基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法
阅读：484发布：2020-05-11
专利汇可以提供基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于PagN基因快速检测食源性沙 门 氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒 力 基因PagN制备多克隆 抗体 与羧基化 磁珠 偶联构建免疫磁珠，与 荧光 定量PCR检测方法联用，避免了传统培养法中复杂耗时等问题，此方法快速有效、成本经济，即时可见，可以实现特异性检测与定量食品中的沙门氏菌。，下面是基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。
2.根据权利要求1所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：
5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为：
5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQ ID No.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；
(2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；
(3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；
(4)PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)，1％牛血清白蛋白进行封闭；
(5)免疫磁珠捕获沙门氏菌效率优化，摸索最佳捕获时间、捕获温度、免疫磁珠与多克隆抗体用量、沙门氏菌最适浓度；
(6)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备的PagN免疫磁珠0.2mg,与合适稀释度的沙门氏菌待测液1mL,室温孵育50min,磁力架回收磁珠分离3-5min，分别取捕获前后上清液进行活菌计数，计算捕获效率；
(7)荧光定量标准曲线的建立，选取沙门氏菌灵敏度较高的invA基因作为检测引物，上游引物为：5‘-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为：
5‘-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3’(SEQ ID No.4)；
(8)IMBs-qPCR联用检测食品中沙门氏菌：牛奶、猪肉样品预增菌进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于qPCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。
3.根据权利要求1所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)捕获沙门氏菌效率优化参数为：30μL PagN多克隆抗体与2mg免疫磁珠偶联4h，沙门氏菌浓度102-105CFU/mL。
基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法
技术领域
背景技术
[0002] 沙门氏菌(Salmonella sp.)是一种能够引起人兽共患，寄生于动物和人类肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，1885年Salmon在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，至今为止沙门氏菌共具有六种肠道亚型，已发现有2600多种肠道血清型，最常见的血清型为肠道沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱杆菌等，饮食如猪肉、牛奶等是感染沙门氏菌的常见途径，感染沙门氏菌的食物口服后经口腔进入体内，后经淋巴系统进入血液，其对入侵的沙门氏菌发生抵御，菌体被破坏并释放内毒素，对细胞和组织产生一系列感染，主要感染症状为持续发热、腹泻、呕吐等，严重可引起伤寒、菌血症和全身感染。在我国食源性疾病中分离出病原体沙门氏菌的检出率一直高居不下，在美国每年约有150万人感染死亡比例高达39％，在越南肉食类食物中沙门氏菌检出率约为41.1％，因此沙门氏菌成为全球公共卫生问题。
[0003] 世界卫生组织也已将沙门氏菌的检验列为必不可少的检测指标，相关技术发展迅速，传统培养法是目前大多数国家检测沙门菌的基本手段，通过选择性增菌进行分离及生化鉴定，但其培养过程过于复杂耗时；分子生物学方法从核酸水平实现对病原体的检测，其具有较高的准确性和灵敏度，如基因芯片技术、基因探针、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等；免疫学检测技术近几年被应用广泛，利用抗原抗体的特异性结合实现病原体的快速检测，例如酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)、免疫胶体金技术、免疫磁珠分离技术(immunomagnetic bead separation technology,IMB)等。但目前的检测技术存在检出限不高、检测时间冗长的问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，解决现有技术中检出限不高、时间冗长，弥补单一检测技术不足等问题。
