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一株链霉菌、抑菌药物及其应用

阅读：95发布：2020-05-13

专利汇可以提供一株链霉菌、抑菌药物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一株链霉菌、抑菌药物及其应用。本发明所提供的链霉菌具体为链霉菌(Streptomyces sp.)，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15109。该链霉菌可以拮抗多种植物病原真菌和卵菌，其发酵产物不但对7种病原细菌有较好的抑制作用，并对18种植物病原真菌及卵菌有较强的抑制作用，抑菌谱广。该链霉菌(Streptomyces sp.)对几种植物土传病害有很强的抑制作用，如对小麦全蚀病、辣椒疫霉病等表现良好的生防效果，说明该链霉菌在植物土传病害的生物防治具有广阔的应用前景。，下面是一株链霉菌、抑菌药物及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株链霉菌，其特征在于，所述链霉菌(Streptomyces sp.)的保藏编号为CGMCC No.15109。
2.权利要求1所述的链霉菌用于制备防治植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害药物的应用。
3.一种抑菌药物，其特征在于，所述的抑菌药物为权利要求1所述链霉菌的菌体、链霉菌的发酵液和/或链霉菌的菌体提取液。
4.根据权利要求3所述的抑菌药物，其特征在于，链霉菌的发酵液制备包括：
a)将链霉菌接种于高氏1号固体培养基中28℃摇床170r/min培养3天获得种子液；
b)以体积百分量为10％的比例将所述种子液转接到100mL发酵培养基中，所述发酵培养基的配方为：小米10g，蛋白胨3g，CaCO3 2g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL；28℃摇床170r/min振荡培养7天，获得发酵产物；发酵产物离心后得所述发酵液。
5.根据权利要求4所述的抑菌药物，其特征在于，链霉菌的菌体提取液制备包括：将链霉菌的发酵液离心后得菌体，菌体用7倍体积的水在冰浴条件下超声破碎30min，工作时间/间隔时间为4s/5s，超声功率560W，重复操作三次，合并三次上清水相，再以10000r/min离心
20min，收集上清水相，即得链霉菌的菌体提取液。
6.根据权利要求3所述的抑菌药物，其特征在于，链霉菌的菌体提取液制备包括：将所述链霉菌的菌体用7倍体积的水在冰浴条件下超声破碎30min，工作时间/间隔时间为4s/
5s，超声功率560W，重复操作三次，合并三次上清水相，再以10000r/min离心20min，收集上清水相，即得链霉菌的菌体提取液。
7.权利要求3-6任一所述的抑菌药物用于制备防治植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害药剂的应用。
8.根据权利要求2或7所述的应用，其特征在于，所述的植物细菌病害包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的植物病害。
9.根据权利要求2或7所述的应用，其特征在于，所述的植物真菌病害或植物卵菌病害包括油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌
(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)或为辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。
10.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述植物土传病害包括油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。

说明书全文

一株链霉菌、抑菌药物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物学领域，具体涉及一株链霉菌、抑菌药物及其应用。

背景技术

[0002] 植物病害的生物防治强调生态系统的良性循环和环境保护，可以有效地避免化学农药所带来的一系列问题，由于其社会效益、生态效益、长远利益显著而愈来愈引起人们的重视。随着人们对生态环境和绿色健康概念越老越重视，生物防治措施在农业生产中得到了前所未有的关注。进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，生物农药由于其具有无污染、无残留、对靶标生物安全、不易产生抗药性等优点，在整个农药市场的份额正在逐年上升。在环境污染日益严重的今天，生物防治更是农业发展的必由之路。

[0003] 放线菌是一类与人类关系密切的微生物，许多抗生素、抗菌素、酶制剂均来自放线菌。在农业方面，放线菌是农用抗生素的主要来源，目前，70％以上的农用抗生素都是由放线菌产生的。农用抗生素越来越广泛地应用于植物保护，减少了因施用化学农药造成的环境污染，这使得农用抗生素作为微生物农药在农业生产中占据非常重要的地位，世界各国都十分重视研究开发高效低毒的农用抗生素。而近几年来，放线菌因本身就来源于土壤，容易在土壤中定殖，并有良好的抗生作用、竞争作用、重寄生作用和促进植物生长等生防作用，在生物防治防治方面起到领军作用，具有很好的开发应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株链霉菌、抑菌药物及其应用。

