ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用
阅读：451发布：2020-05-15
专利汇可以提供ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种增强T细胞活性的方法，通过在T细胞中沉默ATPIF1基因，使T细胞在免疫过程中快速增值、活化、提高T细胞的效应功能及增强T细胞对 肿瘤 细胞的杀伤作用，本发明还公开了ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，为肿瘤过继性免疫 治疗 的研发提供了新的方向。，下面是ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种增强T细胞活性的方法，其特征在于：通过沉默ATPIF1基因来增强T细胞活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述T细胞活性包括T细胞的效应功能和肿瘤杀伤功能。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述T细胞为CD8+ T细胞。
4.ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：沉默ATPIF1基因可增强T细胞活性。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述T细胞活性包括T细胞的效应功能和肿瘤杀伤功能。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述T细胞为CD8+ T细胞。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、胶质瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、B细胞淋巴瘤。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为黑色素瘤。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物为液体制剂，使用方式是单独用药或者联合给药。
ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
[0002] PD-1/PD-L1抗体在临床大量使用的疗效表明，肿瘤免疫治疗成为治疗晚期或传统治疗耐药癌症患者的一个有效策略；T细胞作为肿瘤免疫治疗的关键执行者，其对肿瘤抗原的识别特异性固然至关重要，然T细胞的一些其他内在特性，如持久性、寿命和功能性等，对免疫治疗效果的好坏也具有重要影响；近年来越来越多的研究发现，T细胞能量代谢途径在调节这些特性中起着重要作用，代谢活性受细胞信号通路和表观遗传学的调控，也深刻影响了T细胞分化和命运的轨迹，进而影响T细胞抗肿瘤的实际效果；因此，T细胞代谢调节是一个潜在的改良办法，通过调节T细胞的代谢通路，有望成为一种提高T细胞抗肿瘤疗效的有效策略。
[0003] 线粒体（Mitochondrion, MT）是细胞能量代谢的加工厂，通过对葡萄糖和脂肪酸等底物的氧化获得营养物质的化学能，通过对ADP的磷酸化，转变成细胞能够利用的能量，储存在高能磷酸化合物ATP中，为细胞活动提供能量；线粒体作为真核细胞中具有动态双层膜结构的细胞器，由外至内可以划分为四个功能区，分别是线粒体外膜（OMM）、线粒体膜间隙、线粒体内膜（IMM）和线粒体基质；在线粒体内膜上的复合体V（Complex V）即为ATP合酶，其主要功能是合成ATP；然而后续研究表明，ATP合酶既合成也水解ATP，对细胞ATP水平有双向调节作用；ATP合酶的活性受抑制因子（ATPIF1）的调节，ATPIF1是60年前发现的第一个可与ATP合酶相互作用的细胞核基因编码的、在进化上高度保守的线粒体蛋白，通过与ATP合酶的F1区相互作用，在不同的生理和病理条件下，可发挥选择性的抑制ATP合酶水解ATP或合成ATP的调节作用，从而影响着细胞内的氧化磷酸化水平、糖酵解水平、细胞膜电位、活性氧的产生等；目前对于ATPIF1在细胞能量代谢的研究主要集中在肿瘤细胞、神经元和干细胞的相关方面，其在T细胞代谢中的作用及其对T细胞抗肿瘤免疫功能的影响尚未见相关报道。
