Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Pflanzenpathogene sowie Verfahren zur Erzeugung erhöhter Pathogenresistenz in Pflanzen

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen

Pflanzenpathogene sowie das Verfahren zur Erzeugung erhöhter Pathogenresistenz in Pflanzen mittels der Beeinflussung der intrazellulären Konzentration von

Inositolpyrophosphaten, insbesondere von InsPe.

Pflanzen sind ständig Pflanzenpathogenen ausgesetzt. Insbesondere sind hierbei herbivore Insekten und deren Larven, sowie Pilze und Pilz-ähnliche Erreger (zB Oomyceten) zu nennen. Konservative Schätzungen gehen davon aus, dass die agronomischen Schäden, die allein durch Arten der Pilzgattung Botrytis verursacht werden, weltweit ca. 1 Milliarde Euro /Jahr betragen ¹ . Die hierbei entstehenden Schäden werden nicht nur durch direkten Ernteverlust, sondern auch durch den Qualitätsverlust von Produkten (zB durch Anreicherung von Mycotoxinen) verursacht.

Eine konventionelle Methode zur Bekämpfung von Insekten und pilzlichen Erregern ist die Verwendung von chemischen Pflanzenschutzmitteln, wobei unter diesen Maßnahmen häufig ein Teil des Ertrags verloren geht. Der Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel bei Nutzpflanzen kann negative Auswirkungen auf Menschen und Umwelt haben. Außerdem sind diese Maßnahmen sehr kosten- und

arbeitsintensiv. Darüber hinaus entwickeln die mit chemischen Pflanzenschutzmitteln zu bekämpfenden Krankheitserreger häufig Anpassungsmechanismen, so dass solche Maßnahmen oft nicht die gewünschte Schutzwirkung erzielen.

Eine Alternative zum Einsatz chemischer Mittel ist die Nutzung Insekten- und Pilz- resistenter Sorten. Eine Züchtung neuer Sorten mittels der herkömmlichen

Pflanzenzüchtung ist wegen der Komplexität von Pflanzengenomen sehr langwierig und schwierig; Die herkömmliche Pflanzenzüchtung nutzt meist spontane oder induzierte Mutationen, deren Ausprägungen ungezielt durch äußere Einflüsse (z. B. Kälteschocks oder radioaktive Bestrahlung) hervorgerufen werden.

Eine Alternative zur herkömmlichen Züchtung stellt die Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen dar. Dabei werden in das Erbgut der Pflanzen gezielt Gene mit gewünschten Eigenschaften eingeschleust. Derzeit werden als gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere herbizid- und insektenresistente Pflanzensorten vermarktet. Das Ziel der neuen Sortenherstellung ist dabei die Ertragssteigerung unter widrigen Bedingungen, wie unter Trockenstress oder Insektenbefall.

Vor allem werden derzeit gentechnisch veränderte Mais- und Baumwollpflanzen mit Insektenresistenz angebaut. In den meisten Fällen leitet sich diese Eigenschaft aus dem Bt-Toxin ab, welches von einem in die Pflanzen übertragenen Gen kodiert wird. Das Gen stammt aus dem Bodenbakterium Bacillus thuringiensis, welches diesen Wirkstoff natürlicherweise produziert. Eines der Probleme dieser Strategie ist jedoch, dass sich bereits die ersten Resistenzen bei Pflanzenschädlingen entwickelt haben. Außerdem wurde in vielen wissenschaftlichen Arbeiten gezeigt, dass der Bt-Mais Schmetterlinge schädigt und zahlreiche andere Nichtzielorganismen gefährdet. Bt- Toxine werden nur langsam abgebaut, reichern sich im Boden an und werden in der Nahrungskette weitergegeben. Ähnliche wie der Einsatz von Bt-Toxinen im

biologischen Pflanzenschutz, sowie bei der Bekämpfung von Stechmücken, birgt daher auch der Anbau von Bt-Mais demzufolge vielfältige Risiken für die Artenvielfalt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Pflanzen mit erhöhter

