选择性识别G－四链体DNA的双阳离子化合物

技术领域

本发明涉及结合G-四链体DNA(G-quadruplex DNA)的方法 和化合物。更具体地，本发明涉及结合四链体(quadruplex)形式的 端粒和致癌基因启动子的双阳离子聚芳基化合物、破坏端粒酶活性的 方法和双阳离子聚芳基化合物治疗癌症的应用。

缩写

δ＝化学位移

A＝腺嘌呤

Ac＝乙酰基

Ac2O＝乙酸酐

C＝胞嘧啶

℃＝摄氏度

calcd＝计算出的

CD＝圆二色性

Cf＝未结合浓度

cm＝厘米

dec＝分解点

DMF＝二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

DNA＝脱氧核糖核酸

D2O＝氧化氘

DODC＝3，3’-二乙基噁二羰菁(3，3’-diethyloxadicarbocyanine)

DSS＝3-(三甲基甲硅烷基)丙烷磺酸钠盐

DTC＝N，N’-二乙基硫代羰花青碘(N，N’-diethylthiacarbocyanine iodide)

EDTA＝乙二胺四乙酸

EIMS＝电雾化电离质谱(electrospray-ionization mass spectrometry)

EtOAc＝乙酸乙酯

EtOH＝乙醇

g＝克

G＝鸟嘌呤

h＝小时

HCl＝氯化氢

HEPES＝N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-(乙磺酸)

HPLC＝高压液相色谱

hTERT＝人端粒酶逆转录脢单位

hTR＝人端粒酶RNA单位

Hz＝赫兹

ip＝腹膜内的

KCl＝氯化钾

kg＝千克

KO-t-Bu＝叔丁醇钾

L.d.＝杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)

LiOH＝氢氧化锂

MeOH＝甲醇

MHz＝兆赫

min.＝分钟

mL＝毫升

mm＝毫米

mM＝毫摩尔

mmol＝毫摩尔

m.p.＝熔点

ms＝毫秒

MS＝质谱

MTT＝溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑鎓

Na2CO3＝碳酸钠

Na2SO4＝硫酸钠

NBS＝N-溴丁二酰亚胺

NH2OH·HCl＝盐酸羟胺

nM＝纳摩尔

NMR＝核磁共振

NOESY＝磁欧沃毫斯效应光谱

Pd＝钯

Pd-C＝10％碳载钯

Pd(PPh3)4＝四(三苯基膦)钯

P.f.＝恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

PIPER＝N，N’-bis(2-piperdinoethyl)-3，4，9，10-

     perylenetetracarboxylic acid diimide

po＝口服

ppm＝份/百万

psi＝磅/平方英寸

RU＝响应单位

s＝秒

spp.＝种

SPR＝表面等离子共振

T＝胸腺嘧啶

T.b.r.＝布氏罗得西亚锥虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)

T.cruzi＝克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)

THF＝四氢呋喃

TLC＝薄层色谱

TMS＝四甲基硅烷

TOCSY＝总相关谱

U＝尿嘧啶

UV＝紫外线

背景

G-四链体脱氧核糖核酸(DNA)是一种四链DNA结构，由含 有一连串连续鸟嘌呤残基的单链DNA形成，见 Cech，T.R.，Nature，332， 777-778(1988)。能够形成四链体结构的鸟嘌呤富含序列存在于基因 组中的生物学显著区域中，包括免疫球蛋白转换区( Sen，D.，and Gilbert，W.，Nature，334，364-366(1988))；许多基因例如胰岛素基因的 转录调节区域( Castasi，P.，et al.，J. Mol.Biol.，264，534-545(1996))； 以及某些致癌基因的启动子区域，包括c-MYC( Siddiqui-Jain，A.，et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.USA，99，11593-11598(2002)； Simonsson，T.et al.， Nuc.Acids Res.，26，1167-1172(1998)。

端粒DNA序列同样示出在体外形成四链体结构。见 Wang，Y.，and Patel，D.J.，Structure，2，1141-1156(1994)； Wang，Y.，and Patel，D.J.，J. Mol.Biol.，251，76-94(1995)；和 Smith，F.W.，et al.，Structure，3， 997-1008(1995)。端粒是指位于在象锥虫和人类这样广泛的生物体内 真核染色体末端的非编码DNA区域。它们的功能是保护染色体末端 被腐蚀或者末端-末端融合，并且在重组中协助染色体的排列。

人类端粒具有一段5-15kb的双链区域，一条链富含嘌呤，一 条链富含嘧啶。在3’最末端，富含嘌呤的链存在一个200个碱基长度 的单链突出。端粒序列随着生物体的不同而不同。在人类和其它脊椎 动物中，端粒含有串联T2AG3重复序列。

在生理学条件下，人类端粒序列示出可以在体外形成一种G四 链体的构象。见 Parkinson，G.N.，et al.，Nature，417，876-880(2002)和 Wang，Y.，and Patel，D.，Structure，1，263-282(1993)。可以结合甚至促 进端粒四链体形成的蛋白质如转录因子、核酸酶和解旋酶的发现表明 在某些条件下在体内存在这些结构。见 Giraldo，T.，et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，91，7658-7662(1994)； Fang，G.，and Cech，T.R.， Biochemistry，32，11646-11657(1993)；及 Fang，G.，and Cech，T.R.，Cell， 74，875-885(1993)。Boussin和他的同事最新的研究发现一种同位素 标记的G四链体结合配体聚集在培养的细胞的细胞核中，并且优先 地结合到染色体的末端区域，表明G四链体在体内存在并且可以被 药物作用到。见 Granotier，C.，et al.，Nuc.Acids.Res.，33，4182-4190 (2005)。

每次细胞分裂的时候，DNA聚合酶不能复制染色体的3’链的最 末端，因为3’末端在复制中是滞后链。这种“末端复制问题”导致端 粒在细胞每倍增一次就缩短大约30-200个碱基。大约在60-70次 的细胞复制后，端粒达到一个临界长度，此时细胞就进入非分裂状态， 叫做衰老期，这将导致细胞的凋亡直至死亡。见 Harley，C.B.，et al.， Nature，345，458-460(1990)。然而，在85-90％的癌细胞中，逆转录 酶端粒酶被激活。见 Kim，N.W.，et al.，Science，266，2011-2015(1994)。 这种酶在真核寄生虫例如锥虫和利什曼原虫中也同样具有活性。这种 酶在大部分正常体细胞中没有活性，这提供了一种用于治疗癌症和寄 生虫病的潜在的、非常特异的靶。在人体中，端粒酶把T2AG3重复序 列加入到端粒末端，以平衡细胞分裂所带来的端粒缩短。结果端粒的 长度被保持住，使得癌细胞永生化。

端粒酶包含一个11个碱基的RNA模板和1个具有逆转录酶活性 的人端粒酶逆转录酶(hTERT)催化亚基。抑制端粒酶的作用最近被 作为一种抗癌策略而受到关注。抑制端粒酶的靶包括hTERT催化亚 基，被逆转录酶抑制剂和显性失活hTERT构建体靶向。见 Zhang，X.， et al.，Gene Dev.，13，2388-2399(1999)； Hahn，W.C.，et al.，Nat.Med.，5， 1164-1170(1999)； Strahl，C.，and Blackburn，E.H.，Mol.Cell.Biol.，16， 53-56(1996)； Melana，S.M.，et al.，Clin.Cancer Res.，4，693-696(1997)； Murakami，J.，et al.，Eur.J. Cancer，35，1027-1034(1998)；和 Gomez，D. E.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，246，107-110(1998)。RNA 模板也同样使用反义寡核苷酸( Schindler，A.，et al.，Int.J. Oncol.，19， 25-30(2001)和 Fu，W.M.，et al.，J. Mol.Neurosci.，14，3-15(2000))以及 锤头核酶( Yokoyama，Y.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，273， 316-321(2000)和 Ludwig，A.，et al.，Cancer Res.，61，3053-3061(2001)) 被靶向。

另外一种干预端粒酶活性的方法是和端粒相互作用，而不是直接 和端粒酶相互作用。端粒酶需要端粒引物为单链。更高级别的结构， 例如G-四链体的形成阻止端粒酶RNA模板和端粒引物杂交，因而抑 制端粒酶活性。见 Zahler，A.M.，et al.，Nature，350，718-720(1991)。稳 定端粒的四链体构象，例如通过结合一个小分子，示出抑制端粒酶活 性。因此，关于可以选择性地结合并稳定端粒G-四链体构象的小分 子的研发是目前抗癌药物设计的一个感兴趣的领域。

在真核寄生虫中，端粒和端粒酶对所有上述提到的功能以及额外 的基因控制机制都是必须的。例如，端粒酶在致病的单细胞原生寄生 虫，如疟原虫(Plasmodium spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)和利什 曼原虫(Leishmania spp.)中都被发现。见 Bottius，E.N.，et al.，Mol.Cell. Biol.18，919-925 (1998)和 Cano，M.I.N.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，96，3616-3121(1999)。这些生物体中的端粒具有和人类端粒一致 的串联T2AG3重复序列。这些原生动物的细胞分裂非常迅速，但是由 于端粒缩短被端粒酶的作用所补偿，因而它们可以如癌细胞那样进行 无限次的细胞分裂。这些原生病原体可以造成疾病，例如疟疾和非洲 昏睡病，造成每年数百万计的人死亡。由于抗药性和对宿主的严重毒 性，造成对抗这些原生动物的治疗非常稀少。因而，通过稳定端粒的 四链体构象而产生的端粒酶抑制作用提供了一种有吸引力的、可选择 的药物设计靶，来削弱这些原生动物的增殖，并且具有减低的细胞毒 性和抗药性。

示出结合四链体DNA的主要化合物是那些平面芳香族化合物， 其通过外部末端堆积(external end-stacking)结合四链体中G-四链体 的任一或两个末端。这些化合物，包括蒽醌、阳离子卟啉、吖啶、苝、 大环(macrocycles)和相关分子，具有大的芳香族平面生色团，可以 模拟G四链体的平坦表面。见 Han，F.X.，et al.，J. Am.Chem.Soc.，121， 3561-3570(1999)； Teulade-Fichou，M-P.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，125， 4732-4740(2003)； Fedoroff O.Y.，et al.，Biochemistry，37，12367-12374 (1998)； Read，M.，et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，98，4844-4849 (2001)；和 Clark，G.R.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，125，4066-4067(2003)。 这些分子通过静电力、范德华力和π轨道重叠相互作用非共价地结 合，同时通常也和环状碱基相互作用。因为基本上所有已知的四链体 DNA结合物(binder)都是基于或者衍生自原型DNA双链嵌入剂， 所以相对双链体结构，许多四链体DNA结合物对四链体几乎没有选 择性。这些类型的分子表现出非选择性地结合许多位点，造成了通常 与化疗相关的细胞毒素副作用，例如恶心、呕吐、脱发、心脏和肾损 伤。因而，这就需要一种新类型的化合物，可以通过新的结合模式结 合四链体DNA，相对双链体DNA，具有高亲和力和选择性，从而提 供增强的端粒酶抑制作用及改良的治疗癌症和微生物(例如原生动 物)感染的疗法，同时具有更少的副作用。

概述

在一些实施方案中，本发明提供了一种结合四链体DNA的方法， 所述方法包括将四链体DNA与式(I)的化合物相接触：

Am1-Ar1-Ar2-Ar3-(Ar4)m-Am2    (1)

其中：

m为0-1的整数；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4独立地选自以下基团：

和

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；。

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素(halo)、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个Q独立地选自O、S、Se、Te和NR7，其中R7选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个E独立地选自CR18和N，其中R18选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基(aryloxyl)和取 代的芳基；

每个Z独立地选自CR19和N，其中R19选自从H、卤素、羟基、 烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个y独立地是0-3的整数；

每个t独立地是0-3的整数；

每个u独立地是0-3的整数；

每个R2、R3、R4、R5和R17独立地选自H、烷基、取代的烷基、 芳基、取代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基 (aralkyloxyl)；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团中：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基(acyloxyl)和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基(hydroxycycloalkyl)、烷氧基环烷基(alkoxycycloalkyl)、氨烷 基(aminoalkyl)、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物中至少一个Ar基团为：

其中：

X选自O、S、CH、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷基、取 代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

q是0-2的整数；及

每个R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、卤素、羟 基、烷氧基、芳基、芳氧基、取代的芳基和芳烷氧基；

在一些实施方案中，Ar2和Ar3均为五元环，式(I)的化合物具 有下式：

其中：

m为0-1的整数；

Ar1和Ar4独立地选自以下基团：

和

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个Q独立地选自O、S、Se、Te和NR7，其中R7选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个E独立地选自CR18和N，其中R18选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个Z独立地选自CR19和N，其中R19选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个y独立地是0-3的整数；

每个t独立地是0-3的整数；

每个u独立地是0-3的整数；

每个R2、R3、R4、R5和R17独立地选自H、烷基、取代的烷基、 芳基、取代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，Ar2和Ar3均为五元环，Ar1是六元芳香环， Ar4如果存在，为五元或六元环，式(I)的化合物具有下式：

其中：

m选自0和1；

Ar4选自以下基团：

和

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个Q独立地选自O、S、Se、Te和NR7，其中R7选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个R2和R3独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、芳基、 取代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有结构之一：

在一些实施方案中，式(I-III)化合物的两个分子结合在四链 体DNA的沟(groove)处。

在一些实施方案中，四链体DNA为端粒DNA序列。在一些实 施方案中，端粒DNA序列为人类端粒序列。在一些实施方案中，端 粒DNA为线虫DNA序列。在一些实施方案中，端粒DNA序列为原 生动物DNA序列。在一些实施方案中，端粒DNA序列为疟原虫、 锥虫或利什曼原虫的序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种减少端粒延长的方法，所 述方法包括提供一种式(I-III)的化合物并且端粒酶存在的情况下 将这种化合物与端粒DNA相接触，其中式(I-III)化合物达到一种 有效量可以稳定和维持端粒DNA处于一种四链体形式，降低端粒酶 结合端粒DNA的能力，从而减少端粒的延长。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过将细胞和有效量的式 (I-III)的化合物接触从而降低细胞繁殖能力的方法。在一些实施 方案中，所述细胞为癌细胞。因此，在一些实施方案中，本发明提供 了一种治疗需要接受治疗的患者的癌症的方法，通过给患者施用有效 量的式(I-III)的化合物进行。

在一些实施方案中，本发明提供了一种新的上面描述到的式(I) 的化合物，其中m＝0，Ar1、Ar2和Ar3为五元环，及化合物具有以 下结构：

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基，条件是至少一个X 选自Se、Te和NR1，其中R1选自芳基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、芳基、取 代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，本发明提供了一种药物制剂，其包含式(IV) 的化合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗微生物感染、任选由 疟原虫、锥虫或利什曼原虫引起的感染的方法，所述方法包括给需要 治疗的患者施用有效量的式(IV)的化合物。

因此，本发明的一个目的在于提供一种结合四链体DNA的方法， 通过将四链体DNA与式(I-IV)的化合物接触进行。

本发明的另一个目的在于提供一种方法，所述方法在四链体 DNA的沟中结合式(I-IV)的化合物的二聚体。

本发明的另一个目的在于提供一种减少端粒延长的方法，所述方 法在端粒酶的存在下通过将式(I-IV)的化合物与端粒DNA接触， 其中式(I-IV)的化合物稳定和维持了四链体二级结构中的端粒 DNA，因此削弱了端粒酶结合端粒DNA的能力。

本发明的另一个目的在于提供一种降低细胞繁殖能力的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗患者癌症的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗患者微生物感染的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种新的式(IV)的化合物。

本发明的某些目的已经在上述的描述中全部或部分的得以阐述， 其它目的和方面将通过以下说明书和实施例得以更清楚地说明。

附图简述

图1为分子内G-四链体形成的多种二级结构的示意图。

图2A为现有技术图，示出含有两对平行DNA链的杂交G-四链 体的沟大小。链的极性用在代表核苷酸糖的椭圆形中的(+)和(·)表示。

图2B为现有技术图，示出反平行的G-四链体上相对沟的大小。

图3为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的3.29μM d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)的HEPES缓冲液中的圆二色性(CD) 光谱。化合物∶DNA比率为0.5∶1到5∶1。

图4为图3的CD光谱的DNA区域的放大。

图5A为本发明的化合物8滴定到含有50mM NaCl的3.23μM d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)的HEPES缓冲液中的CD光谱。化合 物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图5B为本发明的化合物8滴定到含有50mM LiCl的3.45μM d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)的HEPES缓冲液中的CD光谱。化合 物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图6为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的2.30μM c-MYC，d[AG3TG4AG3TG4A](SEQ ID NO：2)的HEPES缓冲液中的 CD光谱。化合物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图7为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的9.40μM四膜 虫端粒、d[(T2G4)4](SEQ ID NO：4)的HEPES缓冲液中的CD光谱。 化合物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图8为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的1.83μM尖毛 虫(Oxytricha)端粒，d[G4(T4G4)3](SEQ ID NO：3)的HEPES缓冲液 中的CD光谱。化合物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图9为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的5.63μM d[(GC)7](SEQ ID NO：5)的HEPES缓冲液中的CD光谱。化合 物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图10为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的4.59μM d[GCGAATTCGC](SEQ ID NO：6)的HEPES缓冲液中的CD光谱。 化合物∶DNA比率为1∶1到5∶1。

图11为本发明的化合物8滴定到含有50mM KCl的3.32μM凝 血酶结合适体(Aptamer)，d[G2T2G2TGTG2T2G2](SEQ ID NO：7)的 HEPES缓冲液中的CD光谱。化合物∶DNA比率为1∶1到4∶1。

