猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶及其应用
阅读：545发布：2020-05-11
专利汇可以提供猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供猪 肺 炎支原体毒 力 因子NADH 氧 化酶 及其应用，属于 生物 技术领域。该NADH氧化酶 氨 基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供含有所述编码基因的重组载体、重组菌或细胞系。本发明首次发现猪肺炎支原体NADH氧化酶是一种 毒力 因子，具有结合纤溶酶原及纤连酶原的能力，对猪支气管上皮细胞具有黏附能力，能够诱导宿主细胞的氧化应激、释放乳酸脱氢酶和凋亡，因此可以应用于猪支原体肺炎新型 疫苗 及药物的制备。，下面是猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶及其应用专利的具体信息内容。
猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 支原体作为一种最简单的自我复制生物，由于其生物合成和代谢能力有限，只能依靠受感染的宿主来获得营养满足其寄生生活。在漫长的进化过程中，支原体进化出一套入侵宿主细胞并在宿主细胞内存活的机制。
发明内容
[0004] 本发明的第一目的是提供猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶，该酶是一种毒力因子，具有结合纤溶酶原及纤连酶原的能力，对猪支气管上皮细胞具有黏附能力，诱导宿主细胞的氧化应激、释放乳酸脱氢酶和凋亡，能够应用于猪支原体肺炎新型疫苗及药物的制备。
[0005] 本发明的第二目的是提供上述猪肺炎支原体NADH氧化酶的应用。
[0006] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0007] 一种猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008] 在本发明中，所述猪肺炎支原体毒力因子NADH氧化酶的编码基因。
[0009] 在本发明中，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示本发明还提供含有所述编码基因的重组载体、重组菌或细胞系。
[0010] 本发明还提供所述猪肺炎支原体NADH氧化酶在制备猪支原体肺炎疫苗中的应用、所述猪肺炎支原体NADH氧化酶在制备猪支原体肺炎药物中的应用。
[0011] 有益效果：本发明首次发现了猪肺炎支原体NADH氧化酶的毒力因子功能，包括结合纤溶酶原及纤连酶原的能力，对猪支气管上皮细胞具有黏附能力，诱导宿主细胞的氧化应激、释放乳酸脱氢酶和凋亡，能够应用于制备猪支原体肺炎新型疫苗和药物。附图说明
[0012] 图1 不同猪肺炎支原体中的NADH氧化酶（NOX）转录水平，注：左图为以Mhp-168L为参照，不同猪肺炎支原体中的NOX转录水平；右图为以Mhp-J为参照，不同猪肺炎支原体中的NOX转录水平。
[0013] 图2 猪肺炎支原体NADH氧化酶重组蛋白纯化的SDS-PAGE图，M.蛋白分子质量标准；1-9.纯化后的重组蛋白。
[0014] 图3 猪肺炎支原体NADH氧化酶重组蛋白酶活性分析。
[0015] 图4 流式细胞仪检测168株（A）和168L（B）株表面暴露的猪肺炎支原体NADH氧化酶。
[0016] 图5 免疫胶体金电镜观察表面暴露的NADH氧化酶。
[0017] 图6 IFA检测猪肺炎支原体NADH氧化酶对猪支气管上皮细胞的黏附作用。
[0018] 图7 RT-PCR检测封闭NADH氧化酶对猪肺炎支原体黏附猪支气管上皮细胞的影响，**代表P﹤0.01。
[0019] 图8 ELISA检测猪肺炎支原体NADH氧化酶与纤连酶原结合活性，其中***： p﹤0.001；ns： p＞0.05。
[0020] 图9 Far-Western blot检测猪肺炎支原体NADH氧化酶与纤连酶原以及纤溶酶原结合活性。
[0021] 图10各处理组与猪支气管上皮细胞互作后细胞的乳酸脱氢酶释放量示意图。
[0022] 图11 猪肺炎支原体NADH氧化酶诱导猪支气管上皮细胞产生氧化应激损伤的检测结果。
