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CBLB核酸内切酶变体、组合物及使用方法

阅读：405发布：2020-05-12

专利汇可以提供CBLB核酸内切酶变体、组合物及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了改良的用于编辑CBLB基因的基因组编辑组合物和方法。本公开还提供了用于 预防 、 治疗 或改善癌症、感染性 疾病 、 自身免疫性疾病 、炎性疾病或免疫 缺陷 的至少一种症状的基因组编辑过的细胞。，下面是CBLB核酸内切酶变体、组合物及使用方法专利的具体信息内容。

1.一种多肽，其包含使人卡西塔斯B谱系(Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基因中的靶位
点裂解的归巢核酸内切酶(HE)变体。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述HE变体是LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)变
体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含所述HE变体的生物活性
片段。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、
3、4、5、6、7或8个N末端氨基酸。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏4个N
末端氨基酸。
6.根据权利要求4所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏8个N
末端氨基酸。
7.根据权利要求3所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、
3、4、5或6个C末端氨基酸。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏C末
端氨基酸。
9.根据权利要求7所述的多肽，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏2个C
末端氨基酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述HE变体是选自由以下组成的组
的LHE变体：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI及I-Vdi141I。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述HE变体是选自由以下组成的组
的LHE变体：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI及SmaMI。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述HE变体是I-OnuI LHE变体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在如SEQ ID NO:1-5中
所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的DNA识别界面中选自由以下组成的组的氨
基酸位置处包含一个或多个氨基酸取代：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、
48、68、70、72、75、76、78、80、82、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、
199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在如SEQ ID NO:1-5中
所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的选自由以下组成的组的氨基酸位置处包
含至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个氨基酸取代：19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76 
77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、
223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段的选自由以下位置组成的位置组的至少一个位置处包含至少5个、
至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个氨基酸取代：
24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、78、80、92、116、138、143、
159、168、178、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、207、
223、225、227、232、236及238。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、L26G、R28D、R28Y、R30H、N32A、N32S、K34D、K34V、S35L、S36R、V37A、V37S、S40R、E42R、G44A、G44S、Q46E、T48V、T48S、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、F182M、N184E、I186K、I186M、S188R、S188N、K189R、S190N、K191P、K191N、L192V、G193K、G193I、Q195G、Q195R、Q197R、V199R、S201G、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26G、R28Y、R30H、N32S、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、S201G、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
23.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述HE变体在SEQ ID NO:1-5中任
一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含与SEQ ID NO:6-12
中任一个或其生物活性片段中所示的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少
90％、或甚至更优选至少95％一致的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:6或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:7或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:8或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:9或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:10或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
30.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:11或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述HE变体包含SEQ ID NO:12或其
生物活性片段中所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合SEQ ID NO:20中所示
的聚核苷酸序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其另外包含DNA结合结构域。
34.根据权利要求33所述的多肽，其中所述DNA结合结构域选自由以下组成的组：TALE 
DNA结合结构域和锌指DNA结合结构域。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述TALE DNA结合结构域包含约9.5个TALE重复
单元至约15.5个TALE重复单元。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的多肽，其中所述TALE DNA结合结构域结合所
述CBLB基因中的聚核苷酸序列。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的多肽，其中所述TALE DNA结合结构域结合SEQ 
ID NO:21中所示的聚核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的多肽，其中所述多肽结合并裂解SEQ ID NO:22中所示的聚
核苷酸序列。
39.根据权利要求34所述的多肽，其中所述锌指DNA结合结构域包含2、3、4、5、6、7或8个锌指基元。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其另外包含肽连接子和末端加工酶或其
生物活性片段。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的多肽，其另外包含病毒自裂解2A肽和末端加工
酶或其生物活性片段。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的多肽，其中所述末端加工酶或其生物活性片
段具有5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、TdT或不依赖于模板的DNA聚合酶活性。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的多肽，其中所述末端加工酶包含Trex2或其生
物活性片段。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:13-19中
任一个或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
45.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:13或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
46.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:14或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:15或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:16或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:17或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:18或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
51.根据权利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:19或其生物活性片段
中所示的氨基酸序列。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的多肽，其中所述多肽裂解所述人CBLB基因的
SEQ ID NO:20或22中所示的聚核苷酸序列。
53.一种聚核苷酸，其编码根据权利要求1至52中任一项所述的多肽。
54.一种mRNA，其编码根据权利要求1至52中任一项所述的多肽。
55.一种cDNA，其编码根据权利要求1至52中任一项所述的多肽。
56.一种载体，其包含编码根据权利要求1至52中任一项所述的多肽的聚核苷酸。
57.一种细胞，其包含根据权利要求1至52中任一项所述的多肽。
58.一种细胞，其包含编码根据权利要求1至52中任一项所述的多肽的聚核苷酸。
59.一种细胞，其包含根据权利要求56所述的载体。
60.一种细胞，其包含一个或多个由根据权利要求1至52中任一项所述的多肽引入的基
因组修饰。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含编码以下一种或多
种的聚核苷酸：免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体。
62.根据权利要求61所述的细胞，其中所述聚核苷酸还包含可操作地连接至编码所述
免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的聚核苷酸的RNA聚合酶II
启动子。
63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的组：
短EF1α启动子、长EF1α启动子、人ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的细胞，其中所述聚核苷酸还编码一个或多个
自裂解病毒肽，所述自裂解病毒肽可操作地连接至所述免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻
断剂或工程改造的抗原受体；散布于其间和/或与其侧接。
65.根据权利要求64所述的细胞，其中所述自裂解病毒肽是2A肽。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的细胞，其中所述聚核苷酸还包含异源聚腺苷
酸化信号。
67.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中所述免疫抑制信号阻断剂包含消
除免疫抑制因子作用的酶功能。
68.根据权利要求67所述的细胞，其中所述免疫抑制信号阻断剂包含犬尿氨酸酶活性。
69.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中所述免疫抑制信号阻断剂包含：
(a)结合免疫抑制因子的胞外结构域，任选地其中所述胞外结构域是抗体或其抗原结
合片段；
(b)结合免疫抑制因子的胞外结构域、和跨膜结构域；或
(c)结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域和经过修饰的胞内结构域，所述经过
修饰的胞内结构域不能将免疫抑制信号转导至所述细胞中。
70.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中所述免疫效力增强剂选自由以下
组成的组：双特异性T细胞接合分子(BiTE)、免疫增强因子和翻转受体。
71.根据权利要求70所述的细胞，其中所述免疫增强因子选自由以下组成的组：细胞因
子、趋化因子、细胞毒素、细胞因子受体以及其变体。
72.根据权利要求70所述的细胞，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域和跨膜结
构域；以及与所述TGFβRII跨膜结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
73.根据权利要求70所述的细胞，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；自TLR4、
CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
74.根据权利要求70所述的细胞，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；以及与
所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域和胞内结构域。
75.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中所述工程改造的抗原受体选自由
以下组成的组：工程改造的TCR、CAR、Daric或ζ因子。
76.根据权利要求75所述的细胞，其中所述工程改造的受体未被整合至所述CBLB基因
中。
77.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中所述编码免疫效力增强剂、免疫抑
制信号阻断剂或工程改造的抗原受体中一种或多种的聚核苷酸被整合至所述CBLB基因中。
78.根据权利要求61至66中任一项所述的细胞，其中包含所述编码免疫效力增强剂、免
疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体中一种或多种的聚核苷酸的供体修复模板被整
合至所述CBLB基因中由根据权利要求1至52中任一项所述的多肽引入的DNA双链断裂位点
处。
79.根据权利要求57至78中任一项所述的细胞，其中所述细胞是造血细胞。
80.根据权利要求57至79中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
81.根据权利要求57至80中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细
胞。
82.根据权利要求57至81中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。
83.根据权利要求57至82中任一项所述的细胞，其中所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞
(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。
84.根据权利要求57至82中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自然杀手(NK)细胞或
自然杀手T(NKT)细胞。
85.根据权利要求57至84中任一项所述的细胞，其中所述细胞的来源是外周血液单核
细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
86.根据权利要求47至85中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含一个或多个经过修
饰的CBLB等位基因。
87.根据权利要求72所述的细胞，其中所述一个或多个经过修饰的CBLB等位基因是无
功能的或具有基本上减弱的CBLB功能和/或活性。
88.根据权利要求46至51中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含被引入所述一个或
多个经过修饰的CBLB等位基因中的编码免疫效力增强剂或免疫抑制信号阻断剂的核酸并
且所述细胞还包含未被引入所述一个或多个经过修饰的CBLB等位基因中的工程改造的抗
原受体。
89.多种细胞，其包含一种或多种根据权利要求57至88中任一项所述的细胞。
90.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求57至88中任一项所述的细胞。
91.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求57至88中任一项所述的细胞和生理
学上可接受的载体。
92.一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，其包含：将编码根据权利要求1至52中任一
项所述的多肽的聚核苷酸引入所述细胞中，其中所述多肽的表达在人CBLB基因中的靶位点
处产生双链断裂。
93.一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，其包含：将编码根据权利要求1至52中任一
项所述的多肽的聚核苷酸引入所述细胞中，其中所述多肽的表达在人CBLB基因中的靶位点
处产生双链断裂，其中所述断裂是通过非同源末端接合(NHEJ)修复。
94.一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，其包含：将编码根据权利要求1至52中任一
项所述的多肽的聚核苷酸和供体修复模板引入所述细胞中，其中所述多肽的表达在人CBLB
基因中的靶位点处产生双链断裂，并且所述供体修复模板是通过同源介导的修复(HDR)并
入所述人CBLB基因中的所述双链断裂(DSB)位点处。
95.根据权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血细胞。
96.根据权利要求92至95中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
+ + +
97.根据权利要求92至96中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD3、CD4 和/或CD8 细
胞。
98.根据权利要求92至97中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫效应细胞。
99.根据权利要求92至98中任一项所述的方法，其中所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞
(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。
100.根据权利要求92至98中任一项所述的方法，其中所述细胞是自然杀手(NK)细胞或
自然杀手T(NKT)细胞。
101.根据权利要求92至100中任一项所述的方法，其中所述细胞的来源是外周血液单
核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
102.根据权利要求92至101中任一项所述的方法，其中编码所述多肽的聚核苷酸是
mRNA。
103.根据权利要求92至102中任一项所述的方法，其中将编码5'-3'核酸外切酶的聚核
苷酸引入所述细胞中。
104.根据权利要求92至103中任一项所述的方法，其中将编码Trex2或其生物活性片段
的聚核苷酸引入所述细胞中。
105.根据权利要求94至104中任一项所述的方法，其中所述供体修复模板编码CBLB基
因或其部分，相较于野生型CBLB基因，所述CBLB基因或其部分包含一个或多个突变。
106.根据权利要求94至105中任一项所述的方法，其中所述供体修复模板编码免疫效
力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体中的一种或多种。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述供体修复模板还包含可操作地连接至所
述免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的RNA聚合酶II启动子。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的
组：短EF1α启动子、长EF1α启动子、人ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-
1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子。
109.根据权利要求106至108中任一项所述的方法，其中所述供体修复模板还编码一种
或多种自裂解病毒肽，所述自裂解病毒肽可操作地连接至所述免疫效力增强剂、免疫抑制
信号阻断剂或工程改造的抗原受体；散布于其间和/或与其侧接。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述自裂解病毒肽是2A肽。
111.根据权利要求106至108中任一项所述的方法，其中所述供体修复模板还包含异源
聚腺苷酸化信号。
112.根据权利要求106至111中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制信号阻断剂包含
消除免疫抑制因子作用的酶功能。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述免疫抑制信号阻断剂包含犬尿氨酸酶活
性。
114.根据权利要求106至111中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制信号阻断剂包
含：
(a)结合免疫抑制因子的胞外结构域，任选地其中所述胞外结构域是抗体或其抗原结
合片段；
(b)结合免疫抑制因子的胞外结构域、和跨膜结构域；或
(c)结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域和经过修饰的胞内结构域，所述经过
修饰的胞内结构域不能将免疫抑制信号转导至所述细胞中。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述免疫抑制信号阻断剂的胞外结构域和/或
跨膜结构域是TGFβRII胞外结构域和/或跨膜结构域。
116.根据权利要求106至111中任一项所述的方法，其中所述免疫效力增强剂选自由以
下组成的组：双特异性T细胞接合分子(BiTE)、免疫增强因子和翻转受体。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述免疫增强因子选自由以下组成的组：细胞
因子、趋化因子、细胞毒素、细胞因子受体以及其变体。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域和跨膜
结构域；以及与所述TGFβRII跨膜结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；自
TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
120.根据权利要求116所述的方法，其中所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；以及
与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域和胞内结构域。
121.根据权利要求106至111中任一项所述的方法，其中所述工程改造的抗原受体选自
由以下组成的组：工程改造的TCR、CAR、Daric或ζ因子。
122.根据权利要求94至121中任一项所述的方法，其中所述供体修复模板包含与在所
述DSB的5'端的人CBLB基因序列同源的5'同源臂和与在所述DSB的3'端的人CBLB基因序列
同源的3'同源臂。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述5'和3'同源臂的长度独立地选自约100bp
至约2500bp。
124.根据权利要求122或权利要求123所述的方法，其中所述5'和3'同源臂的长度独立
地选自约600bp至约1500bp。
125.根据权利要求122至124中任一项所述的方法，其中所述5'同源臂是约1500bp并且
所述3'同源臂是约1000bp。
126.根据权利要求122至125中任一项所述的方法，其中所述5'同源臂是约600bp并且
所述3'同源臂是约600bp。
127.根据权利要求94至126中任一项所述的方法，其中使用病毒载体将所述供体修复
模板引入所述细胞中。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)
或逆转录病毒。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述rAAV具有一个或多个来自AAV2的ITR。
130.根据权利要求128或权利要求129所述的方法，其中所述rAAV具有选自由以下组成
的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及AAV10。
131.根据权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述rAAV具有AAV2或AAV6血清
型。
132.根据权利要求128所述的方法，其中所述逆转录病毒是慢病毒。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述慢病毒是整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)。
134.一种治疗、预防或改善癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病及免疫缺陷
或其相关病况的至少一种症状的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求90或权
利要求91所述的组合物。
135.一种治疗实体癌的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求90或权利要
求91所述的组合物。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述实体癌包含肝癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵
巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、肉瘤、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。
137.一种治疗血液恶性病的方法，其包含向受试者施用有效量的根据权利要求90或权
利要求91所述的组合物。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述血液恶性病是白血病、淋巴瘤或多发性骨
髓瘤。

说明书全文

CBLB核酸内切酶变体、组合物及使用方法

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.119(e)要求2017年10月3日提交的美国临时申请第62/567,417号和2017年5月25日提交的美国临时申请第62/511,194号的权益，以上申请各自以全文
引用的方式并入本文中。
[0003] 关于序列表的声明
[0004] 与本申请相关联的序列表是以文本格式提供以代替纸质副本，并以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_087_02WO_ST25.txt。文本文件是
152KB，创建于2018年5月25日，并在本说明书提交的同时，通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

[0005] 本公开涉及改良的基因组编辑组合物。更确切地说，本公开涉及核酸酶变体、组合物以及使用其编辑人卡西塔斯B谱系(casitas B-lineage，Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基
因的方法。

背景技术

[0006] 全球癌症负担在1975年与2000年间增加一倍。癌症是世界范围内导致发病率和死亡率的第二大主导原因，且在2012年间有约一千四百一十万例新增病例和八百二十万例癌
症相关死亡。最常见的癌症是乳癌、肺和支气管癌症、前列腺癌、结肠和直肠癌症、膀胱癌、皮肤黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、甲状腺癌、肾脏和肾盂癌症、子
宫内膜癌、白血病以及胰腺癌。预计在接下来的二十年里新增癌症病例的数量将增加至二
千二百万例。
[0007] 免疫系统在人癌症检测和防治中具有关键作用。大部分的转化细胞被免疫哨兵(immune sentinel)迅速地检测到并且通过克隆地表达的T细胞受体(TCR)活化抗原特异性
T细胞而破坏。因此，癌症可以被视为一种免疫病症，即免疫系统无法产生必要的抗肿瘤反
应以持久地抑制和消除疾病。为了更有效地对抗癌症，在过去数十年里开发出的某些免疫
治疗干预专门地集中在增强T细胞免疫。这些治疗仅引起偶发的疾病缓解病例，并没有取得
显著的总体成功。
[0008] 最近，已经在研究基于T细胞分离、修饰、扩增和再输注的过继性细胞疗法策略并在早期临床试验中进行测试。由于T细胞具有选择性识别和强效的效应子机制，故这些细胞
通常是选择用于癌症免疫疗法的效应细胞。这些治疗显示出一定的成功率，而且少量患者
经历持久的缓解，突出显示了基于T细胞的免疫疗法的尚未实现的潜力。
[0009] 细胞溶解T细胞成功地识别肿瘤细胞相关抗原引起靶肿瘤溶解并且成为任何有效癌症免疫疗法的基础。肿瘤浸润性T细胞(TIL)表达特异性针对肿瘤相关抗原的TCR；不过，
大量的TIL仅局限于少数人类癌症。工程改造的T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)潜在
地增加基于T细胞的免疫疗法在许多癌症和其它免疫病症中的适用性。
[0010] 此外，现有技术工程改造的T细胞还受到复杂免疫抑制肿瘤微环境的调控，所述免疫抑制肿瘤微环境由癌细胞、炎性细胞、基质细胞和细胞因子组成。在这些组分中，癌细胞、炎性细胞和抑制性细胞因子会不利地影响T细胞表型和功能。总体来说，肿瘤微环境驱使T
细胞终末分化成耗竭T细胞。
[0011] T细胞耗竭是在持续环境中以抑制性受体表达增加或抑制性受体引起的信号传导增加；效应细胞因子产生减少；以及持续存在和消除癌症的能力降低为标志的T细胞功能障
碍状态。耗竭T细胞还以分级方式显示功能损失：在耗竭早期，IL-2产生减少且离体杀灭能
力丧失；在中期，无法产生TNF-α；以及在耗竭晚期，无法产生IFN-γ和GzmB。大部分T细胞在肿瘤微环境中分化成耗竭T细胞并丧失消除癌症的能力，且最终被清除。
[0012] 截至目前，尚无可证实的针对免疫抑制性肿瘤微环境的持久性和抗性增加的过继性细胞疗法的临床实例。
发明内容
[0013] 本公开大体上部分涉及组合物以及其使用方法，所述组合物包含裂解人卡西塔斯B谱系(Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基因中的靶位点的归巢核酸内切酶变体和megaTAL。
[0014] 在各种实施例中，本公开部分地涵盖一种多肽，该多肽包含裂解人CBLB基因中的靶位点的归巢核酸内切酶(HE)变体。
[0015] 在特定实施例中，HE变体是LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)变体。
[0016] 在一些实施例中，所述多肽包含HE变体的生物活性片段。
[0017] 在某些实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、3、4、5、6、7或8个N末端氨基酸。
[0018] 在一些实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏4个N末端氨基酸。
[0019] 在另外的实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏8个N末端氨基酸。
[0020] 在特定实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、3、4、5或6个C末端氨基酸。
[0021] 在特定实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏C末端氨基酸。
[0022] 在另外的实施例中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏2个C末端氨基酸。
[0023] 在特定实施例中，HE变体是选自由以下组成的组的LHE变体：I-CreI和I-SceI。
[0024] 在某些实施例中，HE变体是选自由以下组成的组的LHE变体：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-
PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI及I-Vdi141I。
[0025] 在一些实施例中，HE变体是选自由以下组成的组的LHE变体：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI及SmaMI。
[0026] 在另外的实施例中，HE变体是I-OnuI LHE变体。
[0027] 在特定实施例中，HE变体在如SEQ ID NO:1-5中所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的DNA识别界面中选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含一个或多个氨基
酸取代：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、78、80、82、
180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、
231、232、234、236、238及240。
[0028] 在某些实施例中，HE变体在如SEQ ID NO:1-5中所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的DNA识别界面中选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含至少5个、至少15
个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个氨基酸取代：24、26、
28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、78、80、82、180、182、184、
186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、
236、238及240。
[0029] 在特定实施例中，HE变体在如SEQ ID NO:1-5中所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸取代：19、24、
26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76 77、78、80、82、168、
180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、
231、232、234、236、238及240。
[0030] 在某些实施例中，HE变体在如SEQ ID NO:1-5中所示I-OnuI LHE氨基酸序列或其生物活性片段的选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含至少5个、至少15个、优选至少25
个、更优选至少35个或甚至更优选至少40个或更多个氨基酸取代：19、24、26、28、30、32、34、
35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76 77、78、80、82、168、180、182、184、186、
188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、
238及240。
[0031] 在特定实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段的选自由以下位置组成的位置组的至少一个位置处包含至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选
至少35个或甚至更优选至少40个或更多个氨基酸取代：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、
40、42、44、46、48、68、70、72、78、80、92、116、138、143、159、168、178、180、182、184、186、188、
189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、207、223、225、227、232、236及238。
[0032] 在一些实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26R、L26G、R28D、R28Y、R30H、N32A、N32S、K34D、K34V、S35L、S36R、V37A、V37S、S40R、E42R、G44A、G44S、Q46E、T48V、T48S、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、F182M、N184E、I186K、I186M、S188R、S188N、K189R、S190N、K191P、K191N、L192V、G193K、G193I、Q195G、Q195R、Q197R、V199R、S201G、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0033] 在另外的实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至
少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0034] 在特定实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0035] 在某些实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0036] 在一些实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0037] 在特定实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26G、R28Y、R30H、N32S、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0038] 在某些实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少