图12为d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)滴定到含有8.2μM本发 明化合物8的HEPES(含有50mM KCl)缓冲液中的吸收光谱，最 终DNA浓度为4.4μM。

图13为本发明的化合物8在存在50mM KCl、10mM K2HPO4和 0.1mM EDTA调节至pH7.0时滴定到d[TAGGGUTAGGGT](SEQ ID NO：9)发夹二聚体(hairpin dimer)(四链体浓度4μM)中的CD光谱。 K+总浓度为70mM。

图14为本发明的化合物8在存在50mM NaCl、10mM Na2HPO4 和0.01mM EDTA调节至pH7.0时滴定到d[TAGGGUTAGGGT](SEQ ID NO：9)发夹二聚体(四链体浓度4μM)中的CD光谱。Na+总浓度 为70mM。

图15为本发明的化合物8在存在50mM KCl、10mM K2HPO4和 0.1mM EDTA调节至pH7.0时滴定到d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)发夹二聚体(四链体浓度4μM)中的CD光谱。K+总浓度为 70mM。

图16为本发明的化合物8在存在50mM KCl、10mM K2HPO4和 0.1mM EDTA调节至pH7.0时滴定到d[TTAGGGT](SEQ ID NO：12； 单链浓度16μM)中的CD光谱。总浓度为70mM。

图17为本发明的化合物8在存在50mM KCl、10mM K2HPO4和 0.1mM EDTA调节至pH7.0时滴定到d[TGGGGT](SEQ ID NO：13； 单链浓度16μM)中的CD光谱。K+总浓度为70mM。

图18显示在含有200mM KCl的HEPES缓冲液中获得的本发明 化合物8和d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)以及发夹双链体 d[CGAATTCGTCTCCGAATTCG](SEQ ID NO：8)的表面等离子共振 (SPR)稳态结合图。浓度轴为流体溶液中未结合的化合物8浓度；RU 代表仪器反应(共振单位)。由于随机点分散造成的拟合误差小于± 5％。

图19为荧光滴定的斯卡查德图(Scatchard plot)。激发设置为 393.5nm，在荧光峰(469nm)处监测发射。d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)逐渐添加到含有于含有50mM KCl的HEPES缓冲液中的 4.975μM本发明化合物8的试管中，直至总DNA浓度为4.04μM。 Cf定义为未结合的化合物8的浓度，及r定义为结合的化合物8浓 度除以DNA浓度。

图20为0.3μM本发明化合物8独自的和在存在于含有50mM KCl的HEPES缓冲液中的8μM d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)时的 荧光激发光谱。发射波长设在469nm。

图21为显示与本发明化合物8在0∶1、1∶1和2∶1摩尔比下(从 下到上)在35℃在50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA和作 为内标的0.05mM DSS中获得的、d[TAGGGUTAGGGT](SEQ ID NO： 9)发夹二聚体(0.1mM四链体浓度)的亚氨基质子的H1NMR光谱。 参与形成G-四分体的鸟嘌呤的亚氨基质子在12.5到10.5ppm间共 振。游离DNA在记录光谱前退火过夜。

图22为显示与本发明化合物8在0∶1、1∶1和2∶1的摩尔比下(从 下到上)、在35℃下在50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA和 作为内标的0.05mM DSS中获得的、d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)发夹二聚体(0.1mM四链体浓度)的亚氨基质子的H1NMR 光谱。参与形成G-四分体的鸟嘌呤的亚氨基质子在12.5到10.5ppm 间共振。游离DNA在记录光谱前退火2小时。

图23为显示与本发明化合物8在0∶1、1∶1和2∶1的摩尔比下(从 下到上)、在35℃下在50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA和 作为内标的0.05mM DSS中获得的、d[TAGGGUTAGGGU](SEQ ID NO：11)发夹二聚体(0.1mM四链体浓度)的亚氨基质子的H1NMR 光谱。参与形成G-四分体的鸟嘌呤的亚氨基质子在12.5到10.5ppm 间共振。游离DNA在记录光谱前退火过夜。

图24显示在35℃下本发明化合物8和DNA的摩尔比为0∶1和 2∶1时，d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10；0.1-0.5mM四链体浓 度)的尿嘧啶H5-H6交叉峰的扩大TOCSY(60毫秒混合时间)光谱。 标记为U6和U7的峰对应于主要的平行形式，而另外两个峰对应于 次要反平行形式。用化合物滴定后，反平行形式的交叉峰强度减弱， 在底部的光谱表明化合物优先结合平行形式并使它保持稳定。光谱是 在混合时间为60毫秒、35℃、存在50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA和作为内参照的0.05mM DSS的条件下获得的。

图25显示d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)和本发明化 合物8在化合物和DNA比率为0∶1和2∶1时的TOCSY NMR光谱的 一个部分。交叉峰对应于C5的CH3质子和胸腺嘧啶残基的H6质子。 在光谱顶部左边的峰为重叠峰，对应于主要平行形式的T1和T12， 而右边的重叠峰对应于次要反平行形式。用化合物8滴定后，底部光 谱中的箭头表明主要形式中的一个峰向高磁场移动到一个新位置。光 谱是在混合时间为60毫秒、35℃下、存在50mM KCl、10mM K2HPO4、 0.1mM EDTA和作为内参照的0.05mM DSS的条件下获得的。

图26A为d[TAGGUTAGGGU](SEQ ID NO：11)序列中尿嘧啶 H5-H6的TOCSY光谱，条件为35℃、存在50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA和作为内参照的0.05mM DSS的条件下获得 的。

图26B为d[TAGGGUTAGGGU](SEQ ID NO：11)的尿嘧啶 H5-H6在35℃、在化合物8摩尔比为1∶1情况下的TOCSY光谱。光 谱是在混合时间为60毫秒、35℃、存在50mM KCl、10mM K2HPO4、 0.1mM EDTA和作为内参照的0.05mM DSS的条件下获得的。

图26C为d[TAGGGUTAGGGU](SEQ ID NO：11)的尿嘧啶 H5-H6在35℃、在化合物8摩尔比为2∶1情况下的TOCSY光谱。光 谱是在混合时间为60毫秒、35℃、存在50mM KCl、10mM K2HPO4、 0.1mM EDTA和作为内参照的0.05mM DSS的条件下获得的。

详细描述

现将本发明在以下结合实施例做更详细的描述，其中示出了代表 性的实施方案。本发明可以用于不同形式的实施方案，而不局限于下 面介绍的实施方案。提供这些实施方案是为了使本发明更全面地表 述，并且全面地将所述实施方案的范围传达给本领域技术人员。

除非特别说明，本文提到的所有技术和科学术语都与本发明所属 技术领域的技术人员的通常理解的意思相同。本文提到的所有公开 物、专利申请、专利和其它参考文献都以其全文并入参考。

在说明书和权利要求书中，一个特定的化学式或者名称应涵盖所 有光学和立体异构体，以及外旋混合物，如果存在这种异构体和混合 物。

I.定义

本文所用术语“凋亡(apoptosis)”指的是程序性细胞死亡，一 种在多细胞生物体中包含细胞自我毁灭的过程。这个过程通常是由于 未修复的DNA损伤例如端粒的缩短而造成的。

本文所用术语“结合”指的是一或多个分子和其它分子的非共价 缔合(association)。参与结合的分子可以是有机合成产生的小分子， DNA或RNA分子的一部分，蛋白质或其组合。因此，结合可以涉及 杂交或者更通常的氢键和/或其它非共价相互作用，例如离子键、疏 水相互作用、基于范德华力或者伦敦力的相互作用以及偶极-偶极相 互作用。

本文所用术语“癌症”指的是由于无法控制的细胞分裂和细胞转 移或者在其它部位重新开始生长的能力而造成的疾病。术语“恶性的 (malignant)”，“恶性(malignancy)”，“新生物(neoplasm)”，“肿瘤 (tumor)”及其变体指的是癌细胞或一组癌细胞。

特异类型的癌症包括但不限于，皮肤癌、结缔组织癌、脂肪癌、 乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、肛生殖 癌(anogenital cancer)、肾癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神 经系统(CNS)癌、视网膜癌、血液和淋巴癌。

本文所用术语“二聚体”指的是一个化合物的两个分子。所述两 个分子可以直接地或者通过一个连接基团例如烃链共价连接。所述烃 链可以被进一步取代或者在其主链上含有一或多个杂原子。或者，二 聚体的所述两个分子不是共价相连的。更具体地，本文所用术语“二 聚体”指的是一起非共价结合到第三个分子例如DNA序列上的两个 分子。

如本文所用，术语“G-四链体(G-quadruplex)”和“四链体”可 以互换使用，指的是形成3或多个鸟嘌呤四分体(tetrad)的、含有4 个鸟嘌呤富含序列的多核苷酸二级结构。所述4个鸟嘌呤富含序列可 以全部为一个多核苷酸分子的一部分。或者，所述4个鸟嘌呤富含序 列可以为2个、3个或者4个多核苷酸分子的一部分。

本文所用术语“四分体”或者“G-四分体(G-tetrad)”指的是 4个鸟嘌呤碱基的平面阵列。

本文所用术语“端粒DNA”指的是在染色体末端的DNA序列。 这样的序列通常含有很多鸟嘌呤。在人类或者其它脊椎动物中，端粒 DNA序列含有很多d[T2AG3]重复序列。在细胞分裂期间，不是所有 的端粒序列都被复制，因而端粒序列会变短。在很多轮的细胞分裂后， 端粒DNA序列变得太短以至细胞不能存活，引发凋亡。

本文所用术语“减少端粒延长”指的是减少或阻止添加核苷酸到 端粒末端。例如，减少端粒延长可以指阻止或减少人类或其它脊椎动 物中端粒酶添加d[T2AG3]重复序列到端粒DNA末端的能力。

本文所用术语“烷基”指的是C1-20(包括端点)线形(即直链)、 支链或者环状的、饱和的或者至少部分及在某些情况下完全不饱和的 (链烯基和炔基)烃链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、 异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊 烯基、己烯基、辛烯基、丁间二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己 炔基、庚炔基和丙二烯基基团。“支链”指的是一个烷基基团，其中 一个较短的烷基基团，例如甲基、乙基或者丙基连接到一个线形烷基 链上。“较短的烷基”指的是具有1到大约8个碳原子的烷基基团(C1-8 烷基)，例如1、2、3、4、5、6、7、或者8个碳原子。“较长的烷基” 指的是具有大约10到大约20个碳原子的烷基基团，例如10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或者20个碳原子。在某些实施方 案中，烷基指、特别是C1-8直链烷基。在另外一些实施方案中，烷基 指、特别是C1-8支链烷基。

烷基基团可任选被一或多个相同或者不同的烷基取代基取代 (“取代的烷基”)。术语“烷基取代基”包括但不限于烷基、取代的 烷基、卤素、芳氨基(arylamino)、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、 硫代烷基(alkylthio)、硫代芳基(arylthio)、芳烷氧基、硫代芳烷基 (aralkylthio)、羧基、烷氧羰基、氧代和环烷基。在烷基链上可以任 选插入一或多个氧、硫或者取代的或者非取代的氮原子，其中氮取代 基为氢、较短的烷基(本文中也指烷基氨烷基)或者芳基。

因此，本文所用术语“取代的烷基”包括本文限定的烷基，其中 烷基基团的一或多个原子或者功能基团被其它原子或者功能基团所 取代，包括烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、 羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸盐(酯)和巯基。

本文所用术语“芳基”指的是一种芳香族取代基，其可以是一个 单芳香环，或者通过共价连接或者连接至一个共有基团例如但不限于 亚甲基或亚乙基部分而融合在一起的多个芳香环。所述共有的连接基 团还可以为羰基，如苯甲酮，或者氧，如二苯醚，或者氮，如二苯胺。 术语“芳基”特别涵盖杂环芳香族化合物。芳香环可包括苯基、萘基、 联苯、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮。在某些实施方案中，术语“芳基” 指的是包括大约5至大约10个碳原子的环状芳香族，例如5、6、7、 8、9或10个碳原子，并且包括5-和6-元烃和杂环芳香环。

芳基基团可以任选被一或多个相同或者不同的芳基取代基取代 (“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基、取代的烷基、芳 基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、 酰基、卤素、硝基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、酰氧基、酰 氨基、芳酰氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、 硫代芳基、硫代烷基、亚烷基和-NR′R″，其中R′和R″可各自独立地 为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。

因此，本文所用术语“取代的芳基”包括本文限定的芳基，其中 芳基基团的一或多个原子或者功能基团被其它原子或者功能基团所 取代，包括烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、 羟基、硝基、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫酸盐(酯)和巯基。

芳基的特殊例子包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、 吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、 三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等等。

本文中通常如下式表示的结构：

或

指的是一个环结构，例如但不限于3-碳、4-碳、5-碳、6- 碳等等，脂肪族和/或者芳香族环状化合物包含一个取代的R基团， 其中R基团可以存在或不存在，当存在时，一或多个R基团可以在 环状结构上一或多个可利用的碳原子上被取代。存在或不存在R基 团，以及R基团的数目，由整数n来决定。每个R基团，如果多于1 个，取代发生在环状结构上可利用的碳原子而不是其它R基团上。 例如，下列结构：

其中n是0-2的整数，包含但不限于：

；等等。

波折线代表的是在环结构上的一个键，其表明键在环中可以存在 或者不存在。也就是说，波折线代表的是环结构中的一个键，其表明 所述环结构选自饱和环结构、部分饱和环结构以及不饱和环结构。

在一些实施方案中，本发明所描述的化合物含有一个连接基团。 本文所用术语“连接基团”包含一个化学部分，例如呋喃基、亚苯基、 噻吩基和吡咯基，其在特殊的芳基基团上结合2个或更多的其它化学 部分形成一个稳定的结构。

当一个芳香环或者杂环芳香环上的指定原子被定义为“不存在” 时，这个指定的原子被一个直接的键所替代。当连接基团或者间隔基 团被定义为不存在时，所述连接基团或间隔基团被一个直接的键所替 代。

“亚烷基”指的是具有1到大约20个碳原子的直链或者支链二 价脂肪族烃基团，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。亚烷基可以是直链、 支链或者环状。亚烷基也可以任选是不饱的和/或被一或多个“烷基 取代基”取代的。可以任选在亚烷基上插入一或多个氧、硫或者取代 的或非取代的氮原子(这里也指烷基氨烷基)，其中氮取代基是烷基， 如前所述。举例说明亚烷基包括亚甲基(-CH2-)；亚乙基(-CH2-CH2-)； 亚丙基(-(CH2)3-)；亚环己基(-C6H10-)；-CH＝CH-CH＝CH-； -CH＝CH-CH2-；-(CH2)q-N(R)-CH2)r-，其中每个q和r独立地是0 -20的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20，及R是氢或者较短的烷基；亚甲二 氧基(-O-CH2-O-)和亚乙二氧基(-O-(CH2)2-O-)。亚烷基可以具有大 约2至大约3个碳原子并且还可具有6-20个碳。

本文所用术语“酰基”指的是一个有机羧酸基团，其中羧基上 的-OH被其它取代基取代(例如表示为RCO-，其中R为这里提到 的烷基或芳基)。如此，术语“酰基”特异地包括芳酰基，如乙酰呋 喃和苯甲酰甲基。酰基的特别例子包括乙酰基和苯甲酰基。

“环状”和“环烷基”指的是大约有3到大约10个碳原子的非 芳香族单环或多环系统，例如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。 环烷基任选可以是部分不饱和的。环烷基也可以任选被这里提到的烷 基取代基、氧代和/或者亚烷基取代。可以在环烷基的链上任选插入 一或多个氧、硫或者取代的或未取代的氮原子，其中氮取代基是氢、 烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，因此提供了一个杂环基团。 代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环环烷基环 包括金刚烷基、八氢萘基、十氢化萘、樟脑、莰烷和降金刚烷基 (noradamantyl)。

“烷氧基”指的是烷基-O-基团，其中烷基在前面描述过。本 文所用术语“烷氧基”指的是例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧 基、丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。术语“氧烷基(oxyalkyl)”可以和 “烷氧基”相互使用。

“芳氧基”指的是芳基-O-基团，其中芳基在前面描述过，包 括取代的芳基。本文所用术语“芳氧基”可以指苯氧基或己氧基，和 烷基、取代的烷基、卤素，或烷氧基取代的苯氧基或己氧基。

“芳烷基”指的是芳基-烷基-基团，其中芳基和烷基在前面已 经描述过，包括取代的芳基和取代的烷基。举例的芳烷基包括苯甲基、 苯乙基和萘基甲基。

“芳烷氧基”指的是芳烷基-O-基团，其中芳烷基在前面已经 描述过。举例的芳烷氧基是苄氧基。

“二烷基氨基”指的是-NRR′基团，其中每个R和R′独立地是 烷基和/或取代的烷基，如前所述。举例的烷基氨基包括乙基甲基氨 基、二甲基氨基和二乙基氨基。

“烷氧羰基”指的是烷基-O-CO-基团。举例的烷氧羰基包括甲 氧羰基、乙氧羰基、丁氧羰基和叔丁氧羰基。

“芳氧羰基”指的是芳基-O-CO-基团。举例的芳氧羰基包括苯 氧-和萘氧羰基。

“芳烷氧羰基”指的是芳烷基-O-CO-基团。举例的芳烷氧羰基 包括苄氧羰基。

“氨基甲酰基”指的是H2N-CO-基团。

“烷基氨基甲酰基”指的是R′RN-CO-基团，其中R和R′的一个 为氢，另外一个为烷基和/或取代的烷基，如前所述。

“二烷基氨基甲酰基”指的是R′RN-CO-基团，其中每个R和 R′独立地为烷基和/或取代的烷基，如前所述。

“酰氧基”指的是酰基-O-基团，其中酰基如前所述。

“酰氨基”指的是酰基-NH-基团，其中酰基如前所述。

术语“氨基”指的是-NH2基团。

术语“羰基”指的是-(C＝O)-基团。

术语“羧基”指的是-COOH基团。

本文所用术语“卤化物”或者“卤素”指的是氟、氯、溴和碘基 团。

术语“羟基”指的是-OH基团。

术语“羟烷基”指的是被-OH基团取代的烷基。

术语“巯基”指的是-SH基团。

术语“氧代”指的是本文前述的化合物，其中碳原子被氧原子所 取代。

术语“硝基”指的是-NO2基团。

术语“硫代”指的是本文前述的化合物，其中碳原子或氧原子被 硫原子所取代。

术语“硫酸盐(酯)”指的是-SO4基团。

当使用术语“独立地选自”时，取代基(例如R基团，R1和R2， 或者X和Y)可以是一样的或者不同的。例如，R1和R2都可以是 取代的烷基，或者R1可以是氢，R2可以是取代的烷基等等。

