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兽用促红细胞生成素和类似物

阅读：491发布：2020-05-11

专利汇可以提供兽用促红细胞生成素和类似物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了涉及具有一个或多个另外的糖基化位点的猫促红细胞生成素(EPO)多肽类似物以及生产和使用所述猫促红细胞生成素多肽类似物治疗伴侣动物的贫血的方法的各种实施方案。还提供了涉及在第二结合位点具有突变的EPO多肽、包含EPO受体的细胞外结构域的多肽、以及使用所述多肽治疗哺乳动物的红细胞增多症的方法的各种实施方案。，下面是兽用促红细胞生成素和类似物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种促红细胞生成素(EPO)多肽，其除了包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13中不存在的至少一个N连接的糖基化位点的存在之外还包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，其中所述N连接的糖基化位点包含序列天冬酰胺-xaa-丝氨酸或天冬酰胺-xaa-苏氨酸，其中xaa是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且其中一个N连接的糖基化位点不与另一个N连接的糖基化位点重叠。
2.根据权利要求1所述的EPO多肽，其中所述至少一个N连接的糖基化位点中的每一个存在于：
a)选自SEQ ID NO:2的第47-49、55-57、56-58、60-62、61-63、79-81、82-84、91-93、92-
94、97-99、98-100、99-101、112-114、113-115、114-116、115-117、116-118、137-139、140-
142、141-143、142-144、143-145、144-146、145-147、146-148、147-149、148-150、149-151、
150-152、161-163、162-164、184-186和186-188位的位置；或
b)选自SEQ ID NO:13的第21-23、29-31、30-32、34-36、35-37、53-55、56-58、65-67、66-
68、71-73、72-74、73-75、86-88、87-89、88-90、89-91、90-92、111-113、114-116、115-117、
116-118、117-119、118-120、119-121、120-122、121-123、122-124、123-125、124-126、135-
137、136-138、158-160和162-164位的位置。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的EPO多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:4的第113位的位置处的缬氨酸。
4.根据权利要求1至4中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第47位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第48位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第49位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第21位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
22位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第23位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
5.根据权利要求1至5中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第55位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第57位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第29位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
30位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第31位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第57位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第58位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第30位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
31位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第32位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第60位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第61位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第62位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第34位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
35位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第36位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第61位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第62位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第63位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第35位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
36位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第37位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第79位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第80位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第81位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第53位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
54位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第55位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第82位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第83位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第84位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第56位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
57位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第58位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第91位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第92位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第93位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第65位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
66位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第67位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第92位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第93位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第94位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第66位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
67位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第68位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第97位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第98位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第71位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
92位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第73位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第98位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第100位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第72位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
73位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第74位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
100位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第101位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第73位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
74位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第75位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第112位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
113位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第114位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第86位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
87位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第88位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第113位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
114位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第87位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
88位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第114位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
115位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第88位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
89位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
90位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第91位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
90位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第91位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
117位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第118位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第
91位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第92位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第137位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
138位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第139位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第111位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第112位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第113位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第140位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
141位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第142位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第114位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第115位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第141位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
142位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第143位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第142位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
143位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第144位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第143位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
144位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第145位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第144位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
145位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第146位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第145位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
146位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第147位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第146位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
147位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第148位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第147位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
148位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第149位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第148位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
149位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第150位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第149位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
150位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第151位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第125位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第150位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
151位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第152位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第125位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第126位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第161位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
162位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第163位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第135位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第138位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第138位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第184位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
185位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第186位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第158位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第159位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第160位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的EPO多肽，其包含：
a)在对应于SEQ ID NO:2的第186位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第
187位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第188位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或
b)在对应于SEQ ID NO:13的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的EPO多肽，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的EPO多肽，其中所述N连接的糖基化位点包含氨基酸衍生物。
41.根据权利要求40所述的EPO多肽，其中所述氨基酸衍生物是天冬酰胺衍生物、丝氨酸衍生物或苏氨酸衍生物。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽被糖基化。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的EPO多肽，其包含附接到所述N连接的糖基化位点的至少一个聚糖部分。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽被聚乙二醇化。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在聚糖处被聚乙二醇化。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在伯胺处被聚乙二醇化。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在N末端α胺处被聚乙二醇化。
48.一种组合物，其包含多种根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约
3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。
49.一种组合物，其包含多种根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约
4.5或更大。
50.一种组合，其包含根据权利要求48所述的组合物和根据权利要求49所述的组合物。
51.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至41中任一项所述的EPO多肽。
52.根据权利要求51所述的核酸，其中所述核酸包含调控序列。
53.根据权利要求52所述的核酸，其中所述调控序列是组成型启动子；诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。
54.一种分离的核酸，其编码包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的EPO多肽；以及异源调控序列，其中所述异源调控序列不是组成型启动子。
55.根据权利要求54所述的核酸，其中所述异源调控序列是诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。
56.一种载体，其包含根据权利要求51至55中任一项所述的核酸。
57.根据权利要求56所述的载体，其中所述载体是病毒载体或细菌载体。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。
59.一种表达系统，其包含第一载体，所述第一载体包含编码根据权利要求1至41中任一项所述的EPO多肽的核酸；以及第二载体，所述第二载体包含调控序列。
60.一种表达系统，其包含第一载体，所述第一载体包含编码EPO多肽的核酸，所述EPO多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及第二载体，所述第二载体包含调控序列。
61.根据权利要求59或权利要求60所述的表达系统，其中所述调控序列编码微小RNA或转录因子。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的表达系统，其中所述第一载体和/或所述第二载体是病毒载体或细菌载体。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的表达系统，其中所述第一载体和/或所述第二载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。
64.一种宿主细胞，其包含根据权利要求51至55中任一项所述的核酸、根据权利要求56至58中任一项所述的载体、或根据权利要求59至63中任一项所述的表达系统。
65.一种生产包含EPO多肽的组合物的方法，其包括培养根据权利要求64所述的宿主细胞并分离所述EPO多肽。
66.根据权利要求65所述的方法，其中通过柱层析分离所述EPO多肽。
67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中通过离子交换柱层析分离所述EPO多肽。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中通过Capto Butyl柱层析、阳离子交换柱层析或阴离子交换柱层析分离所述EPO多肽。
69.根据权利要求65至68中任一项所述的方法，其中通过混合模式柱层析分离所述EPO多肽。
70.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中通过疏水相互作用柱层析分离所述EPO多肽。
71.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中通过层析柱的组合分离所述EPO多肽。
72.根据权利要求65至71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括灭活和/或去除病毒。
73.根据权利要求65至72中任一项所述的方法，其中如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。
74.根据权利要求65至72中任一项所述的方法，其中如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约
6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。
75.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽、根据权利要求48或49所述的组合物、根据权利要求50所述的组合、根据权利要求51至55中任一项所述的核酸、根据权利要求56至58中任一项所述的载体、或根据权利要求59至63中任一项所述的表达系统、以及药学上可接受的载体。
76.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含a)磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80；b)磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20；c)柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80；或d)柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20。
77.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含柠檬酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯80和间甲酚。
78.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含磷酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯20和苯甲醇。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的药物组合物，其中氯化钠的浓度为约140mM。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的药物组合物，其中磷酸钠或柠檬酸钠的浓度为约20mM。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的药物组合物，其中聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的浓度为约650nM。
82.根据权利要求77或79至81中任一项所述的药物组合物，其中间甲酚的浓度为约
0.2％。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的药物组合物，其中苯甲醇的浓度为约1％。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含：
a)浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140mM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯80，或
b)浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140mM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯20。
85.根据权利要求76至84中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含浓度为约20mM的柠檬酸钠、浓度为约140nM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯80、以及浓度约为0.2％的间甲酚。
86.根据权利要求76至85中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140nM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯20、以及浓度为约1％的苯甲醇。
87.根据权利要求76至86中任一项所述的药物组合物，其中所述EPO多肽是根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽、根据权利要求48或权利要求49所述的组合物、或根据权利要求50所述的组合。
88.一种向伴侣动物物种递送EPO多肽的方法，其包括肠胃外给予根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽、根据权利要求48或49所述的组合物、根据权利要求50所述的组合、或根据权利要求75或权利要求87所述的药物组合物。
89.一种向伴侣动物物种递送EPO多肽的方法，其包括通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予根据权利要求1至
47中任一项所述的EPO多肽、根据权利要求48或49所述的组合物、根据权利要求50所述的组合、或根据权利要求75或权利要求87所述的药物组合物。
90.一种向伴侣动物物种递送编码EPO多肽的分离的核酸的方法，其包括肠胃外给予根据权利要求51至55中任一项所述的核酸、根据权利要求56至58中任一项所述的载体、或根据权利要求59至63中任一项所述的表达系统。
91.一种治疗患有贫血的伴侣动物物种的方法，其包括向所述伴侣动物物种给予治疗有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的EPO多肽、根据权利要求48或49所述的组合物、根据权利要求50所述的组合、或根据权利要求75或权利要求87所述的药物组合物。
92.一种治疗患有贫血的伴侣动物物种的方法，其包括向所述伴侣动物物种给予治疗有效量的根据权利要求51至55中任一项所述的核酸、根据权利要求56至58中任一项所述的载体、或根据权利要求59至63中任一项所述的表达系统。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物是肠胃外给予的。
94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物是通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予的。
95.根据权利要求88至94中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物物种是猫、犬或马。
96.根据权利要求91至95中任一项所述的方法，其中所述贫血是由慢性肾脏疾病、炎性肠病或骨髓增生异常引起的。
97.根据权利要求88至96中任一项所述的方法，其中所述EPO多肽是以约1μg/kg体重至约10μg/kg体重、或约1μg/kg体重至约5μg/kg体重、或约1μg/kg体重、或约3μg/kg体重、或约
5μg/kg体重、或约10μg/kg体重的量给予的。
98.根据权利要求88至97中任一项所述的方法，其中每7至10天给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物。
99.根据权利要求88至98中任一项所述的方法，其中所述方法还包括给予右旋糖酐铁。
100.根据权利要求88至99中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之前，所述伴侣动物物种的基线血细胞比容百分比为约15％至约30％、约15％至约25％、约20％至约25％、约25％至约
30％、低于约15％、低于约18％、低于约20％、低于约25％、低于约29％或低于约30％。
101.根据权利要求88至100中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，所述伴侣动物物种的血细胞比容百分比增加到至少25％、或至少26％、或至少27％、或至少28％、或至少29％、或至少
30％、或至少32％、或至少35％、或至少38％、或至少40％、或至少42％、或至少45％、或至少
48％。
102.根据权利要求101所述的方法，其中在第一次给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后1周、2周、3周、4周、5周或6周，所述伴侣动物物种的血细胞比容百分比增加到至少25％、或至少27％、或至少30％、或至少32％、或至少35％。
103.根据权利要求88至102中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，与基线相比，所述伴侣动物物种的体重得以维持或增加。
104.根据权利要求103所述的方法，其中在第一次给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后1周、2周、3周、4周、5周或6周，所述伴侣动物物种的体重得以维持或增加。
105.根据权利要求88至104中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，与基线相比，对称二甲基精氨酸或血清肌酸肾生物标记物的水平降低。
106.一种在靶细胞中表达EPO多肽的方法，其包括：
a)将核酸、载体或表达系统转移到所述靶细胞中，其中所述核酸、所述载体或所述表达系统包含：
i)编码根据权利要求1至41中任一项所述的EPO多肽的核酸，和
ii)调控序列；以及
b)在支持所述EPO多肽的表达的条件下培养所述细胞。
107.一种在靶细胞中表达EPO多肽的方法，其包括：
a)将核酸、载体或表达系统转移到所述靶细胞中，其中所述核酸、所述载体或所述表达系统包含：
i)编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的EPO多肽或具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的EPO多肽的核酸，和
ii)调控序列，其中所述调控序列不是组成型启动子；以及
b)在支持所述EPO多肽的表达的条件下培养所述细胞。
108.根据权利要求106或权利要求107所述的方法，其中所述调控序列是诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。
109.根据权利要求106至108中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体或细菌载体。
110.根据权利要求106至109中任一项所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。
111.根据权利要求106至110中任一项所述的方法，其中所述细胞是伴侣动物物种的细胞。
112.根据权利要求106至111中任一项所述的方法，其中所述细胞位于活的伴侣动物物种中。
113.根据权利要求111或权利要求112所述的方法，其中所述伴侣动物物种是犬、猫或马。
114.一种促红细胞生成素(EPO)多肽，其包含：
a)在对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、
107、108或110位的位置的一个位置处的至少一个氨基酸取代；
b)SEQ ID NO:9的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、
103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；
c)SEQ ID NO:10的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、
100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；
d)SEQ ID NO:11的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、
100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；或
e)SEQ ID NO:12的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、
100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代。
115.根据权利要求114所述的EPO多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是：
a)在对应于SEQ ID NO:13的第103位的位置处的取代；
b)SEQ ID NO:9的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；
c)SEQ ID NO:10的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；
d)SEQ ID NO:11的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；或
e)SEQ ID NO:12的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代。
116.根据权利要求114或115所述的EPO多肽，其中在对应于SEQ ID NO:13的第103位的位置处丙氨酸被取代。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的EPO多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包含用氨基酸衍生物取代。
118.根据权利要求114至117中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
119.一种多肽，其包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
120.一种分离的核酸，其编码根据权利要求114至119中任一项所述的EPO多肽。
121.一种宿主细胞，其包含根据权利要求120所述的核酸。
122.一种生产包含EPO多肽的组合物的方法，其包括培养根据权利要求121所述的宿主细胞并分离所述EPO多肽。
123.一种药物组合物，其包含根据权利要求114至119中任一项所述的EPO多肽和药学上可接受的载体。
124.根据权利要求76至86中任一项所述的药物组合物，其中所述EPO多肽是根据权利要求114至119中任一项所述的EPO多肽。
125.一种多肽，其包含猫促红细胞生成素受体(EPOR)多肽的细胞外结构域，所述猫促红细胞生成素受体多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及异源多肽序列。
126.一种多肽，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及异源多肽序列。
127.根据权利要求125或权利要求126所述的多肽，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
128.一种分离的核酸，其编码根据权利要求125至127中任一项所述的多肽。
129.一种宿主细胞，其包含根据权利要求128所述的核酸。
130.一种生产多肽的方法，其包括培养根据权利要求129所述的宿主细胞并分离所述多肽。
131.一种药物组合物，其包含根据权利要求126至127中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
132.一种治疗患有红细胞增多症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求114至119中任一项所述的EPO多肽，根据权利要求125至127中任一项所述的多肽，根据权利要求120或权利要求128所述的核酸，或根据权利要求123、权利要求124或权利要求131所述的药物组合物。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述EPO多肽、所述多肽、所述核酸或所述药物组合物是肠胃外给予的。
134.根据权利要求132或权利要求133所述的方法，其中所述EPO多肽、所述多肽、所述核酸或所述药物组合物是通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予的。
135.根据权利要求132至134中任一项所述的方法，其中所述受试者是伴侣动物物种。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述伴侣动物物种是猫、犬或马。
137.根据权利要求132至134中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
138.根据权利要求132至137中任一项所述的方法，其中所述红细胞增多症是由JAK2的突变、来自肿瘤的EPO过度产生和/或分泌引起的。