[0023] 图12 细胞流式术检测各处理组猪支气管细胞凋亡。其中A为不染色的阴性对照组。B为FITC单染的阴性对照组。C为PI单染的阴性对照组。D为使用FITC和PI双染的阴性对照组。E为使用FITC和PI双染的实验组（接种rNOX蛋白）。F组为使用FITC和PI双染的阳性对照组（接种Mhp JS株）。G组为使用FITC和PI双染的抗体封闭组（接种Mhp JS株+兔抗NOX阳性血清）。H组为使用FITC和PI双染的阳性对照组（接种Mhp 168L株）。I组为使用FITC和PI双染的抗体封闭组（接种Mhp 168L株+兔抗NOX阳性血清）。
具体实施方式
[0024] 下面将结合具体实施例，对本发明作进一步的说明，而非对本发明进行限制。
[0025] 本发明中生物材料的来源：1、本发明所涉及的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）168株公开于Ho CL, Chu T, Chin H, Mao H, Yeh A, Chen C, Chang S, Chang D (1980)
Microagglutination test for the diagnosis of swine mycoplasmal pneumonia and the identification of mycoplasmas. Acta Vet Zootech Sin 11:13
2、本发明所用猪肺炎支原体168L株公开于Liu W, Xiao S, Li M, Guo S, Li S, Luo R, Feng Z, Li B, Zhou Z, Shao G, Chen H, Fang L (2013) Comparative genomic analyses of Mycoplasma hyopneumoniae pathogenic 168 strain and its high-passaged attenuated strain. BMC Genomics 14:80。
Microagglutination test for the diagnosis of swine mycoplasmal pneumonia and the identification of mycoplasmas. Acta Vet Zootech Sin 11:13
2、本发明所用猪肺炎支原体168L株公开于Liu W, Xiao S, Li M, Guo S, Li S, Luo R, Feng Z, Li B, Zhou Z, Shao G, Chen H, Fang L (2013) Comparative genomic analyses of Mycoplasma hyopneumoniae pathogenic 168 strain and its high-passaged attenuated strain. BMC Genomics 14:80。
[0026] 3、本发明所用猪肺炎支原体J株购自ATCC，编号为ATCC25934。
[0027] 4、本发明所用猪肺炎支原体JS株公开于Xiong Q, Wei Y, Feng Z, et al. Protective efficacy of a live attenuated Mycoplasma hyopneumoniae vaccine with an ISCOM-matrix adjuvant in pigs. Vet J, 2014, 99(2):268-74.实施例1
一、不同毒力猪肺炎支原体菌株的NADH氧化酶转录水平存在明显差异
对猪肺炎支原体NADH氧化酶（NOX）进行RT-PCR引物设计，同时设计猪肺炎支原体P46基因引物，作为内参。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。
一、不同毒力猪肺炎支原体菌株的NADH氧化酶转录水平存在明显差异
对猪肺炎支原体NADH氧化酶（NOX）进行RT-PCR引物设计，同时设计猪肺炎支原体P46基因引物，作为内参。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。
[0028] NOX的RT-PCR引物序列如下：F：5'-ATGCCGCAGACCTTGTGAT-3'；
R：5'-AAGCAGCAACTATTCCTGATTT-3'。
R：5'-AAGCAGCAACTATTCCTGATTT-3'。
[0029] P46基因的RT-PCR引物序列如下：F：5'-TCACTTGCGGCGGGTCTAT-3'；
R：5'-TTGCTTGTTCGGCCATTCC-3'。
R：5'-TTGCTTGTTCGGCCATTCC-3'。