一个指定的″R″，“X”，″A″，″B，″“D”，“E”或“Q”基团通常具有本 领域认可的对应于所述名字的基团的结构，除非特殊说明。为了阐明， 前面提到的代表性的″R″″X，″和″A” 基团将在下面限定。这些限定是 为了补充和说明，并不是排除在阅读了本发明后对于本领域内技术人 员是明显的限定。

术语“回流(reflux)”或者其文法上相近的词在此指的是在一个 容器中，例如一个反应瓶里，煮沸一种液体，例如溶剂，这个容器连 有冷凝器，从而由于蒸气在冷凝器的内壁凝聚，因此使得可以持续煮 沸而不损失液体。

术语“非质子溶剂”指的是一种溶剂分子，其既不接受也不给予 质子。典型的非质子溶剂包括但不限于丙酮、乙腈、苯、丁酮、丁腈、 四氯化碳、氯苯、氯仿、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基 乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、1，4-二氧杂环 乙烷、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、己烷、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、四 氢呋喃(THF)及甲苯。某些非质子溶剂是极性溶剂。极性非质子溶剂 的例子包括但不限于丙酮、乙腈、丁酮、N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚 砜。某些非质子溶剂是非极性溶剂。非极性非质子溶剂的例子包括但 不限于二乙醚、脂肪烃，例如己烷，芳香烃，例如苯和甲苯，以及对 称的卤化烃，例如四氯化碳。

术语“质子溶剂”指的是一种溶剂分子，其含有结合到一个负电 原子的一个氢原子，例如氧原子或氮原子。典型的质子溶剂包括但不 限于羧酸，例如乙酸，醇，例如甲醇和乙醇，胺、酰胺和水。

II.总则

II.A端粒酶

人端粒酶有至少两个亚基。一个亚基hTR或者人端粒酶RNA单 位是一个450bp长的非翻译RNA序列，含有3′-CCCAAUCCC碱基 序列。这个hTR 3′-CCCAAUCCC序列和端粒最后3个鸟嘌呤杂交。 端粒酶的第二个亚基，端粒酶逆转录酶或hTERT单位，是一个1131 个氨基酸的多肽，象其它逆转录酶一样，用单链RNA为模板合成一 单链DNA。在hTERT中，这个酶利用杂交的hTR单位作为模板催化 添加一段新的5’-TTAGGG序列到端粒的末端。

如上述，正常的哺乳动物体细胞不含有具有活性的端粒酶。当一 个细胞分裂时，不是所有的端粒序列都被复制。细胞分裂的不断累积 造成了端粒每轮缩短50到200个核苷酸。一旦端粒缩短到一定的长 度，细胞就不再分裂并引发凋亡。几乎所有的肿瘤细胞都具有被端粒 酶维持在一个特定长度的缩短的端粒。因此，端粒酶活性与肿瘤细胞 的无限制生长和永生性相关。

II.B G-四链体

四链体DNA的一个关键结构特征是通过Hoogsteen和 Watson-Crick氢键在一个共面环状阵列上结合在一起的一系列堆积的 鸟嘌呤四分体。这个环状四分体阵列可以表示为图解1。

图解1  G-四分体阵列

单链富含鸟嘌呤序列折叠成多种含有3个堆积的四分体的二级 结构，其进一步通过π-π堆积相互作用和位于所述四分体之间或者内 部的阳离子配位而保持稳定。所有四股的分子内G-四链体可以朝向 同一个方向，形成一个平行四链体。或者，这四股链可以有不同的方 向，形成反平行四链体。图1显示了一些报导的端粒DNA的不同四 链体二级结构。曾经有报导在Na+存在下，在人端粒DNA序列中存 在一个反平行、篮状四链体结构。见 Wang，Y.，and Patel，D.J.，Structure， 1，263-282(1993)。在K+存在下，曾经报导人端粒DNA序列中存在 一个螺旋桨(propeller)状的平行结构。见 Parkinson，G.N.et al.， Nature，876-880(2002)。在对四膜虫有纤毛原生动物的端粒DNA 序列的NMR研究报导了一个混合类型的四链体结构。见 Wang，Y.， and Patel，D.J.，Structure，2，1141-1156(1994)。这个四膜虫序列含有 d[T2G4]重复序列，而不是人类的d[T2AG3]重复序列。分子内四链体 也可以由2个或者更多分离的富含G的DNA链形成。

不同于其中糖苷键是反式(anti)的大部分DNA，在G-四链体 四分体中鸟嘌呤可以反式或顺式(syn)。更具体地，如果在同一个四 分体上邻近的鸟嘌呤是在平行的链上，它们都有相同的糖苷扭转角 (glycosidic torsional angle)。如果邻近的鸟嘌呤在反平行的链上，它 们有相反的糖苷扭转角。下面的图解2表示了这两种糖苷扭转角的结 构。链方向和糖苷键角度的不同组合造成了多种多样的沟大小。两个 例子分别表示在图2A和图2B。见 Simonsson，T.，Biol.Chem.，382， 621-628(2001)。图2A表示两对平行链的四链体的沟。平行链间的两 个沟为中等大小，而在反平行链间的沟要么窄，要么宽。图2B表示 一个四链体，其中四个DNA链都朝不同的方向。完全反平行的四链 体的沟或窄或宽。

图解2.顺式和反式糖苷键

II.C  G四链体/小分子相互作用

如上所述，几种小分子和DNA四链体的结合已经被研究过。大 多数这些分子被认为是堆积在四链体的末端，在环区域。这种分子的 两个例子是telomestatin，一种来自环圈链霉菌(Streptomyces anulatus) 3533-SV4的天然产物，和扩展的卟啉类型分子(expanded porphyrin-type molecules)Se2SAP。见 Rezler，E.M.，et al.，J. Am.Chem. Soc.，127，9439-9447(2005)。四链体末端结合化合物的更进一步例子 包括，N，N’-双(2-哌啶子基乙基)-3，4，9，10-苝四羧酸二酰亚胺 (N，N’-bis(2-piperdinoethyl)-3，4，9，10-perylenetetracarboxylic acid diimide，PIPER)和相关的苝四羧酸二酰亚胺。见例如 Han，H.，et al.， Biochemistry，38，6981-6986(1999)；和 Kerwin，S.M.，et al.的U.S.Patent No.6,689,887。这些四链体末端结合化合物的结构在图解3中表示：

图解3.G-四链体末端堆积化合物

溴化乙锭被证实可以插入到四分体中间；但是结构上证明这一点 的证据还缺乏。见 Guo，Q.，et al.，Biochemistry，31，2451-2455(1992)。 一般来说，G-四链体的插入由于高能耗而被认为不是一种可行的结 合模式。见 Han，H.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，123，8902-8913(2001)。 而且，对于四链体结合、抗癌治疗剂的研究，插入不是一个希望的结 合模式，因为它和双链体DNA插入很相似。

四链体沟-结合为研究双链和四链体DNA间的结构不同提供了 一种吸引人的、可选择的策略，使得有可能增加对传统平面末端-堆 积分子识别的选择性。由于沟的尺寸因四链体的类型而有很大的变 化，沟-结合也提供了对特殊四链体结构获得更高选择性的机会。G -四集体(G-quartet)的几何学结构受糖苷(顺式或反式)构象或四 链体的链方向的影响不大。见 Mergny，J.-L.，et al.，Anti-Cancer Drug Design，14，327-339(1999)。但是构尺寸很大程度取决于这些因子，因 此造成多种多样可能的沟的几何形状，其大小、静电势、氢键性质、 空间效应和水合作用不同。见 Randazzo，A.，et al.，Nucleosides， Nucleotides，and Nucleic Acids，21，535-545(2002)和 Simonsson，T.， Biol.Chem.，382，621-628，(2001)。沟结构的变化使得可以高度选择性 地靶向某种四链体序列。

提示羰花青染料化合物与非人类的富含G的DNA序列形成的 DNA四链体的沟结合。 Chen et al研究了羰花青染料3，3’-二乙基恶二 羰花青(3，3’-diethyloxadicarbocyanine，DODC)和一个双链发夹G-四 链体的相互作用。见 Chen，Q.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93， 2635-2639(1996)。光谱数据表明这个分子在一或多个四链体沟中结 合。 Chang和他的同事的Satellite hole光谱研究支持了这个特殊配体 和四链体的沟-结合模型。见 Cheng，J.-Y.，et al.，J.Phys.Chem.，102， 5542-5546(1998)； Chiang，C.-C.，et al.，Proceedings of the National Science Council ROC(A)，23，679-694(1999)。 David et al.用电雾化质谱 研究N，N’-二乙基硫代羰花青碘化物(DTC)和由[d(T2G5T)]序列形成的 四链体的相互作用。见 David，W.M.，et al.，Anal.Chem.，74，2029-2033 (2002)。在电离时的片段化模式也表明了这种分子在四链体的沟中结 合。 Kerwin和他的同事早先描述DTC选择性地结合[d(T2AG3)]序列 的四链体，而不是三联体(triplex)DNA，并抑制人端粒酶。见 Kerwin， S.M.，et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，11，2411-2414(2001)。

另外， Randazzo et al.研究了偏端霉素和一个4链分子间四链体的 相互作用。见 Randazzo，A.，et al.，Nucleosides，Nucleotides，and Nucleic Acids，21，535-545(2002)。NMR结果表明偏端霉素以二聚体形式结合 到一个四链体沟上，但可以在更高浓度时结合2个沟。但是偏端霉素 示出对双链体DNA比四链体DNA具有更高的亲和力。而且，Maizels 和他的同事的NMR研究表明偏端霉素通过末端堆积机制结合几种4 链分子间四链体，包括一种由人端粒序列形成的四链体。见 Cocco，M. J.，et al.，Nuc.Acids Res.，31，2944-2951(2003)。DODC、DTC和偏端 霉素A的结构表示在图解4中。

图解4.报导的四链体沟结合化合物

III.双阳离子聚芳基四链体结合化合物

III.A式(I-IV)的化合物

本发明揭示了一系列结合G-四链体DNA的双阳离子聚芳基化 合物。在一些实施方案中，这些化合物选择性地结合G-四链体DNA， 而不是双链或三联体DNA。在一些实施方案中，结合G-四链体DNA 的双阳离子聚芳基化合物具有式(I)的结构：

Am1-Ar1-Ar2-Ar3-(Ar4)m-Am2    (1)

其中：

m为0-1的整数；

Ar1、Ar2、Ar3和Ar4独立地选自以下基团：

，和

其中：

每个X独立地选自O、S、CH、Se、Te和NR1，其中R1选自H、 烷基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的 芳基；

每个Q独立地选自O、S、Se、Te和NR7，其中R7选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个E独立地选自CR18和N，其中R18选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个Z独立地选自CR19和N，其中R19选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个y独立地是0-3的整数；

每个t独立地是0-3的整数；

每个u独立地是0-3的整数；

每个R2、R3、R4、R5和R17独立地选自H、烷基、取代的烷基、 环烷基、卤素、羟基、烷氧基、芳基、芳氧基、取代的芳基和芳烷氧 基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在上述式(I)的化合物中，Am1和Am2可以通过一个与任何可 利用的、而未被另一指定的取代基取代的碳原子的直接的键与Ar1、 Ar3或Ar4连接。同样地，每个Ar基团可以通过在任何可利用碳原 子上的直接的键与任何其它Ar基团连接。

在一些实施方案中，式(I)的化合物的至少一个Ar基团为：

其中：

X选自O、S、CH、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷基、取 代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

q是0-2的整数；且

每个R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、卤素、羟 基、烷氧基、芳基、芳氧基、取代的芳基和芳烷氧基。

在一些实施方案中，Ar2和Ar3均为五元环，式(I)的化合物具 有下式：

其中：

m为0-1的整数；

Ar1和Ar4独立地选自以下基团：

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个Q独立地选自O、S、Se、Te和NR7，其中R7选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个E独立地选自CR18和N，其中R18选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个Z独立地选自CR19和N，其中R19选自H、卤素、羟基、烷 基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基、芳氧基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个y独立地是0-3的整数；

每个t独立地是0-3的整数；

每个u独立地是0-3的整数；

每个R2、R3、R4、R5和R17独立地选自H、烷基、取代的烷基、 芳基、取代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，Ar2和Ar3均为五元环，Ar1是六元芳香环， Ar4如果存在，为五元或六元环，式(I)的化合物具有下式：

其中：

m为0-1的整数；

Ar4选自以下基团：

和

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个A、B和D独立地选自CR6和N，其中R6选自H、卤素、 羟基、烷基、烷氧基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个R2和R3独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、芳基、 取代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，m是0及Ar1、Ar2和Ar3都为五元环，式(I) 的化合物是一个新的化合物，具有下式：

其中：

每个X独立地选自O、S、Se、Te和NR1，其中R1选自H、烷 基、取代的烷基、环烷基、芳基和取代的芳基，条件是至少一个X 选自Se、Te和NR1，其中R1选自芳基和取代的芳基；

每个q独立地是0-2的整数；

每个R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、芳基、取 代的芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基和芳烷氧基；

Am1和Am2各自独立地选自以下基团：

和

其中：

每个R8独立地选自H、羟基、烷基、取代的烷基、芳基、取代 的芳基、酰氧基和烷氧基；

每个R9、R10、R11和R12独立地选自H、烷基、取代的烷基、环 烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、羟基环 烷基、烷氧基环烷基、氨烷基、酰氧基、烷基氨烷基和烷氧羰基；或 者

R8和R9或者R8和R12一起表示C2到C10烷基，C2到C10羟烷基， 或者C2到C10亚烷基；或者

R8和R9或者R8和R12一起为：

其中s为1-4的整数，及R13是H或者-CONHR14NR15R16，其 中R14是烷基，及R15和R16各自独立地选自H和烷基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有如下结构之一：

，和

在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物结合四链体DNA比其 结合双链体DNA或三链DNA更有亲和力。选择性结合四链体DNA 而不是双链或三联体DNA被认为可以减少化合物对正常细胞(即非 癌细胞)的毒性。在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物选择性 结合由端粒DNA形成的分子内G-四链体。在一些实施方案中，式 (I-IV)的化合物选择性结合由含有d[T2AG3]重复序列的DNA形 成的G-四链体。在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物选择性 结合由人端粒DNA序列形成的四链体。在一些实施方案中，式(I -IV)的化合物选择性结合nemotodal或原生动物端粒DNA序列。 而且，在一些实施方案中，所述原生动物端粒DNA序列为来自锥虫 属物种、疟原虫属物种和利什曼原虫属物种的序列。

在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物选择性结合四链体端 粒结构，稳定该四链体形式使得端粒酶不能结合和/或催化添加多核 苷酸到端粒DNA上。因此，在一些实施方案中，式(I-IV)的化合 物可以用来减少或阻止端粒的延伸。在一些实施方案中，式(I-IV) 的化合物可以用来促进细胞凋亡。因此，在一些实施方案中，式(I -IV)的化合物可以用在降低细胞繁殖的方法中。

而且，在下面描述的CD光谱研究中的椭圆度表明式(I-IV) 的化合物可以结合G-四链体DNA的沟中。因此，在一些实施方案 中，式(I-IV)的化合物在四链体结构的沟中结合G-四链体。本 文所述的化合物的CD光谱的激子分裂(exciton splitting)进一步表 明这种化合物可以以二聚体结合四链体。因此，在一些实施方案中， 式(I-IV)的化合物的两个分子作为二聚体结合在四链体DNA的沟 中。在一些实施方案中，所述二聚体为分支二聚体(offset dimer)。 这样的分支二聚体也可以指J-聚集体(J-aggregate)。在一些实施方 案中，式(I-IV)化合物的二聚体结合在G-四链体的多个沟中。

III.B前体药物(prodrug)

在代表性的实施方案中，本文揭示的化合物是前体药物。前体药 物指的是一种化合物，在施用给受者后，能够提供(直接或间接)本 发明的化合物或者其抑制活性代谢产物或残余物。当这种化合物施用 给个体时(例如通过允许口服容易吸收进血液的化合物)前体药物可 以提高本发明化合物的生物利用率，或者可以增强父本化合物到与代 谢物相关的生物学区室(例如脑或淋巴系统)的输送。本文揭示的许 多化合物(例如16，19，23，32，39，44，60a和60b)都是前体药物。