说明书全文

兽用促红细胞生成素和类似物

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2017年6月6日提交的美国临时申请号62/516,092；2017年6月7日提交的62/516,642；以及2017年9月15日提交的62/559,104的优先权权益，将它们中的每一个出于任何目的通过引用以其整体并入本文。

技术领域

[0003] 本公开文本涉及具有增强的药代动力学的促红细胞生成素(EPO)多肽类似物，以及生产所述类似物和使用类似物例如治疗伴侣动物(诸如犬、猫和马)的贫血的方法。本公开文本还涉及在第二结合位点具有突变的EPO多肽，以及使用所述EPO多肽例如治疗包括人和伴侣动物在内的哺乳动物中EPO的过量产生的方法。本公开文本涉及编码EPO多肽的核酸、载体和表达系统，以及使用所述核酸、载体和表达系统(例如，基因治疗方法)例如用于EPO多肽的受控或诱导表达的方法。本公开文本进一步涉及用于EPO多肽的配制品，包括本文所述的EPO多肽。本公开文本还涉及包含EPO受体的细胞外结构域的多肽，以及使用所述多肽例如治疗包括人和伴侣动物在内的任何哺乳动物中EPO的过量产生的方法。

背景技术

[0004] 促红细胞生成素(EPO)，也称为血细胞生成素或造血素，是一种可以刺激促红细胞生成(即红细胞产生)的糖蛋白激素。EPO用于治疗慢性肾脏疾病、炎性肠病(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)和化疗和放疗引起的骨髓增生异常所致的贫血。有时用重组EPO分子(例如，达贝泊汀(AranespTM和EpogenTM，Amgen)和DynepoTM，Shire)治疗这些人类障碍。

[0005] 伴侣动物患有许多与人类疾病相似的疾病，包括自身免疫疾病和癌症。尽管人类蛋白已被用于治疗伴侣动物疾病，但是应当理解，具有显著的人源氨基酸序列含量的蛋白可以对所治疗的动物具有免疫原性。如果人类药物在伴侣动物中引发免疫反应，则可能无效。参见Mauldin等人,Aug.2010,21(4):373-382。

[0006] 目前，通过给予人类促红细胞生成素药物(诸如EpogenTM或AranespTM)来治疗猫的贫血。但是，当将人类EPO药物给予至猫时，可能会导致免疫原性反应。此外，人类EPO药物可能不会以与在人类中一样的对伴侣动物产生同等有益的治疗效果的方式与伴侣动物EPO受体结合。

[0007] 因此，对于可用于治疗伴侣动物(包括猫、狗和马)的贫血(例如，非难治性贫血)的方法和化合物仍有未满足的需求。理想地，所述化合物将与EPO受体特异性结合，并在血浆中具有足够长的半衰期，以至于适用于治疗，但是将是物种特异性的并且不是高度免疫原性的。本文描述了具有增强的药代动力学的EPO多肽(包括猫EPO多肽)，以及给予那些EPO多肽或编码那些EPO多肽的核酸以治疗伴侣动物的贫血的方法。

[0008] EPO的过量产生也是一个问题。例如，红细胞增多症可能是由肿瘤(例如，肾肿瘤)中EPO的过度产生和/或分泌、JAK2中的非激活性突变或遗传学上遗传失调引起的，从而导致EPO的过度产生。本文还描述了在第二结合位点具有突变的EPO多肽，以及给予那些EPO多肽或编码那些EPO多肽的核酸以治疗哺乳动物的红细胞增多症的方法。还有，本文描述了包含猫EPO受体的细胞外结构域的多肽，以及给予那些多肽或编码那些EPOR多肽的核酸以治疗哺乳动物的红细胞增多症的方法。发明内容

[0009] 实施方案1.一种促红细胞生成素(EPO)多肽，其除了包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13中不存在的至少一个N连接的糖基化位点的存在之外还包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列，其中所述N连接的糖基化位点包含序列天冬酰胺-xaa-丝氨酸或天冬酰胺-xaa-苏氨酸，其中xaa是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且其中一个N连接的糖基化位点不与另一个N连接的糖基化位点重叠。

[0010] 实施方案2.根据实施方案1所述的EPO多肽，其中所述至少一个N连接的糖基化位点中的每一个存在于：

[0011] a)选自SEQ ID NO:2的第47-49、55-57、56-58、60-62、61-63、79-81、82-84、91-93、92-94、97-99、98-100、99-101、112-114、113-115、114-116、115-117、116-118、137-139、
140-142、141-143、142-144、143-145、144-146、145-147、146-148、147-149、148-150、149-
151、150-152、161-163、162-164、184-186和186-188位的位置；或

[0012] b)选自SEQ ID NO:13的第21-23、29-31、30-32、34-36、35-37、53-55、56-58、65-67、66-68、71-73、72-74、73-75、86-88、87-89、88-90、89-91、90-92、111-113、114-116、115-
117、116-118、117-119、118-120、119-121、120-122、121-123、122-124、123-125、124-126、
135-137、136-138、158-160和162-164位的位置。

[0013] 实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的EPO多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:4的第113位的位置处的缬氨酸。

[0014] 实施方案4.根据实施方案1至4中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0015] a)在对应于SEQ ID NO:2的第47位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第48位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第49位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0016] b)在对应于SEQ ID NO:13的第21位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第22位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第23位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0017] 实施方案5.根据实施方案1至5中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0018] a)在对应于SEQ ID NO:2的第55位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第57位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0019] b)在对应于SEQ ID NO:13的第29位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第30位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第31位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0020] 实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0021] a)在对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第57位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第58位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0022] b)在对应于SEQ ID NO:13的第30位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第31位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第32位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0023] 实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0024] a)在对应于SEQ ID NO:2的第60位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第61位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第62位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0025] b)在对应于SEQ ID NO:13的第34位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第35位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第36位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0026] 实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0027] a)在对应于SEQ ID NO:2的第61位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第62位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第63位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0028] b)在对应于SEQ ID NO:13的第35位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第36位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第37位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0029] 实施方案9.根据实施方案1至8中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0030] a)在对应于SEQ ID NO:2的第79位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第80位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第81位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0031] b)在对应于SEQ ID NO:13的第53位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第54位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第55位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0032] 实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0033] a)在对应于SEQ ID NO:2的第82位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第83位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第84位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0034] b)在对应于SEQ ID NO:13的第56位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第57位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第58位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0035] 实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0036] a)在对应于SEQ ID NO:2的第91位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第92位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第93位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0037] b)在对应于SEQ ID NO:13的第65位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第66位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第67位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0038] 实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0039] a)在对应于SEQ ID NO:2的第92位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第93位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第94位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0040] b)在对应于SEQ ID NO:13的第66位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第67位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第68位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0041] 实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0042] a)在对应于SEQ ID NO:2的第97位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第98位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0043] b)在对应于SEQ ID NO:13的第71位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第92位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第73位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0044] 实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0045] a)在对应于SEQ ID NO:2的第98位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第100位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0046] b)在对应于SEQ ID NO:13的第72位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第73位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第74位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0047] 实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0048] a)在对应于SEQ ID NO:2的第99位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第100位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第101位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0049] b)在对应于SEQ ID NO:13的第73位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第74位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第75位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0050] 实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0051] a)在对应于SEQ ID NO:2的第112位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第113位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第114位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0052] b)在对应于SEQ ID NO:13的第86位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第87位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第88位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0053] 实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0054] a)在对应于SEQ ID NO:2的第113位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第114位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0055] b)在对应于SEQ ID NO:13的第87位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第88位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0056] 实施方案18.根据实施方案1至17中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0057] a)在对应于SEQ ID NO:2的第114位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0058] b)在对应于SEQ ID NO:13的第88位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0059] 实施方案19.根据实施方案1至18中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0060] a)在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0061] b)在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第91位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0062] 实施方案20.根据实施方案1至19中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0063] a)在对应于SEQ ID NO:2的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0064] b)在对应于SEQ ID NO:13的第89位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第91位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0065] 实施方案21.根据实施方案1至20中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0066] a)在对应于SEQ ID NO:2的第116位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第117位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第118位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0067] b)在对应于SEQ ID NO:13的第90位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第91位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第92位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0068] 实施方案22.根据实施方案1至21中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0069] a)在对应于SEQ ID NO:2的第137位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第138位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第139位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0070] b)在对应于SEQ ID NO:13的第111位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第112位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第113位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0071] 实施方案23.根据实施方案1至22中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0072] a)在对应于SEQ ID NO:2的第140位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第141位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第142位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0073] b)在对应于SEQ ID NO:13的第114位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第115位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0074] 实施方案24.根据实施方案1至23中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0075] a)在对应于SEQ ID NO:2的第141位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第142位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第143位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0076] b)在对应于SEQ ID NO:13的第115位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0077] 实施方案25.根据实施方案1至24中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0078] a)在对应于SEQ ID NO:2的第142位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第143位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第144位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0079] b)在对应于SEQ ID NO:13的第116位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0080] 实施方案26.根据实施方案1至25中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0081] a)在对应于SEQ ID NO:2的第143位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第144位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第145位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0082] b)在对应于SEQ ID NO:13的第117位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0083] 实施方案27.根据实施方案1至26中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0084] a)在对应于SEQ ID NO:2的第144位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第145位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第146位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0085] b)在对应于SEQ ID NO:13的第118位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0086] 实施方案28.根据实施方案1至27中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0087] a)在对应于SEQ ID NO:2的第145位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第146位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第147位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0088] b)在对应于SEQ ID NO:13的第119位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0089] 实施方案29.根据实施方案1至28中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0090] a)在对应于SEQ ID NO:2的第146位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第147位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第148位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0091] b)在对应于SEQ ID NO:13的第120位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0092] 实施方案30.根据实施方案1至29中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0093] a)在对应于SEQ ID NO:2的第147位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第148位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第149位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0094] b)在对应于SEQ ID NO:13的第121位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0095] 实施方案31.根据实施方案1至30中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0096] a)在对应于SEQ ID NO:2的第148位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第149位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第150位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0097] b)在对应于SEQ ID NO:13的第122位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0098] 实施方案32.根据实施方案1至31中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0099] a)在对应于SEQ ID NO:2的第149位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第150位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第151位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0100] b)在对应于SEQ ID NO:13的第123位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第125位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0101] 实施方案33.根据实施方案1至32中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0102] a)在对应于SEQ ID NO:2的第150位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第151位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第152位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0103] b)在对应于SEQ ID NO:13的第124位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第125位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第126位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0104] 实施方案34.根据实施方案1至33中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0105] a)在对应于SEQ ID NO:2的第161位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第162位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第163位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0106] b)在对应于SEQ ID NO:13的第135位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0107] 实施方案35.根据实施方案1至34中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0108] a)在对应于SEQ ID NO:2的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0109] b)在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第138位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0110] 实施方案36.根据实施方案1至35中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0111] a)在对应于SEQ ID NO:2的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0112] b)在对应于SEQ ID NO:13的第136位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第137位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第138位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0113] 实施方案37.根据实施方案1至36中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0114] a)在对应于SEQ ID NO:2的第184位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第185位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第186位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0115] b)在对应于SEQ ID NO:13的第158位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第159位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第160位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0116] 实施方案38.根据实施方案1至37中任一项所述的EPO多肽，其包含：

[0117] a)在对应于SEQ ID NO:2的第186位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:2的第187位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:2的第188位的位置处的丝氨酸或苏氨酸；或

[0118] b)在对应于SEQ ID NO:13的第162位的位置处的天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:13的第163位的位置处的除脯氨酸之外的任何氨基酸，以及在对应于SEQ ID NO:13的第164位的位置处的丝氨酸或苏氨酸。

[0119] 实施方案39.根据实施方案1至38中任一项所述的EPO多肽，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

[0120] 实施方案40.根据实施方案1至39中任一项所述的EPO多肽，其中所述N连接的糖基化位点包含氨基酸衍生物。

[0121] 实施方案41.根据实施方案40所述的EPO多肽，其中所述氨基酸衍生物是天冬酰胺衍生物、丝氨酸衍生物或苏氨酸衍生物。

[0122] 实施方案42.根据实施方案1至41中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽被糖基化。

[0123] 实施方案43.根据实施方案1至42中任一项所述的EPO多肽，其包含附接到所述N连接的糖基化位点的至少一个聚糖部分。

[0124] 实施方案44.根据实施方案1至43中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽被聚乙二醇化。

[0125] 实施方案45.根据实施方案1至44中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在聚糖处被聚乙二醇化。

[0126] 实施方案46.根据实施方案1至45中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在伯胺处被聚乙二醇化。

[0127] 实施方案47.根据实施方案1至46中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽在N末端α胺处被聚乙二醇化。

[0128] 实施方案48.一种组合物，其包含多种根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。

[0129] 实施方案49.一种组合物，其包含多种根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。

[0130] 实施方案50.一种组合，其包含根据实施方案48所述的组合物和根据实施方案49所述的组合物。

[0131] 实施方案51.一种分离的核酸，其编码根据实施方案1至41中任一项所述的EPO多肽。

[0132] 实施方案52.根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸包含调控序列。

[0133] 实施方案53.根据实施方案52所述的核酸，其中所述调控序列是组成型启动子；诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。

[0134] 实施方案54.一种分离的核酸，其编码包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的EPO多肽；以及异源调控序列，其中所述异源调控序列不是组成型启动子。

[0135] 实施方案55.根据实施方案54所述的核酸，其中所述异源调控序列是诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。

[0136] 实施方案56.一种载体，其包含根据实施方案51至55中任一项所述的核酸。

[0137] 实施方案57.根据实施方案56所述的载体，其中所述载体是病毒载体或细菌载体。

[0138] 实施方案58.根据实施方案56或实施方案57所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。

[0139] 实施方案59.一种表达系统，其包含第一载体，所述第一载体包含编码根据实施方案1至41中任一项所述的EPO多肽的核酸；以及第二载体，所述第二载体包含调控序列。