40个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、S201G、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0039] 在另外的实施例中，HE变体在SEQ ID NO:1-5中任一个或其生物活性片段中包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至
少40个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0040] 在特定实施例中，HE变体包含与SEQ ID NO:6-12中任一个或其生物活性片段中所示氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％或甚至更优选至少95％一致的氨
基酸序列。
[0041] 在一些实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:6或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0042] 在另外的实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:7或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0043] 在特定实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:8或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0044] 在特定实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:9或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0045] 在另外的实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:10或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0046] 在某些实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:11或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0047] 在某些实施例中，HE变体包含SEQ ID NO:12或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0048] 在一些实施例中，所述多肽结合SEQ ID NO:20中所示的聚核苷酸序列。
[0049] 在特定实施例中，所述多肽还包含DNA结合结构域。
[0050] 在另外的实施例中，所述DNA结合结构域选自由以下组成的组：TALE DNA结合结构域和锌指DNA结合结构域。
[0051] 在某些实施例中，所述TALE DNA结合结构域包含约9.5个TALE重复单元至约15.5个TALE重复单元。
[0052] 在另外的实施例中，所述TALE DNA结合结构域结合CBLB基因中的聚核苷酸序列。
[0053] 在特定实施例中，所述TALE DNA结合结构域结合SEQ ID NO:21中所示的聚核苷酸序列。
[0054] 在特定实施例中，所述多肽结合并裂解SEQ ID NO:22中所示的聚核苷酸序列。
[0055] 在特定实施例中，所述锌指DNA结合结构域包含2、3、4、5、6、7或8个锌指基元。
[0056] 在另外的实施例中，所述多肽还包含肽连接子和末端加工酶或其生物活性片段。
[0057] 在某些实施例中，所述多肽还包含病毒自裂解2A肽和末端加工酶或其生物活性片段。
[0058] 在另外的实施例中，所述末端加工酶或其生物活性片段具有5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、TdT或不依赖于模板的DNA聚合酶活性。
[0059] 在一些实施例中，所述末端加工酶包含Trex2或其生物活性片段。
[0060] 在另外的实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:13-19中任一个或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0061] 在另外的实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:13或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0062] 在特定实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:14或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0063] 在某些实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:15或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0064] 在某些实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:16或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0065] 在一些实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:17或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0066] 在特定实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:18或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0067] 在另外的实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:19或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0068] 在特定实施例中，所述多肽裂解人CBLB基因中SEQ ID NO:20或22中所示的聚核苷酸序列。
[0069] 在各种实施例中，本公开部分地提供一种编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸。
[0070] 在一些实施例中，本公开部分地提供一种编码本文所涵盖的多肽的mRNA。
[0071] 在特定实施例中，本公开部分地提供一种编码本文所涵盖的多肽的cDNA。
[0072] 在各种实施例中，本公开部分地提供一种载体，该载体包含编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸。
[0073] 在各种实施例中，本公开部分地提供一种细胞，该细胞包含本文所涵盖的多肽。
[0074] 在另外的实施例中，本公开部分地提供一种细胞，该细胞包含编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸。
[0075] 在另外的实施例中，本公开部分地提供一种细胞，该细胞包含本文所涵盖的载体。
[0076] 在一些实施例中，本公开部分地提供一种细胞，该细胞包含一个或多个由本文所涵盖的多肽引入的基因组修饰。
[0077] 在特定实施例中，所述细胞包含编码以下一种或多种的聚核苷酸：免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体。
[0078] 在另外的实施例中，所述聚核苷酸还包含RNA聚合酶II启动子，该RNA聚合酶II启动子可操作地连接至编码所述免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受
体的聚核苷酸。
[0079] 在一些实施例中，所述RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的组：短EF1α启动子、长EF1α启动子、人ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强
子、负控制区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子。
[0080] 在另外的实施例中，所述聚核苷酸还编码一个或多个自裂解病毒肽，所述自裂解病毒肽可操作地连接至所述免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受
体；散布于其间；和/或与其侧接。
[0081] 在特定实施例中，所述自裂解病毒肽是2A肽。
[0082] 在某些实施例中，所述聚核苷酸还包含异源聚腺苷酸化信号。
[0083] 在特定实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含抵消免疫抑制因子作用的酶功能。
[0084] 在另外的实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含犬尿氨酸酶活性。
[0085] 在特定实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含：结合免疫抑制因子的胞外结构域，任选地其中所述胞外结构域是抗体或其抗原结合片段；结合免疫抑制因子的胞外结构
域和跨膜结构域；或结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域和经过修饰的胞内结构
域，所述经过修饰的胞内结构域不能将免疫抑制信号转导至细胞中。
[0086] 在另外的实施例中，所述免疫效力增强剂选自由以下组成的组：双特异性T细胞接合分子(BiTE)、免疫增强因子和翻转受体(flip receptor)。
[0087] 在一些实施例中，所述免疫增强因子选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、细胞毒素、细胞因子受体以及其变体。
[0088] 在一些实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域和跨膜结构域；以及与所述TGFβRII跨膜结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0089] 在特定实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0090] 在某些实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域和胞内结构域。
[0091] 在特定实施例中，工程改造的抗原受体选自由以下组成的组：工程改造的TCR、CAR、Daric或ζ因子(zetakine)。
[0092] 在另外的实施例中，工程改造的受体未整合至CBLB基因中。
[0093] 在另外的实施例中，编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体中的一种或多种的聚核苷酸被整合至CBLB基因中。
[0094] 在另外的实施例中，供体修复模板包含编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体中的一种或多种的聚核苷酸，该供体修复模板被整合至CBLB基因
中由本文所涵盖的多肽引入的DNA双链断裂位点处。
[0095] 在特定实施例中，细胞是造血细胞。
[0096] 在一些实施例中，细胞是T细胞。
[0097] 在特定实施例中，细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。
[0098] 在另外的实施例中，细胞是免疫效应细胞。
[0099] 在特定实施例中，细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。
[0100] 在某些实施例中，细胞是自然杀手(NK)细胞或自然杀手T(NKT)细胞。
[0101] 在一个优选实施例中，细胞是被基因修饰成表达工程改造的抗原受体的T细胞。
[0102] 在一个优选实施例中，细胞是被基因修饰成表达嵌合抗原受体(CAR)或工程改造的T细胞受体(TCR)的T细胞。
[0103] 在另外的实施例中，细胞的来源是外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
[0104] 在一些实施例中，细胞包含一个或多个经过修饰的CBLB等位基因。
[0105] 在另外的实施例中，所述一个或多个经过修饰的CBLB等位基因是无功能的或具有基本上减弱的CBLB功能和/或活性。
[0106] 在特定实施例中，所述细胞包含被引入所述一个或多个经过修饰的CBLB等位基因中的编码免疫效力增强剂或免疫抑制信号阻断剂的核酸并且所述细胞还包含未被引入所
述一个或多个经过修饰的CBLB等位基因中的工程改造的抗原受体。
[0107] 在一些实施例中，本公开部分地提供包含一种或多种本文所涵盖的细胞的多种细胞。
[0108] 在各种实施例中，本公开部分地提供一种组合物，该组合物包含一种或多种本文所涵盖的细胞。
[0109] 在一些实施例中，本公开部分地提供一种组合物，该组合物包含一种或多种本文所涵盖的细胞和生理学上可接受的载体。
[0110] 在特定实施例中，本公开部分地提供一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，该方法包含：将编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸引入细胞中，其中所述多肽的表达在人CBLB
基因中的靶位点处产生双链断裂。
[0111] 在一些实施例中，本公开部分地提供一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，该方法包含：将编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸引入细胞中，其中所述多肽的表达在人CBLB
基因中的靶位点处产生双链断裂，其中所述断裂是通过非同源末端接合(non-homologous 
end joining，NHEJ)修复。
[0112] 在某些实施例中，本公开部分地提供一种编辑细胞中的人CBLB基因的方法，该方法包含：将编码本文所涵盖的多肽的聚核苷酸和供体修复模板引入细胞中，其中所述多肽
的表达在人CBLB基因中的靶位点处产生双链断裂并且所述供体修复模板通过同源介导修
复(homology directed repair，HDR)并入人CBLB基因中的双链断裂(DSB)位点处。
[0113] 在特定实施例中，细胞是造血细胞。
[0114] 在某些实施例中，细胞是T细胞。
[0115] 在某些实施例中，细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。
[0116] 在一些实施例中，细胞是免疫效应细胞。
[0117] 在另外的实施例中，细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。
[0118] 在另外的实施例中，细胞是自然杀手(NK)细胞或自然杀手T(NKT)细胞。
[0119] 在特定实施例中，细胞的来源是外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
[0120] 在特定实施例中，编码所述多肽的聚核苷酸是mRNA。
[0121] 在某些实施例中，编码5'-3'核酸外切酶的聚核苷酸被引入所述细胞中。
[0122] 在另外的实施例中，编码Trex2或其生物活性片段的聚核苷酸被引入所述细胞中。
[0123] 在一些实施例中，供体修复模板编码CBLB基因或其部分，相较于野生型CBLB基因，所述CBLB基因或其部分包含一个或多个突变。
[0124] 在特定实施例中，供体修复模板编码以下一种或多种：免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体。
[0125] 在一些实施例中，供体修复模板还包含可操作地连接至所述免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的RNA聚合酶II启动子。
[0126] 在另外的实施例中，RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的组：短EF1α启动子、长EF1α启动子、人ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强
子、负控制区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子。
[0127] 在特定实施例中，供体修复模板还编码一个或多个自裂解病毒肽，所述自裂解病毒肽可操作地连接至免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体；散布
于其间；和/或与其侧接。
[0128] 在另外的实施例中，所述自裂解病毒肽是2A肽。
[0129] 在某些实施例中，供体修复模板还包含异源聚腺苷酸化信号。
[0130] 在另外的实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含抵消免疫抑制因子作用的酶功能。
[0131] 在特定实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含犬尿氨酸酶活性。
[0132] 在一些实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂包含：结合免疫抑制因子的胞外结构域，任选地其中所述胞外结构域是抗体或其抗原结合片段；结合免疫抑制因子的胞外结构
域和跨膜结构域；或结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域和经过修饰的胞内结构
域，所述经过修饰的胞内结构域不能将免疫抑制信号转导至细胞中。
[0133] 在某些实施例中，所述免疫抑制信号阻断剂的胞外结构域和/或跨膜结构域是TGFβRII胞外结构域和/或跨膜结构域。
[0134] 在一些实施例中，所述免疫效力增强剂选自由以下组成的组：双特异性T细胞接合分子(BiTE)、免疫增强因子和翻转受体。
[0135] 在特定实施例中，所述免疫增强因子选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、细胞毒素、细胞因子受体以及其变体。
[0136] 在另外的实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域和跨膜结构域；以及与所述TGFβRII跨膜结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0137] 在特定实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的来自TLR4、CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0138] 在另外的实施例中，所述翻转受体包含TGFβRII胞外结构域；以及与所述TGFβRII胞外结构域的C末端同框融合的自TLR4、CD3、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137多肽分离的跨膜结构域和胞内结构域。
[0139] 在某些实施例中，工程改造的抗原受体选自由以下组成的组：工程改造的TCR、CAR、Daric或ζ因子。
[0140] 在一些实施例中，供体修复模板包含与在DSB的5'端的人CBLB基因序列同源的5'同源臂和与在DSB的3'端的人CBLB基因序列同源的3'同源臂。
[0141] 在另外的实施例中，5'和3'同源臂的长度独立地选自约100bp至约2500bp。
[0142] 在特定实施例中，5'和3'同源臂的长度独立地选自约600bp至约1500bp。
[0143] 在特定实施例中，5'同源臂是约1500bp并且3'同源臂是约1000bp。
[0144] 在一些实施例中，5'同源臂是约600bp并且3'同源臂是约600bp。
[0145] 在某些实施例中，使用了病毒载体将供体修复模板引入细胞中。
[0146] 在另外的实施例中，病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)或逆转录病毒。
[0147] 在特定实施例中，rAAV具有来自AAV2的一个或多个ITR。
[0148] 在另外的实施例中，rAAV具有选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9以及AAV10。
[0149] 在另外的实施例中，rAAV具有AAV2或AAV6血清型。
[0150] 在某些实施例中，所述逆转录病毒是慢病毒。
[0151] 在一些实施例中，所述慢病毒是整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)。
[0152] 在各种实施例中，本公开部分地提供一种治疗、预防或改善癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷或其相关病况的至少一种症状的方法，该方法包含向
受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
[0153] 在某些实施例中，本公开部分地提供一种治疗实体癌的方法，该方法包含向受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
[0154] 在特定实施例中，所述实体癌包含肝癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、肉瘤、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。
[0155] 在一些实施例中，本公开部分地提供一种治疗血液恶性病的方法，该方法包含向受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
[0156] 在某些实施例中，所述血液恶性病是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。附图说明
[0157] 图1显示在外显子6中的CBLB基因和HE靶位点(SEQ ID NO:20和76)，所述外显子6编码SH2结构域。
[0158] 图2显示如何对CBLB HE进行重编程，这是通过三轮分选，针对嵌合‘半位点’工程改造NTD和CTD，随后使重编程的结构域融合并针对完整CBLB靶位点筛选以分离出完全重编
程的HE实现。
[0159] 图3显示在染色体报告子分析中CBLB HE变体的活性。
[0160] 图4显示CBLB.E3 HE变体的酵母表面亲和力滴定。
[0161] 图5显示CBLB HE变体(SEQ ID NO:77至83)与野生型I-OnuI蛋白质(SEQ ID NO:1)的比对，突出显示不一致的位置。
[0162] 图6显示TAL RVD与CBLB.E3 HE变体融合产生CBLB.E3 megaTAL的结合位点(SEQ ID NO:22和84)。
[0163] 图7显示了在CAR T细胞中使用CBLB megaTAL的一致CBLB基因编辑率。
[0164] 图8显示了在CBLB megaTAL处理的T细胞中细胞内CBLB蛋白质表达减少。
[0165] 图9显示，当用抗CD3抗体或用CAR特异性抗原刺激时，CBL编辑的T细胞产生较多的IFNγ和TNFα。
[0166] 图10显示了有关通过共递送编码各种CBLB megaTAL和TREX2的mRNA编辑的T细胞的TIDE分析。靶基因座处的编辑率是61-93％。
[0167] 图11显示使用CBLB megaTAL和AAV供体将MND-GFP表达盒插入CBLB靶位点中的HDR策略的图。
[0168] 图12显示相较于模拟编辑的T细胞，使用图11中所描绘的HDR策略编辑的T细胞中GFP的表达稳定增加。
[0169] 图13显示体内小鼠研究的结果。用媒剂处理的T细胞(左上图)、用CBLB megaTAL编辑的T细胞(右上图)、抗EGFR CAR T细胞(左下图)及用CBLB megaTAL编辑的抗EGFR CAR T
细胞(右下图)治疗患有A549肿瘤的小鼠。随时间测量平均肿瘤体积。
[0170] 序列标识符的简要说明
[0171] SEQ ID NO:1是野生型I-OnuI LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)的氨基酸序列。
[0172] SEQ ID NO:2是野生型I-OnuI LHE的氨基酸序列。
[0173] SEQ ID NO:3是野生型I-OnuI LHE的生物活性片段的氨基酸序列。
[0174] SEQ ID NO:4是野生型I-OnuI LHE的生物活性片段的氨基酸序列。
[0175] SEQ ID NO:5是野生型I-OnuI LHE的生物活性片段的氨基酸序列。
[0176] SEQ ID NO:6-12阐述重编程成结合并裂解人CBLB基因中的靶位点的I-OnuI LHE变体的氨基酸序列。
[0177] SEQ ID NO:13-19阐述重编程成结合并裂解人CBLB基因中的靶位点的I-OnuI LHE变体的氨基酸序列。
[0178] SEQ ID NO:20是人CBLB基因外显子6中的I-OnuI LHE变体靶位点。
[0179] SEQ ID NO:21是人CBLB基因外显子6中的TALE DNA结合结构域靶位点。
[0180] SEQ ID NO:22是人CBLB基因外显子6中的megaTAL靶位点。
[0181] SEQ ID NO:23、25、27和29阐述人CBLB基因外显子6中的I-OnuI LHE变体N末端结构域靶位点。
[0182] SEQ ID NO:24、26和28阐述人CBLB基因外显子6中的I-OnuI LHE变体C末端结构域靶位点。
[0183] SEQ ID NO:30是CBLB.E3表面展示质粒的聚核苷酸序列。
[0184] SEQ ID NO:31-36阐述编码CBLB megaTAL的mRNA序列。
[0185] SEQ ID NO:37是编码鼠类Trex2的mRNA序列。
[0186] SEQ ID NO:38是编码鼠类Trex2的氨基酸序列。
[0187] SEQ ID NO:39-49阐述各种连接子的氨基酸序列。
[0188] SEQ ID NO:50-74阐述蛋白酶裂解位点和自裂解多肽裂解位点的氨基酸序列。在前述序列中，如果存在X，则是指任何氨基酸或不存在某一氨基酸。

具体实施方式

[0189] A.概述
[0190] 本公开大体上部分地涉及改良的基因组编辑组合物和其使用方法。不希望受任何特定理论束缚，各种实施例中所涵盖的基因组编辑组合物可以用于预防或治疗癌症、感染
性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷或其相关病况，或改善其至少一种症状。困
扰现有过继性细胞疗法的一个局限或问题是由肿瘤微环境介导的耗竭引起免疫效应细胞
反应性不足。耗竭T细胞具有明显不同于原始T细胞、效应T细胞或记忆T细胞的特有分子特
征。耗竭T细胞是细胞因子表达和效应功能降低的T细胞。
[0191] 卡西塔斯B谱系(Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)是RING指家族或E3泛素连接酶的成员并且在包括造血谱系细胞在内的众多组织和细胞类型中表达。CBLB通过将E2-泛素缀合
酶募集至其RING指结构域来促进靶底物蛋白质的泛素化。CBLB底物蛋白质泛素化可以促进
蛋白质降解或干扰蛋白质-蛋白质相互作用。CBLB通过其含SH2的酪氨酸激酶结合结构域、
其与含SH3结构域的蛋白质相互作用的富含脯氨酸的序列或其与泛素标记的蛋白质相互作
用的泛素相关结构域结合至底物蛋白质。
[0192] CBLB还参与效应T细胞活性和持久性的负调控。CBLB敲除的小鼠T细胞过度增生，响应于抗原刺激而产生较高水平的IL2和IFNγ，对TGFβ介导的抑制作用具有抗性，并且具
有较低的活化阈值，由此指示CBLB在负面地调控T细胞活化中起作用。不希望受任何特定理
论束缚，预期使用工程改造的核酸酶破坏T细胞中的CBLB基因将产生更有效且更持久的过
继性细胞免疫疗法。
[0193] 在特定实施例中，通过消除、减少或阻断CBLB表达、CBLB活性和/或经由CBLB进行的信号传导使本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞对耗竭更具抗性。
[0194] 各种实施例中所涵盖的基因组编辑组合物和方法包含被设计用于结合并裂解卡西塔斯B谱系(Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基因中的靶位点的核酸酶变体。特定实施例中
所涵盖的核酸酶变体可以用于在靶聚核苷酸序列中引入双链断裂，所述双链断裂可以通过
在无聚核苷酸模板，例如供体修复模板存在下进行非同源末端接合(NHEJ)，或通过在供体
修复模板存在下进行同源介导修复(homology repair，HDR)，即同源重组来修复。某些实施
例中所涵盖的核酸酶变体也可以被设计为切口酶形式，所述切口酶产生单链DNA断裂，这些
单链DNA断裂可以使用细胞的碱基切除修复(BER)机构或在供体修复模板存在下进行的同
源重组加以修复。NHEJ是一种易错程序，常常会形成破坏基因功能的小插入和缺失。同源重
组需要同源DNA作为模板进行修复并且可以通过在靶位点处引入含有所希望序列的供体
DNA，侧接于与侧接所述靶位点的区域同源的序列的任一侧上，用于产生无限多种指定修
饰。
[0195] 在一个优选实施例中，本文所涵盖的基因组编辑组合物包含靶向人CBLB基因的归巢核酸内切酶变体或megaTAL。
[0196] 在一个优选实施例中，本文所涵盖的基因组编辑组合物包含归巢核酸内切酶变体或megaTAL和末端加工酶，例如Trex2。
[0197] 在各种实施例中，涵盖基因组编辑过的细胞。基因组编辑过的细胞包含编辑过的CBLB基因，其中编辑策略被设计成用于减少或消除CBLB表达。在特定实施例中，CAR T细胞、工程改造的TCR T细胞或DARIC T细胞包含编辑过的CBLB基因。
[0198] 在各种实施例中，在T细胞，例如免疫效应细胞中CBLB基因的靶位点中产生DNA断裂，并且在裂解的基因组序列的两端进行NHEJ可以产生具有极少或无CBLB表达的细胞，并
且优选地，产生缺乏或基本上缺乏功能性CBLB表达和/或信号传导，例如缺乏增进T细胞耗
竭的能力的T细胞。不希望受任何特定理论束缚，缺乏功能性CBLB表达的T细胞对免疫抑制
和T细胞耗竭具有较高抗性，并因此，具有更持久且更有效的治疗效用。
[0199] 在各种其它实施例中，提供了用于修复裂解的CBLB基因组序列的供体模板。利用所述模板的序列，通过在DNA断裂位点处进行同源重组来修复CBLB基因。在特定实施例中，
修复模板包含破坏，并且优选地基本上降低或消除功能性CBLB表达的聚核苷酸序列。
[0200] 在特定实施例中，CBLB基因是用编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的聚核苷酸修复。
[0201] 在特定实施例中，CBLB基因是用编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的聚核苷酸修复并且被引入CBLB基因中以便采用内源性CBLB启动子，以
转录控制免疫效力增强剂、免疫抑制信号或工程改造的抗原受体的表达。
[0202] 在优选实施例中，使用了本文所涵盖的基因组编辑组合物和方法编辑人CBLB基因。
[0203] 因此，本文所涵盖的方法和组合物表示相较于现有过继性细胞疗法的重大改良。
[0204] 用于重组(即，工程改造的)DNA、肽和寡核苷酸合成的技术、免疫分析、组织培养、转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应、纯化以及相关技术和程序一般可以如本说明书
通篇引用和论述的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学及免疫学中的各种通用且更特定的参考文献中所描述来执行。参见例如Sambrook等人《,分子克
隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,Cold Spring Harbor 
Laboratory Press,纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)；《现代分子生物学实验技术
(Current Protocols in Molecular Biology)》(John Wiley and Sons,2008年7月更新)；
《分子生物学简明方案：现代分子生物学实验技术方法概略(Short Protocols in 
Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular 
Biology)》,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover《, DNA克隆实用方
法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I和II卷(Press,Oxford Univ.PressUSA,
1985)；《免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)》(由以下编辑：John 
E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober 
2001John Wiley&Sons,纽约州纽约)《；实时PCR：当前技术和应用(Real-Time PCR:Current Technology andApplications)》,由Julie Logan,Kirstin Edwards及Nick Saunders编
辑,2009,Caister Academic Press,英国诺福克郡(Norfolk,UK)；Anand《,复杂基因组分析
技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(Academic Press,纽约,
1992)；Guthrie和Fink《, 酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and 
Molecular Biology)》(Academic Press,纽约,1991)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide 
Synthesis)》(N.Gait编,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid The Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编,1985)；《转录与翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames和
S.Higgins编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编,1986)；
Perbal《, 分子克隆实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；《新一代基因组测序(Next-Generation Genome Sequencing)》(Janitz,2008Wiley-VCH)；《PCR方
案(PCR Protocols)》(分子生物学方法)(Park编,第3版,2010Humana Press)；《固定化细胞
和酶(Immobilized Cells And Enzymes)》(IRL Press,1986)；论文《酶学方法(Methods In Enzymology)》(Academic Press,Inc.,纽约)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene 
Transfer Vectors For Mammalian Cells)》(J.H.Miller和M.P.Calos编,1987,Cold 
Spring Harbor Laboratory)；Harlow和Lane《, 抗体(Antibodies)》(Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约冷泉港,1998)；《(细胞和分子生物学的免疫化学方法)》(Mayer和
Walker编,Academic Press,伦敦(London),1987)；《实验免疫学手册(Handbook Of 
Experimental Immunology)》,第I-IV卷(D.M.Weir和CC Blackwell编,1986)；Roitt《,免疫
学基础(Essential Immunology)》,第6版,(Blackwell Scientific Publications,牛津
(Oxford),1988)；《免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)》(Q.E.Coligan,
A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach及W.Strober编,1991)《；免疫学年评(Annual 
Review of Immunology)》；以及如《免疫学进展(Advances in Immunology)》之类杂志中的专论。
[0205] B.定义
[0206] 在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
[0207] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或
相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施例，但本文中描述组合物、方法和材料的优
选实施例。出于本公开的目的，下文定义以下术语。在本公开通篇阐述了另外的定义。
[0208] 本文使用的冠词“一(a/an)”是指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种)或一个(种)或多个(种))该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件”意思指一个元件或一个或多个元件。
[0209] 替代选择(例如“或”)的使用应理解为意思指替代选择中的一种、两种或其任何组合。
[0210] 术语“和/或”应理解为意思指替代选择中的一种或两种。
[0211] 如本文所使用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度在大致参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
[0212] 在一个实施例中，范围，例如1至5、约1至5或约1至约5是指所述范围所涵盖的每个数字值。例如，在一个非限制性且仅说明性实施例中，范围“1至5”相当于表述1、2、3、4、5；或
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、
3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
[0213] 如本文所使用，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。在一个实施例中，“基本上相同”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用，例如生理作用与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同。
[0214] 在本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则“包含(comprise/comprises/comprising)”一词应理解为暗指包括所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其
它步骤或要素或任何其它组步骤或要素。“由……组成”意图包括且限于短语“由……组成”之后的事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由……组成”意图包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响关
于所列要素的公开内容中所说明的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组
成”指示所列要素是必不可少的或必需的，而且不存在实质上影响所列要素的活性或作用
的其它要素。
[0215] 本说明书通篇提到的“一个实施例(one embodiment/an embodiment)”、“一个特定实施例”、“一个相关实施例”、“某一实施例”、“一个另外的实施例”或“另一实施例”或其组合意味着，结合所述实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施例中。因
此，在本说明书通篇各处出现的前述短语未必都参考同一实施例。此外，特定特征、结构或
特性可以通过任何适合方式组合于一个或多个实施例中。还应理解，在一个实施例中关于
一个特征的正面叙述用作一个特定实施例中排除所述特征的基础。
