发明背景

以往，显示抗原表位的噬菌体是经皮下施予(Nature Biotechnology 18(2000)，873-6)。该文章揭露了丝状噬菌体fd可在其 主要壳蛋白的N-端区显示出多个外来肽的拷贝，因此，这样的构造 可用于皮下免疫。Nucleic Acids Research 25(1997)，915-916也揭示了 噬菌体fd的杂交病毒粒子，其显示出两个不同的肽。有人提出这样 的构造在探索疫苗设计上具有许多潜在的优点。

在疫苗学中，最近的研究趋向是对治疗和预防以下疾病的黏膜疫 苗的研究。这些疾病包括在人和动物中的(i)癌症，(ii)对过敏原 的过敏症(包括对遗传性过敏症疾病的抑制)，和(iii)由致病微生 物(包括病毒、细菌、真菌和原生生物)引起的感染。

抗原刺激的主要部位包括结膜、胃肠道、呼吸道和尿道。因此， 排列在这些部位的黏膜上皮细胞就构成了内外环境之间的有效的障 碍，并起着有机体对感染的最主要的抵抗作用(Salminen et al.，1998， 2001)。由于病原体在波及全身之前，通常先与黏膜上皮细胞接触和/ 或集聚，因此采用黏膜传递疫苗相对于传统的注射疫苗，最明显的优 点是它们的引入路线更为逼真地模仿出了这些抗原通常进入宿主的 途径。其结果是，黏膜疫苗将引发由先天性和适应性的免疫系统产生 的强烈反应，从而可提供比用其他方法，如注射更完全的保护。传统 的注射疫苗的问题之一是其模仿了正在发生的全身感染，结果通常是 绕过了大部分的免疫系统(特别是先天性免疫系统)，而这些免疫系 统通常会在身体首次受到非己抗原刺激时被激发。

已有一些研究表明经黏膜施用疫苗比传统疫苗提供了对抗通过 黏膜组织进入体内的病原体的更好保护(Davis，2001)。

为了产生减毒活疫苗，对已知病原体的衍生物进行改造，使其在 它们的宿主中表现出减弱的毒力。这样的菌株常被用作减毒活疫苗的 活性成分。减毒活疫苗通常给予宿主极好的免疫性，且可引起可持续 终生的体液的和细胞的(cellular)免疫。这些疫苗通常在若干施予剂 量甚至单次剂量后即产生保护性。然而，减毒活疫苗的配方也具有很 大的危险性，且有各种各样的缺点是与其使用相关。其中，最为严重 的是减毒菌株可能在体内恢复其毒力，从而导致本来期望由该疫苗预 防的疾病的发生。并且由疫苗菌株产生的感染可传递到免疫受损的或 未接种的个体，其包括儿童和老人。此外，有时减毒的或去活的疫苗 还会产生有害反应，甚至是包括死亡在内的严重的有害反应，这部分 归因于疫苗制剂含有多种通常与给指定的微生物相关的定义不清楚 的成分。出于这些和其他的原因，减毒疫苗通常不适合用于儿童、老 人和免疫受损的个体，包括感染HIV的个体。除了上述这些人群外， 医生对健康成年人群的处方也越来越多地选用更安全的替代物(例 如，亚单位疫苗)；甚至在这些替代物可显示出某种程度的较低的效 率的情况下也是如此(Foss and Mur-taugh，2000)。FDA认识了这些危 险，从而对新疫苗产品的开发不断制定出更为严谨的指导方针。新的 FDA指导方针要求公司更为精确地定义出他们的疫苗产品的成分， 这就使得开发新的减毒活的和失去传染性的疫苗更为困难。这些趋势 促使生物技术和制药部门在很大程度上放弃新品种的减毒活疫苗的 研究，而转为开发可具有更好定义的组分和安全性能的新的疫苗制剂 (例如亚单位疫苗)。

编码抗原因子的基因与疫苗的活的或去活的微生物组分有关，这 与它们的施用方法无关。这些基因通过转导、转化和/或结合而水平 传播到宿主的常住微生物群中存在实际相当大的危险。这些基因包括 不单限于编码毒力因子和抗生素抗性因子的基因。这种转移可发生的 频率不仅取决于疫苗的组成，还依赖于施用的方法。由于健康个体中 的血液中几乎没有天然微生物群，因此即使通过静脉(IV)施用高水 平的活的微生物通常也只存在很小的水平传播的危险。结果，这种施 用方法代表了更为安全(尽管更具侵入性)的传递保护性抗原(尽管 与注射处感染相关的有害反应等仍值得关注)的路线。与此相反，当 活的疫苗被施予到含高水平的具有异质组分的天然常住微生物群的 环境中时(例如胃肠道、阴道、呼吸道等)，转移的危险可能很高。 结果，将黏膜(例如胃肠道内的、阴道内的、鼻内的等)暴露于减毒 活的、重组活的和去活的疫苗微生物就意味着毒力和抗生素抗性基因 发生转移的危险，这可导致新的病原体的出现。

就编码抗生素抗性和/或毒力因子的基因的水平转移而言，最令 人不安的是施用质粒编码的疫苗菌株，因为这些可移动的DNA要素 具有很长的甚至在不同属间产生混杂传递性的历史。质粒通常是经转 导、转化和/或结合而被传递。已开始有不断证据支持编码毒力因子 的DNA，包括抗生素抗性标记可从外源微生物转移到人和动物的天 然微生物群中的推测。Wilcks等(2004)表明了源自基因改性植物的 质粒可在大鼠的胃肠道中持续存在。重要的是，这些质粒被发现仍完 好无损，还可转化电穿孔法胜任的大肠杆菌(Escherichia coli)，这表 明了这些质粒可被肠内细菌吸收。类似的，Blake等(2003)中也揭 示了抗生素抗性基因，属于毒力因子，在大肠杆菌O157(E.coli O157)、沙门氏菌属(Salmonella species)(spp.)和与大肠杆菌相当 的菌株之间交换。另外，Mercer等(1999)还揭示了由口腔中的细菌 或食物释放出的DNA具有对口腔内天然的感受态细菌(competent oral bacteria)进行转换的能力。尽管这些研究没有在疫苗中进行，但 它们清楚地表明了这些类型的传递确实会发生，并指出必须研究出制 备疫苗的替代方法以进一步限制向宿主的天然微生物群中引入毒力 因子。

对在食物和农业中使用基因改造的有机物(GMOs)所存在的普 遍担忧是一旦被引入到系统中，则有恐与GMOs相关的重组基因材 料会散布到环境中，从而赋予内源性物种新的(有可能是有害的)特 性。尽管对大规模引入基因材料会导致出这些基因被导入天然物种中 的争论已经平息，但此时与GMOs相关的危险看似会被很大程度地 夸大。

因此，就需要发展既能够降低这些危险，还能够保持疫苗的有益 作用的安全的技术。

发明概要

本发明的目的之一是提供一组合物，该组合物含有嵌合噬菌体衍 生的颗粒(例如嵌合噬菌体(即噬菌体)颗粒、嵌合的噬菌体样颗粒 或嵌合噬菌体菌影颗粒)，这样，除了编码噬菌体的因子外，还展示 出一或多种附加因子(例如抗原、过敏原、毒力蛋白、受体、配体、 特别是异源的抗原)。特别加以考虑的是对人和/或动物接种有安全保 障的嵌合噬菌体颗粒的组合物。

一种使得颗粒安全的方法是将颗粒引入到安全的宿主细胞内。因 此，本发明的第一方面是关于生产嵌合噬菌体衍生的颗粒的方法(以 及生成含有所述颗粒的组合物的方法)，所述方法包括向安全的宿主 细胞(通过转染、感染和/或转化)引入一或多个(例如2，3，或4 个)遗传要素，这些遗传要素单独或组合对噬菌体衍生的颗粒进行编 码。安全的宿主细胞可选自以下细菌组成的组：

-已经由美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration，FDA)、兽用医药中心(Center for Veterinary Medicine) 评价其使用是公认安全(GRAS)的细菌，特别是出现在2005年9 月16日公布于http://www.cfsan.fda.gov/～dms/opa-micr.html上的题为 “Partial List Of Microorganisms And Microbial-Derived Ingredients That Are Used In Foods”中的细菌；以及

-根据欧洲食品和饲料培养物协会和国际乳制品联盟(European Food and Fed Cultures Association and International Dairy Federation) (EFFCA/IDF)(Mogensen等(2002))公开的名单中的细菌，这些细菌 是具有在食物中使用无副作用历史记录的微生物；和

-被丹麦兽用和食物管理局(Danish Veterinary and Food Administration)于2005年9月16日接受的作为食物用的食物培养物 的细菌。

应当理解的是，当只有一个遗传要素被引入到宿主细胞中时，所 述遗传要素应当能编码嵌合噬菌体衍生的所有的成分。当前优选的情 况是要素未被嵌合颗粒所包含，或通过如化学处理等从颗粒中移除 (或在颗粒中去活)。当两个或多个要素被引入到宿主细胞中时，目 前优选的情况是一个要素(例如噬菌体)编码野生型噬菌体，而另一 要素(例如质粒)编码野生型噬菌体蛋白和展示在噬菌体表面的多肽 的杂种。

根据本发明，在提供对人和/或动物吸收安全的嵌合噬菌体衍生 的颗粒(例如嵌合噬菌体颗粒、嵌合的噬菌体样颗粒或嵌合噬菌体菌 影颗粒)的组合物时存在的问题，可通过使用已知为安全的细菌和与 它们相关的噬菌体而得以解决。这些细菌和与它们相关的噬菌体具有 对产生嵌合颗粒而言通常被公认安全的(GRAS)可查到的记录，而 且所产生的嵌合颗粒不会编码所述附加表面展示因子的基因。

因此，本发明进一步涉及生成含有嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合 物的方法，当中的嵌合噬菌体衍生的颗粒含有至少两种不同的表面展 示蛋白，而所述方法包含以下步骤：(i)获得至少两种遗传要素，其 中至少一种所述遗传要素(原生遗传要素)包括相当部分的噬菌体基 因组，其中至少一种其他的所述遗传要素(反式互补遗传要素)编码 至少一种成分(附加成分)的合成，该至少一种成分在组装和/或释 放颗粒的过程中被引导至所述颗粒的表面；(ii)用两个或多个所述遗 传要素转染、感染和/或转化适合的细菌宿主细胞；(iii)在允许由所 述原生遗传要素编码的噬菌体结构蛋白进行表达的条件下，以及所述 至少一种在组装和/或释放颗粒中被引导至所述颗粒的表面附加成分 进行表达的条件下，培养所述细菌宿主细胞；(iv)在一定条件下， 所述细菌宿主细胞的培养物形成嵌合噬菌体衍生的颗粒，其包含至少 一种附加成分，该成分由反式互补遗传要素编码，但不包含由反式互 补遗传要素编码的所述至少一种附加成分的至少一部分的编码序列； 以及(v)获得包含嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合物。

如以下给出的详细说明中所描述的，这样的嵌合颗粒可从上述的 组合物中分离出。因此，本发明的第二方面涉及嵌合噬菌体衍生的颗 粒，除了至少一种展示或包含至少一种附加成分的正常噬菌体成分 外，所述至少一种正常噬菌体成分由含有绝大部分的噬菌体基因组的 遗传要素编码，且所述至少一种附加成分被不同的遗传要素编码，颗 粒的进一步特征在于其不包含编码至少一部分所述至少一种附加成 分的序列。

这样的颗粒将具有安全的特性，可符合规定方面有一定优势，有 助于快速通过管理机构的批准。因此，本发明的进一方面是关于应用 本发明的嵌合噬菌体衍生的颗粒来制备疫苗、噬菌体疗法的组合物， 以及用于治疗过敏、用作生物防除剂和其他将进一步描述的应用。

可能的应用包括但不限于表面展示一种或多种因子的嵌合颗粒 的繁殖，其中，这些颗粒：

...允许颗粒竞争性地从黏膜表面(例如胃肠道)排除病原体或其 他非有益微生物群(例如，那些降低饲料效率的)。

...作为通用接合体(例如)(e.g.多聚组氨酸标签(polyhistidine tag))而特异性地和非共价地附着于一第二接合体成分(adaptor component)(例如小鼠抗多聚组氨酸抗体)，该第二接合体成分为共 价地结合到异源的生物活性分子或复合物(例如碱性磷酸酶)。

...刺激免疫系统，使颗粒作为疫苗和/或免疫刺激辅药。由于某些 天然的噬菌体蛋白可能具有高度的抗原性，基于噬菌体的传递媒介物 也被认为有起到刺激免疫系统的辅药的作用。另外，通过刺激抗原呈 递细胞(APCs)的作用，抗原颗粒的大小也会增强免疫应答。多价疫 苗制剂可通过(i)在一个颗粒上表面展示两个或多个抗原，或(ii) 组合使用两个或多个截然不同的颗粒而设计出。替换因子可被用作特 异性地以T-或B-淋巴细胞为靶，而传递它们的抗原物(即使颗粒成 为智能疫苗)