[0004] 免疫代谢反应提出了对T细胞分化方向和T细胞功能中生物能量需求方面的新理解，随着对免疫代谢及代谢影响T细胞效应状态机制的阐明，通过代谢调节来优化T细胞的抗肿瘤功能将会为免疫治疗提供新的方向；本发明尝试从细胞能量代谢途径来探讨ATPIF1调控T细胞功能的变化，为临床基于T细胞的肿瘤过继性免疫治疗提供新的策略和科学依据。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提出了一种增强T细胞抗肿瘤活性的方法，该方法通过沉默ATPIF1基因来增强T细胞抗肿瘤的活性。
[0006] 本发明的目的还在于提出了ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，主要探讨了ATPIF1基因沉默对T细胞抗肿瘤活性的影响，结果表明利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑，沉默ATPIF1基因，通过增强T细胞线粒体活性使T细胞快速增值、活化，显著增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0007] 优选的，所述T细胞活性包括T细胞的效应功能和肿瘤杀伤功能。
[0008] 优选的，所述T细胞为CD8+ T细胞。
[0010] 优选的，所述药物为活的T细胞形式的液体制剂，使用方式是单独用药或者联合给药。
[0011] 本发明产生的有益效果是：本发明经过研究得到了调节T细胞抗肿瘤活性的新因素，即ATP合酶抑制因子1（ATPIF1）基因，通过沉默该基因表达可直接增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能；
本发明凸显出ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向。
附图说明
本发明凸显出ATPIF1基因沉默的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向。
附图说明
[0012] 图1为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠接种B16肿瘤细胞以及CD8+T细胞清除后肿瘤生长的差异对比图；图2为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在CD3/CD28磁珠刺激三天后的增值情况对比图；
图3为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在CD3/CD28磁珠刺激三天后培养基中IFN-γ的表达情况对比图；
图4为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在静息状态下的线粒体通量分析图；
图5为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在CD3/CD28磁珠刺激活化条件下的糖酵解分析图；
图6为野生型小鼠和ATPIF1-/-OT-1小鼠脾脏细胞与B16-OVA细胞共培养后，流式检测CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平对比图；
图7为野生型小鼠和ATPIF1-/-OT-1小鼠脾脏细胞与B16-OVA细胞共培养后，流式检测CD8+T细胞分泌Granzyme B的水平对比图；
图8为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠CD8+T细胞的电镜图。
图3为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在CD3/CD28磁珠刺激三天后培养基中IFN-γ的表达情况对比图；
图4为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在静息状态下的线粒体通量分析图；
图5为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠T细胞在CD3/CD28磁珠刺激活化条件下的糖酵解分析图；
图6为野生型小鼠和ATPIF1-/-OT-1小鼠脾脏细胞与B16-OVA细胞共培养后，流式检测CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平对比图；
图7为野生型小鼠和ATPIF1-/-OT-1小鼠脾脏细胞与B16-OVA细胞共培养后，流式检测CD8+T细胞分泌Granzyme B的水平对比图；