Resistenz gegen Pflanzenpathogene, sowie Verfahren zur deren Herstellung bereit zu stellen, denen die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten längerfristigen Toxizität von Wirkstoffen, zB durch Anreicherung im Boden, nicht anhaften. Darüber hinaus soll durch Bereitstellen solcher Pflanzen bzw. Verfahren das Spektrum möglicher Maßnahmen gegen Pathogene erweitert und dadurch die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung minimiert werden.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der Pflanzen gelöst, bei denen die intrazelluläre Konzentration von Inositolpyrophosphaten lnsP ₇ und / oder InsPe im Vergleich zur Wildtyppflanze erhöht ist.

In tierischen Systemen wurden Inositolpyrophosphate als wichtige intrazelluläre Signalmoleküle beschrieben. In der vorliegenden Erfindung wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die Proteine VIH2 und VIH1 die Phosphorylierung von

Inositolpyrophosphaten ΙηβΡβ und lnsP ₇ katalysieren können und dass VIH2 in ^rab/ ^' c/ops/s-Sämlingen vor allem für die Synthese des Inositolpyrophosphats InsPe verantwortlich ist. Das /-/2-Transkript wird in erster Linie in verschiedenen vegetativen Geweben exprimiert und sowohl durch mechanische Verwundung, als auch durch Raupenbefall induziert, wohingegen WHi-Transkript vor allem in den Pollen akkumuliert.

In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass VIH2 (GenBank Accession: At3g01310) an der Pathogenabwehr in Pflanzen beteiligt ist (s.

Ausführungsbeispiele). Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird insbesondere durch die Bereitstellung einer Pflanze mit induzierbarer oder erhöhter Expression wenigstens eines Proteins gelöst, welches an der Synthese von Inositolpyrophosphaten, insbesondere von InsPe, beteiligt ist. In einer Ausführung der Erfindung handelt es sich um eine Pflanze, bei der die Expression und / oder die Aktivität des durch die Nukleotid-Sequenz 2 (GenBank Accession: At3g01310) kodierten Proteins VIH2, oder eines homologen Proteins, welches in der Lage ist, Inositolpyrophosphate, insbesondere InsPe, zu synthetisieren, in der gesamten Pflanze oder in spezifischen Geweben induzierbar oder im Vergleich zur Wildtyppflanze erhöht ist.

In einer anderen Ausführung der Erfindung handelt es sich um eine Pflanze, bei der die Expression und / oder Aktivität des durch die Nukleotid-Sequenz 1 (GenBank Accession: At5g 15070) kodierten Proteins VIH1 , oder eines homologen Proteins, welches in der Lage ist, Inositolpyrophosphate, insbesondere InsPs, zu

synthetisieren, in der gesamten Pflanze oder in spezifischen Geweben induzierbar oder im Vergleich zur Wildtyppflanze erhöht ist.

Die Nukleotid-Sequenz 1 bzw. die Nukleotid-Sequenz 2 können dergleichen

Pflanzenart entstammen, also homolog exprimiert werden, oder aus einem anderen Organismus stammen, also heterolog exprimiert werden. Die heterologe Expression kann hierbei von Vorteil sein, da postranskriptionelle bzw. postranslationale

Regulationsmöglichkeiten im Wirtsorganismus (zB Deaktivierung des Enzyms bei Überproduktion) häufig umgangen werden können.