[0005] 一株链霉菌，所述链霉菌(Streptomyces sp.)的保藏编号为CGMCC No.15109。该菌株已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

[0006] 所述的链霉菌用于制备防治植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害药物的应用。

[0007] 一种抑菌药物，所述的抑菌药物为本发明所述链霉菌的菌体、链霉菌的发酵液和/ 或链霉菌的菌体提取液。

[0008] 可选的，链霉菌的发酵液制备包括：

[0009] a)将链霉菌接种于高氏1号固体培养基中28℃摇床170r/min培养3天获得种子液；

[0010] b)以体积百分量为10％的比例将所述种子液转接到100mL发酵培养基中，所述发酵培养基的配方为：小米10g，蛋白胨3g，CaCO3 2g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL； 28℃摇床170r/min振荡培养7天，获得发酵产物；发酵产物离心后得所述发酵液。

[0011] 可选的，链霉菌的菌体提取液制备包括：将链霉菌的发酵液离心后得菌体，菌体用 7倍体积的水在冰浴条件下超声破碎30min，工作时间/间隔时间为4s/5s，超声功率560 W，重复操作三次，合并三次上清水相，再以10000r/min离心20min，收集上清水相，即得链霉菌的菌体提取液。

[0012] 可选的，链霉菌的菌体提取液制备包括：将所述链霉菌的菌体用7倍体积的水在冰浴条件下超声破碎30min，工作时间/间隔时间为4s/5s，超声功率560W，重复操作三次，合并三次上清水相，再以10000r/min离心20min，收集上清水相，即得链霉菌的菌体提取液。

[0013] 所述的抑菌药物用于制备防治植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害药剂的应用。

[0014] 可选的，所述的植物细菌病害包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌 (Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌 (Erwiniacarotovora)和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的植物病害。

[0015] 可选的，所述的植物真菌病害或植物卵菌病害包括油菜菌核病菌 (Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌 (Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌
(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌 (Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌
(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌
(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌 (Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)或为辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。

[0016] 可选的，所述植物土传病害包括油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌 (Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、辣椒疫霉病菌 (Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。

[0017] 本发明提供了一株具有广谱抑菌活性的链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109。实验证明，链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109不但对7种病原细菌有一定的抑制作用，而且对18种植物病原真菌和卵菌具有较强的抑菌活性，抑菌谱广。该链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109对油菜菌核病，小麦全蚀病，辣椒疫霉病等植物病害有显著的生防效果，说明该菌株在植物病害的生物防治领域具有广阔的应用前景。
附图说明

[0018] 图1为菌株11-3-135菌丝及孢子形态特征；

[0019] 图2为依据16S rDNA基因序列构建的菌株11-3-135的系统发育树；

[0020] 图3为菌株11-3-135对植物病原真菌和卵菌的拮抗作用，(左，实验组；右，CK)；

[0021] 图4为菌株11-1-135发酵液对植物真菌和卵菌的菌丝生长抑制作用，(左，实验组；右，CK)；

[0022] 图5为菌株11-1-135菌体提取液对植物真菌和卵菌的菌丝生长抑制作用，(左，实验组；右，CK)；

[0023] 图6为菌株11-1-135发酵液对油菜菌核病的防治效果，(上，保护作用；下，治疗作用)；

[0024] 图7为菌株11-1-135发酵液对小麦全蚀病的防治效果，(上，保护作用；下，治疗作用)；

[0025] 图8为菌株11-1-135发酵液对辣椒疫霉病的防治效果，(上，保护作用；下，治疗作用)。

具体实施方式

[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。

[0028] 本发明所提供的链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135，该菌株已于2017年12 月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15109

[0029] 链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109的发酵液或者菌体提取液也属于本发明的保护范围。

[0030] 链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109、发酵液或菌体提取液，或所述发酵液或菌体提取液在如下1)或2)或3)中的应用也属于本发明的保护范围。