图8为野生型小鼠和ATPIF1-/-小鼠CD8+T细胞的电镜图。
具体实施方式
[0013] 实验动物 ：A组为野生型小鼠30只，8-12周龄；B组为ATPIF1-/-小鼠30只，8-12周龄；C组为野生型OT-1小鼠6只，8-12周龄；D组为ATPIF1-/-OT-1小鼠6只，8-12周龄；所有小鼠均由新乡医学院动物实验中心提供，小鼠饲养在SPF级环境中，12h明暗交替，环境温度22-26℃，湿度40%-60%，低脂饲料（脂肪=≥4％的kcal）喂养，自由摄食和饮水。
[0014] 实施例1：小鼠B16肿瘤接种实验
1)、分别从A组和B组取8只小鼠，均在腋下注射B16肿瘤细胞，将A组的8只小鼠均分为A1组和A2组，B组的8只小鼠均分为B1组和B2组；
2)、三天后，对A2组和B2组的小鼠进行腹腔注射CD8抗体，之后每隔三天进行一次腹腔CD8抗体注射，以消除小鼠CD8+ T细胞的作用；
3)、14天后，处死A1、A2、B1、B2组的小鼠取出黑色素瘤；
对比各组小鼠的黑色素瘤的尺寸和重量，结果参见附图1，其中，图A是两种小鼠体内取出的黑色素瘤的尺寸对照图片，图B是黑色素瘤的重量对比，可以看出ATPIF1-/-小鼠与野生型小鼠相比，肿瘤较小且重量较轻，肿瘤生长延缓，说明沉默ATPIF1可以抑制肿瘤生长；注+ -/-
射CD8抗体清除CD8T细胞后，ATPIF1 小鼠肿瘤变大且重量变重，其对B16肿瘤的增值抑制作用消失，说明CD8+ T细胞在延缓B16在ATPIF1-/-小鼠的生长中起着重要的作用，也表明ATPIF1基因沉默能够增强CD8+T细胞的抗肿瘤能力的作用。
1)、分别从A组和B组取8只小鼠，均在腋下注射B16肿瘤细胞，将A组的8只小鼠均分为A1组和A2组，B组的8只小鼠均分为B1组和B2组；
2)、三天后，对A2组和B2组的小鼠进行腹腔注射CD8抗体，之后每隔三天进行一次腹腔CD8抗体注射，以消除小鼠CD8+ T细胞的作用；
3)、14天后，处死A1、A2、B1、B2组的小鼠取出黑色素瘤；
对比各组小鼠的黑色素瘤的尺寸和重量，结果参见附图1，其中，图A是两种小鼠体内取出的黑色素瘤的尺寸对照图片，图B是黑色素瘤的重量对比，可以看出ATPIF1-/-小鼠与野生型小鼠相比，肿瘤较小且重量较轻，肿瘤生长延缓，说明沉默ATPIF1可以抑制肿瘤生长；注+ -/-
射CD8抗体清除CD8T细胞后，ATPIF1 小鼠肿瘤变大且重量变重，其对B16肿瘤的增值抑制作用消失，说明CD8+ T细胞在延缓B16在ATPIF1-/-小鼠的生长中起着重要的作用，也表明ATPIF1基因沉默能够增强CD8+T细胞的抗肿瘤能力的作用。
[0015] 实施例2：+
分离纯化小鼠CD8 T细胞
1、脾脏细胞的制备
1)取34个5cm的细胞培养皿，分别标号为A1、A2、A3…A17、B1、B2、B3…B17，每个细胞培养皿中加入预热至室温的PBS（0.1％BSA + 0.6％柠檬酸钠）5 mL，每个细胞培养皿中分别放一个细胞滤网，取A、B两组小鼠各17只并处死，取出脾脏分别放在滤网里，用注射器后部研磨组织，定期用PBS冲洗滤网；
2)研磨好的脾脏细胞悬液用移液器转移至15ml离心管中，用冷的PBS填充满，1300rpm离心10分钟；
3)弃上清，细胞悬液重悬于15ml冷的PBS中，离心10分钟；
4)重复上步操作，洗3遍；
2、小鼠红细胞的裂解
1)每个脾脏用5ml红细胞裂解缓冲液重悬沉淀；
2)在冰上孵育5分钟，偶尔摇动；
3)用20-30ml 1X PBS稀释裂解缓冲液以终止反应；
4)离心弃上清，重悬于5ml PBS中；
5)细胞计数；
3、洗珠子
1)重新悬浮小瓶中的珠子（即涡旋> 30秒，或倾斜并旋转5分钟）；
2)按照每1×107个脾脏细胞加入200μL磁珠，将所需体积的珠子转移到离心管中；
3)加入相同体积的分离缓冲液，并重新悬浮；
4)将试管置于磁铁中1分钟，弃去上清液；
5)从磁铁上取下试管，并将洗过的珠粒重悬于与初始转移的珠子相同体积的分离缓冲液中；
4、分离未接触的小鼠CD8+ T细胞（以1×107个细胞为例）
1)将100μL细胞在分离缓冲液中转移至离心管中；
2)加入20μL热灭活的FBS；
3)加入20μL抗体混合物；
4)充分混匀，在2°C至8°C孵育20分钟；
5)加入2 mL分离缓冲液洗涤细胞。将离心管倾斜几次并在2℃至8℃以350×g离心8分钟以充分混合，丢弃上清液；
6)将细胞重悬于800μL分离缓冲液中；