...延长噬菌体颗粒在黏膜上皮细胞和/或它们在体内的同源生物 膜的保留时间。进而，本发明可用作提供工业化的表面或生物膜(既 用在噬菌体生物防除中)。

...选择性地使颗粒传递细胞毒素有效载荷以杀死癌细胞、病原体 或感染的宿主细胞。例如，一种表面展示的因子可对特定类型的癌细 胞(或病原体)产生选择性的特异性，而第二种因子可作为细胞毒素。 有可能在细胞毒素结合到适合的靶后，才由宿主隔离(例如，在疏水 袋子中)。另外的选择是，这些颗粒可被用作特异性地以淋巴细胞为 靶，而传递它们的细胞毒素(例如，选择性地杀死HIV-感染的淋巴 细胞)。

...允许颗粒体内特异性地结合到和包覆到病原体上(例如在肠胃 道中)，从而中和病原体，允许其在不致病的情况下排泄出。

...协助从非嵌合颗粒、细胞碎片和细胞培养介质残渣中(例如多 聚组氨酸标签)纯化嵌合颗粒。

定义

在此使用的术语“乳酸细菌”(LAB)是指革兰阳性、触酶阴性 兼性厌氧菌或微需氧菌，其对糖发酵，产生包括以乳酸为主要发酵产 物在内的酸。工业上用得最多的乳酸菌包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、 明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、酒球 菌属(Oenococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌属 (Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。此外， 产乳酸菌的细菌也通常包含在乳酸细菌的组中，它们包括属于严格厌 氧的细菌，双歧杆菌(bifidobacteria)，即双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)，这些细菌常被用作食物起子培养物，可单独使用或与乳酸细菌 组合使用。

在此使用的术语“噬菌体”(phage，或bacteriophage)涉及已知 的一类感染细菌的病毒。噬菌体包括被蛋白被膜或壳(“衣壳”)包裹 的DNA或RNA序列。噬菌体通过各种方法传播到宿主细胞中，包 括感染、转化、转染和/或结合。

在此使用的术语“病毒”是为本领域所理解的含义，也包括其他 为本领域技术人员所理解的可能衍生自噬菌体或病毒的种类。

在此使用的术语“宿主细胞”、“宿主”或“宿主有机体”可互换 着用于描述适当的细菌细胞，在其中引入原生遗传要素和反式互补遗 传要素，以及噬菌体可在产生原生遗传要素的细菌细胞中进行复制。

在此使用的术语“培养物”涉及在任何介质中细菌生长而得到的 细菌细胞种群，这些介质包括发酵的饲料和食物制品，例如发酵的乳 制品、肉、鱼、水果和/或蔬菜制品。

在此使用的术语“噬菌体基片”涉及将噬菌体尾丝和/或刺突连 接到噬菌体上的结构。

在此使用的术语“噬菌体颈部”涉及将头部和颈须连接到尾部结 构的结构。

在此使用的术语“噬菌体尾丝”涉及在噬菌体颗粒的底部上发现 的丝状结构。噬菌体尾丝通常负责识别适合的宿主细胞。

在此使用的术语“噬菌体前头部”涉及在噬菌体基因组壳体化和 连接尾和/或颈部成分之前的噬菌体头部结构。

在此使用的术语“噬菌体头部”涉及容纳噬菌体基因组的二十面 的结构。

在此使用的术语“噬菌体尾部”涉及将噬菌体基因组从噬菌体头 部导出并进入到宿主细胞质中的管状结构。

在此使用的术语“噬菌体颈须”涉及可以或不可以用作感觉噬 菌体的物理化学环境的丝状结构。

在此使用的术语“原生菌类组合物”涉及含有原生菌类微生物的 组合物，其中，原生菌类微生物被定义为当施用足够量后能给宿主健 康带来益处的活的微生物(FAO/WHO report，October 2001 http://www.mesanders.com/probio_report.pdf.)。与惯例相同，在本文中， 该定义也包括以下陈述：“...益处不仅仅是简单的营养。”(即它们不 仅仅是被消化而提供所含的卡路里)。在本文中所指的噬菌体颗粒， 不是指噬菌体样或噬菌体菌影颗粒，而是可感染宿主细胞的活的微生 物。

在本文中，术语“噬菌体基因组的绝大部分”应理解为含有至少 70％的用于形成功能性噬菌体基因组的遗传位点的噬菌体基因组的 部分，优选的该部分为至少80％，更优选的为至少90％，进一步优 选的是形成功能性噬菌体基因组所需要的所有的基因和其他基因序 列。

在此使用的术语“功能性噬菌体基因组”涉及DNA或RNA分 子或一组DNA或RNA分子，当它们被引入到合适的细菌细胞中时， 在某些条件下，与一种或多种噬菌体编码的因子一同可控制完整的感 染周期，以形成噬菌体颗粒。在优选的形式中，这个或这些DNA或 RNA分子将含有从亲代噬菌体中衍生出的复制DNA的起点。

术语“成分”被理解为构成噬菌体(或噬菌体样或噬菌体菌影颗 粒)的部分。该术语包括由噬菌体基因组编码的蛋白。

在此使用的术语“附加成分”是指由反式互补遗传要素编码的成 分，其在组装和/或释放颗粒的过程中被引导至所述嵌合噬菌体衍生 的颗粒(例如嵌合噬菌体颗粒、嵌合的噬菌体样颗粒或嵌合噬菌体菌 影颗粒)的表面。

在此使用的与嵌合噬菌体衍生的颗粒相关的术语“分离”是指将 颗粒从它们的原始环境(例如产生颗粒的细菌宿主细胞的培养物)中 除去的过程。

在此使用的术语“抗体”在广义上并特异地包含了完好的单克隆 抗体、多克隆抗体、由至少两种完好的抗体形成的多特异性抗体(例 如双特异性抗体)、以及能显示出理想的生物活性的抗体片段。

在此使用的术语“抗原或抗原决定簇”涉及抗原分子的一部分， 该部分决定了抗原—抗体反应的特异性。

在此使用的术语“附加体”涉及一类能够可逆地整合入细胞染色 体中的质粒。

在此使用的“动物”涉及脊椎动物，例如人和动物，这里，动物 包括鱼、鸟类，例如鸡、火鸡、鸵鸟，哺乳动物，例如狗、猫、兔、 牛、猪、水牛、骆驼、鹿、羚羊、长颈鹿、绵羊、山羊、马、驴、象、 猴和黑猩猩。

在此使用的“穴蛋白(Holin)”涉及在噬菌体感染后期，由噬菌体 基因组典型地表达的蛋白。穴蛋白在细胞膜上形成穿孔，使得溶素或 溶菌酶蛋白有机会进入细胞壁肽聚糖，从而导致细胞溶解，释放出后 代噬菌体颗粒。

在此使用的“衣壳”被定义为病毒颗粒的外壳。“噬菌体菌影” 和“与嵌合的噬菌体样颗粒”的壳也被称为衣壳。

在此使用的“溶素”涉及鼠科的水解酶，其能够降解细菌细胞壁， 使噬菌体得以释放(综述见Young等，2000)。

在此使用的“生物毒素的中和”涉及通过一种或多种嵌合噬菌体 颗粒与感兴趣的试剂间的反应，而降低或消除特定毒素的毒性的做 法。并不受特定解释或理论的限制，生物毒素的中和可解释为将生物 试剂从它的预期宿主受体中隔离开，从而消除了导致对所述试剂不利 的一连串的事件。

在此使用的“病原体的中和”涉及通过一种或多种嵌合噬菌体颗 粒与感兴趣的试剂间的反应，而降低或消除特定生物试剂的毒性的做 法。并不受特定解释或理论的限制，病原体的中和可解释为将生物试 剂从它的预期宿主受体或生态位隔离开，从而消除了导致对所述试剂 不利的一连串的事件。中和也可防止营养物吸收这次使用的“不期望 的微生物”涉及微生物或一组微生物，当存在于人或动物的特定的生 态位时，在不导致特定疾病状态下，降低了其居住的人或动物的整体 健康和/或生化效能。例如，细菌的某些种属导致反刍动物体内过量 的气体(肠胃气胀)。这些牛虽然没有生病，但它们显示出降低的消 化吸收效率。

在此使用的“噬菌体结构蛋白”涉及包含噬菌体的衣壳的成分和 /或噬菌体的成分的蛋白和/或肽。

在此使用的“噬菌体感染”涉及噬菌体基因组已成功进入宿主细 菌的细胞质内的情形。在此使用的“感染”与“噬菌体复制”无关。

在此使用的“噬菌体复制”涉及合成噬菌体成分，并对其处理和 组装进入成熟噬菌体颗粒中。噬菌体复制需要在宿主中进行基因表 达，而这与成熟颗粒的感染性无关。

在此使用的“噬菌体疗法”涉及使用噬菌体消除和/或减少致病 的和/或不期望的微生物在人体和/或动物体内存在的数目，可通过任 何机制的数量达成，这些机制包括但不限于掠夺、竞争排除、病原体 中和或是它们的组合。噬菌体疗法还可通过减少或消除不期望的微生 物，包括病原体而富集期望的微生物。另外，噬菌体疗法还可被用作 治疗急性和/或慢性疾病状况的替代疗法。

在此使用的“原生颗粒”涉及天然的噬菌体隔离种群衍生的原生 遗传要素。

在此使用的“原生遗传要素”涉及含有原生颗粒的噬菌体基因组 的绝大部分的遗传要素。

在此使用的“病毒或噬菌体生物防除”涉及使用病毒或噬菌体消 除和/或减少致病的和/或不期望的微生物在特定环境中存在的数目， 可通过任何机制的数量达成，这些机制包括但不限于掠夺、竞争排除、 病原体中和或是它们的组合。病毒或噬菌体生物防除还可通过减少或 消除不期望的微生物，包括病原体而富集期望的微生物。另外，噬菌 体疗法还可被用作治疗急性和/或慢性疾病状况的替代疗法。在此使 用的病毒或噬菌体生物防除不适用于活的人或动物体系，而仅指非治 疗的应用(例如用于包装，喷涂在动物屠体上等)。

在此使用的“质粒”是自主复制分子，其通常由双链DNA构成， 存在于细胞中作为染色体外因子。通常，质粒含有有限数目的基因， 且通常编码一个或多个用于它们自己复制用的蛋白。在大多情况下， 质粒都是非必需的，它们编码非必要的功能以提高某些细胞代谢的能 力。

在此使用的“原噬菌体”涉及噬菌体复制的相对被动的形式，因 此噬菌体基因组被整合进细菌染色体中，而不会导致宿主细胞的死 亡。

在此使用的“适合的宿主细胞”涉及可用原生遗传要素和反式互 补遗传要素转染、感染和/或转化，且支持所述遗传要素的表达和嵌 合噬菌体颗粒、噬菌体样颗粒或噬菌体菌影颗粒的组装。

“反式互补遗传要素”是编码至少一个不为原生遗传要素编码的 成分的遗传要素，优选不含有噬菌体基因组的绝大部分。通常，反式 互补遗传要素”是质粒。重要的是，这里定义的辅助噬菌体作为一种 普通野生型噬菌体，其与特异性噬菌体(例如原生遗传要素)一同生 长，并提供产生噬菌体颗粒任何必须的功能而不被认为是反式互补遗 传要素。

“病毒样颗粒”(VLPs)被定义为自组装的、非复制的、非致病 的和去基因组的颗粒，其大小与完好的病毒粒子可比，但组成的成分 远少于病毒粒子。实际上，VLPs通常由单个噬菌体或病毒衣壳蛋白 (衣壳粒)构成，其融合进感兴趣的抗原/抗原表位中。该融合蛋白 通常在没有噬菌体基因组存在下由质粒表达，其中，基因由所述基因 组分离。因此，VLPs是一种改造的且由质粒带动的技术。尽管VLPs 和噬菌体菌影具有某些重要的共同特点(例如，都不含遗传材料)， 但根据定义，它们在功能上和生物学上截然不同，且在制备方式上也 不同。

“噬菌体样颗粒”被定义为由噬菌体颗粒衍生出的颗粒，其大小与 完好的病毒粒子可比，但由若干(通常为几个)组分构成，这些衍生 自完好的病毒粒子的组分与完好的病毒粒子类似，但不一定完全相 同，甚至可含有部分原生遗传要素。

“噬菌体菌影”被定义为由噬菌体衍生的空的蛋白壳。噬菌体菌影 可通过介入由一个或多个因子的表达导致的裂解性感染而诱发缺陷 的原噬菌体而制得，或在某些情况下，通过化学处理(例如渗透压休 克)完好的噬菌体颗粒(即含基因组)得到。在本文中，术语“基因” 指DNA或RNA序列，其涉及产生多肽链，且包括在编码区前后的 区域(5′-上游和3′-下游序列)。5′-上游区包含调节序列，其控制基因 的表达，通常为一启动子。3′-下游区包含涉及终止基因转录的序列。