III.C药物学可接受的盐

另外，本文所述的活性化合物可以作为药物学可接受的盐进行施 用。这样的药物学可接受的盐包括葡糖酸盐、乳酸盐、乙酸盐、酒石 酸盐(tartarate)、柠檬酸盐、磷酸盐、马来酸盐、硼酸盐、硝酸盐、 硫酸盐和盐酸盐。本文所述的化合物的盐可以例如通过将所述碱化合 物与需要的酸在溶液中进行反应而制备。反应完后，通过加入一定量 的其中盐不溶的溶剂使得盐从溶液中结晶。在一些实施方案中，如下 文所述，脒肟(amidoxime)化合物的盐酸盐是通过将氯化氢气体通 入游离碱的乙醇溶液中获得的。在一些实施方案中，如下文所述，本 发明的联脒化合物和/或相应N-甲氧基类似物的乙酸盐是通过将适 当的N-羟基类似物直接制备的。在一些实施方案中，如下文所述， 联脒化合物的N-甲氧基类似物的马来酸盐是通过将N-甲氧基类 似物和马来酸在醇中加热一段时间而制备的。因此，在一些实施方案 中，所述药物学可接受的盐是盐酸盐。在一些实施方案中，所述药物 学可接受的盐是乙酸盐。在一些实施方案中，所述药物学可接受的盐 是马来酸盐。

IV.药物学制剂

式(I-IV)的化合物，其药物学可接受的盐，相应于式(I-IV) 化合物的前体药物和其药物学可接受的盐，全部在这里都是指“活性 化合物”。本发明还提供了包含上述活性化合物的药学制剂。这些药 学制剂包含了存在于药物学可接受的载体中的、本文所述的活性化合 物。药学制剂可以制备用于口服、静脉或者气溶胶施用，在下文会详 细描述。而且，本发明提供了这种活性化合物，其被冷冻干燥而且可 以被复水(reconstitute)形成用于施用例如通过静脉内或肌内注射的 药物学可接受的制剂。

在本文实施方案中应用的、任何特异的活性化合物的治疗有效剂 量根据化合物的不同、病人的不同而变化，并且依赖于病人状况和输 送途径。通常建议，从大约0.1到大约50mg/kg的剂量将具有治疗效 力，这里所有的重量都是基于活性化合物的重量计算的，包括使用盐 的情况。在较高水平的毒性问题可以将静脉内剂量限制到较低水平， 如最高大约10mg/kg，所有的重量都是基于活性化合物的重量计算 的，包括使用盐的情况。从大约10mg/kg到大约50mg/kg的剂量可 以用于口服施用。典型地，大约0.5mg/kg到大约5mg/kg的剂量可 以用于肌内注射。静脉内或口服施用优选的剂量为1μmol/kg到 50μmol/kg、更优选22μmol/kg和33μmol/kg的化合物。治疗的疗程 通常为每天一次，2到3周，或者直到病症基本被控制。低频率给予 较低剂量可以预防性用于防止或减少感染复发的发生。

根据本发明的方法，本文所述的药学活性化合物可以以固体或液 体进行口服施用，或可以以溶液、悬浮液或乳状液肌内或静脉内施用。 或者，化合物或盐也可以作为脂质体悬液通过吸入、静脉内或者肌内 施用。当通过吸入施用时，活性化合物或盐应是多个固体颗粒或者小 滴的形式，颗粒大小为大约0.5到大约5微米，并优选大约1到大约 2微米。

适于静脉内或肌内注射的药学制剂在本文另一个实施方案中提 供。药学制剂包含了在任何药物学可接受的载体中的、本文所述的式 (I-IV)的化合物、前体药物、或者其药物学可接受的盐。如果需 要溶液，对于水溶性的化合物或盐，水是可选择的载体。对于水溶性 的化合物或盐，可以适用的有机载体如甘油、丙二醇、聚乙二醇或其 混合物。在后一种情况中，有机载体可以含有大量的水。两种情况中 的所述溶液都可以用本领域技术人员所知的一种适当的方式来灭菌， 典型地可以通过0.22微米滤膜来过滤除菌。灭菌后，溶液可以被分 装进适合的容器，例如无热源(depyrogenated)玻璃小瓶。分装优选 用无菌方法进行。然后将灭菌过的瓶塞加在小瓶上。如果需要，可以 将瓶内容物冷冻干燥。

除了式(I-IV)的化合物或其盐或前体药物，药学制剂还可以 含有其它添加剂，例如pH调节添加剂。特别地，有用的pH调节剂 包括酸，如盐酸，碱或缓冲液，如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸 钠、硼酸钠或葡糖酸钠。而且，所述制剂可以含有抗微生物防腐剂。 有用的抗微生物防腐剂包括羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯和苄醇。 当所述制剂置于设计用于多剂量使用的小瓶内时，典型地应用抗微生 物防腐剂。本文所述的药学制剂可以用本领域内熟知的技术冷冻干 燥。

在本发明的另一实施方案中，提供了一种可注射的、稳定的、无 菌制剂，其包含式(I-IV)的化合物或其盐，以单位剂型在密封的 容器中。所述化合物或盐以冻干形式提供，其可以用适合的药物学可 接受的载体复水形成适于注射给个体的液体制剂。所述单位剂型典型 地包含大约10mg到大约10g的化合物盐。当化合物或盐基本上为 水不溶性的时，可以使用足够量的、生理学可接受的乳化剂在含水的 载体中乳化所述化合物或盐。一种有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。

用本文揭示的水不溶性的化合物或其盐如含水的碱乳状液可以 制备其它药学制剂。在这种情况下，所述制剂含有足够量的药物学可 接受的乳化剂来乳化所需量的化合物或其盐。特别有用的乳化剂包括 磷脂酰胆碱和卵磷脂。

本文提供的其它实施方案包括本发明揭示的活性化合物的脂质 体制剂。本领域内熟知形成脂质体悬浮液的技术。当所述化合物为一 种水溶性盐时，用传统的脂质体技术，可以将其掺入脂质载体中。在 这种情况下，由于活性化合物的水溶性，活性化合物将会被充分地包 裹在脂质体的亲水中心或核中。应用的脂质层可以是任何传统的组 成，可以含有或不含有胆固醇。当感兴趣的活性化合物为水不溶性， 同样可以用传统的脂质体制剂技术将盐充分包裹在形成脂质体结构 的疏水脂质双层中。在任何一种情况，产生的脂质体可以通过应用标 准的超声波和均质化技术减小大小。

本文揭示的、包含所述活性化合物的脂质体制剂可以被冻干制成 冻干物，其可以用药物学可接受的载体复水，例如水，再生为脂质体 悬浮液。

药学制剂也可以以适合作为气溶胶通过吸入施用的形式提供。这 些制剂包含本文所述的所需化合物或其盐的溶液或悬浮液，或所述化 合物或盐的多个固体颗粒。所述所需制剂可以置于小室中并且雾化。 雾化可以通过压缩空气或者通过超声波能形成多个包含所述化合物 或盐的小液滴或固体颗粒而实现。小液滴或固体颗粒的大小应在大约 0.5到大约10微米的范围内，更优选在大约0.5到大约5微米。固体 颗粒可以通过将固体化合物或其盐利用任何本领域内已知的适当方 式如微粉化来获得。最优选地，固体颗粒或小液滴的大小在大约1到 大约2微米。这方面，商业化的雾化器可以用来实现这个目的。化合 物可以通过在美国专利No.5,628,984中提到的可吸入颗粒的气溶胶 悬液来施用，该美国专利以其全文并入本文参考。

当适于作为气溶胶施用的药学制剂为液体形式时，所述制剂包含 一种在包含水的载体中的水溶性活性化合物。进行雾化时，可以存在 表面活性剂，其使制剂的表面张力减少至足以形成所需大小范围内的 小滴。

如述，本发明提供了水溶性和水不溶性的活性化合物。如本文所 用，术语“水溶性的”是指在水中以大约50mg/mL或更高的量可溶 的任何成分。同样，如本文所用，术语“水不溶性的”是指在水中具 有的溶解度小于大约20mg/mL的任何成分。在一些实施方案中，需 要水溶性的化合物或盐，而在另一些实施方案中，需要水不溶性的化 合物或盐。

V.用G-四链体结合化合物治疗疾病的方法

V.A治疗哺乳动物中涉及端粒酶活性的癌症和其它疾病的方法

本发明提供了抑制细胞增殖的方法和组合物。而且，本发明提供 了干扰端粒酶活性的方法，通过结合、任选选择性地结合细胞内端粒 DNA的四链体形式从而破坏端粒延长而实现。在一或多次细胞分裂 期间，通过破坏端粒延长，细胞增殖停止并引发凋亡。因此，本发明 提供了一种治疗涉及非所需端粒活性的疾病的方法。

在一些实施方案中，抑制细胞增殖的方法包括给需要治疗的对象 施用本发明揭示的活性化合物。这些活性化合物包括式(I-IV)的 化合物，它们对应的前体药物和所述化合物和前体药物的药物学可接 受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了破坏端粒酶的活性、抑制端粒 酶阳性细胞增殖以及治疗患者癌症的方法和组合物。本发明的方法和 组合物也可以用来治疗其它端粒酶介导的病症或疾病，例如其它过度 增殖或自体免疫紊乱，例如牛皮癣、类风湿性关节炎以及其它需要免 疫系统抑制的免疫系统紊乱。由于端粒酶只在肿瘤细胞、生殖细胞和 某些造血系统的干细胞中具有活性，其它正常细胞将不受端粒酶干扰 作用的影响。如果需要，可以采取措施防止结合G-四链体结合化合 物和生殖细胞或干细胞接触。例如，G-四链体结合化合物可以区域 性地输送到患者体内的、特定的受影响的一或多个区域。或者，全身 性输送所述药剂在某些情况下更为适用，例如当发生了广泛转移时。

本文所述的G-四链体结合化合物可以对广泛的肿瘤和癌症提 供治疗，所述肿瘤和癌症包括皮肤癌、结缔组织癌、脂肪癌、乳腺癌、 肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、肛生殖癌、肾癌、 膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统(CNS)癌、视网膜癌、 血液和淋巴癌。

本文限定的治疗癌症相关的“有效量”是指可以降低、减少、抑 制或者消除癌细胞或肿瘤生长的量。

另外，本发明的G-四链体结合化合物和其它一或多种抗癌药物 或治疗方法组合治疗，对于治疗癌症将会得到更好的治疗效果。这种 组合的选择依赖于多种因素，包括但不限于疾病类型、患者年龄和一 般健康状况、病情进展的严重程度以及患者对包含所述组合的药物的 耐受能力。例如，在肿瘤发展到了晚期，G-四链体结合试剂可以组 合其它能有效减少肿瘤大小的药物以及治疗方案(例如放疗、手术、 化疗、激素治疗、和或者基因治疗)。而且，在一些实施方案中，需 要将G-四链体结合药物和治疗疾病的副作用或治疗剂之一的副作 用的一或多种其它药物组合，例如提供给患者止痛剂，或者是可以有 效刺激患者自身免疫应答的药物(例如集落刺激因子)。

因此，多种化学化合物，或者说是“抗肿瘤”药物或“化疗药物” 可以和一或多种本发明的G-四链体化合物组合使用。这些化合物包 括但不限于烷基化试剂、DNA嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、DNA或 RNA合成抑制剂、DNA碱基类似物、拓扑异构酶抑制剂、抗血管发 生剂和其它端粒酶抑制剂或端粒DNA结合化合物。例如，适合的烷 基化试剂包括烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如 benzodizepa、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedepa)和乌瑞 替派(uredepa)；氮丙啶类(ethylenimines)和甲基蜜胺 (methylmelamines)，如六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺 (triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、 三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺 (trimethylolmelamine)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥、 萘氮芥(chlomaphazine)、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环 磷酰胺(iphosphamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 mechlorethamine oxide hydrochloride、苯丙氨酸氮芥、novembichine、 胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、 曲洛磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶芥子(uracil mustard)；亚硝基脲， 如亚硝脲氮芥、葡糖氯乙亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷 莫司汀(ranimustine)。

在治疗癌症中使用的抗生素包括更生霉素、道诺红菌素、阿霉素、 伊达比星(idarubicin)、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、丝裂霉 素(mytomycin)、普卡霉素(plicamycin)和链脲霉素(streptozocin)。 化疗抗代谢物包括巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、克拉曲滨(cladribine)、磷 酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil(5-FU))、 5’-氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、戊制菌素、氨甲蝶呤和咪唑硫嘌呤 (azathioprine)、无环鸟苷、腺嘌呤β-1-D-阿拉伯糖苷、氨甲蝶呤 (amethopterin)、氨基喋呤、2-氨基嘌呤、蚜栖菌素、氮鸟嘌呤、重 氮丝氨酸、氮尿嘧啶、2′-叠氮-2′-脱氧核苷、5-溴脱氧胞苷、胞嘧啶 β-1-D-阿拉伯糖苷、重氮氧正亮氨酸(diazooxynorleucine)、双脱氧核 苷、5-氟脱氧胞苷、5-氟脱氧尿苷和羟基脲。

化疗蛋白合成抑制剂包括相思豆毒蛋白、金精三羧酸 (aurintricarboxylic acid)、氯霉素、大肠杆菌素E3、放线菌酮、白喉 毒素、伊短菌素A、吐根碱、红霉素、乙硫氨酸、氟化物、5-氟色氨 酸、梭链孢酸、鸟苷酰基亚甲基二膦酸酯(guanylyl methylene diphosphonate)和鸟苷酰亚氨基二磷酸(guanylyl imidodiphosphate)、 卡那徽素、春雷霉素、黄色霉素和O-甲基苏氨酸。其它的蛋白合成 抑制剂包括莫迪素(modeccin)、新霉素、正缬氨酸、密旋霉素、巴 龙霉素、嘌呤霉素、篦麻毒蛋白、志贺菌毒素、焦土霉素、稀疏霉素、 壮观霉素、链霉素、四环素、硫链丝菌肽和三甲氧苄二氨嘧啶。DNA 合成抑制剂包括烷基化试剂例如二甲基硫酸盐/酯(dimethyl sulfate)、 丝裂霉素C、氮和硫芥子气，插入试剂例如吖啶染料、放射菌素、阿 霉素、蒽类、苯并芘、溴化乙锭、缠结二碘化丙啶(propidium diiodide-intertwining)和药物例如偏端霉素和纺锤菌素也可以和本发 明的化合物在药物组合物中组合。拓扑异构酶抑制剂，例如香豆霉素、 萘啶酮酸、新生霉素和恶喹酸(oxolinic acid)，细胞分裂抑制剂包括 秋水仙酰胺、秋水仙碱、长春花碱和长春花新碱；及RNA合成抑制 剂包括放射菌素D、α-鹅膏蕈毒环肽和其它真菌鹅膏毒素、蛹虫草菌 素(3′-脱氧腺苷)、二氯核呋喃糖基苯并咪唑(dichlororibofuranosyl benzimidazole)、利福平(rifampicine)、曲张链菌素和利迪链菌素也 可以组合本发明的G-四链体结合化合物以提供适当的癌症治疗。

因此，目前可以和本发明的G-四链体结合剂组合治疗应用的化 疗药物包括阿霉素(adrimycin)、5-氟尿嘧啶(5FU)、表鬼臼毒素吡喃 葡糖苷、喜树碱(camptothecin)、放射菌素D、丝裂霉素、顺式铂氨 (cisplatin)、过氧化氢、卡铂(carboplatin)、甲苄肼(procarbazine)、 双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨 酸氮芥、chjlorambucil、bisulfan、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、 柔红霉素(duanorubicin)、阿霉素、博来霉素、plicomycin、三苯氧 胺、紫杉醇、transplatimun、长春灭瘟碱和甲氨蝶呤等等。

包含G-四链体结合剂和其它治疗药物，例如其它化疗药物的组 合治疗可以通过同时将细胞与G-四链体结合剂和其它药物接触来 实现。这样的组合治疗可以通过将细胞与包括两种药物的单一组合物 或药物制剂接触、或同时将细胞与两种不同的组合物或制剂接触来实 现，其中一种组合物包括G-四链体结合剂，另一种包括其它药物。

或者，G-四链体结合剂还可以先于或者后于其它药物的治疗， 间隔可以从几分钟到几周。在其它药物和基于G-四链体的治疗分别 应用于细胞的实施方案中，要保证每种输送时间之间不能超过有效期 (significant period)，这样药物和基于G-四链体的治疗才能对细胞 施加有利的组合作用。在这种情况下，将细胞与两种疗法相互之间在 大约12-24小时内接触，任选在大约6-12小时内。然而，在某些 情况下，治疗的时间显著延长，此时每次施用之间间隔几天(2、3、 4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。而且，在某些 情况下，需要施用不止一种的基于端粒酶的治疗或其它药物。

在另一个实施方案中，本发明的G-四链体结合化合物或与结合 于靶定药物的胞毒性药物组合或共价结合，所述靶定药物如单克隆抗 体(例如鼠或人源化单克隆抗体)。后一种组合可以使胞毒性药物更 特异性地导入到癌细胞中。因此，胞毒性药物的活性形式(即游离形 态)将只存在于抗体靶定的细胞中。

其它的癌症治疗也可以和施用G-四链体结合化合物组合应用。 例如，本发明的G-四链体结合化合物可以作为疗程的一部分，该疗 程进一步包括手术切除部分或全部的癌细胞。例如，本发明的G-四 链体结合剂可以在手术治疗个体后施用，来治疗任何遗留的新生或转 移细胞。本发明的G-四链体结合剂的治疗也可以在手术前，缩小肿 瘤的大小以减少要被切除的组织量，从而减少手术的创伤性。

用本发明的G-四链体结合剂治疗癌症可以进一步包括一或多 个用放疗药物诱导DNA损伤的疗程。放疗药物包括，例如γ放射、 X射线、紫外辐射、微波、电子放射、放射性同位素等等。治疗可以 通过用上述的放射方法照射定位的肿瘤位点而实现。

