一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器及其制备方法和应用
专利汇可以提供一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种基于电催化剂和 信号 分子共同限域的ZIF-8 复合材料 电化学免疫 传感器 的制备方法及应用。该电化学免疫传感器的制备方法包括甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与 信号分子 共同限域的ZIF-8复合材料的制备，以及电化学免疫传感器的制备两部分。制备得到的免疫传感器具有良好的催化性能，对甲胎蛋白（AFP）在0.01 pg mL−1至1 ng mL-1范围内显示出良好的线性相关性， 检测限 低至3 fg mL-1。应用该传感器可实现对人血清样品中AFP含量的检测。，下面是一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；
再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器。
2.权利要求1所述制备方法制备得到的电化学免疫传感器。
3.权利要求2所述的电化学免疫传感器在检测甲胎蛋白中的应用。
4.一种甲胎蛋白的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；
再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器；
（C）甲胎蛋白的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，步骤（B）中制备的电化学免疫传感器为工作电极；
（2）使用方波伏安法，在0.1 M pH 5.5的HAc-NaAc中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
5.根据权利要求4所述甲胎蛋白的检测方法，其特征在于：步骤（B）中，将抛光的GCE浸入2 mL 1 %的 HAuCl4溶液中，并在−0.2 V下保持电沉积30 s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE。
6.根据权利要求4所述甲胎蛋白的检测方法，其特征在于：步骤（B）中，将DpAu/GCE与一抗Ab1 在4 ℃下孵育16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极。
7.根据权利要求6所述甲胎蛋白的检测方法，其特征在于：步骤（B）中，将10 μL 0.25%的BSA滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE。
8.根据权利要求7所述甲胎蛋白的检测方法，其特征在于：步骤（B）中，将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 0.01 pg mL-1 50 ng mL-1甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟。
~
9.根据权利要求8所述甲胎蛋白的检测方法，其特征在于：步骤（B）中，将孵育好的电极与二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料在37 ℃下静置反应30 min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器及其
制备方法和应用
技术领域
背景技术
6834.）。这些成功的例子表明了ZIF的“限制作用”对提高催化效率和酶稳定性在生物催化领域的巨大前景。
发明内容
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备
首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；
再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器。
首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；
再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器；
（C）甲胎蛋白的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，步骤（B）中制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(2)使用方波伏安法，在0.1 M pH 5.5的HAc-NaAc中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
(2) 本发明将AuNPs负载复合材料中，提高了传感器的导电性；
(3) 本发明将电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料作为信号放大标签构建−1 -1
免疫传感器，对AFP在0.01 pg mL 至1 ng mL 范围内显示出良好的线性相关性，检测限低至3 fg mL-1；
(4) 用加标回收实验评估了该传感器在血清中测定AFP的实际应用能力，表现出良好的选择性和重现性。
附图说明
图3为通过使用不同的探针在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中0 ng mL-1 AFP（曲线a）和50 ng mL-1 AFP（曲线b）孵育制备的免疫传感器的SWV响应：（A）Au-Thi/Au/Ab2, (B) Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2 and (C) Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2；
图4为（A）免疫传感器分别孵育的不同浓度的AFP后的SWV响应：0 pg mL−1, 0.01 pg mL−1, 0.1 pg mL−1, 1 pg mL−1, 0.01 ng mL−1, 0.1 ng mL−1, 1 ng mL−1, 10 ng mL−1 and
50 ng mL−1, （B）免疫传感器检测AFP的标准曲线；
图5为（A）传感器的特异性；（B）10次间歇性SWV测量稳定性。
具体实施方式
(2) 将抛光的GCE浸入2 mL 1 %HAuCl4溶液（wt）中，并在−0.2 V下保持电沉积30 s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
(3) 将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 ℃下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
(4) 将10 μL 0.25%的BSA滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
(5) 在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
(6) 将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 0.01 pg mL-1 50 ng mL-1甲胎蛋白~