[0216] 术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动，如在生物体外部的人造环境，优选在具有最少天然条件变化的人造环境中，在活组织中或对活组织进行的实验或测量。在
特定实施例中，“离体”程序涉及从生物体获得活细胞或组织并在实验室设备中，通常在无
菌条件下培养或调节，且取决于情况，典型地持续数小时或长达约24小时，但包括长达48或
72小时。在某些实施例中，可收集这些组织或细胞并冷冻，且稍后解冻以进行离体处理。使
用活细胞或组织进行的持续超过数天的组织培养实验或程序典型地被视为“体外”的，但在
某些实施例中，这一术语可与离体互换使用。
[0217] 术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。在一个实施例中，细胞基因组在体内经历工程改造、编辑或修饰。
[0218] “增强”或“促进”或“增加”或“扩增”或“加强”一般是指本文所涵盖的核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞产生、引发或引起比由媒剂或对照所引起的反应要强的反应(即，生理反应)的能力。从本领域中的理解和本文中的说明显而易见，可测量的
反应可以包括催化活性、结合亲和力、结合位点特异性、结合位点选择性、持久性、细胞溶解活性增加和/或促炎性细胞因子增加等。“增加”或“增强”的量典型地是“统计显著”的量，并且可以包括达到媒剂或对照所产生的反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更高倍数(例如500、1000倍)(包括在其间并高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、
1.7、1.8等)的增加。
[0219] “减少”或“减小”或“减低”或“降低”或“减轻”或“除去”或“抑制”或“减弱”一般是指本文所涵盖的核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞产生、引发或引起比媒剂或对照所引起的反应要弱的反应(即，生理反应)的能力。可测量的反应可以包括脱
靶结合亲和力、脱靶裂解特异性、T细胞耗竭等的减小。“减少”或“降低”的量典型地是“统计显著”的量，并且可以包括达到媒剂或对照所产生的反应(参考反应)1.1、1.2、1.5、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、15、20、30或更高倍数(例如500、1000倍)(包括在其间和高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8)的减少。
[0220] “维持(maintain)”或“保持(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著减少”一般是指本文所涵盖的核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞产生、引发或引起与媒剂或对照所引起的反应基本上类似或相当的生理反应(即，下游效应)的能力。相当的反应是与参考反应并无显著不同或可测量不同的反应。
[0221] 如本文所使用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specifically binds)”或“特异性结合(specifically bound)”或“特异性结合(specific binding)”或“特异性靶向”描述一个分子与另一个分子结合，例如多肽的DNA结合结构域与DNA结合的结合亲和力高于背景结合。如果结合结构域以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相
互作用的平衡缔合常数，以1/M为单位)与靶位点结合或缔合，则该结合结构域“特异性结
合”至靶位点。在某些实施例中，结合结构域与靶位点结合的Ka大于或等于约106M-1、107M-1、
108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1。“高亲和力”结合结构域是指Ka是至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的结合结构域。
[0222] 或者，在特定实施例中，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)且以M为单位(例如10-5M至10-13M，或更低)。特定实施例中所涵盖的包含一个或多个DNA结合结构域的核酸酶变体针对DNA靶位点的亲和力可以使用常规技术，例如酵母细胞表面
展示，或通过结合缔合或使用标记过的配体进行的置换分析容易地测定。
[0223] 在一个实施例中，特异性结合的亲和力比背景结合高约2倍、比背景结合高约5倍、比背景结合高约10倍、比背景结合高约20倍、比背景结合高约50倍、比背景结合高约100倍、或比背景结合高约1000倍或更高。
[0224] 术语“选择性结合(selectively binds)”或“选择性结合(selectively bound)”或“选择性结合(selectively binding)”或“选择性靶向”描述在多个脱靶分子存在下，一个分子优先结合至靶分子(在靶结合(on-target binding))。在特定实施例中，HE或
megaTAL选择性结合在靶DNA结合位点的频率比HE或megaTAL结合脱靶DNA靶结合位点的频
率高约5、10、15、20、25、50、100或1000倍。
[0225] “在靶”是指靶位点序列。
[0226] “脱靶”是指与靶位点序列类似但不一致的序列。
[0227] “靶位点”或“靶序列”是在存在足以实现结合和/或裂解的条件下，界定核酸中结合分子将结合和/或裂解的一部分的染色体或染色体外核酸序列。当提到仅涉及靶位点或
靶序列一条链的聚核苷酸序列或SEQ ID NO.时，应理解，核酸酶变体所结合和/或裂解的靶
位点或靶序列是双链的并且包含参考序列和其补体。在一个优选实施例中，靶位点是人
CBLB基因中的序列。
[0228] “重组”是指二个聚核苷酸之间遗传信息交换的程序，包括但不限于通过非同源末端接合(NHEJ)和同源重组进行的供体捕获。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指在例
如通过同源介导修复(HDR)机制修复细胞中的双链断裂期间发生的此类交换的特殊形式。
这一程序需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子作为模板来修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)，并且不同地称为“不产生交换的基因转换(non-crossover  gene 
conversion)”或“短链基因转化(short tract gene conversion)”，因为其导致遗传信息
从供体转移至靶。不希望受任何特定理论束缚，此类转移可涉及在断裂的靶与供体之间形
成的异双螺旋DNA的错配校正；和/或“合成依赖性链退火(synthesis-dependent strand 
annealing)”，其中使用供体再合成遗传信息，所述遗传信息将变成靶的一部分；和/或相关程序。此类特殊HR通常引起靶分子序列的改变，使得供体聚核苷酸序列的一部分或全部被
并入靶聚核苷酸中。
[0229] “NHEJ”或“非同源末端接合”是指在无供体修复模板或同源序列存在下双链断裂的消除。NHEJ可以在断裂位点处引起插入和缺失。NHEJ是由若干子路径介导的，这些子路径
各自具有不同的突变结果。经典NHEJ路径(cNHEJ)需要KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4复合物，通
过最低限度的加工，将两端重新连接在一起，并且通常引起断裂的精确修复。替代性NHEJ路
径(altNHEJ)在消除dsDNA断裂方面也具有活性，但这些路径明显更易于诱变且通常无法精
确修复以插入和缺失为标志的断裂。尽管不希望受任何特定理论束缚，但预期利用末端加
工酶，如核酸外切酶，例如Trex2修饰dsDNA断裂可能增加不精确修复的可能性。
[0230] “裂解”是指DNA分子共价主链的断裂。裂解可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶或化学水解。单链裂解和双链裂解都是可能的。双链裂解可作为二个不同
的单链裂解事件的结果发生。DNA裂解可导致产生钝端或交错端。在某些实施例中，将本文
所涵盖的多肽和核酸酶变体，例如归巢核酸内切酶变体、megaTAL等用于靶向双链DNA裂解。
核酸内切酶裂解识别位点可以在任一DNA链上。
[0231] “外源”分子是通常不存在于细胞中，而是通过一种或多种基因、生物化学或其它方法引入细胞中的分子。例示性外源分子包括但不限于小有机分子、蛋白质、核酸、碳水化
合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、前述分子的任何经过修饰的衍生物或包含一个或多个前述分子的任何复合物。用于将外源分子引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包
括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子性脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米粒子、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移以及病毒载体介导的转移。
[0232] “内源”分子是在特定环境条件下通常存在于处于特定发育阶段的特定细胞中的分子。另外的内源分子可以包括蛋白质。
[0233] “基因”是指编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论这些调控序列是否邻近于编码序列和/或转录的序列。基因包括但不限于启动子序列、
增强子、沉默子、隔离子、边界元件、终止子、聚腺苷酸化序列、转录后反应元件、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。
[0234] “基因表达”是指基因中所含信息转化成基因产物。基因产物可以是基因(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)的直接转录产物或由mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过如戴帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑之类方法修饰
的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻酸化和糖基化修饰的蛋白质。
[0235] 如本文所使用，术语“基因工程改造”或“基因修饰”是指将呈DNA或RNA形式的额外遗传物质染色体或染色体外添加至细胞中的总遗传物质中。基因修饰可以被靶向或不靶向细胞基因组中的特定位点。在一个实施例中，基因修饰具有位点特异性。在一个实施例中，
基因修饰不具有位点特异性。
[0236] 如本文所使用，术语“基因组编辑”是指在细胞基因组中靶位点处遗传物质的取代、缺失和/或引入，其恢复、校正、破坏和/或改变基因或基因产物的表达。特定实施例中所涵盖的基因组编辑包含将一种或多种核酸酶变体引入细胞中以任选地在供体修复模板存
在下，在细胞基因组中的靶位点处或附近产生DNA损伤。
[0237] 如本文所使用，术语“基因疗法”是指将额外遗传物质引入细胞中的总遗传物质中以恢复、校正或改变基因或基因产物的表达或达到表达治疗性多肽的目的。在特定实施例
中，通过基因组编辑将遗传物质引入细胞基因组中以恢复、校正、破坏或改变基因或基因产
物的表达或达到表达治疗性多肽的目的被认为是基因疗法。
[0238] “免疫病症”是指引起免疫系统反应的疾病。在特定实施例中，术语“免疫病症”是指癌症、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病或免疫缺陷。在一个实施例中，免疫病症包含感染性疾病。
[0239] 如本文所使用，术语“癌症”大体上涉及异常细胞不受控制地分裂且可侵袭邻近组织的一类疾病或病况。
[0240] 如本文所使用，术语“恶性”是指一组肿瘤细胞展示以下一种或多种特性的癌症：不受控制的生长(即，分裂超过正常限值)、侵袭(即，入侵并破坏邻近组织)和转移(即，通过淋巴或血液扩散至身体其它位置)。
[0241] 如本文所使用，术语“转移”是指癌症从身体的一个部分扩散至另一部分。由扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移瘤”或“转移”。转移瘤含有的细胞与原始肿瘤(原发瘤)中的细胞相似。
[0242] 如本文所使用，术语“良性”或“非恶性”是指肿瘤可生长至较大但不会扩散至身体的其它部分。良性肿瘤是自限性的且典型地不会侵袭或转移。
[0243] “癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌变生长或组织的各个细胞。肿瘤一般是指细胞异常生长形成的肿胀或病变，它可以是良性、癌前或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但有一些，例如白血病，未必形成肿瘤。对于形成肿瘤的癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，它可以通过肿瘤的数目、体积或重量度量。
[0244] “移植物抗宿主疾病”或“GVHD”是指在细胞、组织或实体器官移植之后发生的并发症。GVHD可在干细胞或骨髓移植之后发生，在此情况下移植的供体细胞攻击移植物接受者的身体。人急性GVHD是在移植后约60天内发生并且在细胞溶解性淋巴细胞的作用下引起皮
肤、肝和肠道的损伤。慢性GVHD是在稍后发生并且是主要影响皮肤，导致B细胞多克隆活化
以及Ig和自身抗体过量产生的一种全身自身免疫性疾病。实体器官移植的移植物抗宿主疾
病(SOT-GVHD)是以二种形式发生。较常见类型是抗体介导的，其中来自有O型血液的供体的
抗体攻击有A型、B型或AB型血液的接受者体内的红细胞，导致轻度短暂性、溶血性贫血。
SOT-GVHD的第二种形式是伴随高死亡率的一种细胞类型，其中供体来源的T细胞针对免疫
不同的宿主组织，最通常在皮肤、肝、胃肠道和骨髓中产生免疫攻击，在这些器官中引起并
发症。
[0245] “移植物抗白血病”或“GVL”是指供体的移植组织，如骨髓或外周血液中存在的免疫细胞针对个人的白血病细胞的免疫反应。
[0246] “自身免疫性疾病”是指身体针对其自身组织的一些成分产生免疫原性(即，免疫系统)反应的一种疾病。换句话说，免疫系统丧失其将身体内的某一组织或系统识别为“自
身的”能力，并且靶向并攻击该组织或系统，就好象它是外来的。自身免疫性疾病的示例性
实例包括但不限于：关节炎、炎性肠病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、自身免疫性甲状腺炎、全身性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn's disease)、结肠炎、糖尿病、硬皮病、牛皮癣等。
[0247] “免疫缺陷”意思指患者免疫系统因疾病或因施用化学品而受损的状态。这一病况使系统缺乏防御外来物质所需的血细胞数目和类型。免疫缺陷病况或疾病是本领域中已知
的并且包括例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、重度联合免疫缺陷疾病(SCID)、选择性IgA
缺乏症、常见变异型免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症、慢性肉芽肿病、高IgM综合症、韦斯考特-奥德里奇综合症(Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS)以及糖尿病。
[0248] “感染性疾病”是指可以在人与人之间或在生物体与生物体之间传播的一种疾病，并且是由微生物或病毒因子引起(例如普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的并且包括
例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体病、淋病)、肺结核、HIV/AIDS、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱以及流感。
[0249] 如本文所使用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用并且是指展现可以用本文别处所涵盖的核酸酶变体、基因组编辑组合物、基因疗法载体、基因组编辑载体、基因组编辑过的细胞以及方法治疗的免疫病症的症状的任何动物。适合受试者(例如患者)包括实验
动物(如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、农畜和家畜或宠物(如猫或狗)。非人类灵长类动物并且
优选地人类受试者也包括在内。典型的受试者包括患有免疫病症、被诊断患有免疫病症或
有患免疫病症的风险的人类患者。
[0250] 如本文所使用，术语“患者”是指被诊断患有可以用本文别处所涵盖的核酸酶变体、基因组编辑组合物、基因疗法载体、基因组编辑载体、基因组编辑过的细胞以及方法治
疗的免疫病症的受试者。
[0251] 如本文所使用，“治疗(treatment/treating)”包括针对疾病或病理病况的症状或病理的任何有益或所希望的作用，并且可以包括所治疗疾病或病况，例如癌症、GVHD、感染
性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷的一种或多种可测量标记物的甚至最低程
度的降低。治疗可以任选地涉及疾病或病况进展的延迟。“治疗”未必指示疾病或病况或其
相关症状的完全根除或治愈。
[0252] 如本文所使用，“预防(prevent)”和类似词语，如“预防(prevention/prevented/preventing)”等指示用于预防、抑制疾病或病况，例如癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷的发生或复发，或降低其发生或复发的可能性的方法。这些词语
还指延迟疾病或病况的发作或复发，或延迟疾病或病况症状的发生或复发。如本文所使用，
“预防”和类似词语还包括在疾病或病况发作或复发之前，降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负荷。
[0253] 如本文中所使用，短语“改善……的至少一种症状”是指减少所治疗受试者所患疾病或病况，例如癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷的一种或多种症状。在特定实施例中，所治疗的疾病或病况是癌症，其中被改善的一种或多种症状包括
但不限于虚弱、疲劳、呼吸急促、容易瘀伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹胀或腹痛(由腹部器官增大引起)、骨头或关节疼痛、骨折、计划外的体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性低热和排尿减少(由肾功能减退引起)。
[0254] 如本文所使用，术语“量”是指足以实现有益或希望的预防性或治疗性结果，包括临床结果的核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞的“有效的量”或“有效
量”。
[0255] “预防有效量”是指足以实现所希望的预防结果的核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞的量。典型地但非必需地，由于预防剂量是在患病之前或在疾病早
期用于受试者，故预防有效量小于治疗有效量。
[0256] 核酸酶变体、基因组编辑组合物或基因组编辑过的细胞的“治疗有效量”可以根据如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及在个体体内引起所希望的反应的能力等因素而
变化。治疗有效量还是治疗有益作用超过任何有毒或有害作用的量。术语“治疗有效量”包
括有效地“治疗”受试者(例如患者)的量。当指示治疗量时，打算施用的特定实施例中所涵
盖的组合物的确切量可由医师根据本说明书并且考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或
转移的程度以及患者(受试者)的状况确定。
[0257] C.核酸酶变体
[0258] 本文在特定实施例中所涵盖的核酸酶变体适于基因组编辑CBLB基因中的靶位点并且包含一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA裂解结构域(例如一种或多种核酸内
切酶和/或一个或多个核酸外切酶结构域)，以及任选地一个或多个本文所涵盖的连接子。
术语“重编程的核酸酶”、“工程改造的核酸酶”或“核酸酶变体”可互换使用并且是指包含一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA裂解结构域的核酸酶，其中所述核酸酶自亲本或
天然存在的核酸酶设计和/或修饰成结合并裂解CBLB基因中的双链DNA靶序列。
[0259] 在特定实施例中，核酸酶变体结合并裂解CBLB基因外显子6中的靶序列，优选地CBLB基因外显子6中的SEQ ID NO:20，并且更优选地CBLB基因外显子6中SEQ ID NO:20中的
序列“ATTC”。
[0260] 核酸酶变体可以自天然存在的核酸酶或先前的核酸酶变体设计和/或修饰得到。特定实施例中所涵盖的核酸酶变体还可包含一个或多个另外的功能结构域，例如末端加工
酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'瓣状
核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性DNA聚合酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工
酶结构域。
[0261] 结合并裂解CBLB基因中的靶序列的核酸酶变体的示例性实例包括但不限于归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)变体和megaTAL。
[0262] 1.归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)变体
[0263] 在各种实施例中，归巢核酸内切酶或大范围核酸酶被重编程以在CBLB基因中的靶位点中引入双链断裂(DSB)。在特定实施例中，归巢核酸内切酶变体在CBLB基因外显子6中，
优选地在CBLB基因外显子6中的SEQ ID NO:20处，并且更优选地在CBLB基因外显子6中SEQ 
ID NO:20中的序列“ATTC”处引入双链断裂。
[0264] “归巢核酸内切酶”与“大范围核酸酶”可互换使用并且是指识别具有12-45个碱基对的裂解位点的天然存在的归巢核酸内切酶，并且这些归巢核酸内切酶通常基于序列和结
构基元分成五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒以及PD-(D/E)XK。
[0265] “参考归巢核酸内切酶”或“参考大范围核酸酶”是指野生型归巢核酸内切酶或自然界中所发现的归巢核酸内切酶。在一个实施例中，“参考归巢核酸内切酶”是指被修饰成
增加基础活性的野生型归巢核酸内切酶。
[0266] “工程改造的归巢核酸内切酶”、“重编程的归巢核酸内切酶”、“归巢核酸内切酶变体”、“工程改造的大范围核酸酶”、“重编程的大范围核酸酶”或“大范围核酸酶变体”是指包含一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA裂解结构域的归巢核酸内切酶，其中所述归巢核酸内切酶自亲本或天然存在的归巢核酸内切酶设计和/或修饰成结合并裂解CBLB基因
中的DNA靶序列。归巢核酸内切酶变体可以自天然存在的归巢核酸内切酶或自另一归巢核
酸内切酶变体设计和/或修饰得到。特定实施例中所涵盖的归巢核酸内切酶变体还可包含
一个或多个另外的功能结构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸
外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性DNA聚合酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶结构域。
[0267] 归巢核酸内切酶(HE)变体不存在于自然界中并且可以通过重组DNA技术或通过随机诱变获得。HE变体可以通过使天然存在的HE或HE变体中的一个或多个氨基酸改变，例如
突变、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得。在特定实施例中，HE变体包含DNA识别界面的一个或多个氨基酸变化。
[0268] 特定实施例中所涵盖的HE变体还可包含一个或多个另外的功能结构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'
瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性DNA聚合酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端
加工酶结构域。在特定实施例中，利用展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性DNA聚合酶或不依赖模
板的DNA聚合酶活性的末端加工酶将HE变体引入T细胞中。HE变体和3'加工酶可以分开地引
入，例如利用不同载体或独立mRNA引入；或一起引入，例如以融合蛋白形式，或以通过病毒
自裂解肽或IRES元件隔开的多顺反子构建体引入。
[0269] “DNA识别界面”是指与核酸靶碱基以及邻近残基相互作用的HE氨基酸残基。对于每个HE，DNA识别界面包含侧链与侧链和侧链与DNA接触构成的广泛网状结构，所述接触中
大部分必然是识别特定核酸靶序列特有的。因此，对应于特定核酸序列的DNA识别界面的氨
基酸序列变化极大并且是任何天然HE或HE变体的特征。作为非限制性实例，特定实施例中
所涵盖的HE变体可以通过构造HE变体文库得到，在所述HE变体文库中，位于天然HE(或先前
产生的HE变体)的DNA识别界面中的一个或多个氨基酸残基是变化的。可以使用裂解分析，
针对每个预测的CBLB靶位点的靶裂解活性筛选这些文库(参见例如Jarjour等人,2009《. 核
酸研究(Nuc.Acids Res.)》37(20):6871-6880)。
[0270] LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)是研究最充分的归巢核酸内切酶家族，主要在古细菌中以及绿藻和真菌中的细胞器DNA中编码，并且展示最高的总体DNA识别特异性。LHE包
含每条蛋白质链一个或二个LAGLIDADG催化基元并且分别以同二聚体或单链单体形式起作
用。关于LAGLIDADG蛋白质的结构研究鉴别出高度保守的核心结构(Stoddard 2005)，以αββαββα折叠为特征，并且LAGLIDADG基元属于这一折叠的第一个螺旋。LHE的高效特异性裂解表示得到新颖、高度特异性核酸内切酶的蛋白质骨架。然而，将LHE工程改造成结合并裂解
非天然或非典型靶位点需要选择适当LHE骨架、检查靶基因座、选择推定的靶位点以及在靶
位点中多达三分之二的碱基对位置处广泛地改变LHE以改变其DNA接触点和裂解特异性。
[0271] 在一个实施例中，可以被设计成重编程的LHE或LHE变体的LHE包括但不限于I-CreI和I-SceI。
[0272] 可以被设计成重编程的LHE或LHE变体的LHE的示例性实例包括但不限于I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I。
[0273] 在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体选自由以下组成的组：I-CpaMI变体、I-HjeMI变体、I-OnuI变体、I-PanMI变体和I-SmaMI变体。
[0274] 在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体是I-OnuI变体。参见例如SEQ ID NO:6-12。
[0275] 在一个实施例中，靶向CBLB基因的重编程的I-OnuI LHE或I-OnuI变体是由天然I-OnuI或其生物活性片段(SEQ ID NO:1-5)产生。在一个优选实施例中，靶向人CBLB基因的重
编程的I-OnuI LHE或I-OnuI变体是由现有I-OnuI变体产生。在一个实施例中，产生的重编
程的I-OnuI LHE是针对SEQ ID NO:20中所示的人CBLB基因靶位点。
[0276] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的重编程的I-OnuI LHE或I-OnuI变体在DNA识别界面中包含一个或多个氨基酸取代。在特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因
的I-OnuI LHE与I-OnuI(Taekuchi等人,2011《.美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci 
U.S.A.)》2011年8月9日；108(32):13077-13082)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-
OnuI LHE变体、其生物活性片段和/或其另外地变体的DNA识别界面包含至少70％、至少
71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少
88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
[0277] 在一个实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE与I-OnuI(Taekuchi等人,2011《. 美国国家科学院院刊》2011年8月9日；108(32):13077-13082)或如SEQ ID NO:6-12
中任一个中所示的I-OnuI LHE变体、其生物活性片段和/或其另外的变体的DNA识别界面包
含至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少99％序列一致性。
[0278] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在SEQ ID NO:1-12中任一个中所示的I-OnuI、其生物活性片段和/或其另外的变体的DNA识别界面中包含一
个或多个氨基酸取代或修饰。
[0279] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其
另外的变体的DNA识别界面中，特别是在位于位置24至50、68至82、180至203以及223至240
的子结构域中包含一个或多个氨基酸取代或修饰。
[0280] 在特定实施例中，HE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体的DNA识别界面中选自由以下
组成的组的氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸取代：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、
40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、78、80、82、180、182、184、186、188、189、190、191、192、
193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
[0281] 在特定实施例中，HE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体的选自由以下组成的组的氨
基酸位置处包含一个或多个氨基酸取代：19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、
46、48、59、68、70、72、75、76 77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、
193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
[0282] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其
另外的变体的DNA识别界面中，特别是位于位置24至50、68至82、180至203以及223至240的
子结构域中包含5、10、15、20、25、30、35或40个或更多个氨基酸取代或修饰。
[0283] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其
另外的变体的选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含5、10、15、20、25、30、35或40个或更多个氨基酸取代或修饰：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、
75、76、78、80、82、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、
223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
[0284] 在一个特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其
另外的变体的选自由以下组成的组的氨基酸位置处包含5、10、15、20、25、30、35或40个或更多个氨基酸取代或修饰：19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、
70、72、75、76 77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、
199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238及240。
[0285] 在一个实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体在位于整个I-OnuI序列内任何地方的另外的位置处包含一个或多个氨基酸取代或修饰。可以被取代和/或修饰
的残基包括但不限于接触核酸靶或者直接地或通过水分子与核酸主链或核苷酸碱基相互
作用的氨基酸。在一个非限制性实例中，本文所涵盖的结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI 
LHE变体在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其
生物活性片段和/或其另外的变体的选自由以下位置组成的位置组的至少一个位置中包含
一个或多个取代和/或修饰，优选至少5个、优选至少10个、优选至少15个、优选至少20个、更优选至少25个、更优选至少30个、甚至更优选地至少35个或甚至更优选至少40个或更多个
氨基酸取代：24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、78、80、92、
116、138、143、159、168、178、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、
201、203、207、223、225、227、232、236及238。
[0286] 在某些实施例中，HE变体裂解CBLB外显子6靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个中所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中
包含以下氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优
选至少40个或更多个：S24C、L26R、L26G、R28D、R28Y、R30H、N32A、N32S、K34D、K34V、S35L、S36R、V37A、V37S、S40R、E42R、G44A、G44S、Q46E、T48V、T48S、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、F182M、N184E、I186K、I186M、S188R、S188N、K189R、S190N、K191P、K191N、L192V、G193K、G193I、Q195G、Q195R、Q197R、V199R、S201G、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0287] 在一些实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0288] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0289] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0290] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、V68K、A70Y、S72A、S78R、K80Q、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0291] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26G、R28Y、R30H、N32S、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48S、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0292] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、R30H、N32A、K34V、S35L、S36R、V37S、S40R、E42R、G44S、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182V、N184E、I186K、S188R、K189R、K191P、L192V、G193K、Q195G、Q197R、V199R、S201G、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0293] 在特定实施例中，HE变体裂解CBLB靶位点并在I-OnuI(SEQ ID NO:1-5)或如SEQ ID NO:6-12中任一个所示的I-OnuI变体、其生物活性片段和/或其另外的变体中包含以下
氨基酸取代中的至少5个、至少15个、优选至少25个、更优选至少35个或甚至更优选至少40
个或更多个：S24C、L26R、R28D、N32A、K34D、S35L、S36R、V37A、S40R、E42R、G44A、Q46E、T48V、V68T、A70Y、S72A、S78R、K80Q、D92G、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182M、N184E、I186M、S188N、S190N、K191N、L192V、G193I、Q195R、Q197R、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225V、K227N、F232H、D236E及V238I。
[0294] 在特定实施例中，结合并裂解人CBLB基因的I-OnuI LHE变体包含与SEQ ID NO:6-12中任一个或其生物活性片段中所示的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少
90％或甚至更优选至少95％一致的氨基酸序列。
[0295] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:6-12中任一个或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0296] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:6或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0297] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:7或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0298] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:8或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0299] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:9或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0300] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:10或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0301] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:11或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0302] 在特定实施例中，I-OnuI LHE变体包含SEQ ID NO:12或其生物活性片段中所示的氨基酸序列。