[0140] 实施方案60.一种表达系统，其包含第一载体，所述第一载体包含编码EPO多肽的核酸，所述EPO多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及第二载体，所述第二载体包含调控序列。

[0141] 实施方案61.根据实施方案59或实施方案60所述的表达系统，其中所述调控序列编码微小RNA或转录因子。

[0142] 实施方案62.根据实施方案60或实施方案61所述的表达系统，其中所述第一载体和/或第二载体是病毒载体或细菌载体。

[0143] 实施方案63.根据实施方案60至62中任一项所述的表达系统，其中所述第一载体和/或第二载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。

[0144] 实施方案64.一种宿主细胞，其包含根据实施方案51至55中任一项所述的核酸、根据实施方案56至58中任一项所述的载体、或根据实施方案59至63中任一项所述的表达系统。

[0145] 实施方案65.一种生产包含EPO多肽的组合物的方法，其包括培养根据实施方案64所述的宿主细胞并分离所述EPO多肽。

[0146] 实施方案66.根据实施方案65所述的方法，其中通过柱层析分离所述EPO多肽。

[0147] 实施方案67.根据实施方案65或实施方案66所述的方法，其中通过离子交换柱层析分离所述EPO多肽。

[0148] 实施方案68.根据实施方案65至67中任一项所述的方法，其中通过Capto Butyl柱层析、阳离子交换柱层析或阴离子交换柱层析分离所述EPO多肽。

[0149] 实施方案69.根据实施方案65至68中任一项所述的方法，其中通过混合模式柱层析分离所述EPO多肽。

[0150] 实施方案70.根据实施方案65至69中任一项所述的方法，其中通过疏水相互作用柱层析分离所述EPO多肽。

[0151] 实施方案71.根据实施方案65至70中任一项所述的方法，其中通过层析柱的组合分离所述EPO多肽。

[0152] 实施方案72.根据实施方案65至71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括灭活和/或去除病毒。

[0153] 实施方案73.根据实施方案65至72中任一项所述的方法，其中如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。

[0154] 实施方案74.根据实施方案65至72中任一项所述的方法，其中如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。

[0155] 实施方案75.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽、根据实施方案48或49所述的组合物、根据实施方案50所述的组合、根据实施方案51至55中任一项所述的核酸、根据实施方案56至58中任一项所述的载体、或根据实施方案59至63中任一项所述的表达系统；以及药学上可接受的载体。

[0156] 实施方案76.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含a)磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80；b)磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20；c)柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80；或d)柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20。

[0157] 实施方案77.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含柠檬酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯80和间甲酚。

[0158] 实施方案78.一种药物组合物，其包含EPO多肽和药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体包含磷酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯20和苯甲醇。

[0159] 实施方案79.根据实施方案76至78中任一项所述的药物组合物，其中氯化钠的浓度为约140mM。

[0160] 实施方案80.根据实施方案76至79中任一项所述的药物组合物，其中磷酸钠或柠檬酸钠的浓度为约20mM。

[0161] 实施方案81.根据实施方案76至80中任一项所述的药物组合物，其中聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的浓度为约650nM。

[0162] 实施方案82.根据实施方案77或79至81中任一项所述的药物组合物，其中间甲酚的浓度为约0.2％。

[0163] 实施方案83.根据实施方案78至82中任一项所述的药物组合物，其中苯甲醇的浓度为约1％。

[0164] 实施方案84.根据实施方案76至83中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含

[0165] a)浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140mM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯80，或

[0166] b)浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140mM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯20。

[0167] 实施方案85.根据实施方案76至84中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含浓度为约20mM的柠檬酸钠、浓度为约140nM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯80、以及浓度约为0.2％的间甲酚。

[0168] 实施方案86.根据实施方案76至85中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含浓度为约20mM的磷酸钠、浓度为约140nM的氯化钠、浓度为约650nM的聚山梨醇酯20、以及浓度为约1％的苯甲醇。

[0169] 实施方案87.根据实施方案76至86中任一项所述的药物组合物，其中所述EPO多肽是根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽、根据实施方案48或实施方案49所述的组合物、或根据实施方案50所述的组合。

[0170] 实施方案88.一种向伴侣动物物种递送EPO多肽的方法，其包括肠胃外给予根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽、根据实施方案48或49所述的组合物、根据实施方案50所述的组合、或根据实施方案75或实施方案87所述的药物组合物。

[0171] 实施方案89.一种向伴侣动物物种递送EPO多肽的方法，其包括通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽、根据实施方案48或49所述的组合物、根据实施方案50所述的组合、或根据实施方案75或实施方案87所述的药物组合物。

[0172] 实施方案90.一种向伴侣动物物种递送编码EPO多肽的分离的核酸的方法，其包括肠胃外给予根据实施方案51至55中任一项所述的核酸、根据实施方案56至58中任一项所述的载体、或根据实施方案59至63中任一项所述的表达系统。

[0173] 实施方案91.一种治疗患有贫血的伴侣动物物种的方法，其包括向所述伴侣动物物种给予治疗有效量的根据实施方案1至47中任一项所述的EPO多肽、根据实施方案48或49所述的组合物、根据实施方案50所述的组合、或根据实施方案75或实施方案87所述的药物组合物。

[0174] 实施方案92.一种治疗患有贫血的伴侣动物物种的方法，其包括向所述伴侣动物物种给予治疗有效量的根据实施方案51至55中任一项所述的核酸、根据实施方案56至58中任一项所述的载体、或根据实施方案59至63中任一项所述的表达系统。

[0175] 实施方案93.根据实施方案91或实施方案92所述的方法，其中所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物是肠胃外给予的。

[0176] 实施方案94.根据实施方案91至93中任一项所述的方法，其中所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物是通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予的。

[0177] 实施方案95.根据实施方案88至94中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物物种是猫、犬或马。

[0178] 实施方案96.根据实施方案91至95中任一项所述的方法，其中所述贫血是由慢性肾脏疾病、炎性肠病或骨髓增生异常引起的。

[0179] 实施方案97.根据实施方案88至96中任一项所述的方法，其中所述EPO多肽是以约1μg/kg体重至约10μg/kg体重、或约1μg/kg体重至约5μg/kg体重、或约1μg/kg体重、或约3μg/kg体重、或约5μg/kg体重、或约10μg/kg体重的量给予的。

[0180] 实施方案98.根据实施方案88至97中任一项所述的方法，其中每7至10天给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物。

[0181] 实施方案99.根据实施方案88至98中任一项所述的方法，其中所述方法还包括给予右旋糖酐铁。

[0182] 实施方案100.根据实施方案88至99中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之前，所述伴侣动物物种的基线血细胞比容百分比为约15％至约30％、约15％至约25％、约20％至约25％、约25％至约30％、低于约15％、低于约18％、低于约20％、低于约25％、低于约29％或低于约
30％。

[0183] 实施方案101.根据实施方案88至100中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，所述伴侣动物物种的血细胞比容百分比增加到至少25％、或至少26％、或至少27％、或至少28％、或至少29％、或至少30％、或至少32％、或至少35％、或至少38％、或至少40％、或至少42％、或至少
45％、或至少48％。

[0184] 实施方案102.根据实施方案101所述的方法，其中在第一次给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后1周、2周、3周、4周、5周或6周，所述伴侣动物物种的血细胞比容百分比增加到至少25％、或至少27％、或至少30％、或至少32％、或至少35％。

[0185] 实施方案103.根据实施方案88至102中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，与基线相比，所述伴侣动物物种的体重得以维持或增加。

[0186] 实施方案104.根据实施方案103所述的方法，其中在第一次给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后1周、2周、3周、4周、5周或6周，所述伴侣动物物种的体重得以维持或增加。

[0187] 实施方案105.根据实施方案88至104中任一项所述的方法，其中在给予所述EPO多肽、所述组合物、所述核酸、所述载体、所述表达系统或所述药物组合物之后，与基线相比，对称二甲基精氨酸或血清肌酸肾生物标记物的水平减少。

[0188] 实施方案106.一种在靶细胞中表达EPO多肽的方法，其包括：

[0189] a)将核酸、载体或表达系统转移到所述靶细胞中，其中所述核酸、所述载体或所述表达系统包含：

[0190] i)编码根据实施方案1至41中任一项所述的EPO多肽的核酸，和

[0191] ii)调控序列；以及

[0192] b)在支持所述EPO多肽的表达的条件下培养所述细胞。

[0193] 实施方案107.一种在靶细胞中表达EPO多肽的方法，其包括：

[0194] a)将核酸、载体或表达系统转移到所述靶细胞中，其中所述核酸、所述载体或所述表达系统包含：

[0195] i)编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的EPO多肽或具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的EPO多肽的核酸，和

[0196] ii)调控序列，其中所述调控序列不是组成型启动子；以及

[0197] b)在支持所述EPO多肽的表达的条件下培养所述细胞。

[0198] 实施方案108.根据实施方案106或实施方案107所述的方法，其中所述调控序列是诱导型调控序列，诸如四环素应答元件或缺氧诱导型启动子；组织特异性启动子；增强子；沉默子；或者编码微小RNA或转录因子。

[0199] 实施方案109.根据实施方案106至108中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体或细菌载体。

[0200] 实施方案110.根据实施方案106至109中任一项所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。

[0201] 实施方案111.根据实施方案106至110中任一项所述的方法，其中所述细胞是伴侣动物物种的细胞。

[0202] 实施方案112.根据实施方案106至111中任一项所述的方法，其中所述细胞位于活的伴侣动物物种中。

[0203] 实施方案113.根据实施方案111或实施方案112所述的方法，其中所述伴侣动物物种是犬、猫或马。

[0204] 实施方案114.一种促红细胞生成素(EPO)多肽，其包含：

[0205] a)在对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、107、108或110位的位置的一个位置处的至少一个氨基酸取代；

[0206] b)SEQ ID NO:9的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；

[0207] c)SEQ ID NO:10的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；

[0208] d)SEQ ID NO:11的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代；或

[0209] e)SEQ ID NO:12的对应于选自SEQ ID NO:13的第5、8、10、11、14、15、78、96、97、99、100、103、104、107、108或110位的位置的至少一个氨基酸取代。

[0210] 实施方案115.根据实施方案114所述的EPO多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是：

[0211] a)在对应于SEQ ID NO:13的第103位的位置处的取代；

[0212] b)SEQ ID NO:9的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；

[0213] c)SEQ ID NO:10的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；

[0214] d)SEQ ID NO:11的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代；或

[0215] e)SEQ ID NO:12的对应于SEQ ID NO:13的第103位的取代。

[0216] 实施方案116.根据实施方案114或115所述的EPO多肽，其中在对应于SEQ ID NO:13的第103位的位置处丙氨酸被取代。

[0217] 实施方案117.根据实施方案114至116中任一项所述的EPO多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包含用氨基酸衍生物取代。

[0218] 实施方案118.根据实施方案114至117中任一项所述的EPO多肽，其中所述EPO多肽包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

[0219] 实施方案119.一种多肽，其包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

[0220] 实施方案120.一种分离的核酸，其编码根据实施方案114至119中任一项所述的EPO多肽。

[0221] 实施方案121.一种宿主细胞，其包含根据实施方案120所述的核酸。

[0222] 实施方案122.一种生产包含EPO多肽的组合物的方法，其包括培养根据实施方案121所述的宿主细胞并分离所述EPO多肽。

[0223] 实施方案123.一种药物组合物，其包含根据实施方案114至119中任一项所述的EPO多肽和药学上可接受的载体。

[0224] 实施方案124.根据实施方案76至86中任一项所述的药物组合物，其中所述EPO多肽是根据实施方案114至119中任一项所述的EPO多肽。

[0225] 实施方案125.一种多肽，其包含猫促红细胞生成素受体(EPOR)多肽的细胞外结构域，所述猫促红细胞生成素受体多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及异源多肽序列。

[0226] 实施方案126.一种多肽，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及异源多肽序列。

[0227] 实施方案127.根据实施方案115或实施方案116所述的多肽，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

[0228] 实施方案128.一种分离的核酸，其编码根据实施方案125至127中任一项所述的多肽。

[0229] 实施方案129.一种宿主细胞，其包含根据实施方案128所述的核酸。

[0230] 实施方案130.一种生产多肽的方法，其包括培养根据实施方案129所述的宿主细胞并分离所述多肽。

[0231] 实施方案131.一种药物组合物，其包含根据实施方案126至127中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。

[0232] 实施方案132.一种治疗患有红细胞增多症的受试者的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的根据实施方案114至119中任一项所述的EPO多肽，根据实施方案125至127中任一项所述的多肽，根据实施方案120或实施方案128所述的核酸，或根据实施方案123、实施方案124或实施方案131所述的药物组合物。

[0233] 实施方案133.根据实施方案132所述的方法，其中所述EPO多肽、所述多肽、所述核酸或所述药物组合物是肠胃外给予的。

[0234] 实施方案134.根据实施方案132或实施方案133所述的方法，其中所述EPO多肽、所述多肽、所述核酸或所述药物组合物是通过肌内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径给予的。

[0235] 实施方案135.根据实施方案132至132中任一项所述的方法，其中所述受试者是伴侣动物物种。

[0236] 实施方案136.根据实施方案135所述的方法，其中所述伴侣动物物种是猫、犬或马。

[0237] 实施方案137.根据实施方案132至134中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

[0238] 实施方案138.根据实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述红细胞增多症是由JAK2的突变、来自肿瘤的EPO过度产生和/或分泌引起的。

[0239] 下面更加全面地描述这些和其他方面以及各种实施方案。附图说明

[0240] 图1A显示了等电聚焦(IEF)，而图1B显示了分离的碱性和酸性类似物6-30GV成熟级分的SDS-PAGE。

[0241] 图2A和图2B显示了IEF凝胶以证明各种唾液酸化状态的分离。指示了pI标记位置。

[0242] 图3显示了分离的猫EPO类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)的Western印迹。泳道1：分子量标记物；泳道2-6：分别为1μg、0.5μg、0.2μg、0.1μg和0.05μg的分离的类似物6-30GV成熟物。

[0243] 图4显示了使用具有荧光检测器的HPLC的作为DMB-唾液酸的唾液酸分析。图4A显示了已知浓度的商业标准的Neu5Gc/Neu5A的唾液酸分析。图4B显示了分离的类似物6-30GV成熟物的唾液酸分析。