在本文中，“辅助噬菌体”用于描述正常的野生型噬菌体，其与 特异性噬菌体(例如原生遗传要素)一同生长，提供产生噬菌体颗粒 任何必须的功能。

“不相关的肽序列”描述了与引导融合蛋白到达噬菌体表面的肽 序列不同的肽序列。

本文中，术语“嵌合颗粒”用于描述嵌合噬菌体颗粒、嵌合噬菌 体样颗粒或嵌合噬菌体菌影颗粒，它们包含由至少两种不同的要素编 码的蛋白和/或其他成分，在此，是由原生遗传要素以及反式互补遗 传要素编码的成分。

“嵌合噬菌体衍生的颗粒”被认为是衍生自噬菌体的颗粒是因为 其展示出至少一种附加的(异源的)成分在其表面，(优选为除了至 少一种正常的噬菌体编码的成分外)。这种颗粒可选自由嵌合噬菌体 颗粒、嵌合噬菌体样颗粒和嵌合噬菌体菌影颗粒组成的组，或选自可 由本发明的方法获得的颗粒。

“安全的微生物”被定义为那些通常被认为在食品或饲料中是公 认安全的微生物，和/或那些据有关管理机构认可的在食物中使用无 副作用历史记录的微生物。术语“安全的微生物”与术语“安全的宿 主细胞”可互换使用。

本文中使用的描述本发明的术语“一”和“该”以及类似的用法 (特别是在后面的权利要求中)，除了有特别指出或有与文中有明显 抵触外，应理解为包括单数和复数的形式。术语“包含”、“具有”、 “包括”和“含有”，除有特别指出外，应理解为开放的术语(即意 思是“包括但不限于”)。除有特别指出外，这里对数值范围的引用是 对每个落入该范围内的单独的值进行单独引用的简化方法，其效果与 在说明书中单独引用各个值相同。除有特别指出或有与文中有明显抵 触外，这里描述的所有方法可以适当的顺序进行。除有特别指出外， 所有例子或示例性语言(如，“例如”)的使用，其目的只是更好地描 述本发明，而不是对本发明的范围加以限制。说明书中的语言不应理 解为具有以任何非要求的元素作为实施本发明的必要元素的含义。

发明的详细说明

据发明者所知，所有的以嵌合病毒或噬菌体作为载体而展示一种 或多种成分的尝试均是基于病毒/宿主细胞系统，而这样的系统具有 潜在的致病性。此外，关于嵌合噬菌体的现有技术不能将在嵌合噬菌 体表面发现的一个或多个附加因子从编码所述一个或多个因子的基 因隔离开，特别是在这些因子中的一个是融合蛋白的情况下。

为了提供最安全的嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合物，本发明描述 了一产生大量这种嵌合颗粒的方法，该方法主要是基于通常被认为是 安全的病毒/宿主细胞系统。这样的系统例如是那些通常被认为在食 品或饲料中有公认安全的状态的宿主有机体，和/或那些据有关管理 机构认可的在食物中使用无副作用历史记录的微生物(此后简称“安 全的微生物”)。尽管噬菌体与宿主之间存在着天然的关系，但他们不 被明确认为是“GRAS”的，或是被相关管理机构描述为“安全的微 生物”的状态。有相当数量的报道证明了虽然不是全部，但有很多“安 全的微生物”通常会被噬菌体感染。这样的噬菌体与他们的特定的宿 主细胞和使用这些细菌制造的食品之间有着天然的和不可避免的联 系。因此，处于“安全的微生物”的状态必须是基于在用于食品时无 副作用的历史记录，且有必要含有宿主细胞和与它们相关的噬菌体。

作为一个额外的重要安全预防措施，本发明的方法目前优选的一 实施方式还进一步设计了在颗粒中不含有编码至少一个附加成分的 至少一个基因，所述附加成分是由反式互补遗传要素编码，并展示在 嵌合噬菌体衍生的颗粒的表面。通过确保所述宿主细胞的基因组和/ 或所述原生颗粒和/或所述反式互补遗传要素具有内在的性质以保证 来自反式互补遗传要素的遗传材料不与所述嵌合颗粒发生联系，所述 这种从嵌合噬菌体中分离基因的做法可以方便地实现。这样的内在性 质的一个例子被大多数细菌质粒所表达。如果反式互补遗传要素是质 粒，除非质粒中存在特别的包装信号，在质粒中的基因将不会转移到 嵌合颗粒中。类似的，如果反式互补遗传要素通过重组转位子等而被 整合入细菌基因组，则在反式互补遗传要素中的基因转移到嵌合噬菌 体颗粒的可能性很小。但是，可以预想出有其他的的方法能降低所述 基因被转移到嵌合颗粒上的可能。可以预期，宿主细胞的基因组和/ 或所述原生颗粒和/或所述反式互补遗传要素经基因工程改造而表达 一些因子(例如，反义RNA或反式显性蛋白表达、条件突变等)，从 而保证了基因从所述嵌合颗粒的分离。因此，尽管嵌合颗粒可展示部 分的毒力因子或毒素，但编码不利成分的“不利”遗传要素的水平传 播的危险几乎为零。

图1示出了由本方法得到的主要类型的颗粒。

应当注意的是，由在此揭示的方法制造的颗粒将得到的嵌合颗粒 除了由原生遗传要素编码的成分之外，还含有一个或多个由反式互补 遗传要素编码的附加因子，其中，原生遗传要素包括相当部分的噬菌 体基因组。一个或多个这些附加因子可展示在单个颗粒上，就如同相 同因子的多个单元。如图所示，表面展示的因子可被整合入尾纤维、 头、尾或任何其他与噬菌体颗粒相关的结构中。在大多数应用中，颗 粒并不需要是完好的才能有效地作为展示因子的载体。颗粒不含有某 些编码附加因子的反式互补遗传要素的遗传材料。因此，尽管颗粒是 嵌合的，他们却不是基因重组的。因此，关于重组GMO技术的立法 限制不适用于这些产品。

本发明重要的一方面是原生遗传要素包含绝大部分的噬菌体基 因组。这与如WO04003143中形成对比，在WO04003143中，病毒 样颗粒不含有天然产的噬菌体衣壳成分，但是由平移融合进外源肽序 列的病毒壳蛋白构成。

原生遗传要素和反式互补遗传要素可在一步中同时引入到宿主 细胞中，但出于技术上的原因，通常优选采用顺序的方法将两种遗传 要素引入到宿主细胞中，该顺序的方法包括以下步骤：(i)用所述至 少一种反式互补遗传要素转染、感染和/或转化适合的宿主细胞；和(ii) 用所述原生遗传要素转染、感染和/或转化宿主细胞。这种实施方式 在原生遗传要素是完整的编码天然的传染性噬菌体的完整的噬菌体 基因组时，优点是很显著的。在该方法的本实施例的第一步中，反式 互补遗传要素被引入到宿主细胞中，该反式互补遗传要素通常选自由 质粒、转位子、原噬菌体、原噬菌体残体、假噬菌体、附加体和噬粒 组成的组。接下来，含有反式互补遗传要素的宿主细胞被选择、表征 和扩展。该方法的进一步的优点是如此转换的宿主细胞可在低温下保 存很长一段时间，并由含不同原生遗传要素的噬菌体感染。

尽管原生遗传要素是由噬菌体隔离种群，特别是从自然分离出的 噬菌体隔离种群构成，它可仅编码几个功能性的噬菌体成分。然而， 在优选的实施方式中，原生遗传要素编码若干正常的噬菌体成分而得 到嵌合噬菌体衍生的颗粒，其包含了若干正常的噬菌体成分。

在此描述的方法是否得到嵌合噬菌体衍生的颗粒将取决于宿主 细胞基因组的遗传成分，除了确切的实验条件外，还有原生遗传要素 和反式互补遗传要素。

如果原生遗传要素能够在至少一个由反式互补遗传要素编码的 附加因子存在下完成感染周期，则该方法将产生嵌合噬菌体。通常， 原生遗传要素会在期间进行复制。如果引入的原生遗传要素并不编码 由原生颗粒编码的所有因子，而这些因子是组装天然的原生颗粒所必 须的，且能够进行完整的感染周期，则会导致嵌合噬菌体样颗粒的产 生。最后，嵌合噬菌体菌影的产生通常需要额外的处理步骤。

该额外的处理步骤通常是采用两种可能的操作中的一种的结果。 第一中选择可以是使用未将其基因组加以整合的母噬菌体。这种缺陷 可以是有条件的，也可以是无条件的。如果是有条件的，则噬菌体将 能够在一种条件下(如温度1)用壳体包裹它们的基因组，但在第二 种条件下(如温度2)不能用壳体包裹它们的基因组。如果它们不是 条件突变体，则必须提供一反式的因子来复制突变的噬菌体。不管用 什么方法，一旦经复制，这些突变的噬菌体颗粒就可被用于感染已含 有如上所述的反式互补遗传要素的宿主细胞。一旦被感染，宿主细胞 将合成缺乏DNA的标记的菌影颗粒。

第二种选择是感染已含有如上所述的反式互补遗传要素的宿主 细胞，该反式互补遗传要素表达第二遗传构建，以用于特异性地防止 对噬菌体基因组的壳体包裹。这可通过若干方法加以实行，这些方法 包括(但不限于)表达(i)天然噬菌体抵抗机制(包括但不限于无效性 抵御机制；(ii)反义RNA特异性地对编码一个或多个基因组壳体包 裹因子的噬菌体转录体的表达；(iii)噬菌体编码的基因组壳体包裹因 子的反式显性负性突变体衍生物(例如蛋白)；或(iv)抑制基因组壳体 包裹因子的表达或使它们编码的蛋白去活的因子。不管用什么方法， 一旦复制，这些突变的噬菌体颗粒即可被用于感染已含有如上所述的 反式互补遗传要素的宿主细胞。一旦被感染，宿主将合成缺乏DNA 的标记的菌影颗粒。

一旦成熟的颗粒被组装，宿主细胞将经过合适的噬菌体编码体系 而裂解，将细胞内成分(包括颗粒)释放入生长介质中，或者在原生 和互补遗传要素不提供所有必要因子时，通过非噬菌体诱导的裂解， 包括物理分裂过程(例如声波降解法)和/或加入化学物质(例如噬 菌体溶素，溶解酵素等)而裂解。在本发明的优选的实施方式中，颗 粒通过天然裂解过程而从宿主细胞中释放。这就意味着转化的宿主细 胞表达了组装和释放颗粒所需要的适合的机制，即它们表达了所有指 导颗粒组装和释放所需要的噬菌体编码的基因。

对此，本发明的嵌合噬菌体样颗粒和嵌合噬菌体菌影颗粒与 VLPs的不同就在于对VLPs的普遍理解可定义为是自组装、非复制、 非致病的和去基因组的颗粒，其大小与完好的病毒粒子可比，但组成 成分远少于病毒粒子。实际上，VLPs通常由几个，典型的是仅有单 个噬菌体或病毒衣壳蛋白(衣壳粒)构成，其融合进感兴趣的抗原/ 抗原表位中。该VLPs的融合蛋白通常由宿主细胞中的质粒表达，而 不含有噬菌体基因组的绝大部分，其中，基因由所述基因组分离。因 此，VLPs是一种改造的且由质粒带动的技术。尽管VLPs和噬菌体 菌影具有某些重要的共同特点(例如，都不含遗传材料)，但根据定 义，它们在功能上和生物学上截然不同，且在制备方式上也不同。据 本发明者所知，所有的VLPs一般均从人类发明的的细胞工厂中释放 (例如，通过将宿主细胞进行声波降解、弗氏压滤、化学溶解或类似 的过程)。

一旦噬菌体颗粒被释放，将进行发酵以除去外源核酸—包括重组 融合基因。额外的处理步骤有时为必要的，有时为非必要的。这样的 处理可包括(i)颗粒纯化和/或(ii)颗粒活化。如果表面展示因子是 作为一个或多个生物活性因子(例如抗体、蛋白、小分子等)的载体， 则颗粒活化可以是必要的。这时，生物活性因子可直接加入到经发酵 或纯化的颗粒中，使得它们结合到展示在嵌合颗粒表面的载体蛋白 上。

在大多数情况下，原生遗传要素和反式互补遗传要素是通过使用 标准分子生物学方法，例如转染、感染和/或转化等描述于Ausubel 等(ed.)″Current Protocols in Molecular Biology″John Wiley and Sons， 1995(并入作为参考)中的方法而引入到宿主细胞中的。然而，在某些 情况下，颗粒产生的宿主细胞也可以是通过细胞融合而形成，其中一 种情形是当发现将两个噬菌体基因组结合到一个细胞中是重要时，此 时，每个噬菌体基因组均赋予感染的细胞对抗另一个噬菌体基因组的 重复感染的抵抗力。尽管不被认为是标准的分子生物学方法，但 Ausubel(1995)仍对细胞融合的方法给出了详细的信息。