[0030] 将Mhp 168株、168L株、JS株和J株四个菌株，分别于KM2无细胞培养基中培养48小时后，收集菌液，提取RNA，采用RT-PCR检测不同Mhp菌株NOX转录水平，以P46基因为内参。
[0031] 结果如图1所示，与168L株相比，168株及JS株的NOX表达量显著上调。其中，168株NOX表达量上调8倍以上；JS株NOX表达量上调5倍。与J株相比，168株及JS株的NOX表达量显著上调；其中，168株NOX表达量上调10倍以上； JS株NOX表达量上调5倍以上。168L株与J株相比，NOX表达量几乎没有差异。上述实验结果可以看到，不同毒力猪肺炎支原体菌株的NADH氧化酶转录水平存在明显差异，提示NADH氧化酶与猪肺炎支原体的毒力存在相关性。
[0032] 二、猪肺炎支原体NADH氧化酶的原核表达及纯化对猪肺炎支原体NADH氧化酶（NOX）的基因序列进行密码子优化，序列如SEQ ID NO:2所示，猪肺炎支原体NADH氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由南京金斯瑞生物科技有限公司对SEQ ID NO:2进行全基因合成，并亚克隆至pET32a载体上，命名为pET32a-nox。将pET32a-nox转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性克隆pET32a-nox（BL21）后经IPTG诱导表达猪肺炎支原体NADH氧化酶。收集pET32a-nox（BL21）菌体，超声破碎后的包涵体用包涵体洗涤液（含有20mM Na3PO4、0.5M NaCl、30mM 咪唑和2M 脲的水溶液，pH 7.4）重新溶解，4℃、
12000rpm/min离心20min，弃上清。在沉淀中加入binding Buffer（含有20mM Na3PO4、0.5M NaCl、30mM 咪唑、8M 脲和1mM β-巯基乙醇的水溶液，pH 7.4），在30℃水浴中放置1h至完全溶解，得到重NOX组蛋白粗品。采用Ni-NTA纯化柱（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）对NOX重组蛋白粗品进行纯化。采用SDS-PAGE电泳检测纯化后的重组蛋白，并测定蛋白浓度。
从图2可见，SDS-PAGE电泳图中出现了大小约为50 kDa的特异性条带，即成功获得了猪肺炎支原体NADH氧化酶原核表达的重组蛋白（缩写为rNOX）。
12000rpm/min离心20min，弃上清。在沉淀中加入binding Buffer（含有20mM Na3PO4、0.5M NaCl、30mM 咪唑、8M 脲和1mM β-巯基乙醇的水溶液，pH 7.4），在30℃水浴中放置1h至完全溶解，得到重NOX组蛋白粗品。采用Ni-NTA纯化柱（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）对NOX重组蛋白粗品进行纯化。采用SDS-PAGE电泳检测纯化后的重组蛋白，并测定蛋白浓度。
从图2可见，SDS-PAGE电泳图中出现了大小约为50 kDa的特异性条带，即成功获得了猪肺炎支原体NADH氧化酶原核表达的重组蛋白（缩写为rNOX）。
[0033] 三、兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清的制备将rNOX进行超滤浓缩，使浓度达到2mg/mL以上。选择2只健康的2月龄新西兰大耳白兔，以rNOX与等体积弗氏完全佐剂（购自Sigma公司）混合后进行免疫，首免后14天、28天及35天以重组蛋白rNOX与等体积弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司）混合后分别进行二免、三免及加强免疫。首免后42天，分别对各免疫后的兔只进行心脏采血，收集兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶的效价达1:204800的血清作为兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清。分离血清后储存-20℃备用。同时采集未免疫组兔只血清作为阴性血清备用。