[0244] 图5显示了TF-1细胞增殖测定的结果，证明与低唾液酸化猫EPO(碱性级分)相比，高唾液酸化猫EPO(酸性级分)具有较低的活性。

[0245] 图6A显示了在皮下(SQ)注射之后两只猫(Dot和Salem)中低唾液酸化类似物6-30GV成熟物(碱性级分)的药代动力学(PK)曲线。图6B显示了在静脉内(IV)注射之后四只猫中高唾液酸化类似物6-30GV成熟物(酸性级分)的平均PK曲线和参数。图6C显示了在皮下(SQ)注射之后四只猫中的高唾液酸化类似物6-30GV成熟物(酸性级分)的平均PK曲线和参数。图6D显示了在肌内(IM)注射之后三只猫中高唾液酸化类似物6-30GV成熟物(酸性级分)的平均PK曲线和参数。

[0246] 图7是一系列Western印迹，其显示了fEPOR201-N-flag、fEPOR202-N-flag、fEPOR201_ECD-Fc、fEPOR202_ECD-Fc和fEPOR203_ECD-Fc的表达。图7A是使用抗人Fc抗体鉴定猫EPOR201-ECD-Fc(泳道1)和猫EPOR202-ECD-Fc(泳道2)的Western印迹。图7B和图7C是与未转染的对照(泳道5)相比，使用抗flag抗体鉴定猫EPOR201-N-flag(泳道3和4)和猫EPOR202-N-flag(泳道6和7)的Western印迹。图7D是猫EPOR203-ECD-Fc的SDS-PAGE(泳道9)和分子量标准(泳道8)的考马斯染色。

[0247] 图8显示了重组人EPO和类似物6-30GV成熟物的TF-1细胞增殖测定的结果和计算的EC50值。

[0248] 图9显示了提出的在猫EPO的E18与R14、Y15与K97之间的相互作用。

[0249] 图10显示了类似物6-30EV成熟物以及类似物6-30EV成熟物和类似物6-30GV成熟物的50/50混合物的TF-1细胞增殖测定的结果。

[0250] 图11显示了在猫类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)和猫EPOR203_39A_ECD_Fc(SEQ ID NO:26)之间的ELISA结合测定。代表的四个参数是A：最小值；D：最大值；C：拐点；和D：曲线的斜坡斜率。

[0251] 图12是显示在以三种剂量水平之一(1μg/kg(“EPO1”；n＝5)、3μg/kg(“EPO3”；n＝5)或10μg/kg(“EPO10”；n＝5))给予安慰剂或猫类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)之前1天以及之后5、7、10和14天在猫中网状细胞的绝对百分比的图。

[0252] 图13是显示在给予猫类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14；10μg/kg；n＝4)之前4天以及之后3、5、10、17、19、24、31和33天在猫中网状细胞的绝对百分比的图。

[0253] 序列说明

[0254] 表1提供了本文引用的某些序列的列表。

[0255]

[0256]

[0257]

[0258]

[0259]

[0260]

[0261]

[0262]

[0263]

[0264]

[0265]

具体实施方式

[0266] 本公开文本提供了结构证据，即成熟形式的第18位具有甘氨酸的野生型猫EPO(EPO G18)可对第二受体结合位点具有修饰的作用，而第18位具有谷氨酸的野生型猫EPO(EPO E18)可具有改善的猫EPO第二位点结合活性。本公开文本描述了如何鉴定E18在猫EPO的第二结合位点与至少三个氨基酸(R14、T15和L97)的潜在相互作用。第二结合位点应理解为促进EPO受体二聚化。

[0267] 本公开文本提供了野生型猫EPO E44前体(SEQ ID NO:2，其中E44对应于所述成熟EPO中的E18)以及野生型猫EPO E18成熟(SEQ ID NO:13)多肽的类似物，所述类似物具有一个或多个另外的糖基化位点。例如，提供了猫EPO中适用于引入另外的N连接的糖基化位点(单独或以任何组合)的氨基酸位置。还提供了生产或纯化所述猫EPO多肽(包括猫EPO多肽的酸性和碱性级分)的方法，以及使用猫EPO多肽的治疗方法。还描述了用于EPO多肽(包括猫EPO多肽)的单剂量和/或多剂量药物组合物的配制品。描述了核酸、载体、编码猫EPO多肽的表达系统以及通过基因治疗方法表达这些多肽(包括受控表达)的方法。

[0268] 本文还描述了在第二结合位点具有突变的EPO多肽，以及给予那些EPO多肽或表达那些EPO多肽的核酸以治疗哺乳动物的红细胞增多症的方法。在第二结合位点具有突变的EPO多肽可以维持对第一EPO受体的高亲和力，但是在EPO受体二聚化中具有缺陷。具有第二位点突变的EPO多肽可通过占据EPO受体来防止内源性EPO发挥功能。还有，本文描述了包含猫EPO受体的细胞外结构域的多肽以及给予那些EPOR多肽或编码那些EPOR多肽的核酸以治疗哺乳动物的红细胞增多症的方法。

[0269] 为方便读者，提供了以下本文所使用的术语的定义。

[0270] 如本文所用，诸如Kd的数字术语是基于科学测量计算的，因此受到适当的测量误差的影响。在一些情况下，数字术语可以包括化整到最接近的有效数字的数值。

[0271] 如本文所用，除非另有说明，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。如本文所用，除非另有说明，术语“或”意指“和/或”。在多个从属权利要求的上下文中，当引用其他权利要求时，“或”的使用仅指替代方案中的那些权利要求。

[0272] 示例性EPO多肽

[0273] 提供了新型猫EPO多肽，例如除了包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13中不存在的至少一个N连接的糖基化位点的存在之外还包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的EPO多肽。

[0274] “氨基酸序列”意指蛋白质中的氨基酸序列，并且包括其中一个或多个氨基酸的侧基经过化学修饰的氨基酸序列，以及相对于在已知序列，其中一个或多个氨基酸已被替代、插入或缺失，而没有因此消除期望特性，诸如与EPO受体结合的能力。氨基酸序列也可称为肽、寡肽或蛋白质。

[0275] 如本文所用，“促红细胞生成素”、“EPO”或“EPO多肽”是包含EPO的整体或片段的多肽。

[0276] 除非另有指示，“EPO”是指来自任何脊椎动物来源的EPO多肽，所述脊椎动物包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人和食蟹猴)、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)以及伴侣动物(例如狗、猫和马)。在一些实施方案中，EPO多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

[0277] 如本文所用，“促红细胞生成素受体”、“EPO受体”或“EPOR”是包含与EPO多肽结合的EPO受体的整体或部分的多肽。

[0278] 例如，除非另有指示，“EPOR”是指来自任何脊椎动物来源的EPOR多肽，所述脊椎动物包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人和食蟹猴)、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)以及伴侣动物(例如狗、猫和马)。在一些实施方案中，EPOR包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

[0279] 术语“伴侣动物物种动物”或“伴侣动物”是指适合作为人类伴侣的动物。在一些实施方案中，伴侣动物是狗、猫或马。在一些实施方案中，伴侣动物是兔、雪貂、豚鼠或啮齿动物等。在一些实施方案中，伴侣动物是牛或猪。

[0280] “细胞外结构域”(“ECD”)是多肽延伸超过跨膜结构域到细胞外空间的一部分。如本文所用，术语“细胞外结构域”可包含完整的细胞外结构域或可包含缺失一个或多个与其配体结合的氨基酸的截短的细胞外结构域。所述细胞外结构域的组成可取决于用于确定膜中哪些氨基酸的算法。对于给定的蛋白质，不同的算法可预测不同的细胞外结构域，并且不同的系统可表达不同的细胞外结构域。

[0281] EPOR多肽的细胞外结构域可包含与EPO结合的EPOR的完整的细胞外结构域或截短的细胞外结构域。在一些实施方案中，EPOR多肽的细胞外结构域是源自伴侣动物物种的EPOR多肽的细胞外结构域。例如，在一些实施方案中，EPOR多肽的细胞外结构域源自犬EPOR、猫EPOR、马EPOR或人EPOR。在一些实施方案中，EPOR多肽的细胞外结构域包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

[0282] “野生型”是指天然存在的多肽或其片段的未突变的版本。可以重组产生野生型多肽。

[0283] “生物活性”实体或具有“生物活性”的实体是具有涉及代谢或生理过程或与代谢或生理过程相关的任何功能，和/或具有天然存在的分子的结构、调控或生化功能的实体。生物活性多肽或其片段包括可以参与生物反应的一种，所述生物反应包括但不限于配体-受体相互作用或抗原-抗体结合。生物活性可以包括改善的期望活性或减少的不期望活性。
当一个实体参与与另一种分子的分子相互作用时，当其具有减轻疾病病症的治疗价值时，当其具有诱导免疫反应的预防价值时，当其具有确定分子的存在的诊断和/或预后价值时，其可证明生物学活性。

[0284] “类似物”是一种多肽，其与参考多肽的不同之处在于基本上保留了所述参考多肽的至少一种生物学活性的单个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

[0285] 如本文所用，关于多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在用以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域技术内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALINETM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。

[0286] 在一些实施方案中，类似物具有与野生型序列多肽至少约50％的氨基酸序列同一性、至少约60％的氨基酸序列同一性、至少约65％的氨基酸序列同一性、至少约70％的氨基酸序列同一性、至少约75％的氨基酸序列同一性、至少约80％的氨基酸序列同一性、至少约85％的氨基酸序列同一性、至少约90％的氨基酸序列同一性、至少约95％的氨基酸序列同一性、至少约97％的氨基酸序列同一性、至少约98％的氨基酸序列同一性、或至少约99％的氨基酸序列同一性。

[0287] 氨基酸取代可包括但不限于用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。示例性取代在表2中示出。可以将氨基酸取代引入目的分子中，并筛选产物的期望活性，例如，保留/改善的受体结合、减少的免疫原性、或改善的药代动力学。

[0288] 表2.

[0289]

[0290] 可根据常见的侧链特性将氨基酸分组：

[0291] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

[0292] (2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

[0293] (3)酸性：Asp、Glu；

[0294] (4)碱性：His、Lys、Arg；

[0295] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

[0296] (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

[0297] 非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。

[0298] 在一些实施方案中，所述EPO多肽除了包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13中不存在的至少一个N连接的糖基化位点的存在之外还包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个N连接的糖基化位点包含所述序列天冬酰胺-xaa-丝氨酸，其中xaa是除脯氨酸外的任何氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一个N连接的糖基化位点包含所述序列天冬酰胺-xaa-苏氨酸，其中xaa是除脯氨酸外的任何氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一个N连接的糖基化位点不与另一个N连接的糖基化位点重叠。

[0299] 在一些实施方案中，所述EPO多肽在SEQ ID NO:2的氨基酸位置47-49、55-57、56-58、60-62、61-63、79-81、82-84、91-93、92-94、97-99、98-100、99-101、112-114、113-115、
114-116、115-117、116-118、137-139、140-142、141-143、142-144、143-145、144-146、145-
147、146-148、147-149、148-150、149-151、150-152、161-163、162-164、184-186和/或186-
188包含N连接的糖基化位点。

[0300] 在一些实施方案中，所述EPO多肽在SEQ ID NO:13的氨基酸位置21-23、29-31、30-32、34-36、35-37、53-55、56-58、65-67、66-68、71-73、72-74、73-75、86-88、87-89、88-90、
89-91、90-92、111-113、114-116、115-117、116-118、117-119、118-120、119-121、120-122、
121-123、122-124、123-125、124-126、135-137、136-138、158-160和/或162-164包含N连接的糖基化位点。

[0301] 在一些实施方案中，所述EPO多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的第113位的氨基酸位置处的缬氨酸。

[0302] 在一些实施方案中，所述EPO多肽包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

[0303] 在一些实施方案中，所述EPO多肽包含下表3中列出的一种或多种氨基酸修饰。

[0304] 表3

[0305]

[0306]

[0307]

[0308] *X指示除脯氨酸外的任何氨基酸。

[0309] 如本文所用，“氨基酸衍生物”是指任何氨基酸、修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，而不是在人类中发现的20种常见的天然氨基酸之一。示例性氨基酸衍生物包括在人类中未发现的天然氨基酸(例如，可能在一些微生物中发现的硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸)和非天然氨基酸。示例性氨基酸衍生物包括但不限于可通过化学产品制造商和分销商购得的氨基酸衍生物(例如，于2017年5月6日访问的sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry-products.html？TablePage＝16274965，其通过引用并入本文)。可使用利用宿主细胞、源自真细菌合成酶的正交氨酰基-tRNA合成酶、正交tRNA和氨基酸衍生物的翻译系统在特定位置处将一种或多种氨基酸衍生物掺入多肽中。有关进一步说明，参见，例如，美国专利号9,624,485。

[0310] 在一些实施方案中，本文所述的EPO多肽或其他多肽包含用氨基酸衍生物的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸衍生物是天冬酰胺衍生物、丝氨酸衍生物、苏氨酸衍生物或丙氨酸衍生物。

[0311] 如本文所用，“被糖基化”是指具有一个或多个共价附接的聚糖部分的多肽。

[0312] 如本文所用，“聚糖”或“聚糖部分”是指糖苷连接的单糖。

[0313] 聚糖以几种方式附接到糖肽，其中与天冬酰胺连接的N以及与丝氨酸和苏氨酸连接的O与重组治疗性糖蛋白最相关。N连接的糖基化发生在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。

[0314] 如本文所用，“被唾液酸化”是指具有一个或多个共价附接的唾液酸部分的多肽。

[0315] 已经开发了多种用于生产糖基化的和唾液酸化的蛋白质的方法。参见，例如，Savinova等人,Applied Biochem&Microbiol.51(8):827-33(2015)。

[0316] 如本文所用，“被聚乙二醇化”是指具有一个或多个结合或共价或非共价附接的聚乙二醇(PEG)部分的多肽。

[0317] 在一些实施方案中，所述EPO多肽被糖基化。在一些实施方案中，所述EPO多肽包含附接到N连接的糖基化位点的至少一个聚糖部分。在一些实施方案中，所述EPO多肽被唾液酸化。在一些实施方案中，所述EPO多肽被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述EPO多肽在聚糖处被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述EPO多肽在伯胺处被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述EPO多肽在N末端α胺处被聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述EPO多肽被糖基化、唾液酸化和/或聚乙二醇化。

[0318] 示例性EPO多肽的表达和产生

[0319] 提供了多核苷酸序列，其可编码带有或不带有信号序列的EPO多肽的全部或部分。如果在核酸分子的构建中未使用同源信号序列(即野生型EPO的信号序列)，则可使用另一种信号序列，例如，在PCT/US06/02951中描述的任何一个信号序列。