[0005] 本发明的技术方案包括：
[0006] 一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。
[0007] 具体包括以下步骤：
[0008] (1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为：5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQ ID No.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；
[0009] (2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；
[0010] (3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；
[0012] (5)免疫磁珠捕获沙门氏菌效率优化，摸索最佳捕获时间、捕获温度、免疫磁珠与多克隆抗体用量、沙门氏菌最适浓度；
[0013] (6)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备的PagN免疫磁珠0.2mg,与合适稀释度的沙门氏菌待测液1mL,室温孵育50min,磁力架回收磁珠分离3-5min，分别取捕获前后上清液进行活菌计数，计算捕获效率；
[0014] (7)荧光定量标准曲线的建立，选取沙门氏菌灵敏度较高的invA基因作为检测引物，上游引物为：5‘-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为：5‘-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3’(SEQ ID No.4)；
[0015] (8)IMBs-qPCR联用检测食品中沙门氏菌：牛奶、猪肉样品预增菌进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于qPCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。
[0016] 所述步骤(5)捕获沙门氏菌效率优化参数为：30μLPagN多克隆抗体与2mg免疫磁珠偶联4h，沙门氏菌浓度102-105CFU/mL。
[0018] 本发明有益效果：首先，本发明发明人设计了特异于沙门氏菌的PagN基因引物，该基因存在于大多数沙门氏菌中具有广谱性，根据此特点PCR扩增出PagN目的片段，纯化出目的蛋白制备多克隆抗体，该抗体可以特异性识别沙门氏菌PagN外膜蛋白上的抗原表位，避免了对其他干扰菌株捕获的可能，保证检测结果的有效性和准确性。
[0019] 其次，本发明采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠，通过三次重复试验平板计数结果发现，0.1mg免疫磁珠的捕获能力在沙门氏菌浓度为3.8×102-3.8×105CFU/mL时可达80％以上，对非沙门氏菌对捕获效率低于10％。此方法提高了捕获效率的特异性，重复性高，便于应用。
[0020] 最后，本发明所检测的沙门氏菌只需要用免疫磁珠去捕获，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，该复合物在磁力架的作用下发生定向力学移动，将其与杂质分开，达到富集的目的。收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测，根据Ct值结合标准曲线就可精确推算出其捕获的菌落数，并且在食品样品中进一步验证，可用于基层检测机构，便于推广。该方法检测时间短、方便快捷、经济有效，又具备PCR扩增的高度灵敏性特点，结果判断较为直观。
[0021] 本发明选取免疫磁珠与荧光定量PCR联用技术，利用免疫磁珠这一超顺磁性高分子复合物与免疫雄性兔子制备的针对于沙门氏菌外膜蛋白多克隆抗体通过EDC/NHS法进行共价偶联，实现对沙门氏菌的快速分离并结合荧光定量分析，制备的沙门氏菌外膜蛋白多克隆抗体提高捕获的特异性，设计荧光定量检测引物大大提高其灵敏度。附图说明
[0022] 图1：沙门氏菌PagN基因的PCR扩增电泳图；
[0023] 图2：原核重组蛋白pET-28a-PagN在大肠杆菌中表达纯化；
[0024] 图3：免疫磁珠制备及参数优化折线图；其中A为PagN多克隆抗体与免疫磁珠偶联时间，B为不同用量免疫磁珠对沙门菌捕获效率的影响，C为免疫磁珠对不同浓度沙门氏菌的捕获效率折线图；
[0025] 图4：免疫磁珠与沙门菌复合物扫描电镜图；其中A为伤寒沙门氏菌CMCC 50619，B为免疫磁珠，C为免疫磁珠与沙门菌复合物；
[0026] 图5:荧光定量PCR标准曲线的稳定性评估；其中A为沙门氏菌荧光定量PCR标准曲线的建立，B为标准曲线稳定性评估；