[0303] 2.MegaTAL
[0304] 在各种实施例中，包含归巢核酸内切酶变体的megaTAL被重编程以在CBLB基因中的靶位点中引入双链断裂(DSB)。在特定实施例中，megaTAL在CBLB基因外显子6中，优选地
在CBLB基因外显子6中的SEQ ID NO:20处，并且更优选地在CBLB基因外显子6中SEQ ID NO:
20中的序列“ATTC”处引入DSB。
[0305] “megaTAL”是指包含TALE DNA结合结构域以及结合并裂解CBLB基因中的DNA靶序列的归巢核酸内切酶变体的多肽，并且任选地包含一个或多个连接子和/或另外的功能结
构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶
(例如Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶或不依赖于模板的DNA聚合酶活性的末端加工
酶结构域。
[0306] 在特定实施例中，megaTAL可以与末端加工酶一起引入细胞中，所述末端加工酶展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'瓣状核酸内
切酶、解螺旋酶、模板依赖性DNA聚合酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。megaTAL和3'加工
酶可以分开地引入，例如利用不同载体或独立mRNA引入；或一起引入，例如以融合蛋白形
式，或以通过病毒自裂解肽或IRES元件隔开的多顺反子构建体引入。
[0307] “TALE DNA结合结构域”是转录活化因子样效应子(TALE或TAL效应子)的DNA结合部分，其模拟植物转录活化因子以操作植物转录物组(参见例如Kay等人,2007《. 科学
(Science)》318:648-651)。特定实施例中所涵盖的TALE DNA结合结构域是从头工程改造得
到或由天然存在的TALE，例如来自野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas 
campestris pv.vesicatoria)、大豆黄单胞菌(Xanthomonas gardneri)、半透明黄单胞菌
(Xanthomonas translucens)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、番茄黄单胞菌
(Xanthomonas perforans)、苜蓿黄单胞菌(Xanthomonas alfalfa)、柑橘黄单胞菌
(Xanthomonas citri)、辣椒-番茄黄单胞菌(Xanthomonas euvesicatoria)和水稻黄单胞
菌(Xanthomonas oryzae)的AvrBs3，以及来自茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的
brg11和hpx17工程改造得到。用于得到并设计DNA结合结构域的TALE蛋白质的示例性实例
公开于美国专利第9,017,967号和其中引用的参考文献中，其全部以引用的方式整体并入
本文中。
[0308] 在特定实施例中，megaTAL包含TALE DNA结合结构域，该TALE DNA结合结构域包含TALE DNA结合结构域与其相应靶DNA序列结合所涉及的一个或多个重复单元。单一“重复单
元”(又称为“重复”)典型地是33-35个氨基酸长度。每个TALE DNA结合结构域重复单元典型地在该重复的12位和/或13位包括1或2个DNA结合残基，构成重复可变双残基(Repeat 
Variable Di-Residue，RVD)。已测定这些TALE DNA结合结构域的DNA识别序列的天然(典
型)编码序列，由此在12位和13位的HD序列使得结合至胞嘧啶(C)，NG结合至T，NI结合至A，
NN结合至G或A且NG结合至T。在某些实施例中，涵盖非典型(非典型性)RVD。
[0309] 适用于特定实施例中所涵盖的特定megaTAL中的非典型RVD的示例性实例包括但不限于用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；用于识别腺嘌呤(A)的NI、KI、RI、HI、SI；用于识别胸腺嘧啶(T)的NG、HG、KG、RG；用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD、HD、ND、KD、YG；用于识别A或G的NV、HN；以及用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意思指13位的氨基酸不存在。适用于特定实施例中所涵盖的特定megaTAL中的
RVD的其它示例性实例还包括以全文引用的方式并入本文中的美国专利第8,614,092号中
所公开的那些。
[0310] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包括含3至30个重复单元的TALE DNA结合结构域。在某些实施例中，megaTAL包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个TALE DNA结合结构域重复单元。在一个优选实施例中，本文所涵盖的megaTAL包括含5-15个重复单元、更优选7-15个重复单元、更优选9-15
个重复单元并且更优选地9、10、11、12、13、14或15个重复单元的TALE DNA结合结构域。
[0311] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包括含3至30个重复单元和另外的单个截短的TALE重复单元的TALE DNA结合结构域，所述截短的TALE重复单元包含位于一组TALE重
复单元的C末端处的20个氨基酸，即，另外的在C末端的一半TALE DNA结合结构域重复单元
(本文别处所公开的C-帽的氨基酸-20至-1，见下文)。在特定实施例中，本文所涵盖的
megaTAL包括含3.5至30.5个重复单元的TALE DNA结合结构域。在某些实施例中，megaTAL包
含3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、
19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5或30.5个TALE DNA结合结构域重复单元。在一个优选实施例中，本文所涵盖的megaTAL包括含5.5-15.5个重复单元、
更优选7.5-15.5个重复单元、更优选9.5-15.5个重复单元并且更优选地9.5、10.5、11.5、
12.5、13.5、14.5或15.5个重复单元的TALE DNA结合结构域。
[0312] 在特定实施例中，megaTAL包含TAL效应子架构，所述TAL效应子架构包含“N末端结构域(NTD)”多肽、一个或多个TALE重复结构域/单元、“C末端结构域(CTD)”多肽和归巢核酸内切酶变体。在一些实施例中，所述NTD、TALE重复和/或CTD结构域是来自相同物种。在其它实施例中，所述NTD、TALE重复和/或CTD结构域中的一个或多个是来自不同物种。
[0313] 如本文所使用，术语“N末端结构域(NTD)”多肽是指侧接天然存在的TALE DNA结合结构域的N末端部分或片段的序列。NTD序列如果存在的话，可具有任何长度，只要TALE DNA
结合结构域重复单元保持结合DNA的能力即可。在特定实施例中，NTD多肽包含在TALE DNA
结合结构域N末端的至少120个到至少140个或更多个氨基酸(0是在最N末端重复单元的氨
基酸1)。在特定实施例中，NTD多肽包含在TALE DNA结合结构域N末端的至少约120、121、
122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或至少
140个氨基酸。在一个实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含在黄单胞菌属TALE蛋白质的至
少约氨基酸+1至+122到至少约+1至+137的NTD多肽(0是在最N末端重复单元的氨基酸1)。在
特定实施例中，NTD多肽包含在黄单胞菌属TALE蛋白质TALE DNA结合结构域N末端的至少约
122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137个氨基酸。在一个实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含在罗尔斯通氏菌属TALE蛋白质的至少氨基酸+1至+
121的NTD多肽(0是在最N末端重复单元的氨基酸1)。在特定实施例中，NTD多肽包含在罗尔
斯通氏菌属TALE蛋白质TALE DNA结合结构域N末端的至少约121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137个氨基酸。
[0314] 如本文所使用，术语“C末端结构域(CTD)”多肽是指侧接天然存在的TALE DNA结合结构域的C末端部分或片段的序列。CTD序列如果存在的话，可具有任何长度，只要TALE DNA
结合结构域重复单元保持结合DNA的能力即可。在特定实施例中，CTD多肽包含在TALE DNA
结合结构域最后一个完整重复的C末端的至少20个到至少85个或更多个氨基酸(前20个氨
基酸是在最后一个C末端完整重复单元C末端的一半重复单元)。在特定实施例中，CTD多肽
包含在TALE DNA结合结构域最后一个完整重复的C末端的至少约20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、443、44、45、46、47、48、49、50、51、
52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、
77、78、79、80、81、82、83、84或至少85个氨基酸。在一个实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含在黄单胞菌属TALE蛋白质的至少约氨基酸-20至-1的CTD多肽(-20是在最后一个C末端完
整重复单元的C末端的一半重复单元的氨基酸1)。在特定实施例中，CTD多肽包含在黄单胞
菌属TALE蛋白质TALE DNA结合结构域的最后一个完整重复的C末端的至少约20、19、18、17、
16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在一个实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含在罗尔斯通氏菌属TALE蛋白质的至少约氨基酸-20至-1的CTD多肽(-20是在最
后一个C末端完整重复单元的C末端的一半重复单元的氨基酸1)。在特定实施例中，CTD多肽
包含在罗尔斯通氏菌属TALE蛋白质TALE DNA结合结构域的最后一个完整重复的C末端的至
少约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
[0315] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含融合多肽，所述融合多肽包含被工程改造成结合靶序列的TALE DNA结合结构域、重编程用于结合并裂解靶序列的归巢核酸内切
酶以及任选地NTD和/或CTD多肽任选地通过本文别处涵盖的一个或多个连接子多肽彼此接
合在一起。不希望受任何特定理论束缚，预期包含TALE DNA结合结构域和任选地NTD和/或
CTD多肽的megaTAL与连接子多肽融合，所述连接子多肽又与归巢核酸内切酶变体融合。因
此，TALE DNA结合结构域结合在距归巢核酸内切酶变体DNA结合结构域所结合的靶序列约
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸内的DNA靶序列。通过这种方式，本文所涵盖的megaTAL增加基因组编辑的特异性和效率。
[0316] 在一个实施例中，megaTAL包含归巢核酸内切酶变体和TALE DNA结合结构域，所述TALE DNA结合结构域结合在重编程的归巢核酸内切酶的结合位点上游约4、5或6个核苷酸，
优选5或6个核苷酸内的核苷酸序列。
[0317] 在一个实施例中，megaTAL包含归巢核酸内切酶变体和结合SEQ ID NO:21中所示的核苷酸序列的TALE DNA结合结构域，所述核苷酸序列是在归巢核酸内切酶变体(SEQ ID 
NO:20)所结合和裂解的核苷酸序列上游的5个核苷酸(即，在TALE结合位点与HE结合位点之
间存在4个核苷酸)。在优选实施例中，megaTAL靶序列是SEQ ID NO:22。
[0318] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含一个或多个TALE DNA结合重复单元和LHE变体，所述LHE变体是由选自由以下组成的组的LHE设计或重编程得到：I-AabMI、I-
AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I以及其变体，或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI以及其变体，或更优选地I-OnuI和其变体。
[0319] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含NTD、一个或多个TALE DNA结合重复单元、CTD和LHE变体，所述LHE变体选自由以下组成的组：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-
ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I以及其变体，或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI以及其变体，或更优选地I-OnuI和其变体。
[0320] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含NTD、约9.5至约15.5个TALE DNA结合重复单元和LHE变体，所述LHE变体选自由以下组成的组：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-
ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I以及其变体，或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI以及其变体，或更优选地I-OnuI和其变体。
[0321] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含具有约122个氨基酸至137个氨基酸、约9.5个、约10.5个、约11.5个、约12.5个、约13.5个、约14.5个或约15.5个结合重复单元的NTD、具有约20个氨基酸至约85个氨基酸的CTD以及I-OnuI LHE变体。在特定实施例中，NTD、DNA结合结构域和CTD中的任一个、二个或全部可以由相同物种或不同物种以任何适合组合
设计。
[0322] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL包含SEQ ID NO:13-19中任一个中所示的氨基酸序列。
[0323] 在特定实施例中，本文所涵盖的megaTAL-Trex2融合蛋白包含SEQ ID NO:13-19和38中任一个中所示的氨基酸序列。
[0324] 在某些实施例中，megaTAL包含TALEDNA结合结构域并且I-OnuI LHE变体结合并裂解SEQ ID NO:22中所示的核苷酸序列。
[0325] 3.末端加工酶
[0326] 特定实施例中所涵盖的基因组编辑组合物和方法包含使用核酸酶变体以及末端加工酶的一个或多个拷贝编辑细胞基因组。在特定实施例中，单一聚核苷酸编码通过连接
子、自裂解肽序列如2A序列或通过IRES序列隔开的归巢核酸内切酶变体和末端加工酶。在
特定实施例中，基因组编辑组合物包含编码核酸酶变体的聚核苷酸和编码末端加工酶的独
立的聚核苷酸。在特定实施例中，基因组编辑组合物包含编码呈单一融合多肽形式的归巢
核酸内切酶变体和末端加工酶的聚核苷酸。在一个实施例中，融合多肽包含megaTAL和一个
或多个末端加工酶拷贝，各自通过自裂解肽隔开。
[0327] 术语“末端加工酶”是指修饰聚核苷酸链的暴露端的酶。所述聚核苷酸可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA与RNA的双链杂交物以及合成DNA(例如含有除A、C、G和T外的碱基)。末端加工酶可以通过添加一个或多个核苷酸、移除一个或多个核苷酸、移除
或修饰磷酸酯基和/或移除或修饰羟基来修饰暴露的聚核苷酸链两端。末端加工酶可以在
核酸内切酶切割位点处或在通过其它化学或机械手段，如剪切(例如通过穿过精细规格针、
加热、超声波处理、微型珠粒翻滚以及喷洒)、电离辐射、紫外辐射、氧自由基、化学水解以及化学治疗剂产生的末端处修饰末端。
[0328] 在特定实施例中，特定实施例中所涵盖的基因组编辑组合物和方法包含使用归巢核酸内切酶变体或megaTAL和DNA末端加工酶编辑细胞基因组。
[0329] 术语“DNA末端加工酶”是指修饰DNA的暴露端的酶。DNA末端加工酶可以修饰钝端或交错端(具有5'或3'突出的末端)。DNA末端加工酶可以修饰单链或双链DNA。DNA末端加工
酶可以在核酸内切酶切割位点处或在通过其它化学或机械手段，如剪切(例如通过穿过精
细规格针、加热、超声波处理、微型珠粒翻滚以及喷洒)、电离辐射、紫外辐射、氧自由基、化学水解以及化学治疗剂产生的末端处修饰末端。DNA末端加工酶可以通过添加一个或多个
核苷酸、移除一个或多个核苷酸、移除或修饰磷酸酯基和/或移除或修饰羟基来修饰暴露的
DNA末端。
[0330] 适用于本文所涵盖的特定实施例中的DNA末端加工酶的示例性实例包括但不限于：5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解螺旋酶、磷酸酶、水解酶以及不依赖于模板的DNA聚合酶。
[0331] 适用于本文所涵盖的特定实施例中的DNA末端加工酶的其它示例性实例包括但不限于Trex2、Trex1、无跨膜结构域的Trex1、Apollo、Artemis、DNA2、Exo1、ExoT、ExoIII、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、λ核酸外切酶、Sox、牛痘DNA聚合酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7-核酸外切酶基因6、禽成髓细胞瘤病毒整合蛋白(IN)、Bloom、热敏磷酸酶、碱性磷酸酶、聚核苷酸激酶(PNK)、ApeI、绿豆核酸酶、Hex1、TTRAP(TDP2)、Sgs1、Sae2、CUP、聚合酶μ(Pol mu)、聚合酶λ(Pol lambda)、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4以及UL-12。
[0332] 在特定实施例中，本文所涵盖的用于编辑细胞基因组的基因组编辑组合物和方法包括含归巢核酸内切酶变体或megaTAL和核酸外切酶的多肽。术语“核酸外切酶”是指通过
水解反应裂解在聚核苷酸链一端处的磷酸二酯键的酶，所述水解反应使3'或5'端的磷酸二
酯键断裂。
[0333] 适用于本文所涵盖的特定实施例中的核酸外切酶的示例性实例包括但不限于：hExoI、酵母ExoI、大肠杆菌ExoI、hTREX2、小鼠TREX2、大鼠TREX2、hTREX1、小鼠TREX1以及大鼠TREX1。
[0334] 在特定实施例中，DNA末端加工酶是3'或5'核酸外切酶，优选地是Trex 1或Trex2，更优选地是Trex2，并且甚至更优选地是人或小鼠Trex2。
[0335] D.靶位点
[0336] 特定实施例中所涵盖的核酸酶变体可以被设计用于结合至任何适合的靶序列并且相较于天然存在的核酸酶，可以具有新颖的结合特异性。在特定实施例中，靶位点是基因
调控区，包括但不限于启动子、增强子、阻遏子元件等。在特定实施例中，靶位点是基因编码区或剪接位点。在某些实施例中，核酸酶变体被设计用于下调或减少基因的表达。在特定实
施例中，核酸酶变体和供体修复模板可以被设计用于修复或除去所希望的靶序列。
[0337] 在各种实施例中，核酸酶变体结合并裂解人卡西塔斯B谱系(Cbl)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基因中的靶序列。CBL又称为CBL2；伴随或不伴随幼年型髓单核细胞白血病的努南
综合症样病症(Noonan syndrome-like disorder with or without juvenile 
myelomonocytic leukemia，NSLL)；C-CBL；RING指蛋白55(RNF55)；罕见脆性位点，叶酸型
fra(11)(q23.3)(FRA11B)；E3泛素-蛋白质连接酶CBL；Cas-Br-M(鼠类)单嗜性反转录病毒
转化序列；Cbl原癌基因、E3泛素蛋白质连接酶；RING型E3泛素转移酶CBL；卡西塔斯B谱系淋巴瘤原癌基因；癌基因CBL2；原癌基因c-Cbl；以及信号转导蛋白质CBL。
[0338] 这一基因是编码RING指E3泛素连接酶的原癌基因。编码的蛋白质是靶向被蛋白酶体降解的底物所需的一种酶。这一蛋白质介导泛素从泛素缀合酶(E2)转移至特定底物。这
一蛋白质还含有N末端磷酸酪氨酸结合结构域，使其与多种酪氨酸磷酸化的底物相互作用
并靶向这些底物以实现蛋白酶体降解。CBLB充当包括T细胞活化和持久性在内的许多信号
转导路径的负调控剂。
[0339] 在特定实施例中，归巢核酸内切酶变体或megaTAL在CBLB基因中的靶位点中引入双链断裂(DSB)。在特定实施例中，归巢核酸内切酶变体或megaTAL在CBLB基因外显子6中，
优选在CBLB基因外显子6中的SEQ ID NO:20处，并且更优选在CBLB基因外显子6中SEQ ID 
NO:20中的序列“ATTC”处引入DSB。
[0340] 在一个优选实施例中，归巢核酸内切酶变体或megaTAL裂解双链DNA并将DSB引入SEQ ID NO:20或22中所示的聚核苷酸序列中。
[0341] 在一个优选实施例中，CBLB基因是人CBLB基因。
[0342] E.供体修复模板
[0343] 核酸酶变体可用于在靶序列中引入DSB；所述DSB可以在一个或多个供体修复模板存在下，通过同源介导修复(HDR)机制修复。
[0344] 在各种实施例中，所述供体修复模板包含编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的一个或多个聚核苷酸。
[0345] 在各种实施例中，预期在独立地编码靶向不同免疫抑制路径的免疫效力增强剂和/或免疫抑制信号阻断剂的多个供体修复模板存在下，向细胞提供工程改造的核酸酶，产
生治疗功效和持久性增加的基因组编辑过的T细胞。例如，靶向PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIM3、IL-10R、TIGIT以及TGFβRII路径的组合的免疫效力增强剂或免疫抑制信号在特定实施例中
可为优选的。
[0346] 在特定实施例中，使用了供体修复模板将序列插入基因组中。在特别优选的实施例中，使用了供体修复模板修复或修饰基因组中的序列。
[0347] 在各种实施例中，通过用包含供体修复模板的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒如慢病毒、IDLV等、单纯疱疹病毒、腺病毒或牛痘病毒载体转导细胞，将供体修复模板引入造血
细胞，例如T细胞中。
[0348] 在特定实施例中，供体修复模板包含侧接DSB位点的一个或多个同源臂。
[0349] 如本文所使用，术语“同源臂”是指供体修复模板中与侧接靶位点处由核酸酶引入的DNA断裂的DNA序列一致或大体上一致的核酸序列。在一个实施例中，供体修复模板包含
5'同源臂，其包含与在DNA断裂位点5'端的DNA序列一致或大体上一致的核酸序列。在一个
实施例中，供体修复模板包含3'同源臂，其包含与在DNA断裂位点3'端的DNA序列一致或大
体上一致的核酸序列。在一个优选实施例中，供体修复模板包含5'同源臂和3'同源臂。供体
修复模板可与紧邻DSB位点的基因组序列同源，或与在距DSB位点多个碱基对内的基因组序
列同源。在特定实施例中，一对同源臂包括一个含聚核苷酸序列的同源臂，该聚核苷酸序列
包括针对双链断裂的靶位点且在靶位点中具有突变以使该靶位点的再裂解减到最少。在一
个实施例中，供体修复模板包含与基因组序列或同源臂同源的约5bp、约10bp、约25bp、约
50bp、约100bp、约250bp、约500bp、约1000bp、约2500bp、约5000bp、约10000bp或更长的核酸序列，包括任何中间长度的同源序列。
[0350] 特定实施例中所涵盖的适合长度的同源臂的示例性实例可以独立地选择并且包括但不限于：5bp、约10bp、约25bp、约50bp、约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp、约1500bp、约1600bp、约1700bp、约1800bp、约1900bp、约2000bp、约2100bp、约2200bp、约
2300bp、约2400bp、约2500bp、约2600bp、约2700bp、约2800bp、约2900bp或约3000bp，或更长的同源臂，包括所有中间长度的同源臂。
[0351] 适合同源臂长度的其它示例性实例包括但不限于：约100bp至约3000bp、约200bp至约3000bp、约300bp至约3000bp、约400bp至约3000bp、约500bp至约3000bp、约500bp至约
2500bp、约500bp至约2000bp、约750bp至约2000bp、约750bp至约1500bp或约1000bp至约
1500bp，包括所有中间长度的同源臂。
[0352] 在一个特定实施例中，5'同源臂和3'同源臂的长度独立地选自约500bp至约1500bp。在一个实施例中，5'同源臂是约1500bp并且3'同源臂是约1000bp。在一个实施例
中，5'同源臂在约200bp至约600bp之间并且3'同源臂在约200bp至约600bp之间。在一个实
施例中，5'同源臂是约200bp并且3'同源臂是约200bp。在一个实施例中，5'同源臂是约
300bp并且3'同源臂是约300bp。在一个实施例中，5'同源臂是约400bp并且3'同源臂是约
400bp。在一个实施例中，5'同源臂是约500bp并且3'同源臂是约500bp。在一个实施例中，5'同源臂是约600bp并且3'同源臂是约600bp。
[0353] 在特定实施例中，供体修复模板可包含一个或多个表达盒。在某些实施例中，供体修复模板可包含一个或同源臂以及一个或多个聚核苷酸，包括但不限于启动子和/或增强
子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信
号、编码自裂解多肽的聚核苷酸以及表位标签。
[0354] 在各种实施例中，供体修复模板包含5'同源臂；RNA聚合酶II启动子；编码免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体的一个或多个聚核苷酸；以及3'同
源臂。
[0355] 在各种实施例中，用供体修复模板修饰靶位点，所述供体修复模板包含5'同源臂；编码自裂解病毒肽如T2A、免疫效力增强剂、免疫抑制信号阻断剂或工程改造的抗原受体，
任选地聚腺苷酸化信号或自裂解肽的一个或多个聚核苷酸；以及3'同源臂，其中所述一个
或多个聚核苷酸的表达是由内源性CBLB启动子控制。
[0356] 1.免疫效力增强剂
[0357] 在特定实施例中，通过在含编码免疫效力增强剂的聚核苷酸的供体修复模板存在下，在CBLB基因中引入DSB使本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞更强效和/或对免
疫抑制因子更具抗性。如本文所使用，术语“免疫效力增强剂”是指刺激和/或增强T细胞活
化和/或功能的非天然存在的分子、免疫增强因子，以及在T细胞或其它免疫细胞中将来自
肿瘤微环境的免疫抑制信号转化成免疫刺激信号的非天然存在的多肽。
[0358] 在特定实施例中，免疫效力增强剂选自由以下组成的组：双特异性T细胞接合分子(BiTE)；免疫增强因子，包括但不限于细胞因子、趋化因子、细胞毒素和/或细胞因子受体；
以及翻转受体。
[0359] 在一些实施例中，免疫效力增强剂、免疫增强因子或翻转受体是包含蛋白质不稳定结构域。
[0360] a.双特异性T细胞接合分子(BiTE)
[0361] 在特定实施例中，通过在含编码双特异性T细胞接合分子(BiTE)的聚核苷酸的供体修复模板存在下，在CBLB基因中引入DSB使本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞
更强效。BiTE分子是由两部分组成的分子，其包含结合靶抗原的第一结合结构域、本文别处
所涵盖的连接子或间隔子以及结合免疫效应细胞上的刺激或共刺激分子的第二结合结构
域。第一结合结构域和第二结合结构域可以独立地选自配体、受体、抗体或其抗原结合片
段、凝集素以及碳水化合物。
[0362] 在特定实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域是抗原结合结构域。
[0363] 在特定实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域是抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域是单链可变片段(scFv)。
[0364] 在特定实施例中，可以被第一结合结构域识别和结合的靶抗原的示例性实例包括但不限于：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+
MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、
Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
[0365] 靶抗原的其它示例性实施例包括MHC-肽复合物，任选地其中所述肽是由以下各物加工得到：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、MAGE1、NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
[0366] 在特定实施例中，免疫效应细胞上被第二结合结构域识别并结合的刺激或共刺激分子的示例性实例包括但不限于：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD134、CD137以及CD278。
[0367] 在特定实施例中，在CBLB基因中通过工程改造的核酸酶诱导DSB，并且含编码BiTE的聚核苷酸的供体修复模板被引入细胞中并通过同源重组插入CBLB基因中。
[0368] b.免疫增强因子
[0369] 在特定实施例中，通过在基因组编辑过的细胞或处于肿瘤微环境中的细胞中增加免疫增强因子，使本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞更强效。免疫增强因子是指
增强免疫效应细胞中的免疫反应的特定细胞因子、趋化因子、细胞毒素和细胞因子受体。在
一个实施例中，通过在含编码细胞因子、趋化因子、细胞毒素或细胞因子受体的聚核苷酸的
供体修复模板存在下，在CBLB基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。
[0370] 在特定实施例中，供体修复模板包含编码选自由以下组成的组的细胞因子的聚核苷酸：IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15以及TNF-α。
[0371] 在特定实施例中，供体修复模板包含编码选自由以下组成的组的趋化因子的聚核苷酸：MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES。
[0372] 在特定实施例中，供体修复模板包含编码选自由以下组成的组的细胞毒素的聚核苷酸：穿孔素(Perforin)、颗粒酶A和颗粒酶B。
[0373] 在特定实施例中，供体修复模板包含编码选自由以下组成的组的细胞因子受体的聚核苷酸：IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体以及IL-21受体。
[0374] c.翻转受体
[0375] 在特定实施例中，本文中所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞通过“翻转”或“逆转”免疫抑制因子的免疫抑制信号而变得对耗竭具有更高的抗性，所述免疫抑制信号是
由肿瘤微环境针对阳性免疫刺激信号引发。在一个实施例中，通过在含编码翻转受体的聚
核苷酸的供体修复模板存在下，将DSB引入CBLB基因中，对T细胞进行工程改造。如本文所使
用，术语“翻转受体”是指将来自肿瘤微环境的免疫抑制信号转化成T细胞中的免疫刺激信
号的非天然存在的多肽。在优选实施例中，翻转受体是指一种多肽，该多肽包含结合免疫抑
制因子的胞外结构域、跨膜结构域和将免疫刺激信号转导至T细胞中的胞内结构域。
[0376] 在一个实施例中，供体修复模板编码翻转受体，该翻转受体包含结合免疫抑制细胞因子的胞外结构域或细胞外结合结构域、跨膜结构域和免疫增强细胞因子受体的胞内结
构域。
[0377] 在特定实施例中，翻转受体包含结合免疫抑制细胞因子的胞外结构域，其是以下的细胞外细胞因子结合结构域：IL-4受体、IL-6受体、IL-8受体、IL-10受体、IL-13受体、TGFβ受体1或TGFβ受体2；从CD4、CD8α、CD27、CD28、CD134、CD137、CD3、TGFβ受体1、TGFβ受体2、IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体或IL-21受体分离的跨膜结构域；以及从IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体或IL-21受体分离的胞内结构域。
[0378] 在特定实施例中，翻转受体包含结合免疫抑制细胞因子的胞外结构域，其是结合IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、TGFβ受体1或TGFβ受体2的抗体或其抗原结合片段；从CD4、CD8α、CD27、CD28、CD134、CD137、CD3、TGFβ受体1或TGFβ受体2、IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体或IL-21受体分离的跨膜结构域；以及从IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-
15受体或IL-21受体分离的胞内结构域。
[0379] 在一个实施例中，供体修复模板包含翻转受体，该翻转受体包含结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域和/或初级信
号传导结构域。
[0380] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞外结构域的示例性实例包括但不限于：受体的细胞外配位体结合结构域，其包含ITIM和/或ITSM。
[0381] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞外结构域的其它示例性实例包括但不限于以下的细胞外配体结合结构域：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、BTLA、CEACAM1、TIGIT、TGFβRI、TGFβRII、IL4R、IL6R、CXCR1、CXCR2、IL10R、IL13Rα2、TRAILR1、RCAS1R及FAS。
[0382] 在一个实施例中，胞外结构域包含选自由以下组成的组的受体的细胞外配体结合结构域：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、TGFβRI及TGFβRII。
[0383] 在一个实施例中，供体修复模板包含翻转受体，该翻转受体包含结合免疫抑制细胞因子的胞外结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域和/或初
级信号传导结构域。
[0384] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的跨膜结构域的示例性实例包括但不限于以下蛋白质的跨膜结构域：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、T细胞受体的TGFβRI和TGFβRIIα或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
[0385] 在各种实施例中，翻转受体包含引发免疫刺激信号的胞内结构域。如本文中所使用，术语“胞内结构域”是指免疫刺激基元或结构域，包括但不限于免疫受体酪氨酸活化基
元(ITAM)、共刺激信号传导结构域、初级信号传导结构域或与在T细胞中引发免疫刺激信号
相关的另一个细胞内结构域。
[0386] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞内结构域的示例性实例包括但不限于含ITAM基元的结构域。
[0387] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞内结构域的额外示例性实例包括但不限于从以下分离的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、
TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM或ZAP70。
[0388] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞内结构域的额外示例性实例包括但不限于：从IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体或IL-21受体分离的胞内结构域。
[0389] 适用于特定实施例中所涵盖的翻转受体的特定实施例中的胞内结构域的额外示例性实例包括但不限于从以下分离的初级信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。
[0390] 在特定实施例中，翻转受体包含胞外结构域，该胞外结构域包含来自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、TGFβRI或TGFβRII的细胞外结构域；从IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体或IL-21受体分离的胞内结构域。
[0391] 在特定实施例中，翻转受体包含胞外结构域，该胞外结构域包含来自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、TGFβRI或TGFβRII的细胞外结构域；来自CD3多肽、CD4、CD8α、CD28、CD134、CD137、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TGFβRI及TGFβRII的跨膜结构域；以及来自CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0392] 在特定实施例中，翻转受体包含胞外结构域，该胞外结构域包含来自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、IL10R、TIGIT或TGFβRII的细胞外结构域；来自CD3多肽、CD4、CD8α、CD28、CD134或CD137的跨膜结构域；以及来自CD28、CD134、CD137、CD278和/或CD3ζ的胞内结构域。
[0393] 2.免疫抑制信号阻断剂
[0394] 困扰现有过继性细胞疗法的一个局限或问题是由肿瘤微环境介导的耗竭所引起的免疫效应细胞反应性不足。耗竭T细胞具有明显不同于原始T细胞、效应T细胞或记忆T细
胞的特有分子特征。其被定义为细胞因子表达和效应功能降低的T细胞。
[0395] 在特定实施例中，通过减少或阻断免疫抑制因子的信号传导使本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞对耗竭更具抗性。在一个实施例中，通过在含编码免疫抑制信号
阻断剂的聚核苷酸的供体修复模板存在下，在CBLB基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。
[0396] 如本文所使用，术语“免疫抑制信号阻断剂”是指减弱来自肿瘤微环境的免疫抑制信号至T细胞的转导的非天然存在的多肽。在一个实施例中，免疫抑制信号阻断剂是结合免
疫抑制因子的抗体或其抗原结合片段。在优选实施例中，免疫抑制信号阻断剂是指引起针
对特定免疫抑制因子或信号传导路径的抑制、阻断或显性负性作用的多肽，因为所述阻断
剂包含结合免疫抑制因子的胞外结构域，和任选地，跨膜结构域，以及任选地，经过修饰的
胞内结构域(例如细胞内信号传导结构域)。
[0397] 在特定实施例中，胞外结构域是识别并结合免疫抑制因子的细胞外结合结构域。
[0398] 在特定实施例中，使经过修饰的胞内结构域突变以减弱或抑制免疫抑制信号。适合突变策略包括但不限于氨基酸取代、添加或缺失。适合突变还包括但不限于截短胞内结
构域以移除信号传导结构域；使胞内结构域突变以移除对于信号传导基元活性极为重要的
残基；以及使胞内结构域突变以阻断受体循环。在特定实施例中，胞内结构域当存在时不会
转导免疫抑制信号，或具有基本上减弱的信号传导。
[0399] 因此，在一些实施例中，免疫抑制信号阻断剂充当来自肿瘤微环境的一个或多个免疫抑制因子的接收器(sink)并抑制T细胞中的相应免疫抑制信号传导路径。
[0400] 一种免疫抑制信号是由色氨酸分解代解介导的。癌细胞中由吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)引起的色氨酸分解代解使得产生犬尿氨酸，经显示，犬尿氨酸对肿瘤微环境中的T细