Die Induzierbarkeit von VIH2, VIH1 oder ihren homologen Proteinen kann durch die dem Fachmann bekannten Verfahren erreicht werden. So kann die Expression entsprechender Nukleotid-Sequenzen beispielsweise unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors in der Zielpflanze erfolgen. Bekannte induzierbare

Expressionssysteme, die bereits erfolgreich in Arabidopsis, Tabak, Reis, oder Mais verwendet wurde, bestehen normalerweise aus zwei Komponenten: einem (häufig Chimären) Transkriptionsfaktor, der konstitutiv oder gewebespezifisch exprimiert wird, und dem eigentlichen Promotor, der die Expression der erwünschten Nukleotid- sequenz reguliert. Dieser Promoter kann vom Chimären Transkriptionsfaktor durch einen externen Stimulus aktiviert werden. Bekannte Beispiele sind Ethanol- inuzierbare ("AlcR/AlcA"-System), Dexamethasone-induzierbare (GR-Fusionen, GVG- und pOp/LhGR-Systeme), ß-Estradiol-induzierbare (XVE/OlexA-System) und Hitzeschock-induzierbare Expressionssysteme.

Zur induzierten Expression könnten auch in der Zielpflanze natürlich vorkommende Promotoren, die beispielsweise durch Pathogene induziert werden, verwendet werden. Bekannte Beispiele sind zB Promotoren, welche die Expression der Transkripte der im Jasmonat-Haushalt wichtigen JAZ („jasmonate ZIM-domain")- Proteine regulieren und in allen höheren Pflanzen vorkommen. Die erhöhte Expression (Überexpression) von VIH2, VIH1 oder ihren homologen Proteinen kann durch die dem Fachmann bekannten Verfahren erreicht werden. So kann die Expression entsprechender Nukleotid-Sequenzen unter der

transkriptionellen Kontrolle eines konstitutiven Promotors erfolgen, zB des

Blumenkohlmosaikvirus-Promotors CaMV 35S oder eines Ubiquitin (UBQ)- Promotors. Denkbar ist auch die Verwendung gewebespezifischer Promotoren, die zB nur in den potentiell durch Pathogen zu befallenen Geweben natürlicherweise von der Pflanze exprimiert werden, wie beispielsweise blatt-, frucht- oder

samenspezifische Promotoren. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Pflanzen resistenz gegen Pflanzenpathogene, wobei die intrazelluläre Konzentration von

Inositolpyrophosphaten lnsP ₇ und / oder InsPe, beeinflusst oder im Vergleich zur Wildtyppflanze erhöht wird. Die intrazelluläre Konzentration von Inositolpyrophosphaten lnsP und / oder von InsPe kann insbesondere durch eine induzierbare oder konstitutive Expression und / oder Aktivität von VIH2, VIH1 oder ihren homologen Proteinen erreicht werden.

In einer alternativen Ausführung wird die intrazelluläre Konzentration von

Inositolpyrophosphaten lnsP ₇ und / oder lnsP ₈ , erhöht, indem die Pflanzen mit dem Substrat für lnsP (dem Vorläufer von InsPe), mit InsPe und / oder mit lnsP ₇ - oder InsPe-Derivaten, zB in Form von Spritzen, Sprühen o.ä. behandelt werden. Hierbei sind vor allem membranpermeable Ester von Interesse, wie sie beispielsweise zur exogenen Applikation des Botenstoffs InsP _ß entwickelt wurden ² . Hierbei wird die Aktivität von in der Zelle natürlich vorkommenden Esterasen ausgenutzt, die nach Aufnahme des Derivats zu einer Freisetzung des aktiven Inositolphosphats bzw. des Inositolpyrophosphats führen. Bei den Pflanzenpathogenen, gegen die die erfindungsgemäße Pflanze resistent ist, handelt es sich insbesondere um herbivore Insekten, zB Larven von

landwirtschaftlich relevanten Schädlingen, wie des kleinen Kohlweißlings oder des Eulenfalters, sowie um pathogene Pilze, wie nekrotrophe Pilze, zB Vertreter der Gattungen Alternaria oder Botrytis.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie zB der Expression des Bt-Toxins aus dem Bakterium Bacillus thuringiensis in Pflanzen, besteht darin, dass in der erfindungsgemäßen Pflanze endogene Mechanismen zur Erhöhung von Resistenz gegen