7)加入200μL预先洗涤并重新悬浮的磁珠；
8)轻柔倾斜和旋转，在18°C至25°C孵育15分钟(使细胞和珠粒保留在离心管底部)；
9)加入1 mL分离缓冲液；
10)使用移液器轻轻吸取5次，重新悬浮珠子束缚的细胞，避免起泡；
11)将离心管置于磁体中2分钟，并将上清液分别转移到34个15ml的新的离心管中，离心管标号依旧是A1、A2、A3…A17；B1、B2、B3…B17，上清液中含有分离的小鼠T细胞。
分离纯化小鼠CD8 T细胞
1、脾脏细胞的制备
1)取34个5cm的细胞培养皿，分别标号为A1、A2、A3…A17、B1、B2、B3…B17，每个细胞培养皿中加入预热至室温的PBS（0.1％BSA + 0.6％柠檬酸钠）5 mL，每个细胞培养皿中分别放一个细胞滤网，取A、B两组小鼠各17只并处死，取出脾脏分别放在滤网里，用注射器后部研磨组织，定期用PBS冲洗滤网；
2)研磨好的脾脏细胞悬液用移液器转移至15ml离心管中，用冷的PBS填充满，1300rpm离心10分钟；
3)弃上清，细胞悬液重悬于15ml冷的PBS中，离心10分钟；
4)重复上步操作，洗3遍；
2、小鼠红细胞的裂解
1)每个脾脏用5ml红细胞裂解缓冲液重悬沉淀；
2)在冰上孵育5分钟，偶尔摇动；
3)用20-30ml 1X PBS稀释裂解缓冲液以终止反应；
4)离心弃上清，重悬于5ml PBS中；
5)细胞计数；
3、洗珠子
1)重新悬浮小瓶中的珠子（即涡旋> 30秒，或倾斜并旋转5分钟）；
2)按照每1×107个脾脏细胞加入200μL磁珠，将所需体积的珠子转移到离心管中；
3)加入相同体积的分离缓冲液，并重新悬浮；
4)将试管置于磁铁中1分钟，弃去上清液；
5)从磁铁上取下试管，并将洗过的珠粒重悬于与初始转移的珠子相同体积的分离缓冲液中；
4、分离未接触的小鼠CD8+ T细胞（以1×107个细胞为例）
1)将100μL细胞在分离缓冲液中转移至离心管中；
2)加入20μL热灭活的FBS；
3)加入20μL抗体混合物；
4)充分混匀，在2°C至8°C孵育20分钟；
5)加入2 mL分离缓冲液洗涤细胞。将离心管倾斜几次并在2℃至8℃以350×g离心8分钟以充分混合，丢弃上清液；
6)将细胞重悬于800μL分离缓冲液中；
7)加入200μL预先洗涤并重新悬浮的磁珠；
8)轻柔倾斜和旋转，在18°C至25°C孵育15分钟(使细胞和珠粒保留在离心管底部)；
9)加入1 mL分离缓冲液；
10)使用移液器轻轻吸取5次，重新悬浮珠子束缚的细胞，避免起泡；
11)将离心管置于磁体中2分钟，并将上清液分别转移到34个15ml的新的离心管中，离心管标号依旧是A1、A2、A3…A17；B1、B2、B3…B17，上清液中含有分离的小鼠T细胞。
[0016] 实施例3：羧酸荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测T淋巴细胞增殖
1)取实施例2中的A1、A2、A3、A4、A5、A6和B1、B2、B3、B4、B5、B6离心管，离心弃上清，每管的T细胞重悬于含有5％热灭活的血清（FBS）的1 mL1640培养基中，T细胞浓度在5 x 106/毫升；
2)将每管T细胞彻底重悬于1 mL体积的含2%血清的1640培养基中，小心地放入新鲜（未润湿）的15 mL离心管底部；
3)水平放置管子（使用未润湿的管子将阻止1 mL细胞悬浮液移动并过早地与CFDA，SE溶液混合）；
4)小心地将110μLPBS添加到管顶部塑料的未润湿部分，确保其不与细胞溶液接触；
5)在110μLPBS中重悬1.1μL的5mM CFDA；
6)快速盖住管子并反转并充分涡旋，以使溶液快速均匀混合，CFSE染料的最终浓度为
5mM；
7)在室温下孵育T细胞5分钟，用铝箔覆盖，保护管免受光照；
8)每管T细胞通过在完全培养基中稀释来洗涤细胞，在20℃下以300×g离心5分钟沉淀并弃去上清液，重复洗涤两次；
9)将标记过的T细胞用CD3/CD28磁珠刺激三天后，离心之后取T细胞沉淀通过流式细胞仪检测，并留存离心获得的上清液，备用。
1)取实施例2中的A1、A2、A3、A4、A5、A6和B1、B2、B3、B4、B5、B6离心管，离心弃上清，每管的T细胞重悬于含有5％热灭活的血清（FBS）的1 mL1640培养基中，T细胞浓度在5 x 106/毫升；
2)将每管T细胞彻底重悬于1 mL体积的含2%血清的1640培养基中，小心地放入新鲜（未润湿）的15 mL离心管底部；
3)水平放置管子（使用未润湿的管子将阻止1 mL细胞悬浮液移动并过早地与CFDA，SE溶液混合）；
