技术领域
[0001] 本
发明属于生物电化学领域,具体涉及一种基于辅酶/
电子载体与酶结合物的酶电极、
生物传感器及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 自然界中,辅酶作为第二底物被很多酶利用。据不完全统计,有很多酶为辅酶依赖性酶,需要辅酶在反应过程中作为氢或者电子的传递体。以常见的辅酶I和辅酶II为例,NAD+或NADP+被还原成其还原态NADH或NADPH。对反应过程中产生的NADH或者NADPH的测定是构建此生物传感器的
基础。然而在目前的生物传感器中存在很多问题。首先,NAD(P)H在电极表面的直接电化学
氧化一般的过程为
[0003] NAD(P)H→NAD(P)H+·+e- (1)
[0004] NAD(P)H+·→NAD(P)·+H+ (2)
[0005] NAD(P)·→NAD(P)++e- (3)
[0006] 其中,第一步反应是整个反应中的控速步骤。实验证明,电子在NAD(P)H与裸电极之间的传递需要很高的过电势(一般为1.0V以上),而过高的电势常常会引起电极污染,酶失活,辅酶变成二聚体等等。常见的解决的方法就是:引入电子载体。电子载体是参与
氧化还原反应并且能够
加速总反应的化学物质。理想的电子载体应该具有较低的氧化还原电势,较高的化学
稳定性以及较快的电子传递速率。电子载体参与的NAD(P)H的氧化原理是:
[0007] NAD(P)H+Mox→NAD++Mred (4)
[0008] Mred→Mox+e- (5)
[0009] 其次,可利用NADH
氧化酶也能实现辅酶的电化学氧化。黄递酶是最常见的一种NADH氧化酶,能够在
萘醌类等电子载体存在下的条件先实现NADH的氧化。相比于直接引入电子载体,黄递酶的加入可以明显地提高电极表面催化的反应速度。2003年,Antiochia等以甲
氨基
苯酚为电子载体研究了黄递酶催化辅酶的氧化反应的反应动
力学,发现黄递酶在电子载体存在下,电催化氧化NADH的速度明显增大。因此黄递酶和多种脱氢酶能够构建生物传感器。但是在此类传感器中,一般需要外加辅酶如NAD+或者NADP+,辅酶的价格昂贵,这种单次使用导致分析成本增加,并且稳定性差,不利于实际应用。此外很多文献报道,也有将辅酶、电子载体等与酶一起通过交联、包埋等方法共固定在电极上,然而此类方法因为共固定方法较复杂、难以控制、并且限制了上述物质的有效传递而造成反应速度低、测量不灵敏、响应低。
发明内容
[0010] 针对现有生物传感器所存在的
缺陷,本发明提供一种基于辅酶依赖性酶与辅酶/电子载体交联结合的酶电极、生物传感器及其制备方法和用途。本发明的酶电极以及生物传感器具有较高
检测限和灵敏度、使用方便、降低成本等优点。
[0011] 为解决上述问题,本发明提供如下技术方案:
[0012] 根据本发明的一个方面,本发明提供一种酶电极,包括基础电极,所述基础电极表面固定有第一交联结合物、第二交联结合物的至少一种,所述第一交联结合物为辅酶与辅酶依赖性酶形成的交联结合物,所述第二交联结合物为电子载体与酶形成的交联结合物。
[0013] 根据本发明的实施方案,所述至少一种应当理解为任一种或两种。当存在时,所述固定为第一交联结合物、第二交联结合物可以分别固定或者共固定。
[0014] 根据本发明的实施方案,所述辅酶可以包含活性官能团。
[0015] 根据本发明的实施方案,所述电子载体可以包含活性官能团。
[0016] 根据本发明的实施方案,所述辅酶可以选自辅酶I、辅酶II、核黄素、硫胺素、维生素B6、维生素B12、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽、以及烟酰胺单核苷酸、1-苯甲基3-氨基甲酰-吡啶、1-甲基烟酰胺等中的至少一种。
[0017] 根据本发明的实施方案,所述辅酶依赖性酶可以选自
乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异
柠檬酸脱氢酶、丙
酮酸脱氢酶、莽
草酸脱氢酶、α-酮
戊二酸脱氢酶、甘油脱氢酶、3-
磷酸甘油
醛脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、胆
碱脱氢酶、肉碱3-脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胍乙酸转甲基酶、组蛋白转甲基酶、胆碱乙酰化酶、磷酸转乙酰化酶、硫辛酸乙酰转移酶、乙酰CoA羧化酶、
丙酮酸羧化酶、苯丙氨酸羧化酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、转酮醇酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶乙二醛酶、谷氨酸脱氢酶、
甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、
葡萄糖脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸
葡萄糖酸脱氢酶、黄递酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、核糖脱氢酶、半乳糖脱氢酶、阿拉伯糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘露醇脱氢酶、鼠李糖脱氢酶、糖醛酸脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、肌醇脱氢酶中的至少一种。