Pflanzenpathogene und Umweltstress vorteilhaft ausgenutzt werden können. Weil es dabei um pflanzeneigene und nicht um artfremde Gene und Substanzen geht, kann davon ausgegangen werden, dass die Akzeptanz solcher Pflanzen in der

Bevölkerung besser ist, als es bei herkömmlichen genetisch veränderten Pflanzen der Fall ist. Außerdem ist nicht zu erwarten, dass der landwirtschaftliche Einsatz erfindungsgemäßer Pflanzen gravierende Auswirkungen auf Nichtzielorganismen und auf die Umwelt haben wird, wie die Nutzung herkömmlicher Insektizide oder der Anbau von Bt-Pflanzen. Ferner kann davon ausgegangen werden, dass die

Resistenzbildung von Schädlingen im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen langsamer auftritt, da die gesamte pflanzliche

Abwehrmaschinerie gegenüber Pathogenen durch Inositolpyrophosphate induziert werden kann und nicht nur einzelne Toxine.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand des unten beschriebenen Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die Figuren beschrieben.

Fig. 1 : Arabidopsis VIH2 Funktionsverlustmutanten zeigen eine verminderte Resistenz gegen Larven des Kleinen Kohlweißlings {Pieris rapae). Die

Larvenentwicklung wurde in einem sogenannten 'no choice' Assay untersucht.

Hierbei wird je eine Raupe im Larvenstadium L1 auf eine einzelne, 5-Wochen alte Pflanze des angegebenen Genotyps gebracht, und durch eine Gaze am Entkommen gehindert. Col-0 bezeichnet den verwendeten Wildtyp Arabidopsis thaliana (Acker- Schmalwand) ökotyp, vih2-3 und vih2-4 sind VIH2 Funktionsverlustmutanten im Col- 0 Hintergrund. Das Frischgewicht der Raupen wurde nach 7 Tagen bestimmt. Die Werte geben den Mittelwert (± Standardfehler) an (n=20). Statistisch signifikante Unterschiede werden durch ein Sternchen angezeigt (t-Test; * p < 0.02).

Fig. 2: Arabidopsis VIH2 Funktionsverlustmutante zeigt eine verminderte Resistenz gegen Larven des Eulenfalters Mamestra brassicae (Kohleule). Die

Larvenentwicklung wurde in einem sogenannten 'no choice' Assay untersucht.

Hierbei wird je eine Raupe im Larvenstadium L1 auf eine einzelne, 5-Wochen alte Pflanze des angegebenen Genotyps gebracht, und durch eine Gaze am Entkommen gehindert. Col-0 bezeichnet den verwendeten Wildtyp Arabidopsis thaliana (Acker- Schmalwand) Ökotyp, vih2-4 ist eine VIH2 Funktionsverlustmutanten im Col-0 Hintergrund. Das Frischgewicht der Raupen wurde nach 8 Tagen bestimmt. Die Werte geben den Mittelwert (± Standardfehler) an (n=20). Statistisch signifikante Unterschiede werden durch ein Sternchen angezeigt (t-Test; ^* p < 0.02).

Fig. 3: Arabidopsis VIH2 überexprimierende Linien zeigen eine erhöhte

Resistenz gegen Larven des Eulenfalters Mamestra brassicae (Kohleule). Die

Larvenentwicklung wurde in einem sogenannten 'no choice' Assay untersucht.