组合治疗也可以包括涉及肿瘤细胞表面发现的肿瘤抗原标记物 的免疫疗法。用本发明的G-四链体结合剂治疗癌症可以进一步组合 基于基因疗法的治疗，所述基因疗法靶向癌基因和/或细胞周期控制 基因，如p53、p16、p21、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、BRCA2、 FHIT、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCAl、VHL、FCC、MCC、ras、 myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl， 其在癌组织中经常是其在正常细胞中的对应物的突变形式。

可以检测本发明的G-四链体结合化合物以测定其抑制癌细胞 生长、诱导癌细胞中的胞毒性事件、诱导癌细胞凋亡、减轻肿瘤负担 及抑制转移的能力。例如，可以通过MTT检测来测量细胞生长。用 MTT方法检测生长在本领域内已熟知。在MTT分析中，细胞(例如 端粒酶阳性细胞)用不同浓度的抗癌化合物诱导，通过监测四唑盐的 有色甲 (formazan)3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物 (MTT)的形成来测定细胞活性。也可以使用其它用来测量细胞死亡的 检测方法。

体内检测可以用一个小鼠异种移植物模型来进行，例如将 OVCAR-5肿瘤细胞移植到裸鼠中，其中预期用式(I-IV)的化合物 治疗的小鼠平均在在开始给药后肿瘤块增长一段时间，但是随着治疗 继续，肿瘤块开始萎缩。相反，用对照物(例如DMSO)治疗的小鼠 预期肿瘤块持续增长。

另外，式(I-IV)化合物的体外或体内活性可以通过确定端粒 序列长度的变化来测量。例如，用式(I-IV)的化合物处理端粒酶 阳性细胞系，如HEK-293和HeLa细胞，预期可以诱导端粒长度的缩 短。预期式(I-IV)的化合物也可以在人类肿瘤细胞系例如卵巢肿 瘤细胞系OVCAR-5和SK-OV-3的细胞分裂期间诱导端粒的缩短。但 重要的是，在正常人细胞中，例如成纤维细胞来源的BJ细胞中，观 察到的端粒长度的缩短预期与用对照物例如二甲基亚砜(DMSO)处 理的细胞没有不同。

末端限制片段(TRF)分析可以用于测量端粒长度。在TRF中， 来自肿瘤细胞的DNA用特异于除了端粒T2AG3序列外的序列的限制 酶消化分析。消化DNA后，进行凝胶电泳将大小分离限制片段。然 后将分离的片段用特异于端粒序列的核酸探针探查，来确定含有样品 细胞端粒DNA的末端片段的长度。通过测量来自治疗期间患者细胞 的端粒DNA的长度，可以估计端粒酶抑制剂施用的时间要多长及是 否要应用其它的治疗方法(例如，手术、化疗和/或放疗)。

V.B治疗感染的方法

本发明的组合物和方法可以用来治疗由其它表现端粒酶活性的 生物体造成的疾病。这些有机体包括农业上致植物病生物体，包括线 虫动物，例如其中已经发现端粒酶活性的秀丽线虫(Ceanorhabditis elegans)和真菌，真菌被认为具有端粒酶活性是基于发现真菌玉蜀黍 黑粉菌(Ustilago maydis)DNA显示具有被端粒酶维持的T2AG3重复 序列的端粒。因此，本文所述的四链体结合化合物可以单独施用给被 具有端粒酶活性的致植物病生物体感染的植物和土壤或者组合其它 控制植物疾病的药物一起施用。同样，如上所讨论过的，原生动物具 有T2AG3端粒，会造成人类疾病。

确定线虫、原生动物和可能真菌具有端粒酶活性还表明了本发明 提供的G-四链体结合化合物可以用于治疗人或兽医上感兴趣的动 物如狗和猫中的线虫感染。人和动物中的线虫感染经常是十二指肠虫 或蛔虫感染的形式，造成宿主致命的二级疾病，如脑膜炎、心肌炎和 多种神经疾病。因此，可以单独施四链体结合化合物或组合端粒酶抑 制化合物和/或其它治疗化合物用于来控制人和动物中的线虫、原生 动物和真菌感染。

可以用本发明的方法治疗的原生动物感染的例子包括但不限于 由锥虫属(Trypanosoma spp.)(例如布氏罗得西亚锥虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)、布氏冈比亚锥虫(Trypanosoma brucei gambiense)、布氏布氏锥虫(Trypanosoma brucei brucei)和克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi))、疟原虫属(Plasmodium spp.)(例如恶性疟原 虫(Plasmodium falciparum))、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani) 和Leishmania mexicana amazonensis引起的感染。这里使用到的术语 锥虫属、疟原虫属和利什曼原虫属涵盖了锥虫、疟原虫和利什曼虫属 的微生物。本发明的方法可以用于治疗这些疾病，因为所述方法能抑 制所述疾病的发生、发展和传播、造成疾病消退、治愈疾病或者改善 患有所述疾病或者具有患有所述疾病风险的个体的一般健康状况。因 此，根据本发明，术语“治疗”和其它相关词汇以及“治疗方法”是 涵盖任何所希望的治疗手段，包括但不限于治疗个体中已经存在感染 的方法及预防感染的方法，例如在暴露于或有可能暴露于本文所述的 微生物的个体中存在的感染。

治疗感染的方法包括给需要的个体施用本文所述的活性化合物。 这些活性化合物如上述包括式(I-IV)的化合物、其对应的前体药 物以及所述化合物和前体药物的药物学可接受的盐。

在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物以药物学可接受的盐 的形式施用。在一些实施方案中，药物学可接受的盐包括盐酸盐。在 一些实施方案中，药物学可接受的盐包括乙酸盐。在一些实施方案中， 药物学可接受的盐包括马来酸盐。

在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物施用给已存在微生物 感染的个体。在一些实施方案中，式(I-IV)的化合物预防性施用 以防止微生物感染或者防止微生物感染的复发。因此，在一些实施方 案中，式(I-IV)的化合物预防性施用以防止或减少以下一种情况 的发生：a)处于感染风险中的个体的微生物感染；b)微生物感染的 复发；及c)其组合。

在一些实施方案中，所述个体是植物或者土壤样品。具体地，所 述植物可以是一种食用或者具有经济重要性的培育的植物。因此，所 述植物可以是蔬菜、水果或者谷物。这些植物可以包括但不限于玉米、 小麦、大豆、向日葵、燕麦、苜蓿、西红柿、土豆和水稻。土壤样品 包括其中种植或即将种植这些植物的土壤样品。

在一些实施方案中，本发明治疗的个体意指人类个体，尽管需要 理解的是本文所述的方法对所有脊椎动物都是有效的，所述脊椎动物 也包括在术语“个体”中。本文所述的方法特别用于治疗和/或预防 温血脊椎动物中的感染性疾病。因此，所述方法可以用于治疗哺乳动 物和鸟类。

更具体地，本文提供的是治疗哺乳动物，例如人类，以及那些由 于以下原因对人类重要的的哺乳动物：濒临危险(如西伯利亚虎)或 者有经济重要性(用于人类消费的饲养哺乳动物)和/或社会重要性 (动物宠物或动物园里的动物)，例如除人类外的食肉动物(如猫类 和犬类)、猪(pig、swine、hog和野猪)、反刍动物(如牛、公牛、 绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、水牛和骆驼)和马。本文也提供了治疗鸟 类的方法，所述鸟类包括那些濒临绝种的鸟、动物园里的鸟以及禽类、 特别是那些家禽，即火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等等，因为它们同样 对人类具有经济重要性。因此，本文所述方法的实施方案包括治疗家 畜，包括但不限于家猪(猪(pig和hog))、反刍动物、马、家禽等 等。

6.合成式(IV)的化合物的一般方法

以下提供的合成过程包含生产本发明化合物生产方法的代表性 实施方案。具体地，下文所示用于合成式(IV)的新化合物的方法在 图解15中描述。

在一些实施方案中，本发明提供了制备式(IV)的化合物及其药 物学可接受的盐的方法，所述方法包括：

a)将硒吩(selenophene)和碲吩(tellurophene)之一与N-溴 代丁二酰亚胺(NBS)接触形成一溴化物；

b)将硒吩或碲吩之一与正丁基锂接触，然后再与氯化三烷基 锡接触形成2，5-双(三烷基锡)化合物；

c)在钯催化剂存在下，将所述2，5-双(三烷基锡)化合物与两摩 尔当量的一溴化物接触形成三芳基化合物；

d)将所述三芳基化合物与NBS接触形成二溴化物；

e)将所述二溴化物与氰化铜接触形成二腈；

f)将所述二腈与以下之一接触：

i)盐酸羟胺(hydroxylamine hydrochloride)和一个碱形成式 (IV)的双脒肟(bis-amidoxime)；

ii)强酸和醇，接着二胺形成式(IV)的双咪唑。

在一些实施方案中，上述方法进一步包括将双脒肟与乙酸和乙酐 接触，随后和氢，在碳催化剂上的钯及质子溶剂接触形成式(IV)双 脒。

在一些实施方案中，氯化三烷基锡包括三正丁基锡氯化物。

在一些实施方案中，碱包括叔丁醇钾。

在一些实施方案中，强酸包括盐酸。

在一些实施方案中，醇包括烷基醇。在一些实施方案中，烷基醇 选自乙醇和甲醇。

在一些实施方案中，钯催化剂包括四(三苯膦)钯。

因此上述方法提供了式(IV)的三-硒吩和三-碲吩公化合物，以 及同时包含三-硒吩和三-碲吩环的式(IV)的化合物。所述方法也可 以修饰，一或多个呋喃、噻吩或吡咯化合物可以被一或两个硒吩或碲 吩环取代形成含有不同杂芳基(heteroaryl)组合的式(IV)的化合物。 例如，2，5-双(三烷基锡)硒吩可以与两摩尔当量的溴代呋喃 (bromofuran)接触形成包含2，5-双(呋喃基)硒吩 (2，5-bis(furanyl)selenophene)的三芳基结构。

实施例

以下实施例用于给本领域技术人员提供实践本发明的代表性实 施方案的指导。根据本发明和本领域中的一般知识，本领域技术人员 可知以下实施例只是示例性的，在不偏离本发明范围的情况下，可以 进行很多变化、修饰和改变。

合成方法和材料

熔点用Thomas-Hoover(Uni-Melt)毛细管熔点仪器记录，未被修 正。TLC分析在硅胶60 F254预涂层的铝片上进行并在UV光下监测。 1H和13C NMR光谱用Varian Unity Plus 300分光计记录，相对于作为 内标的TMS的化学移位(δ)以ppm为单位。质谱用VG analytical 70-SE 分光计记录。元素分析得自Atlantic Microlab Inc.(Norcross，Georgia， United States of America)或者GSU CHN unit，在理论值±0.4范围内。 所有的化学品和试剂都购自Aldrich Chemical Co.，Fisher Scientific。

Furamidine的合成已经被描述过。见 Das，B.P.，and Boykin，D.W.， J. Med.Chem.，20，531-536(1977)。用于制备本发明化合物包括化合物 46-48、50-51和53的特异合成的合成方法也被描述过。见 Czamy，A.， et al.，J. Heterocycl.Chem.，33，1393-1397(1996)； Hopkins，K.T.，et al.， J. Med.Chem.，41，3872-3878(1998)； Lansiaux，A.，et al.，J. Med.Chem.， 45，1994-2002(2002)； Boykin，D.W.，et al的U.S.Published Patent Application No.20050148646；和 Boykin，D.W.，et al 的published PCT application WO 2005/086808。合成类似于化合物49的三呋喃(trifuran) 和三噻吩(trithiophene)化合物的方法也描述过了。见 Bilik，P.，et al.， CHEMBIOCHEM，2，559-569(2001)。本发明其它化合物的合成将在下 文描述。

实施例1

5’-(4-脒苯基)-2，2’-双呋喃-5-羧脒(5′-(4-Amidinophenyl)-2，2′-bifuran- 5-carboxamidine)

试剂和条件：(i)NBS，DMF；(ii)2-三丁基锡呋喃，Pd(PPh3)4；(iii)CuCN，DMF，110-120℃；(iv) NH2OH·HCl，KO-t-Bu，DMSO；(v)AcOH/Ac20；(vi)H2/Pd-C，AcOH.

图解5.合成5’-(4-脒苯基)-2，2’-双呋喃-5-羧脒

4-(5-溴代呋喃-2-基)-苄腈(2)。参照上述图解5，向于DMF中的1(8.45 g，50mmol)的溶液(30mL)中边搅拌边一部分一部分地加入N-溴丁 二酰亚胺(NBS，9.79g，55mmol)。反应混合物搅拌过夜，然后倒入冷 水中。收集形成的沉淀，水洗并且干燥，得到分析纯产物2，产量 94.2％，mp 94-94.5℃。1H NMR(CDCl3)；δ6.45(d，J＝3.6Hz，1H)，6.76 (d，J＝3.6Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，2H)，7.70(d，J＝8.4Hz，2H)。13C NMR(CDCl3)；δ153.7，133.5，132.6，123.8，123.6，118.7，114.0，110.7， 110.3。EIMS(m/z，rel.int.)；247(M+，50)，140(100)，113(10)。 C11H6BrNO的计算值：C，53.26；H，2.44；N，5.64。发现C，53.22；H，2.43； N，5.59。

4-(2，2′-双呋喃-5-基)-苄腈(3).2(2.48g，10mmol)、2-三丁基锡呋喃 (3.58g，10mmol)和四(三苯膦)钯(200mg)在干二噁烷中的混合物(60 mL)在氮气下回流加热(100-110℃)24小时。溶剂在减压下浓缩，形成 的固体溶于乙酸乙酯。这个溶液通过C盐(celite)除掉Pd。溶液蒸 发，通过过滤收集固体，并用己烷洗涤得到化合物3，产量79.5％， mp 104-105℃。1H NMR(CDCl3)；δ6.51(dd，J＝3.6Hz，J＝1.8Hz，1H)， 6.68(m，2H)，6.87(d，J＝3.6Hz，1H)，7.46(d，J＝1.8Hz，1H)，7.66(d，J ＝8.4Hz，2H)，7.77(d，J＝8.4Hz，2H)。13C NMR(CDCl3)；δ150.9， 147.5，145.8，142.4，134.1，132.5，123.7，118.9，111.6，110.1，107.5， 106.3。EIMS(m/z，rel.int.)；235(M+，100)，206(10)，178(15)。C15H9NO2 的计算值：C，76.59；H，3.86；N，5.95。发现C，76.35；H，3.88；N，5.92。

4-(5′-溴-2，2′-双呋喃-5-基)-苄腈(4).  与2的过程相同，起始物用3。

产量65％，mp 127℃。1H NMR(CDCl3)；δ 6.42(d，J＝3.6Hz，1H)，6.63 (d，J＝3.6Hz，1H)，6.68(d，J＝3.6Hz，1H)，6.86(d，J＝3.6Hz，1H)， 7.66(d，J＝8.4Hz，2H)，7.76(d，J＝8.4Hz，2H)。13C NMR(CDCl3)；δ 151.2，147.6，146.2，134.0，132.5，124.0，123.8，122.3，113.4，110.4，110.0， 108.4，108.1。EIMS(m/z，rel.int.)；314(M+，40)，234(10)，206(100)。 C15H8BrNO2的计算值：C；57.32，H；2.56；N，4.46。发现C；56.93，H； 2.55；N，4.39。

5′-(4-氰苯基)-2，2′-双呋喃-5-腈(5).4(740mg，2.35mmol)和Cu(I)CN (423mg，4.7mmol)的混合物(于干DMF(25mL)中)回流48小时。 反应混合物倒入水/氨中并用二氯甲烷萃取。萃取物用水和盐水冲洗， 在Na2SO4上干燥，然后通过硅胶得到分析纯的产物5，产量40％， mp 194-195℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.17(d，J＝3.6Hz，1H)，7.21(d， J＝3.6Hz，1H)，7.43(d，J＝3.6Hz，1H)，7.76(d，J＝3.6Hz，1H)，7.91(d， J＝8.4Hz，2H)，7.99(d，J＝8.4Hz，2H)。13C NMR(DMSO-d6)；δ152.3， 149.3，144.3，133.0，132.9，125.6，124.3，124.1，118.7，112.0，111.8，111.5， 110.0，107.9。EIMS(m/z，rel.int.)；260(M+，100)，231(15)，203(25)，177 (25)，140(10)，130(55)。C16H8N2O2的计算值：C，73.84；H，3.09；N， 10.76。发现C，73.62；H，3.18；N，10.92。

N-羟基-5′-[4-(N-羟脒基)-苯基]-2，2′-双呋喃-5-羧脒(6).盐酸羟胺 (695mg，10mmol，10eq.)在无水DMSO(8mL)中的混合物在氮气下 冷却倒5℃，一份份加入叔丁醇钾(1120mg，10mmol，10eq.)。混合物 搅拌30分钟。这个混合物加入到双-氰衍生物5(260mg，1mmol，1eq.) 中。反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物缓慢倒入冰水 (20mL水和20mL冰)中。过滤沉淀，水洗，加入乙醇得到6(游离 碱)，产量93％，mp 205-206℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ5.83(br s，4H)， 6.86-6.89(m，3H)，7.14(s，1H)，7.75(s，4H)，9.70(s，1H)，9.75(s，1H)。 13C NMR(DMSO-d6)；δ152.3，150.3，146.7，145.0，144.9，144.1，132.3， 129.9，125.8，123.1，109.7，108.5，107.2。EIMS(m/z，rel.int.)；327(M++1， 40)，307(100)，299(60)，273(10)，220(30)。计算的C16H15N4O4高分辨 (High resolution)ms 327.10933。观测到327.11373。