[0027] 图6:沙门氏菌检测干扰性实验；其中A为invA基因荧光定量PCR检测干扰实验，B为免疫磁珠对不同细菌捕获效率的特异性评价；
[0028] 图7:免疫磁珠对牛奶样品中沙门菌的捕获效率分析；其中A为牛奶样品荧光定量PCR扩增曲线，B为牛奶样品荧光定量PCR溶解曲线；
[0029] 图8:免疫磁珠对猪肉样品中沙门菌的捕获效率分析；其中A为猪肉样品荧光定量PCR扩增曲线，B为牛奶样品荧光定量PCR溶解曲线。
具体实施方式
[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的阐述。
[0031] 实施例1:检测方法的建立
[0032] 步骤一，根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为：5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQ ID No.2)，提取不同血清型沙门氏菌基因组DNA，PCR扩增结果发现该毒力基因存在于绝大多数沙门氏菌中，具有广谱性，且扩增条带单一，为一段长为657bp的DNA片段。
[0034] 步骤二，构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/ml蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体。具体结果见说明书附图1和2。
[0035] 步骤三，磁力架的制作，用于富集免疫磁珠。
[0036] 步骤四，PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)，1％牛血清白蛋白进行封闭。
[0037] 步骤五：免疫磁珠捕获沙门氏菌效率优化，摸索最佳捕获时间、捕获温度、免疫磁珠与多克隆抗体用量、沙门氏菌最适浓度。
[0038] 步骤六：免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备的PagN免疫磁珠0.2mg，与合适稀释度的沙门氏菌待测液1mL，室温孵育50min，磁力架回收磁珠分离3-5min，分别取捕获前后上清液进行活菌计数，计算捕获效率。
[0039] 步骤七：荧光定量标准曲线的建立，选取沙门氏菌灵敏度较高的invA基因作为检测引物，上游引物为：5‘AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为：5‘-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3’(SEQ ID No.4)。
[0040] q-PCR扩增反应条件：94℃30sec；94℃5sec；60℃30sec,扩增40-45个循环。
[0041] q-PCR反应体系(20μL)：2×TransStart Top Green qPCR Super Mix 10μL,Passive reference dye 0.4μL,10μmol/L上/下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，dd H2O补齐至20μL。
[0042] 步骤八：IMBs-qPCR联用检测食品中沙门氏菌：将稀释至100-101CFU/mL沙门氏菌在5
混有灭菌牛奶、猪肉的BPW培养基中37℃预增菌4h至10CFU/mL，取1mL牛奶、猪肉样品进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于q-PCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。
混有灭菌牛奶、猪肉的BPW培养基中37℃预增菌4h至10CFU/mL，取1mL牛奶、猪肉样品进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于q-PCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。
[0043] 实施例2；免疫磁珠捕获效率及参数优化
[0044] 探究免疫磁珠捕获沙门氏菌实验最优参数，以期提高捕获效率。采用控制变量方式对抗体包被量、偶联时间、捕获时免疫磁珠用量等多个条件进行优化，首先取不同体积PagN多克隆抗体与1mg磁珠偶联，确定最适抗体用量，期间在不同时间点测量磁珠偶联上抗体量摸索最佳偶联时间。免疫磁珠制备完成后设置不同浓度梯度对105CFU/mL沙门氏菌菌液进行捕获，获得最适免疫磁珠用量后对不同浓度梯度沙门氏菌捕获，最终确定最优捕获参数，即30μL PagN多克隆抗体与2mg免疫磁珠偶联4h时，对102-105CFU/mL沙门氏菌的捕获效率可达80％以上，为后续样品检测提供最佳捕获条件。具体结果见说明书附图3。
[0045] 实施例3：扫描电镜观察捕获情况
[0046] 为直观确定所构建PagN免疫磁珠是否能捕获沙门氏菌，进行了扫描电镜下观察，平板划线挑取沙门菌CMCC 619单菌落接种于5mL LB液体培养基中，于37℃摇床过夜培养后，4000rpm离心5min，用1mL无菌双蒸水洗涤稀释至104-105CFU/mL，按照实施例1中所述方法加入0.2mg免疫磁珠进行捕获，捕获后磁力架吸附免疫磁珠-菌体复合物，用1mL无菌双蒸水洗涤3遍。洗涤后的复合物重悬于200μL无菌双蒸水中，将载玻片切割成1cm正方形，取20μL复合物滴加到盖玻片上，固定，37℃烘箱风干。样品镀金处理后，在场发射扫描电子显微镜Nanosem 430下观察并照相。电镜下可清晰捕捉到单个沙门氏菌菌落、磁珠表面因偶联着多克隆抗体而凹凸不平，且由于颗粒较小具有粘附性容易发生聚集，以及免疫磁珠-细菌复合物的结合体。可证明本发明中所述检测方法可行，所制备的免疫磁珠可对沙门氏菌进行捕获。具体结果见说明书附图4。