Hierbei wird je eine Raupe im Larvenstadium L1 auf eine einzelne, 5-Wochen alte Pflanze des angegebenen Genotyps gebracht, und durch eine Gaze am Entkommen gehindert. Col-0 bezeichnet den verwendeten Wildtyp Arabidopsis thaliana (Acker- Schmalwand) Ökotyp,„CaMV 35S:VIH2" sind transgene Pflanzen, in denen die Kinasedomäne des wildtypischen VIH2 Gens unter der Kontrolle des starken, viralen CaMV 35S Promotors überexprimiert wird. Das Frischgewicht der Raupen wurde nach 8 Tagen bestimmt. Die Werte geben den Mittelwert (± Standardfehler) an (n=20). Statistisch signifikante Unterschiede werden durch ein Sternchen angezeigt (t-Test; * p < 0.05). Diese Versuche zeigen, dass eine Erhöhung der Expression von VIH2 (welche mit einer Erhöhung des Inositolpyrophosphats lnsP ₈ verbunden ist) zu einer erhöhten Resistenz der Pflanzen gegenüber herbivoren Insektenschädlingen führt. Das Wachstum von Schädlingen auf den transgenen Pflanzen (und in

Annäherung daran der Schädlings-induzierte Schaden) ist um ca. 30 % verringert. Hierbei gibt es keine„unerwünschten" Nebeneffekte der Inositolpyrophosphat- Erhöhung: Die Pflanzen sind gesund und entwickeln und vermehren sich normal.

Fig. 4: In Arabidopsis führt Überexpression von VIH2 zur erhöhten Resistenz gegen den nekrotrophen Ascomycet Alternaria brassicicola während VIH2 Funktionsverlustmutanten eine verminderte Resistenz zeigen

Infektionsversuche mit Alternaria brassicicola (Isolat MUCL 20297) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt ³ . Hierzu wurden Sporen auf eine Dichte von 5 ^χ 10 ⁵ Sporen/mL eingestellt, vier bis sechs 5 pL-Tropfen der Sporensuspension auf die Blattoberfläche aufgebracht und die Pflanzen bei 100 % Luftfeuchte bei 22°C und einem 8-Stunden/16-Stunden Licht/Dunkelrhythmus für 7-10 Tage inkubiert (Anzahl der Pflanzen ^' > 15). Anschließend wurden die Krankheitssymptome dokumentiert und in verschiedene Klassen je Phänotyp der Blattschädigung eingeteilt. Die Klassen waren hierbei wie folgt. Klasse I (quer gestreift): Hellbraune Flecken an der

Infektionsstelle; Klasse II (schräg gestreift): Dunkelbraune Flecken an der

Infektionsstelle und erste Anzeichen von Nekrose; Klasse III (durchgehend schwarz): fortschreitende Nekrose und Blattmazeration. Die Verteilungen der Daten wurde mit einem Chi-Quadrat-Test ausgewertet und zeigen, dass die Unterschiede zwischen Col-0 und vih2-3, zwischen Col-0 und vih2-4, sowie zwischen Col-0 und CaMV 35S:VIH2 signifikant sind (p < 0.05). Bei vih2-3 und vih2-4 handelt es sich um VIH2 Funktionsverlustmutanten, bei CaMV 35S:VIH2 handelt es sich um transgene Pflanzen, in denen die Kinasedomäne des wildtypischen VIH2 Gens unter der Kontrolle des starken, viralen CaMV 35S Promotors überexprimiert wird. Diese Versuche zeigen, dass eine Erhöhung der Expression von VIH2 (welche mit einer Erhöhung des Inositolpyrophosphats lnsP ₈ verbunden ist) zu einer erhöhten

Resistenz der Pflanzen gegenüber nektrotrophen Pilzen führt, da die Pilz-induzierten Schäden auf solchen Pflanzen signifikant verringert sind.

Fig. 5: Arabidopsis VIH2 Funktionsverlustmutanten zeigen eine verminderte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz und Erreger der Grauschimmelfäule Botrytis cinerea. Ein 5 pL großer Tropfen einer Konidien (Sporen)-Suspension von Botrytis cinerea wurde auf die Blattoberfläche einer 5-Wochen alten Pflanzen pipettiert. Dies wurde für 5 ausgewachsene Blätter pro Pflanze und insgesamt 20 Pflanzen des angezeigten Genotyps durchgeführt. Hierbei wurden nur Blätter verwendet, die jünger sind als das 4. Blatt der jeweiligen Pflanze. Danach wurden die inokulierten Pflanzen bei 100 % Luftfeuchte für 3 Tage bei 21 °C in einer