N-乙酰氧基-5′-[4-(N-乙酰氧基脒基)-苯基]-2，2′-双呋喃-5-羧脒(7).往 6(262mg，0.8mmol)的冰乙酸(8mL)溶液中缓慢加入乙酸酐(0.28 mL)。搅拌过夜后，TLC显示起始物质被完全酰化。反应混合物倒入 冰水中，过滤沉淀，水洗，干燥得到化合物7，产量89％，mp 212-213 ℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ2.17(s，6H)，6.85(br s，4H)，.6.98(d，J＝3.6 Hz，1H)，7.00(d，J＝3.6Hz，1H)，7.14(d，J＝3.6Hz，1H)，7.24(d，J＝ 3.6Hz，1H)，7.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.87(d，J＝8.4Hz，2H)。13C NMR (DMSO-d6)；δ168.4，168.1，155.8，152.4，148.9，146.1，144.8，144.3， 131.2，130.6，127.2，123.3，113.1，109.6，109.3，107.6，19.8，19.7。 C20H18N4O6的计算值：C，58.53；H，4.42。发现C，58.71；H，4.50。

5′-(4-脒基苯基)-2，2′-双呋喃-5-羧脒乙酸盐(8a).往7(246mg，0.6mmol) 的冰乙酸(8mL)和乙醇(20mL)溶液中加入10％碳载钯(60mg)。混合物 置于Parr氢化装置上在50psi和室温下4小时。混合物用hyflo过滤， 滤垫用水洗。过滤物在减压下蒸发，收集沉淀，用醚洗，得到8a， 产量67％，mp 240-242℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ1.80(s，2×CH3)， 7.06(d，J＝3.6Hz，1H)，7.11(d，J＝3.6Hz，1H)，7.36(d，J＝3.6Hz，1H)， 7.39(d，J＝3.6Hz，1H)，7.89(d，J＝8.4Hz，2H)，7.98(d，J＝8.4Hz， 2H)。C16H14N4O2-2.0AcOH-2.4H2O的计算值：C，52.48；H，5.87；N， 12.23。发现C，52.28；H，5.49；N，11.91。

5′-(4-脒基苯基)-2，2′-双呋喃-5-羧脒(8).将乙酸盐(50mg)溶于水(5mL) 中并用1N NaOH中和来制备8a的游离碱。过滤沉淀，干燥得到游离 脒8，mp 202-203.5℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ6.93(d，J＝3.6Hz，1H)， 7.01(d，J＝3.6Hz，1H)，7.11(d，J＝3.6Hz，1H)，7.7.22(d，J＝3.6Hz， 1H)，7.83(s，4H)。13C NMR(DMSO-d6)；δ162.2，153.9，152.4，147.4， 145.7，145.0，134.1，131.1，127.3，123.1，111.9，109.4，109.2，107.7。 EIMS(m/z，rel.int.)；294(M+，50)，277(100)，261(25)。C16H14N4O2的计 算的高分辨质量(High resolution mass)：294.11168。观测到： 294.11013。

实施例2

6-(5′-脒基-2，2′-双呋喃-5-基)-烟酰脒(6-(5’-Amidino-2，2’-bifuran-5-yl)- nicotinamidine)

试剂和条件：(i)2-三丁基锡呋喃，Pd(PPh3)4；(ii)NBS，DMF；(iii)CuCN，DMF110-120℃；(iv) NH2OH·HCl，KO-t-Bu，DMSO；(v)a)AcOH/Ac2O；b)H2/Pd-C，AcOH。

图解6.合成6-(5′-脒基-2，2′-双呋喃-5-基)-烟酰脒 6-(2，2′-双呋喃-5-基)-烟酰腈(6-(2，2′-Bifuran-5-yl)-nicotinonitrile)(10). 参照图解6，过程和3的相同，起始物用9。产量78％，mp 169-170 ℃。1H NMR(CDCl3)；δ6.52(dd，J＝3.6Hz，J＝1.8Hz，1H)，6.74(m， 2H)，7.31(d，J＝3.6Hz，1H)，7.49(d，J＝1.8Hz，1H)，7.79(d，J＝8.4Hz， 1H)，7.95(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，8.80(d，J＝2.1Hz，1H)。13C NMR；δ 152.5，151.3，151.0，148.7，145.5，142.9，139.6，117.6，117.0，114.3，111.7， 108.1，107.1，106.6。C14H8N2O2计算值：C，71.18；H，3.41；N，11.85。发 现C，70.83；H，3.61；N，11.84.

6-(5′-溴-2，2′-双呋喃-5-基)-烟酰腈(11).过程和4的相同，起始物用 10。产量58％，mp 143-145℃。1H NMR(CDCl3)；δ 6.44(d，J＝3.6Hz， 1H)，6.70(d，J＝3.6Hz，1H)，6.75(d，J＝3.6Hz，1H)，7.30(d，J＝3.6Hz， 1H)，7.79(d，J＝8.4Hz，1H)，7.95(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，8.80(d，J＝ 2.1Hz，1H)。13C NMR；δ152.5，151.2，151.1，147.5，147.3，139.7，122.8， 117.7，117.0，114.3，113.5，109.3，108.6，106.9。MS(m/z，rel.int.)；314 (M+，60)，285(10)，235(20)，207(100)，179(10)。C14H7BrN2O2的计算 的高分辨ms 313.96909。观测到313.96614。

6-(5′-氰基-2，2′双呋喃-5-基)-烟酰腈(12).过程和5的相同，起始物用 11。产量27％，mp 209-210.5℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.23(d，J＝3.6 Hz，1H)，7.27(d，J＝3.6Hz，1H)，7.52(d，J＝3.6Hz，1H)，7.79(d，J＝ 3.6Hz，1H)，8.04(d，J＝8.4Hz，1H)，8.39(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，9.03 (d，J＝2.4Hz，1H)。Anal.(C15H7N3O2)C，H.

N-羟基-6-[5′-(N-羟基脒基)-2，2′-双呋喃-5-基]-烟酰脒(13).过程和6的 相同，起始物用12。产量89％，mp 248-250℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ 5.88(s，2H)，6.04(s，2H)，6.92-6.96(m，3H)，7.29(d，J＝3.6Hz，1H)， 7.84(d，J＝8.4Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，8.88(d，J＝2.1 Hz，1H)，9.80(s，1H)，9.92(s，1H)。13C NMR；δ152.2，148.7，147.8， 147.0，146.6，146.0，144.6，144.0，133.6，127.3，117.7，111.3，109.7，108.5， 107.9。MS(m/z，rel.int.)；327(M+，15)，311(5)，295(10)，278(85)，261 (100)。计算的C15H13N5O4高分辨ms 327.09675。观测到327.09742。

6-(5′-脒基-2，2′-双呋喃-5-基)-烟酰脒乙酸盐(14).类似于8a，使用碳 载钯还原。产量59％，mp 269-271℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ1.8(s， 2×CH3)，7.15(d，J＝3.6Hz，1H)，7.23(d，J＝3.6Hz，1H)，7.47(d，J＝3.6 Hz，1H)，7.57(d，J＝3.6Hz，1H)，8.04(d，J＝8.4Hz，1H)，8.30(d，J＝ 8.4Hz，1H)，8.99(s，1H)。MS(m/z，rel.int.硫甘油)；296(M++1，100)， 273(12)，239(40)。计算的C15H14N5O2高分辨ms 296.1147。观测到 296.1189。计算的C15H13N5O2-2.0AcOH-2.65H2O-0.5EtOH：C，49.41；H， 6.07；N，14.40。发现C，49.72；H，5.96；N，14.02。

实施例3

5，5′-双-(4-N-羟基苄脒)-2，2′-双呋喃(16)和5，5′-双-(4-脒基苯 基)-2，2′-双呋喃盐酸盐(17)

试剂和条件：(i)Pd(PPh3)4，Na2CO3，甲苯，80℃，24h；(ii)双(三丁基锡)，Pd(PPh3)4，甲苯，120 ℃，4h；(iii)a)LiN(TMS)2，THF，r.t.，过夜；b)HCl(气体)，干乙醇，r.t.，过夜；(iv)a)HCl，EtOH； b)NH3，EtOH；(v)NH2OH·HCl，KO-t-Bu，DMSO，r.t.，过夜。

图解7.合成5，5′-双-(4-N-羟基苄脒)-2，2′-双呋喃(16)和5，5′-双 -(4-脒基苯基)-2，2′-双呋喃盐酸盐(17)

5，5′-bis-(4-氰基苯基)-2，2′-双呋喃(15)

方法(i)：参照图解7，在氮气下往搅拌的4(1.256g，4mmol)和四 (三苯膦)钯(230mg)在甲苯(8mL)的溶液中加入4mL的2M Na2CO3水 溶液，接着加入于4mL甲醇中的4-氰基苯基硼酸(4-cyanophenyl boronic acid)(658mg，4.8mmol)溶液。用力搅拌的混合物加热到80 ℃24小时，然后冷却，过滤沉淀。沉淀在二氯甲烷(250mL)和含2.4mL 浓缩氨的2M Na2CO3水溶液(20mL)中分配。干燥有机层(Na2SO4)，然 后在减压下浓缩干燥得到15，产量52％，mp 298-299℃(DMF)。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.09(d，J＝3.6Hz，2H)，7.39(d，J＝3.6Hz，2H)， 7.89(d，J＝8.1Hz，4H)，7.97(d，J＝8.1Hz，4H)。13C NMR；δ151.1， 145.8，133.3，132.7，123.8，118.6，111.4，109.45，109.40。MS(m/z， rel.int.)；336(M+，100)，307(5)，279(5)，206(15)，168(15)。计算的 C22H12N2O2高分辨ms 336.08988。观测到336.08978。计算的 C22H12N2O2-0.75H2O：C，75.52；H，3.86；N，8.00。发现C，75.12；H，3.48； N，7.74。

方法(ii)：Stille均相偶联(Stille homocoupling)，使用双(n-三丁 基锡)为催化剂，类似于合成3中所述的Stille偶联(Stille coupling)， 产量78％。

5，5′-双-(4-N-羟基苄脒)-2，2′-双呋喃(16).过程和6的相同，起始物用 15。16的游离碱，产量82％；mp 309℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ5.86(s， 4H)，6.97(d，J＝3.6Hz，2H)，7.17(d，J＝3.6Hz，2H)，7.76(d，J＝8.4Hz， 4H)，7.80(d，J＝8.4Hz，4H)，9.72(s，2H)。13C NMR；δ152.3，150.3， 145.2，132.3，129.9，125.8，123.1，108.6，108.5。MS(m/z，rel.int.)；403 (M++1，90)，388(15)，370(10)，201(100)。16的盐酸盐.mp＞320℃。 计算的C22H18N4O4-2.0HCl-1.0H2O：C，53.56；H，4.49；N，14.37；Cl， 14.37。发现C，53.52；H，4.40；N，11.00；Cl，14.13。

5，5′-双-(4-脒基苯基)-2，2′-双呋喃盐酸盐(17).

方法(iii)：使用锂-酰胺(Li-amide)方法制备，产量90％，起始 物用15。二腈化合物15(1.67mmol)，悬浮在新蒸馏的THF(5mL)中， 用三甲基甲硅烷酰胺锂(lithium trimethylsilylamide)(THF中的2％溶 液，3.67mmol)处理并且反应搅拌过夜。反应混合物然后冷却到0℃ 并在开始形成沉淀时加入HCl(g)饱和乙醇。反应过夜，然后用醚稀释， 形成的固体过滤后获得二脒盐。

方法(iv)：用Pinner方法从15制备。见 Das，B.P. and  D.W. Boykin，J.Med.Chem.，20，531-536(1977)； McFarland，J.W.and H.L. Howes，Jr.，J.Med.Chem.，15，365-368(1972)。产量30％，mp 325-327.5 ℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.16(d，J＝3.6Hz，2H)，7.47(d，J＝3.6Hz， 2H)，7.96(d，J＝8.4Hz，4H)，8.05(d，J＝8.4Hz，4H)，9.17(s，2H)，9.45 (s，2H)。13C NMR；δ 164.7，151.4，145.9，134.1，129.0，126.3，123.5， 111.4，109.5。MS(m/z，rel.int.)；371(8)，337(50)，201(100)。计算的 C22H18N4O2-2.0HCl-1.0H2O：C，57.28；H，4.75；N，12.03。发现C，57.56； H，4.75；N，12.03。

实施例4

5，5’-双-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]-2，2’-双呋喃马来酸盐

(5，5’-Bis-[4-(N-methoxyamidino)phenyl]-2，2’-bifuran Maleate)(19)

试剂和条件：(i)NBS，DMF；(ii)a)NH2OH·HCl，KO-t-Bu，DMSO；b)LiOH，(Me)2SO4，二噁烷 /DMSO；(iii)(Bu3Sn)2，Pd(PPh3)4，甲苯，120℃，3h。

图解8.合成5，5’-双-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]-2，2’-双呋喃马来酸盐(19) 2-溴-5-(4-氰基苯基)呋喃(2).参考图解8，往冷冻(冰/水浴)的2-(4- 氰基苯基)呋喃(28.25g，0.167mol)的DMF(100mL)溶液中一份份地边 搅拌边加入NBS(31.20g，1.05eq.，从硝基甲烷中新结晶的)(大约40 分钟加入约1g)。将得到的溶液在室温下搅拌2小时，此时TLC显示 了起始物的消耗。在反应过程中，颜色由黄变橙，最后到红色。然后 溶液用水(大约300ml)稀释得到粉红/红色固体，收集、水洗并空 气干燥。产量39.0g，94％。从MeOH/水重结晶出的小量样品呈淡红 色结晶固体，mp 96.5-97℃。1H NMR(DMSO-d6)：6.80(d，J＝3.6Hz， 1H)，7.29(d，J＝3.6Hz，1H)，7.87(m，4H)。IR(cm-1)：3142，3128，3060， 2226，1613，1515，1475，1015，929，833，787，545。

2-溴-5-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]呋喃(18).  往冰冷的盐酸羟胺(17.25g， 0.25mol)的DMSO(150ml)溶液中一份份地加入KO-t-Bu(28.0g， 0.25mol)并将混合物在氮气下搅拌30分钟。然后加入2-溴-5-(4-氰基 苯基)呋喃(17.37g，0.07mol)，混合物在室温下搅拌过夜。得到的溶液 用过量的水稀释得到2-溴-5-[4-(N-羟基脒基)苯基]呋喃白色固体，收 集并水洗。产量19.45g，99％；mp 162-164℃。1H NMR(DMSO-d6)： 5.84(broad s，2H)，6.71(d，J＝3.6Hz，1H)，7.05(d，J＝3.6Hz，1H)，7.65 (d，J＝8.4Hz，2H)，7.72(d，J＝8.4Hz，2H)，9.70(s，1H)。IR(cm-1)：3475， 3369，3209(broad)，1639，1482，1341，1017，927，787。中间产物脒肟 (38.9g，0.138mol)溶于DMSO(60ml)和二噁烷(300ml)的混合物中， 冷冻，用于水(60ml)中的LiOH水合物(11.61g，0.277mol)溶液处理。 在室温下，得到的悬液一滴滴通过添加漏斗(addition funnel)用二甲 基硫酸盐(26.18g.0.208mol)处理，大约30分钟。之后，混合物轻微 发热，固体溶解。搅拌过夜后，混合物用过量水溶解，用EtOAc萃 取。用硅胶柱层析纯化滤渣，用含10％EtOAc的己烷洗脱得到略微不 纯的产物，再多批经过在MeOH/水中重结晶进一步纯化得到白色固 体，mp 116-117℃。产量28.0g，69％。1H NMR(DMSO-d6，立体异构 体的表观混合物(apparent mixture))：3.74(2s，3H)，6.09(broad s，2H)， 6.72(2d，J＝3.6Hz，1H)，7.09(2d，J＝3.6Hz，1H)，7.70(m，4H)。IR (cm-1)：3459，3312，3177，2957，2935，2901，2818，1634，1403，1051，910， 842，785。

5，5’-双-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]-2，2’-双呋喃(19).于甲苯(400ml)中 的2-溴-5-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]呋喃(27.90g，94.5mmol)、六-n-丁基 二锡(28.37g，48.9mmol)和四(三苯膦)钯(0)(1.40g，1.2mmol)的混合 物在氮气下油浴加热到120℃3小时，然后冷却到室温。放置1小时 后，收集生成的沉淀，用二乙醚洗涤，得到黄色绒毛状固体(12.25g， 60％)。产物通过溶于热DMF(100ml)中然后加入MeOH(200ml)重结 晶。冰冷几个小时后，收集产物并用MeOH洗涤，得到细的黄色结 晶固体，mp 258-259℃。产量10.75g，53％。1H NMR(DMSO-d6)：3.76 (s，6H)，6.11(br s，4H)，6.99(d，J＝3.6Hz，2H)，7.20(d，J＝3.6Hz，2H)， 7.73(d，J＝8.7Hz，4H)，7.80(d，J＝8.7Hz，4H)。13C NMR(DMSO-d6)： 60.6，108.5，108.8，123.1，126.2，130.3，131.4，145.2，150.5，152.2。IR (em-1)：3520，3412，3125，2991，2961，2897，2817，1622，1415，1402， 1056，904，842，789。MS(EI)：m/z 431(MH+)。分析计算的C24H22N4O4 (430.46)：C，66.96；H，5.15；N，13.02。发现：C，66.91；H，5.14；N， 13.01。

5，5’-双-[4-(N-甲氧基脒基)苯基]-2，2’-双呋喃马来酸盐(19a).游离碱 (8.61g，20.0mmol)和马来酸(2.33g，20.0mmol)在EtOH(200ml)中50-60 ℃下加热过夜，然后回流30分钟。悬液在真空中浓缩，残渣用二乙 醚粉碎，过滤并在50-60℃真空干燥24小时，得到绒毛状黄色固体 (10.50g)。燃烧分析表明只有0.8摩尔当量的马来酸存在于产物中。1H NMR(DMSO-d6)：3.76(s，6H)，6.23(broad s)和6.24(s)：马来酸乙烯基 H与2NH2重叠，预期的整合0.83％，6.99(d，J＝3.6Hz，2H)，7.21(d，J ＝3.6Hz，2H)，7.74(d，J＝8.7Hz，4H)，7.82(d，J＝8.7Hz，4H)。计算的 C24H22N4O4-0.8C4H4O4(523.32)：C，62.42；H，4.85；N，10.71。发现： C，62.72；H，4.94；N，10.74。

实施例5

5，5’-双-(5-脒基-2-吡啶基)-2，2’-双呋喃(22)和5，5’-双-[5-(N-甲氧 基脒基)-2-吡啶基]-2，2’-双呋喃(23)

试剂和条件：(i)双(三丁基锡)，Pd(PPh3)4，甲苯，120℃，4h；(ii)a)LiN(TMS)2，THF，r.t.，过夜； b)HCl(气体)，干乙醇，r.t.，过夜。

图解9.合成化合物22和23.