为了确保在组装和/或释放颗粒中，由反式互补遗传要素编码的 成分被引导至所述颗粒的表面，本发明是采取了将编码期望的多肽的 基因(基因1)融合到第二基因(基因2)中，使得在反式互补遗传 要素进行转录时产生融合蛋白。基因1通常是噬菌体编码的基因，其 优选为来自感染一种或多种乳酸菌的噬菌体的衣壳蛋白，或其部分。 基因2(“不相关的肽序列”)通常编码抗原、过敏原、毒力蛋白受 体、配体等或其部分。基因1和2的融合可通过将基因2插入到含有 基因1的质粒上的特别的位点而得以实现，或者通过将基因1插入到 含有基因2的质粒上的特别的位点而得以实现，所采用的方法是描述 于上述Ausubel，1995 supra和Sambrook，1989 supra中的标准分子生 物技术。另外，也可采用Horton，1995描述的所谓的重叠延伸基因剪 接(SOEing)技术，以聚合酶链式反应将基因2融合到基因1中。

在本发明的大多数实施方式中，在组装和/或释放颗粒中，被引 导至所述颗粒的表面的成分是一融合蛋白，其是在编码指导融合蛋白 到所述嵌合噬菌体衍生的颗粒表面的序列和不相关的肽或蛋白编码 序列之间的翻译融合。在本发明一特别优选的实施方式中，所述融合 蛋白的不相关的肽序列编码能引起人和/或动物体内的免疫应答的抗 原和/或过敏原。在本发明的其他实施方式中，不相关的肽序列选自 由含在对植物、人、动物、真菌或细菌致病的肽或蛋白序列组成的肽 或蛋白序列的组。在本发明的其他实施方式中，融合蛋白的不相关的 肽或蛋白序列是选自一组肽。它们与植物、人、动物、真菌或细菌的 相互作用可能会被认为是没有益处但不致病的，包括部分毒力因子的 肽和允许至少一个分子的特异性结合的肽。

如上所述，本发明的目的是提供安全的嵌合噬菌体衍生的颗粒的 组合物，该组合物可对人和/或动物施用(例如，通过摄食、注射或 点滴法)，而不必损及展示各种因子的颗粒的效率。根据本发明，通 过选择对细菌宿主细胞特异的噬菌体，获得了额外的安全性。其中， 细菌宿主细胞是选自由其使用已通过美国食品和药品管理局、兽用医 药中心和/或类似机构评价，并认可作为属于GRAS状态而批准用于 食品或饲料的食品添加剂或直接饲喂微生物制品的细菌宿主细胞组 成的组。在本发明一具体的实施方式中，细菌宿主细胞被认为在用于 奶制食物产品上是GRAS的，但其他的GRAS类别也被考虑到本发 明中。

欧洲食品和饲料培养物协会和国际乳制品联盟(EFFCA/IDF) 已在协作编写具有在食物中使用具有安全历史记录的微生物目录。该 完整目录记载于G.Mo-gensen等(2002)的“Inventory of Microorganism with a documented history of use in food”。Bulletin of the International Dairy Federation，No.377 page 10-19(在此并入作为参 考)。因此，在本发明一重要的实施方式中，细菌宿主细胞是选自由 细菌组成的组，其中，细菌是根据欧洲食品和饲料培养物协会和国际 乳制品联盟(EFFCA/IDF)的，具有用于食物和饲料(包括在直接饲 喂微生物制品中的使用)而无副作用的记录历史的微生物。特别是选 自具有良好的食物和饲料安全使用的历史记录的一组乳酸菌。通常， 乳酸菌可被描述为革兰阳性、触酶阴性兼性厌氧菌或微需氧菌，其对 糖发酵，产生包括以乳酸为主要发酵产物在内的酸。工业上用得最多 的乳酸菌包括非致病的乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属 (Streptococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属 (Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属 (Brevibacterium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属 (Propionibacterium spp.)。此外，属于严格厌氧菌的组的产乳酸菌的 细菌也通常包含在乳酸细菌的组中，包括双歧杆菌(bifidobacteria)， 即双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)，这些细菌常被单独用作食物起 子培养物或添加剂，或与乳酸细菌组合使用。因此，本发明的另一重 要的实施方式中，细菌宿主细胞选自一组非致病的细菌属，其通常由 非致病的双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、 乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、明串 珠菌属(Leuconostoc spp.)、酒球菌属(Oenococcus spp.)、片球菌属 (Pediococcus spp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)、葡萄球 菌属(Staphylococcus spp.)和链球菌属(Streptococcus spp.)组成。

在丹麦，所有的食物培养物必须告知丹麦兽用和食物管理局，并 且在用于食物工业之前，它们的应用需被管理局接受。表1列出了批 准的食物培养物已被归类的细菌的种和亚种。     表1.在丹麦被接受用于食物中的细菌食物培养物的分类     球形节杆菌，Arthrobacter globiformis     青春双歧杆菌，Bifidobacterium adolescentis     动物双岐杆菌，Bifidobacterium animalis     两歧双歧杆菌，Bifidobacterium bifidum     短双歧杆菌，Bifidobacterium breve     婴儿双歧杆菌，Bifidobacterium infantis     乳酸双歧杆菌，Bifidobacterium lactis     长双歧杆菌，Bifidobacterium longum     假长双歧杆菌，Bifidobacterium pseudolongum     嗜热双歧杆菌，Bifidobacterium thermophilus     干酪短杆菌，Brevibacterium casei     亚麻短杆菌，Brevibacterium linens     黄色棒状杆菌，Corynebacterium flavescens     产气肠球菌，Enterococcus aerogenes     屎肠球菌，Enterococcus faecium     蜂房哈夫尼菌，Hafnia alvei     变异库克菌，Kocuria varians     德氏乳杆菌乳酸亚种，Lactobaccillus delbrueckii subsp.lactis     嗜酸乳酸菌，Lactobacillus acidophilus     营养乳杆菌，Lactobacillus alimentarius     短营养乳杆菌林氏变种，Lactobacillus alimentarius brevis var.     lindneri     巴伐利亚乳杆菌，Lactobacillus bavaricus     短乳杆菌，Lactobacillus brevis     短乳杆菌林氏变种，Lactobacillus brevis var.lindneri     保加利亚乳杆菌，Lactobacillus bulgaricus     肉食乳杆菌，Lactobacillus carnis     干酪乳杆菌，Lactobacillus casei     干酪乳杆菌鼠李糖变种，Lactobacillus casei var.rhamnosus     弯曲乳杆菌，Lactobacillus curvatus     德氏乳杆菌，Lactobacillus delbrueckii     德氏乳杆菌保加利亚种，Lactobacillus delbrueckii subsp.     bulgaricus     德氏乳杆菌乳酸亚种，Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis     乳酸杆菌，Lactobacillus farciminis     瑞士乳杆菌，Lactobacillus helveticus     詹氏乳杆菌，Lactobacillus jensenii     乳酸乳杆菌，Lactobacillus lactis     乳酸乳杆菌乳酸亚种，Lactobacillus lactis subsp.lactis     乳酸乳杆菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种，Lactobacillus lactis     subsp.lactis biov.Diacetyllactis     赖氏乳杆菌，Lactobacillus leichmanii     副干酪副干酪乳杆菌，Lactobacillus paracasei paracasei     副干酪乳杆菌副干酪亚种，Lactobacillus paracasei subsp.paracasei     戊糖乳杆菌，Lactobacillus pentosus     植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum     鼠李糖乳杆菌，Lactobacillus rhamnosus     清酒乳杆菌，Lactobacillus sake     旧金山乳杆菌，Lactobacillus sanfrancisco     木糖乳杆菌，Lactobacillus xylosus     乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种，Lactococcus lactis     sub.lactis biovar.Diacetylactis     嗜酸乳球菌，Lactococcus acidophilus     乳酸乳球菌乳脂亚种，Lactococcus lactis ssp.cremoris     乳酸乳球菌乳酸亚种，Lactococcus lactis ssp.lactis     乳酸乳球菌乳脂亚种，Lactococcus lactis subsp.cremoris     乳酸乳球菌乳酸双乙酰乳酸亚种，Lactococcus lactis subsp.lactis     diacetylactis     肉质明串珠菌，Leuconostoc carnosum     嗜橙明串珠菌，Leuconostoc citrivorum     葡萄糖明串球菌，Leuconostoc dextranicum     肠膜明串珠菌乳脂亚种，Leuconostoc mesenteroides subsp.     cremoris     假肠膜明串珠菌，Leuconostoc pseudomesenteroides     变异微球菌，Micrococcus varians     酒类酒球菌，Oenococcus oeni     乳酸片球菌，Pediococcus acidilactici     戊糖片球菌，Pediococcus pentosaceus     薛氏丙酸杆菌，Propionbacterium Shermanii     丙酸丙酸杆菌，Propionibacterium acidipropionici     阿拉伯糖丙酸杆菌，Propionibacterium arabinosum     费氏丙酸杆菌精子亚种，Propionibacterium freudenreichii ssp.     spermanii     费氏丙酸杆菌，Propionibacterium freudenreichii     Rhodosporidium infirmominiatum     肉糖葡萄球菌，Staphylococcus carnosus     木糖葡萄球菌，Staphylococcus xylosus     乳脂链球菌，Streptococcus cremoris     双乙酰乳酸链球菌，Streptococcus diacetylactis     耐久链球菌，Streptococcus durans     粪链球菌，Streptococcus faecium     乳酸链球菌，Streptococcus lactis     唾液链球菌嗜热亚种，Streptococcus salivarius subsp.thermophilus     嗜热链球菌，Streptococcus thermophilus

对这些细菌的接受意味着它们被认为是安全的，因此，对这些安 全的“食品级”的细菌特异的，即感染这些细菌的噬菌体也通常被认 为是安全的。因此，在本发明的一重要实施方式中，细菌宿主细胞是 选自由以下细菌组成的组：球形节杆菌、青春双歧杆菌、动物双岐杆 菌(原为两歧双歧杆菌，Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌、婴儿 双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、假长双歧杆菌、嗜热双歧杆 菌、干酪短杆菌、亚麻类短杆菌、黄色棒状杆菌、产气肠球菌、屎肠 球菌、蜂房哈夫尼菌、变异库克菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、嗜酸乳酸 菌、营养乳杆菌、短营养乳杆菌林氏变种、巴伐利亚乳杆菌、短乳杆 菌、短乳杆菌林氏变种、保加利亚乳杆菌、肉食乳杆菌、干酪乳杆菌 干酪亚种、干酪乳杆菌鼠李糖变种、乳脂乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏 乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、farciminis 乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、乳酸乳杆菌乳酸亚 种、乳酸乳杆菌乳酸生物变种双乙酰乳酸亚种、赖氏乳杆菌、副干酪 乳杆菌(原为干酪乳杆菌)、副干酪副干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌副干 酪亚种、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌(早 期为营养乳杆菌)、旧金山乳杆菌、木糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚 种双乙酰乳酸生物变种、乳酸乳球菌(原为链球菌)乳脂亚种、嗜酸 乳球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌双乙酰乳酸种(原为双乙酰乳酸链 球菌)、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳 酸双乙酰乳酸亚种、肉质明串珠菌、嗜橙明串珠菌、葡萄糖明串球菌、 肠膜明串珠菌乳脂亚种、假肠膜明串珠菌、变异微球菌、酒类酒球菌 (原为酒明串珠菌Leuconostoc oenos)、乳酸片球菌、戊糖片球菌、丙 酸丙酸杆菌、阿拉伯糖丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌精子亚种、费氏丙酸 杆菌、薛氏丙酸杆菌、infirmominiatum红冬孢酵母、肉糖葡萄球菌、 木糖葡萄球菌、唾液链球菌嗜热亚种、乳脂链球菌、双乙酰乳酸链球 菌、耐久链球菌、粪链球菌、乳酸链球菌、和嗜热链球菌(原为唾液 链球菌嗜热亚种)。

由表1和上述讨论可知，选自由节杆菌属(Arthrobacter spp.)、 双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、 棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球 菌属(Enterococcus spp.)、哈夫尼菌属(Hafnia spp.)、克氏库克菌属 (Kocuria spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、明串球菌属(Leuconostoc spp.)、微球菌属(Micrococcus spp.)、 酒球菌属(Oenococcus spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、丙酸杆 菌属(Propionibacterium spp.)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium spp.)、 葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)和链球菌属(Streptococcus spp.) 组成的细菌属中的非致病的微生物非常有可能获得政府部门的许可， 从而构成本发明另一重要实施方式。

一些其他的非致病性微生物，包括芽孢杆菌属(Bacillus spp.)， 特别是凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)也被美国食品和药品管 理局、兽用医药中心和/或类似机构批准，被认为是可安全地用于动 物饲料中的直接饲喂微生物产品。因此，本发明的进一步重要的实施 方式是细菌宿主细胞选自由非致病的凝结芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的非致病性细菌的 组。