Klimakammer unter einem 10-Stunden/14-Stunden Licht/Dunkelrhythmus inkubiert. Anschließend wurden die Krankheitssymptome dokumentiert und in verschiedene Klassen je nach Größe und dem Zeitpunkt des Auftretens von Läsionen eingeteilt. Die Klassen waren hierbei wie folgt: Klasse I (quer gestreift): Läsionen von 2 mm Durchmesser; Klasse II (durchgehend schwarz): Läsionen von 2 mm Durchmesser mit Chlorose; Klasse III (schräg gestreift): Läsionen von 2-4 mm Durchmesser mit Chlorose; Klasse IV (längs gestreift): Läsionen mit einem Durchmesser > 4 mm und Chlorose. Die Verteilungen der Daten wurde mit einem Chi-Quadrat-Test

ausgewertet und zeigen, dass die Unterschiede zwischen Col-0 und vih2-3 sowie zwischen Col-0 und vih2-4 signifikant sind (p < 0.001). Die Konidiensuspensionen für diese Versuche wurden, wie zuvor beschrieben ⁴ , hergestellt. Hierzu wurden Konidien von Botrytis cinerea aus einem Glycerolstock auf halb-konzentriertes 'potato dextrose broth' Festmedium (PDB; Difco TM ) inokuliert und 2 Wochen bei 22°C unter einem 10-Stunden/14-Stunden Licht/Dunkelrhythmus inkubiert. Danach wurden Konidien von der Oberfläche des Festmediums mit halb-konzentriertem PDB- Flüssigmedium gewaschen, durch Glaswolle gefiltert und die Konidiendichte in einer Zählkammer bestimmt. Die Suspension wurde in halb-konzentriertem PDB-

Flüssigmedium auf eine Dichte von 5 χ 10 ⁵ Konidien/mL eingestellt, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und zur Blattinokulation verwendet. Die Versuche wurden mit ähnlichen Ergebnissen 3-mal wiederholt.

Ausführungsbeispiele

Die Versuche wurden mit isogenen Linien des gleichen Ökotyps (Arabiopsis thaliana, Col-0) durchgeführt, die sich durch Anwesenheit (Col-0) bzw. Abwesenheit (vih2-3 und vih2-4) eines intakten VIH2 Gens (und damit VIH2-Proteins), oder aber durch eine erhöhte Expression der VIH2 Kinasedomäne (CaMV 35S:VIH2) auszeichnen. Bei den letztgenannten Pflanzen (CaMV 35S:VIH2) wurde die Kinasedomäne des wildtypischen VIH2 Gens unter der Kontrolle des starken, viralen CaMV 35S

Promotors überexprimiert. Hierzu wurde die die VIH2 Kinasedomänesequenz von einer Arabidopsis cDNA amplifiziert und in den Vektor pENTR™/D-TOPO®

(Invitrogen Life Technologies) integriert. Von dort wurde die VIH2

Kinasedomänesequenz durch Gateway® LR Clonase™ II (Invitrogen Life

Technologies) in den binären Pflanzentransformationsvektor pGWB441 (Nakagawa et al., 2007, Biosci. Biotechnol. Biochem, 71 , 2095-2100) überführt und der hierdurch hergestellte Vektor ,pGWB441-VIH2 KD' zur Transformation von