4)小心地将110μLPBS添加到管顶部塑料的未润湿部分，确保其不与细胞溶液接触；
5)在110μLPBS中重悬1.1μL的5mM CFDA；
6)快速盖住管子并反转并充分涡旋，以使溶液快速均匀混合，CFSE染料的最终浓度为
5mM；
7)在室温下孵育T细胞5分钟，用铝箔覆盖，保护管免受光照；
8)每管T细胞通过在完全培养基中稀释来洗涤细胞，在20℃下以300×g离心5分钟沉淀并弃去上清液，重复洗涤两次；
9)将标记过的T细胞用CD3/CD28磁珠刺激三天后，离心之后取T细胞沉淀通过流式细胞仪检测，并留存离心获得的上清液，备用。
[0017] 结果：图2可以看出，与野生型小鼠相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞在CD3/CD28磁珠刺激下增值更快。
[0018] 实施例4：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠T细胞培养液上清液（上清液来自于实施例3步骤
9））中IFN-γ的表达
1)取用于检测的预先包被IFN-γ抗体的96孔板，每孔用至少300μL1X洗涤缓冲液洗涤平板4次，然后用吸水纸牢固地轻轻敲击平板，以吸干残留的缓冲液，随后的所有洗涤应该以相似的方式进行；
2)采用标准浓度为2000pg / mL，1000pg / mL，500pg / mL，250pg / mL，125pg / mL，
62.5pg / mL和31.3pg / mL小鼠IFN-γ溶液制备标准曲线，测定缓冲液A用作零标准（0pg/mL）；
3)将50μL分析缓冲液加入到孔中；
4)将50μL标准稀释液和50μL上清液分别加入到对应的孔中；
5)用包含在试剂盒中的密封板密封平板，并在200rpm振荡的同时在室温下温育平板2小时；
6)将板的内容物倒入水槽中，然后如步骤1中一样用1X洗涤缓冲液洗涤板4次；
7)向每个孔中加入100μL小鼠IFN-γ检测抗体溶液，密封板并在室温下振荡1小时；
8)将板的内容物倒入水槽中，然后按照步骤1中的方法用1X洗涤缓冲液洗涤板4次；
9)向每个孔中加入100μL抗生物素蛋白-HRP A溶液，密封板并在室温下摇动30分钟；
10)将板的内容物倒入水槽中，然后用1X洗涤缓冲液洗涤板5次，如步骤1）所示，对于最后一次洗涤，在1X洗涤缓冲液中将孔浸泡30秒至每次洗涤1分钟；
11)向每个孔中加入100μL底物溶液F并在黑暗中孵育15分钟，含有小鼠IFN-γ的孔应该以与其浓度成比例的强度变成蓝色；
12)每孔加入100μL Stop Solution，溶液颜色从蓝色变为黄色时反应终止；
13)在30分钟内读取450nm和570nm处的吸光度，从450nm处的吸光度中减去570nm处的吸光度；
14)根据标准品的浓度和吸光度制备标准曲线，将检测上清的吸光度代入标准曲线求得T细胞培养液上清中IFN-γ的浓度；
结果：由图3可以看出，与野生型小鼠相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞经过CD3/CD28磁珠活化之后，培养液上清中有更高的IFN-γ的表达。
9））中IFN-γ的表达
1)取用于检测的预先包被IFN-γ抗体的96孔板，每孔用至少300μL1X洗涤缓冲液洗涤平板4次，然后用吸水纸牢固地轻轻敲击平板，以吸干残留的缓冲液，随后的所有洗涤应该以相似的方式进行；
2)采用标准浓度为2000pg / mL，1000pg / mL，500pg / mL，250pg / mL，125pg / mL，
62.5pg / mL和31.3pg / mL小鼠IFN-γ溶液制备标准曲线，测定缓冲液A用作零标准（0pg/mL）；
3)将50μL分析缓冲液加入到孔中；
4)将50μL标准稀释液和50μL上清液分别加入到对应的孔中；
5)用包含在试剂盒中的密封板密封平板，并在200rpm振荡的同时在室温下温育平板2小时；
6)将板的内容物倒入水槽中，然后如步骤1中一样用1X洗涤缓冲液洗涤板4次；
7)向每个孔中加入100μL小鼠IFN-γ检测抗体溶液，密封板并在室温下振荡1小时；
8)将板的内容物倒入水槽中，然后按照步骤1中的方法用1X洗涤缓冲液洗涤板4次；
9)向每个孔中加入100μL抗生物素蛋白-HRP A溶液，密封板并在室温下摇动30分钟；
10)将板的内容物倒入水槽中，然后用1X洗涤缓冲液洗涤板5次，如步骤1）所示，对于最后一次洗涤，在1X洗涤缓冲液中将孔浸泡30秒至每次洗涤1分钟；