[0031] 1)抑制病原细菌；

[0032] 2)抑制植物病原真菌或卵菌；

[0033] 3)防治植物土传病害；

[0034] 4)制备用于防治植物病害的产品。

[0035] 在1)中，病原细菌可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌 (Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌 (Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌 (Erwiniacarotovora)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

[0036] 在2)中，植物病原真菌或卵菌可为油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、、水稻纹枯病菌 (Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)或为辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)。

[0037] 在3)中，植物土传病害病害可为由下述任一植物病原菌引起的植物病害：油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌 (Glomerellacingulata)、、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌 (Bipolariamaydis)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和烟草疫霉病菌 (Phytophthoranicotianae)。

[0038] 在4)中，产品具体可为药物，如生物农药。

[0039] 在4)中，产品具体可为药物，如抗生素。

[0040] 在本发明中，链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109的发酵液是按照包括如下的方法制备得到的：a)将链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109 接种于高氏1号固体培养基(配方：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)中28℃培养 4d；b)接种于高氏1号液体培养基(配方：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，KH2PO4 0.5g， NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL)中于28℃摇床上(170r/min)培养3天后，获得种子液；c)以10％(体积百分量)的比例将所述种子液转接到100mL发酵培养基中(配方：小米10g，蛋白胨3g，CaCO3 2g，NaCl 2.5 g，蒸馏水1000mL)，28℃于摇床上(170r/min)振荡培养7天，获得发酵产物；d) 发酵产物经离心机10000r/min离心后得所述发酵液。

[0041] 在本发明中，链霉菌(Streptomyces sp.)11-3-135CGMCC No.15109的菌体提取液是按照如下方法制备得到的：将上述得到的发酵产物离心后得菌体，用7倍体积的水在冰浴条件超声破碎30min(工作时间/间隔时间为4s/5s，560W)，破碎3次，合并三次上清水相，再以10000r/min离心20min，收集上清水相，即可得到菌体提取液。

[0042] 实施例1、11-3-135菌株的分离

[0043] 11-3-135菌株从青藏高原地区茶卡盐湖(N 36°38'29.01"～36°45'2.82"，E 99°0'53.58"～99°11'58.44")的滩沙土中分离得到，其分离过程为：

[0044] 将供试土样风干磨碎过200目筛，称取0.5g进行120℃干热处理60min后冷却至室温，用浸湿液(0.1％的脱脂牛奶和5mmol/L CHES，pH＝9.0)处理60min，1500g离心20min，然后静置10min，取上清液系列稀释后分别涂于添加有放线菌酮(50mg/L) 和萘啶酸(50mg/L)的TPA[海藻糖(5g)，脯氨酸(1g)，(NH4)2SO4(1g)，NaCl(1g)， CaCl2(2g)，K2HPO4(1g)，ZnSO4·7H2O(1g)，硫胺素(0.05mg)，核黄素(0.05mg)，烟酸(0.05mg)，泛酸钙(0.05mg)，维生素B6(0.05mg)，肌醇(0.05mg)，对-氨基苯甲酸(0.05mg)，生物素(0.025mg)，琼脂(20g)，蒸馏水(1L)，pH＝7.2]培养基平板上培养15～30d，挑出放线菌后于GA培养基中纯化培养。

[0045] 实施例2、菌株的鉴定

[0046] 一、菌株培养特征

[0047] 形态特征观察：将待鉴定菌株11-3-135作插片培养，后用生物显微镜观察并拍照。

[0048] 培养特征观察：将待鉴定的菌株11-3-135分别接种在高氏一号、蔗糖察氏、葡萄糖天门冬素、苹果酸钙、燕麦粉、无机盐淀粉、葡萄糖酵母膏、酪氨酸和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置于28℃培养，分别在7、14及28d观察其培养特征及颜色。观察记录气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素的颜色。结果记入鉴定表。此外观察菌株在各个培养基上的生长状况等作为参考特征。

[0049] 二、生理生化特征

[0050] 明胶液化能力测定：将菌株接种于柱形明胶培养基表面，22℃下恒温培养，分别在5、10、20、及30d,各观察一次液化程度。观察前应将菌种管冷冻20-30min。如明胶不液化仍是固体状态，若呈现液体即为液化。