[0034] 其中，兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶的效价检测方法如下：将rNOX蛋白稀释至4μg/mL，每孔100 μL进行抗原的包被，采用0.05%的BSA溶液封闭。采用PBST稀释液（含有0.5%吐温20的PBS缓冲液）将阴性血清（未免疫组兔只血清）及阳性血清（免疫组兔只血清）分别做1:50稀释，然后按照100 μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1.5 h。PBST洗涤3-5次，3-5 min/次。加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)（购自武汉博士德生物工程有限公司），100 μL/孔，37℃孵育1 h。PBST洗涤3-5次，3-5 min/次。每孔加入100 μL新鲜配置的TMB显色液，避光显色10-15 min。每孔加入50μL、2 mol/L的H2SO4溶液。采用酶标仪读取OD450。以P/N>2.1作为阳性的评判标准。
[0035] 四、NADH氧化酶活性检测反应体系为2mL，在含1 mM的二硫苏糖醇（DTT，购自BIO-RAD）的磷酸钾缓冲液（浓度为
0.1M、pH 7.5）中加入rNOX（重组蛋白）至终浓度为5 μg/mL，然后加入黄素单核苷酸（FMN，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）至终浓度为10 μΜ，25℃作用5 min后加入底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）至终浓度为500 μΜ，在25℃反应。每隔一定时间检测反应体系在340nm处的吸光值OD340nm。同时设立阴性对照组（不加NADH）和空白对照组（不加rNOX蛋白），其他反应条件不变。测定结果表明，在pH 7.5、25℃的条件下，rNOX蛋白的活性随时间的变化如图3所示，因而可得rNOX蛋白的比活力为：25.23 IU/mg。
0.1M、pH 7.5）中加入rNOX（重组蛋白）至终浓度为5 μg/mL，然后加入黄素单核苷酸（FMN，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）至终浓度为10 μΜ，25℃作用5 min后加入底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）至终浓度为500 μΜ，在25℃反应。每隔一定时间检测反应体系在340nm处的吸光值OD340nm。同时设立阴性对照组（不加NADH）和空白对照组（不加rNOX蛋白），其他反应条件不变。测定结果表明，在pH 7.5、25℃的条件下，rNOX蛋白的活性随时间的变化如图3所示，因而可得rNOX蛋白的比活力为：25.23 IU/mg。
[0036] 五、NADH氧化酶存在于猪肺炎支原体的膜表面1. 流式细胞仪检测猪肺炎支原体表面暴露的NADH氧化酶
8
将对数期猪肺炎支原体168株（10 CCU/mL）在10℃、10 000rpm/min离心20min，采用3% BSA溶液37℃封闭2 h后，弃去封闭液，分别加入按体积比1:100稀释的兔抗NOX阳性血清（即兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清，下同）或阴性血清，37℃孵育1h，PBS洗3遍，加入按体积比1:500稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司），37℃作用1h；PBS洗3遍，离心，收集细胞沉淀，加入1mL的PBS重悬后用流式细胞仪进行定量检测，各处理组设置三个样本重复。同时，采用相同方法检测168L株表面暴露的NADH氧化酶（各处理组设置三个样本重复）。图4（A）和（B）图均出现FITC荧光峰值，说明无论是猪肺炎支原体
168株还是168L株，NADH氧化酶均存在于猪肺炎支原体的表面。图4（A）中使用的猪肺炎支原体菌株是强毒株168株，图4（B）中使用的则是连续传代致弱之后的弱毒力菌株168L。图4（A）中猪肺炎支原体168株和阴性血清孵育后其荧光强度峰值在104.5左右，168株和兔抗NOX阳性血清孵育后荧光强度提高至105.5。而图4（B）中猪肺炎支原体168L株与阴性血清处理组以及168L与兔抗NOX阳性血清处理组的荧光强度没有差别，都在104.5左右，即两个组别的荧光峰值没有差别而重合了。因此，该实验结果说明NADH氧化酶（NOX）和猪肺炎支原体的毒力存在关联。
8