[0320] 典型地，将编码目的多肽(诸如EPO多肽或本文所述的另一种多肽)的核苷酸序列插入表达载体中，以适合在选择的宿主细胞中表达。

[0321] 术语“载体”用于描述可被工程化以含有克隆的多核苷酸或可在宿主细胞中繁殖的多核苷酸。载体可包括一种或多种以下元件：复制起点、调控目的多肽表达的一种或多种调控序列(诸如例如，启动子或增强子)、或一种或多种选择性标记基因(诸如例如，抗生素抗性基因和可用于比色测定的基因，例如，β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。

[0322] 载体可以是通过非病毒方法(例如裸露的DNA、配制的DNA或脂质体)或病毒方法递送的DNA质粒。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，诸如逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。所述载体可以是细菌载体。

[0323] 如本文所用，术语“表达系统”是指表达载体和至少一种另外的载体的组合。所述组合可以通过非病毒或病毒方法递送。

[0324] 在一些实施方案中，所述表达系统包含表达载体和包含调控序列(例如，编码转录因子或微小RNA的核酸序列)的载体。

[0325] 可以调控本文所述的EPO或EPOR多肽的表达，以防止体内EPO或EPOR的过量产生。受控表达可以降低免疫原性、红细胞增多症(红细胞的过度生产)或其他负面影响。有许多已知的体外和体内控制基因调控的方法，诸如四环素反应系统、微小RNA调控系统或缺氧诱导型系统(例如，使用脯氨酰羟化酶激活缺氧诱导型启动子或增强子)。

[0326] 术语“调控序列”(也称为“调控区”或“调控元件”)是指直接或间接促进和/或控制基因表达和/或蛋白质表达的核酸序列。调控序列可以是启动子、增强子、沉默子或编码微小RNA(miRNA)或转录因子的核酸序列。调控序列可以增加或减少基因表达和/或蛋白质表达。

[0327] 在一些实施方案中，调控序列与调控蛋白(诸如转录因子)结合，以控制基因表达和/或蛋白质表达。在一些实施方案中，调控序列编码控制基因表达和/或蛋白质表达的转录因子。在一些实施方案中，调控序列编码与靶mRNA结合以控制蛋白质表达的miRNA。

[0328] 在一些实施方案中，所述调控序列是可控的调控序列。在一些实施方案中，所述调控序列是不可控的调控序列，诸如组成型启动子(例如，CMV启动子)。在一些实施方案中，所述调控序列是正调控序列，诸如启动子。在一些实施方案中，所述调控序列是负调控序列，诸如沉默子。在一些实施方案中，所述调控序列提供瞬时的、可诱导的(例如，四环素反应启动子或低氧诱导型启动子)和/或组织特异性基因表达和/或蛋白质表达。

[0329] 在一些实施方案中，所述调控序列可操作地连接到编码本公开文本的EPO多肽的核酸(编码序列)。所述调控序列不必与所述编码序列邻接，只要它们起作用以指导编码的多肽的表达即可。因此，例如，在启动子序列与编码序列之间可以存在中间的未翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”到所述编码序列。

[0330] 在一些实施方案中，所述调控序列不可操作地连接到编码本公开文本的EPO多肽的核酸。例如，所述调控序列可以是从与编码所述EPO多肽的核酸相同的载体或不同的载体表达的微小RNA序列或转录因子。

[0331] “宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NS0细胞、PER. 细胞(Crucell)、293细胞和CHO细胞，及其诸如293-6E、DG-44、CHO-S和CHO-K细胞等衍生物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，所述后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补序列中)。宿主细胞包括在体内用编码本文提供的一个或多个氨基酸序列的一个或多个多核苷酸转染的细胞。

[0332] 如本文所用，术语“分离的”是指已经与典型地在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，称其为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，将含有所述多肽的上清液与产生它的细胞物理分离，认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是典型地在自然界中发现的较大的多核苷酸的一部分时(诸如例如，在DNA多核苷酸的情况下的基因组DNA或线粒体DNA)，或例如在RNA多核苷酸的情况下与产生它的细胞的至少一些组分分离，多核苷酸被称为“分离的”。因此，包含在宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可被称为“分离的”。

[0333] 在一些实施方案中，本文所述的EPO多肽或另一种多肽是使用层析(诸如尺寸排阻层析、离子交换层析、蛋白质A柱层析、疏水相互作用层析、CHT层析和/或合成分子缀合树脂层析(例如，His标签亲和柱层析))分离的。在一些实施方案中，使用Capto Butyl柱层析、阳离子交换柱层析、阴离子交换柱层析和/或混合模式柱层析分离所述EPO多肽或本文所述的另一种多肽。在一些实施方案中，使用层析方法和/或柱的组合分离本文所述的EPO多肽或另一种多肽。

[0334] 在一些实施方案中，产生或分离的方法还包括灭活或去除任何病毒。

[0335] 如本文所用，如通过等电聚焦所确定的，术语“等电点”或“pI”是指分子不携带净电荷和/或在电场中不进一步迁移的pH。

[0336] 如本文所用，如通过等电聚焦所确定的，术语“等电点范围”是指多个分子不带净电荷和/或不在电场中进一步迁移的pH范围。

[0337] 在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽的酸性级分，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽的高唾液酸化级分，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约1至约3.5、约1.5至约3.5、约2至约3.5、约2.5至约3.5、约3至约3.5、约3.5或更小、或约3或更小。

[0338] 在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽的碱性级分，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约
3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。在一些实施方案中，一种组合物，其包含EPO多肽的低唾液酸化级分，如通过等电聚焦所确定的，所述EPO多肽具有如下范围的等电点：约3.5至约6、约4至约6、约4.5至约6、约5至约6、约5.5至约6、约3.5至约5、约4至约5、约4.5至约5、约3.5或更大、约4或更大、或约4.5或更大。

[0339] 示例性EPO多肽对EPOR的亲和力

[0340] 术语“亲和力”意指在分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的诸如例如免疫印迹、ELISA KD、KinEx A、生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振装置等常规方法测量。

[0341] 术语“KD”、“Kd”、“Kd”或“Kd值”可互换使用，是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。在一些实施方案中，根据供应商说明书，使用诸如系统(Pall ForteBio LLC，加利福尼亚州弗里蒙特)等的生物传感器，通过使用生物层干涉测定来测量抗体的Kd。简而言之，将生物素化的抗原结合到传感器尖端，并监测抗体缔合90秒，监测解离600秒。用于稀释和结合步骤的缓冲液是20mM磷酸盐、150mM NaCl，pH 7.2。减去仅空白曲线的缓冲液以校正任何漂移。使用ForteBio数据分析软件将数据拟合至2:1结合模型以确定缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和Kd。所述平衡解离常数(Kd)通过koff/kon的比率计算。术语“kon”是指抗体与抗原缔合的速率常数，而术语“koff”是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。

[0342] 术语与配体或受体“结合”是本领域熟知的术语，确定这种结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与特定细胞或物质反应、缔合或具有亲和力，则称其表现出“结合”，并且所述反应、缔合或亲和力可通过本领域已知的诸如例如免疫印迹、ELISA KD、KinEx A、生物层干涉法(BLI)、表面等离子体共振装置等的一种或多种方法检测。

[0343] “表面等离子体共振”表示光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcoreTM系统(BIAcore International AB,a GE Healthcare company，瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦)。有关进一步说明，请参见Jonsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26。

[0344] “生物层干涉法”是指光学分析技术，其分析在生物传感器尖端和内部参考层上从固定化蛋白质层反射的光的干涉图案。与生物传感器尖端结合的分子数量的变化引起可以实时测量的干涉图案的偏移。用于生物层干涉法的非限制性示例性装置是系统(Pall ForteBio LLC)。参见，例如，Abdiche等人,2008,Anal.Biochem.377:209-277。

[0345] “降低”或“抑制”意指与参考相比使活性、功能或量减少、降低或停滞。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少20％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少50％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指引起总体减少75％、85％、90％、95％或更多的能力。在一些实施方案中，在相同的时间段内，相对于对照剂量(诸如安慰剂)，上述量在一段时间内被抑制或减少。

[0346] “增加”或“刺激”意指与参考相比使活性、功能或量增加、改善或增强。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体增加20％或更多的能力。在一些实施方案中，“增加”或“刺激”意指导致总体增加50％或更多的能力。在一些实施方案中，“增加”或“刺激”意指引起总体增加75％、85％、90％、95％或更多的能力。在一些实施方案中，在相同的时间段内，相对于对照剂量(诸如安慰剂)，上述量在一段时间内被刺激或增加。

[0347] 如本文所用，“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准或水平。可以从健康或未患病样品中获得参考。在一些例子中，从伴侣动物的未患病或未处理样品中获得参考。在一些例子中，从特定物种的一种或多种健康动物而不是被测试或治疗的动物获得参照。

[0348] 在一些实施方案中，给予本发明的EPO多肽或核酸可导致血细胞比容百分比的增加增加到至少25％、或至少26％、或至少27％、或至少28％、或至少29％、或至少30％、或至少32％、或至少35％、或至少38％、或至少40％、或至少42％、或至少45％、或至少48％。

[0349] 示例性药物组合物

[0350] 术语“药物配制品”和“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对所述配制品所给予的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。

[0351] “药学上可接受的载体”是指用于与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、配制助剂或本领域中常规的载体，它们共同包含用于给予至受试者的“药物组合物”。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与所述配制品的其他成分相容。所述药学上可接受的载体适用于所用的配制品。药学上可接受的载体的例子包括氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；诸如人血清白蛋白、犬或其他动物白蛋白等的血清蛋白；诸如磷酸盐、柠檬酸盐、氨丁三醇或HEPES缓冲液等的缓冲液；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；盐或诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅或三硅酸镁等的电解质；聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质；聚乙二醇；蔗糖；甘露糖醇；或包括但不限于精氨酸的氨基酸。

[0352] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体具有约6.2至约7、约6至约7.2、约6.4至约6.8、约6、或约7的pH，并且包含磷酸钠和氯化钠。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体具有约6.2至约7、约6至约7.2、约6、约6.4至约6.8、或约7的pH，并且包含柠檬酸钠和氯化钠。

[0353] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括磷酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括柠檬酸钠、氯化钠和聚山梨醇酯80。

[0354] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含具有约100nM至约180nM、约110nM至约170nM、约120nM至约160nM、约130nM至约150nM、约140nM、约130nM至约160nM、约
120nM至约150nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约
170nM、或约180nM的浓度的氯化钠。

[0355] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含具有约100nM至约180nM、约110nM至约170nM、约120nM至约160nM、约130nM至约150nM、约140nM、约130nM至约160nM、约
120nM至约150nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约
170nM、或约180nM的浓度的磷酸钠。

[0356] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含具有约550nM至约750nM、约570nM至约730nM、约590nM至约720nM、约600nM至约700nM、约620nM至约680nM、约640nM至约
660nM、约650nM、约570nM至约670nM、约550nM至约650nM、约650nM至约750nM、约630nM至约
700nM、或约670nM至约600nM的浓度的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。

[0357] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含间甲酚或苯甲醇。在一些实施方案中，间甲酚的浓度为约0.2％、约0.1％至约0.3％、约0.08％至约0.25％、或约0.05％至约0.25％。在一些实施方案中，苯甲醇的浓度为约1％、约0.5％至约2％、约0.2％至约2.5％、约1％至约5％、约0.5％至约5％、或约1％至约3％。

[0358] 所述药物组合物可以冻干形式保存；因此，在一些实施方案中，所述制备过程包括冻干步骤。然后可以在给予至猫之前，将所述冻干的组合物重新配制，典型地作为适于肠胃外给予的含水组合物。在其他实施方案中，特别是当所述蛋白质对热变性和氧化变性而言高度稳定时，所述药物组合物可以作为液体储存，即作为含水组合物储存，其可以直接或在适当稀释的情况下给予至狗、猫或马。可以用无菌注射用水(WFI)进行重建，并且可以包括抑菌剂，诸如苯甲醇。因此，本发明提供了固体或液体形式的药物组合物。

[0359] 当给予时，所述药物组合物的pH典型地将在约pH 6至pH 8的范围内，例如约6、约6.2、约6.4、约6.6、约6.8、约7、约7.2。如果它们用于治疗目的，则本发明的配制品是无菌的。无菌可以通过本领域已知的几种方式中的任何一种来实现，包括通过无菌过滤膜(例如，0.2微米膜)过滤。可以使用或不使用抗细菌剂来维持无菌。

[0360] 本发明的药物配制品可用于本发明的方法中治疗伴侣动物诸如猫的贫血相关病症。例如，本文所述的方法包括向猫给予治疗有效剂量的本公开文本的核酸或多肽。在许多实施方案中，肠胃外给予治疗有效剂量，例如通过皮下给予、静脉内输注、静脉内推注注射或肌内注射。

[0361] 因此，根据本发明的方法，将EPO多肽或核酸、本发明的其他多肽或核酸、或药物组合物以治疗有效剂量给予猫、犬、马或人。

[0362] 在一些实施方案中，将所述治疗有效剂量每周给予一次，持续至少连续两周或三周，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地散布有一周或多周未治疗。在其他实施方案中，将所述治疗有效剂量每天给予一次，持续连续二至五天，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地散布有一天或多天未治疗。

[0363] EPO和EPOR ECD多肽的示例性用途

[0364] 包含一个或多个另外的N糖基化位点的EPO多肽或包含本文公开的EPO多肽的药物组合物可用于治疗非再生性贫血。非再生性贫血病症可以在伴侣动物中表现出来，所述伴侣动物包括但不限于犬、猫、或马。

[0365] 在第二结合位点包含氨基酸取代的EPO多肽或本文公开的包含第二位点突变EPO多肽的药物组合物可用于治疗红细胞增多症。

[0366] 包含EPOR的细胞外结构域的多肽或包含本文公开的EPOR ECD多肽的药物组合物可用于治疗红细胞增多症。

[0367] 如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望临床结果的途径。如本文所用，“治疗”包括针对哺乳动物(包括伴侣动物)中的疾病，对治疗剂的任何给予或施加。出于本公开文本的目的，有益或期望临床结果包括但不限于以下中的任何一个或多个：减轻一种或多种症状，降低疾病程度，预防或延迟疾病的传播，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，抑制疾病或疾病进展，抑制或减缓疾病或疾病进展，停滞疾病发展和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还涵盖减少增殖性疾病的病理后果。本文提供的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。与上述一致，术语治疗不需要百分之百地去除所述障碍的所有方面。

[0368] 在一些实施方案中，可以根据本文方法利用EPO多肽、核酸、载体、表达系统或包含它的药物组合物来治疗EPO缺陷或EPO不敏感性诱导的病症。在一些实施方案中，将EPO多肽、核酸、载体、表达系统或药物组合物给予至伴侣动物，诸如犬、猫或马，以治疗EPO缺陷或EPO不敏感性诱导的病症。在一些实施方案中，将EPO多肽、核酸、载体、表达系统或药物组合物给予至伴侣动物，诸如犬、猫或马，以治疗贫血。