[0051] 牛奶凝固与胨化测定：将待测定菌株接种于脱脂牛奶中，28℃恒温培养，分别在第3、6、10、20、及30d各观察1次。

[0052] 淀粉水解测定：将培养基溶化后，冷却50℃倒成平板，凝固后将菌种点种于平板上，适温培养2-4d，形成菌苔后在平板上滴加碘-碘化钾溶液，以铺满菌落周围为宜，平板呈蓝色，而菌落周围有无透明圈出现说明淀粉是否被水解，透明圈的大小能够说明水解淀粉能力的大小。

[0053] 纤维素水解试验：配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管后，以滤纸作纤维素(碳源)，把它切成宽1cm、长6cm滤纸条，加入试管中，一半浸在液内，一半露在液外，将鉴定菌株接种在液外一段滤纸条上，置28℃恒温培养30d后观察。若该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断为阳性，说明该菌株产生纤维素使之水解。反之，滤纸无变化者为阴性。

[0054] 硫化氢产生试验：将待测菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上，置28℃培养10 d左右(视菌苔生长成熟为宜)观察结果。若培养基中出现黑褐色沉淀，表示实验为阳性。反之，不变色者为阴性。

[0055] 碳源利用试验：将待鉴定菌株接种在无碳源培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，然后划线扢沟，以沟为界，把平板培养基分成若干小区，每小区分别加入一种碳源。常用的碳源有9种：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和肌醇等。每皿需设无糖对照区。置28℃恒温培养7、14d后，分别观察记载生长利用情况。

[0056] 三、菌株16S rDNA序列分析

[0057] 总DNA的提取

[0058] (1)取放线菌11-3-135菌体0.1g，置于研钵中，加液氮研磨成粉末；

[0059] (2)迅速装入2mL离心管中，加入550μL TE buffer(1mMTris-HCI；1mM EDTA； pH8.0)充分涡旋震荡悬浮沉淀；

[0060] (3)加入20μL溶菌酶(10mg/mL)和20μL蛋白酶K(20mg/mL)后颠倒混匀，37℃ 水浴1h；

[0061] (4)加入60μL 10％SDS和60μL 0.5M EDTA，颠倒混匀后，55℃水浴2h；

[0062] (5)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)轻轻颠倒混匀后，10000r/min离心5min；

[0063] (6)取上层液体至新的2mL离心管中，加入等体积异丙醇(4℃预冷)，后轻轻颠倒混匀，10000r/min离心5min；

[0064] (7)弃上清，加入1mL 70％乙醇(4℃预冷)清洗沉淀，10000r/min离心5min，重复清洗沉淀后离心、弃上清，静置至无乙醇味。

[0065] (8)用40μL TE buffer溶解后于-20℃保存备用。

[0066] DNA的检测

[0067] 用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳鉴定提取的总DNA，每孔点样5μL(4μL样品+1μL loading buffer)，5V·cm-1，电泳25min。利用UVIDBT-08凝胶成像系统进行观察，拍照。菌体DNA检测合格后进行PCR扩增。

[0068] PCR扩增

[0069] 将提取的基因组作为模板进行PCR扩增，反应在PCR扩增仪上进行。

[0070] 扩增体系(25μL反应体系)：Mix 12.5μL，dd H2O 9.5μL，27F 1μL，1492R 1μL，DNA模板1μL。

[0071] 反应程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1.5min， 35个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物在1％琼脂凝胶80V电泳，用凝胶成像系统进行观察，拍照。

[0072] 菌株系统发育树构建

[0073] 将PCR产物送去西安热默尔生物科技有限公司测序。将所获序列拼接校对后，与 GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，并选取相似性较高的菌株序列进行同源性分析，并用MEGA 6 软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树。

[0074] 结果：

[0075] 一、形态特征

[0076] 通过生物显微镜观察可以看出：菌株11-3-135在高氏一号琼脂培养基上基内菌丝交织紧密，有大量分支，无横膈膜，不裂段；气生菌丝丰富，分支多，较基丝粗，呈波曲形，气生菌丝形成孢子链，孢子丝丛生、弯曲。孢子为圆形，表面光滑，见图1。