为了使GMO能用于食物，必须符合一系列的安全条件且必须能 够在美国得到GRAS的状态。尽管没有对“食品级”GMO构成的 官方定义，但已有工作定义被详细阐述(Johansen，(1999)Genetic engineering(b)Modification of bacteria.In：Encyclopedia of Food Microbiology(Robinson，R.，Batt，C.and Patel，P.，eds).Academic Press， London，pp.917-921)，以及至少一种符合该定义的乳球菌菌株已被确 认为GRAS且在美国已上市。该定义的一个重要元素是食品级GMO 只可含有来自相同物种的DNA。在更为广泛的食品级的定义中，来 自其他GRAS食品微生物的基因被认为是可接受的(Johansen， 1999)。在任何一种情况下，都不允许使用抗生素抗性基因作为选择 标记。在大学和研究机构内构建出的许多菌株均是为了“概念证明” 之目的，因而它们通常不需要是食品级的。因此，抗生素抗性标记由 于操作上容易而被使用。如果这些菌株被用于工业，则有必要消除所 有不适当的DNA，或重新构建更适合的菌株。尽管这样的病毒如本 发明的颗粒不含有任何基因操纵的遗传材料，只含有其自生种类的遗 传材料，从而很难被归类于GMO，但实际上关于GMOs的安全性的 讨论继续存在，以及随之而产生的本发明一有意思的关于制造嵌合颗 粒的方法的实施方式中，在加入所述两种或多种遗传要素前，细菌宿 主细胞可被认为是满足Johansen(1999)定义的食品级的微生物或食 品级的GMO。

使用这些安全的微生物保证了在嵌合噬菌体衍生的颗粒的最终 制剂中不含有毒因子(例如超抗原、内毒素、脂多糖等)，(由于它们 与这些安全的微生物没有关系)，而这些有毒因子可能是其他潜在的 非安全微生物(如大肠杆菌)所固有的。这点不同代表了本发明相对 于现有技术的重要的改进，在现有技术中，通常描述了使用潜在的非 安全的微生物来制造类似产品，例如病毒样颗粒。

通常，天然噬菌体的基因组编码一或多个成分，这些成分独自或 与其他噬菌体或细菌编码的因子协同诱导细菌宿主细胞的溶解。在本 发明的一种实施方式中，借助于噬菌体基因组编码的一个或多个成分 (“噬菌体编码的溶解成分”)的作用，颗粒从所述细菌宿主细胞中释 放。在一优选的实施方式中，噬菌体编码的溶解成分由原生遗传要素 编码，但也构想出其他的实施方式，其中至少一个噬菌体编码的融胞 成分是由不同的遗传要素编码。一种这样的情形是在至少一个噬菌体 编码的溶解成分是由与原生遗传要素不同的噬菌体基因组或原噬菌 体基因组编码，或甚至是由一个或多个反式互补遗传要素编码时出 现。尽管许多不同的因子已经与噬菌体诱导的细胞溶解建立了联系， 本发明的一个重要的实施方式是一种生产方法，在该方法中，噬菌体 基因组编码的一种或多种成分包含穴蛋白和/或细胞内溶素和/或溶解 酵素。

对生产含有嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合物的方法的优选应用 是提供含本发明的嵌合颗粒的组合物供人或动物摄取。这样的组合物 的一个例子是含有颗粒的发酵的乳制品的组合物，例如酸奶。在这类 发酵食品的情况下，在一定条件下导致形成嵌合颗粒的细菌宿主细胞 培养物与进行奶制品发酵的细菌培养物可以是同一培养物。由于细菌 /病毒系统可被认为是“安全的食品级”有机体，因此对于人类摄取 也是安全的，所以这样的含有颗粒的酸奶可上市，且可声称具有与嵌 合颗粒的附加表面展示因子有关的额外的好处。

尽管不需要进一步从可直接上市的为获得发酵的组合物的细菌 宿主细胞培养物中纯化或分离嵌合颗粒，在某些应用中，对于嵌合颗 粒的其他应用，可能会需要纯化或分离步骤。

这类应用的一个例子是应用嵌合噬菌体衍生的颗粒(例如嵌合噬 菌体、嵌合噬菌体样或嵌合噬菌体菌影颗粒)来产生疫苗，该应用要 求嵌合颗粒从细菌宿主细胞培养物中至少有一定程度的分离或纯化。 因此，本发明也提供一种获得含有至少两种不同表面展示蛋白的噬菌 体衍生的颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得组合物，从 该组合物中可按上述分离出所述嵌合噬菌体衍生的颗粒，和(ii)从组 合物中分离出嵌合噬菌体衍生的颗粒。

术语“分离的”或“纯化的”指嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合物 几乎不含多余的成分，这些成分通常是伴随着天然状态的颗粒(即产 生颗粒的细菌培养物中的非嵌合颗粒的成分，例如，细菌、细菌碎片 和生长介质成分)。特别的，这意味着至少50％的多余成分从组合物 中被除去，更优选的是至少75％的被除去，最优选的是至少99％的 多余成分从组合物中被除去。

已有技术描述了许多可用于分离噬菌体颗粒的方法。由于本发明 的颗粒在许多方面看似嵌合噬菌体样颗粒，这些方法中的很多都能用 于从组合物中分离的嵌合噬菌体衍生的颗粒。可以预期，可通过标准 的用于噬菌体纯化的方法，例如离心(包括CsCl密度离心)、聚乙二 醇(PEG)沉淀和亲和色谱来分离或纯化颗粒。这些和其他适合的分离 方法的详细描述可在Ausubel等(ed.)″Current Protocols in Molecular Biology″.John Wiley and Sons，1995；和Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press， NY，Vol.1，2，3，1989中找到。这两本书均在此并入作为参考。嵌合颗 粒还可以使用基于所述颗粒的固有物理性质的分离方法加以纯化，例 如(但不限于)微米和纳米过滤、分子大小排除和等电点聚焦。

如在此描述的，本发明提供了一种产生嵌合噬菌体衍生的颗粒 (例如嵌合噬菌体、嵌合噬菌体样或嵌合噬菌体菌影颗粒)的方法， 该嵌合噬菌体衍生的颗粒除了至少一正常的噬菌体成分外，还展示或 包含了至少一附加成分，其中，该至少一正常噬菌体成分由包含绝大 部分的噬菌体基因组(原生遗传要素)的遗传要素编码，该至少一附 加成分由不同的遗传要素(反式互补遗传要素)编码。本发明的颗粒 的一个重要的特点是它们不含有编码至少部分附加成分的序列。

尽管反式互补遗传要素只编码一个或多个嵌合颗粒的成分，原生 遗传要素通常含有绝大部分的噬菌体基因组编码大量的噬菌体蛋白。 如图1所示，三种噬菌体颗粒通常含有除至少一附加成分外的若干正 常噬菌体成分。在大多数情形下，这样的颗粒具有与天然的噬菌体隔 离种群相似的大小和外观，从该天然的噬菌体隔离种群得到原生遗传 要素。在本文中，得到原生遗传要素的天然的噬菌体隔离种群被成为 “原生颗粒”。

本发明的嵌合颗粒可只含有噬菌体成分，例如，它们可主要由原 生遗传要素编码的正常的噬菌体成分和一个或几个从反式互补遗传 要素表达的源自完全无关的病毒的噬菌体成分构成。这种情况是在当 本发明被用于产生表达噬菌体编码的毒力因子的嵌合颗粒时出现。在 本发明的另一实施方式中，颗粒除了若干正常噬菌体成分外，还展示 出至少一个附加成分，该附加成分不一定是正常噬菌体成分。本发明 描述的病毒/宿主细胞体系可主要包含较宽范围内的任意成分，其与 所形成的颗粒发生联系或结合到其上，从而是位于反式互补遗传要素 上的基因不能整合进嵌合颗粒。然而，在一优选的实施方式中，由反 式互补遗传要素编码的至少一种附加成分是蛋白。在一特别的实施方 式中，由反式互补遗传要素编码的至少一种附加成分是融合蛋白，该 融合蛋白是在引导融合蛋白到所述嵌合噬菌体衍生的颗粒表面的肽 序列和不相关的肽序列之间的融合。

许多已描述过的蛋白在噬菌体组装和释放过程中被引导到噬菌 体的表面。这种蛋白中的一类是噬菌体衣壳蛋白，是一种形成噬菌体 壳或衣壳的蛋白。当包含“功能部分”的肽融合到另一感兴趣的肽时， 融合的肽将会被引导到衣壳上，所述“功能部分”在此定义为引导蛋 白到衣壳上的噬菌体衣壳蛋白的部分。结果是感兴趣的肽，例如感兴 趣的抗原或抗原表位被引导到噬菌体壳上，并展示在嵌合颗粒的壳的 表面。从而，在本发明的一实施方式中，融合蛋白包含一肽序列，该 肽序列含有噬菌体衣壳蛋白的功能部分。除了构成所有噬菌体所必须 部分的衣壳蛋白之外，噬菌体可含有其他表面结构。与衣壳蛋白类似， 构成这些其他结构的蛋白含有信号(肽序列)，该信号引导蛋白到噬 菌体的表面。这种表面展示噬菌体蛋白的例子是那些形成噬菌体颈 部、噬菌体颈须、噬菌体尾部、噬菌体基片和/或噬菌体尾丝的蛋白。 另外，也预测出了使用这些蛋白来引导融合蛋白到噬菌体表面。

如前所讨论的，本发明的重点是提供嵌合颗粒，其主要是基于通 常被公认安全的病毒/宿主细胞体系。一组被通常认为是安全的有机 体的细菌是乳酸菌。一些工业上最为有用的乳酸菌是在乳球菌种中发 现的细菌。在真正的工业装置中，尽管非常小心避免噬菌体感染，但 噬菌体感染仍在无规律的时隔发生。因此，在本发明的一优选实施方 式中，优选含有乳球菌种以及与其相关的噬菌体的病毒/宿主细胞体 系。在一优选实施方式中，优选类似乳球菌型噬菌体c6A的噬菌体。 这种噬菌体的一个具体例子是噬菌体c2。这组噬菌体是非常复杂的 噬菌体，且许多噬菌体蛋白可被用于构建融合蛋白，其将被引导到噬 菌体的表面。因此，在本发明的一个优选实施方式中，融合蛋白包含 一肽序列，其包含噬菌体衣壳蛋白的功能部分，所述噬菌体衣壳蛋白 选自由gpL1，gpL2，gpL3，gpL4，gpL5，gpL6，gpL7，gpL8，gpL9，gpL10， gpL11，gpL12，gpL13，gpL14，gpL15，gpL16和gpL17组成的噬菌体蛋 白的组，这些噬菌体蛋白衍生自与乳球菌型噬菌体c6A类似或相同 的噬菌体，如噬菌体c2。

尽管噬菌体基因组可通过许多方法进入到细胞中，但通常最有效 的将基因组引入到宿主细菌的细胞质中的方法是通过感染。因此，在 另一优选的实施方式中，本发明涉及感染性的嵌合噬菌体或嵌合噬菌 体样颗粒。由于本发明的嵌合噬菌体菌影颗粒不含有遗传材料，从而 不能将它们的基因组引入到宿主细胞中，所以它们不被认为是感染性 的。但它们通常可表达与原生颗粒类似的“宿主细胞特异性”，从而 可黏附到特定细菌上，产生若干具有早期噬菌体感染特征的举动。因 此，本发明的一实施方式是嵌合噬菌体衍生的颗粒(例如，嵌合噬菌 体、嵌合噬菌体样或嵌合噬菌体菌影颗粒)，对于感染性的嵌合噬菌 体或嵌合噬菌体样颗粒而言是具有感染性的，或对于嵌合噬菌体菌影 颗粒而言，能够黏附到特定细菌上，产生若干具有早期噬菌体感染特 征的举动，且展现出由原生遗传要素决定的宿主特异性。

在本发明的大多实施方式中，嵌合噬菌体衍生的颗粒保持了与天 然噬菌体隔离种群相同的宿主特异性，而原生遗传要素即衍生自该天 然噬菌体隔离种群(即“原生颗粒”)。尽管存在宿主细胞特异性， 从而在大多数装置中被确定为原生遗传要素，反式互补遗传要素也被 认为可编码确定宿主细胞范围或宿主特异性的成分。因此，还构思出 了一嵌合噬菌体衍生的颗粒，其中，宿主特异性相对于天然噬菌体隔 离种群发生了改变。类似的，原生遗传要素、反式互补遗传要素或甚 至这两种类型的要素均可编码一些因子或包含基因的变异，从而导致 嵌合噬菌体衍生的颗粒，其展示出与天然噬菌体隔离种群相比的增加 的或减少的或甚至消失的感染细菌的能力，其中，原生遗传要素即衍 生自该天然噬菌体隔离种群。

根据这里定义的不具有感染性的颗粒的例子是嵌合噬菌体样或 嵌合噬菌体菌影颗粒，这是由于这些嵌合颗粒不含有任何遗传材料。

如前所述，反式互补遗传要素编码在本发明更优选的实施方式中 的融合蛋白。通常，由于具有部分噬菌体衣壳蛋白，而衣壳蛋白包含 定位信号以确保因子展示在颗粒表面，所以这种融合蛋白被引导到表 面上。然而，由反式互补遗传要素编码的因子也可通过其他机制而被 引导到噬菌体的表面上。在本发明的一实施方式中，融合蛋白能够与 病毒编码的成分发生缔合，且由于这种缔合，融合蛋白将在嵌合噬菌 体的组装和从宿主细胞释放的过程中被引导到嵌合噬菌体的表面上。 在另一实施方式中，融合蛋白含有肽序列，其能与除了包含颗粒定位 信号的部分噬菌体衣壳蛋白之外的病毒编码的成分发生缔合。由融合 蛋白缔合的病毒编码的成分可以是任意的病毒编码的成分，包括与原 生颗粒不同的病毒的成分以及存在于天然噬菌体隔离种群中的病毒 编码的蛋白，其中，所述噬菌体基因组的绝大部分(原生颗粒)即衍 生自该天然噬菌体隔离种群。类似的，融合蛋白预期被构建成能够在 细菌宿主溶胞之前和在嵌合颗粒从宿主细胞中释放出之后，与所述原 生颗粒隔离种群的病毒编码的一种或多种蛋白缔合。