将对数期猪肺炎支原体168株（10 CCU/mL）在10℃、10 000rpm/min离心20min，采用3% BSA溶液37℃封闭2 h后，弃去封闭液，分别加入按体积比1:100稀释的兔抗NOX阳性血清（即兔抗猪肺炎支原体NADH氧化酶高免血清，下同）或阴性血清，37℃孵育1h，PBS洗3遍，加入按体积比1:500稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司），37℃作用1h；PBS洗3遍，离心，收集细胞沉淀，加入1mL的PBS重悬后用流式细胞仪进行定量检测，各处理组设置三个样本重复。同时，采用相同方法检测168L株表面暴露的NADH氧化酶（各处理组设置三个样本重复）。图4（A）和（B）图均出现FITC荧光峰值，说明无论是猪肺炎支原体
168株还是168L株，NADH氧化酶均存在于猪肺炎支原体的表面。图4（A）中使用的猪肺炎支原体菌株是强毒株168株，图4（B）中使用的则是连续传代致弱之后的弱毒力菌株168L。图4（A）中猪肺炎支原体168株和阴性血清孵育后其荧光强度峰值在104.5左右，168株和兔抗NOX阳性血清孵育后荧光强度提高至105.5。而图4（B）中猪肺炎支原体168L株与阴性血清处理组以及168L与兔抗NOX阳性血清处理组的荧光强度没有差别，都在104.5左右，即两个组别的荧光峰值没有差别而重合了。因此，该实验结果说明NADH氧化酶（NOX）和猪肺炎支原体的毒力存在关联。
[0037] 2. 免疫胶体金电镜观察猪肺炎支原体表面暴露的NADH氧化酶采用免疫胶体金电镜观察猪肺炎支原体表面暴露的NADH氧化酶。实验组操作如下：将5μL浓缩后的猪肺炎支原体JS株置于镍网5min，采用含2%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定
5min，用含1%抗NADH氧化酶阴性兔血清和1%BSA的PBS室温封闭1 h。将镍网置于以封闭液（含有1%BSA的PBS）稀释的兔抗NOX阳性血清（血清与封闭液体积比为1：10）中室温漂浮1h，用5滴封闭液洗5min。以采用封闭液按照体积比为1：20稀释的胶体金标记羊抗兔IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司）漂浮1h，用5滴PBS洗。用含有2%PFA（多聚甲醛）的PBS室温固定5min，蒸馏水洗（8滴）。采用1%磷钨酸（PTA）溶液（pH 6.5）染色15s，滤纸吸掉多余液体。置于透射电镜下观察。另外设置对照组，镍网不用兔抗NOX阳性血清漂浮，其他不变。由图5可见，实验组猪肺炎支原体表面可见金标颗粒，对照组表面无金标颗粒，表明NADH氧化酶存在于猪肺炎支原体的表面。
5min，用含1%抗NADH氧化酶阴性兔血清和1%BSA的PBS室温封闭1 h。将镍网置于以封闭液（含有1%BSA的PBS）稀释的兔抗NOX阳性血清（血清与封闭液体积比为1：10）中室温漂浮1h，用5滴封闭液洗5min。以采用封闭液按照体积比为1：20稀释的胶体金标记羊抗兔IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司）漂浮1h，用5滴PBS洗。用含有2%PFA（多聚甲醛）的PBS室温固定5min，蒸馏水洗（8滴）。采用1%磷钨酸（PTA）溶液（pH 6.5）染色15s，滤纸吸掉多余液体。置于透射电镜下观察。另外设置对照组，镍网不用兔抗NOX阳性血清漂浮，其他不变。由图5可见，实验组猪肺炎支原体表面可见金标颗粒，对照组表面无金标颗粒，表明NADH氧化酶存在于猪肺炎支原体的表面。
[0038] 六、NADH氧化酶是猪肺炎支原体的一种黏附素1. NADH氧化酶对猪支气管上皮细胞的黏附作用
将培养至90%汇合度的猪支气管上皮细胞清洗后，利用4%多聚甲醛室温固定10min；PBS洗3遍，每孔加入200 μL浓度为0.1%的Trixon100溶液（溶剂为PBS）通透2min；PBS洗3遍，3% BSA溶液在37℃封闭2 h；弃去封闭液，每孔加入100 μg rNOX，37℃孵育2 h；PBS洗2遍，加入按1:250稀释的兔抗NOX阳性血清，4℃孵育过夜；PBS洗2遍，加入按1:100稀释的TRITC标记的羊抗兔IgG抗体（购自Proteintech公司），37℃作用1h；PBS洗3遍，每孔加入100 μL DAPI（购自碧云天）对细胞核进行染色，37℃作用5min；PBS洗2遍，荧光显微镜观察结果。对照组中以阴性血清替代兔抗NOX阳性血清。从图6可见，实验组（NOX）可在猪支气管上皮细胞细胞核周观察到特异性的荧光，而对照组（control）未出现特异性荧光。结果表明NADH氧化酶可以与猪支气管上皮细胞的细胞膜特异性的结合，具有黏附猪支气管上皮细胞的能力。