[0077] 二、培养特征

[0078] 表1是菌株11-3-135在9种不同培养基上的培养特征。根据表1可知，11-3-135菌株在高氏一号、苹果酸钙、燕麦粉等大部分培养基上生长状况良好，在葡萄糖酵母膏琼脂培养基中几乎不生长。基内菌丝在不同培养基上大多都呈白色或象牙黄色，气生菌丝大多呈白色。同时，11-3-135菌株在各培养基中都无可溶性色素的产生。

[0079] 表1菌株11-3-135的培养特征

[0080] 培养基生长状况基内菌丝气生菌丝可溶性色素高氏一号琼脂良好灰白色至象牙黄白色无
苹果酸钙琼脂良好白色白色无
燕麦粉琼脂良好白色白色无
无机盐淀粉琼脂良好土黄色白色无
葡萄糖天门冬素琼脂良好土黄色土黄色无
蔗糖察氏琼脂良好土黄色土黄色无
马铃薯葡萄糖琼脂良好灰白色至土黄色土黄色无
葡萄糖酵母膏琼脂差无明显生长无明显生长无
酪氨酸琼脂良好土黄色白色无

[0081] 三、生理生化特征

[0082] 菌株11-3-135的部分生理生化特征见表2。菌株11-3-135明胶液化快，可以使牛奶胨化而不凝固，淀粉水解弱，纤维素分解弱(菌株可以在滤纸条上生长但不能分解)，不产生H2S和黑色素。菌株可以利用D-半乳糖、鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖等唯一碳源，但不能利用蔗糖，具体见表2。

[0083] 表2 11-3-135菌株生理生化特征

[0084]

[0085] 注：“-”表示负反应；“+”“++”“+++”表示反应的强弱程度分别为弱、中强、很强。

[0086] 四、16S rDNA系统进化分析

[0087] 16S rDNA剪辑序列测定结果如序列表中序列1所示，共测定菌株11-3-135的16S rDNA有1425个碱基。

[0088] 系统发育树的构建：选取9株模式菌株进行系统发育分析，所用链霉菌属菌株的序列登录号见表3，构建的系统发育树见图2所示。

[0089] 表3 11-3-135菌株构建系统发育树所用链霉菌属16S rDNA序列注册号[0090]

[0091]

[0092] 由表3可知，11-3-135菌株属于链霉菌属。系统发育树中(图2)，菌株11-3-135 与三株黄色类群链霉菌Streptomyces kanamyceticus(DQ442511、EU367975和NR043822) 和三株金色类群链霉菌Streptomyces aureus(FJ481072、NR112608和KP718506)同在一个分支中，且同源性均达到98％以上。

[0093] 结合形态特征、培养特征和生理生化特征，将放线菌11-3-135菌株鉴定为链霉菌属，但具体的分类地位还需要进一步的确定。菌株的16S rDNA序列已经被NCBI收录，其注册号为MG657018，具体序列为SEQ ID NO：1。

[0094] 该菌株已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No. 15109。该菌株的分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，菌株名称为11-3-135。

[0095] 实施例3、菌株抑菌谱的测定

[0096] 一、菌株11-3-135对植物病原真菌和卵菌的拮抗作用

[0097] 采用平板对峙法测定放线菌11-3-135对不同病原真菌(油菜菌核病菌 (Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌 (Glomerellacingulata)、、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌 (Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌
(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌 (Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌 (Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)或辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae))的拮抗作用。先将11-3-135菌株和供试病原菌在平板上活化，再用4mm打孔器制成菌饼。将病原真菌的菌饼面朝下紧贴于PDA平板中央，在其两侧25mm处贴两块供试病原菌菌饼，28℃ 下培养3-7天后，测量菌落边缘与病菌菌落边缘之间的抑菌带直径，每处理重复3次。

[0098] 结果如表3所示，11-3-135菌株对大多数供试病原真菌和卵菌均具有一定的拮抗作用。其中对油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌、苹果树腐烂病菌、小麦全蚀病菌等8种供试病原菌有较强的拮抗作用，其抑菌带大于10mm(图3)。