（AFP）抗原孵育30分钟；
(7) 将步骤6孵育好的电极与15 μL 二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8材料在37 °C下放置30 min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
(2) 二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的合成。依次在电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料上修饰PEI和纳米金，然后通过强NH2-Au亲和力制备二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，最后，用BSA封闭Ab2耦合物非特异性吸附位点。
(2) 使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
2H2O（2.2 g）加入上述溶液中并加热90 ℃保持20 min。冷却至室温后，通过磁性分离得到Fe3O4NPs，并用乙醇和蒸馏水洗涤，并在60 ℃下干燥。
(2) 二抗（Ab2）耦合信号分子复合材料（Au-Thi/Au/Ab2）的合成：
将10 mg上述Au-Thi分散在3 mL纳米金溶液中，缓慢搅拌反应4 h，通过强Au-S亲和力得到Au-Thi/Au。之后，将合成的Au-Thi/Au分散在含有100 μL Ab2的1 mL PBS中，在4 ℃下反应8 h。通过磁性分离收集制备的Ab2耦合物（Au-Thi/Au/Ab2），然后再分散在1 mL PBS中。
最后，用BSA封闭Ab2耦合物（Au-Thi/Au/Ab2）的非特异性吸附位点。
(2) 二抗（Ab2）耦合电催化剂和信号分子复合材料（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2）的合成：
将10 mg上述Thi-Au-Fe3O4分散在1 mL含有40 μL PEI（1%）的蒸馏水中，并在搅拌条件下充分混合4 h，形成PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4。通过离心去除没有反应的PEI后，将PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4重新分散在1 mL PBS中。然后，加入3 mL纳米金溶液，缓慢搅拌反应4 h，通过强氨基-金亲和力得到Thi-Au-Fe3O4/Au。之后，将合成的Thi-Au-Fe3O4/Au分散在含有100 μL Ab2的1 mL PBS中，在4 ℃下反应8 h。通过磁性分离收集制备的Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2），然后再分散在1 mL PBS中。最后，用BSA封闭Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2）的非特异性吸附位点。
(2)将抛光的GCE浸入2 mL HAuCl4溶液（1 wt%）中，并在−0.2 V下保持电沉积30 s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
(3)将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 °C下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
(4)将10 μL的BSA（0.25%）滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
(5)在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
(6)将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 50 ng mL-1）的甲胎蛋白（AFP）抗原孵育30分钟；
(7)将步骤6孵育好的电极与分别与15 μL Au-Thi-Au/Ab2、Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2和Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2在37 ℃下放置30 min，完成夹心型免疫反应；
(8)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(9)使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -
0.4 V 至0.1 V。
（2）将抛光的GCE浸入2 mL HAuCl4溶液（1 wt%）中，并在−0.2 V下保持电沉积30 s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
（3）将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 ℃下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
（4）将10 μL的BSA（0.25%）滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
（5）在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
（6）将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL各种浓度（0.01 pg mL-1, 0.1 pg mL-1, 1 pg mL-1, 0.01 ng mL-1, 0.1 ng mL-1, 1 ng mL-1, 10 ng mL-1 和 50 ng mL-1）的甲胎蛋白（AFP）抗原孵育30分钟；
（7）将步骤6孵育好的电极与15 μL Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2在37 ℃下放置30 min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
(2)使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -
0.4 V 至0.1 V，绘制工作曲线。图4A显示，随着AFP浓度从0.01 pg mL-1增至50 ng mL-1，SWV的信号强度逐渐增加。SWV强度和AFP浓度的对数之间表现出理想的线性关系（图4B），回归方程I = 1.972 lgc/ng mL-1 + 20.71；
(3)将待测样品溶液代替AFP的标准溶液进行检测；
-1 -1
(4)AFP检测的线性范围为0.01 ～1 ng mL ，检测限为3 fg mL 。
-1 -1
如图5A所示，浓度为10倍（500 ng mL ）的干扰物的电流响应与AFP（50 ng mL ）相比可以忽略不计，表明免疫传感器的高选择性。在与50 ng mL-1 AFP孵育后，使用同一电极进行10次间歇SWV扫描后，免疫传感器的SWV响应未显示明显的起伏(RSD = 0.99%)（图5B），结果表明该免疫传感器具有较好的稳定性。
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