将培养至90%汇合度的猪支气管上皮细胞清洗后，利用4%多聚甲醛室温固定10min；PBS洗3遍，每孔加入200 μL浓度为0.1%的Trixon100溶液（溶剂为PBS）通透2min；PBS洗3遍，3% BSA溶液在37℃封闭2 h；弃去封闭液，每孔加入100 μg rNOX，37℃孵育2 h；PBS洗2遍，加入按1:250稀释的兔抗NOX阳性血清，4℃孵育过夜；PBS洗2遍，加入按1:100稀释的TRITC标记的羊抗兔IgG抗体（购自Proteintech公司），37℃作用1h；PBS洗3遍，每孔加入100 μL DAPI（购自碧云天）对细胞核进行染色，37℃作用5min；PBS洗2遍，荧光显微镜观察结果。对照组中以阴性血清替代兔抗NOX阳性血清。从图6可见，实验组（NOX）可在猪支气管上皮细胞细胞核周观察到特异性的荧光，而对照组（control）未出现特异性荧光。结果表明NADH氧化酶可以与猪支气管上皮细胞的细胞膜特异性的结合，具有黏附猪支气管上皮细胞的能力。
[0039] 2. 封闭NADH氧化酶可显著降低猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞的黏附对数期猪肺炎支原体168株（107 CCU/mL）在10℃、10000rpm/min离心20min，PBS洗3遍后用PBS重悬至500 μL；加入按1:20稀释的兔抗NOX阳性血清，37℃孵育30min；同时设立第一对照组和第二对照组，第一对照组中以NOX阴性血清替代兔抗NOX阳性血清，第二对照组中不加任何血清；将各样本移至90%汇合度的猪支气管上皮细胞，4℃作用2h，每20min轻轻摇匀一次；PBS洗2遍，ET消化，加入400 μL ddH2O重悬细胞；取100μL测定各组猪肺炎支原体CCU50。采用相同方法处理168L株。结果如表1所示，猪肺炎支原体表面封闭了NOX能显著降低168株和168L株对猪支气管上皮细胞的黏附。
[0040] 本标题中第一段处理后的168株和168L株分别取200μL提取DNA，利用荧光定量PCR测定各组猪肺炎支原体核酸（引物序列见武昱孜，靳蒙蒙，白方方，等．猪肺炎支原体P97 TaqMan-BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]．中国兽医科学，2012，42（12）：1268-1272．）。通过黏附率=各组猪肺炎支原体核酸量/第二对照组猪肺炎支原体核酸量*100%计算黏附率。RT-PCR检测结果显示，采用兔抗NOX阳性血清封闭NOX后，猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞的黏附作用显著降低（如图7所示）。其中，相对于第一对照组来说，兔抗NOX阳性血清的加入使Mhp 168株对猪支气管上皮细胞的黏附率下降了52.73%，使Mhp 168L株对猪支气管上皮细胞的黏附率下降了57.47%。
[0041] 表1各组CCU50测定结果（2倍比稀释）2*105cell/孔七、猪肺炎支原体NADH氧化酶具有与纤溶酶原及纤连酶原结合能力
1. ELISA检测NADH氧化酶与纤连酶原的相互作用
将rNOX及rGroEL蛋白分别按200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔包被96孔板，每个蛋白每个浓度6个重复，4℃包被过夜；同时，以PBS替代rNOX蛋白作为空白对照。PBST洗2遍，采用5%BSA溶液在37℃封闭2h；PBST洗3遍，每孔加入100μL含200μg纤连酶原（购自Sigma公司）的PBST，37℃孵育1小时；PBST洗3遍，然后加入按体积比为1:2000稀释的抗纤连酶原抗体（购自abcam公司），在37℃孵育1小时；PBST洗3遍，再加入按体积比为1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司），在37℃孵育1小时；PBST洗3遍，TMB显色后，采用酶标仪读取OD450。ELISA检测结果如图8所示，结果表明rNOX蛋白可以与纤连酶原结合。
1. ELISA检测NADH氧化酶与纤连酶原的相互作用
将rNOX及rGroEL蛋白分别按200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔包被96孔板，每个蛋白每个浓度6个重复，4℃包被过夜；同时，以PBS替代rNOX蛋白作为空白对照。PBST洗2遍，采用5%BSA溶液在37℃封闭2h；PBST洗3遍，每孔加入100μL含200μg纤连酶原（购自Sigma公司）的PBST，37℃孵育1小时；PBST洗3遍，然后加入按体积比为1:2000稀释的抗纤连酶原抗体（购自abcam公司），在37℃孵育1小时；PBST洗3遍，再加入按体积比为1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司），在37℃孵育1小时；PBST洗3遍，TMB显色后，采用酶标仪读取OD450。ELISA检测结果如图8所示，结果表明rNOX蛋白可以与纤连酶原结合。