[0099] 表3菌株11-3-135对植物病原真菌和卵菌的拮抗作用

[0100]

[0101] 二、菌株11-3-135发酵液及菌体提取液对植物病原真菌和卵菌的菌丝生长抑制作用

[0102] 采用菌丝生长速率法测定菌株11-3-135发酵液及菌体提取液对病原真菌及卵菌(油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌 (Glomerellacingulata)、、水稻纹枯病菌
(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌
(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌 (Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌 (Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌 (Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)或辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae))的抑菌活性。用融化的PDA培养基将发酵产物稀释10倍后，取10mL含发酵产物培养基倒入直径 90mm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌水培养基的PDA平板为对照，再将供试病原真菌菌饼(4mm)紧贴于平板中央，于28℃下培养3-7d，用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，重复三次，根据公式1和2计算菌丝生长抑制率。

[0103] 菌落生长直径(mm)＝测量直径-4(菌饼直径)

[0104] 公式1

[0105]

[0106] 公式2

[0107] 结果如表4和表5，菌株11-3-135发酵液对所有供试病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用。其中对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、苹果树腐烂病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、稻瘟病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌和小麦全蚀病菌的菌丝生长具有较强的抑制作用，抑制率大于85.0％；对苹果树腐烂病的菌丝抑制作用最强，抑制率为 100％(图4)；菌株11-3-135菌体提取液对所有供试病原真菌均有一定的抑制作用。其中对苹果树腐烂病菌、草莓灰霉病菌和小麦全蚀病菌3种病原真菌有较强的抑制作用，其抑制率大于
70％，对苹果树腐烂病的菌丝生长抑制率最强，为79.98％；对油菜菌核病菌和烟草疫霉病菌的抑制率分别为61.75％、65.79％(图5)。

[0108] 表4菌株11-3-135发酵液对植物病原真菌和卵菌菌丝生长的抑制作用

[0109]

[0110] 表5菌株11-3-135菌体提取液对植物病原真菌和卵菌菌丝生长的抑制作用[0111]

[0112]

[0113] 三、菌株11-3-135发酵液对7种病原细菌的抑制作用

[0114] 采用琼脂扩散法测定菌株11-3-135发酵液对供试病原细菌(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌 (Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌 (Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus))的抑制作用。将熔化的NA培养基冷却至45-50℃，加入体积分数1.5％的供试病原细菌摇匀，每个培养皿(直径90mm)倒入15mL培养基，制成细菌平板，在带菌平板上打三个直径9mm的孔，每孔加入100μL发酵液，以发酵培养基为对照，28℃培养24h，十字交叉法测量抑菌圈大小。

[0115] 结果如表6，菌株11-3-135发酵液对7种细菌均有较好的抑菌活性。其中对枯草芽孢杆菌、猕猴桃溃疡病菌、水稻白叶枯病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌、魔芋软腐病菌和金黄色葡萄球菌7种抑菌圈直径依次为16.17mm、17.5mm、16mm、12.0mm、 13mm、11.5mm和11.0mm，与1mg/mL的硫酸链霉素的活性相当，具有潜在的应用价值。

[0116] 表6菌株11-3-135发酵液对7种病原细菌的抑制作用

[0117]

[0118]

[0119] 综上所述，采用平板对峙法、菌丝生长速率法、琼脂扩散法证明了该菌株11-3-135 的抑菌谱广，且抑菌活性好。

[0120] 实施例4、菌株11-3-135的温室生物防治植物病害实验

[0121] 一、对油菜菌核病的防治效果

[0122] 采用喷发酵液的方法进行试验。试验有2个处理，发酵液和80％多菌灵WP(化学药剂对照)，清水为空白对照，每个处理3次重复。保护作用先喷发酵液和多菌灵，24h 后接种油菜菌核病菌菌饼(4mm)，每片叶子接一个菌饼，每株油菜接3个；治疗作用先接种油菜菌核病菌菌饼，24h后喷发酵液和多菌灵。3天后，采用十字交叉法统计病斑直径大小，根据实施例2中公式1和2计算防治效果。