融合蛋白还可进一步为所谓的“结合伴侣”的一部分。“结合伴 侣”通常是通过非共价作用而能特异性地结合到另外一部分上的物 质。结合伴侣的例子包括配体—受体、抗生蛋白链菌素—生物素、多 聚组氨酸—镍螯合物、抗体—抗原、药物—靶和酶—底物相互作用。 结合伴侣在治疗和诊断领域都极为有用。

为了避免融合蛋白必须与野生型噬菌体编码的衣壳蛋白竞争嵌 合噬菌体中的“开放”的或自由位点的情形，可使用在编码特定衣壳 蛋白作为原生遗传要素的基因中携带“破坏”突变的噬菌体基因组。 这样的破坏突变的例子有错义突变和缺失。

本发明的优选实施方式是基于相对复杂的噬菌体类型，其含有更 多的衣壳蛋白。除此之外，在一些实施方式中，还含有如噬菌体颈部、 噬菌体颈须、噬菌体尾部、噬菌体基片和/或噬菌体尾丝这些结构的 蛋白。大体上对可由一个或多个反式互补遗传要素编码的融合蛋白的 数目没有严格的限制。因此，在另一实施方式中，本发明涉及的颗粒 除了含有至少一个正常的噬菌体成分外，还含有至少两个不是由原生 遗传要素编码的附加成分。

融合蛋白的不相关的肽序列对应于融合蛋白的附加成分(即在大 多数实施方式中为非病毒部分)，并大体上可为任何序列。然而，在 优选的实施方式中，不相关的肽序列源自植物、人、动物、真菌、细 菌或病毒的基因组，或者也可以是合成的或任意产生的氨基酸序列。 特别的，序列可源自植物、人、动物、真菌或细菌的病原体。在优选 的实施方式中，不相关的肽序列是源自那些与植物、人、动物、真菌 或细菌的相互作用可能是致病的微生物。在进一步优选的实施方式 中，不相关的肽序列是源自由特定序列的氨基酸或其部分组成的毒力 因子。术语“部分”对应于允许对抗所述毒力因子的特定抗体产生的 最小长度的氨基酸序列。通常，肽的这部分构成了被称为抗原决定簇 的部分。“抗原表位”指多肽的抗原决定簇。抗原表位可只含有最少 3个氨基酸，其在空间构象上对抗原表位是独特的。通常，抗原表位 至少由6个这样的氨基酸组成，更常见的是至少由8-10个这样的氨 基酸组成。

尽管不致病，但由其中分离出不相关的肽序列的微生物仍可被认 为是无益的。这种无益的微生物的例子是那些降低饲养效率，例如是 减少由饲料中吸收的营养但不导致任何疾病的微生物。在进一步的实 施方式中，所述融合蛋白的不相关的肽序列是源自那些与植物、人、 动物、真菌或细菌相互作用并可被认为是无益的但不致病的微生物。

本发明的一项有意思的应用是将技术应用于在噬菌体疗法中延 长噬菌体颗粒在胃肠道中的保留时间。例如，黏液素—结合蛋白可表 达在噬菌体的壳上。该蛋白会将噬菌体锚定在肠内，且允许噬菌体特 异性地感染(通过其自由尾部)它的致病靶微生物。另外，噬菌体也 可用蛋白进行壳标记，这种蛋白有助于噬菌体结合到益生细菌菌株 上。这样，嵌合颗粒和益生细菌就能够容易地被一并施用，且得到益 生细菌在肠内延长的保留时间。因此，在本发明一重要的实施方式中， 所述融合蛋白的不相关的肽序列编码那些有助于和/或容许嵌合噬菌 体衍生的颗粒结合到在固体表面、生物膜、人或动物细胞或其他微生 物中发现的受体上的蛋白或肽。

融合蛋白的不相关的肽序列也可含有那些有助于和/或容许嵌合 噬菌体颗粒、噬菌体样颗粒、或噬菌体菌影颗粒有条件地结合到基质 (例如镍-氨三乙酸(Ni-NTA)金属亲和色谱基质)上的蛋白或肽(例 如多聚组氨酸)。这样的肽序列可被用于纯化所述嵌合噬菌体衍生的 颗粒。它们还可被用作标签(或抗原表位)以用于免疫接种。

在本发明的最优秀的实施方式中，融合蛋白的不相关的肽序列编 码能够引起人和/或动物体内的免疫应答的抗原和/或过敏原。

再有，融合蛋白也可是结合伴侣对的部分。现有技术中的若干例 子显示出结合伴侣在治疗和诊断领域都极为有用，因此，在本发明的 一个实施方式中，不相关的肽序列包含允许至少一个分子的特异性结 合，特别的，在融合蛋白起到细胞外受体的功能时可作为一种预期情 况。可以想到的有可能结合到这样的融合蛋白上的分子有很多。特别 的，相关的分子是具有如蛋白、脂蛋白、糖蛋白、糖类或脂质这样的 生物起源的分子，但也包括如各种金属(例如Cd，Ni，Fe)和有着非 生物起源(例如某些杀虫剂或它们的降解产品)的某些有机分子也是 相关的。

在一些情况下，毒素对各种颗粒或大的分子结构的实际结合将导 致毒素的失活或中和。也可通过加入毒素结合颗粒到溶液或悬浮液 中，使得毒素结合到颗粒上并通过离心等而从溶液或悬浮液中移除颗 粒，从而可从溶液或悬浮液中将毒素取代。因此，本发明的一个附加 实施方式是使用嵌合颗粒结合和/或中和生物毒素。如前所述，提供 嵌合颗粒给两种或多种不同展示它们的融合蛋白完全在本发明的范 围之内。预计该展示两种或多种特异性结合亲和性的嵌合颗粒，在此 称为“附加标签”将会有广泛的应用。这种有用的附加标签的例子是 在前描述过的结合伴侣。当一种附加标签是结合伴侣的成员，例如， 多聚组氨酸，而其他的标签特异性地结合到毒素上时，则这样的颗粒 可方便地通过亲和色谱移除，从而将毒素移除，此时这样的颗粒将对 于从溶液或悬浮液中移除毒素有用。类似的，附加标签可被用于嵌合 颗粒的纯化或分离。因此，本发明的另一个有意思的实施方式是一组 合物，其含有嵌合噬菌体衍生的颗粒，该颗粒展示了有助于它们结合 和/或下游纯化的附加标签。

在其他实施方式中，本发明涉及生产药物组合物的方法，该方法 包括本发明的方法中的步骤，且进一步包括将至少一所述嵌合颗粒配 成药学上可接受的形式。

如果本发明的嵌合噬菌体颗粒给动物施用，它们将作为疫苗起到 向免疫系统传递特异性抗原的作用。此外，它们还可被特异性地标记， 以T-或B-淋巴细胞为靶传递抗原物质。与减毒活疫苗或传统的去活 疫苗不同的是，不会有毒力基因水平传播到宿主的常驻菌群的可能。 进而，标记的噬菌体也不可能转换为致病的变种，而这样的转变可能 发生在减活的或活的疫苗中。因此，在最优选的实施方式中，嵌合噬 菌体衍生的颗粒被用于产生疫苗。特别的，在对可施用于人和/或动 物的黏膜表面的病毒，包括结膜、胃肠道、呼吸道和尿道的病毒考虑 后认为特别优选的是基于乳酸乳球菌的疫苗。在某些情况下，发现含 有抗原的组合物可被用于治疗过敏。因此，本发明的另一个重要的实 施方式是使用包含嵌合噬菌体衍生的颗粒的组合物治疗过敏。

多重标记的颗粒可被用于靶向和杀死癌细胞或病原体细胞。例 如，一种标记可特异地针对癌性细胞或病原体，而第二种标记可编码 毒素。有可能在这种颗粒结合到癌细胞之前由宿主中释放细胞毒素。 因此，这些颗粒可作为靶向杀伤的平台。

另外，认为嵌合颗粒可由蛋白进行标记，并使之能够特异性地结 合到壳上或覆盖在病原体上。如果要求病原体在它的宿主内结合到特 定的受体，以发挥病原体的功效(例如在肠内)，则其后病原体可被 有效地中和。这特别对于功能性食物是一项值得关注的应用。

因此，在本发明另一最优选的实施方式中，嵌合噬菌体衍生的颗 粒被用于生产组合物，该组合物通过竞争而排除病原体或不期望的微 生物。

本发明的颗粒被认为对生产组合物是特别有效的，该组合物通过 竞争而排除病原体或不期望的与人和/或动物的黏膜表面包括结膜、 胃肠道、呼吸道和尿道相关的微生物。

进一步认为这些颗粒将找到更为广阔的应用，甚至能用于生产可 通过竞争而排除病原体或不期望的微生物的组合物，这些组合物与农 用植物和/或种子相关。

益生菌构成了一类被定义为对动物或人类宿主产生有益效果的 活微生物有机体的微生物。有益效果包括改善肠内微生物群的微生物 平衡以及改善常駐的微生物群的性能。益生菌的有益效果可通过对一 组不期望的特定有机体产生直接的拮抗效应而体现，通过对这组有机 体的代谢的影响或通过对动物或人宿主免疫系统的一般刺激作用而 导致它们的数量减少。益生菌可通过产生抗细菌的化合物和/或通过 成功竞争营养和/或黏附在胃肠道的位点上而抑制不期望的肠内有机 体。此外，它们还可通过增加或减少酶活性而改变微生物代谢，或可 通过增加抗体水平或增加巨噬细胞活性而刺激免疫系统。益生菌还甚 至可表达抗肿瘤的活性或协助降低血胆固醇水平，(Fuller(1989)； Elmer(2001))。

益生菌微生物经确定属于微生物中的酵母、真菌和细菌。益生菌 制剂的一个重要方面是它必须与活的微生物有关。在本文中，可感染 宿主细胞的噬菌体和噬菌体样颗粒被认为是活的微生物。如上文和实 施例中所描述的，本发明的嵌合颗粒在施用了适当量后，可拮抗特定 的多组不期望的有机体，抑制不期望的肠内有机体，刺激免疫系统和 通过多条途径使宿主健康受益。因此，本发明的颗粒完全可被称作益 生菌微生物或益生菌试剂。于是，在本发明的一优选实施方式中，嵌 合噬菌体衍生的颗粒被用于产生益生菌组合物。尽管嵌合噬菌体菌影 颗粒在本文中不被认为是活的有机体，嵌合噬菌体菌影颗粒可在益生 菌组合物的制造过程中发挥重要作用，作为对益生菌有机体的补充， 提供给益生菌组合物某些额外的好处。

在另一实施方式中，颗粒被用于生产直接饲喂微生物组合物。这 样的直接饲喂微生物除了含有本发明的嵌合颗粒外，还可含有益生菌 细菌。

噬菌体疗法主要是利用噬菌体消除和/或减少致病的和/或其他不 期望的微生物的数目。在进一步的实施方式中，本发明描述的组合物 含有用于噬菌体疗法中的根据前面所述任何一项权利要求中的嵌合 噬菌体衍生的颗粒。这种组合物在许多情况下，是做成药物组合物的 形式，其除了含有嵌合颗粒外，还配入了药学上可接受的载体和/或 稀释剂。药学上合适的载体的例子是本领域熟知的，包括磷酸盐缓冲 生理盐水、水、乳剂、例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶 液等。含有这些载体的组合物可通过传统方法配方。对传统配方技术 的综述可参见如″The Theory and Practice of Industrial Pharmacy″(Ed. Lachman L.等，1986)或Laulund(1994)，这些在此并入作为参考。可 向受治疗者施用合适剂量的这些药物组合物。适当组合物的施用可通 过不同方法进行，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部的、 皮内、鼻内或支气管内进行施用。剂量设计将由主治医师以及一些临 床因素决定。已为医学领域所熟知，对一个患者的剂量取决于许多因 素，包括患者的大小、身体表面积、年龄、施用的具体化合物、性别、 施用的时间和途径、一般健康和其他同时服用的药物。

本发明的嵌合颗粒也可有非治疗方面的应用，以减少或控制存在 于规定环境中致病的和/或不期望的微生物的数目。因此，在本发明 的另一实施方式中，嵌合噬菌体衍生的颗粒可被特定用作对致病的和 /或不期望的微生物的生物防除剂。

本发明的嵌合颗粒可经改造而表达对一个或多个细胞毒素剂的 特异性结合亲合力，从而可用作所述细胞毒素试剂的载体。一特殊的 情况出现在细胞毒素剂是蛋白质分子时，其经翻译融合到噬菌体(衣 壳)蛋白的功能形式上。因此，本发明的进一步的实施方式是一组合 物，其包含嵌合噬菌体衍生的颗粒，通过采用不同于那些与传统的噬 菌体疗法或噬菌体生物防除相关的方法，通过传递一种或多种细胞毒 素试剂，所述组合物被用来中和、杀死和/或阻碍病原体或不期望的 微生物。