胞具有免疫抑制作用。参见例如Platten等人(2012)《癌症研究(Cancer Res.)》72(21):
5435-40。
[0401] 在一个实施例中，供体修复模板包含具有犬尿氨酸酶活性的酶。
[0402] 适用于特定实施例中的具有犬尿氨酸酶活性的酶的示例性实例包括但不限于L-犬尿氨酸水解酶。
[0403] 在一个实施例中，供体修复模板包含编码免疫抑制信号阻断剂的一个或多个聚核苷酸，所述免疫抑制信号阻断剂减弱或阻断由免疫抑制因子介导的免疫抑制信号传导。
[0404] 特定实施例中所涵盖的作为免疫抑制信号阻断剂的靶的免疫抑制因子的示例性实例包括但不限于：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、转化生长因子β
(TGFβ)、巨噬细胞集落刺激因子1(M-CSF1)、肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、在SiSo细胞上表达的受体结合癌症抗原配体(RCAS1)、Fas配体(FasL)、CD47、白细胞介素-4
(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)以及白细胞介
素-13(IL-13)。
[0405] 在各种实施例中，免疫抑制信号阻断剂包含结合免疫抑制因子的抗体或其抗原结合片段。
[0406] 在各种实施例中，免疫抑制信号阻断剂包含结合免疫抑制因子的胞外结构域。
[0407] 在特定实施例中，免疫抑制信号阻断剂包含结合免疫抑制因子的胞外结构域和跨膜结构域。
[0408] 在另一个实施例中，免疫抑制信号阻断剂包含结合免疫抑制因子的胞外结构域、跨膜结构域以及经过修饰的胞内结构域，所述经过修饰的胞内结构域不转导免疫抑制信号
或具有基本上减弱的转导免疫抑制信号的能力。
[0409] 如本文所使用，术语“胞外结构域”是指抗原结合结构域。在一个实施例中，胞外结构域是将来自肿瘤微环境的免疫抑制信号转导至T细胞中的免疫抑制受体的细胞外配体结合结构域。在特定实施例中，胞外结构域是指包含免疫受体酪氨酸抑制基元(ITIM)和/或免
疫受体酪氨酸转换基元(ITSM)的受体的细胞外配体结合结构域。
[0410] 适用于免疫抑制信号阻断剂的特定实施例中的胞外结构域的示例性实例包括但不限于抗体或其抗原结合片段，或从以下多肽分离的细胞外配体结合结构域：程序性细胞
死亡蛋白质1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3蛋白质(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋
白结构域蛋白质3(TIM3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、b/T淋巴细胞衰减因子
(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基元结构域(TIGIT)、转化生长因子β受体
1(TGFβRI)、转化生长因子β受体2(TGFβRII)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(CSF1R)、白细胞介素4受体(IL4R)、白细胞介素6受体(IL6R)、趋化因子(C-X-C基元)受体1(CXCR1)、趋化因
子(C-X-C基元)受体2(CXCR2)、白细胞介素10受体亚单元α(IL10R)、白细胞介素13受体亚单
元α2(IL13Rα2)、肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAILR1)、在SiSo细胞上表达的受
体结合癌症抗原(RCAS1R)以及Fas细胞表面死亡受体(FAS)。
[0411] 在一个实施例中，胞外结构域包含选自由以下组成的组的受体的细胞外配体结合结构域：PD-1、LAG-3、TIM3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、CSF1R、TGFβRII以及TGFβRII。
[0412] 在特定实施例中，可以使用多个跨膜结构域。特定实施例中所涵盖的适用于免疫抑制信号阻断剂的特定实施例中的跨膜结构域的示例性实例包括但不限于以下蛋白质的
跨膜结构域：T细胞受体的α或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD-1。
[0413] 3.工程改造的抗原受体
[0414] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞包含工程改造的抗原受体。在一个实施例中，通过在CBLB基因中引入DSB来编辑含编码工程改造的抗原受体的
聚核苷酸的T细胞。在一个实施例中，通过在含编码工程改造的抗原受体的聚核苷酸的供体
修复模板存在下，在CBLB基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。
[0415] 在特定实施例中，工程改造的抗原受体是工程改造的T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分，或嵌合细胞因子受体。
[0416] a.工程改造的TCR
[0417] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的免疫效应细胞包含编码工程改造的TCR的聚核苷酸。在一个实施例中，通过在CBLB基因中引入DSB来编辑含编码工程改造的
TCR的聚核苷酸的T细胞。在一个实施例中，通过在编码工程改造的TCR的供体修复模板存在
下，在CBLB基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。在一个特定实施例中，工程改造的TCR被插入单个CBLB等位基因中的DSB处。在另一个实施例中，工程改造的TCR的α链被插入一个
CBLB等位基因中的DSB中，并且工程改造的TCR的β链被插入另一个CBLB等位基因中的DSB
中。
[0418] 在一个实施例中，本文所涵盖的工程改造的T细胞包含未插入CBLB基因处的编码工程改造的TCR的聚核苷酸，和/或以下一种或多种被插入一个或多个CBLB等位基因中的
DSB中：免疫抑制信号阻断剂、翻转受体、工程改造的T细胞受体(TCR)的α链和/或β链、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。
[0419] 天然存在的T细胞受体包含二个亚单元，即α链和β链亚单元，其各自是由每个T细胞基因组中的重组事件所产生的特有蛋白质。可以关于其针对特定靶抗原的选择性筛选
TCR文库。通过这种方式，可以选出对靶抗原具有高亲合力和反应性的天然TCR，克隆且随后
引入T细胞群中用于过继性免疫疗法。
[0420] 在一个实施例中，通过在一个或多个CBLB等位基因中的DSB处引入供体修复模板对T细胞进行修饰，所述供体修复模板包含编码TCR亚单元的聚核苷酸，其中所述TCR亚单元
能够形成TCR以使T细胞对表达靶抗原的肿瘤细胞具有特异性。在特定实施例中，相较于天
然存在的亚单元，所述亚单元具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰，只要所述亚
单元能够形成TCR并且使经过转染的T细胞能够将靶细胞归巢并参与免疫相关细胞因子信
号传导。工程改造的TCR优选地还以高亲合力结合展示相关肿瘤相关肽的靶细胞，并且任选
地介导对在体内呈现相关肽的靶细胞的高效杀灭作用。
[0421] 编码工程改造的TCR的核酸优选地是自其在T细胞的(天然存在的)染色体中的天然环境分离，并且可以被并入适合载体(如本文别处所描述)中。在特定实施例中，所述核酸
和包含所述核酸的载体都可以被转移至细胞，优选地T细胞中。接着，经过修饰的T细胞能够
表达由一个或多个转导的核酸所编码的TCR的一条或多条链。在优选实施例中，由于工程改
造的TCR被引入通常不表达特定TCR的T细胞中，故所述工程改造的TCR是外源TCR。工程改造
的TCR的重要方面是它对主要组织相容性复合体(MHC)或类似免疫组分所呈现的肿瘤抗原
具有高亲合力。相对于工程改造的TCR，CAR被工程改造成以不依赖于MHC的方式结合靶抗
原。
[0422] TCR可以被表达成具有另外的多肽附接至本发明TCR的α链或β链的氨基末端或羧基末端部分，只要所附接的另外的多肽不干扰所述α链或β链形成功能性T细胞受体的能力
以及MHC依赖性抗原识别即可。
[0423] 特定实施例中所涵盖的工程改造的TCR所识别的抗原包括但不限于癌症抗原，包括在血液癌和实体肿瘤上的抗原。示例性抗原包括但不限于α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、
EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
[0424] 在一个实施例中，供体修复模板包含编码RNA聚合酶II启动子或第一自裂解病毒肽的聚核苷酸以及编码整合至一个修饰的和/或非功能性CBLB基因中的工程改造的TCR的α
链和/或β链的聚核苷酸。
[0425] 在一个实施例中，供体修复模板包含编码RNA聚合酶II启动子或第一自裂解病毒肽的聚核苷酸以及编码整合至一个修饰的和/或非功能性CBLB基因中的工程改造的TCR的α
链和β链的聚核苷酸。
[0426] 在一个特定实施例中，供体修复模板自5'至3'包含编码第一自裂解病毒肽的聚核苷酸、编码工程改造的TCR的α链的聚核苷酸、编码第二自裂解病毒肽的聚核苷酸以及编码
整合至一个修饰的和/或非功能性CBLB基因中的工程改造的TCR的β链的聚核苷酸。在这一
情况下，另一个CBLB基因可以具有功能，或可因DSB而具有减弱的功能或呈现非功能性并通
过NHEJ修复。在一个实施例中，另一个CBLB基因已通过本文所涵盖的工程改造的核酸酶进
行修饰并且可具有减弱的功能或呈现非功能性。
[0427] 在某一实施例中，两个CBLB基因都经过修饰并具有减弱的功能或为非功能的：第一个经过修饰的CBLB基因包含一种核酸，所述核酸包含编码第一自裂解病毒肽的聚核苷酸
和编码工程改造的TCR的α链的聚核苷酸；并且第二个经过修饰的CBLB基因包含编码第二自
裂解病毒肽的聚核苷酸和编码工程改造的TCR的β链的聚核苷酸。
[0428] b.嵌合抗原受体(CAR)
[0429] 在特定实施例中，本文所涵盖的工程改造的免疫效应细胞包含一个或多个嵌合抗原受体(CAR)。在一个实施例中，通过在CBLB基因中引入DSB来编辑含编码一个或多个CAR的
聚核苷酸的T细胞。在一个实施例中，通过在编码CAR的供体修复模板存在下，在一个或多个
CBLB基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。在一个特定实施例中，CAR被插入单个CBLB基
因中的DSB处。
[0430] 在一个实施例中，本文所涵盖的工程改造的T细胞包含未插入CBLB基因处的CAR，并且以下一种或多种被插入一个或多个CBLB基因中的DSB中：免疫抑制信号阻断剂、翻转受
体、工程改造的T细胞受体(TCR)的α链和/或β链、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。
[0431] 在各种实施例中，基因组编辑过的T细胞表达将细胞毒性重新引导至肿瘤细胞的CAR。CAR是将抗体针对靶抗原(例如肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域相
组合以产生展现特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所使用，术语“嵌
合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或DNA部分构成。
[0432] 在各种实施例中，CAR包含结合至特异性靶抗原(又称为结合结构域或抗原特异性结合域)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的主要特征是其能够
重新引导免疫效应细胞特异性，由此触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用，或能以不依赖主
要组织相容性(MHC)的方式，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性辅助受体的细胞特
异性靶向能力介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子的产生。
[0433] 在特定实施例中，CAR包含特异性结合至肿瘤细胞上表达的靶多肽，例如靶抗原的细胞外结合结构域。如本文所使用，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”以及“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用并提供能够特异性结合至目的靶抗原的嵌合受体，例如CAR或Daric。结合结构域
可以包含能够特异性识别并结合至生物分子(例如细胞表面受体或肿瘤蛋白质、脂质、多糖
或其它细胞表面靶分子，或其组分)的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。结合结构域包括目的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或以重组方式产生的结合搭配物。
[0434] 在特定实施例中，细胞外结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
[0435] “抗体”是指一种结合剂，即特异性地识别并结合靶抗原如肽、脂质、多糖或含有抗原决定子(如免疫细胞所识别的那些)的核酸的表位的多肽，其包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区。抗体包括抗原结合片段，例如骆驼Ig(骆驼抗体或其VHH片段)、Ig NAR、
Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)
2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白质(“dsFv”)以及单结构域抗体(sdAb、纳米抗体(Nanobody))或它们的其它抗体片段。所述术语还包括基因
工程改造的形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、异偶联物抗体(如双特异性抗体)和其
抗原结合片段。还参见《皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook)》,1994-1995
(Pierce Chemical Co.,伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))；Kuby,J.,《免疫学
(Immunology)》,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
[0436] 在一个优选实施例中，所述结合结构域是scFv。
[0437] 在另一个优选实施例中，所述结合结构域是骆驼抗体。
[0438] 在特定实施例中，CAR包含结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
[0439] 在特定实施例中，CAR包含细胞外结合结构域，例如结合抗原的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原是MHC-肽复合物，如I类MHC-肽复合物或II类MHC-肽复合物。
[0440] 在某些实施例中，CAR在各个结构域之间包含连接子残基。“可变区连接序列”是将重链可变区连接至轻链可变区的氨基酸序列，其提供与所述二个子结合结构域的相互作用
相容的间隔子功能，使得由此得到的多肽保持针对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相
同的靶分子的特异性结合亲和力。在特定实施例中，CAR包含一个、二个、三个、四个或五个或更多个连接子。在特定实施例中，连接子的长度是约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基
酸，或约10至约20个氨基酸，或任何中间长度的氨基酸。在一些实施例中，连接子是1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸长。
[0441] 在特定实施例中，在CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔子结构域”，间隔子结构域是指移动抗原结合结构域远离效应细胞表面以便能实现适当细胞/细胞接触、抗原
结合和活化的区域(Patel等人《, 基因疗法(Gene Therapy)》,1999；6:412-419)。间隔子结构域可来源于天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施例中，间隔子结构域是免疫球蛋
白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔子结构域可以包括
天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0442] 在一个实施例中，间隔子结构域包含IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3。
[0443] 在一个实施例中，CAR的结合结构域被连接至一个或多个“铰链结构域”，铰链结构域在定位抗原结合结构域远离效应细胞表面以便能实现适当细胞/细胞接触、抗原结合和
活化中起到作用。CAR一般在结合结构域与跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构
域。铰链结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在
的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0444] 适用于本文所描述的CAR中的示例性铰链结构域包括来源于1型膜蛋白如CD8α和CD4的细胞外区域的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一
个实施例中，铰链结构域包含CD8α铰链区。
[0445] 在一个实施例中，铰链是PD-1铰链或CD152铰链。
[0446] “跨膜结构域”是CAR中融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并将CAR锚定至免疫效应细胞的质膜的部分。TM结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。
[0447] 示例性TM结构域可以来源于(即，至少包含)T细胞受体α或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154、AMN以及PD-1的跨膜区。
[0448] 在一个实施例中，CAR包含来源于CD8α的TM结构域。在另一个实施例中，本文所涵盖的CAR包含来源于CD8α的TM结构域以及长度优选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间的短寡肽或多肽连接子，所述连接子连接CAR的TM结构域和细胞内信号传导结构域。甘
氨酸-丝氨酸连接子提供特别适合的连接子。
[0449] 在特定实施例中，CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR中参与将有效CAR结合至靶抗原的信息转导至免疫效应细胞内部以引起效应细胞功能
的部分，所述效应细胞功能例如是活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒
性因子释放至结合CAR的靶细胞中，或由抗原结合至细胞外CAR结构域引起的其它细胞反
应。
[0450] 术语“效应功能”是指细胞的特有功能。T细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或帮助或活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指一种蛋白质中转导效应功能信号并引导细胞执行特有功能的部分。尽管通常可采用整个细胞内信号
传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短
部分来说，可使用这类截短部分代替整个结构域，只要其转导效应功能信号即可。术语细胞
内信号传导结构域意图包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短
部分。
[0451] 众所周知，仅由TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要二次或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被认为是由二个不同类别的细胞内信号传导结构域介导：通过TCR
(例如TCR/CD3复合物)起始抗原依赖性初级活化的初级信号传导结构域，以及以不依赖抗
原的方式起作用以提供二次或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选实施例中，CAR
包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含一个或多个“共刺激信号传
导结构域”和一个“初级信号传导结构域”。
[0452] 初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激性方式起作用的初级信号传导结构域可含有信号传导基元，所述信号传导基元称为
免疫受体酪氨酸活化基元或ITAM。
[0453] 适用于特定实施例中所涵盖的CAR中的含ITAM的初级信号传导结构域的示例性实例包括来源于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的那些。
在特别优选的实施例中，CAR包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导
结构域。细胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何次序串联连接至
跨膜结构域的羧基末端。
[0454] 在特定实施例中，CAR包含一个或多个共刺激信号传导结构域，用以增进表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。如本文所使用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
[0455] 适用于特定实施例中所涵盖的CAR中的此类共刺激分子的示例性分子包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在一个实施例中，CAR包含一个或多个选自由CD28、CD137和CD134组成的组的共刺激信号传导结构域，以及一个CD3ζ初级信号传导结构域。
[0456] 在各种实施例中，CAR包含：结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72；自选自由以下组成的组的多肽分离的跨膜结构域：
CD4、CD8α、CD154和PD-1；自选自由以下组成的组的多肽分离的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD134和CD137；以及自选自由以下组成的组的多肽分离的信号传导结
构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。
[0457] c.Daric受体
[0458] 在特定实施例中，工程改造的免疫效应细胞包含一个或多个Daric受体。如本文所使用，术语“Daric受体”是指多链工程改造的抗原受体。在一个实施例中，通过在CBLB基因中引入DSB来编辑含编码一种或多种Daric受体组分的聚核苷酸的T细胞。在一个实施例中，
通过在编码Daric的一种或多种组分的供体修复模板存在下，在一个或多个CBLB等位基因
中引入DSB，对T细胞进行工程改造。在一个特定实施例中，Daric或其一种或多种组分被插
入单个CBLB等位基因中的DSB处。
[0459] 在一个实施例中，工程改造的T细胞包含未插入CBLB基因处的Daric，并且以下一种或多种被插入一个或多个CBLB等位基因中的DSB中：免疫抑制信号阻断剂、翻转受体工程
改造的T细胞受体(TCR)的α链和/或β链、嵌合抗原受体(CAR)、或Daric受体或其组分。
[0460] Daric架构和组分的示例性实例公开于PCT公开第WO2015/017214号和美国专利公开第20150266973号中，其各自以全文引用的方式并入此处。
[0461] 在一个实施例中，供体修复模板包含以下Daric组分：信号传导多肽，其包含第一多聚化结构域、第一跨膜结构域和一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域和/或初级信
号传导结构域；以及结合多肽，其包含结合结构域、第二多聚化结构域和任选地第二跨膜结
构域。功能性Daric包含促进在细胞表面上形成Daric受体复合物的桥接因子，并且所述桥
接因子与信号传导多肽和结合多肽的多聚化结构域缔合并且安置在信号传导多肽和结合
多肽的多聚化结构域之间。
[0462] 在特定实施例中，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域与选自由以下组成的组的桥接因子缔合：雷帕霉素(rapamycin)或其雷帕霉素类似物(rapalog)、库马霉素
(coumermycin)或其衍生物、赤霉素(gibberellin)或其衍生物、脱落酸(ABA)或其衍生物、
甲氨蝶呤(methotrexate)或其衍生物、环孢菌素A(cyclosporin A)或其衍生物、FKCsA或其
衍生物、FKBP的甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)(Tmp)合成配体(SLF)或其衍生物，及其任何
组合。
[0463] 雷帕霉素类似物的示例性实例包括美国专利第6,649,595号中所公开的那些，所述雷帕霉素类似物的结构以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，桥接因子是相
较于雷帕霉素，具有明显较低的免疫抑制作用的雷帕霉素类似物。“明显较低的免疫抑制作
用”是指如在临床上或在具有人免疫抑制活性的适当体外(例如抑制T细胞增殖)或体内替
代物中所测量，雷帕霉素类似物的免疫抑制作用比关于等摩尔量雷帕霉素所观测或预期的
免疫抑制作用的低至少0.1至0.005倍。在一个实施例中，“明显较低的免疫抑制作用”是指
雷帕霉素类似物在此类体外分析中的EC50值比在同一分析中关于雷帕霉素所观测到的
EC50值要高至少10至250倍。
[0464] 雷帕霉素类似物的其它示例性实例包括但不限于依维莫司(everolimus)、诺瓦莫司(novolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、他克莫司
(tacrolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、优米莫司(umirolimus)以及佐他莫司
(zotarolimus)。
[0465] 在某些实施例中，多聚化结构域将与桥接因子缔合，所述桥接因子是雷帕霉素或其雷帕霉素类似物。例如，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域是选自FKBP和FRB的一
对。FRB结构域是能够与FKBP蛋白质和雷帕霉素或其雷帕霉素类似物形成三联复合物的多
肽区域(蛋白质“结构域”)。FRB结构域存在于多种天然存在的蛋白质中，包括来自人类和其它物种的mTOR蛋白质(在文献中又称为FRAP、RAPT1或RAFT)；酵母蛋白质，包括Tor1和Tor2；
以及念珠菌属FRAP同源物。有关这些蛋白质的核苷酸序列、克隆以及其它方面的信息是本
领域中已知的。例如，人mTOR的蛋白质序列登录号是GenBank登录号L34075.1(Brown等人,
《自然(Nature)》369:756,1994)。
[0466] 适用于本文所涵盖的特定实施例中的FRB结构域一般含有至少约85个至约100个氨基酸残基。在某些实施例中，根据GenBank登录号L34075.1的氨基酸序列，用于本公开的
融合蛋白中的FRB氨基酸序列将包含93个氨基酸的序列Ile-2021至Lys-2113和T2098L突
变。用于特定实施例中所涵盖的Darics中的FRB结构域将能够与FKBP蛋白质结合至雷帕霉
素或其雷帕霉素类似物的复合物结合。在某些实施例中，FRB结构域的肽序列包含(a)至少
跨越人mTOR中所示93个氨基酸的区域或同源蛋白质的相应区域的天然存在的肽序列；(b)
天然存在的FRB的变体，其中天然存在的肽的至多约十个氨基酸、或约1至约5个氨基酸、或
约1至约3个氨基酸，或在一些实施例中仅一个氨基酸已经缺失、插入或被取代；或(c)由能
够与编码天然存在的FRB结构域的DNA分子选择性杂交的核酸分子或由因遗传密码的简并
性而能够与编码天然存在的FRB结构域的DNA分子选择性杂交的DNA序列所编码的肽。
[0467] FKBP(FK506结合蛋白)是针对大环内酯如FK506、FK520和雷帕霉素的胞质受体，并且在各物种界间高度保守。FKBP是能够结合至雷帕霉素或其雷帕霉素类似物并且进一步与
含FRB的蛋白质或融合蛋白形成三联复合物的蛋白质或蛋白质结构域。FKBP结构域又可称
为“雷帕霉素结合结构域”。有关各种FKBP物种的核苷酸序列、克隆和其它方面的信息是本
领域中已知的(参见例如Staendart等人《, 自然》346:671,1990(人FKBP12)；Kay《,生物化学杂志(Biochem.J.)》314:361、1996)。在其它哺乳动物物种中、酵母中以及在其它生物体中
的同源FKBP蛋白质也是本领域中已知的并且可以用于本文所公开的融合蛋白中。特定实施
例中所涵盖的FKBP结构域将能够结合至雷帕霉素或其雷帕霉素类似物并且参加与含FRB蛋
白质的三联复合物(可以通过用于检测此类结合的任何手段直接或间接地测定)。
[0468] 适用于特定实施例中所涵盖的Daric中的FKBP结构域的示例性实例包括但不限于：天然存在的FKBP肽序列，优选地自人FKBP12蛋白质(GenBank登录号AAA58476.1)分离的
FKBP肽序列或由其、由另一人FKBP、由鼠类或其它哺乳动物FKBP或由某一其他动物、酵母或
真菌FKBP分离的肽序列；天然存在的FKBP序列的变体，其中天然存在的肽中至多约十个氨
基酸、或约1至约5个氨基酸或约1至约3个氨基酸，或在一些实施例中仅一个氨基酸已经缺
失、插入或被取代；或由能够与编码天然存在的FKBP的DNA分子选择性杂交的核酸分子或由
因遗传密码的简并性而能够与编码天然存在的FKBP的DNA分子选择性杂交的DNA序列所编
码的肽序列。
[0469] 适用于特定实施例中所涵盖的Daric中的多聚化结构域对的其它示例性实例包括但不限于包括来自FKBP与FRB、FKBP与钙调神经磷酸酶、FKBP与亲环蛋白、FKBP与细菌DHFR、钙调神经磷酸酶与亲环蛋白、PYL1与ABI1、或GIB1与GAI，或其变体。
[0470] 在又其它实施例中，抗桥接因子阻断信号传导多肽和结合多肽与桥接因子的缔合。例如，环孢菌素或FK506可用作抗桥接因子以滴定去除雷帕霉素并因此，由于仅结合一
个多聚化结构域而停止信号传导。在某些实施例中，抗桥接因子(例如环孢菌素、FK506)是
一种免疫抑制剂。例如，可以使用免疫抑制性抗桥接因子使特定实施例中所涵盖的Daric组
分的功能阻断或降到最低并同时在临床环境中抑制或阻断不合需要的或病理性炎性反应。
[0471] 在一个实施例中，第一多聚化结构域包含FRB T2098L，第二多聚化结构域包含FKBP12，并且桥接因子是雷帕霉素类似物AP21967。
[0472] 在另一个实施例中，第一多聚化结构域包含FRB，第二多聚化结构域包含FKBP12，并且桥接因子是雷帕霉素、坦罗莫司或依维莫司。
[0473] 在特定实施例中，信号传导多肽第一跨膜结构域并且结合多肽包含第二跨膜结构域或GPI锚。第一跨膜结构域和第二跨膜结构域的示例性实例是从独立地选自由以下组成
的组的多肽分离：CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154、AMN以及PD-1。
[0474] 在一个实施例中，信号传导多肽包含一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域。
[0475] 适用于特定实施例中所涵盖的Daric信号传导组分中的初级信号传导结构域的示例性实例包括来源于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的那些。在特别优选的实施例中，Daric信号传导组分包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或
多个共刺激信号传导结构域。细胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按
任何次序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。
[0476] 适用于特定实施例中所涵盖的Daric信号传导组分中的这些共刺激分子的示例性实例包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在一个实施例中，Daric信号传导组分包含选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域，以及一个CD3ζ初级
信号传导结构域。
[0477] 在特定实施例中，Daric结合组分包含结合结构域。在一个实施例中，所述结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
[0478] 所述抗体或其抗原结合片段包含特异性地识别并结合靶抗原如肽、脂质、多糖或含有抗原决定子(如由免疫细胞识别的那些)的核酸的表位的至少一个轻链或重链免疫球
蛋白可变区。抗体包括抗原结合片段，例如骆驼Ig(骆驼抗体或其VHH片段)、Ig NAR、Fab片
段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白质(“dsFv”)以及单结构域抗体(sdAb、纳米抗体(Nanobody))或它们的其它抗体片段。所述术语还包括基因工程改
造的形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、异偶联物抗体(如双特异性抗体)和其抗原结
合片段。还参见《皮尔斯目录与手册》,1994-1995(Pierce Chemical Co.,伊利诺伊州罗克
福德)；Kuby,J.《, 免疫学》,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
[0479] 在一个优选实施例中，所述结合结构域是scFv。
[0480] 在另一个优选实施例中，所述结合结构域是骆驼抗体。
[0481] 在特定实施例中，Daric结合组分包含结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+
MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、
Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
[0482] 在一个实施例中，Daric结合组分包含细胞外结构域，例如结合MHC-肽复合物，如I类MHC-肽复合物或II类MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合片段。
[0483] 在特定实施例中，本文所涵盖的Daric组分包含连接二种蛋白质、多肽、肽、结构域、区域或基元的连接子或间隔子。在某些实施例中，连接子包含约二个至约35个氨基酸、
或约四个至约20个氨基酸、或约八个至约15个氨基酸、或约15个至约25个氨基酸。在其它实
施例中，间隔子可以具有特定结构，如抗体CH2CH3结构域、铰链结构域等。在一个实施例中，间隔子包含IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3结构域。
[0484] 在特定实施例中，本文所涵盖的Daric组分包含一个或多个“铰链结构域”，所述铰链结构域在定位结构域以便能实现适当细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起到作用。
Daric可以在结合结构域与多聚化结构域和/或跨膜结构域(TM)之间或在多聚化结构域与
跨膜结构域之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来源于天然、合成、半合成或
重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区
的氨基酸序列。在特定实施例中，铰链是CD8α铰链或CD4铰链。
[0485] 在一个实施例中，Daric包含信号传导多肽，其包含FRB T2098L的第一多聚化结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域；结合多肽包含结合
CD19的scFv、FKBP12的第二多聚化结构域和CD4跨膜结构域；并且桥接因子是雷帕霉素类似
物AP21967。
[0486] 在一个实施例中，Daric包含信号传导多肽，其包含FRB的第一多聚化结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域；结合多肽包含结合CD19的
scFv、FKBP12的第二多聚化结构域和CD4跨膜结构域；并且桥接因子是雷帕霉素、坦罗莫司
或依维莫司。
[0487] d.ζ因子
[0488] 在特定实施例中，本文所涵盖的工程改造的免疫效应细胞包含一个或多个嵌合细胞因子受体。在一个实施例中，通过在CBLB基因中引入DSB来编辑含编码ζ因子的聚核苷酸
的T细胞。在一个实施例中，通过在编码CAR的供体修复模板存在下，在一个或多个CBLB等位
基因中引入DSB，对T细胞进行工程改造。在一个特定实施例中，嵌合细胞因子受体被插入单
个CBLB等位基因中的DSB处。
[0489] 在一个实施例中，本文所涵盖的工程改造的T细胞包含未插入CBLB基因处的嵌合细胞因子受体，并且以下一种或多种被插入一个或多个CBLB等位基因中的DSB中：免疫抑制
信号阻断剂、翻转受体、工程改造的T细胞受体(TCR)的α链和/或β链、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。
[0490] 在各种实施例中，基因组编辑过的T细胞表达将细胞毒性重新引导至肿瘤细胞的嵌合细胞因子受体。ζ因子是嵌合跨膜免疫受体，其包含细胞外结构域、跨膜区和细胞内信
号传导结构域，所述细胞外结构域包含可溶性受体配体连接至能够将细胞外结构域系栓至
细胞表面的载体区域。ζ因子当在T淋巴细胞的表面上表达时，将T细胞活性引导至表达可溶
性受体配体特异性针对的受体的细胞。ζ因子嵌合免疫受体重新引导T细胞的抗原特异性，
并且用于治疗多种癌症，特别是通过人恶性疾病利用的自分泌/旁分泌细胞因子系统进行
治疗。
[0491] 在特定实施例中，所述嵌合细胞因子受体包含免疫抑制细胞因子或其细胞因子受体结合变体、连接子、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
[0492] 在特定实施例中，所述细胞因子或其细胞因子受体结合变体选自由以下组成的组：白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-
10)和白细胞介素-13(IL-13)。
[0493] 在某些实施例中，连接子包含CH2CH3结构域、铰链结构域等。在一个实施例中，连接子包含IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3结构域。在一个实施例中，连接子包含CD8α或CD4铰链结构域。
[0494] 在特定实施例中，跨膜结构域选自由以下组成的组：T细胞受体的α链或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154、AMN以及PD-1。
[0495] 在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：含ITAM的初级信号传导结构域和/或共刺激结构域。
[0496] 在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。
[0497] 在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。
[0498] 在一个实施例中，嵌合细胞因子受体包含选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域，以及一个CD3ζ初级信号传导结构域。
[0499] F.多肽
[0500] 本文涵盖各种多肽，包括但不限于归巢核酸内切酶变体、megaTAL和融合多肽。在优选实施例中，多肽包含SEQ ID NO:1-19和38中所示的氨基酸序列。除非作相反说明，否则
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，且根据常规含义，即，定义为氨基酸序列。在一个实施例中，“多肽”包括融合多肽和其它变体。多肽可使用多种众所周知的重组
和/或合成技术中的任一种制备。多肽不限于特定长度，例如其可以包含全长蛋白质序列、
全长蛋白质的片段、或融合蛋白，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。
[0501] 如本文所使用，“分离的蛋白质”、“分离的肽”或“分离的多肽”等是指体外合成、从细胞环境以及从与细胞中其它组分的缔合分离和/或纯化的肽或多肽分子，即，它不与体内物质明显缔合。