[0018] 所述与电子载体结合的酶也可选自上述辅酶依赖性酶中的一种或多种,还可选自本领域其他已知的在反应过程中需要与氢或者电子传递体共同作用的酶。
[0019] 根据本发明的实施方案,所述电子载体可以为本领域已知的除本发明所述辅酶外的其他具有电子传递作用的载体,例如选自
硫堇类、黄素类、萘醌类、中性红、甲基紫精、苄基紫精、亚甲基蓝、甲基橙、甲基红、甲基绿、绿脓菌素、1-甲酰胺吩嗪等吩嗪类、和蒽醌-2,6-二磺酸等
腐殖质类似物等中的至少一种。
[0020] 根据本发明的实施方案,所述活性官能团彼此相同或不同,例如可以独立地选自羧基、
马来酰亚胺基、氨基、环氧基、巯基、苯基或醛基官能团的至少一种。
[0021] 根据本发明的实施方案,基础电极可为金电极,玻
碳电极,
磁性电极,丝网印刷电极,导电玻璃,碳糊电极,
石墨电极,碳毡,碳布中的至少一种。
[0022] 根据本发明的第二方面,本发明提供所述酶电极的制备方法,包括将所述第一交联结合物和第二交联结合物中的至少一种固定在基础电极表面,得到所述酶电极。
[0023] 进一步地,所述制备方法可以包括将辅酶与辅酶依赖性酶交联结合,得到第一交联结合物;和/或将电子载体与酶交联结合,得到第二交联结合物。
[0024] 根据本发明的实施方案,具体地,所述制备方法包括如下步骤:
[0025] (1)将辅酶用活性官能团修饰,得到辅酶复合物,然后将辅酶复合物和辅酶依赖性酶进行混合,交联结合,得到辅酶与辅酶依赖性酶的第一交联结合物;
[0026] (2)将电子载体用活性官能团修饰,然后与酶混合,交联结合,得到酶与电子载体的第二交联结合物;
[0027] (3)将所述第一交联结合物或第二交联结合物中至少一种固定到基础电极表面形成酶电极。
[0028] 根据本发明的实施方案,所述辅酶或电子载体可通过本领域已知的反应,在辅酶或电子载体的一定部位进行修饰,引入适当的官能团或间隔臂,生成辅酶或电子载体的修饰物。优选地,所述辅酶或电子载体上修饰的活性官能团是羧基、马来酰亚胺、氨基、环氧基、巯基、苯环或醛基官能团的至少一种。
[0029] 根据本发明的实施方案,所述活性官能团可以通过酰胺基团,如马来酰亚胺基团与巯基偶联,Huisgen环加成,生物素或链酶亲和素等方式中的至少一种,使得辅酶或电子载体与辅酶依赖性酶交联结合。
[0030] 根据本发明的实施方案,所述第一交联结合物或第二交联结合物与基础电极的固定可以通过本领域已知的任何适用于固定酶与电极的方法实现,所述方法包括但不限于物理
吸附法、离子吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法中的至少一种。
[0031] 根据本发明的第三方面,本发明还提供一种生物传感器,其以第一方面所述酶电极作为
工作电极。
[0032] 根据本发明的实施方案,所述生物传感器还包括参比电极和
对电极。根据本发明的实施方案,所述参比电极可以选自饱和甘汞电极、氢电极、
银|氯化银电极或汞|氧化汞电极。
[0033] 根据本发明的实施方案,所述对电极可以选自铂丝电极或碳电极。
[0034] 根据本发明的第四方面,本发明还提供如第三方面所述生物传感器在检测生物样本或底物中的应用。
[0035] 根据本发明的生物传感器,其中首先将酶与辅酶或电子载体分别进行交联结合。共固定到电极上时,当辅酶依赖性酶催化待测物时,辅酶由其氧化态变成还原态,然后经过电子载体,还原态辅酶转成其氧化态,与此同时,电子载体由氧化态变成还原态,根据电子载体的氧化电位设置
电压,得到对应的氧化
电流从而实现对底物的检测。其中一种交联结合物分别固定到电极上时,则依靠辅酶氧化还原状态变化或者电子载体氧化还原状态变化产生相应的电流变化,从而实现对底物的检测。具体地,可以用循环伏安和/或计时电流的方式测定样本或底物浓度。
[0036] 与
现有技术相比,本发明有如下有益效果:
[0037] (1)本发明将辅酶依靠性酶与辅酶连接,电子载体与酶连接,制成两个酶结合物,拉近了辅酶与酶之间以及电子载体与酶之间的距离,提高辅酶与酶以及电子载体与酶的催化效率,减小传质内阻,制成生物传感器后,可有效的提高电流响应,降低检测限,提高检测灵敏度。
[0038] (2)在实际操作中,可循环使用辅酶以及电子载体,勿需继续外加,降低成本。此传感器属于无
试剂化传感器,固定后的酶结合物不易流失,可反复使用。
附图说明
[0039] 图1为生物传感器中工作电极-酶电极的制备原理及过程。
[0040] 图2为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与辅酶NAD成为结合物后的紫外可见吸收
光谱表征。在实验中,用甲酸脱氢酶将NAD转
化成NADH。曲线1为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,曲线2为聚乙二醇PEG和NAD复合物,曲线3为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和NAD结合物。
[0041] 图3为黄递酶与电子载体苄基紫精成为结合物后的紫外可见吸收光谱表征。在实验中,用连二
硫酸钠将苄基紫精氧化态转化成还原态。曲线1为黄递酶,曲线2为苄基紫精,曲线3为黄递酶和苄基紫精结合物。
[0042] 图4为黄递酶与苄基紫精结合物催化NADH产生电流图。其中曲线1为游离的黄递酶与苄基紫精,产生的电流
