利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法
阅读：3发布：2021-02-27
专利汇可以提供利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法，属于 微 生物 技术领域。该方法通过联合抗药性突变株的筛选，获得对低浓度 链霉素 、高浓度链霉素和巴龙霉素都产生抗药性的 淀粉 酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）D的突变株，获得的突变株产丰加霉素的能 力 比淀粉酶产色链霉菌D显著提高。，下面是利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法专利的具体信息内容。
1.利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法，其特征在于通过联合抗药性突变株的筛选，获得对低浓度链霉素100μg/mL、高浓度链霉素2000μg/mL和巴龙霉素
50μg/mL都产生抗药性的淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）D的突变株，获得的突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高， 所述的淀粉酶产色链霉菌D已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。
2.权利要求1所述的突变株合成丰加霉素的方法，其特征在于发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g， NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水，每
300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D和抗药性突变株孢子接种，28℃±1℃，发酵培养
6天，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于丰加霉素含量的测定。
利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法
技术领域
背景技术
[0002] 目前许多自主开发的新型农用抗生素只是停留在实验室阶段，其中关键的原因就是生产菌的产素水平未达到工业化要求。所以，当前摆在研究工作者面前一个主要的问题就是提高现有和正在开发的农用抗生素生产菌的产素水平，加快农用抗生素的产业化进程。常规的微生物诱变育种费时费力、随机性高，通过基因工程手段已可实现单基因编码的酶类的定向进化并进行超量表达，但对需要成簇基因编码的抗生素等天然产物的产量提高则困难重重。研究表明联合抗药性突变筛选方法是一种新颖的优化抗生素产生菌的新方法，联合抗药性突变可加强微生物合成抗生素的水平，并且这一优化菌株的新方法能够应用于多种抗生素生产菌株的优化并且能够提高野生型菌株的抗生素产量。
[0003] 丰加霉素能抑制多种病原真菌的生长，具有广阔的生防应用前景。淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）D能合成丰加霉素，利用联合抗药性突变筛选方法改良淀粉酶产色链霉菌使其提高丰加霉素合成能力的研究未见有报道。
发明内容
[0004] 本发明通过联合抗药性突变株的筛选，获得对低浓度链霉素、高浓度链霉素和巴龙霉素都产生抗药性的淀粉酶产色链霉菌D的突变株，获得的突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高。该发明为提高丰加霉素的产素水平提供了一种可靠的方法。
[0005] 本发明的目的是针对野生型菌株淀粉酶产色链霉菌D产丰加霉素水平低的不足，提供一种提高丰加霉素产素水平的方法；本发明的另一目的是提供了一株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌D突变株。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案来实现：利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法按以下步骤进行：
（1）低浓度链霉素抗性突变株的获得（第一轮抗药性突变株筛选）
淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes），定名为淀粉酶产色链霉菌D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。前期研究表明用GYM固体培养基培养，链霉素抑制淀粉酶产色链霉菌D的MIC值为20 μg/mL。
（1）低浓度链霉素抗性突变株的获得（第一轮抗药性突变株筛选）
淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes），定名为淀粉酶产色链霉菌D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。前期研究表明用GYM固体培养基培养，链霉素抑制淀粉酶产色链霉菌D的MIC值为20 μg/mL。
[0007] 制备链霉素终浓度为100 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为100 μg/mL 。GYM固体培养基组分与浓度为葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L，N-Z-Amine A 1 g/L，NaCl 2 g/L，OB溶液 600 μL，定容后用2 mol/L NaCl 溶液调节pH 至7.3，琼脂20 g/L；其中OB溶液配置方法：称取 MgSO4·7H2O 25g，CuSO4·5H2O 2.5g，FeSO4·7H2O 3.75g，MnSO4·5H2O 1.8g，CaCl2·2H2O17.5g，ZnSO4·7H2O 4.5g，加500 mL水，用前摇匀；用移液枪吸取1000 μL淀粉酶产色链
6
霉菌D孢子悬液（1×10个/mL）于含有100 μg/mL链霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有100 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。
6
霉菌D孢子悬液（1×10个/mL）于含有100 μg/mL链霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有100 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。
[0008] （2）高浓度链霉素抗性突变株的获得（第二轮抗药性突变株筛选）制备链霉素终浓度为2000 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为2000 μg/mL 。GYM固体培养基组分与浓度同步骤（1）；用移液枪吸取1000 μL低浓度12
链霉素抗性突变株（也即第一轮抗药性筛选获得的突变株）孢子悬液（1×10 个/mL）于含有2000 μg/mL链霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养
10~15天，分别挑取单菌落至新的含有2000 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。
链霉素抗性突变株（也即第一轮抗药性筛选获得的突变株）孢子悬液（1×10 个/mL）于含有2000 μg/mL链霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养
10~15天，分别挑取单菌落至新的含有2000 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。
[0009] （3）巴龙霉素抗性突变株的获得（第三轮抗药性突变株筛选）制备巴龙霉素终浓度为50 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中巴龙霉素浓度为50 μg/mL 。GYM固体培养基组分与浓度同步骤（1）；用移液枪吸取1000 μL第二轮12
筛选获得的突变株孢子悬液（1×10 个/mL）于含有50 μg/mL巴龙霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有50 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为巴龙霉素抗性突变株。
筛选获得的突变株孢子悬液（1×10 个/mL）于含有50 μg/mL巴龙霉素的 GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有50 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为巴龙霉素抗性突变株。
[0010] （4）突变株发酵培养发酵培养：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g， NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 ℃灭菌
20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D和抗药性突变株孢子接种， 28 ℃±1 ℃，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定。
20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D和抗药性突变株孢子接种， 28 ℃±1 ℃，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定。