[0502] 特定实施例中所涵盖的多肽的示例性实例包括但不限于归巢核酸内切酶变体、megaTAL、BiTE、细胞因子、趋化因子、细胞毒素和细胞因子受体、翻转受体、免疫抑制信号阻断剂、CAR、DARIC、TCR及ζ因子。
[0503] 多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。这类变体可以是天然存在的或可以例如通过修饰上述
多肽序列中的一个或多个氨基酸，以合成方式产生。例如，在特定实施例中，可能需要通过
在归巢核酸内切酶、megaTAL等中引入一个或多个取代、缺失、添加和/或插入来改善所述多
肽的生物特性，所述多肽结合并裂解人CBLB基因中的靶位点。在特定实施例中，多肽包括与
本文所涵盖的参考序列中的任一个具有至少约65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸一致性的多肽，典型地其中变体保持参考序列的至少一种生物活性。
[0504] 多肽变体包括生物活性“多肽片段”。生物活性多肽片段的示例性实例包括DNA结合结构域、核酸酶结构域等。如本文所使用，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少
30％、至少20％、至少10％、或至少5％的天然存在的多肽活性的多肽片段。在优选实施例
中，所述生物活性是针对靶序列的结合亲和力和/或裂解活性。在某些实施例中，多肽片段
可包含至少5个至约1700个氨基酸长的氨基酸链。应了解，在某些实施例中，片段是至少5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700个或更多个氨基酸长。在特定实施例中，多肽包含归巢核酸内切酶变体的生物活性片段。在特定实施例中，本文所述的多肽可
以包含一个或多个表示为“X”的氨基酸。“X”如果存在于氨基酸SEQ ID NO中，则是指任何氨基酸。一个或多个“X”残基可以存在于本文所涵盖的特定SEQ ID NO中所述氨基酸序列的N
末端和C末端。如果“X”氨基酸不存在，则SEQ ID NO中所述的其余氨基酸序列可以视为生物活性片段。
[0505] 在特定实施例中，多肽包含归巢核酸内切酶变体的生物活性片段，例如SEQ ID NO:3-12，或megaTAL(SEQ ID NO:13-19)。所述生物活性片段可以包含N末端截短和/或C末
端截短。在一个特定实施例中，生物活性片段缺乏或包含相较于相应野生型归巢核酸内切
酶序列，归巢核酸内切酶变体中1、2、3、4、5、6、7或8个N末端氨基酸的缺失，更优选相较于相应野生型归巢核酸内切酶序列，归巢核酸内切酶变体中4个N末端氨基酸的缺失。在一个特
定实施例中，生物活性片段缺乏或包含相较于相应野生型归巢核酸内切酶序列，归巢核酸
内切酶变体中1、2、3、4或5个C末端氨基酸的缺失，更优选相较于相应野生型归巢核酸内切
酶序列，归巢核酸内切酶变体中2个C末端氨基酸的缺失。在一个特别优选的实施例中，生物
活性片段缺乏或包含相较于相应野生型归巢核酸内切酶序列，归巢核酸内切酶变体中4个N
末端氨基酸和2个C末端氨基酸的缺失。
[0506] 在一个特定实施例中，I-OnuI变体包含以下N末端氨基酸中1、2、3、4、5、6、7或8个的缺失：M、A、Y、M、S、R、R、E；和/或以下1、2、3、4或5个C末端氨基酸的缺失：R、G、S、F、V。
[0507] 在一个特定实施例中，I-OnuI变体包含以下N末端氨基酸中1、2、3、4、5、6、7或8个缺失或取代：M、A、Y、M、S、R、R、E；和/或以下1、2、3、4或5个C末端氨基酸的缺失或取代：R、G、S、F、V。
[0508] 如上文所述，多肽可以通过不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法是本领域中一般已知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中众所周知的。参见例如
Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊》82:488-492)；Kunkel等人,(1987,《酶学方法
(Methods in Enzymol)》,154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人(《基
因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,Benjamin/Cummings,加利福
尼亚州门洛帕克(Menlo Park,Calif.),1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响目的
蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可见于Dayhoff等人,(1978)蛋白序列和结构
图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)(《国家生物医学研究基础
(Natl.Biomed.Res.Found.)》,华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.))的模型中。
[0509] 在某些实施例中，变体将含有一个或多个保守性取代。“保守性取代”是氨基酸被具有类似特性的另一个氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员能预期多肽的二级结构和
亲水性质基本上不变的取代。可以对特定实施例中所涵盖的聚核苷酸和多肽的结构进行修
饰，多肽包括具有至少约的多肽且仍获得编码具有所希望特征的变体或衍生物多肽的功能
性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生等效或甚至改良的变体多肽时，本领域技术
人员例如可以改变编码DNA序列的一个或多个密码子，例如根据表1。
[0510] 表1-氨基酸密码子
[0511]
[0512]
[0513] 可以使用本领域中众所周知的计算机程序，如DNASTAR、GCG、DNA Strider、Geneious、Mac Vector或Vector NTI软件发现有关确定可以被取代、插入或缺失而不消除
生物活性的氨基酸残基的指导。优选地，本文所公开的蛋白质变体中的氨基酸变化是保守
性氨基酸变化，即，带类似电荷或不带电氨基酸的取代。保守性氨基酸变化涉及侧链相关的
一组氨基酸中的一个的取代。天然存在的氨基酸一般被分成四组：酸性氨基酸(天冬氨酸、
谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适合的氨基酸保守性取代是本领域技术人员已知的且一般
可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员应认识到，一般说来，多
肽非必需区中的单一氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如Watson等人《,基因分
子生物学》,第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页)。
[0514] 在需要表达两个或更多个多肽的一个实施例中，编码所述多肽的聚核苷酸序列可通过如本文别处所公开的IRES序列隔开。
[0515] 特定实施例中涵盖的多肽包括融合多肽。在特定实施例中，提供了融合多肽和编码融合多肽的聚核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指具有至少二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽区段的多肽。
[0516] 在另一个实施例中，两个或更多个多肽可表达为融合蛋白形式，所述融合蛋白包含一个或多个如本文别处所公开的自裂解多肽序列。
[0517] 在一个实施例中，本文所涵盖的融合蛋白包含一个或多个DNA结合结构域和一种或多种核酸酶，以及一个或多个连接子和/或自裂解多肽。
[0518] 在一个实施例中，本文所涵盖的融合蛋白包含核酸酶变体；连接子或自裂解肽；以及末端加工酶，包括但不限于5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶和3'-5'核酸外切酶
(例如Trex2)。
[0519] 融合多肽可包含一个或多个多肽结构域或区段，包括但不限于信号肽、细胞穿透肽结构域(CPP)、DNA结合结构域、核酸酶结构域等、表位标签(例如麦芽糖结合蛋白
(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G以及HA)、多肽连接子以及多肽裂解信号。融合多肽典型地是C末端连接至N末端，不过它们还可以是C末端连接至C末端、N
末端连接至N末端、或N末端连接至C末端。在特定实施例中，融合蛋白的多肽可以遵循任何
次序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守性修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物，只要保存融合多肽所希望的活性即可。融合多肽可以通过化学合成
方法或通过二个部分之间的化学键联制造，或一般可以使用其它标准技术制备。构成融合
多肽的连接的DNA序列可操作地连接至如本文别处所公开的适合转录或翻译控制元件。
[0520] 融合多肽可任选地包含连接子，所述连接子可以用于连接一个或多个多肽或一个多肽内的一个或多个结构域。肽连接子序列可以用于将任何两种或更多种多肽组分隔开一
定距离，该距离足以确保每一多肽折叠成其适当二级结构和三级结构，从而允许多肽结构
域发挥其所希望的功能。此类肽连接子序列是使用本领域中的标准技术并入融合多肽中。
适合肽连接子序列可以基于以下因素选择：(1)其能够呈现柔性延长构象；(2)其无法呈现
能与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；以及(3)缺乏可能与多肽
功能性表位反应的疏水性或带电残基。优选的肽连接子序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它
接近中性的氨基酸，如Thr和Ala，也可以用于连接子序列中。可以有效地用作连接子的氨基
酸序列包括Maratea等人《, 基因(Gene)》40:39-46,1985；Murphy等人《,美国国家科学院院刊》83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中所公开的那
些。当特定融合多肽区段含有可用于隔开功能性结构域并防止空间干扰的非必需N末端氨
基酸区域时，不需要连接子序列。优选的连接子典型地是作为重组融合蛋白的一部分合成
的柔性氨基酸子序列。连接子多肽可以是在1个与200个氨基酸之间的长度、在1个与100个
氨基酸之间的长度或在1个与50个氨基酸之间的长度，包括其间的所有整数值。
[0521] 例示性连接子包括但不限于以下氨基酸序列：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是整数至少一、二、三、四或五；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；GGG(SEQ ID NO:39)；DGGGS(SEQ ID NO:40)；TGEKP(SEQ ID NO:41)(参见例如
Liu等人,PNAS 5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:42)(Pomerantz等人,1995,前述)；
(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:43)(Kim等人,PNAS93,1156-1160(1996.)；
EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:44)(Chaudhary等人,1990《, 美国国家科学院院刊》87:1066-
1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:45)(Bird等人,1988《, 科学》242:423-426)；
GGRRGGGS(SEQ ID NO:46)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:47)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:48)；
LRQKD(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:49)。或者，柔性连接子可使用能够建立DNA-结合位点和肽本
身的模型(Desjarlais和Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS 91:11099-11103(1994))
的计算机程序或通过噬菌体展示方法合理地设计。
[0522] 融合多肽还可以在本文所描述的每个多肽结构域之间或在内源性开放阅读框与供体修复模板所编码的多肽之间包含多肽裂解信号。此外，可将多肽裂解位点放在任何连
接子肽序列中。例示性多肽裂解信号包括多肽裂解识别位点，如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂
解位点(例如罕见限制酶识别位点、自裂解核酶识别位点)和自裂解病毒寡肽(参见
deFelipe和Ryan,2004《. 交通(Traffic)》,5(8)；616-26)。
[0523] 适合的蛋白酶裂解位点和自裂解肽是熟练技术人员已知的(参见例如Ryan等人,1997《. 普通病毒学杂志(J.Gener.Virol.)》78,699-722；Scymczak等人(2004)《自然·生物技术(Nature Biotech.)》5,589-594)。例示性蛋白酶裂解位点包括但不限于马铃薯Y病毒
(potyvirus)NIa蛋白酶(例如烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒
P1(P35)蛋白酶、大麦花叶病毒(byovirus)NIa蛋白酶、大麦花叶病毒RNA-2编码的蛋白酶、
口疮病毒(aphthovirus)L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、细小核糖核酸3C蛋白
酶、豇豆花叶病毒(comovirus)24K蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24K蛋白酶、水稻
东格鲁球状病毒(rice tungro spherical virus，RTSV)3C样蛋白酶、欧防风黄点病毒
(parsnip yellow fleck virus，PYVF)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa以及肠激酶的裂
解位点。在一个实施例中，烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点因其较高的裂解严格度而成
为优选的，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO:50)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:51)和ENLYFQS(SEQ 
ID NO:52)，其中X表示任何氨基酸(TEV裂解发生于Q与G或Q与S之间)。
[0524] 在某些实施例中，自裂解多肽位点包含2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人，2001《.普通病毒学杂志》82:1027-1041)。在一个特定实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心病毒2A肽。
[0525] 在一个实施例中，病毒2A肽选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马鼻炎A病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体(Thosea asigna virus，TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1，PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒(Theilovirus)2A肽以及脑心
肌炎病毒2A肽。
[0526] 2A位点的示例性实例提供于表2中。
[0527] 表2：例示性2A位点包括以下序列：
[0528] SEQ ID NO:53 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPSEQ ID NO:54 ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:55 LLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:56 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:57 EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:58 LLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:59 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:60 QCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:61 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:62 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:63 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:64 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:65 LLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:66 TLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:67 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:68 NFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:69 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:70 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:71 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
SEQ ID NO:72 LNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:73 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:74 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
[0529] G.聚核苷酸
[0530] 在特定实施例中，提供了编码本文所涵盖的一种或多种归巢核酸内切酶变体、megaTAL、末端加工酶和融合多肽或一种或多种生物活性片段或变体的聚核苷酸。如本文所
使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂交体。聚核苷酸可以是单链或双链的并且是重组、合成或分离的。聚核苷酸包括但不限于：前
信使RNA(pre-mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))负链RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、单向导RNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增的DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。在特定实施例中，聚核苷酸是编码一种或多种生物活性多肽片段或变体
的聚核苷酸片段。聚核苷酸是指至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少
1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸长度，以及所有中间长度
的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。容
易理解的是，在此情形中，“中间长度”意思指在引述值之间的任何长度，如6、7、8、9等；101、
102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施例中，聚核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％,76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。
[0531] 在特定实施例中，聚核苷酸可以经历密码子优化。如本文所使用，术语“密码子优化的”是指取代编码多肽的聚核苷酸中的密码子以便增加所述多肽的表达、稳定性和/或活
性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下一个或多个：(i)两种或更多种生物体或基因
之间密码子偏好的变化或合成地构造的偏好表；(ii)生物体、基因或基因集内密码子偏好
程度的变化；(iii)包括环境在内的密码子的系统性变化；(iv)根据解码tRNA得到的密码子
变化；(v)根据总体或三联体一个位置中的GC％得到的密码子变化；(vi)与参考序列，例如
天然存在序列相似程度的变化；(vii)密码子频率截止值的变化；(viii)由DNA序列转录的
mRNA的结构特性；(ix)有关作为设计密码子取代集合的基础的DNA序列的功能的先验知识；
(x)每个氨基酸的密码子集的系统性变化；和/或(xi)伪翻译起始位点的分离移除。
[0532] 如本文所使用，术语“核苷酸”是指与磷酸化糖的N-糖苷键联中的杂环含氮碱基。核苷酸应理解为包括天然碱基，以及多种本领域认可的经过修饰的碱基。此类碱基一般位
于核苷酸糖部分的1'位处。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸酯基。在核糖核酸(RNA)中，糖是核糖，并且在脱氧核糖核酸(DNA)中，糖是脱氧核糖，即，不含核糖中存在的羟基的糖。例示性天然含氮碱基包括嘌呤，即腺苷(A)和胍(G)；以及嘧啶，即胞苷(C)和胸苷(T)(或在RNA情
形中是尿嘧啶(U))。脱氧核糖的C-1原子键结至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸通常是单磷
酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。核苷酸可以是未修饰的或在糖、磷酸酯和/或碱基部分处经历
修饰(也可互换地称为核苷酸类似物、核苷酸衍生物、经过修饰的核苷酸、非天然核苷酸和
非标准核苷酸；参见例如WO 92/07065和WO 93/15187)。经过修饰的核酸碱基的实例概述于
Limbach等人(1994《, 核酸研究(Nucleic Acids Res.)》22,2183-2196)中。
[0533] 核苷酸也可被视为核苷的磷酸酯，并且酯化是在连接至糖的C-5的羟基上发生。如本文所使用，术语“核苷”是指与糖的N-糖苷键联中的杂环含氮碱基。核苷在本领域中公认
为包括天然碱基，并且还包括众所周知的经过修饰的碱基。此类碱基一般位于核苷糖部分
的1'位处。核苷一般包含碱基和糖基。核苷可以是未修饰的或在糖和/或碱基部分处经历修
饰(也可互换地称为核苷类似物、核苷衍生物、经过修饰的核苷、非天然核苷或非标准核
苷)。另外，如上文所述，经过修饰的核酸碱基的实例概述于Limbach等人(1994《,核酸研究》
22,2183-2196)中。
[0534] 聚核苷酸的示例性实例包括但不限于编码SEQ ID NO:1-19和38的聚核苷酸，以及SEQ ID NO:20-37中所示的聚核苷酸序列。
[0535] 在各种示例性实施例中，本文所涵盖的聚核苷酸包括但不限于编码归巢核酸内切酶变体、megaTAL、末端加工酶、融合多肽的聚核苷酸，以及包含本文所涵盖的聚核苷酸的表达载体、病毒载体和转移质粒。
[0536] 如本文所使用，术语“聚核苷酸变体”和“变体”等是指与参考聚核苷酸序列展示相当大的序列一致性的聚核苷酸或在下文所定义的严格条件下与参考序列杂交的聚核苷酸。这些术语还涵盖因至少一个核苷酸的添加、缺失、取代或修饰而有别于参考聚核苷酸的聚
核苷酸。因此，术语“聚核苷酸变体”和“变体”包括一个或多个核苷酸被添加或缺失或修饰，或被置换成不同核苷酸的聚核苷酸。就这一点而言，本领域中应充分理解，可以对参考聚核
苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代在内的某些改变，由此使改变的聚核苷酸保持参考聚
核苷酸的生物功能或活性。
[0537] 聚核苷酸变体包括编码生物活性多肽片段或变体的聚核苷酸片段。如本文所使用，术语“聚核苷酸片段”是指长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、
450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、
1600、1700个或更多个核苷酸的聚核苷酸片段，其编码保持至少100％、至少90％、至少
80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的天然存在的多肽的活性的多肽变体。聚核苷酸片段是指这样一种聚核苷酸，该聚核苷酸
编码具有天然存在或以重组方式制造的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或一个或
多个氨基酸内部缺失或取代的多肽。
[0538] 在一个实施例中，聚核苷酸包含在严格条件下与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。在“严格条件”下杂交描述使彼此至少60％一致的核苷酸序列保持杂交的杂交方案。一般来
说，选择的严格条件比特定序列在既定离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是在平衡
时50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度(在既定离子强度、pH和核酸浓度下)。
由于靶序列在Tm下一般是过量存在，故在平衡时50％探针被占据。
[0539] 如本文所使用，叙述“序列一致性”或例如包含“与……50％一致的序列”是指在核苷酸与核苷酸基础上或在氨基酸与氨基酸基础上，序列在比较窗内一致的程度。因此，“序列一致性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗内比较二个最佳地对准的序列，测定的
一致核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或一致氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)在两个序列中出现的位置的数目以得到相配位置的数目，用相配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)
并将结果乘以100，得到序列一致性百分比。包括与本文所描述的参考序列中的任一个具有
至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列一致性的核苷酸和多肽，典型地其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活
性。
[0540] 用于描述两个或更多个聚核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“基本上一致”。“参考序列”的长度是至少
12个，但常常是15至18个且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基在内。因为
两个聚核苷酸可以各自包含(1)在两个聚核苷酸之间类似的序列(即，仅完整聚核苷酸序列
的一部分)；和(2)在两个聚核苷酸之间相异的序列，两个(或更多个)聚核苷酸之间的序列
比较典型地通过在“比较窗”内比较该两个聚核苷酸的序列以鉴别并比较序列局部区域的
相似性来进行。“比较窗”是指具有至少6个、通常约50个至约100个、更通常约100个至约150个连续位置的概念性区段，其中在最佳地对准一个序列与具有相同数目连续位置的参考序
列之后，比较该两个序列。对于最佳对准的两个序列，比较窗可以包含相较于参考序列(不
包含添加或缺失的序列)，约20％或更低百分比的添加或缺失(即，空位)。用于比对比较窗
的最佳序列对准可以通过计算机实施算法(例如DNASTAR、GCG、DNA Strider、Geneious、Mac Vector或Vector NTI软件中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过由各种所选方法中的
任一种生成的检查和最佳比对(即，在比较窗内产生最高同源性百分比)来进行。还可以参
考如例如Altschul等人,1997《, 核酸研究》25:3389所公开的BLAST程序家族。有关序列分析的详细论述可以见于Ausubel等人《, 最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols 
in Molecular Biology)》,John Wiley&Sons Inc.,1994-1998,第15章的19.3单元。
[0541] 如本文所使用，“分离的聚核苷酸”是指已经从在天然存在的状态中侧接其的序列纯化的聚核苷酸，例如从通常邻近于DNA片段的序列移出的所述DNA片段。在特定实施例中，
“分离的聚核苷酸”是指互补DNA(cDNA)、重组聚核苷酸、合成聚核苷酸或在自然界中不存在且通过人工制备的其它聚核苷酸。
[0542] 在各种实施例中，聚核苷酸包含编码本文所涵盖的多肽的mRNA，所述多肽包括但不限于归巢核酸内切酶变体、megaTAL和末端加工酶。在某些实施例中，所述mRNA包含帽、一个或多个核苷酸和聚腺苷酸尾。
[0543] 如本文所使用，术语“5'帽”或“5'帽结构”或“5'帽部分”是指并入mRNA 5'端的化学修饰。5'帽涉及到核输出、mRNA稳定性和翻译。
[0544] 在特定实施例中，本文所涵盖的mRNA包含5'帽，其包含在mRNA分子末端鸟苷帽残基与5'末端转录的有义核苷酸之间的5'-ppp-5'-三磷酸键联。接着，此5'-鸟苷酸帽可被甲
基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。
[0545] 适用于本文所涵盖的mRNA聚核苷酸的特定实施例中的5'帽的示例性实例包括但不限于：未甲基化的5'帽类似物，例如G(5')ppp(5')G、G(5')ppp(5')C、G(5')ppp(5')A；甲基化的5'帽类似物，例如m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')C和m7G(5')ppp(5')A；二甲基化的5'帽类似物，例如m2,7G(5')ppp(5')G、m2,7G(5')ppp(5')C和m2,7G(5')ppp(5')A；三甲基化的5'帽类似物，例如m2,2,7G(5')ppp(5')G、m2,2,7G(5')ppp(5')C和m2,2,7G(5')ppp(5')A；二甲基化的对称5'帽类似物，例如m7G(5')pppm7(5')G、m7G(5')pppm7(5')C和m7G(5')pppm7(5')
A；以及抗反向5'帽类似物，例如抗反向帽类似物(Anti-Reverse Cap Analog，ARCA)帽，命
名为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G、2'O-Me-m7G(5')ppp(5')G、2'O-Me-m7G(5')ppp(5')C、2'O-
Me-m7G(5')ppp(5')A、m72'd(5')ppp(5')G、m72'd(5')ppp(5')C、m72'd(5')ppp(5')A、3'O-Me-m7G(5')ppp(5')C、3'O-Me-m7G(5')ppp(5')A、m73'd(5')ppp(5')G、m73'd(5')ppp(5')C、m73'd(5')ppp(5')A及其四磷酸酯衍生物)(参见例如Jemielity等人,RNA,9:1108-1122
(2003))。
[0546] 在特定实施例中，mRNA包含5'帽，它是7-甲基鸟苷酸(“m7G”)，通过三磷酸酯桥连接至第一个转录的核苷酸的5'端，产生m7G(5')ppp(5')N，其中N是任何核苷。
[0547] 在一些实施例中，mRNA包含5'帽，其中所述帽是帽0结构(帽0结构不包含附接至碱基1和2的核糖的2'-O-甲基残基)、帽1结构(帽1结构在碱基2处具有2'-O-甲基残基)或帽2
结构(帽2结构具有附接至碱基2和3的2'-O-甲基残基)。
[0548] 在一个实施例中，mRNA包含m7G(5')ppp(5')G帽。
[0549] 在一个实施例中，mRNA包含ARCA帽。
[0550] 在特定实施例中，本文所涵盖的mRNA包含一个或多个经过修饰的核苷。
[0551] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个选自由以下组成的组的经过修饰的核苷：假尿苷、吡啶-4-酮核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、
2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-
尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、
2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿
苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林
(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代泽布拉林、2-硫代-泽
布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-
假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-
2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-
二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺
苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷(wyosine)、怀丁苷(wybutosine)、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮
杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟
苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷以及N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
[0552] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个选自由以下组成的组的经过修饰的核苷：假尿苷、吡啶-4-酮核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿核苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫
代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷以及4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
[0553] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个选自由以下组成的组的经过修饰的核苷：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、
1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫
代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异
胞苷以及4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。
[0554] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个选自由以下组成的组的经过修饰的核苷：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌
呤、7-脱氮-8氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌
呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲
硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤以
及2-甲氧基-腺嘌呤。
[0555] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个选自由以下组成的组的经过修饰的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-
甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷以及N2,N2-二甲基-6-硫
代-鸟苷。
[0556] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个假尿苷、一个或多个5-甲基-胞嘧啶和/或一个或多个5-甲基-胞苷。
[0557] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个假尿苷。
[0558] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个5-甲基-胞苷。
[0559] 在一个实施例中，mRNA包含一个或多个5-甲基-胞嘧啶。
[0560] 在特定实施例中，本文所涵盖的mRNA包含聚腺苷酸尾以帮助防止mRNA被核酸外切酶降解，使mRNA稳定并且促进翻译。在某些实施例中，mRNA包含3'聚腺苷酸尾结构。
[0561] 在特定实施例中，聚腺苷酸尾的长度是至少约10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450个或至少约500个或更多个腺嘌呤核苷酸或任何中间数目的腺嘌呤核苷
酸。在特定实施例中，聚腺苷酸尾的长度是至少约125、126、127、128、129、130、131、132、
133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、
152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、
190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、202、203、205、206、207、208、
209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、
228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、
247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、
266、267、268、269、270、271、272、273、274或275个或更多个腺嘌呤核苷酸。
[0562] 在特定实施例中，聚腺苷酸尾的长度是约10至约500个腺嘌呤核苷酸、约50至约500个腺嘌呤核苷酸、约100至约500个腺嘌呤核苷酸、约150至约500个腺嘌呤核苷酸、约200
至约500个腺嘌呤核苷酸、约250至约500个腺嘌呤核苷酸、约300至约500个腺嘌呤核苷酸、
约50至约450个腺嘌呤核苷酸、约50至约400个腺嘌呤核苷酸、约50至约350个腺嘌呤核苷
酸、约100至约500个腺嘌呤核苷酸、约100至约450个腺嘌呤核苷酸、约100至约400腺嘌呤核
苷酸、约100至约350个腺嘌呤核苷酸、约100至约300个腺嘌呤核苷酸、约150至约500个腺嘌
呤核苷酸、约150至约450个腺嘌呤核苷酸、约150至约400个腺嘌呤核苷酸、约150至约350个
腺嘌呤核苷酸、约150至约300个腺嘌呤核苷酸、约150至约250个腺嘌呤核苷酸、约150至约
200个腺嘌呤核苷酸、约200至约500个腺嘌呤核苷酸、约200至约450个腺嘌呤核苷酸、约200
至约400个腺嘌呤核苷酸、约200至约350个腺嘌呤核苷酸、约200至约300个腺嘌呤核苷酸、
约250至约500个腺嘌呤核苷酸、约250至约450个腺嘌呤核苷酸、约250至约400个腺嘌呤核