Arabidopsispflanzen verwendet. Es wurden mehrere unabhängige Transformanten auf Kanamycin selektioniert, nicht mehr segregierende CaMV 35S:VIH2 T3 Pflanzen etabliert und .eine erhöhte InsPa Biosynthese in diesen Pflanzen bestätigt. In den Figuren 3 und 4 werden exemplarisch Versuche mit einer dieser Linien gezeigt, die demonstrieren, dass die erhöhte Expression der VIH2 Kinasedomäne (und damit einhergehend die erhöhte Produktion von InsPa) zu einer erhöhten Resistenz sowohl gegen Larven des herbivoren Insekts Mamestra brassicae (Kohleule, Fig. 3) als auch gegen den nekrotrophen Pilz Alternaria brassicicola (Fig. 4) führt. Die verwendeten VIH2 Funktionsverlustpflanzen (vih2-3 und vih2-4) stammen aus öffentlich

zugänglichen Samen-Repositorien wie nachführend angegeben: Arabidopsis thaliana Col-0 (Columbia-0, CS60000 dessen Genom vollständig sequenziert ist) vom 'Salk Institute Genomic Analysis Laboratory' (USA); vih2-3 (SAIL_165_F12) von der 'Syngenta Arabidopsis Insertion Library (SAIL)' Sammlung. Diese Linie wurde uns über das 'Arabidopsis Biological Research Center' (ABRC) der Ohio State University' (USA) verfügbar gemacht; vih2-4 (GK-080A07) stammt aus der Kollektion .Genomanalyse im biologischen System Pflanze (GABI-KAT)' der Universität

Bielefeld. In beiden Fällen (SAIL und GABI-KAT) wurden Arabidopsis thaliana Col-0- Pflanzen durch Transformation mit spezifischen T-DNA-enthaltenden Vektoren mit Hilfe von Agrobakterien transformiert. Die T-DNAs integrieren hierbei weitestgehend ungerichtet ins Genom und können je nach genomischem Lokus zur Zerstörung des betroffenen Gens (und damit zum Verlust des durch dieses Gen kodierten Proteins) führen. Eine Vielzahl solcher Pflanzen werden in den entsprechenden Repositorien mit Hilfe T-DNA-spezifischer Oligonukleotide sequenziert, um die Insertionsstelle und damit die Identität des betroffenen Gens in einer spezifischen Pflanze zu ermitteln. Entsprechende Daten werden online zur Verfügung gestellt, um damit die

Identifizierung einer potentiellen Funktionsverlustmutante des gewünschten Proteins zu ermöglichen. Dieser Umweg (ungerichtete Insertion und nachfolgende

Genotypisierung) ist notwendig, da in höheren Pflanzen eine gezielte Herstellung von ,knockout'-Pflanzen durch das Prinzip der homologen Rekombination (im

Unterschied beispielsweise zur Bäckerhefe oder zu Mäusen) sehr ineffektiv ist.

Die Ausführungsbeispiele weisen darauf hin, dass VIH2-Funktionsverlustmutanten eine verminderte Resistenz gegenüber herbivoren Insekten und nektrotrophen Pilzen besitzen (Fig. 1, 2, 4 und 5), während die erhöhte Expression der VIH2

Kinasedomäne (und damit einhergehend die erhöhte Produktion von InsPe) eine erhöhte Resistenz gegenüber herbivoren Insekten und nektrotrophen Pilzen bewirkt (Fig. 3 und 4).

Referenzen

1. Dean R, Van Kan JA, Pretorius ZA, Hammond-Kosack KE, Di Pietro A, Spanu PD, et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol 2012, 13(4): 414-430.

2. Dakin K, Li WH. Cell membrane permeable esters of D-myo-inositol 1 ,4,5- trisphosphate. Cell calcium 2007 ^' , 42(3): 291-301.

3. Kemmerling B, Schwedt A, Rodriguez P, Mazzotta S, Frank M, Abu Qamar S, et al. The BRI1-associated kinase 1 , BAK1 , has a Brassinoli-independent role in plant cell-death control. Current Biology 2007 , 17(13): 1116-1122.

4. Van Wees SC, Van Pelt JA, Bakker PA, Pieterse CM. Bioassays for assessing jasmonate-dependent defenses triggered by pathogens, herbivorous insects, or beneficial rhizobacteria. Methods Mol Biol 2013, 1011 : 35-49.