阵评估，其中20个真阳性，1个
假阳性，2个假阴性，准确度达到了90％(表11)。对于耐异烟肼，模型预测了6个阳性结果，其中5个真阳性，1个假阳性，1个假阴性结果，准确度达到了93.33％(表12)。对于耐利福平分类模型，模型预测了3个阳性结果，通过混淆矩阵评估，其中2个真阳性，2个假阳性，1个假阴性，准确度达到了90％(表13)。对于耐多药，模型预测了6个阳性结果，其中5个真阳性，2个假阳性，1个假阴性，准确度达90％(表14)。对于多耐药，模型预测了7个阳性结果，其中6个真阳性，1个假阳性，1个假阴性结果，准确度达到了93.33％(表15)。