苷酸、约250至约350个腺嘌呤核苷酸或约250至约300个腺嘌呤核苷酸或任何中间范围的腺
嘌呤核苷酸。
[0563] 描述聚核苷酸取向的术语包括：5'(通常是聚核苷酸具有游离磷酸酯基的一端)和3'(通常是聚核苷酸具有游离羟基(OH)的一端)。聚核苷酸序列可以按5'至3'取向或3'至5'
取向标注。对于DNA和mRNA，5'至3'链被命名为“有义”链、“正”链或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列一致[不过在RNA中是尿嘧啶(U)，而在DNA中是胸腺嘧啶(T)]。对于
DNA和mRNA，作为由RNA聚合酶转录的链的互补3'至5'链被命名为“模板”链、“反义”链、“负”链或“非编码”链。如本文所使用，术语“反向取向”是指以3'至5'取向书写的5'至3'序列或以5'至3'取向书写的3'至5'序列。
[0564] 术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关联的聚核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G T A C 5'。后一个序列通常
被写成反向互补序列，其中5'端在左侧并且3'端在右侧，即5'C A T G A C T 3'。与其反向
互补序列相同的序列被称为回文序列。互补可以是“部分”的，其中仅一些核酸的碱基根据
碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“总体”互补性。
[0565] 如本文所使用，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可以表达RNA且随后表达多肽的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有目的基因，例如目的聚核苷酸。在另一个实施
例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及目的
基因，例如目的聚核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内是按位置依序地取向，使得盒中的核酸可以被转录成RNA，并且当需要时被翻译
成蛋白质或多肽，经历被转化的细胞中的活性所需的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当
细胞内区室或分泌至细胞外区室中而易位至适当区室中以获得生物活性。优选地，在一些
实施例中，所述盒的3'和5'端适合于迅速地插入载体和/或基因组中，例如其在每一端处具
有限制性核酸内切酶位点。在一个优选实施例中，核酸盒含有用于治疗、预防或改善遗传病
症的治疗基因序列。所述盒可以作为单一单元移出并插入质粒或病毒载体中。
[0566] 聚核苷酸包括目的聚核苷酸。如本文所使用，术语“目的聚核苷酸”是指如本文所预期，编码多肽或融合多肽的聚核苷酸或用作模板以转录抑制性聚核苷酸的聚核苷酸。
[0567] 此外，本领域的普通技术人员应了解，如本文所预期，由于遗传密码的简并性，存在许多可以编码多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些聚核苷酸中有一些与任何天然基因
的核苷酸序列具有最小同源性。尽管如此，在特定实施例中特别地涵盖由于密码子使用差
异而变化的聚核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的聚核苷酸。在一
个实施例中，提供了包含特定等位基因序列的聚核苷酸。等位基因是因核苷酸的一个或多
个突变，如缺失、添加和/或取代而改变的内源性聚核苷酸序列。
[0568] 在某一实施例中，目的聚核苷酸包含供体修复模板。
[0569] 在某一实施例中，目的聚核苷酸包含抑制性聚核苷酸，包括但不限于siRNA、miRNA、shRNA、核酶或另一抑制性RNA。
[0570] 在一个实施例中，包含抑制性RNA的供体修复模板包含一个或多个调控序列，如例如强组成型pol III，例如人或小鼠U6 snRNA启动子、人和小鼠H1 RNA启动子或人tRNA-val
启动子，或强组成型pol II启动子，如本文别处所描述。
[0571] 特定实施例中所涵盖的聚核苷酸，不管编码序列本身的长度如何，可以与其它DNA序列组合，如本文别处所公开或如本领域中所知，所述序列是如启动子和/或增强子、非翻
译区(UTR)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号、转录后反应元件以及编码自裂解多肽、表位标签的聚核苷酸，使得其总长度可能变化极大。因
此，特定实施例中预期可以采用几乎任何长度的聚核苷酸片段，并且总长度优选地受预定
重组DNA方案中制备的简易性和使用限制。
[0572] 聚核苷酸可以使用本领域中已知并且可用的多种公认技术中的任一种制备、操作、表达和/或递送。为了表达所希望的多肽，可将编码所述多肽的核苷酸序列插入适当载
体中。也可以通过将编码所希望多肽的mRNA递送至细胞中来表达所述多肽。
[0573] 载体的示例性实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座元件，例如Sleeping Beauty、PiggyBac。
[0574] 载体的其它示例性实例包括但不限于质粒；噬菌粒；黏粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或
M13噬菌体；以及动物病毒。
[0575] 可用作载体的病毒的示例性实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多泡病毒(例如SV40)。
[0576] 表达载体的示例性实例包括但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体TM
(Promega)；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的pLenti4/V5-DEST 、
pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在特定实施例中，本文所公开
的多肽的编码序列可连接至此类表达载体中以在哺乳动物细胞中表达所述多肽。
[0577] 在特定实施例中，载体是游离型载体或维持在染色体外的载体。如本文所使用，术语“游离型”是指载体能够复制而不必整合至宿主染色体DNA中且不会从分裂的宿主细胞逐
渐损失，还意味着所述载体在染色体外或游离地复制。
[0578] 表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调控序列”是载体的非翻译区域，即复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、转录后调控元件、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区，所述非翻译区与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录与翻译。这些元件在其强度和特异性方面可能变化。取决于所利
用的载体系统和宿主，可使用多种适合的转录与翻译元件，包括遍在型启动子和诱导型启
动子。
[0579] 在特定实施例中，聚核苷酸包含载体，包括但不限于表达载体和病毒载体。载体可包含一个或多个外源性、内源性或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源性控制序
列”是天然地与基因组中的给定基因连接的控制序列。“外源性控制序列”是借助于基因操
作(即，分子生物技术)与基因并接放置以使得所连接的增强子/启动子引导该基因的转录
的控制序列。“异源控制序列”是来自与经历基因操作的细胞不同的物种的外源序列。“合
成”控制序列可以包含具有一个或多个内源性和/或外源性序列和/或在体外或通过计算机
模拟确定的序列的元件，其为特定疗法提供最佳的启动子和/或增强子活性。
[0580] 如本文所使用，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合的聚核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并且转录可操作地连接至启动子的聚核苷酸。在特定实施例中，在
哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富AT区，
和/或在转录起始点上游70至80个碱基处所见的另一序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何
核苷酸。
[0581] 术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于其相对于另一控制序列的取向起作用的一段DNA。增强子可以与启动子和/或其它增强子
元件协作地或叠加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够同时提供启动子和增强
子功能的序列的一段DNA。
[0582] 术语“可操作地连接”是指所描述的组分的关系允许其以其预定方式起作用的并接。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二聚核
苷酸序列，例如目的聚核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列引导对应于所述
第二序列的核酸的转录。
[0583] 如本文所使用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地使可操作地连接的序列转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在多种细
胞和组织类型中表达的“遍在型”启动子、增强子或启动子/增强子，或允许分别在多种限定细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
[0584] 适用于特定实施例中的示例性遍在型表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒
(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma 
virus，RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启
动子、短延伸因子1-α(EF1a-短)启动子、长延伸因子1-α(EF1a-长)启动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子
4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白质5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA 26基因座(Irions等人《, 自然·生物技术
(NatureBiotechnology)》25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1
(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)的启动子(Challita
等人《, 病毒学杂志(J Virol.)》69(2):748-55(1995))。
[0585] 在一个特定实施例中，可能需要使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现所希望聚核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达
(例如仅在一小组细胞类型、细胞谱系或组织中或在特定发育阶段期间表达编码多肽的特
定核酸)。
[0586] 如本文所使用，“条件性表达”可以指任何类型的条件性表达，包括但不限于诱导型表达；阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态的细胞或组织中的表达等。这一定
义不打算排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了目的聚核苷酸的条件性表
达，例如表达是通过使细胞、组织、生物体等经历使聚核苷酸表达或使目的聚核苷酸所编码
的聚核苷酸的表达增加或减少的处理或条件进行控制。
[0587] 诱导型启动子/系统的示例性实例包括但不限于类固醇诱导型启动子，如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(可通过用相应激素处理诱导)；金属硫蛋白启动子
(可通过用各种重金属处理诱导)；MX-1启动子(可通过干扰素诱导)；“GeneSwitch”米非司
酮(mifepristone)可调控系统(Sirin等人,2003《,基因(Gene)》,323:67)；二甲氨基二硫代
甲酸铜(cumate)诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调控系统等。
[0588] 条件性表达还可以通过使用位点特异性DNA重组酶实现。根据某些实施例，聚核苷酸包含至少一个(典型地两个)用于由位点特异性重组酶介导的重组的位点。如本文所使
用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括参与涉及一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十个或更多个)重组位点的重组反应的切除型或整合型蛋白质、酶、辅因子或相关蛋白质，其可以是野生型蛋白质(参见Landy《, 生物技术新见(Current Opinion in 
Biotechnology)》3:699-707(1993))或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白序列或其片段
的融合蛋白)、片段和变体。适用于特定实施例中的重组酶的示例性实例包括但不限于：
Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。
[0589] 聚核苷酸可以包含用于多种位点特异性重组酶中的任一种的一个或多个重组位点。应理解，除用于位点特异性重组酶的靶位点外，还需要整合载体，例如逆转录病毒载体
或慢病毒载体所需的任何位点。如本文所使用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别并结合的特定核酸序列。
[0590] 例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，它是有34个碱基对的序列，该序列包含两个有13个碱基对的反向重复序列(充当重组酶结合位点)侧接有8个碱基对的核心序列
(Sauer B.《, 生物技术新见》5:521-527(1994))。其它例示性loxP位点包括但不限于：
lox511(Hoess等人，1996；Bethke和Sauer，1997)、lox5171(Lee和Saito，1998)、lox2272
(Lee和Saito，1998)、m2(Langer等人，2002)、lox71(Albert等人，1995)以及lox66(Albert等人，1995)。
[0591] 适合FLP重组酶的识别位点包括但不限于：FRT(McLeod等人，1996)；F1、F2、F3(Schlake和Bode，1994)；F4、F5(Schlake和Bode，1994)；FRT(LE)(Senecoff等人，1988)；FRT(RE)(Senecoff等人，1988)。
[0592] 识别序列的其它实例是attB、attP、attL和attR序列，它们由重组酶λ整合酶，例如识别。 SSR介导仅在异型位点attB(长度是34 bp)与attP(长度是39 bp)之间发生的重组(Groth等人，2000)。attB和attP分别是针对细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合
酶的连接位点命名，二者都含有很可能与 同源二聚体结合的不完美反向重复序列
(Groth等人,2000)。产物位点attL和attR对进一步 介导的重组实际上呈惰性
(Belteki等人,2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，与attP位点插入到基因
组attB位点中相比，带有attB的DNA更容易插入到基因组attP位点中(Thyagarajan等人,
2001；Belteki等人,2003)。因此，典型策略通过同源重组将带有attP的“对接位点”定位至指定基因座中，所述基因座接着与带有attB的输入序列(incomingsequence)配对以进行插
入。
[0593] 在一个实施例中，本文所涵盖的聚核苷酸包含侧接一对重组酶识别位点的供体修复模板聚核苷酸。在特定实施例中，修复模板聚核苷酸侧接LoxP位点、FRT位点或att位点。
[0594] 在特定实施例中，本文所涵盖的聚核苷酸包括编码一个或多个多肽的一个或多个目的聚核苷酸。在特定实施例中，为了实现多个多肽各自的高效翻译，聚核苷酸序列可以通
过一个或多个编码自裂解多肽的IRES序列或聚核苷酸序列隔开。
[0595] 如本文所使用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进直接内部核糖体进入到顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子如ATG中，由此引起基因的不依赖于帽的翻译的元件。参见例如Jackson等人,1990《. 生化科学趋势(Trends Biochem Sci)》15(12):477-83，和
Jackson和Kaminski.1995.RNA 1(10):985-1000。本领域的技术人员一般采用的IRES的实
例包括美国专利第6,692,736号中所描述的那些。本领域中已知的“IRES”的其它实例包括
但不限于从小核糖核酸病毒获得的IRES(Jackson等人,1990)以及从病毒或细胞mRNA源，如
免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)(Huez等人1998《.分子与细胞生
物学(Mol.Cell.Biol.)》18(11):6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和类胰岛素生
长因子(IGFII)获得的IRES、翻译起始因子eIF4G及酵母转录因子TFIID和HAP4、可购自
Novagen的脑心肌炎病毒(EMCV)(Duke等人,1992.《病毒学杂志》66(3):1602-9)和VEGF 
IRES(Huez等人,1998《. 分子细胞生物学》18(11):6178-90)。IRES在小核糖核酸病毒科
(Picornaviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)物种
的病毒基因组中以及在HCV、弗云德鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus，
FrMLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)中也已有报导。
[0596] 在一个实施例中，用于本文所涵盖的聚核苷酸中的IRES是EMCV IRES。
[0597] 在特定实施例中，聚核苷酸包含具有共同Kozak序列且编码所希望多肽的聚核苷酸。如本文所使用，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体的小亚单元的初始结合并增加翻译的短核苷酸序列。共同Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:75)，其中R是嘌
呤(A或G)(Kozak,1986《. 细胞(Cell)》.44(2):283-92；和Kozak,1987《. 核酸研究》15(20):
8125-48)。
[0598] 引导异源核酸转录物的高效终止和聚腺苷酸化的元件将增加异源基因的表达。转录终止信号一般见于聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施例中，载体在编码待表达多肽的
聚核苷酸的3'端包含聚腺苷酸化序列。如本文所使用，术语“聚腺苷酸位点(polyA site)”
或“聚腺苷酸序列(polyA sequence)”表示引导由RNA聚合酶II引起的初生RNA转录物终止
和聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过在编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾来
促进mRNA稳定性，并因此促使翻译效率增加。裂解和聚腺苷酸化是由RNA中的聚腺苷酸序列
引导。哺乳动物mRNA前体(pre-mRNA)的核心聚腺苷酸序列有两个识别元件侧接裂解-聚腺
苷酸化位点上。典型地，几乎不变的AAUAAA六聚物位于富含U或GU残基的可变性较高的元件
上游20-50个核苷酸处。初生转录物的裂解发生于这两个元件之间并偶合以将多达250个腺
苷添加至5'裂解产物中。在特定实施例中，核心聚腺苷酸序列是理想的聚腺苷酸序列(例如
AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，聚腺苷酸序列是SV40聚腺苷酸序列、牛生长激素聚腺苷酸序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白聚腺苷酸序列(rβgpA)、其变体、或本领域中已知的另一种适合的异源或内源性聚腺苷酸序列。
[0599] 在一些实施例中，聚核苷酸或含有所述聚核苷酸的细胞利用了自杀基因，包括诱导型自杀基因，来降低直接毒性和/或不受控增殖的风险。在具体实施例中，自杀基因对含
有所述聚核苷酸或细胞的宿主不具有免疫原性。可以使用的自杀基因的某一实例是半胱天
冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。半胱天冬酶-9可以使用特定的二聚化化学诱导剂
(CID)活化。
[0600] 在某些实施例中，聚核苷酸包含使本文所涵盖的基因修饰的细胞易于在体内发生阴性选择的基因区段。“阴性选择”是指，输注的细胞可因个体体内状况的变化而消除。阴性选择表型可以通过插入赋予对所施用试剂(例如化合物)的敏感性的基因而产生。阴性选择
基因是本领域中已知的，并且包括但不限于：赋予更昔洛韦敏感性的I型单纯疱疹病毒胸苷
激酶(HSV-I TK)基因；细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖转
移酶(APRT)基因以及细菌胞嘧啶脱氨酶。
[0601] 在一些实施例中，基因修饰的细胞包含的聚核苷酸还包含能够在体外选择具有阴性选择表型的细胞的阳性标记物。阳性选择标记物可以是在引入宿主细胞中后表达显性表
型的基因，所述显性表型允许对带有所述基因的细胞进行阳性选择。这种类型的基因在本
领域中是已知的并且包括但不限于：赋予对潮霉素B(hygromycin B)的抗性的潮霉素-B磷
酸转移酶基因(hph)；编码对抗生素G418的抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo
或aph)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；腺苷脱氨酶基因(ADA)；以及多药耐药性(MDR)基因。
[0602] 在一个实施例中，阳性选择标记物和阴性选择元件被连接起来，使得阴性选择元件的丧失必然还伴随阳性选择标记物的丧失。在一个特定实施例中，阳性选择标记物与阴
性选择标记物融合，使得其中之一的丧失强制性地导致另一个的丧失。产生赋予上述所希
望阳性和阴性选择特征的多肽作为表达产物的融合聚核苷酸的一个实例是潮霉素磷酸转
移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。表达这一基因产生的多肽赋予潮霉素B抗性用于体外阳性
选择，以及赋予更昔洛韦敏感性用于体内阴性选择。还参见颁予S.D.Lupton的公开PCT 
US91/08442和PCT/US94/05601，描述了通过融合显性阳性选择标记物与阴性选择标记物得
到的双功能选择性融合基因的用途。
[0603] 优选的阳性选择标记物是来源于选自由以下组成的组的基因：hph、nco和gpt，并且优选的阴性选择标记物是来源于选自由以下组成的组的基因：胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、
VZV TK、HPRT、APRT以及gpt。特定实施例中所涵盖的例示性双功能选择性融合基因包括但
不限于阳性选择标记物来源于hph或neo，且阴性选择标记物来源于胞嘧啶脱氨酶或TK基因
或选择性标记物的基因。
[0604] 在特定实施例中，编码一个或多个核酸酶变体、megaTAL、末端加工酶或融合多肽的聚核苷酸可以通过非病毒和病毒方法引入造血细胞，例如T细胞中。在特定实施例中，可
以通过相同方法或通过不同方法，和/或通过相同载体或通过不同载体递送编码核酸酶和/
或供体修复模板的一个或多个聚核苷酸。
[0605] 术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸一般被连接至载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括引导在细胞
中自主复制的序列，或可以包括足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。在特定实施例中，
使用了非病毒载体将本文所涵盖的一个或多个聚核苷酸递送至T细胞中。
[0606] 非病毒载体的示例性实例包括但不限于质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、黏粒和细菌人工染色体。
[0607] 非病毒递送特定实施例中所涵盖的聚核苷酸的示例性方法包括但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪法(biolistics)、病毒粒子、脂质体、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪(gene gun)以及热休克。
[0608] 适用于特定实施例中所涵盖的特定实施例中的聚核苷酸递送系统的示例性实例包括但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX Molecular Delivery Systems和
Copernicus Therapeutics Inc.所提供的那些。脂质体转染试剂是商售的(例如
TransfectamTM和LipofectinTM)。适于聚核苷酸的高效受体识别脂质体转染的阳离子性和
中性脂质在文献中已有描述。参见例如Liu等人(2003)《基因疗法(Gene Therapy.)》10:
180-187；和Balazs等人(2011)《药物递送杂志(Journal of Drug Delivery.)》2011:1-12。
在特定实施例中，还涵盖抗体靶向的、细菌源性、基于纳米单元的非活体递送。
[0609] 包含特定实施例中所涵盖的聚核苷酸的病毒载体可以通过施用给各个患者，典型地如下所述，通过全身施用(例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或表面施用进
行体内递送。或者，可将载体递送至离体细胞，如从各个患者取出的细胞(例如流动的外周
血液、淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检样品等)或全适供血者造血干细胞，随后将所述细胞再植入患者体内。
[0610] 在一个实施例中，包含核酸酶变体和/或供体修复模板的病毒载体被直接施用给生物体以用于体内细胞转导。或者，可以施用裸DNA。施用是通过通常用于引入分子以与血
液或组织细胞最终接触的途径中的任一种进行，包括但不限于注射、输注、表面施加和电穿
孔。施用这类核酸的适合方法是本领域的技术人员可用且众所周知的，并且尽管可以使用
多于一种途径施用特定组合物，但特定途径通常可以提供比另一途径更迅速且更有效的反
应。
[0611] 适用于本文所涵盖的特定实施例中的病毒载体系统的示例性实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。
[0612] 在各种实施例中，编码核酸酶变体和/或供体修复模板的一个或多个聚核苷酸是通过用包含所述一个或多个聚核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导造血细胞，例如T细胞
来引入所述细胞中。
[0613] AAV是较小(约26nm)的复制缺陷型，主要是游离型的无包膜病毒。AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞两种并且可以将其基因组并入宿主细胞的基因组中。重组AAV(rAAV)
典型地在最低限度上由转基因和其调控序列，以及5'和3'AAV反向末端重复(ITR)构成。ITR
序列的长度是约145bp。
[0614] 在特定实施例中，rAAV包含从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10分离的ITR和衣壳序列。
[0615] 在一些实施例中，嵌合rAAV使用了从一种AAV血清型分离ITR序列和从不同AAV血清型分离的衣壳序列。例如，具有来源于AAV2的ITR序列和来源于AAV6的衣壳序列的rAAV称
为AAV2/AAV6。在特定实施例中，rAAV载体可包含来自AAV2的ITR，以及来自AAV1、AAV2、
AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任一种的衣壳蛋白。在一个优选实施例中，rAAV包含来源于AAV2的ITR序列和来源于AAV6的衣壳序列。在一个优选实施例中，rAAV
包含来源于AAV2的ITR序列和来源于AAV2的衣壳序列。
[0616] 在一些实施例中，可将工程改造和选择方法应用于AAV衣壳以使其更容易地转导目的细胞。
[0617] rAAV载体的构造、制造和其纯化已经公开于例如美国专利第9,169,494号；第9,169,492号；第9,012,224号；第8,889,641号；第8,809,058号；以及第8,784,799号中，这些专利各自以全文引用的方式并入本文中。
[0618] 在各种实施例中，编码核酸酶变体和/或供体修复模板的一个或多个聚核苷酸是通过用包含所述一个或多个聚核苷酸的逆转录病毒，例如慢病毒转导造血细胞来引入所述
细胞中。
[0619] 如本文所使用，术语“逆转录病毒”是指将基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝且随后将基因组DNA共价整合至宿主基因组中的RNA病毒。适用于特定实施例中的示例性逆转
录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠
(Harvey murine)肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、
猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒
(MSCV)以及劳斯肉瘤病毒(RSV)和慢病毒。
[0620] 如本文所使用，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒群(或属)。示例性慢病毒包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV；包括1型HIV和HIV 2)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi 
virus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病
毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，基于HIV
的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。
[0621] 在各种实施例中，本文所涵盖的慢病毒载体包含一个或多个LTR，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、聚腺苷酸序列，并且可以任选地包含如本文别处所论述的WPRE或HPRE、隔离子元件、选择性标记物和细胞自杀基
因。
[0622] 在特定实施例中，本文所涵盖的慢病毒载体可以是整合型或非整合型或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用，术语“整合缺陷型慢病毒”或“IDLV”是指具有不能将病毒基因组整合至宿主细胞基因组中的整合酶的慢病毒。不能整合的病毒载体在专利申请WO2006/
010834中已有描述，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
[0623] HIV-1pol基因中适合于降低整合酶活性的示例性突变包括但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81 R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221 L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A以及K264H。
[0624] 在一个实施例中，HIV-1整合酶缺陷型pol基因包含D64V、D116I、D116A、E152G或E152A突变；D64V、D116I和E152G突变；或D64V、D116A和E152A突变。
[0625] 在一个实施例中，HIV-1整合酶缺陷型pol基因包含D64V突变。
[0626] 术语“长末端重复序列(LTR)”是指由位于逆转录病毒DNA两端处的碱基对形成的结构域，其在其天然序列情形下是直接重复序列并且含有U3、R和U5区。
[0627] 如本文所使用，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”是指这样一种核酸，其序列包括逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)。适合FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou等人,2000《, 细胞(Cell)》,101:173中。在另一个
实施例中，慢病毒载体含有在cPPT和/或CTS元件中具有一个或多个突变的FLAP元件。在又
另一个实施例中，慢病毒载体包含cPPT或CTS元件。在又另一个实施例中，慢病毒载体不含
cPPT或CTS元件。
[0628] 如本文所使用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[Ψ]序列，这些序列是病毒RNA插入病毒衣壳或粒子中所需的，参见例如Clever等人,
1995《. 病毒学杂志(J.of Virology)》,第69卷,第4期；第2101-2109页。
[0629] 术语“输出元件”是指调控RNA转录物从细胞核向细胞质的输送的顺式作用转录后调控元件。RNA输出元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参
见例如Cullen等人,1991《. 病毒学杂志》65:1053；和Cullen等人,1991《. 细胞》58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。
[0630] 在特定实施例中，通过将转录后调控元件、高效的聚腺苷酸化位点和任选地转录终止信号并入病毒载体中，使这些载体中异源序列的表达增加。多种转录后调控元件可以
在蛋白质水平上增加异源核酸的表达，例如土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；
Zufferey等人,1999《, 病毒学杂志》,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调控元件
(HPRE)(Huang等人《, 分子与细胞生物学》,5:3864)等(Liu等人,1995《, 基因与发育(Genes Dev.)》,9:1766)。
[0631] 慢病毒载体优选地含有因修饰LTR而引起的若干安全性增强。“自灭活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如其中称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区经过修饰(例如通
过缺失或取代)以防止在第一轮病毒复制之外进行病毒转录。通过用异源启动子置换5'LTR
的U3区以在病毒粒子产生期间驱动病毒基因组的转录，将提供额外安全性增强。可以使用
的异源启动子的实例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒
(CMV)(例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病
毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。
[0632] 如本文所使用，术语“假型”或“假型化”是指病毒包膜蛋白已经被另一具有优选特征的病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，由此允许HIV感染更多的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒
靶向CD4+展示细胞。
[0633] 在某些实施例中，慢病毒载体是根据已知方法制造。参见例如Kutner等人《,BMC生物技术(BMC Biotechnol.)》2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人《.《自然-实验手册》(Nat.Protoc.)》2009；4(4):495-505.doi:10.1038/nprot.2009.22。
[0634] 根据本文所涵盖的某些特定实施例，大部分或所有的病毒载体主链序列都来源于慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列也可以使
用，或可以在不削弱转移载体执行本文所述功能的能力的情况下对某些慢病毒序列进行组
合并作出多种取代和改变。此外，多种慢病毒载体是本领域中已知的，参见Naldini等人
(1996a,1996b和1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号和
第5,994,136号，其中有许多都适合于制造本文所涵盖的病毒载体或转移质粒。
[0635] 在各种实施例中，编码核酸酶变体和/或供体修复模板的一个或多个聚核苷酸是通过用包含所述一个或多个聚核苷酸的腺病毒转导造血细胞来引入所述细胞中。
[0636] 基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中实现极高转导效率且不需要细胞分裂。利用这类载体，已获得高效价和高水平表达。此载体可以在相对简单的系统中大量制造。大
部分腺病毒载体都被工程改造成使得转基因置换Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后，将复制缺
陷型载体传送于以反式提供缺失的基因功能的人293细胞中。Ad载体可以在体内转导多种
类型的组织，包括非分裂、分化细胞，如在肝、肾和肌肉中发现的那些。常规的Ad载体具有较大载运容量。
[0637] 当前复制缺乏型腺病毒载体的产生和传送可利用称为293的独特辅助细胞系，这种细胞系利用Ad5 DNA片段转化人胚肾细胞且组成性表达E1蛋白质(Graham等人,1977)。由
于E3区在腺病毒基因组中是可有可无的(Jones和Shenk,1978)，故当前的腺病毒载体借助
于293细胞在E1、D3或两个区域中携带外来DNA(Graham和Prevec,1991)。腺病毒载体已被用
于真核基因表达(Levrero等人,1991；Gomez-Foix等人,1992)和疫苗研究(Grunhaus和
Horwitz,1992；Graham和Prevec,1992)中。有关将重组腺病毒施用至不同组织的研究包括
气管灌输(Rosenfeld等人,1991；Rosenfeld等人,1992)、肌肉注射(Ragot等人,1993)、周边
静脉内注射(Herz和Gerard,1993)以及立体定位接种至脑中(Le Gal La Salle等人,
1993)。在临床试验中使用Ad载体的实例包含利用肌肉内注射进行抗肿瘤免疫接种的聚核
苷酸疗法(Sterman等人《, 人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》7:1083-9(1998))。
[0638] 在各种实施例中，编码核酸酶变体和/或供体修复模板的一个或多个聚核苷酸是通过用包含所述一个或多个聚核苷酸的单纯疱疹病毒，例如HSV-1、HSV-2转导造血细胞来
引入所述细胞中。
[0639] 成熟HSV病毒粒子由二十面体衣壳包覆由152kb的线性双链DNA分子组成的病毒基因组组成。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需HSV基因。在
一个实施例中，基于HSV的病毒载体是复制缺陷型的。大多数复制缺陷型HSV载体都含有缺
失，移除了一个或多个立即早期、早期或晚期HSV基因以防止复制。例如，HSV载体可缺乏选
自由以下组成的组的立即早期基因：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47和其组合。HSV载体的优势在于，它能够进入潜伏期以引起长期DNA表达并且其具有较大的病毒DNA基因组，由此可以容
纳长达25kb的外源性DNA插入序列。基于HSV的载体描述于例如美国专利第5,837,532号、第