化合物20.参照图解9，化合物20通过9的Stille均相偶联(Stille homocoupling)制备，类似于从2合成15。产量81％，mp＞300℃。 1H NMR(DMSO-d6)；δ7.17(d，J＝3.6Hz，2H)，7.48(d，J＝3.6Hz，2H)， 8.00(d，J＝8.1Hz，2H)，8.31(dd，J＝8.1，2.1Hz，2H)，8.98(d，J＝2.1 Hz，2H)。13C NMR；δ152.3，151.5，149.9，146.5，140.3，117.9，116.6， 114.2，110.1，106.4。MS(m/z，rel.int.)；339(M++1，100)，319(15)，277 (10)。

5，5’-双-(5-脒基-2-吡啶基)-2，2’-双呋喃(22).类似于17，用LiN(TMS)2 进行腈反应。产量92％，mp＞300℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ7.21 (d，J＝3.6Hz，2H)，7.52(d，J＝3.6Hz，2H)，8.07(d，J＝8.4Hz，2H)， 8.31(dd，J＝8.4，2.1Hz，2H)，9.00(d，J＝2.1Hz，2H)。13C NMR；δ164.1， 152.2，151.9，149.3，147.3，137.7，122.5，118.8，114.9，110.9。MS(m/z， rel.int.)；373  (M++1，60)，356 (5)，187(100)。计算的 C20H16N6O2-4.0HCl-0.75H2O：C，45.17；H，4.08；N，15.80。发现C，45.17； H，4.25；N，15.53。

5，5’-双-[5-(N-甲氧基脒基)-2-吡啶基]-2，2’-双呋喃(23).类似于19的 Stille均相偶联。游离碱产量95％，mp 292-294℃。1H NMR(DMSO-d6)； δ3.80(s，6H)，6.07(s，4H)，7.06(d，J＝3.6Hz，2H)，7.30(d，J＝3.6Hz， 2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，8.11(d，J＝8.4Hz，2H)，8.88(s，2H)。13C NMR；δ152.4，148.8，148.0，146.7，145.8，133.7，126.4，117.5，111.3， 109.0，60.4。MS(m/z，rel.int.)；432(M+，100)，3 85(20)，370(60)。 23的盐酸盐：mp 254-256℃。计算的C22H20N6O4-4.0HCl-2.5H2O：C， 42.39；H，4.68；N，13.48。发现C，42.32；H，4.52；N，13.35。

实施例6

5，5’-双-(4-脒基苯基)-2，2’-并噻吩(26a)和5，5’-双-(4-脒基-2-吡啶 基)-2，2’-并噻吩(26b)

试剂和条件：(i)双(三丁基锡)，Pd(PPh3)4，甲苯，120℃，4h；(ii)a)LiN(TMS)2，THF，r.t，过夜； b)HCl(气体)，干乙醇，r.t.，过夜。

图解10.合成化合物26a和26b.

化合物25a.参照图解10，25a通过24a的Stille均相偶联制备。产 量91％，mp 298-300℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.45(d，J＝4.2Hz，2H)， 7.68(d，J＝4.2Hz，2H)，7.85-7.89(m，8H)。13C NMR；δ140.3，137.0， 132.5，126.8，125.7，125.4，118.0，109.6。计算的C22H12N2S2：C，71.71；H， 3.28。发现C，71.48；H，3.40。

化合物25b.通过24b的Stille均相偶联制备。产量85％，mp 300℃。 1H NMR(DMSO-d6)；δ7.53(d，J＝4.2Hz，2H)，7.94(d，J＝4.2Hz，2H)， 8.07(d，J＝8.1Hz，2H)，8.23(d，J＝8.1Hz，2H)，8.90(s，2H)。MS(m/z， rel.int.)；370(M+，100)，337(30)，305(5)，292(5)，223(20)，185(60)， 163(80)。计算的C20H10N4S2：C，64.84；H，2.72。计算的C，64.59；H， 2.88。

5，5’-双-(4-脒基苯基)-2，2’-并噻吩(26a).用LiN(TMS)2进行25a的腈 反应。产量73％，mp＞300℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ7.52(d，J＝ 3.9Hz，2H)，7.75(d，J＝3.9Hz，2H)，7.88(d，J＝8.4Hz，4H)，7.94(d，J ＝8.4Hz，4H)。13C NMR；δ165.6，141.3，138.8，137.8，129.4，127.7， 126.7，126.0。MS(m/z，rel.int.)；403(M++1，20)，386(25)，368(40)，185 (95)，171(100)。计算的C22H18N4S2-2.0HCl-2.4H2O：C，51.05；H，4.79；N， 10.80。发现C，51.12；H，4.57；N，10.50。

5，5’-双-(4-脒基-2-吡啶基)-2，2’-并噻吩(26b).用LiN(TMS)2进行25b 的腈反应。产量89％，mp＞300℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ7.55(d， J＝3.9Hz，2H)，7.94(d，J＝3.9Hz，2H)，8.09(d，J＝8.4Hz，2H)，8.24 (dd，J＝8.4，2.1Hz，2H)，8.93(d，J＝2.1Hz，2H)。MS(m/z，rel.int.)；405 (M++1，50)，23 1(15)，203(100)。计算的C20H16N6S2-4.0HCl-0.75H2O：C， 42.60；H，3.84；N，14.90。发现C，42.56；H，3.83；N，14.66。

实施例7

5，5’-双-(4-脒基苯基)-2，2’-并硒吩(5，5’-Bis-(4-amidinophenyl)-2， 2’-biselenophene)(29a)和5，5’-双-(4-脒基-2-吡啶基)-2，2’-并硒吩(29b)

试剂和条件：(i)双(三丁基锡)，Pd(PPh3)4，甲苯，120℃，4h；(ii)a)LiN(TMS)2，THF，r.t.，过 夜；b)HCl(气体)，干乙醇，r.t，过夜.

图解11.合成化合物29a和29b.

化合物28a.参照图解11，通过27a的Stille均相偶联制备28a。产 量92％，mp 285-286.5℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.52(d，J＝3.9Hz，2H)， 7.76-7.84(m，10H)。 13C NMR；δ146.6，144.5，139.2，132.6，129.1，128.6， 125.9，118.2，109.6。MS(m/z，rel.int.)；462(M+，90)，464(M++2，100)， 384(5)，302(15)。计算的C22H12N2Se2：C，57.16；H，2.62。发现C，56.98； H，2.63。

化合物28b.27b的Stille均相偶联。产量85％，mp＞300℃。1H NMR (DMSO-d6)；δ7.62(d，J＝3.9Hz，2H)，7.98-8.30(m，6H)，8.93(d，J＝ 2.1Hz，2H)。MS(m/z，rel.int.)；464(M+，60)，466(M++2，100)，385(25)， 305(40)。

5，5’-双-(4-脒基苯基)-2，2’-并硒吩(29a).28a的腈还原反应类似于17 的制备。产量80％，mp＞300℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ7.46(d，J ＝3.9Hz，2H)，7.72-7.82(m，10H)。13C NMR；δ165.4，147.4，145.1， 140.6，129.5，129.3，129.2，126.9，126.3。MS(m/z，rel.int.)；496(M+，10)， 498(M++2，20)，250(100)。计算的C22H18N4Se2-2.0HCl-1.5H2O：C， 44.31；H，3.90；N，9.36。发现C，44.28；H，3.90；N，9.13。

5，5’-双-(4-脒基-2-吡啶基)-2，2’-并硒吩(29b).28b的腈还原反应类似 于17的制备。产量71％，mp＞300℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ7.50 (s，2H)，7.91-8.09(m，6H)，8.77(s，2H)。MS(m/z，rel.int.)；499(M++1， 25)，484(15)，290(30)，251(100)。计算的C20H16N6Se2-3.0HCl-0.4EtOH： C，39.90；H，3.41；N，13.40。发现C，39.98；H，3.19；N，13.07。

实施例8

化合物32和33

试剂和条件：(i)DMF/POCl3；(ii)3，4-二氨基苄腈，1，4-苯醌；(iii)NH2OH·HCl，KO-t-Bu， DMSO；(iv)a)AcOH/Ac2O；b)H2/Pd-C，AcOH。

图解12.合成化合物32和33.

化合物30.参照图解12，新蒸馏的DMF(4.2mL)在冰浴中搅拌，一 滴滴用POCl3(14mL)处理，然后一滴滴加入于二氯甲烷(12mL)中 的3(1.645g，7mmol)。反应混合物在60℃加热搅拌2小时。二氯甲 烷在减压下蒸馏去除，剩余的溶液倒入冰水，产物萃取入EtOAc。萃 取物干燥，蒸发得到30，产量85.7％，mp 176℃。1H NMR(CDCl3)；δ 6.86(d，J＝3.9Hz，1H)，6.95(d，J＝3.6Hz，1H)，7.03(d，J＝3.6Hz，1H)， 7.35(d，J＝3.9Hz，1H)，7.70(d，J＝8.4Hz，2H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)， 9.66(s，1H)。13C NMR；δ176.9，153.1，151.9，150.4，145.5，133.5，132.6， 124.2，123.3，118.6，111.9，111.1，110.4，108.2。计算的C16H9NO3：C， 73.00；H，3.44；N，5.32。发现C，73.09；H，3.58；N，5.25。

化合物31.于乙醇(25mL)中的30(526mg，2mmol)、3，4-二氨基苄腈 (266mg，2mmol)和苯醌(216mg，2mmol)的溶液在氮气下回流过夜。反 应混合物在减压下蒸馏。残余物用醚粉碎，过滤得到31，79.7％，mp 295-296℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ7.10(d，J＝3.6Hz，1H)，7.17(d，J＝ 3.6Hz，1H)，7.44(d，J＝3.6Hz，2H)，7.62(d，J＝7.2Hz，1H)，7.69(d，J ＝7.5Hz，0.5H)，7.80(d，J＝7.2Hz，0.5H)，8.18(s，1H)，13.58(s，1H)。 13C NMR(DMSO-d6)；δ151.5，146.6，145.6，144.2，133.3，132.9，124.0， 119.9，118.8，114.3，111.6，110.1，109.6，109.3，104.2。EIMS(m/z， rel.int.)；376(M+，100)，319(5)，246(10)，218(10)，188(15)。计算的 C23H12N4O2高分辨ms 376.09603。观测到376.09468。分析计算的 C23H12N4O2：C，73.39；H，3.21；N，14.88。发现C，73.12；H，3.23；N， 14.87。

化合物32.和制备6类似，起始物用31。产量93％，mp＞300℃。1H NMR(DMSO-d6)；δ5.86(s，2H)，6.20(s，2H)，7.02-7.17(m，2H)，7.19(d， J＝3.6Hz，1H)，7.37(d，J＝3.6Hz，1H)，7.58(s，2H)，7.76-7.97(m，5H)， 9.66(s，2H)，13.00(br s，1H)。EIMS(m/z，rel.int.；443(M++1，60)，428 (25)，241(20)，222(100)。

化合物33.和制备14类似，起始物用32。产量67％，mp 248-250 ℃。1H NMR(D2O/DMSO-d6)；δ1.87(s，3×CH3)，7.15(s，2H)， 7.32-7.46(m，2H)，7.66-7.79(m，2H)，7.95-8.24(m，5H)。MS(m/z， rel.int.)；410(M+，10)，392(100)，365(90)，350(80)，336(5)。计算的 C23H18N6O2-3.0AcOH-0.35H2O：C，58.35；H，5.14；N，14.09。计算的C， 58.03；H，4.88；N，14.20。

实施例9

化合物39

图解13.合成化合物39.

实施例10

化合物45

图解14.合成化合物45

实施例11

合成化合物61a，61b，62a，和62b

图解15.合成化合物61a，61b，62a，和62b.

实施例12

吸光率和CD测量

寡核苷酸d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)、d[AG3TG4AG3TG4A] (SEQ ID NO：2)、d[G4(T4G4)3](SEQ ID NO：3)、d[(T2G4)4](SEQ ID NO： 4)、d[(GC)7](SEQ ID NO：5)、d[GCGAATTCGC](SEQ ID NO：6)、 d[G2T2G2TGTG2T2G2](SEQ ID NO：7)、 d[CGAATTCGTCTCCGAATTCG](SEQ ID NO：8)、 d[TAGGGUTAGGGT](SEQ ID NO：9)、d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)、d[TAGGGUTAGGU](SEQ ID NO：11)、d[TTAGGGT] (SEQ ID NO：12)和d[TGGGGT](SEQ ID NO：13)购自Midland Certified Reagent公司(The Midland Certified Reagent Company，Inc.， Midland，Texas，USA)，用HPLC纯化。每个DNA样品的浓度由分光 光度法在260nm下使用最近邻消光系数测定。

每个双阳离子聚芳基化合物的储存液在双蒸水中制备，并在使用 前用缓冲液稀释到工作浓度。所有测量都是在含3mM EDTA和50mM KCl、NaCl或LiCl的10mM HEPES缓冲液(pH7.4)中在20℃下进行 的。吸收光谱用Varian Cary 300 BIO UV-visible分光光度计(Varian， Inc.，Palo Alto，California，United States of America)获得，使用1厘米 光程长度(pathlength)的石英杯。CD光谱用Jasco J-810旋光分光计 (Jasco，Inc.，Easton，Maryland，United States of America)记录，使用1厘 米杯，扫描速度50nm/min，反应时间1秒。光谱取4次扫描的平均 值。缓冲液基线扫描使用同样的小杯，并从每个样品的平均扫描中减 去。随后加入适量的双阳离子化合物储存液或者DNA以增加摩尔比 率。

实施例13

表面等离子共振研究

表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)测量使用一个4 通道Biacore3000光学生物传感器系统(Biacore International AB， Uppsala，Sweden)进行。5’-生物素标记的DNA被固定到链霉亲和素包 被的BiacoreSA传感器芯片上，如前述。见 Lacy，E.R.，et al.，J. Amer. Chem.Soc.，124，2153-2163(2002)； Mazur，S.，et al.，J. Mol.Biol.，300， 321-337(2000)； Nguyen，B.，et al.，Biopolymers，63，281-297(2002)； Wang，L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，12-16(2000)；和 Wang， L.，et al.，Biochemistry，40，2511-2521(2001)。两个流动槽用来固定 DNA寡聚物样品，第三个槽留空作为对照。SPR研究在25℃在过滤、 脱气的含200mM KCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20(Biacore International AB)的10mM HEPES缓冲液(pH7.4)中进行。化合物溶液 从储存液经过一系列稀释制备并从带有可穿刺的塑料瓶塞的7-mm塑 料瓶注入。

已知浓度的化合物8(浓度从2nM到10μM)溶液通过流动槽 注入，直到获得一个恒定的稳态反应。化合物溶液流随后被缓冲液流 替代，造成复合物的解离。每个含有DNA的槽的反应减去空槽中的 参考反应值，得到信号(RU，反应单位)，其与结合的化合物量成正比。 这样获得了结合人类端粒DNA的、不同浓度的8的一组传感图。在 稳态区域的仪器反应(RU)以50秒时间段的线性平均值决定。预期 的每结合化合物在稳态区域的最大反应(RUmax)由DNA分子量、在流 动槽内的DNA量、化合物分子量和化合物与DNA的折光指数梯度 比率(refractive index gradient ratio)决定，如前述。结合位点的数量 由RU对Cfree的拟合曲线(fitting plots)估计。为了获得结合常数， 将数据拟合到一个使用对结合参数进行非线性最小平方法优化的 KaleidaGraph(Synergy Software，Reading，Pennsylvania，United States of America)的两点平衡模型(two-site equilibrium model)中，其中 RUmax是每结合化合物的最大反应，K1和K2是两点结合模型的宏观 结合参数：

RU＝RUmax*(K1*Cfree+2*K1*K2*Cfree2)/(1+K1*Cfree+K1*K2*KCfree2)

其中，对于单结合位点模型，K2等于0。

实施例14

荧光测量

荧光实验使用Cary Eclipse荧光分光计(Varian，Inc.，Palo Alto， California，United States of America)进行。所有测量都在20℃、含3mM EDTA和50mM KCl的10mM HEPES缓冲液(pH7.4)中进行。使用 0.5mm光程长度的石英杯。荧光滴定通过往含有4.98μM化合物8的 小杯中滴入增加量的d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)来测量。激发波 长设为393.5nm，其是吸光率滴度决定的等吸光点，所以在滴定中样 品吸光率保持恒定。发射光从400到600nm扫描，发射隙缝宽度 2.5nm。在每次扫描前加入DNA，每次增加浓度0.213μM，直到总 DNA浓度为4.04μM。也进行荧光能量转移试验。发射波长设为 469nm，激发隙缝宽度5nm。激发光谱对单独的8和在d[AG3(T2AG3)3] (SEQ ID NO：1)存在下从230nm到330nm扫描。