11)向每个孔中加入100μL底物溶液F并在黑暗中孵育15分钟，含有小鼠IFN-γ的孔应该以与其浓度成比例的强度变成蓝色；
12)每孔加入100μL Stop Solution，溶液颜色从蓝色变为黄色时反应终止；
13)在30分钟内读取450nm和570nm处的吸光度，从450nm处的吸光度中减去570nm处的吸光度；
14)根据标准品的浓度和吸光度制备标准曲线，将检测上清的吸光度代入标准曲线求得T细胞培养液上清中IFN-γ的浓度；
结果：由图3可以看出，与野生型小鼠相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞经过CD3/CD28磁珠活化之后，培养液上清中有更高的IFN-γ的表达。
[0019] 实施例5：小鼠T细胞线粒体通量分析（OCR）
1)海马检测培养基的配制：海马基础培养基加入2.05mM葡萄糖、2.0Mm L-谷氨酰胺和
1.0mM丙酮酸钠；
2)实验前一天在探针板中每孔加1ml水化液，置于37℃恒温箱中过夜，开机器；
3)实验当天在细胞板中每孔加50μl粘附剂，在室温下放置20分钟，每孔用无菌水洗两次；
4)取实施例2中的A7、A8、A9和B7、B8、B9离心管，将每个离心管中的T细胞在室温下以
200×g离心细胞5分钟；
5)将100μL测定培养基移液到室温Cell-Tak-包被的XF24细胞培养微孔板的背景/对照孔中；
6)从离心管中弃去上清液；
7)将T细胞重悬于适当体积的温热测定培养基中，使得在100μL测定培养基中导致每孔
1×106个T细胞；
8)吸取100μL细胞悬液沿着每个孔的侧面，除了背景/对照孔；
9)将细胞板转移到37℃培养箱中，不补充CO2保持25-30分钟，以确保细胞完全附着，目测确认大部分细胞稳定地粘附于培养表面；
10)将前一天置于37℃恒温箱中探针板取出，在加药孔加药；
11)将加好药物的探针板置于Agilent Seahorse XFe24分析仪中校准15分钟；
12)取出细胞板，慢慢地，轻轻地，沿着每个孔的侧面添加400μL温热测定，小心避免干扰细胞；
13)观察显微镜下的细胞，检查细胞是否脱落；
14)将细胞板放回培养箱15-25分钟，之后将细胞平板置于校准好的Agilent Seahorse XFe分析仪中进行分析；
结果：图4的T细胞是在静息状态下检测的，静息状态下，T细胞主要依靠氧化磷酸化来供能，在淋巴组织间迁移，起到免疫监视作用；其中，图A为T细胞线粒体通量分析结果；图B为T细胞线粒体的基础有氧呼吸；图C为T细胞线粒体用于产生ATP的耗氧量；图D为T细胞线粒体有氧呼吸的储备值，可以看出，与野生型小鼠的T细胞相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞有更-/-
高的氧化磷酸化水平，ATPIF1 小鼠的T细胞的基础有氧呼吸、ATP的产生和有氧呼吸的储备值都明显高于野生型小鼠，表明ATPIF1基因沉默可以提高线粒体活性，为T细胞提供更多的能量，从而提高T细胞抗肿瘤功能。
1)海马检测培养基的配制：海马基础培养基加入2.05mM葡萄糖、2.0Mm L-谷氨酰胺和
1.0mM丙酮酸钠；
2)实验前一天在探针板中每孔加1ml水化液，置于37℃恒温箱中过夜，开机器；
3)实验当天在细胞板中每孔加50μl粘附剂，在室温下放置20分钟，每孔用无菌水洗两次；
4)取实施例2中的A7、A8、A9和B7、B8、B9离心管，将每个离心管中的T细胞在室温下以
200×g离心细胞5分钟；
5)将100μL测定培养基移液到室温Cell-Tak-包被的XF24细胞培养微孔板的背景/对照孔中；
6)从离心管中弃去上清液；
7)将T细胞重悬于适当体积的温热测定培养基中，使得在100μL测定培养基中导致每孔
1×106个T细胞；
8)吸取100μL细胞悬液沿着每个孔的侧面，除了背景/对照孔；
9)将细胞板转移到37℃培养箱中，不补充CO2保持25-30分钟，以确保细胞完全附着，目测确认大部分细胞稳定地粘附于培养表面；
10)将前一天置于37℃恒温箱中探针板取出，在加药孔加药；
11)将加好药物的探针板置于Agilent Seahorse XFe24分析仪中校准15分钟；
12)取出细胞板，慢慢地，轻轻地，沿着每个孔的侧面添加400μL温热测定，小心避免干扰细胞；
13)观察显微镜下的细胞，检查细胞是否脱落；
14)将细胞板放回培养箱15-25分钟，之后将细胞平板置于校准好的Agilent Seahorse XFe分析仪中进行分析；