5,846,782号和第5,804,413号，以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/
15637和WO 99/06583中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
[0640] H.基因组编辑过的细胞
[0641] 由特定实施例中所涵盖的方法制造的基因组编辑过的细胞在CBLB基因中包含一个或多个基因编辑并且提供用于预防、治疗或改善癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾
病、免疫缺陷或其相关病况的至少一种症状的改良的基于细胞的治疗剂。不希望受任何特
定理论束缚，相信本文所涵盖的组合物和方法部分地通过使治疗性细胞对免疫抑制信号和
耗竭更持久且更具抗性来增加过继性细胞疗法的功效。
[0642] 特定实施例中所涵盖的基因组编辑过的细胞可以是自体/自体的(“自身的(self)”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体、同基因或异种的)。如本文所使用，“自体”是指来自同一受试者的细胞。如本文所使用，“同种异体”是指来自同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所使用，“同基因”是指来自不同受试者的在基因上与比较
细胞相同的细胞。如本文所使用，“异种”是指来自与比较细胞不同的物种的细胞。在优选实施例中，细胞是从哺乳动物受试者获得。在一个更优选的实施例中，细胞是从灵长类动物受
试者，任选地非人类灵长类动物获得。在最优选实施例中，细胞是从人类受试者获得。
[0643] “分离的细胞”是指从体内组织或器官获得且基本上不含细胞外基质的非天然存在的细胞，例如自然界中不存在的细胞、经过修饰的细胞、工程改造的细胞等。
[0644] 如本文所使用，术语“细胞群”是指可以由任何数目和/或任何组合的如本文别处所描述的同质或异质细胞类型构成的多个细胞。例如，对于转导T细胞，细胞群可以自末梢
血液分离或获得。细胞群可以包含约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约
70％、约80％、约90％或约100％的待编辑的靶细胞类型。在某些实施例中，T细胞可以使用
本领域中已知的方法从异质细胞群分离或纯化。
[0645] 基因组可以使用本文所涵盖的组合物和方法编辑的细胞类型的示例性实例包括但不限于细胞系、原代细胞、干细胞、祖细胞和分化细胞，及其混合物。
[0646] 在一个优选实施例中，所述基因组编辑组合物和方法被用于编辑造血细胞，更优选地编辑免疫细胞并且甚至更优选地编辑T细胞。
[0647] 术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且意图包括胸腺细胞、免疫效应细胞、调节性T细胞、原生T淋巴细胞、不成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可+ + +
以是辅助T细胞(HTL；CD4T细胞)CD4 T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8T细胞)、肿瘤浸润细
胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其它T细胞子集。在一个实施例中，T细胞是免疫效应细胞。在一个实施例中，T细胞是NKT细胞。适用于特定实施例中的其它示例性T细胞群包括原生T细胞和记忆T细胞。
[0648] 在各种实施例中，基因组编辑过的细胞包括含由本文所涵盖的组合物和方法编辑的CBLB基因的免疫效应细胞。“免疫效应细胞”是免疫系统中具有一种或多种效应功能(例
如细胞毒性细胞杀灭活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的任何细胞。特定实施例
中所涵盖的示例性免疫效应细胞是T淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、
TIL和辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。在一个实施例中，免疫效应细胞包含T细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀手(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀手
T(NKT)细胞。
[0649] 在特定实施例中，“强效T细胞”和“幼T细胞”可互换使用并且是指T细胞能够增殖并伴随分化减少的T细胞表型。在特定实施例中，幼T细胞具有“原生T细胞”的表型。在特定实施例中，幼T细胞包含以下生物标记物中的一种或多种，或全部：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，幼T细胞包含以下生物标记物中的一种或多
种，或全部：CD62L、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，幼T细胞不表达CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、PD-1和LAG3。
[0650] T细胞可以从多种来源获得，包括但不限于周边血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、肋膜积液、脾组织以及肿瘤。
[0651] 在特定实施例中，包含免疫效应细胞或T细胞的细胞群包含编辑的CBLB基因，其中所述编辑是通过NHEJ修复的DSB。在特定实施例中，免疫效应细胞或T细胞包含编辑的CBLB
基因，其中所述编辑是通过NHEJ修复的DSB。在特定实施例中，所述编辑是CBLB基因的编码
序列中、优选地在CBLB基因外显子6中，更优选在CBLB基因外显子6中的SEQ ID NO:20(或
SEQ ID NO:22)处约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25个或更多个核苷酸的插入或缺失(INDEL)。
[0652] 在特定实施例中，包含免疫效应细胞或T细胞的细胞群包含在通过HDR修复的DSB处并入的供体修复模板的编辑过的CBLB基因。
[0653] 在特定实施例中，包含免疫效应细胞或T细胞的细胞群包括含供体修复模板的编辑过的CBLB基因，所述供体修复模板包含CBLB基因或其部分并且被设计成用于在基因组
CBLB序列中引入一个或多个突变以改变CBLB表达活性或信号传导，并且优选地，减少或消
除CBLB表达、活性和/或信号传导。
[0654] 在各种实施例中，基因组编辑过的细胞包含在CBLB基因中的编辑并且还包含编码翻转受体、双特异性T细胞接合分子(BiTE)；细胞因子(例如IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-
21、IL-10、IL-12、IL-15以及TNF-α)、趋化因子(例如MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3以及RANTES)、细胞毒素(例如穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如IL-2受体、IL-7
受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)或工程改造的抗原受体(例如工程改造的T细胞
受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分，或嵌合细胞因子受体)的聚核苷酸。
在一个实施例中，包含所述聚核苷酸和核酸酶变体的供体修复模板被引入细胞中并且所述
聚核苷酸通过HDR修复来并入细胞基因组中CBLB基因中的DSB位点处。所述聚核苷酸还可以
例如通过用包含所述聚核苷酸的载体转导细胞来引入细胞中除CBLB基因外的位点处
[0655] I.组合物和配制物
[0656] 特定实施例中所涵盖的组合物可以包含本文所涵盖的一种或多种多肽、聚核苷酸、包含其的载体以及基因组编辑组合物和基因组编辑过的细胞组合物。特定实施例中所
涵盖的基因组编辑组合物和方法可用于编辑细胞或细胞群中人CBLB基因中的靶位点。在优
选实施例中，基因组编辑组合物被用于编辑造血细胞，例如T细胞或免疫效应细胞中的CBLB
基因。
[0657] 在各种实施例中，本文所涵盖的组合物包含核酸酶变体，并且任选地包含末端加工酶，例如3'-5'核酸外切酶(Trex2)。核酸酶变体可呈mRNA形式，以通过前述所公开的聚核
苷酸递送方法，例如电穿孔、脂质纳米粒子等引入细胞中。在一个实施例中，组合物是通过
前述所公开的聚核苷酸递送方法引入细胞中，所述组合物包含编码归巢核酸内切酶变体或
megaTAL和任选地3'-5'核酸外切酶的mRNA。可使用所述组合物，通过易错NHEJ产生基因组
编辑过的细胞或基因组编辑过的细胞群。
[0658] 在各种实施例中，本文所涵盖的组合物包含供体修复模板。所述组合物可以被递送至表达或将表达核酸酶变体和任选地末端加工酶的细胞。在一个实施例中，所述组合物
可以被递送至表达或将表达归巢核酸内切酶变体或megaTAL和任选地3'-5'核酸外切酶的
细胞。可以使用在供体修复模板存在下基因编辑酶的表达，通过HDR产生基因组编辑过的细
胞或基因组编辑过的细胞群。
[0659] 在特定实施例中，本文所涵盖的组合物包含细胞群、核酸酶变体和任选地，供体修复模板。在特定实施例中，本文所涵盖的组合物包含细胞群、核酸酶变体、末端加工酶和任
选地，供体修复模板。核酸酶变体和/或末端加工酶可呈mRNA形式，以通过前述所公开的聚
核苷酸递送方法引入细胞中。
[0660] 在特定实施例中，本文所涵盖的组合物包含细胞群、归巢核酸内切酶变体或megaTAL，和任选地，供体修复模板。在特定实施例中，本文所涵盖的组合物包含细胞群、归巢核酸内切酶变体或megaTAL、3'-5'核酸外切酶，和任选地，供体修复模板。归巢核酸内切
酶变体、megaTAL和/或3'-5'核酸外切酶可呈mRNA形式，以通过前述所公开的聚核苷酸递送
方法，例如电穿孔引入细胞中。
[0661] 在特定实施例中，细胞群包含经过基因修饰的免疫效应细胞。
[0662] 组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指被配制成药学上可接受的或生理学上可接受的溶液以单独或与一种或多种其它治疗模式组合施用给细胞或动物的组
合物。还应理解，必要时，所述组合物还可以与其它试剂，如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药物活性剂组合施用。对于所述组合物中还可以包括的其它组分几乎无限制，只要这些另外的试剂不会不利地影响所述组合物即可。
[0663] 短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触使用而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风
险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
[0664] 术语“药学上可接受的载体”是指与治疗性细胞一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。药物载体的示例性实例可以是无菌液体，如细胞培养基、水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以采用生理盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液作为液体载体，特别是用于可注射溶液。在特定实施例中，适合的
药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可将补充性活性成分并入
所述组合物中。
[0665] 在一个实施例中，包含药学上可接受的载体的组合物适于施用给受试者。在一个实施例中，包含载体的组合物适合肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌
肉内施用。在特定实施例中，包含药学上可接受的载体的组合物适于室内、脊柱内或鞘内施
用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液、细胞培养基或分散液。这些介质和药剂在药学上
活性物质中的使用是本领域中众所周知的。除非任何常规介质或试剂与被转导的细胞不相
容，否则考虑将其用于药物组合物中。
[0666] 在特定实施例中，本文所涵盖的组合物包含经过基因修饰的T细胞和药学上可接受的载体。包含本文所涵盖的基于细胞的组合物的组合物可以通过肠内或肠胃外施用方法
单独施用或与其它适合的化合物组合施用以实现所希望的治疗目标。
[0667] 药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合施用给所治疗的人类受试者。它还应该保持或增加组合物的稳定性。药学上可接受的载体可以是
液体或固体，并且考虑到计划的施用方式，选择的药学上可接受的载体当与组合物的其它
组分组合时可提供所希望的整体(bulk)、稠度等。例如，药学上可接受的载体可以是但不限
于粘合剂(例如预胶凝化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填充剂(例如
乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)、崩解剂(例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。用于本文所涵盖的组合物的其它适合的药学上可接受的载体包
括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0668] 此类载体溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。如本文所使用，术语“缓冲剂”是指化学组成能中和酸或碱但不会显著改变pH的溶液或液体。本文所涵盖的缓冲
剂的实例包括但不限于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco's phosphate 
buffered saline，PBS)、林格氏溶液(Ringer's solution)、5％右旋糖水溶液(D5W)、生理
盐水(normal/physiologic saline)(0.9％NaCl)。
[0669] 药学上可接受的载体的存在量足以将组合物的pH值维持在约7。或者，所述组合物的pH值在约6.8至约7.4范围内，例如是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3以及7.4。在又另一个实施例中，所述组合物的pH值是约7.4。
[0670] 本文所涵盖的组合物可以包含无毒的药学上可接受的介质。组合物可以是悬浮液。如本文所使用，术语“悬浮液”是指非贴壁情形，其中细胞不附着于固体载体。例如，可以搅拌或搅动保持悬浮状态的细胞并使其不粘附到载体，如培养皿。
[0671] 在特定实施例中，本文所涵盖的组合物被配制成悬浮液形式，其中基因组编辑的T细胞被分散于装在静脉内(IV)袋等中的可接受的液体介质或溶液，例如生理盐水或无血清
培养基内。可接受的稀释剂包括但不限于水、PlasmaLyte、林格氏溶液、等张氯化钠(生理盐水)溶液、无血清细胞培养基以及适合低温储存的培养基，例如 培养基。
[0672] 在某些实施例中，药学上可接受的载体基本上不含人或动物来源的天然蛋白质，并且适于储存包含基因组编辑的T细胞群的组合物。治疗性组合物意图施用给人类患者，并
因此基本上不含细胞培养物组分，如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。
[0673] 在一些实施例中，组合物是在药学上可接受的细胞培养基中配制。这类组合物适合施用给人类受试者。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
[0674] 与含有血清的培养基相比，无血清培养基具有几个优点，包括组成简化且更明确、污染程度降低、潜在感染物来源消除并且成本更低。在各种实施例中，无血清培养基是无动
物成分的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物药学上可接受
的重组蛋白。“无动物成分”培养基是指组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换非
动物培养基中的原生动物蛋白且养分是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋
白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
[0675] 特定组合物中所使用的无血清培养基的示例性实例包括但不限于QBSF-60(Quality Biological,Inc.)、StemPro-34(Life Technologies)和X-VIVO 10。
[0676] 在一个优选实施例中，包含基因组编辑的T细胞的组合物是在PlasmaLyte中配制。
[0677] 在各种实施例中，包含基因组编辑的T细胞的组合物是在低温保存培养基中配制。例如，可以使用含低温保存剂的低温保存培养基在解冻后维持高细胞活力结果。特定组合
物中所使用的低温保存培养基的示例性实例包括但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5
和CryoStor CS2。
[0678] 在一个实施例中，所述组合物是在包含50:50PlasmaLyte A:CryoStor CS10的溶液中配制。
[0679] 在特定实施例中，所述组合物基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。对于内毒素而言，“基本上不含”意思指每剂细胞中的内毒素少于FDA关于生物制剂所允许的内毒素，即每天每千克体重5EU总内毒素，对于平均70kg的人来说，就是350EU/总细胞剂量。在特定
实施例中，包含用本文所涵盖的反转录病毒载体转导的造血干细胞或祖细胞的组合物含有
约0.5EU/mL至约5.0EU/mL、或约0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、
3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL或5.0EU/mL。
[0680] 在某些实施例中，所涵盖的适于递送聚核苷酸的组合物和配制物包括但不限于编码一种或多种重编程的核酸酶以及任选地末端加工酶的一个或多个mRNA。
[0681] 用于离体递送的例示性配制物还可以包括使用本领域中已知的各种转染剂，如磷酸钙、电穿孔、热休克以及各种脂质体配制物(即，脂质介导的转染)。如下文更详细地描述，脂质体是包覆一部分含水流体的脂质双层。DNA自发地与阳离子脂质体的外表面缔合(借助
于其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。
[0682] 在特定实施例中，药学上可接受的载体溶液的配制物，以及在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合剂量和治疗方案的研究是本领域的技术人员众所周知
的，包括例如肠内和肠胃外，例如血管内、静脉内、动脉内、骨内、室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内以及髓内施用和配制物。本领域技术人员应理解，本文所涵盖的特定实施例可以包含
其它配制物，如药学领域中众所周知的那些，并且描述于例如《雷明顿：制药科学和实践
(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第I卷和第II卷,第22版,Loyd 
V.Allen Jr.编辑,宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA):Pharmaceutical Press；2012，
其以全文引用的方式并入本文中。
[0683] J.基因组编辑过的细胞的疗法
[0684] 由本文所涵盖的组合物和方法制造的含编辑过的CBLB基因的细胞提供了用于预防、治疗或改善癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的至少一种症状的改良的药品。如本文所使用，术语“药品”是指使用本文所涵盖的组合物和方法制造
的经过基因修饰的细胞。在特定实施例中，所述药品包含经过基因编辑的免疫效应细胞或T
细胞。在优选实施例中，所述药品包含基因编辑过的免疫效应细胞或T细胞，这些细胞表达
工程改造的TCR或CAR或其它工程改造的抗原受体。此外，特定实施例中所涵盖的基因组编
辑的T细胞提供更安全且更有效的过继性细胞疗法，因为这些细胞对T细胞耗竭具有抗性并
且在肿瘤微环境展示出增加的耐久性和持久性，使得可以持续进行治疗。
[0685] 在特定实施例中，将有效量的包含编辑过的CBLB基因的基因组编辑的免疫效应细胞或T细胞施用给受试者以预防、治疗或改善癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的至少一种症状。
[0686] 在特定实施例中，CBLB编辑的细胞基本上不表达或不表达CBLB并因此缺乏或基本上缺乏功能性CBLB表达和/或活性，例如缺乏增加T细胞耗竭和抑制促炎性细胞因子表达的
能力。在特定实施例中，缺乏CBLB的基因组编辑过的免疫效应细胞对来自肿瘤微环境的免
疫抑制信号更具抗性并且对T细胞耗竭展示出增加的持久性和抗性。
[0687] 在特定实施例中，预防、治疗或改善癌症的至少一种症状的方法包含向受试者施用有效量的包含编辑过的CBLB基因和工程改造的TCR、CAR或Daric或其它治疗性转基因的
基因组编辑的免疫效应细胞或T细胞以将细胞重新引导至肿瘤或癌症。经过基因修饰的细
胞是更耐久且更持久的药品，因为这些细胞由于编辑CBLB基因以减少或消除CBLB表达而对
来自肿瘤微环境的免疫抑制信号更具抗性。
[0688] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗实体肿瘤或癌症。
[0689] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗实体肿瘤或癌症，包括但不限于：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS癌症、乳癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、子宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、乳腺管原位癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、头颈癌、血管母细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑素瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi sarcoma)、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌肿瘤、恶性间皮瘤、髓性癌、神经管母细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、梅克尔氏细胞癌(Merkel cell carcinoma)、中线道癌、口部癌症(mouth cancer)、黏液肉瘤、骨髓发育不良综合症、骨髓增生赘瘤、鼻腔和副鼻窦癌症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口部癌症(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、乳头状癌、副神经节瘤、副甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌症、横纹肌肉瘤、唾液腺癌症、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌以及威尔姆斯氏肿瘤(Wilms Tumor)。
[0690] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗实体肿瘤或癌症，包括但不限于肝癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脑癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。
[0691] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗各种癌症，包括但不限于胰腺癌、膀胱癌和肺癌。
[0692] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗液体癌或血液癌。
[0693] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗B细胞恶性病，包括但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0694] 在特定实施例中，本文所涵盖的基因组编辑过的细胞被用于治疗液体癌，包括但不限于白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病
(AML)、骨髓母细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin 
lymphoma)、结节性淋巴细胞为主型霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt 
lymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、多形性大细胞淋巴瘤、塞扎莱氏综合症(Sézary syndrome)、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤、多
发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、郁积性多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、
IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。
[0695] 用于本文所涵盖的基因组编辑方法中的优选的细胞包括自体/自体的(“自身的”)细胞，优选造血细胞，更优选T细胞，并且更优选免疫效应细胞。在一个实施例中，所述细胞是Treg细胞。
[0696] 在特定实施例中，提供了向有需要患者单独或与一种或多种治疗剂组合施用治疗有效量的本文所涵盖的基因组编辑过的细胞或包含这些细胞的组合物的方法。在某些实施
例中，所述细胞被用于治疗有发展癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的风险的患者。因此，特定实施例包含治疗或预防或改善癌症、感染性疾病、自身免
疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的至少一种症状，其包含向有需要的受试者施用治疗有效
量的本文所涵盖的基因组编辑过的细胞。
[0697] 在一个实施例中，治疗有需要的受试者的癌症、GVHD、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的方法包含施用有效量，例如治疗有效量的包含本文所涵盖的基
因组编辑过的细胞的组合物。施用的量和频率将由如患者的状况以及患者疾病的类型和严
重程度等因素决定，不过适当剂量可以通过临床试验确定。
[0698] 在一个示例性实施例中，提供给受试者的基因组编辑过的细胞的有效量是至少2×106个细胞/kg、至少3×106个细胞/kg、至少4×106个细胞/kg、至少5×106个细胞/kg、至
少6×106个细胞/kg、至少7×106个细胞/kg、至少8×106个细胞/kg、至少9×106个细胞/kg、
6
或至少10×10个细胞/kg、或每公斤更多个细胞，包括所有中间细胞剂量。
[0699] 在另一个示例性实施例中，提供给受试者的基因组编辑过的细胞的有效量是约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个
细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、或约10×106个细
胞/kg、或每公斤更多个细胞，包括所有中间细胞剂量。
[0700] 在另一示例性实施例中，提供给受试者的基因组编辑过的细胞的有效量是约2×106个细胞/kg至约10×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg至约10×106个细胞/kg、约4×106
个细胞/kg至约10×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg至约10×106个细胞/kg、2×106个细
胞/kg至约6×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg至约7×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg至
约8×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg至约6×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg至约7×106
个细胞/kg、3×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg至约6×106个细胞/
kg、4×106个细胞/kg至约7×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、5×106
个细胞/kg至约6×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg至约7×106个细胞/kg、5×106个细胞/
kg至约8×106个细胞/kg、或6×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg，包括所有中间细胞剂
量。
[0701] 本领域的普通技术人员应认识到，可能需要多次施用特定实施例中所涵盖的组合物来实行所希望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间范围内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
[0702] 在某些实施例中，可能需要向受试者施用活化的T细胞且随后再抽取血液(或进行单采血液成分术)，活化其中的T细胞，并将这些活化并且扩增的T细胞再输注给患者。这一
过程可以每数周执行多次。在某些实施例中，可以使10cc到400cc的抽血中的T细胞活化。在
某些实施例中，使20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、
250cc、300cc、350cc或400cc或更多的抽血中的T细胞活化。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以用于选出某些T细胞群。
[0703] 特定实施例中所涵盖的组合物的可以通过任何适宜的方式施用，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在一个优选实施例中，组合物是通过肠胃外施用。如本文所使用，短语“肠胃外施用(parenteral administration)”或“通过肠胃外施用
(administered parenterally)”是指除经肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进
行并且包括但不限于血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。在一个实施例中，本文所涵盖的组合物是通过直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中来施用
给受试者。
[0704] 在一个实施例中，治疗被诊断患有癌症的受试者的方法包含从受试者体内取出免疫效应细胞，编辑所述免疫效应细胞的基因组并产生基因组编辑过的免疫效应细胞群，以
及向同一受试者施用所述基因组编辑过的免疫效应细胞群。在一优选实施例中，免疫效应
细胞包含T细胞。
[0705] 用于施用特定实施例中所涵盖的细胞组合物的方法包括可有效再引入离体基因组编辑的免疫效应细胞，或再引入基因组编辑的免疫效应细胞的祖细胞，使其在引入受试
者体内后分化成成熟免疫效应细胞的任何方法。一种方法包含离体基因组编辑末梢血液T
细胞并将被转到的细胞回输至受试者体内。
[0706] 本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同特定且个别地指示每一个别出版物、专利申请或授权专利以引用的
方式并入一般。
[0707] 尽管已经出于清楚理解的目的，通过说明和实例相当详细地描述了前述实施例，但根据本文所涵盖的传授内容，本领域的普通技术人员将易于了解，可以在不脱离所附权
利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且
不具有限制性。本领域的技术人员将容易认识到多种可以被改变或修改以产生基本上类似
的结果的非关键参数。
[0708] 实例
[0709] 实例1
[0710] 对I-ONUI重编程以破坏人卡西塔斯B谱系(CBL)淋巴瘤原癌基因B(CBLB)基因
[0711] 通过构建在DNA识别界面中含有可变氨基酸残基的模块文库，将I-OnuI重编程成靶向CBLB基因的外显子6(图1)。为了构建这些变体，使用寡核苷酸将简并密码子并入I-
OnuI DNA结合结构域中。编码简并密码子的寡核苷酸被用作PCR模板，在酵母菌株酿酒酵母
(S.cerevisiae)中通过空位重组产生变体文库。每个变体文库跨N末端或C末端I-OnuI DNA
识别结构域并且含有约107至108个特有转化体。如图2所示，通过流式细胞术，关于针对包含相应结构域的“半位点”的靶位点(SEQ ID NO:23-29)的裂解活性筛选由此得到的表面展示
文库。
[0712] 对展示N末端和C末端结构域重编程的I-OnuI HE的酵母进行纯化并提取出质粒DNA。执行PCR反应以扩增重编程的结构域，随后将其融合并转化至酿酒酵母中以建立重编
程的结构域组合的文库。从这一文库中鉴别出完全重编程的I-OnuI变体并纯化，这些变体
识别CBLB基因外显子6中存在的完整靶位点(SEQ ID NO:20)。
[0713] 实例2
[0714] 靶向CBLB基因外显子6的重编程的I-ONUI归巢核酸内切酶
[0715] 使用染色体整合的荧光报告子系统测量靶向CBLB基因外显子6的重编程的I-OnuI HE的活性(Certo等人,2011)。将结合并裂解CBLB靶序列(SEQ ID NO:20)的完全重编程的I-
OnuI HE克隆至哺乳动物表达质粒中，接着将其个别地转染至HEK 293T成纤维细胞细胞系
中，该细胞系在编码荧光iRFP蛋白质的框外基因(out-of-frame)上游含有CBLB靶序列。利
用所述HE裂解嵌入的靶位点并在DNA修复之后通过非同源末端接合(NHEJ)路径积累indel
使得约三分之一的被修复的基因座将荧光报告基因放回“框内”。因此，使用带iRFP荧光的
HEK 293T细胞的百分比作为在染色体嵌入的靶序列处核酸内切酶活性的读出。结合并裂解
CBLB靶序列的完全重编程的I-OnuI HE在细胞染色体环境中显示出高频率iRFP表达，由此
指示所述HE变体在细胞染色体环境中具有高编辑效率所希望的特性。图3。
[0716] CBLB.E3 HE变体对于外显子6靶位点具有亚纳摩尔浓度的亲和力。图4。图5显示代表性I-OnuI变体的相对比对以及构成DNA识别界面的残基的位置信息。
[0717] 实例3
[0718] 靶向CBLB外显子6的MEGATAL的表征
[0719] 通过将对应于12个碱基对的TAL阵列靶位点(SEQ ID NO:21)的11.5个单元的TAL阵列附接至大范围核酸酶结构域的N末端，将CBLB.E3、CBLB.A8、CBLB.B5、CBLB.D2及
CBLB.F6 HE变体设计成megaTAL形式(SEQ ID NO:13-19)(如Boissel等人,2013中所描述)。
图6。megaTAL靶位点序列如SEQ ID NO:22中所示。
[0720] 通过在补充有细胞因子的培养基中用抗CD3和抗CD28抗体预刺激原代人T细胞48-72小时，接着将编码megaTAL的体外转录(IVT)、戴帽并聚腺苷酸化的mRNA电穿孔放入所述
细胞中，来评估megaTAL编辑效率。此外，还添加编码3'至5'核酸外切酶Trex2的IVT-mRNA以
通过非同源末端接合(NHEJ)路径增进断裂加工(参见Certo等人,2012)。
[0721] 在一组实验中，在电穿孔后培养细胞7天(总计培养10天)并通过在培养第5天、第7天和第10天分离基因组DNA并跨CBLB靶位点测序以测量插入缺失频率来测量编辑效率。图
7。通过对CD3+T细胞进行细胞内FACS分析来测量CBLB蛋白质水平。图8。
[0722] 用CBLB megaTAL编辑的T细胞或CAR T细胞显示当分别用抗CD3激动性抗体或CAR特异性抗原刺激时细胞因子产生水平相较于缺乏活性megaTAL(电穿孔放入无活性
megaTAL)或完全没有megaTAL(无EP)的未编辑的T细胞和CAR T细胞增加。
[0723] 图9。
[0724] 在另一组实验中，在补充有细胞因子的培养基中培养细胞7-10天。在电穿孔后第7天，分离出基因组DNA，随后跨CBLB外显子6靶位点进行PCR扩增。使用分解跟踪Indel
(Tracking of Indels by DEcomposition，TIDE；参见Brinkman等人,2014)测量indel的频
率。图10显示代表性TIDE分析。
[0725] 实例4
[0726] 使用CBLB MEGATAL的示例性同源介导的修复策略
[0727] 设计并构建腺相关病毒(AAV)质粒，该质粒含有转基因盒，其包含骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点取代(MND)的启动子可操作地连接至编码
荧光蛋白质(GFP)的转基因、土拔鼠肝炎病毒的转录后调控元件(WPRE)及SV40晚期聚腺苷
酸化信号(图11，AAV供体)。通过XmaI消化和测序确定AAV质粒的完整性。所述转基因盒被放
在两个0.3kb同源区之间，侧接CBLB megaTAL裂解位点(SEQ ID NO:20、22)。同源区都不含
完整megaTAL靶位点。
[0728] 通过用一个或多个质粒短暂共转染HEK 293T细胞来制备重组AAV(rAAV)，所述质粒提供所需的复制、衣壳和腺病毒辅助元件。使用超速离心法，以基于碘克沙醇
(iodixanol)的梯度自共转染的HEK 293T细胞培养物中纯化出重组AAV。
[0729] 在用CD3和CD28活化并在补充有IL-2的完全培养基中培养的原代人T细胞中评价megaTAL诱导的同源重组。3天后，洗涤T细胞并电穿孔放入体外转录的编码CBLB.A8 
megaTAL的mRNA(SEQ ID NO:32)，随后用纯化的编码DNA供体修复模板的重组AAV转导，所述
DNA供体修复模板包含以上描述的MND-GFP转基因盒。在多个时间点使用流式细胞测量术测
量表达荧光蛋白质的T细胞的出现率并区分未整合的rAAV靶向载体中荧光蛋白质的短暂表
达。
[0730] 在21-24％用megaTAL和rAAV靶向载体处理的T细胞中观察到长期转基因表达。相比之下，未处理的对照样品不表达可检测水平的荧光蛋白质。结果在针对从独立供体分离
的T细胞执行的实验中得到证实。
[0731] 实例5
[0732] Cbl-b编辑过的抗EGFR CAR T细胞在体内肿瘤模型中显示抗肿瘤功效增加
[0733] 使用抗EGFR CAR T细胞测试CBLB基因编辑对小鼠体内A549肿瘤模型中CAR T细胞药理学的影响。
[0734] 在第0天，用可溶性抗CD3和抗CD28抗体活化人PBMC(1×106个细胞/毫升)。培育246
小时后，用抗EGFR CAR慢病毒转导1×10个细胞。抗体刺激后七十二小时，在体外转录的编
码CBLB.E3  megaTAL的mRNA(SEQ  ID  NO:31)存在或不存在下，电穿孔(Lonza 
Nucleofector)放入转导的PBMC或未转导的对照PBMC。在含有IL-2的培养基中培养电穿孔
的细胞10天。培养之后，通过下一代测序(NGS)indel分析评估71％的T细胞呈CBLB阴性。
[0735] 小鼠接受皮下施用的上皮癌瘤细胞系(A549)并使用测径规测量法监测肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到120mm3时，对小鼠输注等效CAR+T细胞剂量(3×107个CAR+T细胞)。媒剂
处理的T细胞和未转导的对照T细胞对肿瘤生长具有最小影响。相较于对照组，用未经历
CBLB编辑的抗EGFR CAR T细胞治疗的动物能够延迟肿瘤长出；七只小鼠中的两只展现完全
肿瘤控制。相比之下，接受CBLB编辑过的抗EGFR CAR T细胞的全部七只小鼠完全清除A549
肿瘤并在研究持续时间(CAR T细胞注射后35天)中保持无肿瘤。
[0736] 总体而言，在所附权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求项局限于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，而是应解释为包括所有可能的实施例以及
与这些权利要求项所授权的内容等效的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。
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