[0042] 其中嗜水气单胞菌分子伴侣GroEL，为嗜水气单胞菌的一种细胞质蛋白，不能够与纤连酶原结合。重组蛋白rGroEL是将GroEL基因插入原核表达载体pET32a后转化大肠杆菌，诱导表达并纯化后获得；GroEL基因序列为GenBank中公布的登录号为CP006870的嗜水气单胞菌NJ-35株相应序列。
[0043] 2. Far-Western blot检测NADH氧化酶与纤溶酶原以及纤连酶原的互作将15μg/mL的纤溶酶原溶液（购自Sigma公司）与转印到PVDF膜上的rNOX在37℃孵育2 h。然后与按照体积比为1:400稀释的抗纤溶酶原抗体（购自Addgene公司）37℃孵育2 h，再与1:2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司）在37℃孵育2 h，ECL曝光检测。同时设置对照组，以等浓度的BSA溶液替代纤溶酶原溶液，其他不变。
[0044] 将15μg/mL的纤连酶原溶液（购自Sigma公司）与转印到PVDF膜上的rNOX在37℃孵育2 h。然后与1:1000稀释的抗纤连酶原抗体（购自abcam公司）37℃孵育2 h，再与1:2500稀释的HRP标记羊抗兔IgG（购自武汉博士德生物工程有限公司）在37℃孵育2 h，ECL曝光检测。同时设置对照组，以等浓度的BSA溶液替代纤溶酶原溶液，其他不变。
[0045] 检测结果（图9）表明，rNOX蛋白均可与纤溶酶原以及纤连酶原结合，但是与纤溶酶原结合力弱，而与纤连酶原则具有很强的结合力。
[0046] 八、猪肺炎支原体NADH氧化酶具有诱导宿主细胞氧化应激、释放乳酸脱氢酶和凋亡的能力1. 猪肺炎支原体NADH氧化酶可导致宿主细胞大量释放乳酸脱氢酶
按照每孔5 μg、10 μg、15 μg、20 μg，将rNOX蛋白分别接种猪支气管上皮细胞（1×105细胞/孔）；同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照中分别以108 CCU/mL的Mhp JS、J株和
168L株替代rNOX蛋白，阴性对照中不加rNOX蛋白也不加Mhp。6 h后，收集各处理组细胞上清，通过CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒（购自Promega）测定各处理组中细胞的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）释放量，试验结果以OD490nm表示，以此来评估不同rNOX蛋白浓度对细胞的毒性。
按照每孔5 μg、10 μg、15 μg、20 μg，将rNOX蛋白分别接种猪支气管上皮细胞（1×105细胞/孔）；同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照中分别以108 CCU/mL的Mhp JS、J株和
168L株替代rNOX蛋白，阴性对照中不加rNOX蛋白也不加Mhp。6 h后，收集各处理组细胞上清，通过CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒（购自Promega）测定各处理组中细胞的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）释放量，试验结果以OD490nm表示，以此来评估不同rNOX蛋白浓度对细胞的毒性。
[0047] 结果如图10所示，不同浓度rNOX蛋白均可导致猪支气管上皮细胞释放大量乳酸脱氢酶，且宿主细胞上的乳酸脱氢酶释放量与rNOX蛋白剂量呈正相关关系。同时，宿主细胞上的乳酸脱氢酶释放量与Mhp菌株的毒力呈正相关，猪肺炎支原体JS株导致猪支气管上皮细胞的乳酸脱氢酶释放量最高，猪肺炎支原体168L株导致猪支气管上皮细胞的乳酸脱氢酶释放量最低。
[0048] 2. 猪肺炎支原体NADH氧化酶可对宿主细胞造成氧化应激损伤将20 μg的rNOX蛋白接种每孔的猪支气管上皮细胞（1×105细胞/孔），同时设立阳性对照（以108 CCU/mL的Mhp JS、J株或168L株替代rNOX蛋白）和阴性对照（以PBS替代rNOX蛋白），