结果：图4的T细胞是在静息状态下检测的，静息状态下，T细胞主要依靠氧化磷酸化来供能，在淋巴组织间迁移，起到免疫监视作用；其中，图A为T细胞线粒体通量分析结果；图B为T细胞线粒体的基础有氧呼吸；图C为T细胞线粒体用于产生ATP的耗氧量；图D为T细胞线粒体有氧呼吸的储备值，可以看出，与野生型小鼠的T细胞相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞有更-/-
高的氧化磷酸化水平，ATPIF1 小鼠的T细胞的基础有氧呼吸、ATP的产生和有氧呼吸的储备值都明显高于野生型小鼠，表明ATPIF1基因沉默可以提高线粒体活性，为T细胞提供更多的能量，从而提高T细胞抗肿瘤功能。
[0020] 实施例6：小鼠T细胞外酸化率检测（ECAR）
1)海马检测培养基的配制：海马基础培养基加2.0Mm L-谷氨酰胺；
2)实验前一天在探针板中每孔加1ml水化液，置于37℃恒温箱中过夜，开机器；
3)实验当天在细胞板中每孔加50μl粘附剂，在室温下放置20分钟，每孔用无菌水洗两次；
4)取实施例2中的A10、A11、A12和B10、B11、B12离心管，将每个离心管中的T细胞在室温下以200×g离心细胞5分钟；
剩余步骤与实施例5中步骤5)至步骤14)相同。
1)海马检测培养基的配制：海马基础培养基加2.0Mm L-谷氨酰胺；
2)实验前一天在探针板中每孔加1ml水化液，置于37℃恒温箱中过夜，开机器；
3)实验当天在细胞板中每孔加50μl粘附剂，在室温下放置20分钟，每孔用无菌水洗两次；
4)取实施例2中的A10、A11、A12和B10、B11、B12离心管，将每个离心管中的T细胞在室温下以200×g离心细胞5分钟；
剩余步骤与实施例5中步骤5)至步骤14)相同。
[0021] 结果：图5的T细胞是在活化状态下检测的，活化的T细胞因快速克隆增殖的需要，需要大量的中间产物来进行核酸、蛋白质以及质膜的生物合成，此时则需要通过增加有氧糖酵解和谷氨酰胺氧化代谢所产生的中间产物来完成增殖所需的物质提供；图A为T细胞糖酵解结果；图B为T细胞糖代谢基础值；图C为T细胞糖酵解最大值；图D为T细胞糖酵解的储备值，可以看出，与野生型小鼠的T细胞相比，ATPIF1-/-小鼠的T细胞有更高的糖酵解水平，ATPIF1-/-小鼠的T细胞的糖代谢基础值和糖酵解的储备值明显高于野生型小鼠，糖酵解最大值没有明显差异，表明ATPIF1基因沉默能增强活化T细胞糖酵解水平，提高T细胞对环境改变的适应和调整能力，从而增强T细胞介导的肿瘤免疫治疗的效果。
[0022] 实施例7：细胞内细胞因子检测
1)取C组野生型OT-1小鼠和D组ATPIF1-/-OT-1小鼠各6只，按照实施例2中“脾脏细胞的制备和小鼠红细胞裂解”记载的步骤取脾脏细胞，将获得的脾脏细胞与B16-OVA共培养1天后，加入高尔基抑制剂（Golgi）；
2)8小时后收集细胞，用PBS清洗两遍；
3)弃上清，加入胞内抗体，4℃孵育30分钟，PBS洗涤两次；
4)使用破膜剂固定过夜后，洗液清洗两遍；
5)加入胞内抗体，4℃孵育30分钟，洗液清洗两遍；
6)弃上清，用400μlPBS重悬细胞，流式仪器检测；
结果：如图6、图7所示，在图6中，图A是野生型小鼠OT-1 T细胞产生IFN-γ的代表性流式结果图；图B是ATPIF1-/-OT-1 T细胞产生IFN-γ的代表性流式结果图，图C是六个独立重复实验的统计图；在图7中，图A是野生型小鼠OT-1 T细胞产生Granzyme B的代表性流式结果图；图B是ATPIF1-/-OT-1 T细胞产生Granzyme B的代表性流式结果图，图C是六个独立重复实验的统计图；可以看出，与野生型小鼠相比，ATPIF1-/-小鼠的CD8+T细胞产生更多的细胞因子IFN-γ和Granzyme B，提示CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力增强。
1)取C组野生型OT-1小鼠和D组ATPIF1-/-OT-1小鼠各6只，按照实施例2中“脾脏细胞的制备和小鼠红细胞裂解”记载的步骤取脾脏细胞，将获得的脾脏细胞与B16-OVA共培养1天后，加入高尔基抑制剂（Golgi）；
2)8小时后收集细胞，用PBS清洗两遍；
3)弃上清，加入胞内抗体，4℃孵育30分钟，PBS洗涤两次；
4)使用破膜剂固定过夜后，洗液清洗两遍；
5)加入胞内抗体，4℃孵育30分钟，洗液清洗两遍；
6)弃上清，用400μlPBS重悬细胞，流式仪器检测；