[0369] 物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如待治疗的疾病类型、疾病状态、疾病的严重程度和病程、治疗目的的类型、任何既往治疗、临床病史、对先前治疗的反应、主治兽医的判断、动物的年龄、性别和体重、以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在动物中引起期望反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用的量。治疗有效量可以按一次或多次给予来递送。“治疗有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现期望治疗或预防结果的量。

[0370] 在一些实施方案中，通过皮下给予、静脉内输注或肌内注射肠胃外给予EPO或EPOR多肽、多肽、核酸、载体、或表达系统或药物组合物。在一些实施方案中，EPO或EPOR多肽、多肽、核酸、载体、表达系统、或药物组合物作为推注或连续输注一段时间来给予。在一些实施方案中，EPO或EPOR多肽、多肽、核酸、载体、表达系统或药物组合物是通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内或吸入途径给予的。

[0371] 本文所述的EPO或EPOR多肽可以以每剂0.0001mg/kg体重至100mg/kg体重范围内的量给予。在一些实施方案中，EPO或EPOR多肽可以以每剂0.0005mg/kg体重至50mg/kg体重范围内的量给予。在一些实施方案中，EPO或EPOR多肽可以以每剂0.001mg/kg体重至10mg/kg体重范围内的量给予。在一些实施方案中，EPO多肽可以以约1μg/kg体重至约10μg/kg体重、或约1μg/kg体重至约5μg/kg体重、或约1μg/kg体重、或约3μg/kg体重、或约5μg/kg体重、或约10μg/kg体重范围内的量给予。

[0372] EPO或EPOR多肽、核酸、载体、表达系统或药物组合物可一次或通过一系列治疗给予至伴侣动物。例如，EPO或EPOR多肽、核酸、载体、表达系统或药物组合物可以给予至少一次、多于一次、至少两次、至少三次、至少四次、或至少五次、或长期使用。

[0373] 在一些实施方案中，将所述剂量每周给予一次，持续至少连续两周或三周，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地散布有一周或多周未治疗。在其他实施方案中，将所述治疗有效剂量每天给予一次，持续连续二至五天，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地散布有一天或多天未治疗。

[0374] 与一种或多种其他治疗剂“组合”给药包括以任何顺序同时(并发)和连续或依次给予。术语“并发”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的给予，其中至少部分给予在时间上重叠或者一种治疗剂的给药相对于另一种治疗剂的给药在很短的时间内发生。例如，所述两种或更多种治疗剂以不超过约指定分钟数的时间间隔给予。术语“顺序地”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的给药，其中在中断给予一种或多种其他药剂后继续给予一种或多种药剂，或者其中在给予一种或多种其他药剂之前给予一种或多种药剂。例如，以超过约指定分钟数的时间间隔给予所述两种或更多种治疗剂。如本文所用，术语“与……结合”是指除了另一种治疗模态之外还给予一种治疗模态。因此，“与……结合”是指在向动物给予另一种治疗模态之前、期间或之后给予一种治疗模态。

[0375] 本文提供了使用所述抗EPO多肽和多核苷酸用于检测、诊断和监测贫血病症的方法。例如，可以通过使用标准方法测量血细胞比容百分比(HCT％)来检测、诊断或监测贫血。本文提供了确定伴侣动物是否将对EPO多肽有反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用EPO多肽检测动物是否具有表达EPOR的细胞。在一些实施方案中，所述检测方法包括使所述样品与EPO多肽或多核苷酸接触，并确定结合水平是否不同于参考或比较样品(诸如对照)的结合水平。在一些实施方案中，所述方法可用于确定本文所述的抗体或多肽是否是对所述受试动物而言是适当治疗。

[0376] 在一些实施方案中，所述样品是生物样品。术语“生物样品”意指来自活物或曾经的活物的物质的量。在一些实施方案中，所述生物样品是细胞或细胞/组织裂解物。在一些实施方案中，所述生物样品包括但不限于血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、滑液和上皮细胞。

[0377] 可以使用本领域已知的各种检测特异性配体-受体结合的方法。可以进行的示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、比浊法抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。可以将指示剂部分或标记基团附接到所述主题抗体上并进行选择以满足通常由测定设备的可用性和相容的免疫测定程序决定的所述方法的各种使用的需要。适当标记包括但不限于放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或p-乳糖苷酶)、荧光部分或蛋白质(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)或发光部分(例如，由Quantum Dot Corporation,Palo Alto，加利福尼亚州提供的QdotTM纳米颗粒)。用于进行上述各种免疫测定的一般技术是本领域普通技术人员已知的。

[0378] 出于诊断目的，可以用可检测部分标记所述多肽(包括EPO或EPOR)，所述可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记和本领域已知的各种酶-底物标记。将标记与蛋白质缀合的方法是本领域已知的。

[0379] 以下例子说明了本公开文本的具体方面，并不旨在以任何方式限制本公开内容。

[0380] 实施例

[0381] 实施例1

[0382] 猫EPO的N连接的糖基化位点的鉴定

[0383] 野生型猫EPO具有三个N连接的糖基化位点—在野生型猫EPO G44前体形式(SEQ ID NO:1或“野生型猫EPO G44”)的氨基酸位置50-52、64-66和109-111和野生型G18猫EPO成熟形式(SEQ ID NO:12或“野生型猫EPO G18”)的氨基酸位置24-26、38-40和83-85。

[0384] 可以将另外的N连接的糖基化位点引入野生型猫EPO氨基酸序列中。例如，可以将一个、两个、三个、四个、五个或六个另外的N连接的糖基化位点引入野生型猫EPO氨基酸序列中。所述N连接的糖基化位点可以具有Asn-Xaa-Ser/Thr的共有序列，其中Xaa是除脯氨酸外的任何氨基酸。添加一个或多个糖基化位点可能会增加猫EPO分子的分子大小，提供更多的唾液酸化位点和/或改善该分子在动物血清中的半衰期。

[0385] 表4列出了野生型猫EPO G44的氨基酸取代，其可用于生成一个或多个另外的N连接的糖基化位点。

[0386] 表4.

[0387]

[0388]

[0389]

[0390]

[0391] *X指示除脯氨酸外的任何氨基酸。

[0392] 实施例2

[0393] 具有另外的N连接的糖基化位点的猫EPO的表达

[0394] 化学合成了编码EPO多肽的核苷酸序列，与野生型猫EPO G44前体相比，其具有另外的N连接的糖基化位点。具体而言，所述序列编码“类似物6-30GV前体”(SEQ ID NO:3)，其在野生型猫EPO前体的第44位具有一个甘氨酸，在第113位具有一个缬氨酸取代，并在第56-58(N56T58)和114-116(N114)位具有两个另外的N连接的糖基化位点。

[0395] 将所述核苷酸序列插入表达载体中，并转染到CHO DG-44宿主细胞中。如本领域所知，使用所述表达载体上的DHFR基因和甲氨蝶呤介导的基因扩增，针对所述EPO多肽的高产量和表达稳定性选择CHO DG-44细胞。所述EPO多肽的成熟形式(称为“类似物6-30GV成熟物”(SEQ ID NO:14))被分泌到培养基中。

[0396] 实施例3

[0397] 猫EPO的分离

[0398] 可以培养表达猫EPO多肽的细胞系，直到产生足够量的所述EPO多肽。可以通过各种步骤中的一个或多个来分离所述多肽，包括Capto Butyl柱层析、阳离子交换(CEX)柱层析、阴离子交换(AEX)柱层析、或其他层析方法。其他层析方法可以包括离子交换柱层析、疏水相互作用柱层析、混合模式柱层析(例如，CHT和/或多峰模式柱层析，诸如CaptoMMC)。可以应用低pH或其他病毒灭活和病毒去除步骤。可将分离的EPO多肽与赋形剂混合，并通过过滤灭菌以制备本发明的药物组合物。所述药物组合物可以足以刺激造血活性的剂量给予至患有贫血的猫。

[0399] 当细胞活力降至95％以下时，通过澄清条件培养基收获上清液。例如，将层析步骤的组合用于纯化类似物6-30GV成熟多肽(SEQ ID NO:14)。收集来自表达所述EPO多肽的CHO细胞的培养基，并添加氯化钠(NaCl)对其进行处理，以使所述培养基的NaCl浓度大于1M NaCl，以使所述EPO多肽可以通过疏水相互作用层析(HIC)与Capto Butyl柱(GE Healthcare Life Sciences)结合。EPO被理解为在约5.75至约8.5的pH下用约1至约2.5M的NaCl与Capto Butyl柱结合。通过离心和过滤使条件培养基澄清，并加载到所述Capto Butyl柱上。用30％异丙醇在约5.6的pH下从柱上洗脱结合的EPO多肽。

[0400] 使用CHO宿主细胞蛋白分析ELISA 试剂盒(目录号CM015；Cygnus Technologies)分析分离的宿主细胞蛋白。通过这种纯化方法，至少约95％的宿主细胞蛋白与EPO蛋白分离。

[0401] 来自Capto Butyl柱的洗脱液直接作为差减层析步骤(subtraction chromatography step)加载到SP阳离子交换(CEX)柱(GE Healthcare Life Sciences)上。
在pH约5.6的30％异丙醇加载条件下，EPO多肽流经所述SP CEX柱，而宿主细胞蛋白应结合。

[0402] 将来自所述SP CEX柱的流出物直接加载到Capto Q阴离子交换(AEX)柱(GE Healthcare Life Sciences)上，该Capto Q阴离子交换(AEX)柱在pH约5.6的30％异丙醇中与EPO多肽结合。添加pH 4洗涤液以去除碱性EPO多肽级分，而酸性EPO多肽级分保留在固相中。将所述EPO多肽酸性级分用0.15M NaCl在pH 4洗脱，并将洗脱液在pH 4和环境温度下保持90分钟以上以灭活病毒。该步骤还增加了所述EPO多肽酸性级分的浓度。

[0403] 将含有所述EPO多肽酸性级分的洗脱液直接加载到SP CEX柱(GE Healthcare Life Sciences)上，以分离任何残留的内毒素和碱性EPO多肽级分，并进一步浓缩所述EPO多肽酸性级分。将所述EPO多肽酸性级分用0.5M NaCl在pH 4洗脱，并将洗脱液在pH 4和环境温度下保持90分钟以上以灭活病毒。

[0404] 切向流过滤(TFF)可用于浓缩所述酸性和碱性级分EPO多肽级分。可以执行使用Sperdex200的凝胶过滤步骤以去除任何聚集体，并作为交换到期望缓冲液(例如，如下所述的配制品缓冲液)的缓冲液。可以执行纳滤步骤以去除任何残留的病毒污染物。

[0405] 实施例4

[0406] EPO缓冲液配制品

[0407] 分析了各种缓冲液配制品中猫EPO的热稳定性。考虑在pH 6.2和pH 7下含有20mM柠檬酸钠或20mM磷酸钠的缓冲液。所有缓冲液均使用最终浓度为140mM的氯化钠。比较了聚山梨醇酯80和20。还比较了抑菌剂苯甲醇和间甲酚。通过差示扫描荧光技术从20℃到95℃测量每种缓冲液中浓度为6μg/μL的猫EPO类似物6-30GV成熟物的熔融温度(Tm)。表5列出了各种测试缓冲液中猫EPO的Tm值。

[0408] 表5.

[0409]

[0410]

[0411]

[0412] *没有峰指示没有观察到明显的熔点。

[0413] 不含抗细菌剂且Tm为50℃或更高的配制品A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3可能更适合单剂量。在包含抗细菌剂的配制品中，Tm为50℃的配制品A5和C6显现更适合多剂量。

[0414] 实施例5

[0415] 类似物6-30GV成熟物的表征

[0416] 对使用实施例3的方法分离出的猫EPO类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)进行表征。

[0417] 将碱性和酸性类似物6-30GV成熟级分通过等电聚焦(IEF)(图1A和图2)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶(图1B)可视化。

[0418] 对于Western分析，通过SDS-PAGE分离了类似物6-30GV成熟物的酸性级分(1μg、0.5μg、0.2μg、0.1μg和0.05μg)的系列稀释液，转移至PVDF膜，并且将所述膜用兔抗人EPO多克隆抗体(目录号AB-386-NA，R&D Systems)以1:1000稀释度探测(图3)。所述抗体对人EPO的N末端19个氨基酸具有特异性，所述人EPO的N末端19个氨基酸与猫EPO的N末端19个氨基酸相同。糖基化的野生型猫EPO成熟形式的分子量可能约为34kDa。基于图3，类似物6-30GV成熟物的分子量显现为约50-55kDa。另外的糖基化显现促进了分子大小的增加。

[0419] 蛋白质上的唾液酸化糖基化可以增强其体内药代动力学。在所有脊椎动物聚糖上表达为末端单元的常见唾液酸典型地包括N-羟神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。进行类似物6-30GV成熟物的唾液酸分析。简而言之，将类似物6-30GV成熟物的酸性级分在80℃下用2M乙酸处理3小时，然后在真空离心机中去除乙酸。通过3K旋转过滤单元过滤处理过的EPO样品，以去除未水解的蛋白质。使流出样品与DMB试剂反应。使用C18柱和荧光检测器通过高效液相层析(HPLC)对0.04μg的进样量进行分析。N-乙酰神经氨酸被鉴定为转染的CHO DG44细胞表达的类似物6-30GV成熟物上存在的唾液酸的主要形式。未鉴定出可检测N羟乙酰神经氨酸(图4)。

[0420] 通过Edman测序确认了类似物6-30GV成熟物的N末端序列。简而言之，分离的类似物6-30GV成熟物通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜(BioRad)。从膜分离蛋白质带，并在加利福尼亚大学戴维斯分校的分子结构实验室使用Edman降解对其进行N末端测序。所述N末端序列被鉴定为Ala Pro Xaa Arg Leu Ile Xaa Asp Ser Arg Val，其对应于SEQ ID NO:14的N末端序列。

[0421] 使用制造商的说明，将分离的类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)用(PNGase F)(产品目录号GKE-5006A，ProZyme，加利福尼亚)处理，以去除N
连接的聚糖。通过SDS-PAGE监测去糖基化过程，直到观察到19kD带，指示所述多肽被去糖基化。在加利福尼亚州的斯克里普斯代谢组学和质谱中心使用串联质谱分析了去糖基化的类似物6-30GV成熟样品的片段序列。通过绘制77％的肽序列来确认类似物6-30成熟物的序列(数据未示出)。