[0011] （5）丰加霉素的检测方法：采用SHIMADZU C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为0-15 min，5%-37% A；15-30 min，37%-100% A；30-40 min，
100%-5% A；流速1.0 mL/min，检测波长279 nm，柱温30 ℃。
100%-5% A；流速1.0 mL/min，检测波长279 nm，柱温30 ℃。
[0012] 本发明的有益效果：一是本发明通过联合抗药性突变株的筛选，获得的突变株合成丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高，这为提高丰加霉素的产量提供了一种可靠的方法；
二是本发明提供了一株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌D突变株，为今后丰加霉素产业化生产奠定基础。
二是本发明提供了一株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌D突变株，为今后丰加霉素产业化生产奠定基础。
具体实施方式
[0013] 下面结合实施例对本发明利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法做进一步描述。
[0014] 实施例1：低浓度链霉素抗性突变株的获得（第一轮抗药性突变株筛选）制备链霉素终浓度为100 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为6
100 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL淀粉酶产色链霉菌D孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有100 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。共获得低浓度链霉素抗性突变株8株，编号分别为f11， f12， f13，f14， f15， f16， f17和f18，对这8株突变株按照技术方案中的步骤（4）进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株f11产丰加霉素能力较高，为483.58 mg/L，发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌D（151.12 mg/L）的3.2倍；
实施例2：高浓度链霉素抗性突变株的获得（第二轮抗药性突变株筛选）制备链霉素终浓度为2000 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度
12
为2000 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL低浓度链霉素抗性突变株f11孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有2000 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。共获得高浓度链霉素抗性突变株3株，编号分别为s223, s225, s228，对这3株突变株按照技术方案中的步骤（4）进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株s228产丰加霉素能力较高，为925.63 mg/L，发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌D（153.01 mg/L）的6.05倍；
实施例3：巴龙霉素抗性突变株的获得（第三轮抗药性突变株筛选）
制备巴龙霉素终浓度为50 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中巴龙霉素浓
12
度为50 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL高浓度链霉素抗性突变株s228孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有50 μg/mL巴龙霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为巴龙霉素抗性突变株。共获得巴龙霉素抗性突变株2株，编号分别为t3141和t3145；
实施例4：突变株液体发酵
发酵培养：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g， NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 ℃灭菌20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D、突变株t3141和突变株t3145孢子接种， 28 ℃±1 ℃，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心
10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定；
实施例5：丰加霉素的检测
方法：采用SHIMADZU C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为0-15 min，5%-37% A；15-30 min，37%-100% A；30-40 min，
100%-5% A；流速1.0 mL/min，检测波长279 nm，柱温30 ℃。
100 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL淀粉酶产色链霉菌D孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有100 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。共获得低浓度链霉素抗性突变株8株，编号分别为f11， f12， f13，f14， f15， f16， f17和f18，对这8株突变株按照技术方案中的步骤（4）进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株f11产丰加霉素能力较高，为483.58 mg/L，发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌D（151.12 mg/L）的3.2倍；
实施例2：高浓度链霉素抗性突变株的获得（第二轮抗药性突变株筛选）制备链霉素终浓度为2000 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度
12
为2000 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL低浓度链霉素抗性突变株f11孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有2000 μg/mL链霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。共获得高浓度链霉素抗性突变株3株，编号分别为s223, s225, s228，对这3株突变株按照技术方案中的步骤（4）进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株s228产丰加霉素能力较高，为925.63 mg/L，发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌D（153.01 mg/L）的6.05倍；
实施例3：巴龙霉素抗性突变株的获得（第三轮抗药性突变株筛选）
制备巴龙霉素终浓度为50 μg/mL的 GYM固体平板，也即GYM固体平板中巴龙霉素浓
12
度为50 μg/mL 。用移液枪吸取1000 μL高浓度链霉素抗性突变株s228孢子悬液（1×10个/mL）于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 ℃培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有50 μg/mL巴龙霉素的GYM固体平板（一个单菌落划一个平板），置28 ℃培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为巴龙霉素抗性突变株。共获得巴龙霉素抗性突变株2株，编号分别为t3141和t3145；
实施例4：突变株液体发酵
发酵培养：发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g， NH4Cl 3 g， CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 ℃灭菌20 min，待冷却至50 ℃，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D、突变株t3141和突变株t3145孢子接种， 28 ℃±1 ℃，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心
10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定；
实施例5：丰加霉素的检测
方法：采用SHIMADZU C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为0-15 min，5%-37% A；15-30 min，37%-100% A；30-40 min，
100%-5% A；流速1.0 mL/min，检测波长279 nm，柱温30 ℃。
[0015] 结果表明：淀粉酶产色链霉菌突变株t3145和t3141发酵液中丰加霉素的含量分
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