实施例15

NMR研究

所有1D和2D实验都在600MHz Bruker和Varian Unity分光计 和装有冷冻探子的500mHz Bruker分光计上进行。几个DNA四链体 序列用于NMR实验，NMR样品浓度典型地从0.1到0.5mM。NMR 研究的缓冲液为50mM KCl、10mM K2HPO4、0.1mM EDTA以及作 为内参照的0.01mM DSS，调节至pH7.0。化合物用四链体DNA滴定， 化合物：DNA比率为从0.5到2。亚氨基质子的温度依赖性1D光谱 使用jump-and-return和对于水和D2O样品进行水峰压制(water suppression)的WATERGATE脉冲序列来进行。水样品的相位敏感 NOESY和TOCSY研究使用WATERGATE溶剂压制方法。2D光谱 在2048×2048数据点收集，光谱分辨率2.5Hz。TOCSY研究的混合 时间从60到100ms，NOESY实验的混合时间为200到300ms。所有 的1D NMR研究都在10℃到50℃的大温度范围内进行。最后，选择 35℃进行2D研究。

实施例16

结构研究的讨论

非手性分子，如化合物8，在溶液中无CD信号。当一个非手性 配体紧密结合一个手性宿主时，如DNA，可以在相应于配体吸光率 的波长区域内诱导CD信号。图3显示人端粒序列在K+存在下用8 滴定的CD光谱。光谱显示诱导的CD信号，其表明8结合DNA。 当化合物加到DNA上，诱导的信号显示激子分劈(exciton splitting)， 阳性带(positive band)中心在432nm，阴性带(negative band)中心 在416nm，等椭圆点(isoelliptic point)在424nm，这也是当化合物8 结合DNA时的最大吸光率。一条额外的阴性带，中心位于395nm， 和较高的能量激子带重叠。因为激子分裂来自退化的跃迁偶极 (degenerate transition dipole)之间的相互作用产生，它表明了8以一 或多个二聚物结合DNA。和DNA区域的椭圆率比较，诱导的激子 CD表现出一个非常大的椭圆率。二聚物的两个分子相对于彼此的转 动和平动自由度的限制造成了诱导的CD带的转动强度的增加，导致 一个大椭圆率。见 Allenmark，S.，Chirality，15，409-422(2003)。这表 明二聚物可以位于一或多个四链体沟上，因为沟提供了一种几何约 束，这种约束在四链体末端堆积复合物中不存在。

一种与本发明化合物相关的关于沟结合的药物设计策略是共价 连接沟结合二聚物的两个分子在一起。这能极大地增强对靶序列的结 合和选择性。另一种策略是制造能组合末端堆积以及沟结合特征的分 子。沟结合物可以连接到一个末端堆积分子上，这样可以通过一种组 合的结合模式和四链体结合，这与溴化乙锭结合双链体DNA的方式 相似。这个方法的一个拓展是用一个适当长度的沟结合分子并且共价 附着一个末端堆积分子到每个末端，形成一个“分子钳(molecular clamp)”，这样可以以一种类似于双链双嵌入剂(bisintercalator)的方 式结合端粒DNA。

8添加到人类端粒DNA上也能影响在DNA吸光率波长区域内的 CD信号(图4)。DNA有个峰在290nm左右，还有一个较小的峰在 大约265nm。对CD光谱的解释很大程度上基于模式识别。许多平行 式的四链体具有特征性很强的、在264nm处的阳性带和240nm处的 阴性带，而反平行的四链体通常具有一个位于290到295nm之间的 阳性带和一个260-265nm的阴性带。见 Balagurumoorthy，P.，et al.，J. Biomol.Struc.Dyn.，8，15(1992)； Balagurumoorthy，P.，et al.，Nuc.Acids. Res.，20，4061-4067(1992)。基于这些已建立的CD模式识别，表明人 类端粒DNA序列在这些条件下的构象可以是一个杂种构造，同时具 有平行和反平行结构的特征，或者可以在溶液中混合多种构象而存 在。当加入8后，在290nm处的峰开始下降，而在265nm处的峰开 始上升。这表明8正在诱导或捕获DNA的平行构象。

人类端粒序列的CD光谱已经被证明在钠离子和钾离子存在的情 况下会有不同。见 Sen，D.，and Gilbert，W.，Nature，344，410(1990)。这 表明这个DNA序列在这些相反离子存在时表现不同的构象。在钠离 子和钾离子存在下分别获得的不同的NMR和结晶结构支持了这种离 子依赖构象说。在钾离子存在下的d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)的 NMR结构是一个反平行的篮状结构。见 Wang，Y.，and Patel，D.， Structure，1，263-282(1993)。在钠离子存在下这个序列的结晶结构为 平行的、螺旋桨状结构。见 Parkinson，G. N.，et al.，Nature，417，876-880 (2002)。在钾离子存在下还可能存在其它的结构包括一种反平行的椅 形结构( He，Y.，et al.，Nuc.Acids Res.，32，5359-5367(2004)； Li，J.，et al.， Nuc.Acids Res.，33，4649-4659(2005)； Qi，J.，and Shafer，R.，Nuc.Acids Res.，33，3185-3192(2005))以及一种混合的平行/反平行杂种结构 ( Rezler，E.M.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，127，9439-9447(2005))。另见 图1。

为研究DNA结构对化合物8结合的影响，在不同盐条件下进行 了人端粒DNA的CD滴定，以确定化合物8是否以一个二聚物的形 式结合这个DNA序列的不同构象。图5a和5b显示了d[AG3(T2AG3)3] (SEQ ID NO：1)用化合物8分别在50mM钠和50mM锂存在下滴定的 CD光谱。锂已经示出具有对四链体结构的去稳定作用。见 Sen，D.，and Gilbert，W.，Methods Enzymol.，211，191-199(1992)。不管存在的阳离子 如何，激子分裂发生，并且290nm峰下降，265nm峰上升，就像在 钾离子存在的情况下一样。这表明无论起始的DNA构象如何，化合 物8诱导形成DNA的平行构象，形成一个最佳的二聚物结合位点。 只有PIPER和telomestatin示出诱导人类端粒DNA的四链体形成。 见 Han，H.，et al.，Biochemistry，38，6981-6986(1999)； Phan，A.T.，et al.， Nature Chem.Biol.，1，167-234(2005)。

CD光谱(图6-11和13-17)是化合物8和其它多种构象的 DNA序列以及在不同碱基上修饰的、且不同长度的人类端粒序列获 得的。只和化合物8显示激子分裂的序列是四膜虫端粒和修饰的人端 粒序列。例如d[TGGGGT](SEQ ID NO：13)和化合物8的CD光谱(图 17)不显示任何的诱导CD或者激子分裂，表明化合物8可能不和这 个序列结合。通过NMR四膜虫端粒已经示出具有混合的平行和反平 行杂种结构，有一个螺旋桨环和2个侧环(lateral loop)。这表明如果 事实上人端粒以混合的杂种四链体存在，化合物8将以二聚物形式高 度选择性地结合这种类型的四链体结构。

表1.代表性的DNA序列

DNA 序列 SEQ IDNO： 结构类型 c-MYC启动子 d[AG3TG4AG3TG4A] 1 平行 尖毛虫端粒 d[G4(T4G4)3] 3 反平行篮状 四膜虫端粒 d[(T2G4)4] 4 混合平行/反平行杂种 GC7 d[(GC)7] 5 Watson-Crick双链 双链 d[GCGAATTCGC] 6 Watson-Crick双链 凝血酶结合适体 (Aptamer) d[G2T2G2TGTG2T2G2] 7 反平行椅状 修饰的人端粒 d[TAGGGUTAGGGT] 9 平行发夹二聚物 修饰的人端粒 d[TAGGGUUAGGGT] 10 平行发夹二聚物 修饰的人端粒 d[TAGGGUTAGGGU] 11 平行发夹二聚物 修饰的人端粒 d[TTAGGGT] 12 平行(分子间) Oligo d[TGGGGT] 13 平行(分子间)

关于式(I-IV)的几个化合物的G四链体结合的CD数据总结在 下表2。一些化合物显示结合端粒G-四链体DNA序列d[AG3(T2AG3)3] (SEQ ID NO：1)，由诱导的CD证实，但光谱未显示激子分裂。诱导 CD的相对强度用(+)号的数字表示。其它化合物，包括8、17、49和 51诱导激子分裂，由右手栏中的一或多个(+)号表示。

进行吸光率滴定以监测当化合物8结合人端粒DNA时的光谱特 性的变化。在加入DNA之前，化合物8单体的吸收峰出现在370nm。 当DNA加入时，这个单体峰的强度降低，一个新峰在大约425nm处 出现，对应于二聚物的形成。见图12。这个红移表示形成J-聚集体。 在J-聚集体中，二聚物中两个生色团的跃迁矩是用一个平动偏移定 向的。电子跃迁至最低的激子状态是允许的，造成吸光率最大值的红 移。见 Jelley，E.E.，Nature，138，1009(1936)； Schiebe，G.，Angew.Chem.， 50，212(1937)。对于化合物8，这个二聚物结构的偏移使得末端荷正 电的脒在邻近的分子上在脒之间有一个更大的间距，减少了电子排 斥，这种排斥在H-聚集体(非偏移)结构中存在。滴定光谱也揭示 了一个在395nm的等吸收点，表明了两态跃迁。这表明在该系统中 只存在着未结合的单体和结合的二聚物。

表面等离子共振(SPR)用于定量评价化合物8和人端粒DNA 间的相互作用。SPR是一种很有用的实时监测分子反应的技术，在之 前已用于研究化合物和四链体DNA间的相互作用。端粒序列 d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)被固定，一定范围浓度的化合物8 (2nM到10μM)注入以定量评估和DNA的相互作用。第二种形成 双链发夹的寡核苷酸d[CGAATTCGTCTCCGAATTCG](SEQ ID NO： 8)固定在第二个流动槽中以评价化合物8对四链体DNA和双链体 DNA的选择性。用缓冲液作为空白注射，化合物的传感图减去空白 的传感图得到最终的浓度依赖图。用传感图稳态区域的反应值对流体 溶液中未结合的化合物8的浓度(Cr)作图。由RU值得出的结合的 化学计量关系随着化合物8浓度的增加而接近。人端粒序列和双链序 列RU值的显著差异决定了端粒的结合化学计量关系为2∶1而双链的 为1∶1。化合物8和人端粒序列的2∶1的化学计量关系与CD和吸光 率结果一致，表明是以二聚物结合。

在较高浓度未观察到大的信号增强，表明没有观察到化合物聚 集。这种聚集可以在例如卟啉和羰花青这样的分子中观察到，它们可 以形成二聚物和更高级别的聚集体。化合物8结合位点可以提供一个 几何尺寸约束，其限制位点成为一个二聚物。如果化合物8分子在G -四分体的末端外部堆积，额外的分子将可以堆积在二聚物上，形成 更大的聚集体，这样化学计量关系将大于2∶1。更有可能的是沟-结合 或相互作用结合模式将提供这种类型的限制环境。但是共面二聚物 (cofacial dimer)的嵌入将极不可能，这是由于四分体间的距离比配 体的大小要小。因此，沟-结合仍是化合物8二聚物结合人端粒序列 的最有可能的模型。

SPR也用于确定化合物8结合人端粒序列和双链序列的结合亲和 力(图18)。RU比Cf的图与一或两个结合位点的结合模式匹配。对 于人端粒序列，K1＝4.7×105M-1及K2＝4.5×104M-1。这种化合物8与 人端粒DNA的结合亲和力也被一个在295nm下监测到的、在含 50mM KCl的HEPES缓冲液中大约10℃的ΔTm所支持。对于双链序 列，单个位点的结合常数为K＝1.3×105M-1，表明化合物8对于人端 粒四链体的选择性大约为对双链体DNA的4倍。

对于化合物8结合人端粒序列，对于第二个结合位点的结合常数 比第一个位点的常数低一个数量级，表明负协同性。这点和CD光谱 似乎矛盾，CD光谱表明在诱导区域内正协同性。但是，由于激子分 裂仅仅由二聚物分子间的相互作用引起，而不是单体结合，这样激子 分裂仅能在第二个分子结合后才能观察到，因而就表现出了正协同 性，即使SPR显示结合为负协同性。

荧光滴定通过将DNA滴定到化合物8的溶液中进行。数据的斯 卡查德图(Scatchard plot)显示在图19。当r值很小的时候，化学计 量关系可以通过在起始区域内的曲线外推并确定和x轴的交点来确 定。在此，线交交点大约在r＝2，表明化学计量关系大约为2个化合 物8分子对1个DNA分子，这和SPR实验得到的化学计量关系一致。 曲线的向下的曲率表明结合发生负协同性，这也和SPR数据一致。

荧光能量转移研究用于确定DNA碱基到结合的化合物8二聚物 的能量转移程度。在四链体末端的堆积或者插入到四分体将使得能量 转移，导致由于DNA的吸收在激发光谱上产生一个260nm的峰。当 加入d[AG3(T2AG3)3](SEQ ID NO：1)到化合物8中，所有波长的荧光 都降低，260nm处的峰消失(图20)。这表明化合物8的二聚物位于 四链体沟处，其方向阻止了从DNA的能量转移。

对序列d[TAGGGUTAGGGT](SEQ ID NO：9)在钾存在下的 NMR研究和先前其他人的研究结果一致，表明这个序列形成了二聚 物发夹类型平行结构。见 Phan，A.T.，and Patel，D.，J.Am.Chem.Soc.， 125，15021-15027(2003)。修饰的人端粒的亚氨基质子光谱示出DNA 可以在平行(螺旋桨)或反平行(篮状)形式中存在，当温度增加时， 更倾向于平行形式。化合物8和多种修饰的人端粒序列的滴定研究示 出化合物非常选择性地结合混合结构中的平行结构。当用8滴定时， 对应于反平行结构的峰强度降低，表明化合物结合平行形式并使之稳 定。见图21、22和23。

游离d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)的尿嘧啶H5-H6 TOCSY光谱(图24)示出混合结构的存在。在7.86ppm的峰对应于 U6 H5-H6交叉峰，而在7.80ppm的交叉峰对应于U7 H5-H6质子。这 两个交叉峰构成了主要形式，而其它两个在7.7和7.5ppm的交叉峰 对应于次要形式的U6和U7。在用化合物8滴定后，两个次要形式7.7 和7.5ppm的峰强度极大降低，这也表明化合物偏向于一种单一结构。

游离d[TAGGGUUAGGGT](SEQ ID NO：10)的TOCSY光谱的一 个T-甲基区域(图25)示出了混合结构的存在。仔细观察7.5ppm的 峰表明在这个位点的两个峰相互重叠，对应于平行形式的T1和T12 甲基质子，而在7.3ppm的峰对应于次要的(反平行)形式。加入化 合物8后，1个峰漂移到7.44ppm的新位置，而另一个峰保留在 7.5ppm。d[TAGGGUTAGGGU](SEQ ID NO：11)的尿嘧啶H5-H6质 子的TOCSY光谱(图26a-c)示出化合物8的比率增加时，次要形 式的交叉峰消失，表明化合物选择性地结合单一构象。

实施例17

双阳离子聚芳基的体外抗原生动物活性

体外抗原生动物活性是按照已有的方案来测量的。见 Ismail，M. A.，et al.，J.Med.Chem.，46，4761-4769(2003)； Stephens，C.E.，et al.， Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，2065-2069(2003)(in vitro assay against Leishmania donovani)。Furamidine和化合物8、17、45-47、49和51-53 抗布氏罗得西亚锥虫(T.b.r.)和恶性疟原虫(P.f.的活性示于表3。

实施例18

双阳离子聚芳基的体内抗原生动物活性

Furamidine和化合物8、17、45-47、49和51-53在小鼠模型内抗 布氏罗得西亚锥虫(T.b.r.)STIB 900株的活性也示于表3。4只一 组的几组小鼠腹膜内注射感染2×105血流形式的T.b.r.STIB 900，所 述STIB 900来自坦桑尼亚的一个患者。感染后第3、4、5和6天， 实验组用药物通过腹膜内或者用前体药物通过口服治疗。通常使用的 是在先前毒理学实验中确定的最高耐受剂量。每天观察小鼠的寄生虫 血症直到感染后第14天，在此之后，每周观察2次直到第60天。1 组小鼠没有接受治疗，作为对照组。对于复发的小鼠，记录死亡日期 并确定存活时间。

可以理解，关于本发明的许多细节可以被改变而不偏离本发明的 范围。而且，前面的描述只是为说明目的，并不是为了限制本发明。

序列表

<110>北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 佐治亚州立大学研究基金会公司

<120>选择性识别G-四链体DNA的双阳离子化合物

<130>421-60-32

<160>13

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

agggttaggg ttagggttag gg                                 22

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

agggtgggga gggtgggga                                     19

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>Oxytricha

<400>3

ggggttttgg ggttttgggg ttttgggg                           28

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Tetrahymena sp.

<400>4

ttggggttgg ggttggggtt gggg                               24

<210>5

<211>14

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>5

gcgcgcgcgc gcgc                                          14

<210>6

<211>10

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>6

gcgaatc                                                  10

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>7

ggttgggttgg                                              15

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>8

cgaattcgtc tccgaattcg                                    20

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>9

tagggutagg gt                                            12

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>10

 taggguuagg gt                                           12

<210>11

<211>12

<212>DNA

<213>artificial seqauence

<400>11

tagggutagg gu                                            12

<210>12

<211>7

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>12

ttagggt                                                  7   

<210>13

<211>6

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>13

tggggt                                                   6