[0422] 实施例6

[0423] 猫EPO的唾液酸化对体外活性的影响

[0424] 通过TF-1细胞增殖测定比较了分离的类似物6-30GV成熟物的酸性级分和碱性级分的体外活性。TF-1细胞是因子依赖性人红白血病细胞。EPO是促进TF-1细胞增殖的因子之一。酸性(或高唾液酸化)级分的等电点范围为约2至约3.5，而碱性(或低唾液酸化)级分的等电点范围为约3.5至约5。

[0425] 对于增殖测定，在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL的青霉素、100μg/mL 链霉素和2ng/mL rhGM-CSF(R&D Systems目录号215-GM)的RPMI 1640(Irvine目录号9160)中培养TF-1细胞(ATCC CRL-2003)。在用类似物6-30GV成熟物的酸性级分或基本级分处理之前，将所述TF-1细胞以2 x 105细胞/mL的密度接种在96孔平底板上，并使其附着过夜。第二天早上，用不同浓度的类似物6-30GV成熟物的酸性和碱性级分处理所述细胞。孵育48小时后，根据制造商说明书，将MTT试剂(目录号CGD1，Sigma-Aldrich)添加到所述细胞中，持续48-72小时。然后将不溶的紫色反应产物用异丙醇溶解，并将所述板在570和690nm下读取。在校正了背景的情况下，以在570nm与690nm(ΔOD)之间的光密度差来测量增殖强度。在基于细胞的功能测定中，分离的类似物6-30GV成熟物的酸性级分证明比碱性级分低的效价(图5)，表明较高的唾液酸化导致较低的活性。

[0426] 实施例7

[0427] 唾液酸化对药代动力学的影响

[0428] 在猫中进行的药代动力学研究涉及单次注射10μg/kg剂量的分离的类似物6-30GV成熟物的碱性级分或10μg/kg剂量的分离的类似物6-30GV成熟物的酸性级分。研究的碱性(或低唾液酸化)级分的等电点范围为约4至约6，而酸性级分的等电点范围为约2至约3.5。两只猫皮下注射所述碱性级分，而11只猫则注射酸性级分(静脉内注射4只；皮下注射4只，并且肌肉内注射3只)。

[0429] 通过ELISA分析注射前(时间0)和注射后各个时间点血清中的EPO浓度。ELISA中使用了分离的类似物6-30GV成熟物的基本级分的样品作为参考，检出限为0.4ng/mL。随着时间的流逝，在皮下注射分离的类似物6-30GV成熟物的碱性级分的猫的血清中，几乎没有检测到EPO，表明所述低唾液酸化形式的半衰期非常短(图6A)。通过静脉内、皮下和肌肉内给予而注射分离的类似物6-30GV成熟物的酸性级分的猫的血清中的EPO浓度分别示于图6B、图6C和图6D。在下表6中列出了计算为均值的药代动力学参数。

[0430] 表6.

[0431]

[0432]

[0433] *生物利用度是根据IV组100％生物利用度的假设计算得出的。

[0434] 类似物6-30GV成熟物的高唾液酸化作用显现增强了体内多肽的药代动力学，但在基于体外细胞的功能测定中却降低了其效力(实施例6)。虽然猫EPO的药代动力学可以通过高唾液酸化作用在体内得到增强，但代价是亲和力和活性较低。虽然低唾液酸化的猫EPO可以具有更好的亲和力和活性，但它可能表现出较短的半衰期。

[0435] 实施例8

[0436] 猫EPO受体的表达

[0437] 具有单个跨膜结构域的几种猫EPO受体(EPOR)蛋白是由外显子3的核苷酸序列差异产生的交替剪接的mRNA序列产生的。两种EPOR蛋白的氨基酸序列是从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库获得的：UniProtKB-M3X491 M3X491_FELCA(SEQ ID NO:27)和UniProtKB–M3W333 M3W333_FELCA(SEQ ID NO:32)。M3X491_FELCA的氨基酸序列在本文中也称为Feline EPOR201(fEPOR201)。但是，M3W333的第50-53位的氨基酸未知，在数据库中用“X”表示。使用三维蛋白质结构分析，对M3W333的氨基酸序列进行了修饰，并将氨基酸插入在第50-53位以产生fEPOR202(SEQ ID NO:28)。

[0438] 合成分别与人Fc(分别为SEQ ID NO:7和8)融合的编码猫EPOR201和EPOR202的可溶性细胞外结构域的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:23和24)，将其克隆到哺乳动物表达载体中，并在CHO细胞中表达。使用抗Fc抗体作为探针，通过SDS-PAGE和Western印迹分析来自细胞沉淀的上清液，证明fEPOR201_ECD-Fc和fEPOR202_ECD-Fc都可重组表达(图7A)。也可以使用分别包含SEQ ID NO 29和30的氨基酸序列的EPOR201和EPOR202的细胞外结构域。

[0439] 合成带有N末端flag标签(分别为SEQ ID NO:5和6)的编码全长猫EPOR201和EPOR202的核苷酸序列，并克隆到哺乳动物表达载体中。将每种表达载体转染到CHO细胞中，并从每次转染中选择稳定的池细胞。使用抗flag抗体作为探针，通过SDS-PAGE和Western印迹分析来自细胞沉淀的裂解物，证明fEPOR201-N-flag和fEPOR202-N-flag均可重组表达(图7B和图7C)。猫全长EPOR表达细胞系可用于猫EPO结合测定或带有或不带有适当修饰的功能测定。使用标准蛋白质A层析分离两种EPOR201蛋白(SEQ ID NO:5和7)。

[0440] 实施例9

[0441] 类似物6-30GV成熟物与猫EPO受体结合

[0442] 分别测试类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:12)与fEPOR201_ECD-Fc(SEQ ID NO:7)和fEPOR202_ECD-Fc(SEQ ID NO:8)的结合。进行如下结合分析。简而言之，使用EZ-Link NHS-LC-生物素(目录号21336，Thermo Scientific)将fEPOR201_ECD-Fc和fEPOR202_ECD-Fc生物素化。通过透析去除游离的未反应的生物素。生物素化的fEPOR201_ECD-Fc和fEPOR202_ECD-Fc被捕获在链霉亲和素传感器尖端(目录号18-509，ForteBio)上。

[0443] 对五个不同浓度(150、50、17、5.6和1.9nM)的类似物6-30GV成熟物的缔合进行了90秒的监测。监测解离600秒。减去仅缓冲液空白曲线以校正任何漂移。使用ForteBioTM数据分析软件将数据拟合为1:1结合模型，以确定kon(缔合速率常数)、koff(解离速率常数)和Kd(解离常数)。结合统计在可接受的参数之内(卡方小于或等于3.0；R方大于或等于0.9)。用于稀释和所有结合步骤的缓冲液为：200mM磷酸盐，150mM NaCl，0.02％Tween-20，0.05％叠氮化钠和0.1mg BSA，pH7.4。类似物6-30GV成熟物和fEPOR201_ECD-Fc(SEQ ID NO:7)的Kd-10
为4 x 10 M并且类似物6-30GV成熟物和fEPOR202_ECD-Fc(SEQ ID NO:8)的Kd为1.7 x 10-10M。

[0444] 实施例10

[0445] 类似物6-30GV成熟物和人EPO与人EPO受体结合的比较

[0446] 比较类似物6-30GV成熟物和重组人EPO(目录号E5627，Sigma-Aldrich)与人EPO受体(EPOR)的结合。简而言之，人EPOR的细胞外结构域(目录号963-ER-050，R&D Systems)被生物素化。通过广泛的透析从生物素化的人EPOR中去除游离的未反应生物素。生物素化的人EPOR被捕获在链霉亲和素传感器末端。对5个不同浓度(20、6.7、2.2、0.74和0.25nM)的类似物6-30GV成熟物或人EPO与人EPOR的缔合进行了90秒的监测。监测解离600秒。减去仅缓冲液空白曲线以校正任何漂移。使用ForteBioTM数据分析软件将数据拟合为1:1结合模型，以确定kon(缔合速率常数)、koff(解离速率常数)和Kd(解离常数)。结合统计在可接受的参数之内(卡方小于或等于3.0；R方大于或等于0.9)。用于稀释和所有结合步骤的缓冲液是200mM磷酸盐，150mM NaCl，0.02％Tween-20、0.05％叠氮化钠和0.1mg BSA，pH 7.4。人类EPO和人EPOR的Kd为1.07 x 10-10M，类似物6-30GV成熟物和人EPOR的Kd为9.76 x 1011M。类似物6-30GV成熟物和人EPO显现具有对人EPOR的相似结合亲和力。

[0447] 实施例11

[0448] 类似物6-30GV成熟物和人EPO与人EPO受体结合的比较对TF-1细胞的增殖作用[0449] EPO多肽具有两个EPO受体结合位点。类似于实施例10中所述的测定，体外结合测定在很大程度上反映了第一位点结合动力学，因为第二位点结合应理解为较弱(与人第一位点相比亲和力低约500至1000倍)。参见Philo,J.S.等人,Dimerization of the extracellular domain of the erythropoietin(EPO)receptor by EPO:one high-affinity and one low-affinity interaction.Biochemistry 35,1681-91(1996)。EPO-依赖性细胞增殖测定(如本实施例中所述)可评估EPO活性，因为它与第一结合位点和第二结合位点的完整性有关。

[0450] 将类似物6-30GV成熟物对表达人EPOR的TF-1细胞与重组人EPO(目录号E5627，Sigma-Aldrich)的增殖作用进行了比较。对于增殖测定，在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL的青霉素、100μg/mL链霉素和2ng/mL rhGM-CSF(R&D Systems目录号215-GM)的RPMI 1640(Irvine目录号9160)中培养TF-1细胞。在用类似物6-30GV成熟物或重组人EPO处理之前，将所述TF-1细胞以2 x 105细胞/mL接种在96孔平底板上，并使其附着过夜。第二天早上，用不同浓度的类似物6-30GV成熟物或重组人EPO处理所述细胞。孵育48小时后，根据制造商说明书，将MTT试剂添加到所述细胞中，又持续48-72小时。然后将不溶的紫色反应产物用异丙醇溶解，并将所述板在570和690nm下读取。在校正了背景的情况下，以在570nm与690nm(ΔOD)之间的光密度差来测量增殖强度。

[0451] TF-1细胞对类似物6-30GV成熟物和重组人EPO的增殖反应示于图8。对于每个增殖曲线，确定给出半数最大反应的EPO多肽的浓度(EC50)。出乎意料的是，基于该MTT测定，类似物6-30GV成熟物和重组人EPO对人EPOR的相似亲和力(如实施例10中所测量)显现未转化为两个EPO多肽之间的相似EC50。类似物6-30GV成熟物的EC50(0.3IU/mL)比重组人EPO的EC50(0.02IU/mL)高一个数量级，表明与重组人EPO相比，类似物6-30GV成熟物的增殖活性较低。

[0452] 实施例12

[0453] 猫EPO的蛋白质结构分析

[0454] 为了鉴定与重组人EPO相比，类似物6-30GV成熟物的增殖作用减少的可能原因，比较了野生型猫EPO G18和人EPO的第二受体结合位点的结构。

[0455] 首先，通过本领域技术人员理解的蛋白质结构建模获得了猫EPO G18和人EPO的三维结构。基于人EPO的第二结合位点的位置，鉴定了野生型猫EPO G18的第二结合位点。接下来，比较了野生型猫EPO G18的第二受体结合位点的界面残基和人EPO，发现它们不太可能影响野生型猫EPO G18的第二位点结合。然后，考虑了野生型猫EPO G18的第二结合位点内部的氨基酸残基。出乎意料的是，在第二结合位点的内部鉴定了在第18位的甘氨酸(G)。另外，在G18周围观察到蛋白质结构中的空体积。

[0456] 这导致对野生型猫EPO E18蛋白质结构的研究。野生型猫EPO E18已被表征为变体，尚不清楚野生型猫EPO G18和EPO E18之间的生物学功能(例如，增殖作用等)的任何差异。基于这种蛋白质结构分析，与G18不同，E18显现与R14形成氢键，而与Y15形成氢/范德华力。E18显现也与K97相互作用。参见图9。R14、Y15和K97位于第二结合位点的界面处，并且可以直接参与维持第二受体结合。

[0457] 另外，还考虑了其他哺乳动物物种的氨基酸序列，发现所有这些氨基酸序列不仅共享E18，而且共享R14、Y15和K97。所有四个氨基酸(R14、Y15、E18和K97)在人、狗、马、食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠、绵羊和猪中都是保守的。

[0458] 基于此分析，类似物6-30GV成熟物的G18可以影响其第二位点的结合，并促进了其增殖作用的减少。

[0459] 实施例13

[0460] 类似物6-30EV的表达和分离

[0461] 发现E18对于第二位点结合可能很重要后，进行了涉及野生型猫EPO E18类似物的研究。化学合成了编码EPO多肽的核苷酸序列，与野生型猫EPO E44前体相比，其具有另外的N连接的糖基化位点。具体而言，所述序列编码“类似物6-30EV前体”(SEQ ID NO:4)，其在野生型猫EPO E44前体的第44位具有谷氨酸，在113位具有缬氨酸取代，并在第56-58(N56T58)和114-116(N114)位具有两个另外的N连接的糖基化位点。

[0462] 将所述核苷酸序列插入表达载体中，并转染到CHO DG-44宿主细胞中。如本领域所知，使用所述表达载体上的DHFR基因和甲氨蝶呤介导的基因扩增，针对所述EPO多肽的高产量和表达稳定性选择CHO DG-44细胞。所述EPO多肽的成熟形式(称为“类似物6-30EV成熟物”(SEQ ID NO:15))被分泌到培养基中。根据实施例3中所述的方法分离类似物6-30EV成熟物。

[0463] 实施例14

[0464] 猫EPO E44的N连接的糖基化位点

[0465] 野生型猫EPO E44前体形式(SEQ ID NO:2或“野生型猫EPO E44”)在氨基酸位置50-52、64-66和109-111处具有三个N连接的糖基化位点，它们分别对应于野生型猫EPO E44成熟形式(SEQ ID NO:13或“野生型猫EPO E18”的氨基酸位置24-26、38-40和83-85)。

[0466] 还可以将另外的N连接的糖基化位点引入野生型猫EPO E44和野生型猫EPO E18氨基酸序列中。例如，可以将一个、两个、三个、四个、五个或六个另外的N连接的糖基化位点引入野生型猫EPO E44/E18氨基酸序列中。所述N连接的糖基化位点可以具有Asn-Xaa-Ser/Thr的共有序列，其中Xaa是除脯氨酸外的任何氨基酸。添加一个或多个糖基化位点可能会增加猫EPO分子的分子大小，提供更多的唾液酸化位点和/或改善该分子在动物血清中的半衰期。

[0467] 表7列出了野生型猫EPO E44和E18的氨基酸取代，其可用于生成一个或多个另外的N连接的糖基化位点。

[0468] 表7.