结果：如图6、图7所示，在图6中，图A是野生型小鼠OT-1 T细胞产生IFN-γ的代表性流式结果图；图B是ATPIF1-/-OT-1 T细胞产生IFN-γ的代表性流式结果图，图C是六个独立重复实验的统计图；在图7中，图A是野生型小鼠OT-1 T细胞产生Granzyme B的代表性流式结果图；图B是ATPIF1-/-OT-1 T细胞产生Granzyme B的代表性流式结果图，图C是六个独立重复实验的统计图；可以看出，与野生型小鼠相比，ATPIF1-/-小鼠的CD8+T细胞产生更多的细胞因子IFN-γ和Granzyme B，提示CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力增强。
[0023] 实施例8：小鼠T细胞电镜实验
1)取实施例2中的A13、A14、A15、A16、A17和B13、B14、B15、B16 、B17离心管，每个离心管离心去上清，沉淀T细胞加入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min；
2)1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）室温（20℃）固定2h，0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min；
3)依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脱水，每次
15min；
4)丙酮︰812包埋剂=1︰1，渗透2-4h， 丙酮︰812包埋剂=2︰1渗透过夜，纯812包埋剂5-
8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37度过夜；
5)60℃聚合48h后切片机切片60—80nm超薄切片；
6)铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15min），切片室温干燥过夜；
7)透射电子显微镜下观察，采集图像分析；
结果：如图8所示，其中，图A和图C是野生型小鼠CD8+T细胞电镜图,图B和图D是ATPIF1-/-小鼠CD8+T细胞电镜图，可以看出：ATPIF1-/-小鼠的CD8+ T细胞与野生型小鼠的CD8+ T细胞相比，线粒体嵴密度升高，线粒体嵴和基质的颜色加深，说明有更多年轻的线粒体，此形态学结果与图4功能检测的结果一致，支持ATPIF1基因沉默增加线粒体功能，进而增强T细胞抗肿瘤免疫功能（图A和图B放大倍数为3万倍，图C和图D放大倍数为8万倍）。
1)取实施例2中的A13、A14、A15、A16、A17和B13、B14、B15、B16 、B17离心管，每个离心管离心去上清，沉淀T细胞加入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min；
2)1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）室温（20℃）固定2h，0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min；
3)依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脱水，每次
15min；
4)丙酮︰812包埋剂=1︰1，渗透2-4h， 丙酮︰812包埋剂=2︰1渗透过夜，纯812包埋剂5-
8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37度过夜；
5)60℃聚合48h后切片机切片60—80nm超薄切片；
6)铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15min），切片室温干燥过夜；
7)透射电子显微镜下观察，采集图像分析；
结果：如图8所示，其中，图A和图C是野生型小鼠CD8+T细胞电镜图,图B和图D是ATPIF1-/-小鼠CD8+T细胞电镜图，可以看出：ATPIF1-/-小鼠的CD8+ T细胞与野生型小鼠的CD8+ T细胞相比，线粒体嵴密度升高，线粒体嵴和基质的颜色加深，说明有更多年轻的线粒体，此形态学结果与图4功能检测的结果一致，支持ATPIF1基因沉默增加线粒体功能，进而增强T细胞抗肿瘤免疫功能（图A和图B放大倍数为3万倍，图C和图D放大倍数为8万倍）。
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