特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
专利汇可以提供特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合 抗原 受体修饰T细胞的制备方法，其步骤如下：A、质粒构建、扩增及纯化；B、慢病毒 包装 ：1)培养包装细胞，2)准备DNA?EndoFectin慢病毒混合物，3) 转染 包装细胞，4) 收获 慢病毒颗粒；C、T 细胞转染 ：1)培养板预处理；2)病毒离心；3)T细胞转染。CAR?T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。在此 基础 上，本发明加入了新共刺激分子CD70。在CAR?T细胞中，CD70?CD27的相互作用可诱导CD8+T细胞发挥更强的 肿瘤 杀伤及融病毒作用。因此，引入CD70的CAR?T有着更加强大的抗肿瘤能 力 ，将延长生存期。，下面是特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
A、质粒构建：构建慢病毒包装质粒pEGFP-CD70CAR质粒；
质粒扩增及纯化：在经紫外线照射后的超净台内剪携有pEGFP-CD70CAR质粒的滤纸圈的1/3置于离心管中，加入无菌双蒸水浸泡30min，搅拌后离心取上清，置于-20℃保存备用；
将用于扩增质粒的感受态大肠杆菌DH5α加入到EP管中，加pEGFP-CD70CAR质粒1μL/管，混匀后冰上静置30min；低温42℃热休克1.5～2min，置于冰中5分钟，加Luria-Bertani培养基，摇床150rpm振摇45～60min，使细菌复苏并表达pEGFP-EFGRvIII和pEGFP-CD70CAR质粒氨苄青霉素AMP抗药性，将200μL已转化的感受态细胞转移到氨苄青霉素的固体培养基平板上，涂布均匀，干燥后，培养12-16小时；
挑取转化pEGFP-EFGRvIII和pEGFP-CD70CAR后Amp+平板上长出的单菌落放入到已加有
3mL Amp+LB的试管中，180rpm振摇12-16小时，依据质粒提取试剂盒质粒提取；
B、慢病毒包装
1)培养包装细胞
在进行转染前，提前两天将1.3～1.5×106的GeneCopoeia 293T细胞移入10厘米细胞板进行培养，板内加入完全培养基，融合率为70～80％时进行转染；
2)准备DNA-EndoFectin慢病毒混合物
往无菌EP管加入pEGFP-CD70CAR质粒和5.0ul LentiPac HIV混合试剂，以Opti-MEM I培养基稀释至200μl；在另一无菌EP管内，以Opti-MEM I稀释15ul EndoFectin转染试剂；边进行涡旋，边往DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂；
室温培养该溶液10～25分钟，使DNA-EndoFectin混合物产生；
3)转染包装细胞
将DNA-EndoFectin慢病毒复合物直接加细胞板，分散复合物；过夜培养6～8小时，以加入2～5％热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜培养基更换旧培养基，培养基中加入1/
500体积的TiterBoost试剂；
4)收获慢病毒颗粒
转染两天后收集培养基，以500g离心10分钟，可获得含慢病毒颗粒的培养基；离心后，以0.45μm的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基；
C、T细胞转染
1)培养板预处理
将20～100μg/ml的重组黏连蛋白Retro Nectin包被在未处理的24孔板上，4℃过夜；用
2％牛血清蛋白BSA封闭半小时；用缓冲液冲洗三遍；
2)病毒离心
将病毒上清，即由步骤B获得的含病毒培养基以125～250μl/cm2的浓度加到预处理的24孔板上，4～6h，去除上清用PBS冲洗一次；
3)T细胞转染
管中预先加5ml人淋巴细胞分离液，取抗凝血5ml，与生理盐水1:1混匀后，缓慢滴入，以
1500转/分离心20分钟，肉眼可见薄膜，吸取此处的单核细胞，放入含生理盐水10毫升的试管中，充分混匀后，以500g离心10分钟；弃液，沉淀经无菌PBS反复洗2次即得所需细胞；将用CD3刺激抗体OKT3及IL-2激活的T细胞以0.2～1×105个/ml的浓度加入，以2000g的离心力离心10min，孵育72h，即得特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞。
2.根据权利要求1所述的特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述固体培养基平板使用时需37℃温箱预热。
3.根据权利要求1所述的特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述完全培养基的组成为：90％DMEM+10％胎牛血清。
特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制
备方法
技术领域
背景技术
17例晚期转移性黑素瘤患者，2例患者的肿瘤完全消退，15例患者病情长期稳定。2010年Rosenberg博士首次应用CAR-T治疗理念对淋巴瘤进行治疗，结果表明，治疗后，患者不仅肿瘤消失，而且存在患者骨髓中的癌细胞前体也被选择性地清除了。次年，June等人又在《NEW ENGL J MED》和《SCI TRANSL MED》上发表了应用CAR-T成功治愈慢性淋巴细胞白血病的临床研究报告，因此，这一方法是目前被认为在肿瘤免疫治疗中的一个非常有潜力的治疗手段。CAR-T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。
发明内容
12-16小时。
具体实施方式
12-16小时。
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