6 h后采用ROS-Glo™ H2O2 Assay试剂盒（购自Promega）检测H2O2释放量。检测结果如图11所示，孵育6小时后，rNOX蛋白可诱导猪支气管上皮细胞产生明显的氧化应激损伤；猪肺炎支原体JS株及J株均可诱导猪支气管上皮细胞产生明显的氧化应激损伤，差异极显著；猪肺炎支原体168L株亦可诱导猪支气管上皮细胞产生氧化应激损伤，但其H2O2释放量明显少于其它两株猪肺炎支原体。
6 h后采用ROS-Glo™ H2O2 Assay试剂盒（购自Promega）检测H2O2释放量。检测结果如图11所示，孵育6小时后，rNOX蛋白可诱导猪支气管上皮细胞产生明显的氧化应激损伤；猪肺炎支原体JS株及J株均可诱导猪支气管上皮细胞产生明显的氧化应激损伤，差异极显著；猪肺炎支原体168L株亦可诱导猪支气管上皮细胞产生氧化应激损伤，但其H2O2释放量明显少于其它两株猪肺炎支原体。
[0049] 3. 猪肺炎支原体NADH氧化酶可诱导宿主细胞凋亡将PBECs（猪支气管上皮细胞）以1×105 细胞/孔的数量接种于24孔细胞培养板，每孔接种20μg的rNOX蛋白（实验组），设立阳性对照组（以108 CCU/mL的Mhp JS株和168L株替代rNOX蛋白）和阴性对照组（以细胞培养基替代rNOX蛋白），同时设置抗体封闭组。抗体封闭组处理方法如下：将对数期猪肺炎支原体JS株和168L株，在10℃以10000rpm/min离心20min，PBS洗3遍后用PBS重悬至500 μL；分别加入1:20稀释的兔抗NOX阳性血清，37℃孵育30min后接种细胞；各处理设置三个细胞孔。
[0050] 实验组、阳性对照组、阴性对照组和抗体封闭组均培养12h后，按照Annexin V-FITC-PI Apoptosis Detection Kit（购自南京诺唯赞生物科技有限公司，含有1×Binding Buffer、 Annexin V-FITC和 PI Staining Solution）说明书进行操作：弃去细胞上清后向各细胞孔加入200μL不含EDTA的胰酶消化5min，每孔加入200μL胎牛血清，收集溶液，4℃、300g/min离心5min收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞两次后采用100μL 1×Binding Buffer重悬细胞。再加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10min。加入400μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀后通过流式细胞仪定量检测其细胞凋亡率。流式细胞仪检测结果显示：rNOX蛋白可诱导猪支气管上皮细胞产生明显的细胞凋亡（试验组，图12-E）晚期凋亡率较阴性对照组（图12-D）上调90.6%。NOX阳性血清封闭NOX后，猪肺炎支原体JS株对猪支气管上皮细胞的晚期凋亡率显著降低，下调59.1%（图12-G）；
猪肺炎支原体168L株对猪支气管上皮细胞的晚期凋亡率下调46.5%（图12-I）。
猪肺炎支原体168L株对猪支气管上皮细胞的晚期凋亡率下调46.5%（图12-I）。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种防治蔬菜根结线虫的微生物制剂及其制备方法 | 2020-05-08 | 470 |
| 用于控制植物病毒感染的方法和组合物 | 2020-05-08 | 178 |
| 一种比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法 | 2020-05-12 | 75 |
| 热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用 | 2020-05-11 | 849 |
| 一种抗病毒感染的SFTSV蛋白结合分子 | 2020-05-12 | 110 |
| 用于牲畜生产系统的疫苗 | 2020-05-11 | 767 |
| 用于治疗痤疮的包含痤疮丙酸杆菌噬菌体的组合物 | 2020-05-13 | 361 |
| 基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法 | 2020-05-11 | 484 |
| 朱槿木尔坦棉花曲叶病毒病防治方法 | 2020-05-12 | 303 |
| 一种防治桃细菌性穿孔病的复合制剂及用途 | 2020-05-12 | 331 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