[0123] 实验结果如表7所示。结果：菌株11-3-135发酵液对油菜菌核病的保护作用防效为 86.03％，与对照药剂(80％多菌灵WP 1000倍液)的防效相比有显著性差异；对油菜菌核病的治疗作用防效为93.39％，与对照药剂(80％多菌灵WP 1000倍液)的防效相比无显著性差异(图6)。

[0124] 表7菌株11-3-135发酵液对油菜菌核病的防治效果

[0125]

[0126] 二、对小麦全蚀病的防治效果

[0127] 采用灌根方法进行试验。。将基质与灭菌土按1:1的比例混匀后倒入小花盆中，在表面撒小麦种子16颗，覆土后室温条件下培养，待两叶一芯期时开始试验。保护作用测定先将每盆浇灌50mL发酵液，24h后再每盆灌根50mL小麦全蚀病孢子悬浮液；治疗作用测定先浇灌病原菌孢子悬浮液，24h后再浇灌发酵液。共5个处理，分别为11-3-135 发酵液加小麦全蚀病菌、11-3-135菌悬液加小麦全蚀病菌、37％苯醚甲环唑WG(化学药剂对照)、只接小麦全蚀病和空白对照，每个处理重复3次。参照国家标准分级标准 (GB/T 17980.109-2004)，一个月后将小麦幼苗连根拔出，用清水将根冲洗干净，统计病株发病率，根据公式3和4计算病情指数和防治效果。

[0128] 小麦全蚀病具体分级标准：

[0129] 0级：无病

[0130] 1级：发病面积占根系1％～5％；

[0131] 2级：发病面积占根系6％～20％；

[0132] 3级：发病面积占根系21～40％；

[0133] 4级：发病面积占根系41～60％；

[0134] 5级：发病面积占根系61％以上。

[0135]

[0136]

[0137] 实验结果如表8所示。结果：菌株11-3-135发酵液对小麦全蚀病的保护作用优于治疗作用，其中发酵液对小麦全蚀病的保护作用为90.66％，而37％苯醚甲环唑WG 2000 倍液对小麦全蚀病的保护作用为70.64％，两者有显著性差异；发酵液对小麦全蚀病的治疗作用为67.99％，对照药剂(37％苯醚甲环唑WG 2000倍液)对小麦全蚀病的治疗作用为93.48％，两者有显著性差异(图7)。

[0138] 表8菌株11-3-135发酵液对小麦全蚀病的防治效果

[0139]

[0140] 三、对辣椒疫霉病的防治效果

[0141] 采用灌根方法进行。将基质与灭菌土按1:1的比例混匀后倒入小花盆中，种上辣椒种子，待辣椒苗长有4～6片真叶时开始试验。接种前一天将花盆浇透水，次日将辣椒疫霉病菌的孢子悬浮液25mL浇灌于距根际1～2cm的土壤周围。24h后，然后将供试发酵液浇灌于盆中，每处理3个重复，同时设药剂对照(25％甲霜灵)和清水对照。治疗作用测定：先接菌，保湿24h后灌发酵液，其余同保护作用。7d后，根据辣椒疫霉病分级标准调查发病情况，根据公式3和4计算病情指数和防治效果。

[0142] 辣椒疫霉病分级标准：

[0143] 0级：无病；

[0144] 1级：根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

[0145] 2级：根茎部变黑1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

[0146] 3级：根茎部变黑超过2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

[0147] 4级：根部变黑溢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；

[0148] 5级：植株枯死。

[0149] 表9菌株11-3-135发酵液对辣椒疫霉病的防治效果

[0150]

[0151] 实验结果如表9所示，结果：菌株11-3-135发酵液对辣椒疫霉病有较好的防治效果。发酵液对辣椒疫霉病的保护作用为79.33％，药剂对照(25％甲霜灵WP 1000倍液)对辣椒疫霉病的保护作用为84.33％，两者无显著性差异；11-3-135发酵液和药剂对照对辣椒疫霉病的治疗作用分别为64.67％和68.67％，两者也无差异显著性(图8)。

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