密度达26μA/cm2,曲线2为黄递酶与苄基紫精结合物,产生的电流密度达38μA/cm2。
[0043] 图5为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与NAD结合物催化葡萄糖-6-磷酸产生电流图。其中曲线1为游离酶产生的电流密度,曲线2为结合物产生的电流密度。
具体实施方式
[0044] 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下通过具体
实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行
修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0045] 实施例1:基于辅酶与酶交联结合物的生物传感器
[0046] 将10mM NAD+与10mM羧基苯
硼酸在室温下震荡反应2h,然后用50mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺
盐酸盐和50mM N-羟基琥珀酰亚胺在室温下活化1h,调节pH到7.4,加入10mM修饰氨基和羧基的聚乙二醇,在37℃反应2h,得到修饰羧基的辅酶NAD+。
[0047] 继续加入50mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50mM N-羟基琥珀酰亚胺在室温下活化1h,调节pH到7.4,加入100μM葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,在37℃反应2h,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与辅酶结合物。
[0048] 将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与辅酶结合物在4℃
透析过夜,
超滤浓缩。
[0049] 以0.5mm×0.5mm多孔碳毡电极为基底电极,200uL 50M葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与辅酶结合物滴涂到电极上,自然晾干。通过
物理吸附作用制成酶电极,作为生物传感器中的工作电极。
[0050] 根据图5可以看出,辅酶与辅酶依赖性酶交联结合物产生的电流密度是同种游离酶的2到3倍,证明结合物可大幅提高生物传感器的检测限和灵敏度。
[0051] 实施例2:基于电子载体与酶结合物的生物传感器
[0052] 将10mM 4,4'-联吡啶与21mmol 4-(溴甲基)苯乙酸加入到30mL二甲基甲酰胺中,在120℃回流6小时后,得到淡黄色沉淀,即羧基修饰电子载体-苄基紫精。将沉淀物在
真空中干燥12小时,并将粉末保存在4℃的
冰箱中。
[0053] 将羧基修饰的苄基紫精溶解在0.2M磷酸缓冲液(pH 5.6)中制成20mM苄基紫精溶液,加入1M 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1M N-羟基琥珀酰亚胺在室温下活化1h,调节pH到7.4,加入200μM黄递酶,在37℃反应2h,得到黄递酶与苄基紫精的结合物。
[0054] 将黄递酶与苄基紫精在4℃透析过夜,超滤浓缩。
[0055] 继续向200μM黄递酶与苄基紫精结合物中加入1M 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1M N-羟基琥珀酰亚胺在室温下活化1h,调节pH到7.4,加入1mg氨基修饰的磁性纳米颗粒Fe3O4-NH2,37℃孵育2h,离心收集沉淀,记为Fe3O4酶结合物。
[0056] 将Fe3O4酶结合物溶解在0.1M PBS(pH 7.4)中,溶液浓度为0.1mg/mL。
[0057] 以磁性玻碳电极为基底电极,10uL 0.1mg/mL Fe3O4酶结合物滴涂到磁性玻碳电极上,自然晾干。通过磁性吸附作用制成酶电极,作为生物传感器中的工作电极。
[0058] 黄递酶与苄基紫精结合物催化NADH产生电流图如图4所示。从图4可以看出,曲线1代表游离的黄递酶与苄基紫精,产生的电流密度仅为26μA/cm2左右,而曲线2为黄递酶与苄基紫精结合物,产生的电流密度达产生38μA/cm2,可见,黄递酶与电子载体苄基紫精化学偶联使得其电流值大大增加,可大幅提高生物传感器的检测限和灵敏度。
[0059] 实施例3:基于辅酶与酶结合物的生物传感器
[0060] 用50mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50mM N-羟基琥珀酰亚胺在室温下活化10mM马来亚酰胺和羧基修饰的聚乙二醇在1h,然后10mM NAD+在37℃孵育2h+(pH 7.4),得到修饰马来亚酰胺的辅酶NAD。
[0061] 将100μM表面突变了半胱氨酸的乳酸脱氢酶与1mM马来亚酰胺的辅酶NAD+在4℃孵育12h,超滤去除未结合的NAD+,制成乳酸脱氢酶与辅酶的结合物。
[0062] 用2.0mol/L的乙
酸溶液溶解壳聚糖,配制浓度为0.5%(w/v)的壳聚糖溶液,然后用NaOH溶液调至pH=5.0,放于冰箱中备用。预处理金电极,继续在电极表面依次滴加1μL的戊二醛(2.5%)和5μL的乳酸脱氢酶与辅酶结合物。经过戊二醛将乳酸脱氢酶与辅酶的复合物固定在金电极上制成酶电极,作为生物传感器中的工作电极。