一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法
专利汇可以提供一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了维持鱼类肠 细胞增殖 分化的原代培养方法，包括以下步骤：1)、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净肠道内容物；2)、将肠道剪切成2～3mm的组织小 块 ；3)、用 混合液 消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团；4)、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团；5)、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于 胶原蛋白 涂抹的培养板中进行培养；6)、接种的鱼肠细胞团在24～26℃条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。本发明根据鱼类肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离酶的种类、使用浓度和肠细胞团的纯化方法。采用商品胶原蛋白涂抹方便涂抹细胞培养器皿，摸索了最佳的鱼肠细胞接种和密闭培养条件。，下面是一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法专利的具体信息内容。
1.一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，洗净肠道内容物；
2)、将肠道剪切成2～3mm的组织小块；
3)、用混合液消化分离肠细胞，得到鱼肠细胞和细胞团；
4)、用离心方法分离纯化得到鱼肠细胞团；
5)、将分离纯化的鱼肠细胞团计数接种于胶原蛋白涂抹的培养板中进行培养；
6)、接种的鱼肠细胞团在24～26℃条件下原代培养，细胞贴壁生长，增殖分化。
2.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤3)肠细胞消化分离处理包括以下内容：
A、混合酶消化液中：胶原蛋白酶XI浓度为50IU/ml，中性蛋白酶I浓度为20ug/ml；
B、肠道组织小块与混合消化液的质量：体积比大约为1∶10；
C、组织小块消化液温度为25℃恒温摇床中，100转/分振荡消化70分钟。
3.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤4)肠细胞团的分离纯化包括以下内容：用S-DMEM液(含3.5％山梨醇的DNEM培养液)洗涤分离纯化得到的细胞团。
4.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤5)肠细胞团的适宜接种数量处理包括以下内容：
A、利用商品胶原蛋白涂抹细胞培养器皿；
B、将分离到的细胞团悬液稀释后在血细胞计数板上计数，以350个细胞团/平方厘米的浓度接于胶原蛋白包被的培养器皿。
5.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，所述步骤6)肠细胞团的培养条件处理包括以下内容：
A、培养温度25～26℃；
B、所用细胞生长培养液：含2.5％胎牛血清，10μg/ml胰岛素，40μg/ml转铁蛋白，
1.1mg/ml谷氨酰胺，3.7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素的DMEM培养液；
C、培养液中加入10mmol/l Hepes维持pH稳定，密闭培养细胞。
一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
40000IU的链霉素。
300 100 88 12
150 60 83 17
80 40 80 20
50 20 70 30
肠细胞AKP活性(U/MTTOD) 0.002 0.013 0.015 0.014 0.012 0.010 0.004 0.005[0054] 10、将接种好的培养板放在倒置显微镜的载物台上(温度为25～26℃)，整体观察细胞培养板每一孔细胞团的数量和分布情况，并作描述和照相记录，从中随机选择六个细胞团，用记号笔在培养板上作上标记，定位观察细胞团分散贴壁生长的过程。图2示接种时的鲤鱼肠细胞团。
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