[0047] 实施例4:灵敏度检测
[0048] 对本发明所述的沙门氏菌检测方法进行重复评价，q-PCR检测手段精准灵敏对检测出较低数量级的沙门氏菌浓度是其创新点和技术优势，首先利用沙门菌相对保守灵敏度高的invA基因引物，根据模板基因组DNA的Ct值与该模板起始浓度的对数呈线性关系，建立了一套荧光定量PCR标准曲线，y＝-3.61x+40.40，R2＝0.9979，重复三次评估其稳定性。结果表明该检测技术未能检测到1.31×101CFU/mL沙门菌样品的Ct值，因此本发明建立的q-PCR检测技术检出沙门菌的灵敏度为13CFU/mL。具体结果见说明书附图5。
[0049] 实施例5:特异性检测
[0050] 确定免疫磁珠富集沙门氏菌能力及检测技术灵敏度的同时，对其检测引物进行特异性干扰试验，本发明选取了小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica(CMCC 55075)、大肠杆菌DH5a、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC25923)作为干扰菌株，当沙门菌中混入背景菌株时提取基因组DNA进行q-PCR检测，扩增曲线的重复性良好，背景菌株的存在不会对沙门菌invA基因的扩增产生干扰。PagN免疫磁珠对其他菌株是否存在一定程度上非特异性捕获，因此平板计数计算免疫磁珠对上述背景菌株捕获效率，评价其检测方法的特异性，免疫磁珠对沙门菌的捕获效率远高于其他菌株故具有良好的特异性，综上所述可用于后续实验。具体结果见说明书附图图6。
[0051] 实施例6：食品样品检测试验
[0052] 【检测材料】样品1：灭菌全脂牛奶2：灭菌猪肉
[0053] 【捕获效率计算公式】CE1(％)＝(a-b)/a×100％；CE2(％)＝c/a×100％[0054] 选取无菌猪肉糜25g和全脂牛奶25mL与225mL增菌培养基BPW混匀，并接入100-101CFU/mL的沙门氏菌，37℃增菌至104-105CFU/mL，以模拟沙门氏菌污染食品样品，后取
1.5mL增菌后样品，其中1mL直接加入0.2mg免疫磁珠混匀，剩余0.5mL加入等体积无菌PBS缓冲液二倍稀释后进行捕获，磁珠-细菌复合物进行细菌DNA的提取，按照上述体系和程序进行荧光定量PCR检测，每个DNA样品做两个重复，所得Ct值根据荧光定量标准曲线计算出捕获浓度，捕获后的上清液经适当浓度稀释后用于平板计数，结合二者结果计算捕获效率，分析其重现性，具体结果见下表及说明书附图7和8。结果分析显示，与其他细菌检测技术相比，IMBs-qPCR方法在猪肉和牛奶样品中捕获效率可达70％以上，与传统培养法结果相似，荧光定量PCR无杂峰出现，因此本发明的检测方法，特异性较好，灵敏度高，重现性良好，缩短了检测时间。
1.5mL增菌后样品，其中1mL直接加入0.2mg免疫磁珠混匀，剩余0.5mL加入等体积无菌PBS缓冲液二倍稀释后进行捕获，磁珠-细菌复合物进行细菌DNA的提取，按照上述体系和程序进行荧光定量PCR检测，每个DNA样品做两个重复，所得Ct值根据荧光定量标准曲线计算出捕获浓度，捕获后的上清液经适当浓度稀释后用于平板计数，结合二者结果计算捕获效率，分析其重现性，具体结果见下表及说明书附图7和8。结果分析显示，与其他细菌检测技术相比，IMBs-qPCR方法在猪肉和牛奶样品中捕获效率可达70％以上，与传统培养法结果相似，荧光定量PCR无杂峰出现，因此本发明的检测方法，特异性较好，灵敏度高，重现性良好，缩短了检测时间。
[0055] 免疫磁珠对牛奶样品中沙门菌的捕获效率
[0056]
[0057] A*：BPW中增菌4h后的牛奶样品中沙门菌的总数。
[0058] B*：25℃捕获50min后的上清液中沙门菌的总数。
[0059] C*：qPCR检测出沙门菌数量。
[0060] CE(％)**：免疫磁珠的捕获效率。CE1(％)＝(A-B)/A×100％；CE2(％)＝C/A×100％。
[0061] r***：相关系数.r＝CE2(％)/CE1(％).
[0062] 免疫磁珠对猪肉样品中沙门菌的捕获效率
[0063]
[0064] A*：BPW中增菌4h后的猪肉样品中沙门菌的总数。
[0065] B*：25℃捕获50min后的上清液中沙门菌的总数。
[0066] C*：qPCR检测出沙门菌数量。
[0067] CE(％)**：免疫磁珠的捕获效率。CE1(％)＝(A-B)/A×100％；CE2(％)＝C/A×100％。
[0068] r***：相关系数.r＝CE2(％)/CE1(％).
[0069] 本发明的基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，本领域技术人员可通过借鉴本发明说明书内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
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