[0469]

[0470]

[0471]

[0472]

[0473] *X指示除脯氨酸外的任何氨基酸。

[0474] 实施例15

[0475] 类似物6-30EV成熟物和类似物6-30GV成熟物与EPOR的结合

[0476] 如通过ELISA测试的，类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)的酸性(高唾液酸化)级分和类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)的酸性(高唾液酸化)级分结合的等电点范围为约2至约3.5，而类似物6-30GV成熟物的碱性(低唾液酸化)级分与人EPOR-Fc(目录号963-ER-050，R&D Systems)的范围的等电点为约4至约5。

[0477] 96孔板涂有小鼠抗EPO特异性抗体(目录号MAB287，克隆9C21D11，R&D Systems)以捕获所述EPO多肽。将与EPO结合的孔与浓度为200ng/mL的人EPOR-Fc一起孵育，并通过抗人Fc HRP缀合的抗体检测结合的EPOR。再次进行了ELISA，但是首先用神经氨酸酶处理了三个EPO多肽样品以去除唾液酸。所得的EC50在下表8中列出。

[0478] 表8.

[0479]

[0480] *在进行ELISA 2之前，对EPO样品进行了神经氨酸酶处理。

[0481] 与碱性(低唾液酸化)级分相比，类似物6-30GV成熟物的酸性(高唾液酸化)级分显示出更高的EC50值，表明受体与所述酸性级分的结合亲和力降低。该结果与实施例6的比较类似物6-30GV成熟物的酸性和碱性级分的结合测定结果一致。当去除唾液酸残基以进行第二次ELISA时，类似物6-30EV成熟物和类似物6-30GV成熟物的EC50值总体上相似，表明对EPO受体的结合亲和力相似。

[0482] 实施例16

[0483] 类似物6-30EV成熟物和类似物6-30GV成熟物的增殖作用

[0484] 如实施例11所述，通过TF-1细胞增殖测定比较类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)类似物6 30GV成熟物(SEQ ID NO:14)的第一和第二受体结合位点的完整性。在此测定中，测试了两个样品：1)类似物6-30EV成熟物以及2)50％类似物6-30EV成熟物和50％类似物6 30GV成熟物的混合物。

[0485] 用不同浓度的样品1和2处理TF-1细胞，并使用MTT试剂测量增殖。将反应产物用异丙醇溶解，并将板在570和690nm下读数。在校正了背景的情况下，以在570nm与690nm(ΔOD)之间的光密度差来测量增殖强度。TF-1细胞对样品1和2的增殖反应示于图10。

[0486] 对于每个增殖曲线，确定给出半数最大反应的EPO多肽的浓度(EC50)。样品1(4.78ng/mL)和样品2(4.54ng/mL)的EC50相似，表明样品2中50％类似物6-30GV成熟物的存在可能不会影响EC50。然而，与样品1(ΔOD＝0.44)相比，类似物6-30GV成熟物显现降低了样品2(ΔOD＝0.29)的跨度或增殖信号。两个样品之间增殖活性的降低表明G18减弱了第二位点结合活性。

[0487] 实施例17

[0488] EPO第二位点突变体

[0489] 在第二结合位点有缺陷(或“位点2缺陷”)的EPO可以用于拮抗内源性EPO活性。例如，在第二位点结合有缺陷的EPO可以竞争EPO受体结合并阻断信号传导，从而防止新的红细胞产生。因此，具有一种或多种第二位点突变的EPO可以是治疗疾病的药剂，诸如由于过量的EPO产生而导致的某些形式的红细胞增多症(红细胞计数升高)，诸如由分泌过量EPO的肿瘤(例如，肾肿瘤)或EPO过度产生的遗传性障碍引起的病症。

[0490] 在所述内源性EPO受体过敏或自我激活的情况下，给予在第二结合位点有缺陷的EPO可以阻断所述突变受体。在高剂量下，具有位点2缺陷的EPO可以在需要时杀死靶细胞，从而形成过量1:1比率的EPO:受体复合物和/或降低红细胞形成。

[0491] 人EPO、猫EPO或犬EPO的一个或多个第二位点突变选自对应于野生型猫EPO多肽的位置L(5)、D(8)、R(10)、V(11)、R(14)、Y(15)、Q(78)、D(96)、K(97)、V(99)、S(100)、R(103)、S(104)、T/S(107)、L(108)、或R(110)的位置处的氨基酸取代。例如，R(103)可以突变为Ala或其他氨基酸以破坏第二位点活性。

[0492] 实施例18

[0493] 类似物6-30EV成熟物的唾液酸表征

[0494] 分析类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)的酸性级分的唾液酸含量并将其与类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)的酸性级分进行比较，其每个多肽具有约20个唾液酸分子。类似物6-30EV成熟物和类似物6-30GV成熟物的IEF曲线相似，表明所述E类似物的唾液酸含量与所述G类似物相似。经鉴定，N-乙酰神经氨酸是存在于两种类似物中的唾液酸的主要形式。

[0495] 进行如下唾液酸分析：通过将30μL样品与4μL冰醋酸混合将唾液酸从类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)中释放出来。将所述混合物在80℃下孵育2小时。用荧光染料1,
2-二氨基-4,5-亚甲基氧苯(DMB)标记游离唾液酸。通过将20μL的DMB亚硫酸盐溶液与5μL的游离唾液酸样品混合来进行荧光标记。将所述混合物在50℃下孵育3小时。添加75μL蒸馏去离子水终止反应。使用Zorbax SB-C18色柱(5μ，4.6 x 150mm)或Extend C18柱(5μ，4.6 x
150mm)(Agilent Technologies)通过HPLC分析DMB标记的唾液酸，等度流动相包含7％的甲醇、9％的乙腈和84％的水。所有神经氨酸，例如Neu5Gc(NGNA)；Neu5Ac(NANA)；Neu5,7Ac2；
Neu5,Gc9Ac；Neu5,9Ac2；和Neu5,7(8),9Ac在30分钟内达到基线分离。

[0496] 实施例19

[0497] 猫EPO E18与猫EPOR的结合

[0498] 猫EPOR(fEPOR203(SEQ ID NO:27))的交替剪接的变体的预测的蛋白质序列是从NCBI数据库获得的，登录号为XP_019673378.1。第39位的氨基酸未知，在数据库中用“X”表示。进行了三维蛋白质结构建模，并将丙氨酸放置在EPOR203的(SEQ ID NO:21)的第39位处被确定以维持正确的N末端蛋白构象。

[0499] 鉴定了EPOR203的可溶性细胞外结构域(EPOR203_39A ECD；SEQ ID NO:26)，合成了编码信号序列、EPOR203_39A ECD、接头和人Fc(EPOR203_39A_ECD_Fc；SEQ ID NO:22)的核苷酸序列，克隆到哺乳动物表达载体中，并在HEK或CHO细胞中表达。通过蛋白质A亲和柱层析从细胞培养上清液中纯化EPOR203_39A_ECD_Fc，并在PBS中性pH下配制。图7D显示了猫EPOR203-ECD-Fc的SDS-PAGE分析的考马斯染色。也可以使用包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的EPOR203的细胞外结构域。

[0500] 实施例20

[0501] 类似物6-30EV成熟物与猫EPO受体的结合

[0502] 使用基于ELISA的测定一式两份评估类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)与猫EPOR203_39A_ECD_Fc(SEQ ID NO:26)的结合。将MaxiSorp 96孔板在冷藏温度(2℃-8℃)下用抗人EPO抗体(4μg/mL)包被过夜，并在室温下用PBS中的5％BSA封闭1小时。在1％BSA-PBST(0.05％Tween-20)缓冲液中，从浓度500ng/mL开始，以2倍系列稀释液制备类似物6-30EV成熟物。将类似物6-30EV成熟物(100μL)的稀释液转移至每个孔中，并在室温下孵育2小时。将猫EPOR203_39A_ECD_Fc(在1％BSA-PBST缓冲液中的浓度为200ng/mL)添加到每个孔中，并在室温下进行结合1小时。使用兔抗人Fc抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(0.2μg/mL)进行检测，并在室温下在孔中放置1小时。将3,3,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)作为HRP底物应用于孔中，并在孔中保留5至7分钟以产生信号。证明了在类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)与猫EPOR203_39A_ECD_Fc之间的结合。相对于类似物6-30EV成熟物浓度绘制了平均检测信号，并进行了曲线拟合分析(图11)。

[0503] 实施例21

[0504] 向普通猫给予类似物6-30EV成熟物

[0505] 对正常猫皮下给予单剂量的1μg/kg(n＝5)、3μg/kg(n＝5)或10μg/kg(n＝5)的类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)，单剂量的10μg/kg(n＝4)的类似物6-30GV成熟物(SEQ ID NO:14)，或PBS。测量网状细胞的绝对百分比作为EPO生物活性的指标。简而言之，EPO与红系细胞上的EPO受体结合，并且所述受体的二聚化激活了JAK2途径和红细胞生成的信号传导。红系细胞分化为网状细胞，然后是红细胞。因此，通过绝对网织红细胞百分比的增加来证明EPO生物活性和红细胞生成的增加。

[0506] 图12显示了在给药前1天和皮下给予安慰剂或类似物6-30EV成熟物或PBS后第5、7、10和14天猫的平均网织红细胞绝对百分比(n＝4)。图13显示了在给药前4天和在皮下给予类似物6-30GV后的第3、5、10、17、19、24、31和33天猫的平均网织红细胞绝对百分比。用类似物6-30EV成熟物治疗的组证明了红细胞生成的增加，但是用类似物6-30GV成熟物治疗的组则没有。

[0507] 实施例22

[0508] 贫血猫中类似物6-30EV成熟物的疗效研究

[0509] 进行了开放标签、历史对照(比较猫的治疗后和治疗前数据)和试点疗效研究，以评估类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)对患有国际肾病研究协会(IRIS)3期慢性肾脏疾病(CKD)和贫血的猫的红细胞(RBC)、网织红细胞和生活质量(QoL)的有效性。还通过整理任何不良事件(AE)和中和抗体的存在来评估安全性。两只完成研究的猫的初步数据显示贫血有所改善(即血细胞比容百分比(HCT％)增加)，表明特异于肾功能的对称二甲基精氨酸(SDMA)和血清肌酐肾脏生物标记物测试有所改善，并显示出体重的维持或增加。

[0510] 招募符合以下所有资格标准的患有IRIS 3期CKD和贫血的猫：

[0511] 纳入标准

[0512] 所述猫：

[0513] 1.可管理并与学习程序合作

[0514] 2.在两次连续评估之间患有快速进行性CKD，空腹血清肌酐增加25％

[0515] 3.在第0天至少年满1岁，并且是：任何性别；完整的或绝育的；未怀孕，未哺乳；任何品种，任何体重

[0516] 4.患有IRIS 3期CKD，定义为：

[0517] a)在第0天的6个月内(空腹或未空腹)筛查访视空腹血清肌酐为2.9-5.0mg/dL，并且先前血清肌酐病史为2.9-5.0mg/dL；以及

[0518] b)尿比重(USG)＜1.035

[0519] 5.患有非再生性贫血和15％-30％的HCT

[0520] 6.正在接受CKD的护理标准治疗

[0521] 排除标准

[0522] 所述猫：

[0523] 1.主要居住在户外(每天＞60％的时间都花在户外)

[0524] 2.在两次连续评估之间患有快速进行性CKD，空腹血清肌酐增加25％

[0525] 3.曾经用促红细胞生成素刺激剂治疗过

[0526] 4.在第0天的6周内已给予全血或浓缩红细胞；

[0527] 5.患有尿路感染(UTI)，但以下情况除外：可以招募在适当的抗生素疗法(根据培养物/敏感性)治疗3周后的患有UTI的猫并重复阴性培养

[0528] 6.患有以下任何疾病/病症：

[0529] ·肿瘤形成

[0530] ·肝病

[0531] ·猫白血病病毒(FeLV)

[0532] ·猫免疫缺陷病毒(FIV)

[0533] ·糖尿病(DM)

[0534] ·甲亢

[0535] ·血细胞比容<15％

[0536] ·全身血压>160mmHg

[0537] 7.在第0天之前两周，需要对CKD的现有并发药物或疗法进行新处方或处方更改(剂量或剂量频率)。

[0538] 向两只猫皮下给予类似物6-30EV成熟物(SEQ ID NO:15)两次，起始剂量为3μg/kg，间隔约7-10天，随后进行六周。同时向猫给予右旋糖酐铁。

[0539] 在所有访视(计划的或非计划的)时都收集和/或评估了以下数据：病史的体格检查、生活质量(活力、舒适度和情绪健康)、食欲、活动(Vetrax活动传感器贴在脖子上)、血压以及观察到的事件的所有者日记。在初次筛查和第6周访视时，进行了血液学、生物化学、尿蛋白与肌酐比率的尿液分析以及SDMA评估。在基线和整个研究中需要时，对尿液培养物±敏感性进行了评估。在所有计划的和非计划的访视中都对内部的血细胞比容进行了评估。

[0540] 基线血细胞比容在猫WEX-201中从基线的22.8％改善到最高35.9％(在第4周)(表9)，在猫LUN-201中从基线26.6％改善到最大值35.5％(在第2周)(表10)。由于在类似物6-
30EV成熟物的第二剂量后，两只猫的贫血(HCT)均得到改善，因此在研究期间未给予另外的剂量；但是，WEX-201第6周和LUN-201第5周的HCT下降表明可以给予进一步治疗以维持所述HCT。猫WEX-201(表9)中的SDMA肾脏生物标记物测试从30改善到14μg/dL改善(即降低)，在猫LUN-201中从29改善到17μg/dL(表10)。在研究过程中，体重得以维持(LUN-201；表10)或有所改善(WEX-201；表9)。

[0541] 表9.WEX-201数据

[0542]

[0543] 表10.LUN-201数据

[0544]

[0545]

[0546] 在猫中观察到的改善的SDMA和血清肌酐肾生物标记物的趋势表明，用类似物6-30EV成熟物治疗后肾功能改善。患有晚期CKD和贫血的猫经历临床相关合并症会导致不期望的体重减轻的情况并不少见。用类似物6-30EV成熟物进行治疗可有效增加(WEX-201)体重或维持(LUN-201)体重。

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