在进一步的实施方式中，通过采用不同于那些与传统的噬菌体疗 法或噬菌体生物防除相关的方法，通过将病原体或不期望的微生物从 产生对身体有害的特质的联系中排除，所述组合物被用来中和、杀死 和/或阻碍病原体或不期望的微生物。

图例：

图1.天然噬菌体颗粒的概念图(1)，嵌合噬菌体颗粒(2)，嵌 合噬菌体菌影颗粒(3)和嵌合噬菌体样颗粒(4)。核酸(DNA或 RNA)用圆圈表示，并以箭头“a”表示。表面展示的因子用小球表 示，并以箭头“b”表示。

图2.SDS-PAGE凝胶照片示出了获得了具有嵌合gpL15蛋白(即 gpL15-H)的噬菌体颗粒。泳道(lane)1，在MG1363上繁殖的φc2 (对照)；泳道2，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15)(对照)； 泳道3，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔离种群1)； 泳道4，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔离种群2)； 泳道5，从MG1363中提取的所有蛋白(对照)；泳道6，从MG1363 中提取的所有蛋白(pJMS245::I15)(对照)；泳道7，从MG1363中 提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔离种群1)；泳道8，从MG1363 中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔离种群2)；泳道9，SeeBlue2 Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA.)。

图3.蛋白质印迹(western blot)照片示出了所获得的含有 gpL15-H的嵌合噬菌体颗粒。泳道1，在MG1363上繁殖的Φc2(对 照)；泳道2，在MG1363上繁殖的φc2(pJMS245::I15)(对照)；泳 道3，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔离种群1)； 泳道4，在MG1363上繁殖的Φc2(pJMS245::I15-H)(隔离种群2)； 泳道5，从MG1363中提取的所有蛋白(对照)；泳道6，从MG1363 中提取的所有蛋白(pJMS245::I15)(对照)；泳道7，从MG1363中 提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔离种群1)；泳道8，从MG1363 中提取的所有蛋白(pJMS245::I15-H)(隔离种群2)；泳道9，SeeBlue2 Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad，CA.)。

实施例

实施例1：构建适合组成产生嵌合颗粒的宿主细胞。Construction of a Host Cells Suitable for the Constitutive Production of Chimeric Particles.

细菌菌株和生长条件。所有微生物介质均购自Becton，Dickinson & Company(Sparks，MD)。除非另外说明，所有其他试剂均为分析等 级，且购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。大肠杆菌菌株MC1061 (Huynh等，1985)和One ShotTop10(Invitrogen，Carlsbad，CA.)在 LB培养液(Luria-Bertani broth)中，通气下于37℃繁殖。乳酸乳球 菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)菌株MG1363(Gasson， 1983)和其衍生物在M17培养液辅以0.5％(w/v)葡萄糖(M17-G)中， 通气下于30℃繁殖。噬菌体c2(Φc2)和其嵌合衍生物在M17-G辅 以10mM CaCl2(M17-GC)中于30℃C下在MG1363的衍生物上繁殖。 当选用重组大肠杆菌时，视情况向介质中加入氯霉素(5μg/mL)或红 霉素(100μg/mL)。当选用重组乳酸乳球菌时，视情况向介质中加入 氯霉素(5μg/mL)或红霉素(5μg/mL)。对于固体介质，加入琼脂， 使其最终浓度为1.5％(w/v)的基部琼脂和为0.75％(w/v)的顶部琼脂。 细菌原种保持在含有15％(v/v)甘油的新鲜培养基中于-70℃。

核酸的纯化。按Sambrook等(1982)和O’Sullivan与 Klaenhammer(1993)中所分别描述的，从大肠杆菌和乳酸乳球菌分离 出少量的质粒DNA试剂。按制造商说明，使用质粒中量制备试剂盒 (Plasmid Midi Preparation Kit)(Qiagen，Chatsworth，CA)分离出大量的 质粒DNA试剂。视情况分别使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(Qiagen)或PCR纯化试剂盒(PCR Purification Kit)(Qiagen)从琼脂糖凝胶或酶反应中提取DNA。按制造商说明， 使用Lambda试剂盒(Lambda Kit)(Qiagen)制备乳酸乳球菌Φc2 基因组的DNA。DNA ligations were purified and concentrated prior to electroporation using the MinElute PCR Purification Kit(Qiagen).使用 MinElute PCR纯化试剂盒(MinElute PCR Purification Kit)(Qiagen)， 在进行电穿孔之前对连接后的DNA(DNA ligations)纯化和浓缩。

聚合酶链式反应(PCR)和重组DNA技术。使用TripleMaster DNA 聚合酶混合剂(TripleMaster DNA Polymerase Mix)(Eppendorf， Hamburg，Germany)或Ex TaqTM聚合酶(Ex TaqTM Polymerase) (TaKaRa，Shiga，Japan)，通过iCycler温度循环反应器(iCycler thermal cycler)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行PCR反应。DNA寡 核苷酸引物由Invitrogen，Inc.(Carlsbad，CA)合成。视情况将限制性内 切酶识别位点被整合进入DNA引物的5′端，以助PCR产物的克隆。 连接反应(Ligation reactions)使用T4 DNA连接酶(Invitrogen， Carlsbad，CA.)并按制造商说明进行。视情况可使用小牛小肠道碱性 磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase)(Promega，Madison，W1) 以助PCR产物的克隆。DNA测序反应由Northwoods DNA，Inc. (Solway，MN)进行，并使用Lasergene v5.0(DNAstar，Inc.，Madison，W1) 或Clone Manager 6.0版本(Scientific and Educational Software， Durham，NC)对DNA序列进行分析。

细菌转化。所有的电穿孔均使用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行，装置调配到25μF，2.5kV，和200Ω。 按Sambrook等(1982)中所描述制备电穿孔法胜任大肠杆菌 MC1061；按HoIo和Nes(1989)中所描述的方法制备电穿孔法胜任乳 酸乳球菌MG1363。

基因制品L15(gpL15-H)表达系统。尽管也可使用其他肽和蛋白， 在该项研究中，gpL15被用作在Φc2衣壳表面整合以及展示模型抗原 的载体。这种43.2kDa的蛋白已知为Φc2衣壳的主要结构成分 (Lubbers等，1995)，并参与到扁长头部的噬菌体的宿主细胞识别 (Stuer-Lauridsen等，2003)。引物JS16_F-gpL15和JS36_R-gpL15-H被 用于扩增I15-H(SEQ ID No.1)，这是乳酸乳球菌Φc2I15-H基因的重 组版本。I15-H编码gpL15-H，其是一翻译融合蛋白，在其羧基端展 示了六个邻近的组氨酸残基(六聚组氨酸(hexahistidine))(SEQ ID No. 2)。作为对照，引物JS16_F-gpL15和JS17_R-gpL15被用于扩增来自 乳酸乳球菌Φc2的基因组(对照)的野生型(未标记的)I15基因。 BamHI内切限制酶识别位点被整合入引物JS16_F-gpL15， JS17_R-gpL15和JS36_R-gpL15-H的5′端。所得PCR产物用BamHI 限制，并独立地连接到由BamHI限制的pJMS245(＝pTRK687，Sturino (2002))，其编码氯霉素抗性，作为可选的标记。所得质粒DNA经纯 化和电穿孔而进入电穿孔法胜任大肠杆菌中。氯霉素抗性菌落形成单 元(CFUs)经筛选以用于呈现插入的基因，插入基因的定位由限制分析 确定，并由DNA测序确定。含有正义定位的插入基因的质粒 pJMS245::I15和pJMS245::I15-H被独立地电穿孔进入到MG1363。 氯霉素抗性菌落形成单元经筛选以用于pJMS245::I15或pJMS245:: I15-H的呈现。

使用的引物：

JS16_F-gpL15(SEQ ID No.3)

5′-CGCGGATCCAGATCTCACAATAGAAAGGGTATATAAATG-3′

JS17_R-gpL15(SEQ ID No.4)

5′-CGCGGATCCAGATCTCTATCCATTGTGTAGCCCTC-3′

JS36_R-gpL15-H(SEQ ID No.5)

5′-CGCGGATCCCCCGGGCTAATGATGATGATGATGATGTCCATTG TGTAGCCCTCTCATTCC-3′

实施例2：嵌合噬菌体的制备

噬菌体的沉淀和用SDS-PAGE进行显示。对数中期的乳酸乳球 菌MG1363，MG1363(pJMS245::I15)和两个独立的MG1363 (pJMS245::/I15)隔离种群的培育物分别被野生型Φc2感染，感染复数 (MOI)为0.1。可允许裂解性感染进行，直到培养物的细胞被完全 溶解。按Sambrook等(1982)中所描述的方法，用聚乙二醇(PEG) 沉淀法浓缩效价＞5×109溶菌斑形成单位(PFU)/ml的500mL的噬 菌体溶菌液。按制造商说明，使用Novex 4-12％ Bis-Tris Gels (Invitrogen，Carlsbad，CA.)，在1×MOPS缓冲液中，对经浓缩的噬菌 体溶菌液在还原条件下进行SDS-PAGE。作为对照，通过珠子撹打 (bead beating)，也从未感染的对照培养物中分离出总蛋白。

图2示出了由SDS-PAGE获得的代表结果。通过珠子撹打(bead beating)，从未感染的对照培养物中分离出总蛋白(泳道5-8)，并与 PEG-沉淀的野生型Φc2(泳道1-2)和嵌合标记的Φc2(泳道3-4) 比较。在泳道1-4的gpL15蛋白如同42-kDa的蛋白那样移动，这与 文献报道的一致(Lubbers等，1995)。与预料的相同，除了野生型(噬 菌体编码的)gpL15蛋白外，只有那些在MG1363(pJMS245::I15-H) 上繁殖的噬菌体颗粒被发现含有42+-kDa gpL15-H的蛋白，而该种 蛋白是通过宿主编码的质粒产生的反式结构。与此相反，gpL15-H蛋 白的表达的水平不足以在总蛋白提取物中显示出来，该总蛋白提取物 是从生长在无噬菌体感染(泳道7-8)中的两个独立的MG1363 (pJMS245::I15-H)隔离种群中分离出的。然而，gpL15-H蛋白在泳道 3-4中的清楚的显现表明了gpL15-H蛋白是：(i)由MG1363 (pJMS245::I15-H)表达，且(ii)当被宿主以反式表达时能有效地整合 进入噬菌体颗粒中。并且，由于在泳道3-4中的gpL15-H的强度几乎 与那些在泳道1-2中显示的野生型gpL15蛋白的强度相称，这就表明 了由于在感染前的高度表达，大多数的野生型(噬菌体编码的)gpL15 被宿主编码的gpL15-H蛋白所正确地取代。

整合进入嵌合噬菌体颗粒中的gpL15-H的免疫检测。按制造商 说明，使用Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell(Bio-Rad)，将 SDS-PAGE凝胶中的蛋白转移到0.45μm的Invitrolon PVDF膜上。使 用WesternBreeze发色试剂盒(Chromagenic Kit)(Invitrogen，Carlsbad， CA.)来确定六聚组氨酸标签的存在。代表结果示于图3。在蛋白质印 迹法分析中，小鼠抗六聚组氨酸IgG1抗体(Roche)被用作初次抗 体，而碱性磷酸单酯酶-结合的抗小鼠1gG抗体(Invitrogen，Carlsbad， CA.)在发色检测中被使用。如所预料的，gpL15-H仅在繁殖于 MG1363(pJMS245::I15-H)(泳道3-4)隔离种群上的噬菌体中被检测 到，但在从未感染噬菌体的MG1363(pJMS245::I1S-H)对照培养物(泳 道7-8)中分离出的总蛋白中，为一可见但不明显的带。如在 SDS-PAGE凝胶上所示，泳道3-4中的gpL15-H带强度比泳道7-8中 的大，这表明gpL15-H蛋白通过整合进入噬菌体颗粒中而得到浓缩。

实施例3：将gpL15-H抗原整合到缺乏gpL15-H编码基因和邻近质粒 DNA的嵌合Φc2颗粒中。

质粒转换频率的评价。按Birkeland和HoIo(1993)所描述那样进 行转换研究，从而估计编码抗原重组融合蛋白的由宿主编码的质粒错 误地整合进入噬菌体颗粒的频率(表2)。MG1363天生对氯霉素敏感， 其自发突变为对氯霉素抗性的频率极低，浓度为5μg/mL(＜1.9×10-9)。 早先在乳酸乳球菌MG1363(pJMS245)，MG1363(pJMS245::I15) 和MG1363(pJMS245::I15-H)上繁殖经无菌过滤的噬菌体，在 MG1363的存在下培养，检测MG1363转化成氯霉素抗性显型 (phenotype)的频率。在所有情况下，均未观察到氯霉素抗性的转 导体。这些结果表明，现有系统是制备由无同源宿主编码的核酸编码 敢兴趣的抗原的嵌合标记的噬菌体颗粒的优异平台。

表2.质粒转换频率a。   质粒   PFU/mL   氯霉素抗性转导体   每mL   每PFU   pJMS245   6.3×108   0   ＜1.6×10-9   pJMS245::I15   7.0×108   0   ＜1.4×10-9   pJMS245::I15-H   5.5×108   0   ＜1.8×10-9

a每个结果均是两次独立实验的平均值。

实施例4：构建适合条件性产生嵌合颗粒的宿主细胞。

pH-诱导的gpL15-H表达系统的构建。Pst1限制内切酶识别位点 被整合入引物JS14_F-pH和JS15_R-pH的5′端。使用JS14_F-pH和 JS15_R-pH，由载体pAMJ586(Madsen等，1999)扩增含pH-诱导的启 动子P170(GenBank Accession Number AJ011913)的118碱基对(bp) 片段。PCR片段被Pst1限制，并连接到可复制大肠杆菌和乳酸菌的穿 梭载体pJMS124的Pst1位点，其编码红霉素抗性作为一可选标记。 所得质粒DNA经纯化并独立地由电穿孔进入到电穿孔法胜任大肠杆 菌中。红霉素抗性CFUs经筛选以用于pJMS124::P170的呈现。使用 pJMS124-特异性引物M13F或M13R，并结合使用引物JS14_F-pH， 由PCR确定P170插入基因的定位。

引物JS16_F-gpL15和JS17_R-gpL15被用于扩增含野生型I15的 来自乳酸乳球菌Φc2(对照)基因组的PCR片段。如上所述，引物 JS16_F-gpL15和JS36_R-gpL15-H再次被用于扩增编码gpL15-H的 I15基因的重组版本。这些DNA片段由BamHI限制，并独立地连接 到BamHI限制的pJMS124。所得质粒DNA经纯化并独立地由电穿 孔进入到电穿孔法胜任大肠杆菌中，红霉素抗性CFUs经筛选，以用 于pJMS124::I15或pJMS124::I15-H的呈现。含有正义定位的插入基 因的重组质粒被独立地电穿孔进入乳酸乳球菌MG1363中。红霉素抗 性CFUs经筛选，以用于pJMS124::P170::I15或pJMS124::P170:: I15-H的呈现。使用该系统，可按别处所描述(Madsen等，1999)，通 过用乳酸减少培养基的pH到pH5.5以20分钟来刺激pH诱导的启 动子的转录。诱导的蛋白质翻译期后，可将pH提高回pH7.0，再用 Φc2在MOI为0.1下感染平衡的培养物。这样，如果裂解性感染能够 进行至少一个裂解周期或直到培养物完全溶解，就可得到嵌合标记的 噬菌体。

JS14_F-pH(SEQ ID No.6)

5′-AAAACTGCAGGAACTATGAATATCCACTCC-3′

JS15_R-pH(SEQ ID No.7)

5′-AAAACTGCAGTAGACAACAAAATAGTAGAAG-3′

M13F(SEQ ID No.8)

5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′

M13R(SEQ ID No.9)

5′-AACAGCTATGACCATG-3′

实施例5：表达F18-型菌毛的大肠杆菌菌株的竞争排除

为了展示竞争排除的原理，设计出以下实验，使用表达F18-型菌 毛的大肠杆菌菌株作为致病有机物的模型。

表达F18-型菌毛的大肠杆菌菌株(ECF18)，已知导致猪的断奶后 下痢(post-weaning diarrhea)和水肿病(Ha等，2003)。具体的，F18 黏附素(adhesin)(FedF)(位于这些菌毛的端部)对调节特异性附着到 猪胃肠道负责(Smeds等，2001)。在本实验中，根据本发明，FedF 的功能性形式将在嵌合颗粒的表面展示。给猪喂食不同量的这些颗 粒，并观察是否这些颗粒竞争地排除ECF18细菌。

在实验中，由乳酸乳球菌噬菌体c2构建了表达了融合蛋白的载 体，该融合蛋白含有FedF黏附素(来自F18+猪-病原体大肠杆菌F107 /86)和gpL15衣壳蛋白。通过SOEing PCR(Horton，R.M.，1995)，完 整的fedF基因被融合进完整的I15基因的5′或3′。按制造商说明， 使用T4 DNA(Gibco-BRL Life Technologies，Inc.)连接酶将融合等位 基因连接到pJMS124::P170(3α)。按制造商说明，使用微型洗提试剂 盒(MiniElute Kit)(Qiagen)纯化所得质粒(pJMS124::P170::I15::fedF) DNA。然后，按制造商说明，使用Bio-Rad基因导入仪(Gene Pulser) (Bio-Rad Laboratories)以及Sambrook等(1989)的方法，将该连接电穿 孔进入到电穿孔法胜任大肠杆菌。红霉素抗性菌落经筛选，以用于 pJMS124::P170::I15-H::fedF的呈现。如Holo和Nes(1995)中所描述， 这些质粒将被电穿孔进入乳酸乳球菌MG1363。除了使用 pJMS124::P170::I15::fedF外，嵌合噬菌体将通过以上实施例2中表示 的方法制备。

在确定时间内，以确定量将经纯化所得的嵌合噬菌体喂食给猪 (测试)。第二组猪(对照)不会被喂食嵌合噬菌体，而喂食相当剂 量的无菌盐水。然后，两组猪(测试和对照)均接种确定剂量的大肠 杆菌F107/86。接种后，观察断奶后下痢和水肿病的症状。通过蛋白 质杂交(western hybridization)监视嵌合颗粒的排泄物一段时间，并 通过定量PCR监视大肠杆菌F107/86的释放。

在此描述了本发明的优选实施方式，包括发明人知道的实施本发 明的最佳实施方式。在阅读了上述说明后，这些优选实施方式做出变 异对于本领域技术人员而言是显而易见的。发明人可预计到本领域的 技术人员会恰当地应用这样的变异，且也可预计到本发明可在不局限 于此处描述的范围内加以实施。因此，本发明包括专利法允许范围内 的所有对权利要求中的主题的等同的改变。此外，除非另有指出或与 本文有明显抵触，对上述要素的各种可能的组合也包括在本发明内。

在本专利文件中所引用的文献将全文并入作为参考。

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                            序列表

<110>科·汉森有限公司

<120>嵌合噬菌体衍生的颗粒，它们的制造方法和用途

<130>P2085PC00

<160>9

<170>专利文本3.3

<210>1

<211>1388

<212>DNA

<213>乳酸乳球菌噬菌体fc2噬菌体

<400>1

ttttgtctct cctagttgta cctcatgtcg taaggcaaga gcatggcttg aaaaacataa    60

tattccattt aaggaaagaa acattttttc tgagccatta actaaagaag aattattaaa    120

gatcctctag agtcgacctg cagccaagct ttcgggggat ccagatctca caatagaaag    180

ggtatataaa tgatttcatg gttaaatttc gaggagttat taattcataa ccctattgag    240

ttgataaacc ctagtaaaga tacaataaga gtagcaatga gccaaaagca gtatatcgag    300

tttttcagca ataaatacac ttataacggt ctgtattatg acgaagaaat ggacttctgt    360

ttattttatt atgcagaccc attacaaagc tacaaagagg gcgatgtgta cgctcaagga    420

tatattgatg tagaaatgaa aatataccgc gtaaaatggt tgtgtaacgt ttctattagt    480

cgtcctagtg gtttattgca aactactgac ggaacccaag gagtgccaca agagggcgga    540

aaatacactc acacagcatg gtcttacagt gcagacggta cagacagatt ctcaactgtt    600

tatcctaatt tgaatttatt gaatgggact aaagatttta atggggattg gataaatgga    660

ggtgtttggg gaaacgatgg aaaatataaa ggcttaactg ttaaaagtta tcaaaaagca    720

tgggacggaa tgttcaaaaa atatattgtc ccacaagacg gtttatatac atggtctagt    780

tttgtcaaga gtgaatcaga cacctctgac atttttagag tattgttcat aaataataag    840

gaatttccta ttgttgggct tggtcataaa tttgattggc ttcgtgattc cgtaacagta    900

cctctaaaaa aaggcgatga agtcatattt aactatggta atttaaaaaa taatggaggt    960

aaattaagtg ttgctggtta taaactagaa tcaggttcaa ttgccactcc ttggatgccc    1020

tcagctagcg aagtcacaac ttctgacggt cctagctaca tcggtcaata tacagattac    1080

acgctagagg acagtacaaa ccctagttct tacacttgga gagaaatacg agaggacaaa    1140

tggaacgtta caaaaatagg tatgcttgta agtccacaag ataaacaaat tacaatggtt    1200

caagcagggg cattaatgag gtgtggaatt aataacgaca ttacaggttg gacagacgga    1260

acaacacaat taaattacag cggtcaagat tttataattg acggttatgg aatgagaggg    1320

ctacacaatg gacatcatca tcatcatcat tagcccgggg gatccgtcga cctgcagcca    1380

agctttcg                                                             1388

<210>2

<211>387

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌噬菌体fc2噬菌体

<400>2

Met Ile Ser Trp Leu Asn Phe Glu Glu Leu Leu Ile His Asn Pro Ile

1               5                   10                  15

Glu Leu Ile Asn Pro Ser Lys Asp Thr Ile Arg Val Ala Met Ser Gln

            20                  25                  30

Lys Gln Tyr Ile Glu Phe Phe Ser Asn Lys Tyr Thr Tyr Asn Gly Leu

        35                  40                  45

Tyr Tyr Asp Glu Glu Met Asp Phe Cys Leu Phe Tyr Tyr Ala Asp Pro

    50                  55                  60

Leu Gln Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Val Tyr Ala Gln Gly Tyr Ile Asp

65                  70                  75                  80

Val Glu Met Lys Ile Tyr Arg Val Lys Trp Leu Cys Asn Val Ser Ile

                85                  90                  95

Ser Arg Pro Ser Gly Leu Leu Gln Thr Thr Asp Gly Thr Gln Gly Val

            100                 105                 110

Pro Gln Glu Gly Gly Lys Tyr Thr His Thr Ala Trp Ser Tyr Ser Ala

        115                 120                 125

Asp Gly Thr Asp Arg Phe Ser Thr Val Tyr Pro Asn Leu Asn Leu Leu

    130                 135                 140

Asn Gly Thr Lys Asp Phe Asn Gly Asp Trp Ile Asn Gly Gly Val Trp

145                 150                 155                 160

Gly Asn Asp Gly Lys Tyr Lys Gly Leu Thr Val Lys Ser Tyr Gln Lys

                165                 170                 175

Ala Trp Asp Gly Met Phe Lys Lys Tyr Ile Val Pro Gln Asp Gly Leu

            180                 185                 190

Tyr Thr Trp Ser Ser Phe Val Lys Ser Glu Ser Asp Thr Ser Asp Ile

        195                 200                 205

Phe Arg Val Leu Phe Ile Asn Asn Lys Glu Phe Pro Ile Val Gly Leu

    210                 215                 220

Gly His Lys Phe Asp Trp Leu Arg Asp Ser Val Thr Val Pro Leu Lys

225                 230                 235                 240

Lys Gly Asp Glu Val Ile Phe Asn Tyr Gly Asn Leu Lys Asn Asn Gly

                245                 250                 255

Gly Lys Leu Ser Val Ala Gly Tyr Lys Leu Glu Ser Gly Ser Ile Ala

            260                 265                 270

Thr Pro Trp Met Pro Ser Ala Ser Glu Val Thr Thr Ser Asp Gly Pro

        275                 280                 285

Ser Tyr Ile Gly Gln Tyr Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Asp Ser Thr Asn

    290                 295                 300

Pro Ser Ser Tyr Thr Trp Arg Glu Ile Arg Glu Asp Lys Trp Asn Val

305                 310                 315                 320

Thr Lys Ile Gly Met Leu Val Ser Pro Gln Asp Lys Gln Ile Thr Met

                325                 330                 335

Val Gln Ala Gly Ala Leu Met Arg Cys Gly Ile Asn Asn Asp Ile Thr

            340                 345                 350

Gly Trp Thr Asp Gly Thr Thr Gln Leu Asn Tyr Ser Gly Gln Asp Phe

        355                 360                 365

Ile Ile Asp Gly Tyr Gly Met Arg Gly Leu His Asn Gly His His His

    370                 375                 380

His His His

385

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物JS16_F-gpL15

<400>3

cgcggatcca gatctcacaa tagaaagggt atataaatg                           39

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物JS17_R-gpL15

<400>4

cgcggatcca gatctctatc cattgtgtag ccctc                               35

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物JS36_R-gpL15-H

<400>5

cgcggatccc ccgggctaat gatgatgatg atgatgtcca ttgtgtagcc ctctcattcc    60

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物JS14_F-pH

<400>6

aaaactgcag gaactatgaa tatccactcc                                     30

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物JS15_R-pH

<400>7

aaaactgcag tagacaacaa aatagtagaa g                                   31

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物M13F

<400>8

gtaaaacgac ggccagt                                                   17

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物M13R

<400>9

aacagctatg accatg                                                    16